CN111269307B - 一种去除C1酯酶抑制剂制备原料中杂蛋白IgM的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种去除C1酯酶抑制剂(C1‑INH)制备原料中杂蛋白IgM的方法，所述方法包括提供C1酯酶抑制剂制备原料以及对制备原料进行PEG(聚乙二醇)沉淀处理的步骤。本发明方法方便快捷，在进行层析步骤之前就对原料中最难去除的杂蛋白IgM进行去除，且去除方法简便高效，并减少了层析步骤，有效节省了树脂和仪器使用成本。本发明对于人C1 INH制备工艺的优化具有较高的参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种去除C1酯酶抑制剂制备原料中杂蛋白IgM的方法。
背景技术
C1酯酶抑制剂(C1-INH，C1-esterase inhibitor又称C1抑制剂或C1灭活剂)是一种不耐热的血浆蛋白，可以抑制补体因子1(C1)的酯水解活性。C1INH现在被定义为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)，它是一种血浆蛋白，能抑制多种蛋白酶，与补体、凝血、纤溶和激肽释放的活化与拮抗平衡有密切的联系，在多种生理系统中具有重要的调节作用。C1INH主要由肝脏合成，也可以由单核细胞、表皮成纤维细胞、内皮细胞分泌，其结构为单链糖蛋白，表观分子量为100～105kDa。血浆中含量约为0.2mg/ml，相当于1血浆单位(PU)每毫升，由于个体差异使含量处于0.14mg/ml和0.38mg/ml之间。
C1INH的缺乏会引起一种疾病，称为遗传性血管性水肿(HAE)，这是一种可以致残同时具有潜在致命性的疾病。它是由于C1抑制剂的合成障碍或功能缺陷所致的常染色体显性遗传病，临床特点为皮肤黏膜反复发作、自限性、局限性、非凹陷性水肿。当急性水肿发生在上呼吸道时常因喉头水肿导致患者窒息死亡。在疾病的多种治疗药物中，C1-INH副作用小，安全性和有效性高。除了在HAE的治疗中发挥作用，C1-INH还能与细菌内毒素、黏附分子E，P-选择素等结合发挥非蛋白酶抑制功能。
目前制备C1-INH的方法为三步层析：CM阳离子交换层析、DEAE阴离子交换层析、HIC疏水层析，层析步骤较多，一次实验的周期较长，实验前准备及试验后处理较复杂，且终产品中仍含有少量IgM无法去除。
发明内容
本发明提供了一种去除C1酯酶抑制剂(C1-INH)制备原料中杂蛋白IgM的方法，所述方法包括提供C1酯酶抑制剂制备原料以及对制备原料进行PEG沉淀处理的步骤。
具体而言，所述方法如下步骤：
(1)提供C1酯酶抑制剂制备原料，并调整原料的pH为6.0-7.0，优选，6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9，更优选，6.8；
(2)向步骤(1)的原料中加入一定量的PEG，混匀；优选的，所述PEG的用量占C1酯酶抑制剂制备原料的质量分数为10％-15％，优选，12％；
(3)对步骤(2)的混合物离心取上清，离心条件为3000g-20000g，离心10min-60min，优选的，10000g-15000g，离心10min-30min；温度条件为10℃-40℃，优选，20℃-30℃。
进一步的，步骤(2)在加入PEG之后，通过充分搅拌混匀。
优选的，所述PEG为PEG4000。
进一步的，在步骤(3)之后，还包括对得到的上清液进行离子交换层析的步骤。
优选的，所述离子交换层析为CM离子交换层析(羧甲基阳离子交换层析)；优选的，所述CM离子交换层析柱的类型包括但不限于XK16/20、BPG140/500等；
优选的，所述洗脱液的盐离子浓度为190mM-220mM，优选，200mM-210mM。
进一步的，所述C1酯酶抑制剂制备原料来源于血浆。
在优选的实施方式中，所述C1酯酶抑制剂制备原料为IgG FT UF/DF，所述原料IgGFT UF/DF是将血浆原料进行多次离子交换层析偶联亲和层析梯度分离提取Pg(人纤维蛋白溶酶原)、IgG(人免疫球蛋白)和Fg(人纤维蛋白原)离子交换后，经过UF/DF(超滤/透滤)得到的IgG FT UF/DF。具体的，所述制备方法包括如下步骤：
