CN111269316A - 抗her2单克隆抗体的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本方法涉及抗HER2单克隆抗体的纯化方法，包括亲和层析，病毒灭活，深层过滤，阴离子交换层析，阳离子交换层析等步骤。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质纯化领域，具体而言涉及一种抗HER2单克隆抗体的制备或纯化方法。
背景技术
人类表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2，HER2)是结合在细胞膜表面的受体酪氨酸激酶，参与细胞生长和分化的信号传导途径。HER2过度表达可导致肿瘤患者体内的癌细胞快速繁殖，还容易产生抗药性，降低患者生存时间。曲妥珠单抗(trastuzumab)是一种针对HER2的重组人源化IgG型单克隆抗体，能特异性识别Her2调控的细胞表面蛋白HER2胞外结构域IV，阻止表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)与HER2结合并抑制EGF-HER2二聚体介导的信号转导，从而抑制癌细胞的增殖，达到治疗肿瘤的作用。大量临床资料证实曲妥珠单抗能有效治疗HER2阳性乳腺癌，而且与化疗联合应用时明显提高患者生存时间，减少再复发几率。除此之外，曲妥珠单抗还被批准用于治疗转移性胃癌，目前仍在研究其治疗其他癌症的可能性，表明HER2单克隆抗体具有重要的医药价值。
医药工业中大多抗体药物是通过哺乳动物细胞(如CHO、BHK细胞等)进行表达，其方法包括将含有目的基因的重组质粒插入到该细胞系中，富集能够大量表达目的蛋白的细胞进行培养，得到包含目的蛋白、电荷异构体、聚合物高分子量杂质、宿主细胞蛋白(HostCell Protein，HCP)、残余DNA、培养基组分等多种成分的细胞培养物。电荷异构体是由于抗体分子所带的电荷出现差异而形成的异构体，包括酸性异构体和碱性异构体，产生原因主要与脱酰胺化、糖基化、氧化、C端赖氨酸修饰等翻译后修饰有关。这些电荷异构体可能会对抗体的稳定性、药效、免疫原性或药代动力学产生影响。聚合物高分子量杂质是药品中分子量大于抗体药物本身的杂质的总称，包括外源性蛋白、多糖和内源性抗体自身聚合物产物。高分子量杂质的存在对抗体药物质量的影响很大，如增加免疫原性，引起不良反应，增加抗药性抗体的形成等。抗体药物中的HCP和残余DNA亦可能会导致患者出现不可预测的免疫反应和潜在的致癌风险。为了确保药物的安全性，需要将抗体和电荷异构体、聚合物高分子量杂质、HCP以及残余DNA等杂质进行分离，使抗体达到人治疗用的纯度。
下游纯化步骤是保证抗体药物质量和安全的重要手段，但其又是抗体药物生产中十分复杂的部分，工艺中任何不完善都可能造成极大的损失。因此，HER2单克隆抗体下游纯化工艺的开发不仅能降低药物生产成本，保证产品质量，还可以有效地推动HER2单克隆抗体在医药中的应用。Genentech公司的纯化手段包括亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析，步骤繁琐。为了解决上述问题，本发明提供了一种可以提高单克隆抗体产品的纯度的方法，操作简单，且能有效去除抗体中的污染物。
发明内容
一方面本发明提供一种可以提高单克隆抗体产品的纯度，适合工业化放大生产的抗体纯化工艺方法。
另一方面，本发明的目的还在于提供一种纯化蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)细胞培养液深层过滤；
(b)亲和层析；
(c)病毒灭活；
(d)二次深层过滤；
(e)阴离子交换层析；
(f)阳离子交换层析；
(g)病毒过滤和/或超滤。
在一些具体实施例中，所述(a)-(g)各步骤是依次进行的。
在一些具体实施例中，深层过滤可以采用两级深层过滤，滤膜为D0HC和A1HC滤膜。
在一些具体实施例中，细胞培养液深层过滤步骤包括但不限于水洗、缓冲液平衡、细胞培养液过滤、平衡缓冲液洗涤、膜包排空。
在一些具体实施例中，所述亲和层析可以采用Protein A亲和层析填料，ProteinA可特异性吸附抗体的Fc片段。细胞培养液上样后进行一系列的淋洗，去除杂质，最后洗脱得到单克隆抗体纯度提高的洗脱液。
在一些具体实施例中，亲和层析包括但不限于消毒、平衡、上样、淋洗、洗脱、再生等步骤。在一些具体实施例中，所述淋洗包括上样后用平衡缓冲液(具有第一亲和pH和或/第一亲和电导率)进行冲洗，之后用淋洗缓冲液(具有第二亲和pH和或/第二亲和电导率)进行淋洗，再用洗涤缓冲液(具有第三亲和pH和或/第三亲和电导率)进行淋洗。
在一些具体实施例中，亲和层析的淋洗过程包括缓冲液pH和电导率的变化，其中pH值的变化趋势与电导率的变化趋势相反。优选的是，淋洗缓冲液的pH值低于平衡缓冲液和洗涤缓冲液的pH值，淋洗缓冲液的电导率高于平衡缓冲液和洗涤缓冲液的电导率。
