KR102153258B1 - 베바시주맙 정제의 최적화된 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고가의 단백질 A(protein A) 컬럼을 사용하지 않고 불순물을 제거하여 고순도 및 고품질로 목적하는 항체를 제조할 수 있으며, 특히 용출 공정에서 사용되는 완충액의 양(부피)을 크게 감소시키는 동시에 높은 수율로 항체를 정제할 수 있는 항체의 정제 방법 및 상기 방법으로 제조된 항체에 관한 것이다.

Description

베바시주맙 정제의 최적화된 방법 {Optimized Method for Purification of Bevacizumab}
본 발명은 친화성 크로마토그래피인 단백질 A(protein A) 컬럼의 사용 없이, 저비용으로 고순도 및 고수율로 항제를 정제하는 방법에 관한 것이다.
생물의약품 연구 및 개발에 있어서의 최신 경향은 항체 단편의 개발에 더욱 중점을 둔다. 다수의 바이오시밀러(biosimilar) 치료 단백질이 이전에 비해 더 많이 개발되고 있지만, 바이오시밀러 제품 개발에 있어서의 중대한 어려움은 분리 정제 공정(downstream processing)의 높은 비용, 공정 및 생성물 관련된 불순물의 비-선택적 소거, 생성물의 단백질 분해에 의한 분해 등이다. 항체 단편은 전체 크기의 단일클론성 항체(mAb) 치료제에 비해 특정한 이점을 제공하는데, 이러한 이점은 예컨대 종양으로의 증진된 심부로의 침투, 전체 크기의 mAb에 접근할 수 없는 특이적 에피토프로 결합 등이다. 고 역가 클론 및 연속적인 바이오-제조(bio-manufacturing)와 같은 발효 배양 공정(upstream processes)에서의 진보는, 생물의약품 산업의 초점을 전체적인 분리 정제 공정 경제를 향상시키는 쪽으로 옮겨 놓았다. 분리 정제 공정은 단일클론성 항체 치료제를 위한 전체 제조 비용의 대략 60 내지 70%를 차지한다. 분리 정제 공정의 포획 단계, 중간 단계 및 폴리싱(polishing) 단계는 고가의 다양한 크로마토그래피 조작의 사용을 포함한다.
이에 따라, 항체 의약품과 관련하여 정제 공정에 대한 많은 연구 개발이 진행된 바 있다.
예를 들어 단일클론성 항체에 대한 정제 방법은 통상적으로 4개의 기본 단계를 포함하여 기술 개발이 진행되고 있고, 이와 관련된 많은 연구들이 존재한다. 이들 단계는 (1) 수거 - 발효 배양물로부터 숙주세포의 분리; (2) 포획 - 정화된 수거물 중 대다수의 성분으로부터 항체의 분리; (3) 미세 정제 - 잔류 숙주세포 오염물 및 응집물의 제거; 및 (4) 제형화 - 항체를 최대 안정성 및 저장 기간을 위해 적합한 담체에 배치하는 단계이다. 그러나 이들 단계들이 반드시 약제학적 상황에서 사용하기에 충분한 순도의 항체 조성물을 생성하는 것은 아니다. 따라서, 약제학적 사용에 적합할 정도의 불순물이 제거된 순수한 형태의 목적 항체를 생성 및 정제하는 방법이 무엇보다 중요하다.
구체적으로, 항체 의약품 생산을 위한 정제 공정으로, 단백질 A(Protein A) 컬럼을 이용한 정제 공정이 주로 이루어지고 있다. 그런데, 단백질 A(Protein A) 컬럼을 이용한 정제 방법의 경우, 초기 단계에서 높은 순도로 생산할 수 있는 장점을 가지나, 가격이 일반 이온 교환수지에 비해 30배 이상 높아 생산단가가 높다는 단점이 있다.
기존에 보고된 바에 따르면, 단백질 A 수지가 항체 의약품 생산 원료 단가의 약 35%에 해당하는 높은 비율을 차지하고 있으며, 컬럼에서 용출되는 미량의 단백질 A가 인체 내부에서 면역성 또는 생리적으로 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 단백질 A 컬럼을 이용한 정제 공정의 경우, 잔량의 단백질 A를 공정 별로 모니터링하고 제거해야 하는 어려움을 지닌다. 또한, 생물친화기인 단백질 A는 화학적으로 안정성이 약한 단점이 있어 컬럼의 재생 단계에서 단백질 A의 활성을 유지하는 상태에서 재생시켜야 하기 때문에, 클리닝 공정에서 필수적으로 사용되는 1 M NaOH를 사용할 수 없어, 컬럼에 붙은 불순물을 완전하게 제거할 수 없으며, 이에 따라 컬럼을 재생하여 사용하는 횟수가 다른 일반 화학적 수지에 비하여 현저하게 떨어지는 한계를 지닌다.
이러한 문제점을 해결하고자, 양이온 교환 컬럼, 소수성 컬럼, 음이온 교환 컬럼 등을 이용한 불순물 제거 및 고순도 항체를 개발하고자 하는 많은 노력들이 있었다.
특히, 항체의 생산에 사용되는 동물 세포, 특히 CHO 세포주를 이용하여 생산한 항체의 배양액에는 목적하는 항체 뿐만 아니라 CHO 세포 자체에서 발생하는 숙주세포 유래 단백질(HCP), 숙주세포 유래 DNA(HCD) 등의 불순물도 다량 포함되어 있으며, 또한 세포 생장을 위한 인자들도 포함되어 있다. 따라서 단백질 A 크로마토그래피 컬럼 없이 항체를 정제할 경우 초기 단계에서 불순물을 얼마나 제거할 수 있는지가 특히 중요하다. 그러나, 단백질 A 크로마토그래피 없이 낮은 HCP 수준과 주활성항체의 비율을 높일 수 있는 항체 정제 공정을 개발하기 위해서는, 적합한 크로마토그래피의 종류 및 순서, 나아가 공정의 최적화 과정을 개발해야 하는 어려움이 따른다.