(1)冷冻血浆复融，使用深层过滤器1～4孔径滤器过滤；
(2)阴离子交换层析：层析柱型号BPG140/500，平衡条件pH7.0，收集流穿液；
(3)亲和层析：层析柱型号BPG140/500，树脂名称ECH-Lysine Sepharose 4FastFlow，平衡条件pH 7.5，收集流穿液；
(4)超滤浓缩UF/DF：获得C1 INH制备原料IgG FT UF/DF。
另一方面，本发明还提供了上述方法在制备杂蛋白IgM去除率高并且高活性的C1-INH中的应用。
其中，与C1-INH制备原料相比，最终得到的C1-INH中的IgM去除率高于99％，优选，高于99.5％、99.6％或99.7％。
C1 INH中的活性C1 INH高于1.0IU/ml，比活性高于4.0IU/mg。
本发明分别从pH值、PEG含量和离心条件三个方面考察了PEG用于人C1-INH制备原料IgG FT UF/DF中IgM的去除效果以及CM离子交换层析对活性与非活性C1-INH分离效果的判定。PEG沉淀法实验结果显示，将原料pH值调节为6.8后，加入占原料质量分数为12％的PEG4000干粉，在室温条件下连续充分搅拌1h后，以15000g，25℃条件离心20min，上清液中IgM的去除率和C1 INH的回收率达到最佳，分别为99.8％和86.2％；CM离子交换层析实验结果显示，当活性洗脱液盐离子浓度为200mM时，活性与非活性C1-INH分离效果达到最佳，活性达1.126IU/ml，比活性4.43IU/mg，明显高于上样样品，抗原回收率达39.3％，其中活性成分占比50％以上，且活性回收率达64％，同时绝大多数杂质蛋白去除率达99％以上。
通过特定蛋白检测仪(Neph)对上清液中蛋白种类及浓度进行检测，发现杂蛋白IgM的去除率较高，且目标蛋白C1-INH的回收率较高；经CM层析后，终产品中C1 INH纯度较高，且杂蛋白去除率较高。本发明方法方便快捷，在进行层析步骤之前就对原料中最难去除的杂蛋白IgM进行去除，且去除方法简便高效，并减少了层析步骤，有效节省了树脂和仪器使用成本。本发明对于人C1 INH制备工艺的优化具有较高的参考价值。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
本实施方式中采用如下方法去除C1 INH制备原料中的IgM：
调节原料pH；对原料进行称重，并向其中加入一定量的PEG4000粉末；放入与容器大小匹配的磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上，室温搅拌1h；搅拌结束后离心，离心条件：15000g，25℃，20min；离心结束后，回收上清液；之后，向PEG沉淀法获得的上清液中加入醋酸钠，调节样品至合适的上样盐离子浓度；样品充分混匀，静置后过滤；然后进行CM(羧甲基)阳离子交换层析分离。
本方案基于以下原理来实现：
蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。如破坏这两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂)蛋白质便容易凝集析出。如将蛋白质溶液pH调节到等电点，蛋白质分子呈等电状态，此时虽然分子间同性电荷相互排斥作用消失，但还有水化膜起保护作用，一般不致于发生凝聚作用，若再加入某种脱水剂，除去蛋白质分子的水化膜，则蛋白质分子就会互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白质脱水，然后再调节p H到等电点，也同样可使蛋白质沉淀析出。聚乙二醇具有一定的吸水性，且物理状态依相对分子质量不同而改变，随分子量的增大从无色无臭黏稠液体至蜡状固体。分子量200～600者常温下是液体，分子量在600以上者就逐渐变为半固体状。溶于水、乙醇和许多其它有机溶剂；蒸气压低，对热、酸、碱稳定；与许多化学品不发生反应；无毒，无刺激。PEG 4000常温下为白色固体粉末，具有一定吸湿能力，能有效破坏蛋白质分子的水化膜，使处于等电状态的蛋白质凝聚沉淀；同时，为确保对样品体积不发生较大波动，维持蛋白浓度，加入PEG 4000固体粉末较为合适。