在一些实施例中，所述亲和层析淋洗缓冲液的pH值比平衡缓冲液的pH值至少低约1.5或更多。在一些具体实施例中，亲和层析淋洗缓冲液的pH值比平衡缓冲液的pH值低至少约1.5，至少约1.6，至少约1.7，至少约1.8，至少约1.9，至少约2.0，至少约2.1，至少约2.2，至少约2.3，至少约2.4，至少约2.5，至少约2.6，至少约2.7，至少约2.8，至少约2.9，至少约3.0，至少约3.1，至少约3.2，至少约3.3，至少约3.4，或至少约3.5以上。
在一些实施例中，所述亲和层析淋洗缓冲液的电导率比平衡缓冲液的电导率至少高约6倍或更多。在一些具体实施例中，亲和层析淋洗缓冲液的电导率比平衡缓冲液的电导率高至少约6倍，至少约6.1倍，至少约6.2倍，至少约6.3倍，至少约6.4倍，至少约6.5倍，至少约6.6倍，至少约6.7倍，至少约6.8倍，至少约6.9倍，至少约7.0倍，至少约7.1倍，至少约7.2倍，至少约7.3倍，至少约7.4倍，或至少约7.5倍。
在一些具体实施例中，亲和层析的平衡缓冲液采用含氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，其中氯化钠浓度可以为约70-90mM，优选为约75-85mM，例如约75mM，约76mM，约77mM，约78mM，约79mM，约80mM，约81mM，约82mM，约83mM，约84mM或约85mM。在一些具体实施例中，亲和层析平衡缓冲液的电导率可以为约6-18mS/cm，优选为约10-18mS/cm，最优选为约12mS/cm至15mS/cm之间，例如是约12.5-12.9mS/cm。在一些具体实施例中，亲和层析平衡缓冲液的电导率可以为约6mS/cm，约7mS/cm，约8mS/cm，约9mS/cm，约10mS/cm，约11mS/cm，约12mS/cm，约13mS/cm，约14mS/cm，约15mS/cm，约16mS/cm，约17mS/cm，或约18mS/cm。在另一些具体实施例中，亲和层析平衡缓冲液的pH值可以为约6-8.5，优选为约6.5-8，例如为约6.5，约6.6，约6.7，约6.8，约6.9，约7.0，约7.1，约7.2，约7.3，约7.4，约7.5，约7.6，约7.7，约7.8，约7.9，或约8.0。
在一些具体实施例中，亲和层析淋洗缓冲液可选自含氯化钠的50mM乙酸钠缓冲液，其中氯化钠浓度可以为约0.2-5M，优选为约0.5-2M，例如为约0.5M，约0.6M，约0.7M，约0.8M，约0.9M，约1.0M，约1.1M，约1.2M，约1.3M，约1.4M，约1.5M，约1.6M，约1.7M，约1.8M，约1.9M，或约2.0M。在一些具体实施例中，亲和层析淋洗缓冲液的电导率可以为约60-120mS/cm，优选为约70-100mS/cm，更优选为约80-90mS/cm，最优选为在84mS/cm至86mS/cm之间，例如是约84.2-85.6mS/cm。在一些具体实施例中，亲和层析淋洗缓冲液的电导率可以为约80mS/cm，约81mS/cm，约82mS/cm，约83mS/cm，约84mS/cm，约85mS/cm，约86mS/cm，约87mS/cm，约88mS/cm，约89mS/cm，约90mS/cm。在另一些具体实施例中，亲和层析淋洗缓冲液的pH值可以为约3-6，优选为约4-6，最优选为约4-5，例如为约4.0，约4.1，约4.2，约4.3，约4.4，约4.5，约4.6，约4.7，约4.8，约4.9，或约5.0。
在一些具体实施例中，亲和层析采用低pH和低电导率的缓冲液进行洗脱，所述pH值低于上述亲和层析的平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗涤缓冲液的pH，所述电导率低于上述亲和层析的平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗涤缓冲液的电导率。在一些具体实施例中，亲和层析洗脱缓冲液的pH值可以为约2-5，优选为约2.5-4.5，例如为约2.5，约2.6，约2.7，约2.8，约2.9，约3.0，约3.1，约3.2，约3.3，约3.4，约3.5，约3.6，约3.7，约3.8，约3.9，约4.0，约4.1，约4.2，约4.3，约4.4，或约4.5。在一些具体实施例中，亲和层析洗脱缓冲液的电导率不超过6mS/cm，例如洗脱缓冲液电导率可以是约3.5-5mS/cm，具体地，可以为约3.5mS/cm，约3.6mS/cm，约3.7mS/cm，约3.8mS/cm，约3.9mS/cm，约4.0mS/cm，约4.1mS/cm，约4.2mS/cm，约4.3mS/cm，约4.4mS/cm，约4.5mS/cm，约4.6mS/cm，约4.7mS/cm，约4.8mS/cm，约4.9mS/cm，约5.0mS/cm，约5.1mS/cm，约5.2mS/cm，约5.3mS/cm，约5.4mS/cm，约5.5mS/cm，约5.6mS/cm，约5.7mS/cm，约5.8mS/cm，约5.9mS/cm，或约6.0mS/cm。在一些具体实施例中，亲和层析洗脱缓冲液的电导率是约4.5-4.8mS/cm。在一些具体实施例中，亲和层析洗脱缓冲液采用含氯化钠的50mM柠檬酸钠缓冲液，其中氯化钠的浓度优选为约10-30mM，优选为约15-25mM，例如可以为约15mM，约16mM，约17mM，约18mM，约19mM，约20mM，约21mM，约22mM，约23mM，约24mM，约25mM。
