CN105367650B - 自血浆纯化免疫球蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及自血浆纯化靶分子像免疫球蛋白。某种类型的基于交联聚乙烯醚的离子交换剂的使用导致靶分子的特别高的收率。

Description

自血浆纯化免疫球蛋白
本发明涉及自血浆纯化靶分子像免疫球蛋白。基于亲水性的化学上稳定的聚乙烯醚树脂的某些类型的离子交换剂的使用导致靶分子的特别高的收率。
发明背景
人和动物血包含许多蛋白和酶，其具有例如治疗性质。这些蛋白的一些可在红细胞中发现，而其它的在血浆或血清的溶液中发现。这样的蛋白是用于大规模和特异性分离的目标，目的是纯化和标准化所述蛋白用作人治疗剂。分离以供治疗应用的重要血蛋白的实例有：白蛋白、免疫球蛋白G、因子IX、因子VIII和α-1-蛋白酶抑制剂。这些蛋白的一些以每年数千kg的规模生产(白蛋白和IgG)，而其它的仅以每年克至千克的规模生产。然而，为了分离这些蛋白，在全世界范围内，每年有数百万升的血液被处理。
血、血浆和血清是极其复杂的含蛋白质的溶液，其包含许多并非目的蛋白或酶的其它类型的化合物。从这种类型的样品分离特异性靶分子需要复杂的且往往是多步的纯化程序。
特别是免疫球蛋白G的当前生产方法的一个常见问题是纯化过程中免疫球蛋白G的大量流失，估计为起始原料的总IgG含量的至少30%-35%。一个挑战是保持病毒失活和缺乏可引起不良反应的杂质的品质，同时扩大IgG的收率。在可被考虑的目前的IgG生产水平下，收率的小幅度增加实际上是非常重要的。即使效率的2%增加也将在收率和生产力方面产生显著的增加。
因此，存在对改进的和更有效的生产IgG产品的方法的需求。
发明简述
已经发现，某种类型的色谱材料或基质可以非常有效地用于来自血浆样品的靶分子的阴离子交换纯化。所述基质是携带600和1200 µmol/g之间的阴离子基团的亲水性聚乙烯醚。靶分子可以非常高的收率和极好的纯度获得。
本发明因此涉及一种自血浆样品纯化靶分子的方法，其通过以下方面进行：
a) 提供包含靶分子的血浆样品，
b) 使所述血浆样品经受在携带600和1200 µmol/g之间的阴离子基团的聚乙烯醚基质上的离子交换色谱，藉此自基质中洗脱纯化的靶分子。
在优选的实施方案中，所述基质是一种由至少一种来自组a)和b)的化合物的共聚而形成的共聚物，其中
a) 至少一种式I的亲水取代的烷基乙烯基醚
Figure DEST_PATH_IMAGE001
　　I
其中R1、R2、R3彼此独立地可以是H或C1-C6烷基，优选地H或CH3，
和R4是携带至少一个羟基的基团
和
b) 至少一种符合式II和/或III和/或IV的交联剂，
Figure 401150DEST_PATH_IMAGE002
　　II
其中X是具有2-5个C原子、优选2或3个C原子的二价烷基，其中不邻近的和不位于N的直接附近的一个或多个亚甲基可以被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH或N替代和所述亚甲基的一个或多个H原子可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、C5-C10-芳基、NH-(C1-C8)-烷基、N(C1-C8)-烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，和
Figure DEST_PATH_IMAGE003
　　III
Figure 318290DEST_PATH_IMAGE004
　　IV
其中在式III和IV中的Y1和Y2彼此独立地是C1-C10烷基或环烷基，其中一个或多个非-邻近的亚甲基或不位于N的直接附近的亚甲基可以被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH或N替代和所述亚甲基的一个或多个H可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、C5-C10-芳基、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，
或C6-C18芳基，其中芳基系统中的一个或多个H可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代；和
A是具有2-5个C原子、优选2或3个C原子的二价烷基，其中一个或多个非-邻近的亚甲基或不位于N的直接附近的亚甲基可以被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH或N替代和所述亚甲基的一个或多个H可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、C5-C10-芳基、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代。
式I中的R4通常为携带至少一个羟基的烷基、环脂族基团或芳基。
在非常优选的实施方案中，所述基质通过所用的亲水取代的烷基乙烯基醚和作为交联剂的二乙烯基乙烯脲(1,3-二乙烯基咪唑啉-2-酮)的共聚而形成，所述烷基乙烯基醚选自1,4-丁二醇单乙烯基醚、1,5-戊二醇单乙烯基醚、二乙二醇单乙烯基醚或环己烷二甲醇单乙烯基醚。
在优选的实施方案中，离子基团已通过使聚乙烯醚基质经受铈催化的接枝聚合而附接于基质。这优选地依据US 5453186第9页实施例8进行，其中荷电基团优选地是带正电荷的三甲基铵烷基。
在优选的实施方案中，离子交换基团是带正电荷的三甲基铵烷基。
在优选的实施方案中，离子交换色谱以流通模式进行。
在优选的实施方案中，靶分子是免疫球蛋白，优选人免疫球蛋白，最优选人免疫球蛋白G。