예를 들어, 일반적으로 양이온 교환 컬럼을 사용하는 경우 이성질 항체의 비율을 낮추고 주활성항체의 비율을 높이기 위해 여러 버퍼의 사용이 혼재된다. 이에 따라, 다수의 버퍼를 사용함에 따른 복잡한 공정으로 인해 Elution 되는 단백질을 수집하는 데 어려움이 있다. 특히, 양이온 교환 컬럼의 사용에 있어서 Washing 공정은 많은 양의 상이한 성분을 가지는 버퍼 조성을 이용할 필요가 있으며, 세척 과정에서 사용되는 컬럼 부피가 상당히 크기 때문에 공정 과정에서 버리게 되는 완충액의 양이 상당할 뿐만 아니라 제조 공정에서도 시간이 매우 오래 걸리는 문제가 존재한다.
위와 같은 문제로 인하여 항체 생산 비용 및 생산 시간이 크게 증가하며, 품질 확보를 하더라도 수율이 낮을 수 있는 문제가 존재한다.
이러한 배경 하에, 바이오시밀러 제품, 특히 정제된 항체 단편을 수득하기 위한 편리한 분리 정제 절차를 제공하는 것이 매우 중요하다. 선행기술의 분리 정제 절차에 의해 제기된 문제점의 견지에서, 본 발명자들은 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고자 하였다. 본 발명에 의해 수득된 정제된 항체는 우수한 순도 및 활성 기준을 만족하면서도 기존의 공정에 비해 높은 수율을 충족시킨다.
본 발명자들은 pH 및 전도도를 조절한 시료를 양이온 교환 컬럼에서 적절한 완충액 조건 하에 정제하면 높은 주활성항체 비율과 동시에 높은 수율을 획득하여 고품질의 항체 제제를 제조할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. 특히, 본 발명에서는 양이온 교환 컬럼의 용출 공정에서 사용되는 많은 양의 용출 단계의 완충액을 절반 정도 감축하면서 공정 시간을 감축시키고 완충액 사용량을 줄이는 동시에 생성되는 항체 수율 또한 크게 증가시킴으로써 본 발명을 완성하였다. 이에 따라, 본 발명에서는 하기 목적의 발명을 제공한다.
본 발명의 하나의 목적은 항체 및 하나 이상의 숙주세포 단백질(host cell protein, HCP)을 포함하는, pH 5.5 내지 7.0 및 전도도 5mS/cm 내지 8mS/cm인, 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하고, 양이온 교환 컬럼을 세척 완충액으로 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 단계;를 포함하는 항체의 정제 방법으로서,
상기 세척 완충액으로 세척하는 단계는,
1) 0mM 내지 38mM 염화 나트륨을 포함하는 pH 5.5 내지 7.0의 10mM 내지 50mM 인산염을 포함하는, 완충액으로 항체를 세척하는 단계;를 포함하며,
상기 용출 완충액으로 용출시키는 단계는,
1) 38mM 내지 50mM 염화 나트륨을 포함하는 pH 6.0 내지 7.0의 10mM 내지 50mM의 인산염을 포함하는, 완충액으로 항체를 제1 용출시키는 단계; 및
2) 50mM 내지 60mM 염화 나트륨을 포함하는 pH 6.0 내지 7.0의 10mM 내지 50mM의 인산염을 포함하는, 완충액으로 항체를 제2 용출시키는 단계;를 포함하는, 항체의 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 항체를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 항체 및 하나 이상의 숙주세포 단백질(host cell protein, HCP)을 포함하는 pH 5.5 내지 7.0 및 전도도 5mS/cm 내지 8mS/cm인 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하고, 양이온 교환 컬럼을 세척 완충액으로 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법을 제공한다.
구체적으로, 항체 및 하나 이상의 숙주세포 단백질(host cell protein, HCP)을 포함하는 pH 5.5 내지 7.0 및 전도도 5mS/cm 내지 8mS/cm인 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하고, 양이온 교환 컬럼을 세척 완충액으로 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법으로서,
상기 세척 완충액으로 세척하는 단계는
1) 0mM 내지 38mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM 인산염(바람직하게, 인산나트륨)(pH 5.5 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 세척하는 단계; 및
상기 용출 완충액으로 용출시키는 단계는
1) 38mM 내지 50mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(바람직하게, 인산나트륨) (pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 제1 용출시키는 단계; 및
2) 50mM 내지 60mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(바람직하게, 인산나트륨) (pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 제2 용출시키는 단계를 포함하는 것인, 항체의 정제 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항체의 정제 방법은 선행기술과 대비하여 적은 양의 완충액으로도 더 높은 수율의 정제를 가능케하여 생산 단가를 감소시키고 정제 공정을 빠르게 진행시킬 수 있어서, 항체의 정제 공정에 우수한 장점을 가진다.
구체적으로, 본 발명의 방법은 항체 및 하나 이상의 숙주세포 유래 단백질(HCP)을 포함하는 혼합물에서 단백질 A 컬럼 공정을 사용하지 않으면서도, 숙주세포 유래 단백질(HCP) 및 이성질 항체를 현저히 감소시킨 항체 정제물을 생산할 수 있는 방법이다. 동물 세포 등의 숙주세포로부터 항체를 발현하고 이로부터 항체를 수득하고자 하는 경우, 여기에는 목적하는 항체 외에도 숙주세포 단백질(HCP), 숙주세포 유래 DNA(HCD) 및 성장 인자 등이 존재하며, 나아가 목적하는 항체의 이성질 항체(예: 산성 이성질 항체, 염기성 이성질 항체) 등이 존재할 수 있다. 따라서, 항체 제제를 만들기 위해서는 상기의 혼재해 있는 불순물을 제거하여 순도를 높여, 원하는 품질의 항체를 얻기 위한 정제 과정이 필요하며, 특히 숙주세포 단백질과 이성질 항체를 효과적으로 제거할 수 있는 정제 과정이 필요하다. 그러나, 이의 최적화 방법을 개발하기 위해서는 사용하는 컬럼의 종류, 정제 순서 및 최적화된 조건을 규명해야 하여, 실제 이의 공정을 개발하는 것에는 어려움이 있었다.