在一些具体实施例中，所述第一亲和pH和/或第一亲和电导率与第三亲和pH和/或第三亲和电导率相同。
在一些具体实施例中，所述亲和层析的上样缓冲液、平衡缓冲液的pH和/或电导率与洗涤缓冲液的pH和/或电导率相同。
在一些具体实施例中，所述亲和层析还包括在淋洗后采用pH和/或电导率低于平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗涤缓冲液pH和/或电导率的洗脱缓冲液洗涤目的蛋白。
在一些具体实施例中，病毒灭活是调整样品pH至酸性，破坏病毒外膜导致其失去感染性。
在一些具体实施例中，上述二次深层过滤后得到的溶液需要进行pH调节。
在一些具体实施例中，阴离子交换层析采用流动-通过模式，即抗体穿过层析柱而杂质吸附在层析柱上，来进一步去除残余DNA、内毒素、脱落Protein A等杂质。
在一些具体实施例中，阴离子交换层析可以采用常规或商业化的各种填料，例如采用POROS 50HQ阴离子填料。在一些具体实施例中，所述阴离子交换层析的步骤包括但不限于预平衡、平衡、上样、平衡、再生，平衡缓冲液可选自含10mM氯化钠的20mM Tris溶液，平衡缓冲液的pH值可选自6-8。
在一些具体实施例中，经过上述阴离子层析的收获液需要进行pH或电导率的调节。
在一些具体实施例中，将包含抗体的样品加载到阳离子交换层析材料上，保留时间可选自6-12分钟，优选为6-10分钟。
在一些具体实施例中，阳离子交换层析可以采用常规填料或商业化的填料，例如采用POROS XS阳离子填料。在一些具体实施例中，阳离子交换层析步骤包括但不限于预平衡，平衡，上样，淋洗，洗脱，再生等。在一些具体实施例中，所述的淋洗包括1-4次淋洗，例如1次淋洗，2次淋洗，3次淋洗，或4次淋洗，优选为4次淋洗。在一些具体实施例中，所述阳离子交换层析步骤中缓冲液的温度保持大致稳定。
在一些具体实施例中，采用高pH和或/高电导率的缓冲液进行预平衡，缩短平衡时间。
在一些具体实施例中，阳离子交换层析的淋洗步骤包括淋洗缓冲液pH和电导率的改变，如上升或下降。在一些具体实施方案中，层析柱平衡后将产品加载到阳离子交换材料中，所述组合物处于第一阳离子交换电导率，用平衡缓冲液(又称第一淋洗缓冲液)进行第一次淋洗(淋洗1)，之后用电导率低于所述第一阳离子交换电导率的具有第二阳离子交换电导率的第二淋洗缓冲液进行第二次淋洗(淋洗2)，再用电导率低于所述第二阳离子交换电导率的具有第三阳离子交换电导率的第三淋洗缓冲液进行第三次淋洗(淋洗3)，最后用电导率大于第二、第三阳离子交换电导率，但低于第一阳离子交换电导率的具有第四阳离子交换电导率的第四淋洗缓冲液进行第四次淋洗(淋洗4)。
在一些实施方案中，阳离子交换层析的第二淋洗缓冲液电导率比第一淋洗缓冲液电导率低至少约4mS/cm以上。在一些具体实施方案中，所述第二阳离子交换电导率比第一阳离子交换电导率低至少约4.0mS/cm，至少约4.1mS/cm，至少约4.2mS/cm，至少约4.3mS/cm，至少约4.4mS/cm，至少约4.5mS/cm，至少约4.6mS/cm，至少约4.7mS/cm，至少约4.8mS/cm，至少约4.9mS/cm，至少约5.0mS/cm，至少约5.1mS/cm，至少约5.2mS/cm，至少约5.3mS/cm，至少约5.4mS/cm，至少约5.5mS/cm，至少约5.6mS/cm，至少约5.7mS/cm，至少约5.8mS/cm，至少约5.9mS/cm，或至少约6.0mS/cm。在一些实施方案中，阳离子交换层析的第三淋洗缓冲液电导率比第二淋洗缓冲液电导率低至少约1mS/cm以上。在一些具体实施方案中，所述第三阳离子交换电导率比第二阳离子交换电导率低至少约1.0mS/cm，至少约1.1mS/cm，至少约1.2mS/cm，至少约1.3mS/cm，至少约1.4mS/cm，至少约1.5mS/cm，至少约1.6mS/cm，至少约1.7mS/cm，至少约1.8mS/cm，至少约1.9mS/cm，至少约2.0mS/cm，至少约2.1mS/cm，至少约2.2mS/cm，至少约2.3mS/cm，至少约2.4mS/cm，或至少约2.5mS/cm。在一些实施方案中，阳离子交换层析的第四淋洗缓冲液电导率比第三淋洗缓冲液电导率高至少约1.5mS/cm以上，比第二淋洗缓冲液电导率高至少约0.3mS/cm以上，但比第一淋洗缓冲液的电导率低至少约3.5mS/cm以上。在一些具体实施方案中，所述第四阳离子交换电导率比第三阳离子交换电导率高至少约1.5mS/cm，至少约1.6mS/cm，至少约1.7mS/cm，至少约1.8mS/cm，至少约1.9mS/cm，至少约2.0mS/cm，至少约2.1mS/cm，至少约2.2mS/cm，至少约2.3mS/cm，至少约2.4mS/cm，至少约2.5mS/cm，至少约2.6mS/cm，至少约2.7mS/cm，至少约2.8mS/cm，至少约2.9mS/cm，至少约3.0mS/cm，至少约3.1mS/cm，至少约3.2mS/cm，至少约3.3mS/cm，至少约3.4mS/cm，或至少约3.5mS/cm。