在另一个实施方案中，所述靶分子从IgA、IgM、白蛋白、转铁蛋白和因子XIa分离。
在另一个实施方案中，步骤b)中的基质用具有4和7.4之间的pH的缓冲液洗脱。
在一个实施方案中，将样品以样品中25-150 g蛋白/每升基质的量施加于所述基质。
在优选的实施方案中，步骤b)中的基质的负载和洗脱用包含0.005和1 M之间乙酸盐的乙酸盐缓冲液进行。
在一个实施方案中，所述基质由具有20和250 µm之间的平均粒径的颗粒制得。
所述基质的孔径(例如孔半径)指颗粒在表面改性反应前的孔径并通过逆尺寸排阻色谱测定。用于测定的程序描述于文献(Journal of Chromatography A, 1037卷, 1-2期, 273-282页)。
在一个实施方案中，孔半径在30-150 nm之间。
在一个实施方案中，在从步骤b)中的基质洗脱靶分子后，在随后的步骤c)中，基质用具有低于步骤b)所用的缓冲液pH的pH的缓冲液洗脱，从而自基质中洗脱含IgM的产物。
在一个实施方案中，在从步骤b)中的基质洗脱靶分子后，在随后的步骤c)中，基质用具有低于步骤b)所用的缓冲液pH的pH的缓冲液处理，由此从所述基质洗脱IgA、IgM和因子XIa。
定义
在详细描述本发明之前，将要理解的是，本发明并不限于特定组成或过程步骤，因为所述组成或步骤可能会有所不同。必须注意到，如用于本说明书和所附权利要求书中的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非上下文中另外清楚地指明。因此，例如，提及"配体"包括多种配体和提及"抗体"包括多种抗体等。
除非另外限定，否则本文所用的全部技术和科学术语，具有本发明所涉及领域的普通技术人员通常理解的相同意义。为了如本文所述的本发明的目的，定义以下术语。
本文所用的术语“靶分子”指应从样品的一个或多个其它成分，例如杂质中分离、分开或纯化的任何分子、物质或化合物。靶分子的实例有抗体、抗原结合片段(Fab)、恒定区片段(Fc)、蛋白质、肽、重组蛋白、其它天然化合物。在优选的实施方案中，靶分子是蛋白质。在一个非常优选的实施方案中，靶分子是抗体。在一个特别优选的实施方案中，所述靶分子是免疫球蛋白。在生产和/或纯化过程中，靶分子通常存在于液体中。液体可以是水、缓冲液、非-水性溶剂像乙醇或其任何混合物。除了靶分子，所述液体还可包含一或多种杂质。液体的组成可在生产和/或纯化期间根据进行的过程步骤而改变。在色谱步骤后，由于色谱步骤所用的洗脱剂，液体通常包含比之前更多的其它溶剂。典型地只有经过最后的纯化步骤后，靶分子才可被干燥，供制备最终的剂型。
术语"抗体"指具有特异性地结合于抗原的能力的蛋白质。"抗体"或“IgG”还指基本上由一种或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性地结合和识别分析物(抗原)。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为或者κ或者λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
一种示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成，每一对具有一条"轻链(约25 kD)和一条"重"链(约50-70 kD)，所述链，例如，通过链间二硫键稳定。每条链的N-末端限定一个主要负责抗原识别的约100-110或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链(V L)和可变重链(V H)分别指这些轻链和重链。
抗体可以是单克隆或多克隆的并可以单体或多聚体的形式存在，例如，以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。抗体还可包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们保留或经修饰以包括配体-特异性结合结构域。术语"片段"指包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基的抗体或抗体链的一部分或部分。片段可经由化学或酶法处理完整或完全抗体或抗体链获得。片段还可通过重组手段获得。当重组生产时，片段可以单独表达或作为称为融合蛋白的较大蛋白的一部分表达。示例性片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fc和/或Fv片段。示例性融合蛋白包括Fc融合蛋白。依据本发明，融合蛋白也包含在术语“抗体”中。
在一些实施方案中，抗体是包含Fc区的蛋白，例如，免疫球蛋白。在一些实施方案中，包含Fc区的蛋白是包括融合于另一多肽或其片段的免疫球蛋白的Fc区的重组蛋白。示例性多肽包括，例如，肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；副甲状腺激素；甲状腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素α-链；胰岛素β-链；胰岛素原；卵泡刺激激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管假性血友病因子(von Willebrand factor)；抗-凝血因子例如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES (对正常T-细胞表达和分泌的激活的调节)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白；缪勒管(Muellerian)-抑制物质；松弛素α-链；松弛素β-链；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β-内酰胺酶；DNA酶(DNase)；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA) (例如，CTLA-4)；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子例如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子例如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子例如αFGF和βFGF；上皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-βl、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素-样生长因子-I和-II (IGF-I和IGF-II)；des(l-3)-IGF-I (脑IGF-I)、胰岛素-样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34和CD40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白(BMP)；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如，IL-I至IL-IO；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如，AIDS被膜部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白例如CDl Ia、CDl Ib、CDl Ic、CD 18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原例如HER2、HER3或HER4受体；和任何以上所列多肽的片段和/或变体。此外，依据本发明的抗体是任何蛋白或多肽、其片段或变体，其特异性地结合于任何以上所列的多肽。
本文所用的，并且除非另外声明，术语“样品”指含有靶分子的任何组合物或混合物。样品可从生物或其它来源获得。生物来源包括真核来源像动物或人。优选的样品是从哺乳动物获得的血或血浆样品。样品还可包括被发现与所述靶分子混合的稀释液、缓冲液、洗涤剂和污染物等。样品可以被"部分地纯化" (即，已经受一个或多个纯化步骤，例如过滤或离心步骤)或可直接从产生所述靶分子的生物体获得。血浆样品是包含血浆或部分血浆的任何样品。
本文所用的术语"杂质"或“污染物”，指任何外来或可排斥的分子，包括生物大分子例如DNA、RNA、一或多种宿主细胞蛋白、核酸、内毒素、脂质、合成来源的杂质和可存在于样品中的一或多种添加剂，所述样品含有待与一或多种外来或可排斥的分子分开的所述靶分子。本文所用的术语"杂质"或“污染物”也可应用于需要从靶分子分离的某些免疫球蛋白像免疫球蛋白A (其引起患者的过敏反应)以及免疫球蛋白M。此外，这样的杂质可包括用于生产和/或纯化过程的步骤的任何试剂。
本文可互换使用的术语"纯化"、"分离"或"分开"，指通过使靶分子从包含靶分子和一种或多种其它成分(例如杂质)的组合物或样品分离来增加其纯度。典型地，所述靶分子的纯度通过从组合物除去(完全或部分地)至少一种杂质来增加。
术语"色谱法"指使所涉及的分析物(例如靶分子)与混合物中存在的其它分子分离的任何种类的技术。通常地，靶分子与其它分子分离是由于在移动相的影响下，或在结合和洗脱过程中，混合物的单独分子迁移通过静止介质或基质时的速率的差异所致。色谱分离过程的实例是反相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱和混合模式色谱。
"缓冲液"是通过其酸-碱共轭成分的作用抵抗pH值变化的溶液。取决于例如缓冲液的所需pH的可采用的各种缓冲液描述于Buffers (缓冲液)。A Guide for thePreparation and Use of Buffers in Biological Systems(生物系统中缓冲液的制备和使用指导), Gueffroy, D.编辑. Calbiochem Corporation (1975)。缓冲液的非-限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和铵盐缓冲液，以及这些缓冲液的组合。
术语"基质"或"色谱基质"在此可互换使用并指任何种类的颗粒吸附剂、树脂或固相，其在分离过程中分离靶分子(例如，包含Fc区的蛋白例如免疫球蛋白)与混合物中存在的其它分子。通常，由于在移动相的影响下，或在结合和洗脱过程中，混合物的单独分子迁移通过基质时的速率的差异所致，靶分子与其它分子分离。由树脂颗粒组成的基质可被放入柱或筒中。典型地所述基质携带一个或多个类型的配体。
“配体”是连接于色谱基质并决定所述基质的结合性质的功能基团。"配体"的实例包括，但不限于，离子交换基团、疏水性相互作用基团、亲水性相互作用基团、嗜硫相互作用基团、金属亲和性基团、亲和性基团、生物亲和性基团和混合模式基团(上述的组合)。在此可以使用的优选的配体包括，但不限于，强阴离子交换基团，例如三甲基氯化铵。
术语"离子-交换"和"离子-交换色谱"指色谱过程，其中混合物中的靶分子(例如，包含Fc区的靶蛋白)与键合于(例如通过共价连接)离子交换基质的荷电化合物相互作用，以致所述靶分子与荷电化合物非特异性地相互作用(或多或少地超过混合物中的溶质杂质或污染物)。混合物中的杂质从离子交换材料柱比所述靶分子更快或更慢地洗脱或相对于靶分子结合于树脂或从树脂排除。"离子-交换色谱"特别地包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式的离子交换色谱。阴离子交换色谱可结合靶分子(例如，包含Fc区的靶蛋白)接着经洗脱，或在靶分子"流通"柱时可主要地结合杂质。优选地，阴离子交换色谱步骤以流通模式进行。