이에, 본 발명에서는 항체를 발현하는 숙주세포의 배양 상등액의 pH 및 전도도를 조절하고, 양이온 교환 크로마토그래피에서 세척 단계 및 용출 단계의 조건, 특히 완충액의 성상 및 컬럼 부피 조건에 차이를 줌으로써, 숙주세포 단백질 및 이성질 항체 수준을 현저히 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 높은 수율로 항체를 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, “항체 및 숙주세포 단백질을 하나 이상 포함하는 시료”는 항체를 생산하는 세포의 배양 상등액, 상기 세포의 파쇄물, 또는 이로부터 부분 정제된 시료로서, 정제하고자 하는 목적 항체 및 숙주세포 단백질을 포함하는 시료를 의미한다. 상기 부분정제는 여과 과정을 수행하였으나, 정제하고자 하는 항체 외에도 다른 단백질도 존재하는 상태를 의미한다.
여기서, 상기 시료는 본 발명의 방법에서 효과적인 이성질 항체의 제거를 가져오기 위하여, pH는 5.5 내지 7.0 이며, 전도도가 5.0 mS/cm 내지 8.0 mS/cm를 가지도록 조절된 것일 수 있다.
상세하게, 상기 pH는 5.8 내지 6.2일 수 있다. 상기 전도도는 5.0 mS/cm 내지 8.0 mS/cm, 보다 상세하게는 6.0 mS/cm 내지 8.0 mS/cm, 보다 더 상세하게는 7.0 mS/cm 내지 8.0 mS/cm일 수 있고, 구체적으로 약 7.0 mS/cm일 수 있다.
본 발명에서는 시료의 pH 5.8 내지 6.2의 조건과 전도도 7.0 mS/cm 내지 8.0 mS/cm의 조건으로 양이온 컬럼크로마토그래피를 수행한 결과, 적은 양의 완충액을 이용하면서도 높은 수율로 정제를 수행했을 뿐만 아니라 염기성 이성질 항체의 함량도 크게 감소시켰다.
이와 같은 pH 및 전도도를 가지는 시료를, 양이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 경우, 정제하고자 하는 항체를 양이온 교환 컬럼에 잘 흡착시키면서도 숙주세포 단백질과 같은 불순물은 관류 배출되거나, 또는 양이온 교환 수지에 약하게 또는 비특이적으로 결합하여, 세척 단계에서 쉽사리 제거할 수 있다. 또한, 이성질 항체 특히 염기성 이성질 항체의 비율을 쉽게 낮출 수 있어 원하는 항체 비율의 조절이 용이하다.
본 발명에서 용어, "전도도"는 두 전극 사이의 전류를 통하게 하는 수용액의 능력을 의미한다. 용액 내에서는 이온 수송에 의해 전류가 흐른다. 따라서, 수용액 중 존재하는 이온량을 증가시키면, 용액은 더 높은 전도도를 갖게 될 것이다. 전기 전도도란 전류를 운반할 수 있는 용액 중 이온의 능력이기 때문에 용액의 이온 농도를 변화시킴으로써 용액의 전도도를 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 원하는 전도도를 얻기 위해 용액 중 완충제의 농도 및/또는 염 (예를 들면, 염화나트륨, 아세트산나트륨, 또는 염화칼륨)의 농도를 변화시킬 수 있다. 상세하게는, 각종 완충액의 염 농도를 변경하여 원하는 전도도를 얻을 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질로서, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원-항체반응을 일으키는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 고품질로 정제되기 위한 단백질의 하나로서, 본 발명에 따른 방법에 의하여 효율적으로 정제될 수 있다.
상기 항체는 일반적으로 등전점이 다른 단백질에 비하여 높으므로, 초기 양이온 교환수지를 사용하여 배양 상등액을 컬럼에 흡착시킨 후 용출시키면 비교적 고순도로 일차 정제할 수 있다. 상기 등전점(isoelectric point, pI)은 단백질 분자표면의 평균 실효 하전, 즉 단백질 분자의 전기 이중 층의 전위가 0이 되는 pH 값으로서, 단백질의 기가 해리하여 양, 음이온기의 수가 동수로 되어 실효 하전이 0이 되는 점을 의미한다. 본 발명에서 정제되기 위한 항체는 이에 제한되지는 않으나, 등전점이 상세하게는 6 내지 11일 수 있으며, 보다 상세하게는 7 내지 10인 항체일 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 이에 제한되지는 않으나, 상세하게는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 치료용 항체를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 효과적으로 정제될 수 있는 항체는, VEGF-A(vascular endothelial growth factor A)를 표적으로 하는 항체인 베바시주맙(Bevacizumab)일 수 있다. 상기 베바시주맙 항체는 항체 역가를 1 내지 3의 수준으로 가지는 것일 수 있다. 상세하게는 항체 역가를 2 내지 3의 수준으로 가지는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "주활성 항체"는 본 발명의 항체 집단에 포함되는 주요 구성요소로서, 항체 중에서 일부 아미노산이 탈아민이나 산화에 의해 변형(modification)되어 생물학적 활성이 낮아지지 않은 상태의 항체, 즉 산성 또는 염기성 이성질 항체가 아닌 항체를 의미한다. 상기 주활성 항체는 목적하는 항체 집단의 품질을 조절하기 위해 가장 중요한 구성요소로, 항체의 구성요소 중 생물학적 활성이 가장 높은 항체이다.
본 발명에서 용어, “이성질 항체”는 주활성 항체의 일부 아미노산이 탈아민이나 산화에 의해 변형된 항체를 의미하며, 산성 이성질 항체 및 염기성 이성질 항체를 포함한다. 그 예로, 아미노산 중 아스파라긴(Asparagine)이 탈아민되어 아스파테이트(Aspatate)가 된 이성질 항체, 아미노산 중 메치오닌(methionine)이 산화되어 메치오닌셀페이트(Methionine sulfate)가 된 이성질 항체 등이 있다. 또한, 중쇄의 N 말단에 글루타메이트(glutamate)가 존재하는 경우, 상기 글루타메이트가 오각형 링 구조를 형성하여 파이루글루타메이트(Pyruglutamate)로 변형된 이성질 항체를 포함한다. 상기 이성질 항체들은 CHO 세포와 같은 숙주세포에서 항체를 생성하는 경우에 높은 비율로 숙주세포 배양액에 포함되어 있어, 크로마토그래피와 같은 과정을 통하여 제거되어 목적하는 비율로 항체 집단에 포함되어야 한다.