在一些具体实施方案中，所述第四阳离子交换电导率比第二阳离子交换电导率高至少约0.3mS/cm，至少约0.4mS/cm，至少约0.5mS/cm，至少约0.6mS/cm，至少约0.7mS/cm，至少约0.8mS/cm，至少约0.9mS/cm，或至少约1.0mS/cm。在一些具体实施方案中，所述第四阳离子交换电导率比第一阳离子交换电导率低至少约3.5mS/cm，至少约3.6mS/cm，至少约3.7mS/cm，至少约3.8mS/cm，至少约3.9mS/cm，至少约4.0mS/cm，至少约4.1mS/cm，至少约4.2mS/cm，至少约4.3mS/cm，至少约4.4mS/cm，至少约4.5mS/cm，至少约4.6mS/cm，至少约4.7mS/cm，至少约4.8mS/cm，至少约4.9mS/cm，至少约5.0mS/cm，至少约5.1mS/cm，至少约5.2mS/cm，至少约5.3mS/cm，至少约5.4mS/cm，或至少约5.5mS/cm。
在一些具体实施例中，阳离子交换层析的平衡、上样缓冲液和/或第一淋洗缓冲液的电导率相同或不同。
在一些具体实施例中，阳离子交换层析的平衡缓冲液、上样缓冲液和/或第一淋洗缓冲液采用含氯化钠的20mM柠檬酸盐缓冲液，pH约为5.0-5.2。在一些具体实施例中，阳离子交换层析的平衡缓冲液、上样缓冲液和/或第一淋洗缓冲液中氯化钠的浓度可以为约30-60mM，优选为约40-55mM，例如约40mM，约41mM，约42mM，约43mM，约44mM，约45mM，约46mM，约47mM，约48mM，约49mM，约50mM，约51mM，约52mM，约53mM，约54mM，或约55mM。在一些具体实施方案中，阳离子交换层析的平衡缓冲液、上样缓冲液和/或第一淋洗缓冲液的电导率可以为约7-10mS/cm，优选为约8-9mS/cm，更优选为约8.3-8.9mS/cm。在一些实施方案中，阳离子交换层析的第一淋洗缓冲液的电导率为约7.0mS/cm，约7.1mS/cm，约7.2mS/cm，约7.3mS/cm，约7.4mS/cm，约7.5mS/cm，约7.6mS/cm，约7.7mS/cm，约7.8mS/cm，约7.9mS/cm，约8.0mS/cm，约8.1mS/cm，约8.2mS/cm，约8.3mS/cm，约8.4mS/cm，约8.5mS/cm，约8.6mS/cm，约8.7mS/cm，约8.8mS/cm，约8.9mS/cm，约9.0mS/cm，约9.1mS/cm，约9.2mS/cm，约9.3mS/cm，约9.4mS/cm，或约9.5mS/cm。在一些实施方案中，阳离子交换层析的第一淋洗缓冲液为含45mM氯化钠的20mM柠檬酸钠缓冲液，pH约为5.0-5.2，电导率约为8.3-8.9mS/cm。
在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第二淋洗缓冲液采用磷酸盐缓冲液，优选pH约为7.6。在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第二淋洗缓冲液可以采用浓度为1-50mM的磷酸钾缓冲液，浓度优选为约10-40mM，最优选为约10-30mM，例如约10mM，约11mM，约12mM，约13mM，约14mM，约15mM，约16mM，约17mM，约18mM，约19mM，约20mM，约21mM，约22mM，约23mM，约24mM，约25mM，约26mM，约27mM，约28mM，约29mM，或约30mM。在一些具体实施方案中，阳离子交换层析的第二淋洗缓冲液的电导率可以为约2-5mS/cm，优选为约3-5mS/cm，更优选为约3.5-3.8mS/cm。在一些具体实施方案中，阳离子交换层析的第二淋洗缓冲液的电导率可以为约3.0mS/cm，约3.1mS/cm，约3.2mS/cm，约3.3mS/cm，约3.4mS/cm，约3.5mS/cm，约3.6mS/cm，约3.7mS/cm，约3.8mS/cm，约3.9mS/cm，约4.0mS/cm，约4.1mS/cm，约4.2mS/cm，约4.3mS/cm，约4.4mS/cm，约4.5mS/cm，约4.6mS/cm，约4.7mS/cm，约4.8mS/cm，约4.9mS/cm，或约5.0mS/cm。在一些具体实施方案中，阳离子交换层析的第二淋洗缓冲液为20mM K2HPO4-KH2PO4，pH约为7.6，电导率约为3.5-3.8mS/cm。
在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第二淋洗缓冲液、第三淋洗缓冲液和第四淋洗缓冲液包含相同或不同的盐。在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第二、三淋洗缓冲液中包含相同的盐，第四淋洗缓冲液中含有与第二、三淋洗缓冲液不同的盐。在一些具体实施例中，所述的盐可选自钠盐和钾盐。在一些具体实施例中，所述淋洗2之后，采用pH相同，但缓冲液种类不同的缓冲液分别进行淋洗3和淋洗4，所述不同缓冲液优选含不同盐的缓冲液，所述的盐优选钠盐或钾盐。在一些具体的实施例中，上述方法可以使目标蛋白在淋洗过程中被洗脱的量减少约1-2％。在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第三淋洗缓冲液和第四淋洗缓冲液可选自20mmol/L的磷酸盐缓冲液或20mmol/L的柠檬酸盐缓冲液，缓冲液的pH值可以为约4-6，优选为约5.5。