短语"离子交换基质"指带负电荷的(即阳离子交换树脂)或带正电荷的(即阴离子交换树脂)的色谱基质。通过将一或多种荷电配体连接于所述基质，例如通过共价连接，可以提供电荷。备选地，或者另外，电荷可以是所述基质的固有属性。
本文使用术语"阴离子交换基质"是指带正电荷的色谱基质，例如具有一个或多个带正电荷的配体，例如附接于其上的季胺基团。
当以结合和洗脱模式“加载”分离柱时，使用缓冲液将包含靶分子(例如，包含Fc区的靶蛋白)和一种或多种杂质的样品或组合物加载到色谱柱(如离子交换柱)上。缓冲液具有电导率和/或pH值，使得靶分子结合于色谱基质，而理想地使所有杂质不被结合和流通柱。
当“加载”分离柱以“流通”靶分子时，使用缓冲液以将包含靶分子(例如，包含Fc区的靶蛋白)和一种或多种杂质的样品或组合物加载到色谱柱(例如离子交换柱)上。缓冲液具有电导率和/或pH值，使得靶分子不结合于色谱基质和流通柱，而理想地使所有杂质结合于柱。
典型地，其中将样品加载到基质上的缓冲液被称为加载缓冲液或样品缓冲液。
术语"平衡"指在加载靶分子之前，使用缓冲液平衡色谱基质。典型地，加载缓冲液用于平衡。
所谓“洗涤(wash)”或"洗涤(washing)"色谱基质意指使适当的液体，例如缓冲液通过或流经所述基质。典型地，使用洗涤以在洗脱靶分子之前，从基质除去弱结合的污染物和/或在加载后除去非-结合的或弱结合的靶分子。
在这种情况下，典型地，洗涤缓冲液和加载缓冲液是相同的。在使用病毒灭活缓冲液的情况下，其被用来在洗脱靶分子之前，灭活某些存在的病毒。在这种情况下，典型地，病毒灭活缓冲液不同于加载缓冲液，因为它可含有一种或多种洗涤剂或具有不同的性能(pH/电导率/盐和它们的量)。
洗涤也可用来在洗脱靶分子之后，从基质除去污染物。这通过在洗脱靶分子之后，使适当的液体，例如缓冲液通过或流经基质来进行。在这种情况下，典型地，洗涤缓冲液不同于加载缓冲液。它可含有一种或多种洗涤剂或有不同的性能(pH/电导率/盐和它们的量)。洗涤缓冲液是例如酸性缓冲液。
从色谱基质"洗脱"分子(例如，所提及的多肽像免疫球蛋白G或杂质)意指从中除去分子。当靶分子在加载缓冲液之前用溶剂洗脱时，洗脱可以流通模式直接进行，或通过改变溶液条件，以使不同于加载缓冲液的缓冲液与所涉及的分子在色谱树脂上竞争配体位点来进行洗脱。非-限制性实例是通过改变离子交换材料周围的缓冲液的离子强度，以使缓冲液在离子交换材料上与所述分子竞争荷电位点，从离子交换树脂洗脱分子。
术语“平均粒径”或d50意指在50%的累积粒度分布的平均粒径分布值。粒径用激光-衍射，优选地用Malvern ‘Master Sizer测定。
术语“平均孔径”意指在50%的累积孔径分布的平均孔径分布值。
在此可以互换使用的术语“流通过程”、“流通模式”和“流通操作”，指这样的分离技术，其中意欲使包含在样品中的至少一种靶分子(例如，包含Fc-区的蛋白或抗体)以及一或多种杂质流通色谱基质，所述基质通常结合一或多种杂质，其中靶分子通常不结合(即，流通)并用加载缓冲液从基质洗脱。
本文所用的术语"结合和洗脱模式"和"结合和洗脱过程"，指这样的分离技术，其中包含在样品中的至少一种靶分子(例如，包含Fc区的蛋白)结合合适的色谱基质(例如，离子交换色谱介质)，随后用不同于加载缓冲液的缓冲液洗脱。
发明详述
本纯化过程的起始原料可以是包含待纯化的靶分子的任何样品。典型地，样品是血或血浆或从血或血浆获得。有利地，样品是含免疫球蛋白的血浆蛋白部分。为此起始原料可以是正常人血浆或可来源于具有高滴度的特异性抗体，如超免疫血浆的供体。
依据本发明的方法，这样的包含靶分子的样品经受至少一个纯化步骤，其中样品被加载到包含阴离子交换官能度的色谱基质上。
已经发现，与例如基于甲基丙烯酸酯共聚物的强阴离子交换剂像Macro-Prep®High Q或基于琼脂糖的阴离子交换剂像Q Sepharose FF比较，依据本发明的某种类型的色谱基质的使用导致所述靶分子的5-10%的特别更高的收率，以及更高的纯度。例如，与QSepharose FF比较，表示为IgG靶部分中IgA和IgM之和的纯度通常为5倍高，与Macro-Prep® High Q比较，靶蛋白IgG的收率通常高7.7%，参见表1用于参考。
此显著的效果通过使用携带600和1200 µmol/g之间的阴离子基团的亲水性聚乙烯醚基质而获得。
待使用的基质优选地基于亲水性交联聚合物，后者基于共聚物，所述共聚物至少包含
a) 至少一种式I的亲水取代的烷基乙烯基醚
Figure DEST_PATH_IMAGE005
　　I
其中R1、R2、R3彼此独立地可以是H或C1-C6烷基，优选地H或-CH3，
和R4是携带至少一个羟基的基团
和
b)
至少一种符合式II和/或III和/或IV的交联剂，
Figure 911077DEST_PATH_IMAGE002
　　II
其中X是具有2-5个C原子、优选2或3个C原子的二价烷基，其中不邻近和不位于N的直接附近的一个或多个亚甲基可以被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH或N替代和所述亚甲基的一个或多个H原子可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、C5-C10-芳基、NH-(C1-C8)-烷基、N-(C1-C8)-烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，和
Figure 306286DEST_PATH_IMAGE003
