CN116120392B - 聚体蛋白的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种聚体蛋白的纯化方法，包括如下步骤：S1：对含聚体蛋白的细胞发酵液进行亲和层析，收集亲和层析液；S2：对所述亲和层析液进行超滤，收集超滤浓缩液；S3：对所述超滤液进行阴离子层析，收集阴离子层析液；S4：对所述阴离子层析液进行阳离子层析，收集阳离子层析液；S5：对所述阳离子层析液进行复合膜过滤。上述聚体蛋白的纯化方法，能够实现较大程度地去除如HCPs等杂质，最后得到纯度极高的聚体蛋白。同时，该纯化方法操作简单、回收率高，有利于大规模的工业化生产。

Description

聚体蛋白的纯化方法
技术领域
本申请涉及蛋白纯化技术领域，特别是涉及一种聚体蛋白的纯化方法。
背景技术
疫苗在疾病预防中发挥着极其重要的作用，保证疫苗的质量是保证疫苗始终如一地发挥其特定功效的关键。与单克隆抗体的经典结构相比，疫苗的作用机制往往包括多个结合点位的识别，结构相对比较复杂，这种复杂程度不仅体现在糖型及三维结构上，还体现在疫苗的多聚体结构。
在传统和新型疫苗的制备中，应用先进的分离纯化技术是提高疫苗效力、减少副作用的有效手段。然而，对于疫苗这一聚体蛋白的纯化而言，由于其结构复杂，浓度低（通常＜1g/L的浓度），利用传统的离心、过滤和沉淀技术进行纯化，所得产品中的单体、聚集体及其他杂质，特别是宿主细胞蛋白（HCP）和宿主DNA的含量较高，副作用明显，无法满足疫苗质量的要求。
发明内容
基于此，本申请提供一种聚体蛋白的纯化方法，该纯化方法能够有效去除聚体蛋白中的杂质，提高聚体蛋白的纯度。
具体技术方案如下：
一种聚体蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
S1：对含聚体蛋白的细胞发酵液进行亲和层析，收集亲和层析液；
S2：对所述亲和层析液进行超滤，收集超滤浓缩液；
S3：对所述超滤浓缩液进行阴离子层析，收集阴离子层析液；
S4：对所述阴离子层析液进行阳离子层析，收集阳离子层析液；
S5：对所述阳离子层析液进行复合膜过滤。
在其中一个实施例中，步骤S1中，所述亲和层析采用亲和层析柱进行，所述亲和层析柱填料以扁豆凝集素为亲和介质的亲和填料。
在其中一个实施例中，步骤S1中，所述亲和层析采用的洗脱程序包括：
先以0.005M~0.015MPBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比0.3%~0.5%甘露糖的0.005M~0.015M PBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比9%~11%甘露糖的0.005M~0.015M 的PBS 缓冲液进行聚体蛋白洗脱。
在其中一个实施例中，步骤S2中，所述超滤采用的超滤膜的膜孔径为100KDa。
在其中一个实施例中，步骤S2中，进行所述超滤之前，先采用0.005M~0.015MPBS缓冲液对所述超滤采用的超滤膜进行平衡。
在其中一个实施例中，步骤S3中，所述阴离子层析采用阴离子层析柱进行，所述阴离子层析柱的填料为以-N+(CH3)3为配基的阴离子填料。
在其中一个实施例中，步骤S3中，所述阴离子层析采用的洗脱程序包括：以15mM~25mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液进行淋洗。
在其中一个实施例中，步骤S4中，所述阳离子层析采用阳离子层析柱进行，所述阳离子层析柱的填料为以-SO3H为配基的阳离子填料。
在其中一个实施例中，步骤S4中，所述阳离子层析采用的洗脱程序包括：以含0.5M~1.5M NaCl的15mM~25mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液进行淋洗。
在其中一个实施例中，步骤S5中，所述复合膜为具有季胺功能团以及胍功能团的膜。
在其中一个实施例中，步骤S5中，进行所述复合膜过滤之前，先采用0.005M~0.015MPBS缓冲液对所述复合膜进行平衡。
在其中一个实施例中，所述聚体蛋白为三聚体蛋白。
上述聚体蛋白的纯化方法，依次通过亲和层析、超滤、阴离子层析、阳离子层析和复合膜过滤的纯化步骤对含聚体蛋白的细胞发酵液进行纯化处理，能够实现较大程度地去除如HCPs等杂质，最后得到纯度极高的聚体蛋白。同时，该纯化方法操作简单、回收率高，有利于大规模的工业化生产。
另外，上述聚体蛋白的纯化方法的步骤过程中聚体蛋白不易分解，且制备得到的聚体蛋白性质稳定。
附图说明
图1为本申请一示例的聚体蛋白的纯化方法的流程图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本申请的聚体蛋白的纯化方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本申请中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本申请中的室温一般指4℃~30℃，较佳地指20±5℃。