在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第三淋洗缓冲液电导率可以为约1-5mS/cm，优选为约1-3mS/cm，更优选为1.9-2.0ms/cm。在一些具体实施方案中，阳离子交换层析的第三淋洗缓冲液的电导率可以为约1.0mS/cm，约1.1mS/cm，约1.2mS/cm，约1.3mS/cm，约1.4mS/cm，约1.5mS/cm，约1.6mS/cm，约1.7mS/cm，约1.8mS/cm，约1.9mS/cm，约2.0mS/cm，约2.1mS/cm，约2.2mS/cm，约2.3mS/cm，约2.4mS/cm，约2.5mS/cm，约2.6mS/cm，约2.7mS/cm，约2.8mS/cm，约2.9mS/cm，或约3.0mS/cm。在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第三淋洗缓冲液为20mM K2HPO4-KH2PO4，pH约为5.5，电导率约为1.9-2.0ms/cm。
在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第四淋洗缓冲液电导率可以为约2-6mS/cm，优选为约3-5mS/cm，更优选为4.0-4.2mS/cm。在一些具体实施方案中，阳离子交换层析的第四淋洗缓冲液的电导率可以为约3.0mS/cm，约3.1mS/cm，约3.2mS/cm，约3.3mS/cm，约3.4mS/cm，约3.5mS/cm，约3.6mS/cm，约3.7mS/cm，约3.8mS/cm，约3.9mS/cm，约4.0mS/cm，约4.1mS/cm，约4.2mS/cm，约4.3mS/cm，约4.4mS/cm，约4.5mS/cm，约4.6mS/cm，约4.7mS/cm，约4.8mS/cm，约4.9mS/cm，或约5.0mS/cm。在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第四淋洗缓冲液为20mM柠檬酸钠缓冲液，pH约为5.5，电导率约为4.0-4.2mS/cm。
在一些具体实施例中，阳离子交换层析采用电导率不超过15mS/cm的缓冲液对结合在层析材料上的单克隆抗体进行洗脱，例如采用电导率为约12.0mS/cm，约12.1mS/cm，约12.2mS/cm，约12.3mS/cm，约12.4mS/cm，约12.5mS/cm，约12.6mS/cm，约12.7mS/cm，约12.8mS/cm，约12.9mS/cm，约13.0mS/cm，约13.1mS/cm，约13.2mS/cm，约13.3mS/cm，约13.4mS/cm，约13.5mS/cm，约13.6mS/cm，约13.7mS/cm，约13.8mS/cm，约13.9mS/cm，约14.0mS/cm，约14.1mS/cm，约14.2mS/cm，约14.3mS/cm，约14.5mS/cm，约14.6mS/cm，约14.7mS/cm，约14.8mS/cm，约14.9mS/cm，或约15.0mS/cm的缓冲液进行洗脱。在一些具体实施例中，阳离子交换层析的洗脱缓冲液采用含氯化钠的20mM柠檬酸盐缓冲液，其中氯化钠的浓度可以为约60-120mM，优选为约80-100mM，例如为约80mM，约81mM，约82mM，约83mM，约84mM，约85mM，约86mM，约87mM，约88mM，约89mM，约90mM，约91mM，约92mM，约93mM，约94mM，约95mM，约96mM，约97mM，约98mM，约99mM，或约100mM。在一些具体实施例中，阳离子交换层析的洗脱缓冲液为含93mM氯化钠的20mM柠檬酸钠缓冲液，pH约为5.5，电导率约为13.0-13.5mS/cm。
在一些具体实施例中，亲和层析的平衡缓冲液是含80mM氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液，pH＝7.0，所述磷酸盐缓冲液优选是磷酸钠缓冲液，例如是Na2HPO4、NaH2PO4配制得到的缓冲液，又例如，用磷酸调节pH。在一些具体实施例中，亲和层析的淋洗缓冲液是含1M氯化钠(NaCl)的50mM乙酸盐缓冲液，pH＝4.5，所述乙酸盐缓冲液优选乙酸和乙酸钠配制得到的乙酸钠缓冲液。在一些具体实施例中，亲和层析的洗涤缓冲液是含80mM氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液，pH＝7.0，所述磷酸盐缓冲液优选Na2HPO4和NaH2PO4配制得到的缓冲液。在一些具体实施例中，亲和层析的洗脱缓冲液是含20mM氯化钠的50mM柠檬酸盐缓冲液，pH＝3.4，所述柠檬酸盐缓冲液优选柠檬酸和柠檬酸钠配制得到的缓冲液。
