KR20210021542A - 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제하는 방법 - Google Patents

크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제하는 방법 Download PDF

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KR20210021542A
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지치앙 첸
수안쿼 수
산차이타 고세
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

본 개시내용은 조작 조건 하에 통류 방식의 조합된 AEX-CEX 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제하는 방법으로서, 여기서 AEX와 CEX 사이에서 자동화, 공학 제어 및/또는 인라인 조정이 사용되지 않는 것인 방법을 제공한다. AEX 및 CEX (또는 CEX 및 AEX)는 직접 연결될 수 있다.

Description

크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제하는 방법
대규모의 효율적이고 경제적인 단백질 정제는 현재의 생명공학 및 제약 산업에서 극복해야 할 주요 장애물 중 하나를 나타낸다. 일반적으로, 관심 단백질을 생산하기 위해서는 다양한 "업스트림" 세포 배양 공정으로 생산 및 정제가 먼저 이루어진다. 생산 후에, "다운스트림" 정제 공정을 이용하여, 업스트림 공정에서 생산된 혼합물에 또한 존재할 수 있는 임의의 바람직하지 않은 오염물질로부터 관심 단백질을 분리하고 단리한다. 다양한 업스트림 및 다운스트림 기술은, 예를 들어, 문헌 [Biopharmaceutical Processing: Development, Design, and Implementation of Manufacturing Processes, Jagschies et al., 2017]에서 확인될 수 있다. 특정한 하위세트의 단백질, 모노클로날 항체 (mAb) 및 그의 유도체 산물 (예를 들어, Fc-융합 단백질, 이중특이적 항체)은 이들 유형의 생물제제의 안전성, 효능 및 고급 품질로 인해 가장 난제로 꼽히는 인간 질환 중 일부를 치료하는데 있어서 중요한 역할을 한다. mAb의 제조는 재조합 포유동물 배양물에서의 단백질 발현으로 시작된다. 이어서, 세포 배양물 브로쓰가 직접적인 심층 여과 또는 원심분리를 통해 수거된다. 이어서, 정화된 벌크가 다운스트림 정제 (DSP)에 적용된다. 다운스트림 정제 공정은 문헌 [Shukla et al., Downstream Processing Of Monoclonal Antibodies--Application Of Platform Approaches, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 848 (2007) 28-39]에 기재된 바와 같이 전형적으로 포획을 위해 단백질 A 크로마토그래피를 사용한 다음에, 1 또는 2회의 폴리싱 단계가 이어진다. 양이온-교환 (CEX), 음이온-교환 (AEX), 소수성 상호작용 (HIC) 및 혼합 모드 크로마토그래피가 모두 폴리싱 단계로서 사용되어 왔다.
현재의 다운스트림 정제는 종종 상이한 단위 조작 (크로마토그래피 및 여과) 사이에 보유 탱크가 있는 회분식 공정으로서 수행된다. 각각의 단위 조작을 위해 필수적인 완충제 조정 (예를 들어, pH 또는 전도도 조정)이 종종 요구된다. 용리액의 자동화 및 인라인 조정이 정제 단계를 개선시키는 것으로 보고된 바 있다. 그럼에도 불구하고, 완충제 조건의 인라인 조정은 번거롭고 조작 비용 및 시간 및 스키드 풋프린트를 증가시킬 수 있다.
본 개시내용은 관심 단백질의 연속 정제를 위한 조합된 크로마토그래피 공정으로서, 여기서 AEX 및 CEX가 pH 및/또는 전도도를 포함한 크로마토그래피 조건에 대한 임의의 인라인 조정 없이, 통류 방식으로 조작되는 것인 공정에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 pH 또는 전도도를 포함한 임의의 정제 조건에 대한 인라인 조정이 없는 AEX-CEX 또는 CEX-AEX 정제 접근법을 사용하는 관심 단백질의 정제에 관한 것이다. 구체적으로, 접근법은 일렬의 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 및 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX)를, AEX-CEX 또는 CEX-AEX 순서로 사용한다. 일부 실시양태에서, AEX 및 CEX는 AEX와 CEX 또는 CEX와 AEX 사이에서 공정중 풀의 pH 또는 전도도에 대한 조정이 이루어지지 않는다. 본 개시내용의 또 다른 특색은 AEX 및 CEX의 칼럼 조건이 함께 프로세싱되고 단일 단위로서 조작되어, 이것이 공정 비용, 공정 조작 시간, 및 공정 스키드 풋프린트를 현저히 감소시킨다는 것이다.
일부 실시양태에서, 단백질은 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9 또는 약 8.0 초과의 등전점 (pI)을 갖는다. 다른 실시양태에서, 단백질은 약 12.0, 약 11.9, 약 11.8, 약 11.7, 약 11.6, 약 11.5, 약 11.4, 약 11.3, 약 11.2, 약 11.1, 약 11.0, 약 10.9, 약 10.8, 약 10.8, 약 10.7, 약 10.6, 약 10.5, 약 10.4, 약 10.3, 약 10.2, 약 10.1 또는 약 10.0 미만의 등전점 (pI)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단백질은 약 7.0 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 6.5 내지 약 10.5 또는 약 7.2 내지 약 9.6의 pI를 갖는다. 다른 실시양태에서, 단백질은 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 약 10.0, 약 10.5 또는 약 11.0의 pI를 갖는다. 다른 실시양태에서, 단백질은 약 6.5, 약 6.4, 약 6.3, 약 6.2, 약 6.1, 약 5.9, 약 5.8 또는 약 5.7 미만의 등전점 (pI)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단백질은 약 1.0, 약 2.0, 약 3.0, 약 4.0 또는 약 5.0 초과의 등전점 (pI)을 갖는다. 다른 실시양태에서, 단백질은 약 1.0 내지 약 6.5, 약 2.0 내지 약 6.0, 약 2.5 내지 약 6.5, 또는 약 2.0 내지 약 5.8의 pI를 갖는다. 다른 실시양태에서, 단백질은 약 6.5, 약 6.4, 약 6.3, 약 6.2, 약 6.1, 약 6.0, 약 5.9, 약 5.8, 약 5.7, 약 5.6 또는 약 5.5의 pI를 갖는다.
일부 실시양태에서, 조합된 크로마토그래피는 로딩 완충제를 첨가하고 체이스 완충제를 첨가하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5 또는 약 10.0 초과의 pH를 갖는다. 다른 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 6.0 내지 약 11.0, 약 6.5 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.5, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 9.5, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 8.5, 약 7.0 내지 약 8.0 또는 약 7.0 내지 약 7.5의 pH를 갖는다. 다른 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 6.5, 약 7.0, 약 7.2, 약 7.4, 약 7.6, 약 7.8, 약 8.0, 약 8.2, 약 8.4, 약 8.6, 약 8.8, 약 9.0, 약 9.2, 약 9.4, 약 9.6, 약 9.8, 약 10.0, 약 10.5, 약 11.0 또는 약 11.5의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 6.0, 약 6.5 초과, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5 또는 약 9.0 초과의 pH를 갖는다. 다른 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 6.0 내지 약 11.0, 약 6.5 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 8.5, 약 7.0 내지 약 9.5, 약 6.5 내지 약 8.5 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다. 다른 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 6.0, 약 6.2, 약 6.4, 약 6.6, 약 6.8, 약 7.0, 약 7.2, 약 7.4, 약 7.6, 약 7.8, 약 8.0, 약 8.2, 약 8.4, 약 8.6, 약 8.8 또는 약 9.0의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 체이스 완충제는 로딩 완충제의 pH와 동일하거나 또는 그와 상이한 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 0.1 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 0.5 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 1.0 내지 약 9.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 8.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 7.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 8.5 mS/cm, 약 2.0 내지 약 7.5 mS/cm 또는 약 2.5 내지 약 7.0 mS/cm의 전도도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 0.1 mS/cm, 약 0.5 mS/cm, 약 1.0 mS/cm, 약 1.5 mS/cm, 약 2.0 mS/cm, 약 2.5 mS/cm, 약 3.0 mS/cm, 약 3.5 mS/cm, 약 4.0 mS/cm, 약 4.5 mS/cm, 약 5.0 mS/cm, 약 5.5 mS/cm, 약 6.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 7.0 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 8.0 mS/cm, 약 8.5 mS/cm 또는 약 9.0 mS/cm의 전도도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 6.0 mS/cm 내지 약 15.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm 내지 약 15 mS/cm, 약 7.0 mS/cm 내지 약 14.0 mS/cm, 약 8.0 mS/cm 내지 약 13.0 mS/cm, 약 9.0 mS/cm 내지 약 12.0 mS/cm 또는 약 9.0 mS/cm 내지 약 9.5 mS/cm의 전도도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 6.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 7.0 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 8.0 mS/cm, 약 8.5 mS/cm, 약 9.0 mS/cm, 약 9.5 mS/cm, 약 10.0 mS/cm, 약 10.5 mS/cm, 약 11.0 mS/cm, 약 11.5 mS/cm, 약 12.0 mS/cm, 약 12.5 mS/cm, 약 13.0 mS/cm, 약 13.5 mS/cm, 약 14.0 mS/cm, 약 14.5 mS/cm 또는 약 15.0 mS/cm의 전도도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 0.1 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 0.5 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 1.0 내지 약 9.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 8.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 7.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 8.5 mS/cm, 약 2.0 내지 약 7.5 mS/cm 또는 약 2.5 내지 약 7.0 mS/cm의 전도도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 0.1 mS/cm, 약 0.5 mS/cm, 약 1.0 mS/cm, 약 1.5 mS/cm, 약 2.0 mS/cm, 약 2.5 mS/cm, 약 3.0 mS/cm, 약 3.5 mS/cm, 약 4.0 mS/cm, 약 4.5 mS/cm, 약 5.0 mS/cm, 약 5.5 mS/cm, 약 6.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 7.0 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 8.0 mS/cm, 약 8.5 mS/cm 또는 약 9.0 mS/cm의 전도도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 6.0 mS/cm 내지 약 15.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm 내지 약 15.0 mS/cm, 약 7.0 내지 약 15.0 mS/cm, 약 8.0 내지 약 14.0 mS/cm, 약 8.0 내지 약 13.0 mS/cm, 약 8.0 내지 약 14.5 mS/cm, 약 8.0 내지 약 13.5 mS/cm 또는 약 8.5 내지 약 13.0 mS/cm의 전도도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 6.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 7.0 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 8.0 mS/cm, 약 8.5 mS/cm, 약 9.0 mS/cm, 약 9.5 mS/cm, 약 10.0 mS/cm, 약 10.5 mS/cm, 약 11.0 mS/cm, 약 11.5 mS/cm, 약 12.0 mS/cm, 약 12.5 mS/cm, 약 13.0 mS/cm, 약 13.5 mS/cm, 약 14.0 mS/cm, 약 14.5 mS/cm 또는 약 15.0 mS/cm의 전도도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 체이스 완충제의 전도도는 로딩 완충제의 전도도보다 높거나, 그보다 낮거나, 또는 그와 동일하다. 일부 실시양태에서, 체이스 완충제의 전도도는 로딩 완충제의 전도도보다 적어도 0.1 mS/cm, 적어도 0.2 mS/cm, 적어도 0.3 mS/cm, 적어도 0.4 mS/cm, 적어도 0.5 mS/cm, 적어도 1.0 mS/cm, 적어도 1.5 mS/cm, 적어도 2.0 mS/cm, 적어도 2.5 mS/cm, 적어도 3.0 mS/cm, 적어도 3.5 mS/cm, 적어도 4.0 mS/cm, 적어도 4.5 mS/cm 또는 적어도 5.0 mS/cm 더 높다.
일부 실시양태에서, 혼합물은 1종 이상의 오염물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오염물질은 숙주 세포 단백질 (HCP), DNA, 고분자량 종 (HMW), 저분자량 종 (LMW), 잔류 단백질 A (rPA) 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 오염물질의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 조합된 크로마토그래피는 HCP 수준을 약 100 ppm 이하, 약 90 ppm 이하, 약 80 ppm 이하, 약 70 ppm 이하, 약 60 ppm 이하, 약 50 ppm 이하, 약 40 ppm 이하, 약 30 ppm 이하, 약 20 ppm 이하 또는 약 10 ppm 이하로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 조합된 크로마토그래피는 HMW 수준을 약 1.0% 이하, 약 0.9% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.6% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하 또는 약 0.1% 이하로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 조합된 크로마토그래피는 LMW 수준을 약 1.0% 이하, 약 0.9% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.6% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하 또는 약 0.1% 이하로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 조합된 크로마토그래피는 DNA 수준을 약 20 pg/mL 이하, 약 18 pg/mL 이하, 약 16 pg/mL 이하, 약 14 pg/mL 이하, 약 12 pg/mL 이하, 약 10 pg/mL 이하, 약 8 pg/mL 이하, 약 6 pg/mL 이하, 약 4 pg/mL 이하 또는 약 2 pg/mL 이하로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 조합된 크로마토그래피는 잔류 단백질 A (rPA) 수준을 약 6 ppm 이하, 약 5 ppm 이하, 약 4 ppm 이하, 약 3 ppm 이하, 약 2 ppm 이하, 약 1 ppm 이하, 약 0.8 ppm 이하, 약 0.6 ppm 이하, 약 0.5 ppm 이하, 약 0.4 ppm 이하, 약 0.3 ppm 이하, 약 0.2 ppm 이하 또는 약 0.1 ppm 이하로 감소시킨다.