若无特别说明，本申请中涉及的溶液的溶剂均为水。
宿主细胞蛋白（HCP）是由用于生产重组产品的宿主细胞产生或编码的与预期重组产品无关的蛋白，而DNA是宿主细胞分解后的DNA片段。与重组产品一样，HCP也可以被宿主以许多类型的翻译后修饰(posttranslational modifications, PTMs)进行修饰。HCP和DNA是生物制品中主要工艺相关杂质，是生物药品的强制性关键质量属性（CQA），因为这些残留杂质会影响产品质量、功效和安全性，并诱导或增强免疫原性，因此需要通过纯化工艺充分去除。同时HCPs是一种具有多种理化性质的复杂混合物，某些亚种群可以与目标产品结合，尽管通常以少量存在，但将它们降到普遍接受的水平是很具有挑战性的，工业界为去除它们付出了大量的努力和成本。
聚体蛋白纯化的重大挑战是上游细胞发酵培养过程中生产的聚体蛋白产量很低（<1g/L），同时HCP和DNA等杂质的含量很高，杂质和聚体蛋白的相对比例很大，且杂质的组成复杂。杂质的含量和组成越复杂，越要求下游工艺（Down-stream Process，DSP）的分离能力强和选择性高。
目前，抗体药物技术都集中在重组蛋白单抗和双抗的纯化工艺，对于聚体蛋白的关注较少。抗体纯化的常用平台包括离心、微滤和超滤、蛋白A亲和层析、两个正交病毒灭活步骤、IEX和HIC色谱和过滤的单元操作等，目标是纯化抗体的单体，去除聚体和片段，且几乎没有抗体药物利用聚体蛋白作为活性药物成分（API）。同时，在纯化单抗的过程中，抗体浓度可以在3~5g/L之间，相比较聚体蛋白而言纯化更易达到预期的目的。由于聚体蛋白的浓度很低，杂质含量极高，传统的抗体纯化技术没有办法有效去除其中的HCPs和DNA等杂质，且几乎收获不到聚体蛋白。聚体蛋白的细胞发酵液的各种成分对生物技术生产的下游纯化工艺提出了极大的挑战。
通常而言，纯化工艺各步骤目标因产品中所需去除的杂质类型不同而有所差异，因此在工艺优化过程中必须解决不同的挑战。例如，用作捕获步骤的蛋白A亲和层析将由于杂质浓度的增加而限制层析载量；在中间纯化和抛光步骤期间发生的选择性挑战将阻止每个步骤达到其目标；当HCPs分别在等电点（pI）和疏水性方面与产品相似时，选择性挑战将影响IEX和HIC分离操作的分辨率，杂质物质的等电点和疏水性分布会分别对IEX和HIC分离产生负面影响。
基于此，本申请经过大量的工艺研究，通过特定的、具有顺序的纯化步骤，且各纯化步骤之间具有协同作用，能够实现极大程度地去除如HCPs等杂质，得到纯度极高的聚体蛋白，且该纯化方法操作简单、回收率高，有利于大规模的工业化生产。
具体地，本申请的一示例提供一种聚体蛋白的纯化方法，流程图如图1所示，包括如下步骤：
S1：对含聚体蛋白的细胞发酵液进行亲和层析，收集亲和层析液；
S2：对所述亲和层析液进行超滤，收集超滤浓缩液；
S3：对所述超滤浓缩液进行阴离子层析，收集阴离子层析液；
S4：对所述阴离子层析液进行阳离子层析，收集阳离子层析液；
S5：对所述阳离子层析液进行复合膜过滤。
上述纯化方法中，首先使用亲和层析对细胞发酵液中的聚体蛋白进行初步捕获，去除细胞碎片和大分子核酸等物质，同时对包含有相同糖型结构的蛋白片段进行捕获浓缩，得到初纯样品；然后通过超滤能够有效去除初纯样品中的蛋白碎片、HCPs及其他小分子杂质，并将目标蛋白置换至相应的溶液中；使用阴离子层析对样品内的宿主细胞DNA等杂质进一步去除；使用阳离子层析可对蛋白高聚物有效去除，同时对目标蛋白进行浓缩；复合膜对样品中残留的HCP、DNA等杂质进一步去除。如此，各特定的步骤按照特定的顺序互相协同，能够使制备得到的聚体蛋白纯度高，杂质少。
可以理解地，“含聚体蛋白的细胞发酵液”中的聚体蛋白可通过单克隆细胞发酵得到，即对单克隆细胞进行发酵处理后获得所述含聚体蛋白的细胞发酵液，发酵处理可以通过本领域的现有方法进行。
在其中一示例中，所述聚体蛋白为三聚体蛋白。
进一步地，步骤S1为亲和层析步骤。
在其中一示例中，所述亲和层析采用亲和层析柱进行，所述亲和层析柱的填料为以扁豆凝集素(Lentil Lectin)为亲和介质的亲和填料。不作限制地，可以为LentilLectin Sepharose 4B。聚体蛋白通常为HIV的包膜表面刺突糖蛋白，扁豆凝集素的配基能够与糖蛋白特异性的可逆相互作用，进而有效捕获目标聚体蛋白。
在其中一示例中，所述亲和层析采用的洗脱程序包括：
先以0.005M~0.015MPBS（Phosphate Buffered Saline磷酸盐缓冲液）缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比0.3%~0.5%甘露糖的0.005M~0.015MPBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比9%~11%甘露糖的0.005M~0.015M 的PBS 缓冲液进行聚体蛋白洗脱。
在其中一示例中，所述亲和层析采用的洗脱程序包括：