离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性，极性，所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。层析开始前，功能基团与反离子稳定结合，就与反离子发生可逆交换，与层析剂结合被固定下来。因为盐离子可以与底物竞争功能基团，盐浓度越高样品与层析剂结合越不紧密，易被洗脱下来。不同物质与层析剂结合程度不同，洗脱下来的时间不同，因此得以分开。
实施例1、C1-INH制备原料中杂蛋白IgM的去除条件优化
1、C1-INH制备原料：
采用原料IgG FT UF/DF作为C1 INH制备原料，在其他的实施方式中，原料也可以为血浆或血浆冷上清液。
2、PEG沉淀：
离心条件初步定为3500g，25℃，20min，将原料分为两组，分别加入质量分数为10％和20％的PEG，原料初始pH值为7.8且未进行调节，加入PEG室温搅拌1h后离心，离心条件3500g、25℃，离心20min后，取上清液进行特定蛋白检测；初步确定PEG含量后，另取原料分为四组，分别调节pH值为8.0、7.0、6.0、5.0，加入PEG室温搅拌1h后离心，取上清液进行特定蛋白检测；对pH值进一步摸索，将原料分为四组，分别调节pH值为6.8、6.4、6.0、5.6，加入10％PEG室温搅拌1h后离心，取上清液进行特定蛋白检测。
PEG沉淀法条件进一步摸索：将离心力提高至15000g，离心温度与时间不变，将原料分为八组，分别调节pH值为7.0、6.8、6.6、6.4、6.3、6.1、5.9、5.7，加入10％PEG室温搅拌1h后离心，取上清液进行特定蛋白检测；将原料pH值调节为6.8，并分为八组，分别加入质量分数为5％、8％、10％、11％、14％、15％、17％、20％的PEG，室温搅拌1h，取上清液进行特定蛋白检测；进一步摸索，调节原料pH值为6.8并分为三组，分别加入质量分数为10％、12％、14％的PEG，室温搅拌1h，取上清液进行特定蛋白检测。
3、CM离子交换层析：
柱平衡：使用离子浓度为25mM的醋酸钠溶液对层析柱连续冲洗3至5个柱体积，使柱内树脂状态达到可上样标准。
上样样品处理：向PEG沉淀上清液中加入1M的醋酸钠溶液，加入量为上清液质量的1/39，使得醋酸钠离子浓度达到25mM；充分混匀后室温静置1h后过滤，作为上样样品。
流穿：目标蛋白C1-INH与少量其他杂质蛋白与树脂结合，同时PEG与Alb从流穿液中得以去除。
淋洗：使用含25mM醋酸钠和100mM氯化钠的淋洗缓冲液对层析柱进行冲洗，使CER(铜蓝蛋白)和TRF(转铁蛋白)等杂质蛋白与树脂分离，同时不影响目标蛋白与树脂的结合。
目标蛋白洗脱及活性与非活性成分分离：
活性C1-INH洗脱：原有方法为使用含25mM醋酸钠和180mM氯化钠的洗脱缓冲液对活性C1-INH进行洗脱，但未能完全将活性成分分离，现提高氯化钠盐离子浓度，分别用含190mM、200mM、210mM氯化钠的缓冲液对活性成分进行洗脱，根据蛋白含量及活性检测结果选取最佳的盐离子浓度。
非活性C1-INH及其他蛋白洗脱：使用常规洗脱液(25mM醋酸钠、500mM氯化钠)对非活性C1-INH及少量其他杂质蛋白进行洗脱。
实施例2、C1 INH制备原料中杂蛋白IgM的去除条件优化结果
2.1PEG沉淀
2.1.1预实验结果显示，在离心条件为3500g(25℃，20min)时，未调节pH的原料在分别加入10％和20％PEG时，IgM的去除率接近，分别为52.4％和52.8％，但C1-INH的回收率分别为93.8％和76.0％，结果见表1；故暂定PEG含量为10％，对pH值进行初筛及复筛，发现在pH6.4时，IgM去除率(>95.4％)和C1-INH回收率(90.8％)均较高，结果见表2、3，结果汇总见表4。
表1.在3500g，pH 7.8时不同PEG含量对原料中IgM和C1-INH的影响
表2.在3500g，PEG10％时，pH值5.0-8.0对原料中IgM和C1 INH的影响
表3.在3500g，PEG10％时，pH值5.7-7.0对原料中IgM和C1 INH的影响