또한, 크로마토그래피에서 로딩 단계-후 완충제 전이 피크를 감소시키거나 또는 제거하는 방법으로서, 혼합물 내 단백질을 정제하기 위한 크로마토그래피 동안 로딩 완충제 및 체이스 완충제를 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 체이스 완충제가 로딩 완충제보다 더 높은 전도도를 갖는 것인 방법이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 AEX 크로마토그래피, CEX 크로마토그래피, 조합된 AEX 및 CEX 크로마토그래피, 또는 조합된 CEX 및 AEX 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 통류 방식이다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 3.0 mS/cm 내지 약 6.0 mS/cm의 전도도를 가지며, 체이스 완충제는 약 6.0 mS/cm 내지 약 12.0 mS/cm의 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 체이스 완충제의 전도도는 로딩 완충제의 전도도보다 적어도 0.5 mS/cm, 적어도 1.0 mS/cm, 적어도 1.5 mS/cm, 적어도 2.0 mS/cm, 적어도 2.5 mS/cm, 적어도 3.0 mS/cm, 적어도 3.5 mS/cm, 적어도 4.0 mS/cm, 적어도 4.5 mS/cm 또는 적어도 5.0 mS/cm 더 높다. 구체적 실시양태에서, 로딩 완충제는 5.0 mS/cm의 전도도를 가지며, 체이스 완충제는 6.0 mS/cm의 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 염화나트륨, 염화암모늄, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 아세트산암모늄, 황산나트륨, 황산암모늄, 티오시안산암모늄, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 및 그의 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 염, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 로딩 완충제는 아세트산나트륨-트리스를 포함한다. 다른 실시양태에서, 체이스 완충제는 염화나트륨, 염화암모늄, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 아세트산암모늄, 황산나트륨, 황산암모늄, 티오시안산암모늄, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 및 그의 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 염, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 체이스 완충제는 아세트산나트륨-트리스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 50 g/L 수지, 100 g/L 수지, 150 g/L 수지, 200 g/L 수지, 250 g/L 수지, 300 g/L 수지, 350 g/L 수지, 400 g/L 수지, 450 g/L 수지 또는 500 g/L 수지까지 로딩되는 칼럼을 포함한다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 포로스 HS, 포로스 XS, 카르복시-메틸-셀룰로스, 베이커본드(BAKERBOND) ABX™, 아가로스 상에 고정화된 술포프로필 및 아가로스 상에 고정화된 술포닐, 모노S, 미니S, 소스 15S, 30S, SP 세파로스(SEPHAROSE)™, CM 세파로스™, 베이커본드 카르복시-술폰, WP CBX, WP 술포닉, 히드로셀 CM, 히드로셀 SP, 우노스피어 S, 마크로-프렙 하이 S, 마크로-프렙 CM, 세라믹 하이퍼D S, 세라믹 하이퍼D CM, 세라믹 하이퍼D Z, 트리스아크릴 M CM, 트리스아크릴 LS CM, 트리스아크릴 M SP, 트리스아크릴 LS SP, 스페로덱스 LS SP, 다우엑스 파인 메쉬 강산 양이온 수지, 다우엑스 MAC-3, 매트렉스 셀루파인 C500, 매트렉스 셀루파인 C200, 프락토겔 EMD SO3-, 프락토겔 EMD SE, 프락토겔 EMD COO-, 앰버라이트 약 및 강 양이온 교환체, 다이아이온 약 및 강 양이온 교환체, TSK 겔 SP-5PW-HR, TSK 겔 SP-5PW, 도요펄 CM (650S, 650M, 650C), 도요펄 SP (650S, 650M, 650C), CM (23, 32, 52), SE (52, 53), P11, 익스프레스-이온 C 및 익스프레스-이온 S 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된 CEX 수지를 포함한다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 포로스 HQ, 포로스 XQ, Q 세파로스™ 패스트 플로우, DEAE 세파로스™ 패스트 플로우, 사토바인드(SARTOBIND)® Q, ANX 세파로스™ 4 패스트 플로우 (하이 서브), Q 세파로스™ XL, Q 세파로스™ 빅 비드, DEAE 세파덱스 A-25, DEAE 세파덱스 A-50, QAE 세파덱스 A-25, QAE 세파덱스 A-50, Q 세파로스™ 하이 퍼포먼스, Q 세파로스™ XL, 소스 15Q, 소스 30Q, 리소스 Q, 캅토 Q, 캅토 DEAE, 모노 Q, 도요펄 슈퍼 Q, 도요펄 DEAE, 도요펄 QAE, 도요펄 Q, 도요펄 기가캡 Q, TS 겔 슈퍼Q, TS 겔 DEAE, 프락토겔 EMD TMAE, 프락토겔 EMD TMAE 하이캡, 프락토겔 EMD DEAE, 프락토겔 EMD DMAE, 마크로프렙 하이 Q, 마크로-프렙-DEAE, 우노스피어 Q, 누비아 Q, PORGS PI, DEAE 세라믹 하이퍼D, Q 세라믹 하이퍼D 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된 AEX 수지를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질은 항체 또는 항체 단편, 융합 단백질, 자연 발생 단백질, 키메라 단백질 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgM, IgA, IgE, IgD 및 IgG로부터 선택된 이소타입이다. 일부 실시양태에서, IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 바이러스를 불활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 출발 혼합물을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 단백질 G 친화성 크로마토그래피로부터 선택된 친화성 크로마토그래피에 적용함으로써 단리되었다. 일부 실시양태에서, 출발 혼합물은 수거된 세포 배양물 유체, 세포 배양물 상청액, 조건화된 세포 배양물 상청액, 세포 용해물 및 정화된 벌크로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 출발 혼합물은 포유동물 세포 배양물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 출발 포유동물 세포 배양물은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터 유래된다.
도 1은 조합된 CEX-AEX 또는 AEX-CEX 폴리싱의 다이어그램을 제시한다. 칼럼 1의 유출구가 칼럼 2의 유입구에 직접 연결된다. 이들 두 칼럼 사이에서는 자동화, 공학 제어 또는 조정이 존재하지 않거나 또는 이루어지지 않는다.
도 2는 7.2의 pH, 5 mS/cm의 전도도에서의 조합된 CEX-AEX F/T 폴리싱의 대표적인 크로마토그램을 제시한다.
도 3a는 5 mS/cm, pH 7.2에서의 CEX F/T 로딩 및 체이스의 크로마토그램을 제시한다. 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 아세트산나트륨-트리스 완충제 시스템을 사용하여 유사한 pH 및 전도도를 갖는다. 280nm에서의 흡광도에 의해 측정된, 완충제 전이 유도된 로딩-후 피크가 체이스 완충제를 첨가한 후에 관찰되었다.
도 3b는 5 mS/cm, pH 7.2에서의 로딩 및 6 mS/cm, pH 7.2에서의 체이스의 CEX F/T의 크로마토그램을 제시한다. 체이스 동안 사용되는 완충제의 전도도가 보다 높을수록 로딩-후 피크를 효과적으로 제거할 수 있다.
본 개시내용은 친화성 크로마토그래피를 사용하는 단백질 정제 동안 오염물질을 제거하기 위한 고도로 효과적인 접근법을 제공한다. 구체적으로, 접근법은 일렬의 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 및 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX)를, AEX-CEX 또는 CEX-AEX 순서로 사용한다. 일부 실시양태에서, AEX 및 CEX는 AEX와 CEX 또는 CEX와 AEX 사이에서 완충제의 pH 또는 전도도에 대한 조정이 이루어지지 않는다. 본 개시내용의 또 다른 특색은 AEX 및 CEX의 칼럼 조건이 함께 프로세싱되고 단일 단위로서 조작되어, 이것이 공정 비용, 공정 조작 시간, 및 공정 스키드 풋프린트를 현저히 감소시킨다는 것이다.
작업 실시예에 제시된 바와 같이, 접근법은 넓은 범위의 등전점을 갖는 관심 단백질을 위해 혼합물 내 원치 않는 오염물질을 제거하는데 효과적이다. 이러한 AEX-CEX 시스템의 사용은 CEX 및 AEX 둘 다의 공정을 동시에 개선시키는 것을 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물질 (예를 들어, 숙주 세포 단백질, DNA, 잔류 단백질 A 등)을 포함하는 혼합물로부터 관심 단백질을 정제하는 방법으로서, 여기서 CEX 및 AEX는 통류 방식으로 조작되고, 관심 단백질은 CEX 또는 AEX에 강하게 결합하지 않는 것인 방법을 제공한다. 이러한 시스템의 사용은 매우 높은 처리량을 가능하게 하며, 여기서 CEX 및 AEX는 혼합물로부터 원치 않는 오염물질을 제거하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물질을 포함하는 혼합물로부터 관심 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 가능한 오염물질은 숙주 세포 단백질 (HCP), 고분자량 종 (HMW), 저분자량 종 (LMW), DNA 및/또는 이전 단백질 A 포획 단계로부터의 잔류 단백질 A (rPA)를 포함한다. 본 개시내용은 또한 완충제-전이 로딩-후 피크를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 크로마토그래피 공정은 로딩 단계로부터 칼럼을 통해 혼합물을 체이싱하기 위한 로딩-후 체이스 완충제로 전이될 때 방해된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 혼합물은 수거된 세포 배양물 유체, 세포 배양물 상청액, 세포 용해물 및 정화된 벌크로부터 유래된다.
I. 용어
용어 "및/또는"은 본원에 사용되는 경우에 2가지의 명시된 특색 또는 구성요소 각각을 다른 하나와 함께 또는 다른 하나 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포괄하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서 측면이 언어 "포함하는"을 사용하여 기재된 모든 경우에, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 용어로 기재된 달리 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; [The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 [the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]이 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어에 대한 일반 사전을 제공한다.
단위, 접두어, 및 기호는 국제단위계 (Systeme International de Unites; SI) 허용 형태로 나타내어진다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 본원에 제공된 표제는 본 개시내용의 다양한 측면을 제한하는 것이 아니며, 이는 전체로서의 본 명세서를 참조하는 것일 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 본 명세서 전문을 참조하여 보다 완전히 정의된다.
택일 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 어느 하나, 둘 다, 또는 그의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 단수 형태는 임의의 언급되거나 또는 열거된 구성요소 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 특정한 값 또는 조성에 대해 허용 오차 범위 내의 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정되거나 또는 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야에서의 관행에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 최대 20%의 범위를 의미할 수 있다. 게다가, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 값의 최대 10배 또는 최대 5배를 의미할 수 있다. 특정한 값 또는 조성이 본 출원 및 청구범위에 제공되는 경우에, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 그러한 특정한 값 또는 조성에 대해 허용 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 기재된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는, 달리 나타내지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우에, 그의 분수 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "관심 단백질"은 그의 가장 넓은 의미로 정제를 목적으로 하는, 혼합물에 존재하는 임의의 단백질 (천연 또는 재조합)을 포함하도록 사용된다. 이러한 관심 단백질은, 비제한적으로, 효소, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 이뮤노글로불린 (예를 들어, 항체), 및/또는 임의의 융합 단백질을 포함한다.
용어 "정화"는 미립자를 제거하는 공정을 지칭한다. 정화는 정제 공정 동안 후속 크로마토그래피 (예를 들어, AEX 또는 CEX)에 대한 부담을 낮출 수 있다. 일부 예에서, 정화는 세포 배양물로부터 콜로이드, 지질, DNA-RNA, 잔류 세포 및 다른 입자를 제거하는 방법이다. 여과가 또한 사용될 수 있으며, 심층 여과를 포함할 수 있다. "정화된 벌크"는 정화 공정에 적용된 혼합물을 지칭한다.
용어 "바이러스 불활성화"는 혼합물로부터 감염성 바이러스 오염물질을 제거하는 공정을 지칭한다. 전염성의 병원성 바이러스를 불활성화시키는 많은 상이한 방법, 예컨대, 예를 들어, 열-불활성화, 용매/세제(S/D) 불활성화, pH 불활성화, 화학적 불활성화, 및/또는 자외선 조사 불활성화가 현재 존재한다.