先以0.01MPBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比0.4%甘露糖的0.01M的PBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比10%甘露糖的0.01M的PBS缓冲液进行聚体蛋白洗脱。
在其中一示例中，进行所述洗脱程序之前，还包括采用0.005M~0.015M的PBS缓冲液对亲和层析柱进行平衡3CV~5CV的步骤。
在其中一示例中，所述PBS缓冲液的pH为7~8。进一步地，所述PBS缓冲液的pH为7.4。
进一步地，步骤S2为超滤步骤。
由于聚体蛋白分子量较普通单克隆抗体大，且结构复杂，亲和层析液中会含有较高浓度的宿主蛋白，同时亲和洗脱液蛋白浓度较低，为使后续纯化步骤顺利进行，对亲和层析液进行超滤浓缩换液。
在其中一示例中，所述超滤采用的超滤膜的膜孔径为100KDa。
在其中一示例中，所述超滤采用超滤膜包进行，具体地，所述超滤膜包的材质为PES。不作限制地，可以为科百特UFELA0100010P 100KDa超滤膜包。
在其中一示例中，所述超滤采用切向流过滤。
在其中一示例中，所述超滤的过程中，对所述亲和层析液进行换液5DV~10DV后，收集所述超滤液。
在其中一示例中，进行所述超滤之前，先采用0.005M~0.015M的PBS缓冲液对所述超滤采用的超滤膜进行平衡。
在其中一示例中，所述PBS缓冲液的pH为7~8。进一步地，所述PBS缓冲液的pH为7.4。
进一步地，步骤S3为阴离子层析步骤。在该步骤中，杂质蛋白同层析柱结合，聚体蛋白流穿。
在其中一示例中，所述阴离子层析采用阴离子层析柱进行，所述阴离子层析柱的填料为以-N+(CH3)3为配基的阴离子填料。不作限制地，可为Monomix HC45-Q。
在其中一示例中，所述阴离子层析采用的洗脱程序包括：以15mM~25mM的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液进行淋洗。
在其中一示例中，所述阴离子层析采用的洗脱程序包括：以20mM的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液进行淋洗。
在其中一示例中，进行所述洗脱程序之前，还包括以15mM~25mM的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液对阴离子层析柱进行平衡≥6CV的步骤。
在其中一示例中，所述柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液的pH为5~6。进一步地，所述柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液的pH为5.6。
进一步地，步骤S4为阳离子层析步骤。在该步骤中，聚体蛋白同层析柱结合，杂质物质流穿，然后进行聚体蛋白的洗脱。
在其中一示例中，所述阳离子层析采用阳离子层析柱进行，所述阳离子层析柱的填料以-SO3H为配基的阳离子填料。不作限制地，可为Monomix HC30-SP。
在其中一示例中，所述阳离子层析采用的洗脱程序包括：以含0.5M~1.5M NaCl的15mM~25mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液进行淋洗。
在其中一示例中，所述阳离子层析采用的洗脱程序包括：以含1M NaCl的20mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液进行淋洗。
在其中一示例中，进行所述洗脱程序之前，还包括以15mM~25mM的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液对阳离子层析柱进行平衡≥5CV的步骤。
在其中一示例中，所述柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液的pH为5~6。进一步地，所述柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液的pH为5.6。
进一步地，步骤S5为复合膜过滤步骤。
在其中一示例中，所述复合膜为具有季胺功能团以及胍功能团的膜。进一步地，所述复合膜为3M Polisher ST。
在其中一示例中，进行所述复合膜过滤之前，先采用0.005M~0.015MPBS缓冲液对所述复合膜进行平衡。
在其中一示例中，所述PBS缓冲液的pH为7~8。进一步地，所述PBS缓冲液的pH为7.4。
以下为具体的实施例。如无特别说明，实施例中采用的设备和试剂均为市售产品。
亲和层析填料购自Cytiva，型号：Lentil Lectin Sepharose 4B；
超滤膜包购自科百特，型号：UFELA0100010P；
阴离子层析填料购自赛分科技，型号：Monomix HC45-Q；
阳离子层析填料购自赛分科技，型号：Monomix HC30-SP；