따라서, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 숙주세포에서, 고품질의 항체 집단을 제조하기 위해서는 상기와 같은 이성질 항체가 적절히 제거되어 주활성 항체 및 이성질 항체가 원하는 함량으로 포함되어야 할 필요성이 있다. 또한, 고순도의 항체 집단을 제조하기 위해서는 숙주세포 단백질(HCP), 숙주세포 유래 DNA(HCD) 및 세포생장을 위한 인자와 같은 불순물이 제거되어야 한다. 이에 본 발명에서는 상기 이성질 항체의 함량 조절뿐만 아니라, 숙주세포 단백질과 같은 불순물이 효과적으로 제거된, 항체의 제조 방법을 개발하였다.
본 발명에서 용어, “숙주세포 단백질(Host cell protein; HCP)”은, 당해 항체와 상이한 단백질로서, 통상적으로 항체 생산의 공급원, 즉 숙주세포로부터 유래하는 단백질을 의미한다. 의약품으로 사용될 수 있는 항체에서는, HCP는 최초 항체 제제로부터 배제되는 것이 바람직하다. 상기 제거되는 숙주세포 단백질은 정제하고자 하는 항체를 제외한 불순물을 모두 포함하는 개념이며, 숙주세포 단백질 자체만이 아닌 숙주세포에서 유래한 DNA 및 세포생장을 위한 인자 등을 모두 포함할 수 있다. 따라서, 상기 숙주세포 단백질을 제거하면 정제하고자 하는 항체만을 고순도로 정제할 수 있다.
본 발명에서 용어, “양이온 교환 크로마토그래피”는 양이온 교환 수지를 충진한 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 의미하며, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물, 상세하게는 숙주세포 단백질 및 이성질 항체를 제거할 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 수용액 속의 양이온과 자신의 양이온을 교환하는 역할을 하는 합성수지로서, 항체의 경우 등전점이 높으므로 등전점 값 이하의 pH 완충액에서는 양이온을 띠게 된다. 따라서, 상기 양이온을 띠는 항체를 흡착할 수 있는 양이온 교환 수지를 이용하여 본 발명의 방법에서, 항체 정제 효율을 높일 수 있으며, 특히, 상기 pH는 5.8 내지 6.2일 수 있고, 상기 전도도는 5.0 mS/cm 내지 8.0 mS/cm, 상세하게는 6.0 mS/cm 내지 8.0 mS/cm, 더욱 상세하게는 7.0 mS/cm 내지 8.0 mS/cm 일 수 있다. 구체적으로 약 7.0 mS/cm일 수 있다.
본 발명에서는 세척하는 단계로 하기 단계를 포함한다:
1) 0mM 내지 38mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM 인산염(pH 5.5 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 세척하는 단계.
이러한 세척하는 단계의 경우 약 7 내지 20 컬럼 부피, 상세하게는 약 13 컬럼 부피로 상기 세척 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 세척하는 단계의 경우 일정한 몰농도로 10mM 내지 50mM 인산염의 조건을 유지하면서 염화 나트륨의 몰농도를 증가시키는 세척 완충액을 사용하여 다회에 걸쳐 세척을 수행하는 것일 수 있다.
예를 들어, 10mM 내지 50mM 인산염, 상세하게 15mM 내지 30mM, 보다 상세하게 약 20mM을 포함하며, 염화나트륨을 포함하지 않는 pH 5.5 내지 7.0의 완충액으로 제1 차 세척을 수행할 수 있다. 그리고 나서, 상기 유사 완충액(예컨대 pH 조건만을 달리한 완충액 등)으로 제2 차 세척을 반복 수행할 수 있다. 다음으로, 10mM 내지 50mM 인산염, 상세하게는 15mM 내지 30mM, 보다 상세하게는 약 20mM으로써, 20 내지 38mM의 염화나트륨을 포함하는 pH 6.0 내지 7.0의 완충액으로 제3 차 세척을 수행할 수 있다.
이에 따라, 상기 1) 0mM 내지 38mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM 인산염(pH 5.5 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 세척하는 단계는 하기 단계를 포함하는 것일 수 있다:
a) 염화 나트륨을 포함하지 않고 10mM 내지 50mM 인산염(pH 5.5 내지 7.0)을 포함하는 세척 완충액으로 제1 차 세척하는 단계;
b) 염화 나트륨을 포함하지 않고 10mM 내지 50mM 인산염(pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는 세척 완충액으로 제2 차 세척하는 단계; 및
c) 20 내지 38mM의 염화나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM 인산염(pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는 세척 완충액으로 제3 차 세척하는 단계.
상세하게는 상기 단계들에서의 인산염은 15 mM 내지 30 mM, 구체적으로 약 20 mM의 인산염일 수 있다. 상기 단계들에서 염화나트륨은 각각 0 mM, 0mM 및 37.5mM일 수 있다.
제1 세척하는 단계의 경우 약 1 내지 7 컬럼 부피, 상세하게는 약 5 컬럼 부피로 상기 세척 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
제2 세척하는 단계의 경우 약 1 내지 5 컬럼 부피, 상세하게는 약 3 컬럼 부피로 상기 세척 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적일 실시예에 따르면, 상기 제1 및 제2 세척하는 단계는 각각 약 pH 6.0 및 6.48의 20 mM 인산염을 포함하는 완충액으로 컬럼에서 붙지 않은 항체를 부착시키도록 세척 단계이다.
제3 세척하는 단계의 경우 약 3 내지 7 컬럼 부피, 상세하게는 약 5 컬럼 부피로 상기 세척 완충액을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 제3 세척하는 단계는 약 pH 6.48의 37.5 mM의 NaCl을 포함하는 20 mM 인산염으로 세척을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 용출시키는 단계로 하기 단계를 포함한다:
1) 38mM 내지 50mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 제1 용출시키는 단계; 및
2) 50mM 내지 60mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 제2 용출시키는 단계.
이러한 제1 용출시키는 단계의 경우 약 10 내지 20 컬럼 부피, 상세하게는 약 16 컬럼 부피로 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 제2 용출시키는 단계의 경우 약 5 내지 12 컬럼 부피, 상세하게는 약 7 컬럼 부피로 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
상세하게는 상기 단계들에서의 인산염은 15 mM 내지 30 mM, 구체적으로 약 20 mM의 인산염일 수 있다.