용어 "크로마토그래피"는 혼합물에 존재하는 다른 분자 (예를 들어, 오염물질)로부터 관심 단백질 (예를 들어, 항체)을 분리하는 임의의 종류의 기술을 지칭한다. 통상적으로, 관심 단백질은 혼합물의 개별 분자가 이동 상의 영향 하에, 또는 결합 및 용리 공정에서 고정 매질을 통해 이동하는 속도에서의 차이의 결과로서 다른 분자 (예를 들어, 오염물질)로부터 분리된다. 용어 "매트릭스" 또는 "크로마토그래피 매트릭스"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 분리 공정에서 혼합물에 존재하는 다른 분자로부터 관심 단백질 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질 예컨대 이뮤노글로불린)을 분리하는 임의의 종류의 흡착제, 수지 또는 고체 상을 지칭한다. 비제한적 예는 칼럼 또는 카트리지에 넣을 수 있는 미립자, 모놀리식 또는 섬유상 수지 뿐만 아니라 막을 포함한다. 매트릭스를 형성하는 물질의 예는 폴리사카라이드 (예컨대 아가로스 및 셀룰로스); 및 다른 기계적으로 안정한 매트릭스 예컨대 실리카 (예를 들어 제어된 세공 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 상기 중 임의의 것의 유도체를 포함한다. 본 개시내용의 방법에 적합한 전형적인 매트릭스 유형의 예는 양이온 교환 수지, 친화성 수지, 음이온 교환 수지 또는 혼합 모드 수지이다. "리간드"는 크로마토그래피 매트릭스에 부착되며 매트릭스의 결합 특성을 결정하는 관능기이다. "리간드"의 예는 이온 교환 기, 소수성 상호작용 기, 친수성 상호작용 기, 친황성 상호작용 기, 금속 친화성 기, 친화성 기, 생체친화성 기 및 혼합 모드 기 (상기 언급된 것의 조합)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용될 수 있는 일부 바람직한 리간드는 강 양이온 교환 기, 예컨대 술포프로필, 술폰산; 강 음이온 교환 기, 예컨대 트리메틸암모늄 클로라이드; 약 양이온 교환 기, 예컨대 카르복실산; 약 음이온 교환 기, 예컨대 N5N 디에틸아미노 또는 DEAE; 소수성 상호작용 기, 예컨대 페닐, 부틸, 프로필, 헥실; 및 친화성 기, 예컨대 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본원에 달리 명백하게 제공된 경우를 제외하고는, 본 출원에 사용된 각각의 하기 용어는 하기 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
용어 "친화성 크로마토그래피"는 관심 단백질 (예를 들어, Fc 영역 함유 관심 단백질 또는 항체)이 관심 단백질에 대해 특이적인 리간드에 특이적으로 결합되는 단백질 분리 기술을 지칭한다. 이러한 리간드는 일반적으로 생체특이적 리간드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 생체특이적 리간드 (예를 들어, 단백질 A 또는 그의 기능적 변이체)는 크로마토그래피 매트릭스 물질에 공유 부착되며, 용액이 크로마토그래피 매트릭스와 접촉할 때 용액 내 관심 단백질에 접근가능하다. 관심 단백질은 일반적으로 크로마토그래피 단계 동안 생체특이적 리간드에 대해 특이적인 결합 친화성을 보유하고, 반면에 혼합물 내 다른 용질 및/또는 단백질은 리간드에 인지가능하게 또는 특이적으로 결합하지 않는다. 고정화된 리간드에 대한 관심 단백질의 결합은 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 크로마토그래피 매트릭스를 통해 통과하도록 하는 동시에, 관심 단백질이 고체 상 물질 상의 고정화된 리간드에 특이적으로 결합된 채로 남아있도록 한다. 이어서, 특이적으로 결합된 관심 단백질은 고정화된 리간드로부터 적합한 조건 (예를 들어, 낮은 pH, 높은 pH, 고농도 염, 경쟁 리간드 등) 하에 활성 형태로 제거되고, 앞서 칼럼을 통해 통과하도록 한 오염 단백질 또는 단백질 불순물을 함유하지 않는 용리 완충제와 함께 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과된다. 임의의 구성요소가 그의 각각의 특이적 결합 단백질, 예를 들어, 항체를 정제하기 위한 리간드로서 사용될 수 있다. 그러나, 본 개시내용에 따른 다양한 방법에서는, 단백질 A가 Fc 영역 함유 표적 단백질을 위한 리간드로서 사용된다. 표적 단백질 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질)의 생체특이적 리간드 (예를 들어, 단백질 A)로부터의 용리를 위한 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 G 또는 단백질 L 또는 그의 기능적 변이체가 생체특이적 리간드로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체특이적 리간드 예컨대 단백질 A는 Fc 영역 함유 단백질에 대한 결합, 세척 또는 생체특이적 리간드/표적 단백질 접합체의 재평형화를 위해 5-9의 pH 범위에서 사용된 다음에, 적어도 1종의 염을 함유하는 약 4 또는 4 미만의 pH를 갖는 완충제를 사용한 용리가 이어진다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "정제하는", "분리하는" 또는 "단리하는"은 관심 단백질 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 관심 단백질의 순도의 정도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 관심 단백질의 순도의 정도는 조성물로부터 적어도 1종의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
본원에 사용된 용어 "완충제"는 용액 내 그의 존재로 인해, pH에서의 단위 변화를 유발하기 위해 첨가되어야 하는 산 또는 알칼리의 양을 증가시키는 물질을 지칭한다. 완충된 용액은 산-염기 접합체 구성요소의 작용에 의해 pH에서의 변화에 저항한다. 생물학적 시약과 함께 사용하기 위한 완충된 용액은 일반적으로 용액의 pH가 생리학적 범위 내에 있도록 수소 이온의 일정한 농도를 유지할 수 있다. 전통적인 완충제 구성요소는 유기 및 무기 염, 산 및 염기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "전도도"는 2개의 전극 사이에 전기 전류를 전도하는 수용액의 능력을 지칭한다. 용액에서는, 이온 수송에 의해 전류가 흐른다. 따라서, 수용액에 존재하는 이온의 양이 증가함에 따라, 용액은 보다 높은 전도도를 가질 것이다. 전도도의 측정 단위는 센티미터당 밀리지멘스 (mS/cm)이며, 전도도 미터를 사용하여 측정될 수 있다.
크로마토그래피와 관련하여 본원에 사용된 용어 "크로마토그래피 칼럼" 또는 "칼럼"은 크로마토그래피 매트릭스 또는 수지가 충전되는, 빈번하게는 실린더 또는 중공 기둥 형태의 용기를 지칭한다. 크로마토그래피 매트릭스 또는 수지는 정제를 위해 이용되는 물리적 및/또는 화학적 특성을 제공하는 물질이다.
용어 "이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피"는 관심 용질이 혼합물 내 용질 불순물 또는 오염물질보다 더 많이 또는 더 적게 하전된 화합물과 비-특이적으로 상호작용하도록 pH 및 전도도의 적절한 조건 하에, 이온화가능한 관심 용질 (예를 들어, 혼합물 내 관심 단백질)이 고체 상 이온 교환 물질에 연결된 (예를 들어, 공유 부착에 의해) 반대로 하전된 리간드와 상호작용하는 크로마토그래피 공정을 지칭한다. 혼합물 내 오염 용질은 이온 교환 물질의 칼럼으로부터 세척될 수 있거나 또는 관심 용질보다 더 빠르게 또는 더 느리게 수지에 결합되거나 또는 수지로부터 배제된다. "이온-교환 크로마토그래피"는 구체적으로 양이온 교환 (CEX), 음이온 교환 (AEX), 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한다.
"양이온 교환 수지" 또는 "양이온 교환 막"은 음으로 하전되어 있으며, 고체 상 위로 또는 그를 통해 통과하는 수용액 내 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고체 상을 지칭한다. 양이온 교환 수지를 형성하기에 적합한, 고체상에 부착되는 임의의 음으로 하전된 리간드, 예를 들어, 카르복실레이트, 술포네이트 및 하기 기재된 바와 같은 다른 것들이 사용될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 양이온 교환 수지는, 예를 들어, 술포네이트 계열 기 (예를 들어, 모노S, 미니S, 소스 15S 및 30S, SP 세파로스® 패스트 플로우, SP 세파로스® 하이 퍼포먼스, 캅토 S, 캅토 SP ImpRes (지이 헬스케어(GE Healthcare)), 도요펄(TOYOPEARL)® SP-650S 및 SP-650M (도소(Tosoh)), 마크로-프렙(MACRO-PREP)® 하이 S (바이오라드(BioRad)), 세라믹 하이퍼D S, 트리스아크릴(TRISACRYL)® M 및 LS SP 및 스페로덱스 LS SP (폴 테크놀로지스(Pall Technologies))); 술포에틸 계열 기 (예를 들어, 프락토겔(FRACTOGEL)® SE (EMD), 포로스(POROS)® S-10 및 S-20 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))); 술포프로필 계열 기 (예를 들어, TSK 겔 SP 5PW 및 SP-5PW-HR (도소), 포로스® HS-20, HS 50 및 포로스® XS (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))); 술포이소부틸 계열 기 (예를 들어, 프락토겔® EMD SO3 - (EMD)); 술폭시에틸 계열 기 (예를 들어, SE52, SE53 및 익스프레스-이온 S (와트만(Whatman))), 카르복시메틸 계열 기 (예를 들어, CM 세파로스® 패스트 플로우 (지이 헬스케어), 히드로셀 CM (바이오크롬 랩스 인크.(Biochrom Labs Inc.)), 마크로-프렙® CM (바이오라드), 세라믹 하이퍼D CM, 트리스아크릴® M CM, 트리스아크릴® LS CM (폴 테크놀로지스), 매트렉스 셀루파인(CELLUFINE)® C500 및 C200 (밀리포어(Millipore)), CM52, CM32, CM23 및 익스프레스-이온 C (와트만), 도요펄® CM-650S, CM-650M 및 CM-650C (도소)); 술폰산 및 카르복실산 계열 기 (예를 들어, 베이커본드® 카르복시-술폰 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker))); 카르복실산 계열 기 (예를 들어, WP CBX (제이. 티 베이커), 다우엑스(DOWEX)® MAC-3 (다우 리퀴드 세퍼레이션즈(Dow Liquid Separations)), 앰버라이트(AMBERLITE)® 약 양이온 교환체, 다우엑스® 약 양이온 교환체, 및 다이아이온(DIAION)® 약 양이온 교환체 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 프락토겔® EMD COO-- (EMD)); 술폰산 계열 기 (예를 들어, 히드로셀 SP (바이오크롬 랩스 인크.), 다우엑스® 파인 메쉬 강산 양이온 수지 (다우 리퀴드 세퍼레이션즈), 우노스피어 S, WP 술포닉 (제이. 티. 베이커), 사토바인드® S 멤브레인 (사토리우스(Sartorius)), 앰버라이트® 강 양이온 교환체, 다우엑스® 강 양이온 및 다이아이온® 강 양이온 교환체 (시그마-알드리치)); 또는 오르토포스페이트 계열 기 (예를 들어, P11 (와트만))를 갖는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 양이온 교환 수지는 카르복시-메틸-셀룰로스, 베이커본드 ABX™, 세라믹 하이퍼D Z, 매트렉스 셀루파인 C500, 매트렉스 셀루파인 C200을 포함한다.
"음이온 교환 수지" 또는 "음이온 교환 막"은 양으로 하전되어 있으며, 따라서 그에 부착된 1개 이상의 양으로 하전된 리간드를 갖는 고체 상을 지칭한다. 음이온 교환 수지를 형성하기에 적합한, 고체 상에 부착되는 임의의 양으로 하전된 리간드, 예컨대 4급 아미노 기가 사용될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로스, 포로스® PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 (어플라이드 바이오시스템즈), 사토바인드® Q (사토리우스), 모노Q, 미니Q, 소스 15Q 및 30Q, Q, DEAE 및 ANX 세파로스® 패스트 플로우, Q 세파로스® 하이 퍼포먼스, QAE 세파덱스(SEPHADEX)® 및 FAST Q 세파로스® (지이 헬스케어), WP PEI, WP DEAM, WP QUAT (제이. 티. 베이커), 히드로셀 DEAE 및 히드로셀 QA (바이오크롬 랩스 인크.), 우노스피어 Q, 마크로-프렙® DEAE 및 마크로-프렙® 하이 Q (바이오라드), 세라믹 하이퍼D Q, 세라믹 하이퍼D DEAE, 트리스아크릴® M 및 LS DEAE, 스페로덱스 LS DEAE, QMA 스페로실(SPHEROSIL)® LS, QMA 스페로실® M 및 무스탕(MUSTANG)® Q (폴 테크놀로지스), 다우엑스® 파인 메쉬 강염기 타입 I 및 타입 II 음이온 수지 및 다우엑스® 모노스피어 77 약염기 음이온 (다우 리퀴드 세퍼레이션즈), 인터셉트(INTERCEPT)® Q 멤브레인, 매트렉스 셀루파인® A200, A500, Q500 및 Q800 (밀리포어), 프락토겔® EMD TMAE, 프락토겔® EMD DEAE 및 프락토겔® EMD DMAE (EMD), 앰버라이트® 약 및 강 음이온 교환체 타입 I 및 II, 다우엑스® 약 및 강 음이온 교환체 타입 I 및 II, 다이아이온® 약 및 강 음이온 교환체 타입 I 및 II, 듀오라이트(DUOLITE)® (시그마-알드리치), TSK 겔 Q 및 DEAE 5PW 및 5PW-HR, 도요펄® 슈퍼Q-650S, 650M 및 650C, QAE-550C 및 650S, DEAE-650M 및 650C (도소), QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, 익스프레스-이온 D 또는 익스프레스-이온 Q (와트만), 및 사토바인드® Q (미국 뉴욕 소재의 사토리우스 코포레이션)를 포함한다. 다른 음이온 교환 수지는 포로스 XQ, 사토바인드® Q, Q 세파로스™ XL, Q 세파로스™ 빅 비드, DEAE 세파덱스 A-25, DEAE 세파덱스 A-50, QAE 세파덱스 A-25, QAE 세파덱스 A-50, Q 세파로스™ 하이 퍼포먼스, Q 세파로스™ XL, 리소스 Q, 캅토 Q, 캅토 DEAE, 도요펄 기가캡 Q, 프락토겔 EMD TMAE 하이캡, 누비아 Q 또는 PORGS PI를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "통류" 또는 "통류 방식"은 오염물질이 크로마토그래피 공정에 의해, 통상적으로 칼럼 내 수지에 결합되어 보유되기 때문에 이들이 크로마토그래피 동안 혼합물로부터 제거되는 일반적인 정제 접근법을 지칭한다. 관심 단백질은 크로마토그래피 매질, 통상적으로는 칼럼 내 수지에 결합하지 않으며 (또는 오염물질보다 덜 강하게 결합하며), 대신에 그를 통해 유동하여 수집되기 때문에 이들이 정제된다. 관심 단백질의 용리 후에, 칼럼이 이어서 또 다른 크로마토그래피 전개를 위해 재생될 수 있도록, 칼럼에 결합되어 있는 불순물은 칼럼으로부터 "스트리핑" 또는 제거되어야 한다. 이러한 접근법은 표적 관심 단백질이 칼럼 상에 보유되고 불순물이 칼럼을 통해 유동하는 "결합-용리" 또는 "결합-용리 방식"과는 상이하다. 이러한 공정은 크로마토그래피 매질, 통상적으로는 칼럼 내 수지에 대한 관심 단백질의 결합을 방해하는 상이한 칼럼 조건을 사용하는 관심 단백질의 특이적 용리를 후속적으로 수반한다.