复合膜：Polisher ST，购自3M，型号：70020346980；
分子筛层析柱购自赛分科技，型号：Monomix MC60-SEC；
疏水层析柱购自纳微科技，型号：Uni-HR Phenyl。
实施例中涉及的缩写含义如下：
1x PBS：浓度为0.01M的PBS缓冲液；
CV：柱体积；
DV：样品体积；
NaCl：氯化钠；
PB：磷酸缓冲液；
SEC：体积排阻色谱；
HCP：宿主细胞蛋白；
实施例的细胞发酵液通过单克隆细胞发酵得到，其中聚体蛋白的浓度为0.31g/L。
实施例1
本实施例为一种三聚体蛋白的纯化方法，步骤如下：
（1）亲和层析：使用亲和层析柱对细胞发酵液进行亲和捕获，具体方法如下：依次使用1 x PBS，pH7.4平衡层析柱4CV后上样细胞发酵液，然后以1x PBS，pH7.4淋洗4CV，再以含0.4wt%甘露糖的1x PBS淋洗4CV，最后使用含10 wt %甘露糖的1xPBS洗脱三聚体蛋白，得到亲和洗脱液；
（2）超滤浓缩换液：使用超滤平衡液（1x PBS，pH7.4）对超滤膜包进行平衡润洗后，对步骤（1）的亲和洗脱液进行超滤浓缩，换液7DV后得到超滤收集液；
（3）阴离子交换层析：使用阴离子平衡液（20mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH5.6)）平衡阴离子层析柱6CV后上样步骤（2）的超滤收集液，继续使用阴离子平衡液淋洗，得到阴离子收集液；
（4）阳离子交换层析：使用20mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH5.6)平衡阳离子层析柱5CV后上样步骤（3）的阴离子收集液，之后用20mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH5.6)淋洗，最后使用含1M NaCl的 20mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液（pH5.6）对样品进行洗脱，得到阳离子收集液；
（5）复合膜过滤：使用1x PBS，pH7.4平衡复合膜后上样过滤步骤（4）的阳离子收集液，得到复合膜过滤收集液，即得纯化后的三聚体蛋白。
对比例1
本对比例提供一种三聚体蛋白的纯化方法，步骤依次为亲和层析、超滤浓缩换液、阴离子层析及分子筛层析，不包括阳离子层析及复合膜过滤。
具体步骤如下：
（1）亲和层析、超滤浓缩换液、阴离子层析同实施例1；
（2）分子筛层析：使用分子筛平衡液（1x PBS，pH7.4）对分子筛层析柱进行平衡，之后按照2%柱体积上样步骤（1）获得的阴离子收集液，上样结束后使用1x PBS，pH7.4溶液进行洗脱，得到纯化后的三聚体蛋白。
对比例2
本对比例提供一种三聚体蛋白的纯化方法，步骤依次为亲和层析、超滤浓缩换液、阴离子层析及疏水层析，不包括阳离子层析及复合膜过滤。
具体步骤如下：
（1）亲和层析、超滤浓缩换液、阴离子层析同实施例1；
（2）疏水层析：
使用3M (NH)2SO4溶液调节步骤（1）获得的阴离子收集液，使得阴离子收集液中(NH)2SO4浓度为1M，使用平衡液（含0.9M (NH)2SO4的50mM PB）平衡疏水层析柱，而后使用流动相A: 含0.9M (NH)2SO4的50mM PB ，流动相B：50mM PB, pH 7.0，按照流动相B的体积百分比由20%变化至100%，流动相A的体积百分比由80%变化至0%的程序进行10CV梯度洗脱，得到纯化后的三聚体蛋白。
对比例3
本对比例提供一种三聚体蛋白的纯化方法，其步骤同实施例1，主要区别在于：未进行复合膜过滤的步骤。
对比例4
本对比例提供一种三聚体蛋白的纯化方法，其步骤同实施例1，主要区别在于：未进行阳离子交换层析及复合膜过滤的步骤。
测试例：
采用体积排阻色谱（SEC）进行实施例和对比例制备得到的三聚体蛋白产品进行纯度检测，色谱条件如下表1所示：
表1
测试结果如下表2所示：
表2
NA*1表示样品纯度过低，未进行对应HCP含量检测。
从表2中的结果可以看出，实施例1中三聚体蛋白的SEC主峰纯度为92.91%，HCP含量为180ppm，如此说明本申请通过各纯化步骤的相互协同作用，能够达到有效去除杂质的作用，得到了纯度极高的三聚体蛋白。
对比例1与实施例1相比，增加一步分子筛层析，未进行阳离子层析及复合膜过滤步骤。结果发现，所得到的三聚体蛋白纯度下降，说明阳离子层析能够有效去除目标蛋白杂质，提高样品纯度；分子筛层析对聚集体去除效果较差，同时不便于生产放大。
对比例2与实施例1相比，增加一步疏水层析，未进行阳离子层析及复合膜过滤步骤。结果发现，所得三聚体蛋白纯度下降比例较高，说明三聚体蛋白在该条件下稳定性差，疏水层析不适用于三聚体蛋白的纯化。
对比例3与实施例1相比，未进行复合膜过滤步骤。结果发现，所得三聚体蛋白虽然纯度相当，但是HCP含量较高。这一结果表明复合膜与其余步骤相结合能够有效去除样品中的HCPs，降低产品中HCPs的含量。