본 발명의 정제하고자 하는 항체 및 숙주세포 단백질을 포함하는 시료를 양이온 교환 수지에 주입하는 경우, 항체는 양이온 교환 수지에 결합하고, 숙주세포 단백질을 포함하는 불순물은 결합없이 컬럼을 통과하거나(관류), 약하게 컬럼에 결합하므로, 상기 시료를 양이온 교환 수지에 주입한 다음, 세척 완충액을 처리하여, 약하게 결합된 숙주세포 단백질 및 이성질 항체 등을 제거한 다음, 용출 완충액을 처리하여 정제하고자 하는 항체를 수득할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 상기 양이온 교환 수지는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 상세하게는 카복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S) 등을 사용할 수 있으며, 보다 상세하게는 카르복실레이트(COO-) 또는 설포네이트(SO3)를 사용할 수 있으며, 상기 작용기가 설포네이트인 양이온 교환 수지 중에는 특히 프락토겔(fractogel)TM EMD SO3를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 양이온 교환 수지로서, 상기 프락토겔 EMDTM SO3를 사용하여 항체를 정제하는 방법은 상세하게는
(i) 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 5.5 내지 7.0)을 포함하는, 평형 완충액으로 평형화된 프락토겔(Fractogel)TM EMD SO3 컬럼에, 항체의 혼합액을 포함하는 시료를 로딩하는 단계;
(ii) 0mM 내지 38mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 5.5 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 세척하는 단계;
(iii) 38mM 내지 50mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 제1 용출시키는 단계; 및
(iv) 50mM 내지 60mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 제2 용출시키는 단계를 포함할 수 있다.
특히, 상기 (ii) 0mM 내지 38mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 5.5 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 세척하는 단계;는
a) 염화 나트륨을 포함하지 않고 10mM 내지 50mM 인산염(pH 5.5 내지 7.0)을 포함하는 세척 완충액으로 제1 차 세척하는 단계;
b) 염화 나트륨을 포함하지 않고 10mM 내지 50mM 인산염(pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는 세척 완충액으로 제2 차 세척하는 단계; 및
c) 20 내지 38mM의 염화나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM 인산염(pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는 세척 완충액으로 제3 차 세척하는 단계;로 구성될 수 있다.
상세하게는 상기 단계들에서의 인산염은 15 mM 내지 30 mM, 구체적으로 약 20 mM의 인산염일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 항체를 정제하는 방법은 (i) 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 5.5 내지 7.0)을 포함하는, 평형 완충액으로 평형화된 프락토겔(Fractogel)TM EMD SO3 컬럼에, 항체의 혼합액을 포함하는 시료를 로딩하는 단계를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 약 pH 6.0의 20 mM 인산염으로 평형화를 수행하는 것일 수 있다. 이러한 평형화의 경우 약 1 내지 5 컬럼 부피, 상세하게는 약 3 컬럼 부피로 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 시료를 로딩하는 단계 이후 (ii) 0mM 내지 38mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 5.5 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 세척하는 단계;는 앞서 살핀 세척하는 단계의 각 단계들을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 항체를 정제하는 방법은 (iii) 38mM 내지 50mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 제1 용출시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 약 pH 6.48의 40 mM의 NaCl을 포함하는 20 mM 인산염으로 용출을 수행하는 것일 수 있다. 이러한 용출의 경우 약 10 내지 20 컬럼 부피, 상세하게는 약 16 컬럼 부피로 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 본 발명에 따른 항체를 정제하는 방법은 (iv) 50mM 내지 60mM 염화 나트륨을 포함하는 10mM 내지 50mM의 인산염(pH 6.0 내지 7.0)을 포함하는, 완충액으로 항체를 제2 용출시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 약 pH 6.48의 58 mM의 NaCl을 포함하는 20 mM 인산염으로 용출을 수행하는 것일 수 있다. 이러한 용출의 경우 약 5 내지 12 컬럼 부피, 상세하게는 약 7 컬럼 부피로 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 선행기술들과 상이하게 상기 용출 단계에서 우수한 특성을 나타낸다. 구체적으로, 본 발명에 따른 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 공정은 용출 단계에서 사용되는 완충액을 크게 감소시키는 장점을 가진다. 기존 알려진 공정들은 예를 들어, 최소 20 컬럼 부피 이상의 완충액을 사용하여 2회 이상의 용출 공정을 수행하는 것이 일반적이다.
반면, 본 발명에서는 이러한 용출 공정에서 사용되는 완충액의 양(부피)을 크게 감소시키면서도 숙주 유래 단백질 및 이성질 항체를 크게 감소시키면서 높은 수율로 항체를 정제하였다. 바이오시밀러 제조의 대량 배치 공정에서 이러한 완충액 양(부피)의 감소는 제조 단가 측면에서 큰 비용 감축을 가져올 뿐만 아니라 정제 공정 중 일반적으로 긴 시간이 소요되는 것으로 알려진 용출 공정에 대한 시간을 크게 감축시킨다는 장점을 가진다. 동시에, 본 발명은 용출의 수율을 최대로 증대하였다는 점에서 우수한 효과를 가진다.
본 발명의 항체의 정제 방법은 항체 및 하나 이상의 숙주세포 단백질(host cell protein, HCP)을 포함하는, pH 5.5 내지 7.0 및 전도도 5mS/cm 내지 8mS/cm인, 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하고, 양이온 교환 컬럼을 세척 완충액으로 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 단계;
상기 용출을 통해 회수한 여과액을 한외여과 및 정용여과하는 단계; 및
다층여과 필터에 통과시켜 여과액을 회수하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 한외여과 및 정용여과하는 단계; 및 다층여과 필터에 통과시켜 여과액을 회수하는 단계에서는 양이온 교환 컬럼을 이용한 용출 단계에서 제거하지 못한 숙주세포 단백질 등의 불순물을 더욱 제거하여 항체 제제의 순도를 보다 높이기 위한 목적을 가진다. 본 단계에서는, 양이온 교환 컬럼과 분리기전이 다른, 정전기적 전하와 소수성 반응 등을 이용한, 숙주세포 유래 단백질을 제거할 수 있는 여과 장치를 이용하여 숙주세포 단백질을 보다 효과적으로 제거할 수 있다.