본원에 사용된 용어 "오염물질"은 그의 가장 넓은 의미로 혼합물 내의 임의의 바람직하지 않은 구성요소 또는 화합물을 포괄하도록 사용된다. 세포 배양물, 세포 용해물 또는 정화된 벌크 (예를 들어, 정화된 세포 배양물 상청액)에서, 오염물질은, 예를 들어, 세포 배양물 배지에 존재하는 숙주 세포 핵산 (예를 들어, DNA) 및 숙주 세포 단백질을 포함한다. 숙주 세포 오염물질 단백질은, 비제한적으로, 숙주 세포에 의해 자연적으로 또는 재조합에 의해 생산된 것들, 뿐만 아니라 관심 단백질과 관련되거나 또는 그로부터 유래된 단백질 (예를 들어, 단백질분해 단편) 및 다른 공정 관련된 오염물질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 오염물질 침전물은 또 다른 수단, 예컨대 원심분리, 멸균 여과, 심층 여과 및 접선 유동 여과를 사용하여 세포 배양물로부터 분리된다.
용어 "항체"는, 일부 실시양태에서, 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (본원에서 CH로서 약칭됨)으로 구성된다. 일부 항체, 예를 들어, 자연 발생 IgG 항체에서, 중쇄 불변 영역은 힌지 및 3개의 도메인, 즉, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 일부 항체, 예를 들어, 자연 발생 IgG 항체에서, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (본원에서 CL로서 약칭됨)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 명명되는 보다 잘 보존된 영역이 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 명명되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 중쇄는 C-말단 리신을 가질 수 있거나 또는 갖지 않을 수 있다. 용어 "항체"는 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "IgG 항체", 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 항체는, 일부 실시양태에서, 자연 발생 IgG 항체의 구조를 가지며, 즉, 동일한 하위부류의 자연 발생 IgG 항체와 동일한 수의 중쇄 및 경쇄 및 디술피드 결합을 갖는다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체는 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC)로 이루어질 수 있으며, 여기서 2개의 HC 및 LC는 자연 발생 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 항체에서 각각 발생하는 동일한 수 및 위치의 디술피드 가교에 의해 연결된다 (항체가 돌연변이되어 디술피드 가교가 변형되어 있지 않은 경우).
이뮤노글로불린은 IgA, 분비형 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 임의의 통상적으로 공지된 이소타입의 것일 수 있다. IgG 이소타입은 특정 종의 하위부류: 인간의 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 마우스의 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3으로 분류된다. 이뮤노글로불린, 예를 들어, IgG1은 많아야 몇몇 아미노산이 서로 상이한 여러 동종이형이 존재한다. "항체"는, 예로서, 자연 발생 및 비-자연 발생 항체 둘 다; 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 및 비인간 항체 및 완전 합성 항체를 포함한다.
본원에 사용된 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 제시된 바 있다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편 (파파인 절단으로부터의 단편) 또는 VL, VH, LC 및 CH1 도메인으로 이루어진 유사한 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편 (펩신 절단으로부터의 단편) 또는 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 유사한 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 게다가, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)로서 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성한 단일 단백질 쇄로서 만들어지도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수도 있다. 이러한 단일 쇄 항체도 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되도록 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어, 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합체의, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다.
본원에 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE 항체)를 지칭한다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회에 의해 권장되는 그의 통상적으로 공지된 3문자 기호 또는 1-문자 기호에 의해 본원에서 지칭된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드도 그의 통상적으로 허용되는 단일-문자 코드에 의해 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합 (또한 펩티드 결합이라고도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하며, 특정 길이의 산물을 지칭하지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "단백질"은, 일부 경우에 아미드 결합 이외의 결합에 의해 회합될 수 있는 1개 이상의 폴리펩티드로 구성된 분자를 포괄하도록 의도된다. 다른 한편으로는, 단백질은 또한 단일 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 이러한 후자의 경우에, 단일 폴리펩티드 쇄는 일부 경우에 함께 융합되어 단백질을 형성하는 2개 이상의 폴리펩티드 서브유닛을 포함할 수 있다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해적 절단, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 비제한적으로 포함한 발현-후 변형의 산물을 지칭한다. 폴리펩티드 또는 단백질은 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있으나, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 이는 화학적 합성을 포함한 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 단일의 핵산 뿐만 아니라 복수의 핵산을 포괄하도록 의도되며, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA), 상보적 DNA (cDNA) 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 지칭한다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적인 결합 (예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함한다.
용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 1개 이상의 핵산 세그먼트, 예를 들어, DNA, cDNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 적용되는 경우에, 용어 "단리된"은 그의 원래 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 지칭하며, 예를 들어, 벡터에 함유되어 있는 항원 결합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 개시내용의 목적상 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예는 이종 숙주 세포에 유지되거나 또는 용액 내 다른 폴리뉴클레오티드로부터 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 개시내용에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생산된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 추가로, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결 신호를 포함할 수 있다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"이라는 용어는 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 하는 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 고려하여, 비교 윈도우에 걸쳐 서열에 의해 공유된 동일하게 매칭된 위치의 수를 지칭한다. 매칭된 위치는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 표적 및 참조 서열 둘 다에 존재하는 임의의 위치이다. 갭은 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니기 때문에, 표적 서열에 존재하는 갭은 카운팅되지 않는다. 마찬가지로, 참조 서열로부터의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니라, 표적 서열 뉴클레오티드 또는 아미노산이 카운팅되기 때문에, 참조 서열에 존재하는 갭도 카운팅되지 않는다. 서열 동일성의 백분율은 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 서열 둘 다에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우 내 전체 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 서열 동일성의 결정은 용이하게 이용가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 달성될 수 있다. 적합한 소프트웨어 프로그램이 다양한 공급원으로부터, 단백질 및 뉴클레오티드 서열 둘 다의 정렬을 위해 이용가능하다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 하나의 적합한 프로그램은 미국 정부의 국립 생물 정보 센터 BLAST 웹 사이트 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용가능한 프로그램의 BLAST 묶음의 일부인 bl2seq이다. bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 2개의 서열 사이의 비교를 실행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는데 사용되는 반면에, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는데 사용된다.
단백질의 "등전점" 또는 "pI"라는 용어는 단백질이 알짜 전하를 보유하지 않는 용액의 pH의 측정치를 지칭한다. 단백질이 그의 pI와 같은 pH에서 발견되는 경우에, 이는 전체적으로 중성인 알짜 전기 전하를 보유할 것이다. 그의 용액의 pH보다 더 낮은 pI를 갖는 단백질은 알짜 음전하를 보유할 것이다. 마찬가지로, 그의 용액의 pH보다 더 높은 pI를 갖는 단백질은 알짜 양전하를 보유할 것이다.
용어 "로딩 완충제"는 혼합물 또는 샘플을 제조하고 그를 크로마토그래피 유닛 내로 로딩하는데 사용되는 완충제를 지칭한다.
용어 "체이스 완충제"는 혼합물 또는 샘플을 크로마토그래피 공정을 통해 구동하기 위해, 로딩 완충제 다음에 사용되는 완충제를 지칭한다.
용어 "인라인 조정"은 크로마토그래피 단계 사이에서 용액 조건 또는 조성을 조정하기 위한 AEX와 CEX 사이 또는 CEX와 AEX 사이에서의 혼합물 또는 용액의 임의의 첨가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, AEX-CEX 순서가 사용되고, 혼합물이 AEX에서 나온 후 CEX에 들어가기 전에 pH 및/또는 전도도 조정이 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, CEX-AEX 순서가 사용되고, 혼합물이 CEX에서 나온 후 AEX에 들어가기 전에 pH 또는 전도도 조정이 이루어지지 않는다.
용어 "HMW 종"은 혼합물에 존재하는 임의의 1종 이상의 원치 않는 단백질을 지칭한다. 고분자량 종은 이량체, 삼량체, 사량체 또는 다른 다량체를 포함할 수 있다. 이들 종은 종종 산물 관련된 불순물로 간주되고, 공유 또는 비-공유 연결될 수 있으며, 또한, 예를 들어, 소수성 아미노산 잔기가 극성 용매에 노출되어 응집을 유발할 수 있는 미스폴딩된 단량체로 이루어질 수 있다.
용어 "LMW 종"은 혼합물에 존재하는 임의의 1종 이상의 원치 않는 종을 지칭한다. 저분자량 종은 종종 산물 관련된 불순물로 간주되고, 이량체 (예컨대 모노클로날 항체)이도록 의도된 화합물에 대해 클리핑된 종 또는 반쪽 분자를 포함할 수 있다.
용어 "숙주 세포 단백질" 또는 HCP는 의도된 관심 단백질의 생산과 관련 없는, 숙주 세포에 의해 생성된 바람직하지 않은 단백질을 지칭한다. 바람직하지 않은 숙주 세포 단백질은 업스트림 세포 배양물 상청액으로 배출될 수 있다. 바람직하지 않은 숙주 세포 단백질은 또한 세포 용해 동안 방출될 수 있다. 업스트림 세포 배양을 위해 사용되는 세포는 성장, 전사 및 단백질 합성을 위해 단백질을 요구하며, 이들 관련 없는 단백질은 최종 약물 제품에서 바람직하지 않다.
용어 "잔류 단백질 A" (rPA)는 원래는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포벽에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 단백질 A는 대략 42 kDa이고, 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 매우 강하게 결합하며, 항체의 정제에서의 그의 용도가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 단백질 A는 정제를 위해 관련 기술분야에서 광범위하게 사용되어 왔다 (Boyle et al., 1993; Hou et al. 1991). 단백질 A에 적용되는 경우에, 용어 "잔류" 또는 "rPA"는 제조 공정에서의 추가의 업스트림에서 관심 단백질 또는 항체의 정제에서의 사용으로 인해 혼합물에 존재하는 임의의 잔류하는 단백질 A를 지칭한다.
용어 "완충제 전이 피크"는 크로마토그래피 동안의 변화하는 조건으로 인한 원치 않는 크로마토그래피 용리를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제1 완충제는 크로마토그래피의 처음에 사용되는 로딩 완충제이다. 일부 실시양태에서, 제2 완충제는 처음에 로딩된 혼합물을 크로마토그래피 공정을 통해 체이싱하는데 사용되는 체이스 완충제이다. 완충제 전이 피크는 로딩 완충제의 사용으로부터 체이스 완충제의 사용으로의 전이 동안 나타날 수 있다. 다른 실시양태에서, 완충제 전이 피크는 제1 완충제, 예를 들어, 로딩 완충제와 제2 완충제, 예를 들어, 체이스 완충제 사이의 차이로 인해 발생될 수 있다.
본 개시내용의 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 더욱 상세히 기재된다.