　　III
Figure 120658DEST_PATH_IMAGE004
　　IV
其中在式III和IV中的Y1和Y2彼此独立地是C1-C10烷基或环烷基，其中一个或多个非-邻近的亚甲基或不位于N的直接附近的亚甲基可以被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH或N替代和亚甲基的一个或多个H可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、C5-C10-芳基、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，
或C6-C18芳基，其中芳基系统中的一个或多个H可彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，和
A是具有2-5个C原子、优选2或3个C原子的二价烷基，其中一个或多个非-邻近的亚甲基或不位于N的直接附近的亚甲基可以被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH或N替代和所述亚甲基的一个或多个H可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、C5-C10-芳基、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代。
式I中的R4典型地是携带至少一个羟基的烷基、环脂族基团或芳基。
这意指聚合物通过来自式I的亲水取代的烷基乙烯基醚组的至少一种化合物和来自式II和/或III和/或IV的交联剂组的至少一种化合物的共聚而形成。优选地，使用仅仅一种来自式I的亲水取代的烷基乙烯基醚组的化合物和一种来自式II、III或IV的交联剂组的化合物。
在优选的实施方案中，式I中的R4是
直-链或分支C1-C10烷基，其中一个或多个非-邻近的亚甲基可被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH、N替代和/或其中一个或多个H原子可以彼此独立地被C1-C6-烷基、C5-C10-芳基、卤素、NH2、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代和其中至少一个OH基团存在于C1-C10烷基上或者存在于取代基上，
或环脂族基团，典型地具有5-10个C原子，其中一个或多个非-邻近的亚甲基可被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH、N替代和/或其中环脂族基团的一个或多个H原子可以彼此独立地被C1-C6-烷基、C5-C10-芳基、卤素、NH2、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，其中至少一个OH基团存在于环脂族环上或者存在于侧链或取代基上，或
C6-C18芳基，其中芳基中的一个或多个H原子可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、C5-C10-芳基、卤素、NH2、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，其中至少一个OH基团存在于芳基上或者存在于侧链或取代基上，或
C5-C18杂芳基，其中杂芳基中的一个或多个H原子可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、C5-C10-芳基、卤素、NH2、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，其中至少一个OH基团存在于杂芳基上或者存在于侧链或取代基上。
在一个特别优选的实施方案中，式I中的R4是
直-链或分支C1-C10烷基，其中一个或多个非-邻近的亚甲基可以被O、S、SO2或NH替代和/或其中一个或多个H原子可以彼此独立地被C1-C6-烷基、C5-C10-芳基、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代和其中至少一个OH基团存在于C1-C10烷基上或者存在于取代基上，
或环脂族基团，典型地具有5-10个C原子，其中一个或多个非-邻近的亚甲基可以被O、S、SO2或NH替代和/或其中环脂族基团的一个或多个H原子可以彼此独立地被C1-C6-烷基、C5-C10-芳基、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，其中至少一个OH基团存在于环脂族环上或者存在于侧链或取代基上，或
C6-C14芳基，其中芳基中的一个或多个H原子可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、C5-C10-芳基、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，其中至少一个OH基团存在于芳基上或者存在于侧链或取代基上，或
C6-C14杂芳基，其中至少一个N原子作为杂原子存在和其中杂芳基中的一个或多个H原子可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、C5-C10-芳基、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，其中至少一个OH基团存在于杂芳基上或者存在于侧链或取代基上。
在优选的实施方案中，所用的亲水取代的烷基乙烯基醚是式I的化合物，其中R4是携带羟基的基团。