对比例4与实施例1相比，未进行阳离子层析及复合膜过滤步骤，结果发现，所得三聚体蛋白纯度下降，且HCPs含量较高，说明阳离子层析及复合膜过滤步骤与其余步骤相结合能够有效去除三聚体蛋白的聚体杂质及HCPs。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

Claims (12)

1.一种聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：对含聚体蛋白的细胞发酵液进行亲和层析，收集亲和层析液，所述亲和层析采用亲和层析柱进行，所述亲和层析柱填料以扁豆凝集素为亲和介质的亲和填料；
S2：对所述亲和层析液进行超滤，收集超滤浓缩液，所述超滤采用的超滤膜的膜孔径为100KDa；
S3：对所述超滤浓缩液进行阴离子层析，收集阴离子层析液；
S4：对所述阴离子层析液进行阳离子层析，收集阳离子层析液；
S5：对所述阳离子层析液进行复合膜过滤，所述复合膜为具有季胺功能团以及胍功能团的膜；
所述聚体蛋白为三聚体蛋白。
2.根据权利要求1所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析柱为Lentil Lectin Sepharose 4B。
3.根据权利要求1或2所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析采用的洗脱程序包括：
先以0.005M~0.015MPBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比0.3%~0.5%甘露糖的0.005M~0.015M PBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比9%~11%甘露糖的0.005M~0.015M 的PBS 缓冲液进行聚体蛋白洗脱。
4.根据权利要求3所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，先以0.01MPBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比0.4%甘露糖的0.01M的PBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比10%甘露糖的0.01M的PBS缓冲液进行聚体蛋白洗脱。
5.根据权利要求1所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S2中，进行所述超滤之前，先采用0.005M~0.015MPBS缓冲液对所述超滤采用的超滤膜进行平衡。
6.根据权利要求1所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述阴离子层析采用阴离子层析柱进行，所述阴离子层析柱的填料为以-N+(CH3)3为配基的阴离子填料。
7.根据权利要求1或6所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述阴离子层析采用的洗脱程序包括：以15mM~25mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液进行淋洗。
8.根据权利要求7所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述阴离子层析采用的洗脱程序包括：以20mM的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液进行淋洗。
9.根据权利要求1所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S4中，所述阳离子层析采用阳离子层析柱进行，所述阳离子层析柱的填料为以-SO3H为配基的阳离子填料。
10.根据权利要求1或9所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S4中，所述阳离子层析采用的洗脱程序包括：以含0.5M~1.5M NaCl的15mM~25mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液进行淋洗。
11.根据权利要求10所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，以含1M NaCl的20mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液进行淋洗。
12.根据权利要求1所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S5中，进行所述复合膜过滤之前，先采用0.005M~0.015MPBS缓冲液对所述复合膜进行平衡。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974099A (zh) * 2010-11-15 2011-02-16 上海市肺科医院 结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖纯化方法及结核杆菌诊断试剂