II. 정제 방법
본 개시내용은 혼합물로부터 관심 단백질을 정제하는 방법으로서, 조합된 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 및 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX) 또는 조합된 AEX 및 CEX ("조합된 크로마토그래피")를 통류 방식으로 조작 조건 하에 수행하는 것을 포함하며, 여기서 AEX와 CEX (또는 CEX와 AEX) 사이에서 조작 조건에 대한 변화가 가해지지 않는 것인 방법에 관한 것이다. AEX와 CEX (또는 CEX와 AEX) 사이에서 조작 조건에 대한 변화가 없는 것은 자동화, 공학 제어 및/또는 인라인 조정이 없는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. AEX와 CEX (또는 CEX와 AEX) 공정 사이에서 임의의 변화가 가해지는 것을 피하기 위해, 일부 실시양태에서, AEX 및 CEX (또는 CEX 및 AEX)는 도 1에 제시된 바와 같이 서로에 직접 연결될 수 있다. 다른 실시양태에서, AEX 및 CEX (또는 CEX 및 AEX)는 서로에 직접 연결되지 않지만, AEX와 CEX (또는 CEX와 AEX) 사이에서 조작 조건 (예를 들어, pH 및/또는 전도도)이 변화되지 않으며, 즉, 동일한 방식으로 유지된다. 조작 조건은 크로마토그래피 동안 완충제의 사용을 통해 변화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 로딩 완충제 및/또는 체이스 완충제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조합된 AEX 및 CEX (또는 CEX 및 AEX) 크로마토그래피 칼럼은 약 50 g/L 수지, 약 60 g/L 수지, 약 70 g/L 수지, 약 80 g/L 수지, 약 90 g/L 수지, 약 100 g/L 수지, 약 110 g/L 수지, 약 120 g/L 수지, 약 130 g/L 수지, 약 140 g/L 수지, 약 150 g/L 수지, 약 160 g/L 수지, 약 170 g/L 수지, 약 180 g/L 수지, 약 190 g/L 수지, 약 200 g/L 수지, 약 210 g/L 수지, 약 220 g/L 수지, 약 230 g/L 수지, 약 240 g/L 수지, 약 250 g/L 수지, 약 260 g/L 수지, 약 270 g/L 수지, 약 280 g/L 수지, 약 290 g/L 수지, 약 300 g/L 수지, 약 310 g/L 수지, 약 320 g/L 수지, 약 330 g/L 수지, 약 340 g/L 수지, 약 350 g/L 수지, 약 360 g/L 수지, 약 370 g/L 수지, 약 380 g/L 수지, 약 390 g/L 수지, 약 400 g/L 수지, 약 410 g/L 수지, 약 420 g/L 수지, 약 430 g/L 수지, 약 440 g/L 수지, 약 450 g/L 수지, 약 460 g/L 수지, 약 470 g/L 수지, 약 480 g/L 수지, 약 490 g/L 수지, 약 500 g/L 수지, 약 510 g/L 수지, 약 520 g/L 수지, 약 530 g/L 수지, 약 540 g/L 수지, 약 550 g/L 수지, 약 560 g/L 수지, 약 570 g/L 수지, 약 580 g/L 수지, 약 590 g/L 수지 또는 약 600 g/L 수지까지 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조합된 AEX 및 CEX (또는 CEX 및 AEX) 크로마토그래피 칼럼은 약 300 g/L 수지까지 로딩된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에서의 관심 단백질은, 완충제의 pH가 단백질의 측정된 pI와 상이하다면, 완충제 용액 중에 위치할 때 전하를 보유할 수 있다. 관심 단백질이 그의 pI와 같은 pH에서 발견되는 경우에, 이는 전체적으로 중성인 알짜 전기 전하를 보유할 것이다. 용액의 pH보다 더 낮은 pI를 갖는 관심 단백질은 알짜 음전하를 보유할 것이다. 마찬가지로, 용액의 pH보다 더 높은 pI를 갖는 관심 단백질은 알짜 양전하를 보유할 것이다.
완충제 pH 및 이온 강도가 모든 형태의 이온 교환 크로마토그래피에 있어서 결정적이며, 따라서 염 농도가 조정된 후에는 완충제 pH를 재조정하고 완충제 반대이온이 상용성임을 보장하는 것이 최상이라는 것이 널리 공지되어 있다. 완충제 반대이온이 수지와 동일한 전하를 가져야 한다는 것이 공지되어 있다. 특히 두 반대 크로마토그래피 단계 (예를 들어, AEX 및 CEX)가 함께 조합된 경우에는, AEX 및 CEX를 위한 pH 및/또는 전도도가 그 사이에서 조정될 것이라고 예상된 바 있다.
본 방법은, 예를 들어, 통류 방식의 조합된 AEX 및 CEX (또는 CEX 및 AEX) 크로마토그래피를 위한 특정 조작 조건이 AEX와 CEX (또는 그 반대의 경우) 사이에서의 임의의 조정 없이 유지될 수 있다는 놀라운 발견에 기반한다.
일부 실시양태에서, 조합된 AEX 및 CEX (또는 CEX 및 AEX)를 위한 조작 조건은 관심 단백질의 pI에 기반하여 제1 크로마토그래피 전에 설정되고 계속해서 유지된다. 다른 실시양태에서, 조작 조건은 2개의 상이한 pI, 예를 들어, 중간 내지 높은 pI 및 낮은 pI에 기반하여 설정된다. 일부 실시양태에서, 조작 조건은 중간 내지 높은 pI, 예를 들어, ≥ 약 6.5의 pI를 갖는 관심 단백질 및 낮은 pI, 예를 들어, < 6.5의 pI를 갖는 관심 단백질에 대해 설정된다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질은 중간 내지 높은 pI를 가지며, 이는 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9 또는 약 8.0 초과이다. 일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질은 ≥ 6.5 (초과)의 pI 및 ≤ 약 12.0, 약 11.9, 약 11.8, 약 11.7, 약 11.6, 약 11.5, 약 11.4, 약 11.3, 약 11.2, 약 11.1, 약 11.0, 약 10.9, 약 10.8, 약 10.8, 약 10.7, 약 10.6, 약 10.5, 약 10.4, 약 10.3, 약 10.2, 약 10.1 또는 약 10.0 (미만)의 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질은 ≥ 6.5 (초과)의 pI 및 ≤ 약 10.0, 약 9.9, 약 9.8, 약 9.7, 약 9.6, 약 9.5, 약 9.4, 약 9.3, 약 9.2, 약 9.1, 약 9.0, 약 8.9, 약 8.8, 약 8.7, 약 8.6, 약 8.5, 약 8.4, 약 8.3, 약 8.2, 약 8.1 또는 약 8.0 (미만)의 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질은 약 7.0 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.9, 약 7.1 내지 약 10.9, 약 7.2 내지 약 10.9, 약 7.2 내지 약 10.8, 약 7.3 내지 약 10.8, 약 7.3 내지 약 10.7, 약 7.4 내지 약 10.7, 약 7.4 내지 약 10.6, 약 7.5 내지 약 10.6, 약 7.5 내지 약 10.5, 약 7.6 내지 약 10.5, 약 7.6 내지 약 10.4, 약 7.7 내지 약 10.4, 약 7.7 내지 약 10.3, 약 7.8 내지 약 10.3, 약 7.8 내지 약 10.2, 약 7.9 내지 약 10.2, 약 7.9 내지 약 10.1, 약 8.0 내지 약 10.1, 약 8.0 내지 약 10.0, 약 8.1 내지 약 10.0, 약 8.1 내지 약 9.9, 약 8.2 내지 약 9.9, 약 8.2 내지 약 9.8, 약 8.3 내지 약 9.8, 약 8.3 내지 약 9.7, 약 8.4 내지 약 9.7, 약 8.4 내지 약 9.6, 약 8.5 내지 약 9.6 또는 약 8.5 내지 약 9.5의 pI를 갖는다. 다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 약 10.0, 약 10.5 또는 약 11.0의 pI를 갖는다.
일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질은 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.6의 pI를 갖는다. 다른 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질은 약 8.0 내지 약 9.0, 예를 들어, 약 8.4의 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질은 8.5 내지 9.5, 예를 들어, 약 8.9의 pI를 갖는다. 다른 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질은 약 9.0 내지 약 10.0의 pI를 갖는다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질은 낮은 pI를 가지며, 이는 약 6.5, 약 6.4, 약 6.3, 약 6.2, 약 6.1, 약 6.0, 약 5.9, 약 5.8, 약 5.7, 약 5.6, 약 5.5, 약 5.4, 약 5.3, 약 5.2, 약 5.1 또는 약 5.0 미만이다. 일부 실시양태에서, 낮은 pI를 갖는 관심 단백질은 6.5 미만 및 약 1.0, 약 2.0, 약 3.0, 약 4.0, 약 5.0 또는 약 5.5 초과의 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 낮은 pI를 갖는 관심 단백질은 약 1.0 내지 약 6.5, 약 1.5 내지 약 6.5, 약 2.0 내지 약 6.5, 약 2.5 내지 약 6.5, 약 2.5 내지 약 6.0, 약 3.0 내지 약 6.5, 약 3.0 내지 약 6.0, 약 3.0 내지 약 5.5, 약 3.5 내지 약 5.5 또는 약 3.5 내지 약 5.0의 pI를 갖는다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질은 약 4.8 내지 약 6.5, 약 4.9 내지 약 6.5, 약 4.9 내지 약 6.4, 약 5.0 내지 약 6.4, 약 5.0 내지 약 6.3, 약 5.1 내지 약 6.3, 약 5.1 내지 약 6.2, 약 5.2 내지 약 6.2, 약 5.2 내지 약 6.4 또는 약 5.3 내지 약 6.4의 등전점 (pI)을 갖는다. 다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 5.0 내지 약 6.0의 pI를 갖는다.
특정 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질 및 낮은 pI를 갖는 관심 단백질을 위한 적어도 하나의 조작 조건 (예를 들어, pH)이 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질 및 낮은 pI를 갖는 관심 단백질을 위한 로딩 완충제 및/또는 체이스 완충제의 pH가 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질 및 낮은 pI를 갖는 관심 단백질을 위한 로딩 완충제 및/또는 체이스 완충제의 pH가 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조합된 크로마토그래피를 위한 로딩 완충제는 ≥ 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5 또는 약 10.0 (초과)의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 또는 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 또는 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 약 9.0, 약 9.1, 약 9.2, 약 9.3, 약 9.4, 약 9.5, 약 9.6, 약 9.7, 또는 약 9.8, 약 9.9 또는 약 10.0 초과의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 또는 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 또는 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 약 9.0, 약 9.1, 약 9.2, 약 9.3, 약 9.4, 약 9.5, 약 9.6, 약 9.7, 약 9.8, 약 9.9 또는 약 10.0의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 조합된 크로마토그래피를 위한 로딩 완충제는 약 6.0 내지 약 11.0, 약 6.5 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.5, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 9.5, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 8.5, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.5, 약 7.0 내지 7.4, 약 7.1 내지 약 7.4, 약 7.2 내지 약 7.4의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 조합된 크로마토그래피를 위한 로딩 완충제는 약 6.5, 약 7.0, 약 7.2, 약 7.4, 약 7.6, 약 7.8, 약 8.0, 약 8.2, 약 8.4, 약 8.6, 약 8.8, 약 9.0, 약 9.2, 약 9.4, 약 9.6, 약 9.8, 약 10.0, 약 10.5, 약 11.0 또는 약 11.5의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질은 약 7.0 내지 약 8.0 (예를 들어, 약 7.6)의 중간 내지 높은 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.4의 pH를 갖는다.
다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 8.0 내지 약 9.0 (예를 들어, 약 8.4)의 중간 내지 높은 pI를 가지며, 단백질의 로딩 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.2의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질은 8.5 내지 9.5 (예를 들어, 약 8.9)의 중간 내지 높은 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제는 약 7.5 내지 약 8.5, 예를 들어, 약 8.0의 pH를 갖는다.
다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 9.0 내지 약 10.0 (예를 들어, 약 9.2)의 중간 내지 높은 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.2의 pH를 갖는다.
다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 5.0 내지 약 6.0, 예를 들어, 약 5.8의 낮은 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제는 약 6.5 내지 약 7.5, 예를 들어, 약 7.0의 pH를 갖는다.
다른 실시양태에서, 조합된 크로마토그래피를 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 동일한 조작 조건을 갖는다. 특정 실시양태에서, 완충제 조건, 예를 들어, pH는 로딩 완충제와 체이스 완충제 사이에 동일하게 유지된다. 다른 실시양태에서, 로딩 완충제와 체이스 완충제 사이의 완충제 조건은 상이하다.
일부 실시양태에서, 체이스 완충제는 ≥ 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5 또는 약 10.0 (초과)의 pH를 갖는다. 다른 실시양태에서, 체이스 완충제는 ≥ 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 또는 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 또는 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 약 9.0, 약 9.1, 약 9.2, 약 9.3, 약 9.4, 약 9.5, 약 9.6, 약 9.7, 약 9.8, 약 9.9, 약 10.0, 약 10.1, 약 10.2, 약 10.3, 약 10.4, 약 10.5, 약 10.6, 약 10.7, 약 10.8, 약 10.9 또는 약 11.0 (초과)의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 또는 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 또는 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 약 9.0, 약 9.1, 약 9.2, 약 9.3, 약 9.4, 약 9.5, 약 9.6, 약 9.7, 약 9.8, 약 9.9, 약 10.0, 약 10.1, 약 10.2, 약 10.3, 약 10.4, 약 10.5, 약 10.6, 약 10.7, 약 10.8, 약 10.9 또는 약 11.0의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 6.0 내지 약 11.0, 약 6.5 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.5, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 9.5, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 8.5, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.5, 약 7.0 내지 7.4, 약 7.1 내지 약 7.4 또는 약 7.2 내지 약 7.4의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 6.5, 약 7.0, 약 7.2, 약 7.4, 약 7.6, 약 7.8, 약 8.0, 약 8.2, 약 8.4, 약 8.6, 약 8.8, 약 9.0, 약 9.2, 약 9.4, 약 9.6, 약 9.8, 약 10.0, 약 10.5, 약 11.0 또는 약 11.5의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 체이스 완충제는 약 6.0 내지 약 11.0, 약 6.5 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 8.5, 약 7.0 내지 약 9.5, 약 6.5 내지 약 8.5 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질은 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.6의 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.4의 동일한 pH를 갖는다.
다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 8.0 내지 약 9.0, 예를 들어, 약 8.4의 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.2의 동일한 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질은 8.5 내지 약 9.5, 예를 들어, 약 8.9의 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 약 7.5 내지 약 8.5, 예를 들어, 약 8.0의 동일한 pH를 갖는다.