회수한 여과액을 한외여과 및 정용여과하는 단계는 한외여과 및 정용여과를 수행하는 것일 수 있다.
상세하게는 한외여과가 수행될 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "한외여과(ultrafiltration)" 또는 "UF"는 용매 또는 소형 용질 분자를 통과시키면서 거대분자를 유지시키는 반투과성 막으로 용액 또는 현탁액을 처리하는 임의의 기술을 의미한다. 한외여과는 용액 또는 현탁액에서 거대분자의 농도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
또한, 상세하게는 정용여과가 수행될 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "정용여과(diafiltration)" 또는 "DF"는, 가용성 투과물(permeate) 성분을 감소시키기 위해 잔류물(retentate)을 용매로 희석하여 재여과하는 특화된 여과 부류를 의미하기 위해 사용된다. 정용여과는, 예를 들면, 단백질을 포함하는 보유된 성분의 농도 증가를 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 예를 들면, 연속 정용여과에서, 용매는 여액의 생성 속도와 동일한 속도로 잔류물에 연속적으로 첨가된다. 이 경우, 잔류물 용적 및 보유된 성분의 농도는 공정 동안 변화되지 않는다. 한편, 불연속 또는 순차 희석 정용여과에서, 한외여과 단계는 잔류물 측에 용매의 첨가를 수반하고; 잔류물에 첨가된 용매의 용적이 생성된 여액의 용적 이상인 경우, 보유된 성분은 높은 농도를 가질 것이다. 정용여과는 pH, 이온 강도, 염 조성, 완충제 조성, 또는 거대 분자의 용액 또는 현탁액의 기타 특성을 변경하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 여과 공정을 통하여, 숙주세포 단백질의 함량을 더 감소시킬 수 있다.
상기 한외여과 및 정용여과 공정에서는 pH 5.5 내지 7.0, 상세하게는 5.8 내지 6.2의 조건을 설정하는 것이 바람직하다. 위와 같은 pH 조건을 이용함으로써, 정제 과정에서 발생가능한 aggregate를 최소화할 수 있다. 또한, 인산염 완충액(바람직하게 인산나트륨 완충액)을 사용할 수 있다. 보다 상세하게는 10 내지 50 mM, 보다 더 상세하게는 20 mM의 인산염 완충액을 사용할 수 있다.
다층여과 필터에 통과시켜 여과액을 회수하는 단계가 후속하여 수행될 수 있다.
이러한 다층여과 필터에 주입되는 용출된 항체 용출액은, 용출된 항체 용출액 자체 또는 상기 용출액을 가공한 형태를 모두 포함한다.
예컨대, 본 발명의 정제 공정에 사용되는 용출한 항체 용출액은 다층여과 필터에 통과시키기 전에 바이러스 불활성화한 것일 수 있다. 이러한 바이러스 불활성화는 한외여과 및 정용여과하는 단계의 전 또는 후에 수행될 수 있다.
여기서, 바이러스 불활성화는 상기 용출액에 함유된 바이러스가 비기능성이 되도록 하거나, 상기 용출액에서 바이러스를 제거하는 것을 포함한다. 바이러스를 비기능성이 되게 하거나 바이러스를 제거하는 방법에는 열 불활성화, pH 불활성화, 또는 화학적 불활성화 방법 등이 포함되며, 상세하게는 pH 불활성화 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 pH 불활성화 방법은, 바이러스가 비기능성이 충분히 될 수 있을 정도의 pH로 처리하는 방법으로, 이러한 pH 불활성화의 방법은 저-pH 바이러스 불활성화 방법을 포함하며, 상기 방법은 용출된 항체 용출액을, pH 3.0 내지 4.0의 범위, 상세하게는 pH 3.8에서 적정함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 항체 용출액은 바이러스 불활성화 단계 이후 다층여과 필터에 통과시키기 전에 pH 5.5 내지 7.0으로 조절된 것일 수 있으며, 상세하게는 pH 6.0이나, 이에 제한되지 않는다.
여기서, 완충액을 사용하여 pH를 조절할 수 있으며, 이때 사용되는 완충액의 종류는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상세하게는 Bis-Tris 또는 인산염 완충액을 사용할 수 있으며, 더욱 상세하게는 인산염 완충액을 사용할 수 있다.
또한 용출된 항체 용출액을 다층여과 필터에 적용하기 전에, pH 및/또는 전도도를 조절하는 것이 바람직하며, 이 경우, 항체 용출액의 pH는 5.5 내지 7.0으로, 전도도의 경우, 상세하게는 1.2mS/cm 내지 10mS/cm로, 더욱 상세하게는 1.3mS/cm 내지 5mS/cm로 조정될 수 있다.
본 발명에서 용어, “다층여과 필터”는 규조토가 포함된 여과 장치를 의미한다. 상기 다층여과 필터는 일련의 필터가 구멍크기가 작아지는 형태로 적층되어 있는 필터로서, 미로와 같은 3차원 매트릭스 구조를 가질 수 있다. 이러한 다층여과 필터의 작용 기전의 예로는, 양이온을 띠어, 음이온성인 DNA, 숙주세포 단백질 등의 물질과 결합하여 숙주세포 단백질을 효과적으로 제거하는 것을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 다층여과 필터는 당업계에 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으나, 상세하게는 X0HC, A1HC (Millipore 판매) 등을 사용할 수 있으며, 더욱 상세하게는 X0HC를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 다층여과 필터 과정을 통하여, 수득한 항체 여과액은 양이온 교환 컬럼을 이용하여 용출된 항체 여과액과 대비하여 크게 숙주세포 단백질의 함량을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서 상기 용출시키는 단계; 한외여과 및 정용여과하는 단계; 및 다층여과 필터에 통과시켜 여과액을 회수하는 단계 이후, 음이온 교환 컬럼을 이용하여 숙주세포 단백질을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 회수한 여과액을 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 통과액(flow through)을 수집하는 정제 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “음이온 교환 크로마토그래피”는 음이온 교환 수지를 충진한 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 의미하며, 상기 단계에서는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물, 상세하게는 숙주세포 단백질을 제거할 수 있다.