在优选的实施方案中，所用的亲水取代的烷基乙烯基醚是1,2-乙二醇单乙烯基醚、1,3-丙二醇单乙烯基醚、1,4-丁二醇单乙烯基醚、1,5-戊二醇单乙烯基醚、1,6-己二醇单乙烯基醚或二乙二醇单乙烯基醚和所用的环脂族乙烯基醚是环己烷二甲醇单乙烯基醚，特别优选1,4-丁二醇单乙烯基醚、1,5-戊二醇单乙烯基醚、二乙二醇单乙烯基醚或环己烷二甲醇单乙烯基醚。
所用的交联剂优选地是式II的化合物。给出的优先选择是使用二乙烯基丙烯脲(1,3-二乙烯基-四氢嘧啶-2-酮)或特别优选二乙烯基乙烯脲(1,3-二乙烯基咪唑啉-2-酮)。
亲水取代的烷基乙烯基醚相对于聚合物的重量的比例典型地在1% (按重量计)和90% (按重量计)之间或烷基乙烯基醚的最大重量比例(基于双官能交联剂，其对应于摩尔比2:1，如果烷基乙烯基醚不均聚的话)。亲水取代的烷基乙烯基醚的比例优选地在10和80%(%重量)之间，特别优选地在35和60%之间。因此，交联剂的比例在10和99 (%重量)之间，优选地在20和90%之间，特别优选地在40和65%之间。
在另一个优选的实施方案中，聚合物是多孔的，具有在2和200 nm之间、更优选在30和150 nm之间的孔径。
在另一个实施方案中，聚合物呈现为具有在25和250 µm之间、最优选在30-90 µm之间的平均粒径的颗粒形式。
聚合物携带包含阴离子交换基团的配体。
在优选的实施方案中，聚合物已经借助于已通过接枝聚合连接到聚合物的结构衍生。
在优选的实施方案中，聚合物已经借助于已通过用铈(IV)催化的接枝聚合连接到聚合物的结构衍生，优选地依据US5453186第9页实施例8，其中优选荷电基团是带正电荷的三甲基铵烷基。
关于要用于本发明的方法的材料和关于其生产的更多细节可在WO 2007/014591中发现。
配体是色谱领域技术人员已知的。配体是早在基础材料的合成过程中或随后可引入载体材料并影响载体材料的表面性能的取代基。特别是，借助于配体有针对性地衍生载体材料产生具有某些色谱特性的载体材料。特别是，用于本发明的配体可具有以下末端基团：
离子或可离子化基团，例如
-NR7R8或-NR7R8R9，
其中
R7和R8彼此独立地为H、具有1-5个C原子的烷基，
和
R9为具有1-5个C原子的烷基
前提是，如果X =-NR7R8R9，则R7和R8不能是H，
-胍盐。
在优选的实施方案中，要用作本发明方法中的基质的聚合物通过与触须状结构接枝聚合来衍生，其可进而携带对应的配体或通过后者被官能化。接枝优选地根据EP 0 337144第12页实施例8或US 5453186第9页实施例8，使用N-(2-三甲基铵乙基)-丙烯酰胺进行。所用的聚合催化剂是铈(IV)离子，因为这种催化剂在基础材料的表面上形成游离基位点，单体的接枝聚合从该位点开始。
通过涉及铈盐的终止反应终止聚合。为此理由，(平均)链长可受基础材料、引发剂和单体的浓度比例的影响。而且，可以使用一致的单体或不同单体的混合物；在后一种情况下，形成接枝共聚物。
用于制备接枝聚合物的合适的单体和关于接枝程序的进一步的细节例如公开于WO 2007/014591、EP 0337 144，特别是第12页，实施例8和US 5453186第9页，实施例8中。
优选地，所述基质通过接枝聚合，用离子基团衍生，从而使生成的接枝到基础聚合物基质上的链具有2和100之间、优选5和60之间、特别是在10和30之间的单体单元的长度，每个单元典型地携带一个离子基团。
优选的离子基团是带正电荷的三甲基铵乙基基团。
所述基质除了阴离子交换基团，还可携带另外的其它官能团像疏水性或亲水性基团，但在任何情况下，其具有阴离子交换基团。
要用于本发明的阴离子交换基质的离子容量典型地在600和1200 µmol/g之间，优选地在700和1000 µmol/g之间，最优选在800和1000 µmol/g之间。
待用于本发明方法的合适的材料是得自Merck KGaA, Germany的Eshmuno(R) QPX和Eshmuno (R) QPX Hicap。这些树脂包含依据公开于WO 2007/014591的程序合成的聚乙烯醚珠粒，采用依据EP 0337 144第12页实施例8和US 5453186第9页实施例8的接枝技术并产生携带带正电荷的三甲基铵乙基基团的表面聚合物结构，使聚合物结构接枝到所述珠粒，其中在Eshmuno QPX和Eshmuno QPX Hicap树脂的情况下的电荷密度被调整至600-1200µmol/g。
为了进行本发明的方法，使样品经受阴离子交换色谱，从而色谱基质是用如上所述的阴离子基团官能化的亲水性聚乙烯醚。
样品优选地是包含免疫球蛋白G、优选75-99%重量的IgG的预-纯化的血浆样品。样品优选地包含至少80%重量，更优选至少85%重量，特别优选超过90%重量，最优选在92和98%重量之间的免疫球蛋白G。“%重量”在这种情况下涉及干燥血浆样品的质量。
在将样品施加于所述基质之前，所述基质可被洗涤和/或平衡。
洗涤可以用中等酸性的pH 4.0-5.5的缓冲液像乙酸盐缓冲液，任选地与盐例如NaCl一起进行。缓冲液典型地具有200和1000 mM/l之间的浓度。
平衡用具有4和7.4之间的pH的平衡缓冲液进行。优选地，平衡缓冲液的pH与样品的pH相同。平衡缓冲液的浓度典型地在0.005-2 Mol/l范围内，优选地在0.005-0.05 Mol/l的范围内。
平衡缓冲液典型地与样品缓冲液相同。
在用平衡缓冲液洗涤和/或平衡所述基质之前，用具有pH超过10、优选地为约14的碱性水性液体处理所述基质是可能的。这样一种处理对本领域技术人员而言是已知的。从所述基质除去潜在的杂质是合适的。合适的液体是氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。碱性水性液体可直接用平衡缓冲液或用弱酸性水性洗涤缓冲液像乙酸缓冲液，优选地以例如200-1000 mM/l之间浓度的乙酸盐，从基质除去。