다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 9.0 내지 약 10.0, 예를 들어, 약 9.2의 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.2의 동일한 pH를 갖는다.
다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 5.0 내지 약 6.0, 예를 들어, 약 5.8의 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 약 6.5 내지 약 7.5, 예를 들어, 약 7.0의 동일한 pH를 갖는다.
다른 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질 및 낮은 pI를 갖는 관심 단백질을 위한 조작 조건은 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질 및 낮은 pI를 갖는 관심 단백질을 위한 전도도는 상이하다. 일부 실시양태에서, 낮은 pI를 갖는 단백질을 위한 전도도가 중간 내지 높은 pI를 갖는 단백질을 위한 전도도보다 더 높다.
일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질의 로딩 완충제 및/또는 체이스 완충제의 전도도는 약 0.1 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 0.5 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 1.0 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 2.0 mS/cm 내지 약 8.0 mS/cm, 약 2.0 mS/cm 내지 약 7.0 mS/cm, 약 2.0 mS/cm 내지 약 8.5 mS/cm, 약 2.0 mS/cm 내지 약 7.5 mS/cm 또는 약 2.5 mS/cm 내지 약 7.0 mS/cm이다. 일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질의 로딩 완충제 및/또는 체이스 완충제의 전도도는 약 2.5 mS/cm 내지 약 7.0 mS/cm이다.
일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질의 로딩 완충제 및/또는 체이스 완충제의 전도도는 약 0.1 mS/cm, 약 0.5 mS/cm, 약 1.0 mS/cm, 약 1.5 mS/cm, 약 2.0 mS/cm, 약 2.5 mS/cm, 약 3.0 mS/cm, 약 3.5 mS/cm, 약 4.0 mS/cm, 약 4.5 mS/cm, 약 5.0 mS/cm, 약 5.5 mS/cm, 약 6.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 7.0 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 8.0 mS/cm, 약 8.5 mS/cm 또는 약 9.0 mS/cm이다.
일부 실시양태에서, 중간 내지 높은 pI를 갖는 관심 단백질을 위한 로딩 완충제 및/또는 체이스 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0의 pH 및 약 2.0 mS/cm 내지 약 7.0 mS/cm, 예를 들어, 약 2.0 mS/cm, 약 2.5 mS/cm, 약 2.7 mS/cm, 약 3.0 mS/cm, 약 3.2 mS/cm, 약 3.5 mS/cm, 약 4.0 mS/cm, 약 4.5 mS/cm, 약 5.0 mS/cm, 약 5.5 mS/cm, 약 6.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 6.8 mS/cm 또는 약 7.0 mS/cm의 전도도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 낮은 pI를 갖는 관심 단백질의 로딩 완충제 및/또는 체이스 완충제의 전도도는 약 6.0 mS/cm 내지 약 15.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm 내지 약 15 mS/cm, 약 7.0 mS/cm 내지 약 14.0 mS/cm, 약 8.0 mS/cm 내지 약 13.0 mS/cm, 약 8.0 mS/cm 내지 약 12.0 mS/cm 또는 약 9.0 mS/cm 내지 약 12.0 mS/cm이다.
일부 실시양태에서, 낮은 pI를 갖는 관심 단백질의 로딩 완충제 및/또는 체이스 완충제의 전도도는 약 6.0 mS/cm, 약 6.1 mS/cm, 약 6.2 mS/cm, 약 6.3 mS/cm, 약 6.4 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 6.6 mS/cm, 약 6.7 mS/cm, 약 6.8 mS/cm, 약 6.9 mS/cm, 약 7.0 mS/cm, 약 7.1 mS/cm, 약 7.2 mS/cm, 약 7.3 mS/cm, 약 7.4 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 7.6 mS/cm, 약 7.7 mS/cm, 약 7.8 mS/cm, 약 7.9 mS/cm, 약 8.0 mS/cm, 약 8.1 mS/cm, 약 8.2 mS/cm, 약 8.3 mS/cm, 약 8.4 mS/cm, 약 8.5 mS/cm, 약 8.6 mS/cm, 약 8.7 mS/cm, 약 8.8 mS/cm, 약 8.9 mS/cm, 약 9.0 mS/cm, 약 9.1 mS/cm, 약 9.2 mS/cm, 약 9.3 mS/cm, 약 9.4 mS/cm, 약 9.5 mS/cm, 약 9.6 mS/cm, 약 9.7 mS/cm, 약 9.8 mS/cm, 약 9.9 mS/cm, 약 10.0 mS/cm, 약 10.1 mS/cm, 약 10.2 mS/cm, 약 10.3 mS/cm, 약 10.4 mS/cm, 약 10.5 mS/cm, 약 10.6 mS/cm, 약 10.7 mS/cm, 약 10.8 mS/cm, 약 10.9 mS/cm, 약 11.0 mS/cm, 약 11.1 mS/cm, 약 11.2 mS/cm, 약 11.3 mS/cm, 약 11.4 mS/cm, 약 11.5 mS/cm, 약 11.6 mS/cm, 약 11.7 mS/cm, 약 11.8 mS/cm, 약 11.9 mS/cm, 약 12.0 mS/cm, 약 12.1 mS/cm, 약 12.2 mS/cm, 약 12.3 mS/cm, 약 12.4 mS/cm, 약 12.5 mS/cm, 약 12.6 mS/cm, 약 12.7 mS/cm, 약 12.8 mS/cm, 약 12.9 mS/cm, 약 13.0 mS/cm, 약 13.1 mS/cm, 약 13.2 mS/cm, 약 13.3 mS/cm, 약 13.4 mS/cm, 약 13.5 mS/cm, 약 13.6 mS/cm, 약 13.7 mS/cm, 약 13.8 mS/cm, 약 13.9 mS/cm, 약 14.0 mS/cm, 약 14.1 mS/cm, 약 14.2 mS/cm, 약 14.3 mS/cm, 약 14.4 mS/cm, 약 14.5 mS/cm, 약 14.6 mS/cm, 약 14.7 mS/cm, 약 14.8 mS/cm, 약 14.9 mS/cm 또는 약 15.0 mS/cm이다.
일부 실시양태에서, 낮은 pI를 갖는 관심 단백질을 위한 로딩 완충제 및/또는 체이스 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0의 pH 및 약 8.0 mS/cm 내지 13.0 mS/cm의 전도도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질은 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.6의 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.4의 동일한 pH를 가지며, 3.0 mS/cm 내지 6.0 mS/cm, 예를 들어, 각각 3.2 mS/cm 및 5.5 mS/cm의 전도도를 갖는다.
다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 8.0 내지 약 9.0, 예를 들어, 약 8.4의 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.2의 동일한 pH를 가지며, 2.0 mS/cm 내지 4.0 mS/cm, 예를 들어, 각각 2.7 mS/cm 및 3.0 mS/cm의 전도도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질은 8.5 내지 9.5, 예를 들어, 약 8.9의 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 약 7.5 내지 약 8.5, 예를 들어, 약 8.0의 동일한 pH를 가지며, 2.0 mS/cm 내지 5.0 mS/cm, 예를 들어, 각각 3.0 mS/cm 및 4.5 mS/cm의 전도도를 갖는다.
다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 9.0 내지 약 10.0, 예를 들어, 약 9.2의 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 약 7.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 7.2의 동일한 pH를 가지며, 6.0 mS/cm 내지 7.0 mS/cm, 예를 들어, 각각 6.8 mS/cm 및 6.8 mS/cm의 전도도를 갖는다.
다른 실시양태에서, 관심 단백질은 약 5.0 내지 약 6.0, 예를 들어, 약 5.8의 pI를 가지며, 단백질을 위한 로딩 완충제 및 체이스 완충제는 약 6.5 내지 약 7.5, 예를 들어, 약 7.0의 동일한 pH를 가지며, 9.0 mS/cm 내지 12.0 mS/cm, 예를 들어, 각각 9.2 mS/cm 및 12.0 mS/cm의 전도도를 갖는다.
본원에 개시된 방법 (II 및 III)은 숙주 세포 단백질 (HCP), DNA, 고분자량 종 (HMW), 저분자량 종 (LMW), 잔류 단백질 A (rPA) 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 오염물질을 함유하는 혼합물 내 관심 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 (i) DNA를 약 20 pg/mL 이하의 수준으로, (ii) LMW를 약 1.0% 이하의 수준으로, (iii) HMW를 약 1.0% 이하의 수준으로, (iv) HCP를 약 100 ppm 이하의 수준으로, (v) 잔류 단백질 A (rPA)를 약 6 ppm 이하의 수준으로 감소시키거나 또는 그의 임의의 조합으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 DNA를 약 20 pg/mL 이하, 약 18 pg/mL 이하, 약 16 pg/mL 이하, 약 14 pg/mL 이하, 약 12 pg/mL 이하, 약 10 pg/mL 이하, 약 8 pg/mL 이하, 약 6 pg/mL 이하, 약 4 pg/mL 이하 또는 약 2 pg/mL 이하의 수준으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 저분자량 종 (LMW)을 약 1.0% 이하, 약 0.9% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.6% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하 또는 약 0.1% 이하의 수준으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 고분자량 종 (HMW)을 약 1.0% 이하, 약 0.9% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.6% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하 또는 약 0.1% 이하의 수준으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 숙주 세포 단백질 (HCP)을 약 100 ppm 이하, 약 90 ppm 이하, 약 80 ppm 이하, 약 70 ppm 이하, 약 60 ppm 이하, 약 50 ppm 이하, 약 40 ppm 이하, 약 30 ppm 이하, 약 20 ppm 이하 또는 약 10 ppm 이하의 수준으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 잔류 단백질 A (rPA)를 약 6 ppm 이하, 약 5 ppm 이하, 약 4 ppm 이하, 약 3 ppm 이하, 약 2 ppm 이하, 약 1 ppm 이하, 약 0.8 ppm 이하, 약 0.6 ppm 이하, 약 0.5 ppm 이하, 약 0.4 ppm 이하, 약 0.3 ppm 이하, 약 0.2 ppm 이하 또는 약 0.1 ppm 이하의 수준으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 1회 이상의 다운스트림 정제, 예를 들어, 여과, 친화성 크로마토그래피, 접선 유동 크로마토그래피, 바이러스 불활성화 또는 그의 임의의 조합 후에 수행된다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 수거 후에 임의의 정제 단계 없이 수행된다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 크로마토그래피는 바이러스 불활성화 전의 최종 단계이다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 1종 이상의 바이러스를 동시적으로 불활성화시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 조합된 AEX 및 CEX 또는 CEX 및 AEX 크로마토그래피 전에 또는 그 후에 바이러스 불활성화 단계를 추가로 포함한다.
III. 완충제 전이 피크를 제거하는 방법
본 개시내용은 또한 로딩 완충제와 체이스 완충제 사이에서의 완충제 전이 피크를 제거하거나 또는 감소시키는 방법을 포함한다. 임의적으로 통류 방식의 크로마토그래피, 예를 들어, AEX, CEX, 조합된 AEX 및 CEX, 조합된 CEX 및 AEX에서 완충제 전이 피크를 제거하거나 또는 감소시키기 위해, 방법은 로딩 완충제를 첨가하고 체이스 완충제를 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 체이스 완충제가 로딩 완충제와 비교하여 더 높은 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 조합된 AEX 및 CEX 또는 조합된 CEX 및 AEX 크로마토그래피이다.
일부 실시양태에서, 체이스 완충제의 전도도는 로딩 완충제의 전도도보다 적어도 0.5 mS/cm, 적어도 0.6 mS/cm, 적어도 0.7 mS/cm, 적어도 0.8 mS/cm, 적어도 0.9 mS/cm, 적어도 1.0 mS/cm, 적어도 1.1 mS/cm, 적어도 1.2 mS/cm, 적어도 1.3 mS/cm, 적어도 1.4 mS/cm, 적어도 1.5 mS/cm, 적어도 1.6 mS/cm, 적어도 1.7 mS/cm, 적어도 1.8 mS/cm, 적어도 1.9 mS/cm, 적어도 2.0 mS/cm, 적어도 2.1 mS/cm, 적어도 2.2 mS/cm, 적어도 2.3 mS/cm, 적어도 2.4 mS/cm, 적어도 2.5 mS/cm, 적어도 2.6 mS/cm, 적어도 2.7 mS/cm, 적어도 2.8 mS/cm, 적어도 2.9 mS/cm, 적어도 3.0 mS/cm, 적어도 3.1 mS/cm, 적어도 3.2 mS/cm, 적어도 3.3 mS/cm, 적어도 3.4 mS/cm, 적어도 3.5 mS/cm, 적어도 3.6 mS/cm, 적어도 3.7 mS/cm, 적어도 3.8 mS/cm, 적어도 3.9 mS/cm, 적어도 4.0 mS/cm, 적어도 4.1 mS/cm, 적어도 4.2 mS/cm, 적어도 4.3 mS/cm, 적어도 4.4 mS/cm, 적어도 4.5 mS/cm, 적어도 4.6 mS/cm, 적어도 4.7 mS/cm, 적어도 4.8 mS/cm, 적어도 4.9 mS/cm 또는 적어도 5.0 mS/cm 더 높다. 다른 실시양태에서, 로딩 완충제의 전도도는 체이스 완충제의 전도도보다 약 1.0 mS/cm 더 높다.