상기 음이온 교환 수지는 다른 수용액에 첨가되어 수용액 속의 특정 음이온과 자신의 음이온을 교환하는 역할을 하는 합성수지를 의미하며, 음이온 교환 컬럼은 등전점 이상에서 음이온을 띠는 단백질을 흡착시킬 수 있다. 항체의 경우 등전점이 높으므로 중성 pH의 완충액을 사용할 경우 항체가 음이온 교환 수지에는 붙지 않고 빠져나오게 되나, 숙주세포 단백질을 포함한 불순물들은 등전점이 낮으므로 음이온 교환 수지에 흡착되어 제거될 수 있어, 상기 원리를 이용하여 정제 단계를 수행할 수 있다.
상기 음이온 교환 수지는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 상세하게는 큐 세파로오스(Q sepharose), 4급 아미노에틸 또는 4급 아민(Q) 등을 사용할 수 있으며, 보다 상세하게는 Q 패스트 플로우(Q Fast Flow)TM를 사용할 수 있다.
상기 제거되는 숙주세포 단백질은 상기에서 언급한 바와 같이 정제하고자 하는 항체를 제외한 불순물을 모두 포함하는 개념이며, 숙주세포 단백질 자체만이 아닌 숙주세포에서 유래한 DNA 및 세포생장을 위한 인자 등을 모두 포함할 수 있다. 따라서, 상기 숙주세포 단백질을 제거하면 정제하고자 하는 항체만을 고순도로 정제할 수 있다.
또한, 상기 음이온 교환 컬럼은 숙주세포 단백질뿐만 아니라 엔도톡신의 제거에도 효율적인 컬럼이므로, 최종 정제 단계에서 숙주세포 단백질과 함께 엔도톡신을 제거하여 순도가 높은 목적 항체를 정제할 수 있는 이점을 가진다.
본 발명에 따라 상기 언급된 단계들의 항체 정제 방법을 거치면 최종적으로 불순물, 특히 숙주세포 단백질이 효율적으로 제거된 고순도 및 고수율의 항체를 정제할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 방법은 선행기술들에서 사용하였던 다량의 완충액 사용을 크게 감소시켜 제조 원가 및 제조 시간 측면에서 큰 단축을 이루었다는 점에서 항체 제조 공정상의 우수한 장점을 가진다.
최종 정제 후에 숙주세포 단백질의 함량은 상세하게는, 0.001 내지 10 ppm일 수 있으며, 보다 상세하게는 0.01 내지 5 ppm일 수 있다.
이에 따라 본 발명의 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 항체를 제공한다.
본 발명에 따른 항체의 정제 방법을 이용하면, 고가의 단백질 A(protein A) 컬럼을 사용하지 않고 불순물을 제거하여 고순도 및 고품질로 목적하는 항체를 제조할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 용출 공정에서 사용되는 완충액의 양(부피)을 크게 감소시키는 동시에 높은 수율로 항체를 정제하였다는 점에서 우수한 효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 cation exchange chromatography 단계의 용출 프로파일을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 얻은 용출액의 CE-HPLC 분석 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 한외여과 및 정용여과의 적정 pH 조건을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 베바시주맙 전처리 단계
베바시주맙(Bevacizumab) 항체를 발현시키는 재조합 CHO 세포를 배양하여 베바시주맙 항체를 발현시켰다. 본 발명의 실시예에 따른 베바시주맙 항체는 항체 역가를 2 내지 3의 수준으로 가지는 것으로 확인하였고, 이를 본 발명의 실험에 사용하였다.
양이온 교환 컬럼에 항체를 흡착시키기 위해 배양액에 1M 글라이신(Glycine) HCl(pH 3.0) 완충액을 첨가하여 pH를 6.0으로 조정하고, 전도도를 6.5 mS/cm 내지 8.5 mS/cm로 조정하여 실험을 수행하였다.
각 시험군별 배양액 전처리에 사용된 1M glycine-HCl (pH 3.0)과 첨가된 3차 정제수의 양, 전처리 후의 loading 시료 조건은 아래 표 1과 같다.
전도도 배양액 1M glycine-HCl (pH3.0) 3차 정제수 전처리 후 loading 시료
pH 전도도
6.5mS/cm 400mL 17.40mL 498.15mL 6.02 6.48
7.0mS/cm 400mL 17.40mL 450.15mL 6.02 7.01
7.5mS/cm 400mL 17.56mL 354.53mL 6.00 7.5
8.0mS/cm 454.97mL 20.51mL 363.57mL 6.01 8.02
8.5mS/cm 400mL 17.42mL 272.99mL 6.03 8.45
실시예 2: 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피
본 실시예에서는 프락토겔(fractogel)TMEMDSO3컬럼을 양이온 교환 컬럼으로 사용하였고, 그 과정은 하기와 같았다.
평형화를 위하여, 20mM 인산염 완충액(pH 6.0)을 3 컬럼 부피로 흘려주어 컬럼을 평형화시켰다. 그리고 나서, 상기 실시예 1의 전처리가 완료된 상등액을 SO3의 흡착 용량 이하로 로딩하였다. 로딩량은 1L 수지 볼륨당 30g의 이하의 단백질이었으며, 로딩속도는 150cm/hr로 가하였다.
그리고 나서, 3 단계의 세척 단계 및 2 단계의 용출 단계를 아래 표 2의 조건으로 수행하였다.
완충액 컬럼 부피
세척 1 단계 20 mM 인산염 완충액, pH 6.0, 5
세척 2 단계 20 mM 인산염 완충액, pH 6.48, 3
세척 3 단계 37.5 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액,
pH 6.48, 5.8 mS/cm		 5
용출 1 단계 40 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액,
pH 6.48, 6.2 mS/cm		 16
용출 2 단계 58 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액,
pH 6.48, 7.9 mS/cm		 7
위 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에서는 아래 비교예의 세척 4 단계 및 용출 1 단계에 각각 대응하는 용출 1 단계 및 용출 2 단계 컬럼 부피를 각각 16 컬럼 부피, 7 컬럼 부피로 줄였다.