在一些具体实施例中，阳离子交换层析的平衡缓冲液、上样缓冲液或第一淋洗缓冲液是含45mM氯化钠的20mM柠檬酸盐缓冲液，pH＝5.0，所述柠檬酸盐缓冲液优选柠檬酸和柠檬酸钠配制得到的柠檬酸钠缓冲液。在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第二淋洗缓冲液是20mM磷酸钾(K2HPO4-KH2PO4)缓冲液，pH＝7.6。在一些具体实施例中，阳离子交换层析的第三淋洗缓冲液是20mM磷酸钾(K2HPO4-KH2PO4)缓冲液，pH＝5.5。在一些具体实施例中，阳离子交换层析第四淋洗缓冲液是20mM柠檬酸钠缓冲液，pH＝5.5。在一些具体实施例中，阳离子交换层析洗脱缓冲液是含93mM氯化钠的20mM柠檬酸钠缓冲液，pH＝5.5。
在溶液中，电导率的调节可以通过改变其中的离子浓度来改变，例如可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠、或氯化钾)的浓度来实现期望的电导率，所述的盐优选钠盐和钾盐。
在一些具体实施例中，上述阳离子交换层析的洗脱液经过病毒过滤和超滤换液，得到一种高度稳定的抗体组合物。
在一些具体实施方案中，所述的细胞培养液来自哺乳动物细胞的培养液，例如CHO细胞的培养液。
在一些具体实施例中，所述抗HER2抗体蛋白是结合人HER2的单克隆抗体，包括但不限于曲妥珠单抗。
在一些具体的实施方案中，本发明制备的单克隆抗体酸性异构体小于19％，更优选的小于18.5％。在一些具体的实施方案中，本发明制备的单克隆抗体碱性异构体小于9％，更优选的小于8.5％。
在一些具体的实施方案中，本发明制备的单克隆抗体的单体含量大于99.0％，更优选地大于99.5％。
在又一个方面，本发明提供了药物组合物的制备工艺，所述工艺包括采用本发明提供的纯化方法对蛋白质进行纯化。
本发明的方法至少具有如下有益效果：采用在亲和层析淋洗过程中增加缓冲液电导率，降低缓冲液的pH，在阳离子交换层析淋洗过程中改变或大幅改变缓冲液的电导率，提高了单克隆抗体的纯度。
术语解释
除非另行指明，本发明所用的技术和科学术语的含义等同于本领域普通技术人员的普遍理解。对于本发明一个术语存在多个定义的情况，除非另行指明，应采用本节所用定义。
“纯化”是指从含有抗体和一种或多种污染物的组合物中，完全或部分的除去至少一种污染物来提高组合物中抗体的纯度的技术。“纯化步骤”可以是得到含期望抗体纯度的组合物的总纯化过程中的一部分。
“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗药性”是指药物治疗和改善疾病的效力降低。
“基因工程改造”是指应用分子生物学方法将包含目的蛋白基因的重组质粒插入到细胞系中，使该细胞系能长期稳定表达目的蛋白。
“重组质粒”是指用酶切割目的基因和质粒，再将两者连接起来，使目的基因能够在质粒中进行克隆的质粒。
“宿主细胞”是指将包含目的基因的重组质粒导入后，能表达目的蛋白的细胞系，一般具备生长特性好，无血清培养密度高，异源蛋白表达能力强，正确的翻译后修饰能力。抗体药物的生产优选哺乳动物细胞。
“污染物”是指与期望的抗体产物不同的物质。污染物包括但不限于：宿主细胞物质，宿主细胞蛋白；核酸；期望抗体的变体、片段、聚集物或衍生物；其它多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分。
“淋洗”表示将溶液应用于层析材料以从层析材料中除去非特异性结合的多肽和非多肽化合物，尤其是除去宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和聚合物等杂质。术语“淋洗”不包括从层析材料上大量洗脱结合的抗体。
“洗涤缓冲液”是指在目的蛋白洗脱下来之前，用来洗涤或重新平衡柱材料的缓冲液。洗涤缓冲液和上样缓冲液、平衡缓冲液可以使用同一缓冲液。
“洗脱缓冲液”是指用于洗脱结合在固相的目的抗体的缓冲液，缓冲液中的pH或电导率能使目的抗体从固相材料中洗脱下来。
“流动-通过模式”是指通过设定上样缓冲液的条件，从而使目的蛋白在经过层析柱材料时不与层析柱结合而直接流通，但其中的污染物如宿主DNA等被捕获，从而达到分离的效果。
“电导率”是指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。溶液中的电导率可以通过本领域技术人员已知的标准方法确定。
“抗体组合物”是指包含抗体，并至少包含缓冲液、等渗调节剂、稳定剂/表面活性剂中的一种或多种。该组合物能阻止其中抗体聚合物的增长，同时能使抗体长时间维持较高的生物学活性。
除特别声明外，本发明中的“约”是指在所给定的具体数值范围±5％范围内波动，优选在±2％范围内波动，更优选在±1％范围内波动。例如pH值为约5.5表示pH为5.5±5％，优选pH为5.5±2％，更优选pH为5.5±1％。
附图说明
图1HER2单克隆抗体的CE-SDS电泳图，包括CE-SDS非还原电泳图(图1A)和CE-SDS还原电泳图(图1B)
图2CEX分析HER2单克隆抗体的电荷异质性色谱图
图3SEC分析HER2单克隆抗体色谱图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，然而，本发明中这些实施例仅用于阐明而不限制本发明的范围。同样，本发明不限于本文描述的任何具体优选的实施方案。本领域技术人员应该理解，对本发明技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。除特别说明的以外，以下实施例采用的试剂均为市售产品，溶液的配制可以采用本领域常规技术。