CN102977182A (zh) * 2011-08-19 2013-03-20 Emd密理博公司 在蛋白质纯化过程中降低样品中的一种或多种杂质水平的方法
CN105017418A (zh) * 2014-03-27 2015-11-04 上海药明康德新药开发有限公司 单克隆抗体纯化工艺方法
CN107163138A (zh) * 2017-03-28 2017-09-15 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种人血浆蛋白α1‑抗胰蛋白酶的分离纯化方法
CN114539351A (zh) * 2022-01-26 2022-05-27 上海健士拜生物科技有限公司 纳米抗体的纯化方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5728553A (en) * 1992-09-23 1998-03-17 Delta Biotechnology Limited High purity albumin and method of producing
EP2406274A2 (en) * 2009-03-11 2012-01-18 Wyeth LLC Methods of purifying small modular immunopharmaceutical proteins
WO2016106291A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of purifying recombinant proteins
CN106749660B (zh) * 2016-12-27 2020-02-14 嘉和生物药业有限公司 单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法
CN109929027B (zh) * 2017-12-15 2020-10-09 山东博安生物技术有限公司 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法
JP2021528425A (ja) * 2018-06-19 2021-10-21 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ クロマトグラフィーを用いたタンパク質の精製方法
CN111153993A (zh) * 2018-11-07 2020-05-15 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司 抗TNF-α单克隆抗体的制备方法
CN111704670B (zh) * 2020-08-18 2020-11-03 迈威(上海)生物科技股份有限公司 重组抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体及其纯化方法
WO2023031965A1 (en) * 2021-09-03 2023-03-09 Dr. Reddy’S Laboratories Limited Method to obtain a purified antibody composition
CN115925890A (zh) * 2021-09-28 2023-04-07 江苏泰康生物医药有限公司 一种抗新冠病毒中和抗体纯化方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974099A (zh) * 2010-11-15 2011-02-16 上海市肺科医院 结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖纯化方法及结核杆菌诊断试剂
CN102977182A (zh) * 2011-08-19 2013-03-20 Emd密理博公司 在蛋白质纯化过程中降低样品中的一种或多种杂质水平的方法
CN105017418A (zh) * 2014-03-27 2015-11-04 上海药明康德新药开发有限公司 单克隆抗体纯化工艺方法
CN107163138A (zh) * 2017-03-28 2017-09-15 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种人血浆蛋白α1‑抗胰蛋白酶的分离纯化方法
CN114539351A (zh) * 2022-01-26 2022-05-27 上海健士拜生物科技有限公司 纳米抗体的纯化方法

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