所述样品典型地施加于在缓冲液中的色谱基质(也称为负载缓冲液或样品缓冲液)。缓冲液优选地具有4.0和7.4之间的pH。合适的缓冲液是碳酸/硅酸盐缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和/或2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液。最优选的是乙酸盐缓冲液。
所述缓冲液典型地以5和500 mmol/l之间，优选5和100 mmol/l之间，最优选5和50mmol/l之间的浓度使用。
样品进料的IgG浓度通常被调整在1-50 g/l之间。
要加载在所述基质上的样品量在宽范围内是可变的。
所述基质可用极少量的样品加载，像例如10 g样品/1升基质体积。加载高达150 g样品/升基质体积也是可能的。优选地加载超过25 g/l基质体积，最优选25和100 g/l之间。
样品的色谱纯化可以结合-和-洗脱模式或优选地以流通模式进行。在流通模式中，靶分子基本上不结合或吸附于基质。那意味着靶分子(基本上与溶剂前端-即负载缓冲液的前端-一起)移动通过所述基质并从基质(基本上与溶剂前端一起)被回收。已经发现，当以流通模式使用依据本发明的基质时，靶分子可典型地用相对于基质体积的5-倍、优选3-倍、非常优选2-倍体积的洗脱液，从基质洗脱。在这种情况下，洗脱液与负载缓冲液相同。杂质被保留在基质上。采用流通模式，至少80%，优选地超过90%，最优选超过95%的靶分子可从基质回收。
已经进一步发现，杂质与基质的结合是非常稳定的，只要基质用负载缓冲液洗脱。这也提供扩大用于洗脱靶分子的负载缓冲液的体积至超过基质的5-倍体积的可能性(如果必要)，以使靶分子可以被几乎完全洗脱(约97%收率)，同时其纯度仍非常高(典型地>99.5%)。
以流通模式进行的本发明的方法尤其适合于从杂质像IgA、gM、白蛋白和丝氨酸蛋白酶像因子XIa分离作为靶分子的免疫球蛋白G。
但是对于分离包含IgM的产物或对于分离IgA、IgM和/或因子XIa也是合适的。已经发现，当以流通模式进行色谱纯化时，免疫球蛋白G基本上用溶剂前端洗脱。在洗脱IgG后，洗脱缓冲液(其用于洗脱IgG时与负载缓冲液相同)可被改变以支持洗脱更多的第二靶分子像IgA、IgM和因子XIa。例如第二靶分子可以是IgA和IgM的混合物。为此，洗脱缓冲液的酸性通常增加。优选地，对于此种应用的洗脱缓冲液具有4和5.5之间的pH，从而pH在任何情况下低于负载缓冲液的pH。典型地，用来洗脱IgA、IgM和/或因子XIa的缓冲液的pH在低于负载缓冲液的pH的0.5和2 pH单位之间。
因此，本发明的方法不仅允许纯化一种靶分子，像例如IgG，而且还纯化两种或更多种靶分子，像IgG以及IgA、IgM和/或因子Xia，例如IgG以及IgA和IgM的混合物。
本发明的方法可以用作一种简单的分离纯化步骤，而且它也可优选地与在本发明的方法之前或之后进行的其它纯化步骤组合。
要用本发明方法纯化的优选的靶分子是IgG。用于纯化IgG的已知的程序典型地包括几个步骤，包括沉淀、过滤和色谱步骤。这样的方法例如公开于“生产供治疗应用的血浆蛋白(“Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use)”, 由J. Bertolini, N.Goss, J. Curling编辑；John Wiley and sons Inc., 2013., 见例如第13章。
本发明的方法可有利地应用于替代已知方法的一个或多个纯化步骤。
优选地，使粗血浆样品首先经受沉淀步骤，其中较大比例的非-IgG-蛋白，特别是较高分子量的那些，聚集的免疫球蛋白和其它聚集的蛋白以及潜在感染性颗粒沉淀，而没有单体IgG的显著沉淀。这可例如通过乙醇沉淀而实现，得到称为部分I+II+III或部分II+III或部分II的富含IgG的中间物。在酸沉淀和过滤步骤后，可获得用于阴离子交换色谱的进料。
进行另外的色谱步骤也是可能的。
阴离子色谱后，纯化的IgG通常经纳米过滤和配制。
出乎意料地，已经发现，使用某种类型的色谱基质不仅通过简单的流通离子交换色谱，提供非常有效地纯化靶分子像IgG (收率>95%)的可能性，而且它还确保从低于25mg/L的IgA、低于25 mg/L的IgM、白蛋白(低于检测限)和因子XIa (低于检测限)分离IgG。从这些物质极好地分离IgG可进一步地用来以也非常良好的纯度和得率另外分离一或多种这些物质。
可用依据本发明使用的色谱基质获得的纯度和收率比在不同基质上的等效阴离子交换步骤更好。虽然已知程序往往结合阴离子交换纯化步骤与连续的阳离子交换精制步骤，但当阴离子交换纯化依据本发明进行时，这样的精制步骤通常并不需要。
以上和以下引用的所有的申请、专利和出版物以及相应的2014年8月15日提交的EP 14002852.3的全部公开内容都通过引用结合到本文中。
实施例
实施例1 – 纯化IgG
色谱基质(Eshmuno® QPX Hicap, Merck KGaA)用500 mM乙酸盐缓冲液(pH 6.5)平衡，随后用25 mM乙酸盐缓冲液(pH 6.5)处理。样品是包含15 g/l IgG伴有以下杂质的溶液：IgA (1000 mg/l)和IgM (500 mg/l)和因子XIa (50 pM/l)在25 mM乙酸盐缓冲液(pH6.5)中。
将样品施加于所述基质，相当于以130 cm/h 75 g/l基质的蛋白加载。然后基质用25 mM乙酸盐缓冲液(pH 6.5)洗脱，直至从所述基质完全洗脱IgG。以超过95%收率回收IgG，从而纯化的IgG包含少于25 mg/l IgM和IgA。因子XIa的量可减少至0.0 pM。通过用酸性缓冲液(300 mM乙酸盐缓冲液, pH 4.5)洗脱，可以超过95%的纯度和超过95%的收率，从所述基质进一步获得IgM和IgA。所有步骤以130 cm/h的线性速度运行。