实施例1电荷异构体含量的测定
弱阳离子交换色谱(Weak Cation Exchange Chromatography，CEX)是根据待分析物所带电荷数的差异进行分离，能够分离单克隆抗体中的电荷异构体。使样品带上正电荷，吸附在色谱柱上，采用合适盐浓度和/或pH梯度进行洗脱，各电荷异构体组分依次被洗出，通过紫外检测。再通过峰面积归一法测定样品中酸性峰含量和赖氨酸变体含量。采用CEX-HPLC进行检测，用初始比例流动相平衡色谱柱，直至基线平稳，流动相A：10mmol/L磷酸盐缓冲液，1mg/ml EDTA-Na2，pH7.5，流动相B：10mmol/L磷酸盐缓冲液，1mg/ml EDTA-Na2，100mmol/L NaCl，pH7.5。各具体参数见下表1：
表1弱阳离子交换色谱液相分析参数
| 流速 | 1.0-1.3ml/min |
| 柱温 | 32-35℃ |
| 自动进样器温 | 2～8℃ |
| 上样体积 | 30-35μl |
| UV波长 | 214nm |
| 运行时间 | 50-55min |
实施例2高分子量杂质和低分子量杂质含量的测定
采用分子排阻色谱(Size Exclusion Chromatography，SEC)分析蛋白聚合物和降解物片段，该方法是根据待分析物中各组分的分子量差异进行分离。样品进入色谱柱中，低分子量物质进入凝胶孔中，滞留时间较长；高分子量物质不能进入凝胶孔中，会被较早洗脱下来，各组分按照分子量大到小的顺序依次被洗出，通过紫外检测。再通过峰面积归一法确定样品中免疫球蛋白单体、聚合物高分子量杂质和降解物低分子量杂质片段的含量。采用SEC-HPLC进行分析，用流动相平衡色谱柱，直至基线平衡，流动相：100mmol/L磷酸盐缓冲液，150mmol/L氯化钠，3％异丙醇，pH7.0。各具体参数见下表2：
表2分子排阻色谱液相分析参数
| 流速 | 0.5-0.6ml/min |
| 柱温 | 20-25℃ |
| 自动进样器温 | 2-8℃ |
| 上样体积 | 20-25μl |
| UV波长 | 280nm |
| 梯度类型 | 等度 |
| 运行时间 | 35-40min |
实施例3HCP含量的测定
HCP含量的检测是采用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。在微孔板上，样品中的HCP同时与游离的辣根过氧化物酶(HRP)偶联HCP多克隆抗体及板孔中包被的抗HCP捕获抗体相互作用，形成一个固相的抗体-HCP-酶标抗体三明治复合物。加入底物(TMB)进行显色反应，孵育适当时间后终止液终止反应，检测450nm/650nm波长处OD值。OD值与样品中HCP的浓度呈正相关。采用四参数回归计算法进行标准曲线拟合，并计算出样品中HCP含量。
实施例4宿主细胞DNA含量的测定
宿主细胞DNA的含量检测是采用磁珠法提取加荧光实时定量PCR法相结合的方法。样品中分散的宿主细胞DNA残片被具有DNA结合能力的磁珠收集，经过洗涤液的反复洗涤后被重新溶解于洗脱液中。这些经过提取纯化的宿主残留DNA片段作为模板，在Human DNA特异性引物的引导下进行循坏扩增。在DNA片段扩增过程中，Taqman探针的荧光基团成比例地释放，形成荧光信号被全自动荧光定量PCR仪捕获，DNA片段数量与扩增循环数(CP值)呈负相关，经荧光定量PCR仪配套软件数据分析得到样品中宿主细胞DNA含量。
实施例5抗HER2人源化单克隆抗体的分离纯化
1)细胞培养液的深层过滤：
将收获的细胞培养液进行过滤，收集滤液；过滤完后向膜包通入空气，排空膜包中残留液体。
2)亲和层析：
填料：Protein A亲和填料
平衡缓冲液：含80mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH＝7.0
淋洗缓冲液：含1M氯化钠的50mM乙酸钠缓冲液，pH＝4.5
洗涤缓冲液：含80mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH＝7.0
洗脱缓冲液：含20mM氯化钠的50mM柠檬酸钠缓冲液，pH＝3.4
样品：经过上述深层过滤的细胞培养液。
层析步骤：先用平衡缓冲液冲洗亲和层析柱，然后开始上样。上样结束后，用平衡缓冲液冲洗，之后用淋洗缓冲液洗脱杂质，再用洗涤缓冲液对层析柱进行重平衡。随后用洗脱缓冲液洗涤目的蛋白，收集洗脱液。
3)病毒灭活：
样品：亲和层析洗脱液。
过程：在样品中加入1M的柠檬酸，调整pH值至3.6，在环境温度进行病毒灭活。调节样品pH至中性，进行深层过滤，去除杂质。
4)阴离子交换层析：
填料：阴离子层析材料POROS 50HQ
层析步骤：先用预平衡缓冲液冲洗阴离子层析柱，再用平衡缓冲液接着冲洗层析柱。然后进行上样，上样完毕后再用平衡缓冲液冲洗，收集流通液。最后对层析柱进行再生和清洁。
5)阳离子交换层析：
填料：阳离子层析材料POROS XS
平衡缓冲液或淋洗缓冲液1：含45mM氯化钠的20mM柠檬酸钠(NaCitrate)缓冲液，pH＝5.0