表4.PEG沉淀预实验结果
2.1.2进一步摸索结果显示，在离心条件为15000g(25℃，20min)时，当加入PEG的含量为10％时，在pH6.8的条件下，IgM的去除率和C1-INH的回收率均较高，分别为99.5％和89.2％(表7)，PEG含量广筛结果见表5；确定pH值后，对PEG含量进行细致筛选，发现在PEG含量为12％时，IgM去除率和C1-INH回收率达到最佳，分别为99.8％和86.2％，结果见表6。汇总结果见表7。
表5.在pH值为6.8时，不同PEG含量对原料中IgM和C1 INH的影响
表6.在pH值为6.8时，PEG含量为10％、12％、14％对原料中IgM和C1-INH的影响
表7.PEG沉淀法条件进一步摸索结果
综上所述，PEG沉淀法最佳条件为：调节原料为pH6.8，加入占原料质量分数12％的PEG，在15000×g，25℃条件下，离心20min。
2.2CM离子交换层析
盐浓度线性梯度摸索结果显示，氯化钠浓度在200-210mM时洗脱液中的C1-INH比活性最高，故选择200mM氯化钠作为有活性的C1-INH洗脱条件进行纯化；过程样品的蛋白种类及浓度检测结果显示，与上样样品相比，Elu1(200mM)中7个主要杂质蛋白(IgM、Alb、TRF、CER、IgG)的去除率在99％以上，C1-INH的抗原回收率达39.3％，Elu2(500mM)中的抗原回收率达34.8％；活性检测结果显示，有活性的C1-INH主要集中在目标样品Elu1(200mM)中，其余样品中几乎不含活性成分，该纯化步骤的活性回收率达64.5％，且比活性明显高于上样样品，结果见表8、9。
表8.CM离子交换层析每步样品中C1-INH比活性检测结果
表9.CM离子交换层析每步样品蛋白种类及浓度检测结果
本发明分别从pH值、PEG含量和离心条件三个方面考察了PEG用于人C1-INH制备原料IgG FT UF/DF中IgM的去除效果以及CM离子交换层析对活性与非活性C1-INH分离效果的判定。PEG沉淀法实验结果显示，将原料pH值调节为6.8后，加入占原料质量分数为12％的PEG4000干粉，在室温条件下连续充分搅拌1h后，以15000g，25℃条件离心20min，上清液中IgM的去除率和C1INH的回收率达到最佳，分别为99.8％和86.2％；CM离子交换层析实验结果显示，当活性洗脱液盐离子浓度为200mM时，活性与非活性C1-INH分离效果达到最佳，活性达1.126IU/ml，比活性4.43IU/mg，明显高于上样样品，抗原回收率达39.3％，其中活性成分占比50％以上，且活性回收率达64％，同时绝大多数杂质蛋白去除率达99％以上。
Claims (2)
1.一种去除C1酯酶抑制剂制备原料中杂蛋白IgM的方法，所述C1酯酶抑制剂制备原料来源于血浆，所述方法包括如下步骤：
（1）调整所述C1酯酶抑制剂制备原料的pH为6.8；
（2）向步骤（1）的原料中加入一定量的PEG4000，混匀，所述PEG的用量占C1酯酶抑制剂制备原料的质量分数为12%；
（3）对步骤（2）的混合物离心取上清液，离心条件为15000g，离心时间为10min-60min；
（4）对步骤（3）得到的上清液进行CM离子交换层析，所述离子交换层析中洗脱液的盐离子浓度为200mM-210mM；
所述的C1酯酶抑制剂制备原料的制备方法包括如下步骤：
1）冷冻血浆复融，使用深层过滤器1~4孔径滤器过滤；
2）阴离子交换层析：层析柱型号BPG140/500，平衡条件pH 7.0，收集流穿液；
3）亲和层析：层析柱型号BPG140/500，树脂名称ECH-Lysine Sepharose 4 Fast Flow，平衡条件pH 7.5，收集流穿液；
4）超滤浓缩UF/DF：获得C1酯酶抑制剂制备原料。
2.权利要求1所述的方法在制备杂蛋白IgM去除率高并且高活性的C1酯酶抑制剂中的应用；其特征在于，与C1酯酶抑制剂制备原料相比，最终得到的C1酯酶抑制剂中的IgM去除率高于99%；C1酯酶抑制剂中的活性C1酯酶抑制剂高于1.0 IU/ml，比活性高于4.0 IU/mg。
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