实施例2 –在各种基质上纯化IgG
通用程序：
进料组合物：20 g/l IgG和1 g/l IgA和1 g/l IgM在25 mM乙酸盐pH 6.5中。
预-平衡：500 mM乙酸盐缓冲液, pH 6.5
平衡：25 mM乙酸盐缓冲液, pH 6.5
加载/洗脱：25 mM乙酸盐缓冲液, pH 6.5
流速：> 130 cm/h
加载：5 g/L (IgM和IgA的总和)
洗涤：250 mM乙酸盐缓冲液, pH 4.5
表1显示收率、纯度(杂质的浓度)和回收数据。
Figure 5438DEST_PATH_IMAGE006

Claims (17)

1.一种自血浆样品纯化靶分子的方法，其通过以下方面进行：
a) 提供包含靶分子的血浆样品
b) 使所述血浆样品经受在携带600和1200 µmol/g之间的阴离子交换基团的聚乙烯醚基质上的离子交换色谱，藉此自所述基质中洗脱纯化的靶分子。
2.依据权利要求1的方法，其特征在于所述基质是一种共聚物，其可通过至少一种来自组a)的化合物和一种来自组b)的化合物的共聚而获得，其中
a) 是至少一种式I的亲水取代的烷基乙烯基醚
Figure 165753DEST_PATH_IMAGE001
　　I
其中R1、R2、R3彼此独立地可以是H或C1-C6烷基，
和R4是携带至少一个羟基的基团
和
b) 是至少一种符合式II和/或III和/或IV的交联剂，
Figure 879631DEST_PATH_IMAGE002
　　II
其中X是具有2-5个C原子的二价烷基，其中不邻近的和不位于N的直接附近的一个或多个亚甲基可以被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH或N替代和所述亚甲基的一个或多个H原子可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、C5-C10-芳基、NH-(C1-C8)-烷基、N(C1-C8)-烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，和
Figure 393789DEST_PATH_IMAGE003
　　III
Figure 788998DEST_PATH_IMAGE004
　　IV
其中在式III和IV中的Y1和Y2彼此独立地是C1-C10烷基或环烷基，其中一个或多个非-邻近的亚甲基或不位于N的直接附近的亚甲基可以被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH或N替代和所述亚甲基的一个或多个H可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、C5-C10-芳基、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，
或C6-C18芳基，其中芳基系统中的一个或多个H可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代，和
A是具有2-5个C原子的二价烷基，其中一个或多个非-邻近的亚甲基或不位于N的直接附近的亚甲基可以被O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH或N替代和所述亚甲基的一个或多个H可以彼此独立地被羟基、C1-C6-烷基、卤素、NH2、C5-C10-芳基、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代。
3.依据权利要求1或2的方法，其特征在于所述基质可通过亲水取代的烷基乙烯基醚和作为交联剂的二乙烯基乙烯脲(1,3-二乙烯基咪唑啉-2-酮)的共聚而获得，所述烷基乙烯基醚选自1,4-丁二醇单乙烯基醚、1,5-戊二醇单乙烯基醚、二乙二醇单乙烯基醚或环己烷二甲醇单乙烯基醚。
4.依据权利要求1或2的方法，其特征在于所述离子基团已通过使聚乙烯醚基质经受铈催化的接枝聚合而附接于基质。
5.依据权利要求1或2的方法，其特征在于，聚乙烯醚基质携带具有700-1100 µmol/g带正电荷的阴离子交换基团的接枝聚合物。
6.依据权利要求1或2的方法，其特征在于所述阴离子交换基团是三甲基铵烷基。
7.依据权利要求1或2的方法，其特征在于所述离子交换色谱以流通模式进行。
8.依据权利要求1或2的方法，其特征在于所述靶分子是免疫球蛋白。
9.依据权利要求1或2的方法，其特征在于所述靶分子从IgA、IgM、白蛋白和因子XIa分离。
10.依据权利要求1或2的方法，其特征在于步骤b)中的基质用具有4和7.4之间的pH的缓冲液洗脱。
11.依据权利要求1或2的方法，其特征在于所述样品以样品中25-150 g蛋白/每升基质的量施加于所述基质。
12.依据权利要求1或2的方法，其特征在于步骤b)中的基质的负载和洗脱用包含0.005和1 M之间的乙酸盐的乙酸盐缓冲液进行。
13.依据权利要求1或2的方法，其特征在于所述基质由具有20和250 µm之间的平均粒径的颗粒制得。
14.依据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述靶分子从基质洗脱后，在随后的步骤c)中所述基质用具有低于步骤b)所用的缓冲液pH的pH的缓冲液洗脱，从而从所述基质洗脱IgA、IgM和因子XIa。
15.依据权利要求2的方法，其特征在于R1、R2、R3彼此独立地是H或–CH3。
16.依据权利要求2的方法，其特征在于X是具有2或3个C原子的二价烷基。
17.依据权利要求2的方法，其特征在于A是具有2或3个C原子的二价烷基。
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