淋洗缓冲液2：20mM磷酸钾(K2HPO4-KH2PO4)缓冲液，pH＝7.6
淋洗缓冲液3：20mM磷酸钾(K2HPO4-KH2PO4)缓冲液，pH＝5.5
淋洗缓冲液4：20mM柠檬酸钠(NaCitrate)缓冲液，pH＝5.5
洗脱缓冲液：含93mM氯化钠(NaCl)的20mM柠檬酸钠(NaCitrate)缓冲液，pH＝5.5
样品：经过上述阴离子层析的收获液，调节pH至5.0±0.2，调节电导率至8.5±0.2mS/cm。
层析步骤：先用平衡缓冲液对阳离子层析柱进行冲洗，然后上样。上样完毕后，先用平衡缓冲液进行冲洗，之后采用淋洗缓冲液2进行淋洗，去除酸性异构体杂质。随后用淋洗缓冲液3、淋洗缓冲液4先后进行淋洗，最后用洗脱缓冲液洗脱抗体，收集洗脱液。
5)病毒过滤和/或超滤：
将上述所得阳离子交换层析洗脱样品进行纳滤，再将纳滤后的溶液浓缩至换液浓度，进行等体积置换，得到具有高稳定性的抗体组合物。
采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)的检测方法，在还原和非还原的条件下，根据分子量大小不同导致迁移速度不同，来检测抗体产品的纯度。附图1为本发明方法工艺纯化后抗HER2人源化单克隆抗体的CE-SDS电泳图谱。
表3示出了两批分离纯化试验后，抗HER2人源化单克隆抗体的纯度分析结果。
表3抗HER2人源化单克隆抗体的分离纯化结果
结果显示，该工艺保证产品质量符合法规要求，利于工业放大生产。同时该纯化方法可以极大降低电荷异构体的含量(见图2)，减少高分子量杂质和低分子量杂质的含量(见图3)，提高了单克隆抗体的纯度。
根据本发明所公开的内容，虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。
本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。
Claims (10)
1.一种纯化蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：a)亲和层析；b)病毒灭活；c)深层过滤；d)阴离子交换层析；e)阳离子交换层析；其中，所述亲和层析包括：
1)将产品加载到亲和层析柱，使所述组合物处于第一亲和pH和/或第一亲和电导率，
2)用平衡缓冲液进行第一次淋洗，使所述组合物继续处于第一亲和pH和/或第一亲和电导率，
3)用淋洗缓冲液进行第二次淋洗，所述淋洗缓冲液具有第二亲和pH和/或第二亲和电导率，
4)用洗涤缓冲液进行第三次淋洗，所述洗涤洗缓冲液具有第三亲和pH和/或第三亲和电导率。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第二亲和pH比第一亲和pH值至少低约1.5以上。
3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述第二亲和电导率比第一亲和电导率至少高约6倍以上。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述第一亲和pH和/或第一亲和电导率与第三亲和pH和/或第三亲和电导率相同。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，所述方法还包括在淋洗后采用亲和pH和/或亲和电导率低于平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗涤缓冲液的pH和/或电导率的洗脱缓冲液洗涤目的蛋白。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述阳离子交换层析包括：
1)将产品加载到阳离子交换材料中，使所述组合物处于第一阳离子交换电导率，
2)用第一淋洗缓冲液进行第一次淋洗，使所述组合物继续处于第一阳离子交换电导率，
3)用第二淋洗缓冲液进行第二次淋洗，所述第二淋洗缓冲液具有第二阳离子交换电导率，
4)用第三淋洗缓冲液进行第三次淋洗，所述第三淋洗缓冲液具有第三阳离子交换电导率，
5)用第四淋洗缓冲液进行第四次淋洗，所述第四淋洗缓冲液具有第四阳离子交换电导率。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述第二阳离子交换电导率比第一阳离子交换电导率至少低约4.0mS/cm以上，和/或所述第三阳离子交换电导率比第二阳离子交换电导率至少低约1.0mS/cm以上，和/或所述第四阳离子交换电导率比第三阳离子交换电导率至少高约1.5mS/cm以上。
8.如权利要求6-7任一项所述的方法，其中所述第四阳离子交换电导率比第二阳离子交换电导率至少高约0.3mS/cm以上。
9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其中所述第四阳离子交换电导率比第一阳离子交换电导率至少低约3.5mS/cm以上。
10.如权利要求6-9任一项所述的方法，所述方法还包括在淋洗后采用电导率不超过15mS/cm的缓冲液洗脱目的蛋白。
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