일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 체이스 완충제보다 더 낮은 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제의 전도도는 체이스 완충제의 전도도보다 적어도 0.5 mS/cm, 적어도 1.0 mS/cm, 적어도 1.5 mS/cm, 적어도 2.0 mS/cm, 적어도 2.5 mS/cm, 적어도 3.0 mS/cm, 적어도 3.5 mS/cm, 적어도 4.0 mS/cm, 적어도 4.5 mS/cm 또는 적어도 5.0 mS/cm 더 낮다. 다른 실시양태에서, 로딩 완충제의 전도도는 체이스 완충제의 전도도보다 약 1.0 mS/cm 더 낮다.
일부 실시양태에서, (III)에서의 완충제 전이 피크를 제거하거나 또는 감소시키는 방법은 (II)의 단백질을 정제하는 방법과 조합될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 혼합물 내 관심 단백질을 정제하는 방법으로서, 조작 조건 (예를 들어, pH 및/또는 전도도) 하에 조합된 AEX 및 CEX 또는 조합된 CEX 및 AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하며, 여기서 AEX와 CEX 사이에서 자동화, 공학 제어 및/또는 인라인 조정이 사용되지 않고, 여기서 크로마토그래피에 사용되는 체이스 완충제가 크로마토그래피에 사용되는 로딩 완충제보다 더 높은 전도도를 갖는 것인 방법을 포함한다.
관심 단백질
본 개시내용의 방법 (II) 및/또는 (III)은 임의의 관심 단백질, 예를 들어, 자연 발생 또는 비-자연 발생 단백질, 재조합에 의해 생산되거나 또는 혈장 정제된 단백질 또는 그의 임의의 조합을 단리하거나 또는 정제하는데 사용될 수 있다. 관심 단백질은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 1종 이상의 오염물질이 함유된 혼합물에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 다운스트림 정제, 예를 들어, 여과, 친화성 크로마토그래피, 접선 유동 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 폴리싱 단계 또는 그의 임의의 조합을 이미 거친 것이었다. 다른 실시양태에서, 관심 단백질은 오염물질이 함유된 혼합물에 존재하며, 수거 후에 임의의 정제 단계를 거치지 않았다.
일부 실시양태에서, 혼합물은 항체인 관심 단백질을 함유한다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질은 관심 단백질 및 이종 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시양태에서, 본 방법에 의해 단리되거나 또는 정제될 융합 단백질은 Fc 융합 단백질이다. 다른 실시양태에서, 본 방법에 의해 단리되거나 또는 정제될 단백질은 PEG화, HES화 또는 시알릴화된 단백질이다.
다른 실시양태에서, 관심 단백질은 숙주 세포에서 생산된다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 포유동물 세포를 포함하는 배양물에서 생산된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HEK293 세포, 마우스 골수종 (NS0), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK), 원숭이 신장 섬유모세포 세포 (COS-7), 마딘-다비 소 신장 세포 (MDBK) 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 출발 혼합물은 수거된 세포 배양물 유체, 세포 배양물 상청액, 조건화된 세포 배양물 상청액, 세포 용해물 및 정화된 벌크일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 배양물은 1종 이상의 다운스트림 정제 방법, 예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 단백질 G 친화성 크로마토그래피로부터 선택된 친화성 크로마토그래피에 적용되었다. 다른 실시양태에서, 본 방법의 출발 혼합물은 1종 이상의 다운스트림 정제, 예를 들어, 투석여과, 한외여과, 친화성 크로마토그래피, 접선 유동 크로마토그래피, 바이러스 불활성화 또는 그의 임의의 조합을 통해 전개되었다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이들은 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌의 내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1
폴리싱의 평가
폴리싱 단계 순서 및 가능한 조합된 폴리싱 단계 뿐만 아니라 원치 않는 오염물질에 대한 감소의 유효성을 평가하기 위해, 표 1에 제시된 바와 같은 다양한 폴리싱 시나리오를 연구하였다. 연구를 위한 로딩 물질은 pH 5.5의 단백질 A 용리 및 중화 풀 (PAVIN)이다 (심층 여과 부재). 각각의 전개 전에, PAVIN 풀을 2M 트리스를 사용하여 7.2로 pH 조정한다. 표 1에 제시된 바와 같이, CEX (F/T)는 HMW 및 rPA를 효과적으로 제거할 수 있고; AEX (F/T)는 HCP를 현저히 감소시키지만, rPA 및 HMW를 제거할 수가 없다. 2 단계 폴리싱 (CEX (F/T)에 이어진 AEX (F/T))을 사용하면, HCP, HMW, rPA 수준이 모두 비교적 낮은 수준으로 감소된다. 조합된 CEX-AEX F/T를 또한 여기서 2개의 칼럼을 함께 연결하고 CEX F/T 조건 (pH 7.2 및 5 mS/cm에서의 로딩, pH 7.2 및 6 mS/cm에서의 체이싱)을 사용하여 조작함으로써 평가하였다. 도 1에 제시된 바와 같이, 두 칼럼 사이에서의 임의의 자동화 또는 공학 제어 없이, 포로스 XS 칼럼 (10 cm의 층 높이, 0.66 cm의 내부 직경)의 유출구를 캅토 Q 칼럼 (10 cm의 층 높이, 0.66 cm의 내부 직경)의 유입구에 직접 연결하였다.
임의의 조정이 이루어지지 않는 조합된 CEX/AEX F/T (AEX/CEX F/T) 폴리싱 단계의 유효성을 평가함에 있어서, 출발 혼합물, 즉, "단백질 A 용리 및 중화 풀" (PAVIN)은 5.5의 pH를 가지며 표 1에 열거된 불순물을 함유하였다. 다양한 크로마토그래피 접근법 후의 원치 않는 오염물질의 감소는 표 1에 상술되어 있다. CEX 단독, AEX 단독, 전도도 조정이 이루어지는 조합된 CEX-AEX 및 임의의 조정이 이루어지지 않는 조합된 CEX-AEX에 이어진 AEX-CEX를 상기 열거된 조작 조건으로 시험하였다. 모든 크로마토그래피는 통류 방식으로 조작되었다.
임의의 조정이 이루어지지 않는 조합된 CEX-AEX 또는 AEX-CEX F/T 폴리싱 단계는 감소된 조작 시간/비용 및 스키드 풋프린트와 함께 HCP, rPA 및 HMW의 현저한 제거를 제시한다. 조합된 CEX-AEX 또는 AEX-CEX F/T 폴리싱의 수많은 이점이 제시되었으며; 이들은 단일 F/T 폴리싱 유닛 뿐만 아니라 CEX와 AEX 사이에서 전도도 조정이 이루어지는 조합된 CEX (F/T) 및 AEX (F/T) 폴리싱 단계와 비교하여 상당히 감소된 조작 시간, 비용 및 스키드 풋프린트를 포함한다. 임의의 pH 및 전도도 조정이 이루어지지 않는 조합된 CEX-AEX 또는 AEX-CEX는 단일 F/T 폴리싱 유닛과 비교하여 다운스트림 생산성을 현저히 개선시켰다. CEX 및 AEX (F/T)는 둘 다 높은 로딩 (≥300 g/L)으로 작업할 수 있다. 임의의 pH 및 전도도 조정이 이루어지지 않는 조합된 CEX 및 AEX 또는 AEX 및 CEX 크로마토그래피는 동일한 완충제 시스템을 이용할 수 있다: CEX 및 AEX를 위한 동일한 충전, EQ, 스트리핑, 살균 및 저장 완충제. 본 발명의 크로마토그래피는 또한 도 1에 제시된 바와 같이 CEX의 유출구를 AEX 유입구에 직접 연결함으로써 간단하게 구현될 수 있다.
표 1. 다양한 시나리오의 폴리싱 단계 평가.
Figure pct00001
실시예 2
CEX-AEX F/T 폴리싱을 사용하여 평가된 분자의 요약
다양한 등전점 (pI)을 갖는 수많은 항체에 대해 정제 효능을 측정하였고, 이는 표 2에 상술되어 있다. 처음 4종의 항체는 등전점보다 낮은 pH를 사용하여 정제하였으며, 이는 항체가 크로마토그래피 동안 약한 양성의 알짜 전하를 보유한다는 것을 나타낸다. 칼럼에 대한 항체의 결합을 방지하고 그의 통류를 촉진하기 위해, 염을 사용하여 완충제의 전도도를, 관심 항체는 칼럼 상에 강하게 보유되지 않지만, 바람직하지 않은 오염물질 예컨대 HCP, rPA 및 HMW는 보유되는 수준으로 증가시켰다. 5.8의 pI를 갖는 다섯번째 항체의 경우에는, 음전하 보유 항체 및 음이온 교환 수지의 상호작용을 방지하기 위해 보다 높은 염 농도를 사용하였다.
표 2. CEX-AEX F/T 폴리싱 단계를 사용하여 평가된 분자의 요약
Figure pct00002
임의의 조정이 이루어지지 않는 조합된 CEX-AEX F/T 폴리싱 단계의 대표적인 크로마토그램이 도 2에 제시되어 있다.
실시예 3
완충제 전이 유도된 로딩-후 피크의 평가
항체-3을 함유하는 단백질 혼합물을 CEX (F/T)를 통해 전개시켜 이 항체를 단리하는데 있어서의 그의 유효성을 평가하였다. CEX F/T는 5 mS/cm의 로딩 완충제 및 5 mS/cm의 체이싱 완충제를 사용하여 7.2의 pH에서 전개되었다. 완충제는 둘 다 아세트산나트륨-트리스 완충제를 함유한다. 단백질 용리를 280nm에서의 광 흡광도를 통해 측정하였다. 로딩 완충제로부터 체이스 완충제로의 전이는 도 3a에 제시된 바와 같이 원치 않는, 완충제 전이 후 피크를 유도하였다. CEX F/T를 체이스 완충제의 전도도만을 변화시켜, 즉, 1 mS/cm 증가한 6 mS/cm로 다시 수행하였을 때, 크로마토그램은 도 3b에 제시된 바와 같이 완충제 전이 후 피크가 사라진 것을 제시하였다. 따라서, 체이스 완충제의 전도도를 증가시킴으로써, 로딩 완충제로부터 체이스 완충제로의 전이로 인한 피크가 감소되거나 또는 제거될 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 공개가 괄호 안의 저자명 및 날짜에 의해 또는 특허 번호 또는 특허 공개 번호에 의해 참조된다. 이들 공개의 개시내용은 본원에 기재되고 청구된 개시내용의 개시일 당시에 통상의 기술자에게 공지된 최신 기술을 보다 자세히 기재하기 위해 본 출원에 그 전문이 참조로 포함된다. 그러나, 본원에서 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 본 개시내용에 대한 선행 기술임을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

Claims (61)

  1. 혼합물로부터 단백질을 정제하는 방법으로서, 조합된 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 및 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX) 또는 조합된 AEX 및 CEX ("조합된 크로마토그래피")를 통류 방식으로 조작 조건 하에 수행하는 것을 포함하며, 여기서 AEX와 CEX 사이에서 자동화, 공학 제어 및/또는 인라인 조정이 사용되지 않는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, AEX 및 CEX가 직접 연결되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, AEX와 CEX 사이에서 pH 및/또는 전도도가 조정되지 않는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9 또는 약 8.0 초과의 등전점 (pI)을 갖는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단백질이 약 12.0, 약 11.9, 약 11.8, 약 11.7, 약 11.6, 약 11.5, 약 11.4, 약 11.3, 약 11.2, 약 11.1, 약 11.0, 약 10.9, 약 10.8, 약 10.8, 약 10.7, 약 10.6, 약 10.5, 약 10.4, 약 10.3, 약 10.2, 약 10.1 또는 약 10.0 미만의 등전점 (pI)을 갖는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 약 7.0 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 6.5 내지 약 10.5 또는 약 7.2 내지 약 9.6의 pI를 갖는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 약 10.0, 약 10.5 또는 약 11.0의 pI를 갖는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 약 6.5, 약 6.4, 약 6.3, 약 6.2, 약 6.1, 약 5.9, 약 5.8 또는 약 5.7 미만의 등전점 (pI)을 갖는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 단백질이 약 1.0, 약 2.0, 약 3.0, 약 4.0 또는 약 5.0 초과의 등전점 (pI)을 갖는 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 단백질이 약 1.0 내지 약 6.5, 약 2.0 내지 약 6.0, 약 2.5 내지 약 6.5 또는 약 2.0 내지 약 5.8의 pI를 갖는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단백질이 약 6.5, 약 6.4, 약 6.3, 약 6.2, 약 6.1, 약 6.0, 약 5.9, 약 5.8, 약 5.7, 약 5.6 또는 약 5.5의 pI를 갖는 것인 방법.
  12. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조합된 크로마토그래피가 로딩 완충제를 첨가하고 체이스 완충제를 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  13. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 조합된 크로마토그래피가 로딩 완충제를 첨가하고 체이스 완충제를 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 로딩 완충제가 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5 또는 약 10.0 초과의 pH를 갖는 것인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제가 약 6.0 내지 약 11.0, 약 6.5 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.5, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 9.5, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 8.5, 약 7.0 내지 약 8.0 또는 약 7.0 내지 약 7.5의 pH를 갖는 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제가 약 6.5, 약 7.0, 약 7.2, 약 7.4, 약 7.6, 약 7.8, 약 8.0, 약 8.2, 약 8.4, 약 8.6, 약 8.8, 약 9.0, 약 9.2, 약 9.4, 약 9.6, 약 9.8, 약 10.0, 약 10.5, 약 11.0 또는 약 11.5의 pH를 갖는 것인 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제가 약 6.0, 약 6.5 초과, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5 또는 약 9.0 초과의 pH를 갖는 것인 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제가 약 6.0 내지 약 11.0, 약 6.5 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 8.5, 약 7.0 내지 약 9.5, 약 6.5 내지 약 8.5 또는 약 6.5.0 내지 약 7.5의 pH를 갖는 것인 방법.
  19. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제가 약 6.0, 약 6.2, 약 6.4, 약 6.6, 약 6.8, 약 7.0, 약 7.2, 약 7.4, 약 7.6, 약 7.8, 약 8.0, 약 8.2, 약 8.4, 약 8.6, 약 8.8 또는 약 9.0의 pH를 갖는 것인 방법.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제가 로딩 완충제의 pH와 동일하거나 또는 그와 상이한 pH를 갖는 것인 방법.
  21. 제12항 및 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제가 약 0.1 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 0.5 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 1.0 내지 약 9.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 8.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 7.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 8.5 mS/cm, 약 2.0 내지 약 7.5 mS/cm 또는 약 2.5 내지 약 7.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제가 약 2.5 mS/cm 내지 약 7.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  23. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제가 약 0.1 mS/cm, 약 0.5 mS/cm, 약 1.0 mS/cm, 약 1.5 mS/cm, 약 2.0 mS/cm, 약 2.5 mS/cm, 약 3.0 mS/cm, 약 3.5 mS/cm, 약 4.0 mS/cm, 약 4.5 mS/cm, 약 5.0 mS/cm, 약 5.5 mS/cm, 약 6.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 7.0 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 8.0 mS/cm, 약 8.5 mS/cm 또는 약 9.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  24. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제가 약 6.0 mS/cm 내지 약 15.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm 내지 약 15 mS/cm, 약 7.0 mS/cm 내지 약 14.0 mS/cm, 약 8.0 mS/cm 내지 약 13.0 mS/cm 또는 약 9.0 mS/cm 내지 약 12.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  25. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제가 약 9.0 내지 9.5 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  26. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제가 약 6.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 7.0 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 8.0 mS/cm, 약 8.5 mS/cm, 약 9.0 mS/cm, 약 9.5 mS/cm, 약 10.0 mS/cm, 약 10.5 mS/cm, 약 11.0 mS/cm, 약 11.5 mS/cm, 약 12.0 mS/cm, 약 12.5 mS/cm, 약 13.0 mS/cm, 약 13.5 mS/cm, 약 14.0 mS/cm, 약 14.5 mS/cm 또는 약 15.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  27. 제12항 및 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제가 약 0.1 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 0.5 mS/cm 내지 약 9.0 mS/cm, 약 1.0 내지 약 9.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 8.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 7.0 mS/cm, 약 2.0 내지 약 8.5 mS/cm, 약 2.0 내지 약 7.5 mS/cm 또는 약 2.5 내지 약 7.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  28. 제12항 및 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제가 약 0.1 mS/cm, 약 0.5 mS/cm, 약 1.0 mS/cm, 약 1.5 mS/cm, 약 2.0 mS/cm, 약 2.5 mS/cm, 약 3.0 mS/cm, 약 3.5 mS/cm, 약 4.0 mS/cm, 약 4.5 mS/cm, 약 5.0 mS/cm, 약 5.5 mS/cm, 약 6.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 7.0 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 8.0 mS/cm, 약 8.5 mS/cm 또는 약 9.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  29. 제13항 내지 제20항 및 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제가 약 6.0 mS/cm 내지 약 15.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm 내지 약 15.0 mS/cm, 약 7.0 내지 약 15.0 mS/cm, 약 8.0 내지 약 14.0 mS/cm, 약 8.0 내지 약 13.0 mS/cm, 약 8.0 내지 약 14.5 mS/cm, 약 8.0 내지 약 13.5 mS/cm 또는 약 8.5 내지 약 13.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  30. 제13항 내지 제20항 및 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제가 약 6.0 mS/cm, 약 6.5 mS/cm, 약 7.0 mS/cm, 약 7.5 mS/cm, 약 8.0 mS/cm, 약 8.5 mS/cm, 약 9.0 mS/cm, 약 9.5 mS/cm, 약 10.0 mS/cm, 약 10.5 mS/cm, 약 11.0 mS/cm, 약 11.5 mS/cm, 약 12.0 mS/cm, 약 12.5 mS/cm, 약 13.0 mS/cm, 약 13.5 mS/cm, 약 14.0 mS/cm, 약 14.5 mS/cm 또는 약 15.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  31. 제12항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제의 전도도가 로딩 완충제의 전도도보다 높거나, 그보다 낮거나, 또는 그와 동일한 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 체이스 완충제의 전도도가 로딩 완충제의 전도도보다 적어도 0.1 mS/cm, 적어도 0.2 mS/cm, 적어도 0.3 mS/cm, 적어도 0.4 mS/cm, 적어도 0.5 mS/cm, 적어도 1.0 mS/cm, 적어도 1.5 mS/cm, 적어도 2.0 mS/cm, 적어도 2.5 mS/cm, 적어도 3.0 mS/cm, 적어도 3.5 mS/cm, 적어도 4.0 mS/cm, 적어도 4.5 mS/cm 또는 적어도 5.0 mS/cm 더 높은 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물이 1종 이상의 오염물질을 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 오염물질이 숙주 세포 단백질 (HCP), DNA, 고분자량 종 (HMW), 저분자량 종 (LMW), 잔류 단백질 A (rPA) 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 조합된 크로마토그래피가 HCP 수준을 약 100 ppm 이하, 약 90 ppm 이하, 약 80 ppm 이하, 약 70 ppm 이하, 약 60 ppm 이하, 약 50 ppm 이하, 약 40 ppm 이하, 약 30 ppm 이하, 약 20 ppm 이하 또는 약 10 ppm 이하로 감소시키는 것인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 조합된 크로마토그래피가 HMW 수준을 약 1.0% 이하, 약 0.9% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.6% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하 또는 약 0.1% 이하로 감소시키는 것인 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 조합된 크로마토그래피가 LMW 수준을 약 1.0% 이하, 약 0.9% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.6% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하 또는 약 0.1% 이하로 감소시키는 것인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 조합된 크로마토그래피가 DNA 수준을 약 20 pg/mL 이하, 약 18 pg/mL 이하, 약 16 pg/mL 이하, 약 14 pg/mL 이하, 약 12 pg/mL 이하, 약 10 pg/mL 이하, 약 8 pg/mL 이하, 약 6 pg/mL 이하, 약 4 pg/mL 이하 또는 약 2 pg/mL 이하로 감소시키는 것인 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 조합된 크로마토그래피가 rPA 수준을 약 6 ppm 이하, 약 5 ppm 이하, 약 4 ppm 이하, 약 3 ppm 이하, 약 2 ppm 이하, 약 1 ppm 이하, 약 0.8 ppm 이하, 약 0.6 ppm 이하, 약 0.5 ppm 이하, 약 0.4 ppm 이하, 약 0.3 ppm 이하, 약 0.2 ppm 이하 또는 약 0.1 ppm 이하로 감소시키는 것인 방법.
  40. 크로마토그래피에서 로딩 단계-후 완충제 전이 피크를 감소시키거나 또는 제거하는 방법으로서, 혼합물 내 단백질을 정제하기 위한 크로마토그래피 동안 로딩 완충제 및 체이스 완충제를 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 체이스 완충제가 로딩 완충제보다 더 높은 전도도를 갖는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 크로마토그래피가 AEX 크로마토그래피, CEX 크로마토그래피, 조합된 AEX 및 CEX 크로마토그래피, 또는 조합된 CEX 및 AEX 크로마토그래피인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 크로마토그래피가 통류 방식인 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제가 약 3.0 mS/cm 내지 약 6.0 mS/cm의 전도도를 가지며, 체이스 완충제가 약 6.0 mS/cm 내지 약 12.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제의 전도도가 로딩 완충제의 전도도보다 적어도 0.5 mS/cm, 적어도 1.0 mS/cm, 적어도 1.5 mS/cm, 적어도 2.0 mS/cm, 적어도 2.5 mS/cm, 적어도 3.0 mS/cm, 적어도 3.5 mS/cm, 적어도 4.0 mS/cm, 적어도 4.5 mS/cm 또는 적어도 5.0 mS/cm 더 높은 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 로딩 완충제가 5.0 mS/cm의 전도도를 가지며, 체이스 완충제가 6.0 mS/cm의 전도도를 갖는 것인 방법.
  46. 제12항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 완충제가 염화나트륨, 염화암모늄, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 아세트산암모늄, 황산나트륨, 황산암모늄, 티오시안산암모늄, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 및 그의 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 염, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 로딩 완충제가 아세트산나트륨-트리스를 포함하는 것인 방법.
  48. 제12항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 체이스 완충제가 염화나트륨, 염화암모늄, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 아세트산암모늄, 황산나트륨, 황산암모늄, 티오시안산암모늄, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 및 그의 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 염, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 체이스 완충제가 아세트산나트륨-트리스를 포함하는 것인 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피가 50 g/L 수지, 100 g/L 수지, 150 g/L 수지, 200 g/L 수지, 250 g/L 수지, 300 g/L 수지, 350 g/L 수지, 400 g/L 수지, 450 g/L 수지 또는 500 g/L 수지까지 로딩되는 칼럼을 포함하는 것인 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피가 포로스 HS, 포로스 XS, 카르복시-메틸-셀룰로스, 베이커본드(BAKERBOND) ABX™, 아가로스 상에 고정화된 술포프로필 및 아가로스 상에 고정화된 술포닐, 모노S, 미니S, 소스 15S, 30S, SP 세파로스(SEPHAROSE)™, CM 세파로스™, 베이커본드 카르복시-술폰, WP CBX, WP 술포닉, 히드로셀 CM, 히드로셀 SP, 우노스피어 S, 마크로-프렙 하이 S, 마크로-프렙 CM, 세라믹 하이퍼D S, 세라믹 하이퍼D CM, 세라믹 하이퍼D Z, 트리스아크릴 M CM, 트리스아크릴 LS CM, 트리스아크릴 M SP, 트리스아크릴 LS SP, 스페로덱스 LS SP, 다우엑스 파인 메쉬 강산 양이온 수지, 다우엑스 MAC-3, 매트렉스 셀루파인 C500, 매트렉스 셀루파인 C200, 프락토겔 EMD SO3-, 프락토겔 EMD SE, 프락토겔 EMD COO-, 앰버라이트 약 및 강 양이온 교환체, 다이아이온 약 및 강 양이온 교환체, TSK 겔 SP-5PW-HR, TSK 겔 SP-5PW, 도요펄 CM (650S, 650M, 650C), 도요펄 SP (650S, 650M, 650C), CM (23, 32, 52), SE (52, 53), P11, 익스프레스-이온 C 및 익스프레스-이온 S 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된 CEX 수지를 포함하는 것인 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피가 포로스 HQ, 포로스 XQ, Q 세파로스™ 패스트 플로우, DEAE 세파로스™ 패스트 플로우, 사토바인드(SARTOBIND)® Q, ANX 세파로스™ 4 패스트 플로우 (하이 서브), Q 세파로스™ XL, Q 세파로스™ 빅 비드, DEAE 세파덱스 A-25, DEAE 세파덱스 A-50, QAE 세파덱스 A-25, QAE 세파덱스 A-50, Q 세파로스™ 하이 퍼포먼스, Q 세파로스™ XL, 소스 15Q, 소스 30Q, 리소스 Q, 캅토 Q, 캅토 DEAE, 모노 Q, 도요펄 슈퍼 Q, 도요펄 DEAE, 도요펄 QAE, 도요펄 Q, 도요펄 기가캡 Q, TS 겔 슈퍼Q, TS 겔 DEAE, 프락토겔 EMD TMAE, 프락토겔 EMD TMAE 하이캡, 프락토겔 EMD DEAE, 프락토겔 EMD DMAE, 마크로프렙 하이 Q, 마크로-프렙-DEAE, 우노스피어 Q, 누비아 Q, PORGS PI, DEAE 세라믹 하이퍼D, Q 세라믹 하이퍼D 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된 AEX 수지를 포함하는 것인 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항체 또는 항체 단편, 융합 단백질, 자연 발생 단백질, 키메라 단백질 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 항체가 IgM, IgA, IgE, IgD 및 IgG로부터 선택된 이소타입인 방법.
  55. 제54항에 있어서, IgG 항체가 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되는 것인 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피가 바이러스를 불활성화시키는 것인 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 불활성화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  58. 제1항에 있어서, 혼합물이 출발 혼합물을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 단백질 G 친화성 크로마토그래피로부터 선택된 친화성 크로마토그래피에 적용함으로써 단리된 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 출발 혼합물이 수거된 세포 배양물 유체, 세포 배양물 상청액, 조건화된 세포 배양물 상청액, 세포 용해물 및 정화된 벌크로부터 선택되는 것인 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 출발 혼합물이 포유동물 세포 배양물로부터 유래되는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 방법.
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