한편, 비교를 위하여, 세척 4 단계(상기 실시예의 용출 1 단계에 대응) 및 용출 1 단계(상기 실시예의 용출 2 단계에 대응)에서의 컬럼 부피를 각각 30 컬럼 부피, 20 컬럼 부피으로 하는 하기 표 3의 조건 하의 비교예를 설정하였다.
완충액 컬럼 부피
세척 1 단계 20 mM 인산염 완충액, pH 6.0, 5
세척 2 단계 20 mM 인산염 완충액, pH 6.48, 3
세척 3 단계 37.5 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액,
pH 6.48, 5.8 mS/cm		 5
세척 4 단계 40 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액,
pH 6.48, 6.2 mS/cm		 30
용출 1 단계 58 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액,
pH 6.48, 7.9 mS/cm		 20
특히, 위 비교예의경우, 대한민국 등록특허 제10-1569783호의 발명에서 실제 사용한 방식과 동일한 형태로 컬럼 부피를 사용한 것이다.
실시예 3: 전처리 전도도 차이에 따른 수율 및 Charge variants 함량 확인
상기 실시예 1에 따른 전도도에 따라 제조된 전처리된 베바시주맙 시료를 실시예 2의 조건으로 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여, 단계 수율 및 Charge variant 함량 변화를 확인하였다.
그 결과를 표 4 및 표 5에 나타내었다.
전도도 loading
단백질 양		 용출액 부피 총 회수
단백질 양		 단계 수율
6.5mS/cm 409.5mg 167.26mL 348.0mg 84.9%
7.0mS/cm 402.7mg 166.56mL 389.1mg 96.7%
7.5mS/cm 400.7mg 166.56mL 373.1mg 93.2%
8.0mS/cm 422.1mg 164.72mL 388.6mg 92.0%
8.5mS/cm 394.8mg 123.10mL 117.8mg 29.8%
실험군 Acidic peak (%) Main peak (%) Basic peak (%) Total basic (%)
6.5mS/cm 23.1 72.9 1.6 4.0
7.0mS/cm 20.6 75.8 0.8 2.1
7.5mS/cm 21.5 74.8 0.9 2.5
8.0mS/cm 16.7 79.4 1.2 3.0
8.5mS/cm 12.4 79.4 3.6 8.1
상기 표 4는 전처리 전도도 차이에 따른 수율 변화를 확인한 결과를 나타낸다. 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 7.0mS/cm 내지 8.0mS/cm에서 90.0% 이상의 단계 수율을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 7.0mS/cm에서 가장 우수한 단계 수율을 나타내었음을 확인하였다.
또한, 표 5는 전처리 전도도 차이에 따른 Charge variant 함량을 비교한 결과를 나타낸다. 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 7.0mS/cm 내지 8.0mS/cm에서 대조 약물인 아바스틴과 유사한 주요 피크 및 산성 이성질체와 염기성 이성질체 피크를, 특히, 7.0 mS/cm에서 대조 약물인 아바스틴과 가장 유사한 주요 피크 및 산성 이성질체와 염기성 이성질체 피크를 나타내었다.
특히, 위와 같은 전도도의 변화와 함께 적은 완충액 사용을 통해 용출 공정을 수행하는 경우, 우수한 단계 수율 및 낮은 염기성 이성질체 함량을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 컬럼 부피 감소에 따른 수율 증가 확인
상기 실시예 2의 조건 하에 전도도 7.0 mS/cm을 가지는 하기 시료에 대한 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다.
상기 실시예 1의 전처리된 시료의 경우 시료 농도 1.04 mg/ml이었으며, 로딩 부피는 162 ml이었으며, 총 단백질 투여량은 168.8 mg이었다.
정제 공정은 CV: 5mL (Pre-packed), Bed height: 10.0cm, Flow rate: 0.67mL/min 또는 0.84 mL/min의 조건을 이용하였다.
한편, 위 조건과 동일하게 표 3의 비교예 조건을 함께 실험하여, 수율 변화를 확인하였다.
그 결과를 표 6에 나타내었다.
프로세스 수율
(%)		 Acidic peak (%) Main peak (%) Basic peak (%) Total basic (%)
실시예 2(반복1) 66.5 8.9 85.3 4.1 5.9
실시예 2(반복2) 66.5 9.1 85.1 4.1 5.9
실시예 2(반복3) 66.9 8.8 85.3 4.2 5.9
비교예 48.1 6.8 87.2 3.9 6.0
상기 확인되는 바와 같이, 비교예의 정제 공정 적용시 수율은 단지 50 % 내외에 불과하였다. 반면, 본 발명에 따른 방법을 이용하는 경우, 세척 공정 및 용출 공정의 시간과 사용되는 완충액의 양을 크게 감소시켰음에도 불구하고 약 60 % 이상의 높은 수율을 나타내었다. 또한, Charge variants 함량 측면에서도 바이오시밀러 제조에 적합한 수준의 Charge variants 함량을 나타냄을 확인하였다.
실시예 5: 바이러스 불활성화
상기 실시예 2에 따른 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한 용출액에 1M glycine-HCl(pH 3.0) 완충액을 첨가하여 pH 3.8에서 1시간 동안 바이러스 불활성화를 시켰다. 불활성화가 완료된 후, 0.2㎛ 필터를 통과시켜 여과한 뒤, 시료의 pH는 1M Tris-HCl(pH 9.0) 완충액을 첨가하여 시료의 pH를 6.0으로 조정하였다.
실시예 6: 한외여과 및 정용여과 공정
시료량을 고려하여 한외여과 및 정용여과 (UF/DF1) 공정은 micro-centricon (0.5mL)을 사용하였으며, 각 조건 별로 3반복(Triplicate)으로 진행하였다.
Micro-centricon은 Amicon Ultra 0.5mL Ultracel을 사용하였고, 농축 및 버퍼교환을 위해 사용된 원심분리기는 Eppendorf centrifuge를 사용하였다. 초기 농축 농도 20mg/mL을 맞추기 위해 UF/DF1 주입시료 400㎕(5.13mg/mL)를 micro-centricon에 넣고, 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 진행하여 100㎕까지 농축하였다. 100㎕까지 농축된 시료에 대해 표 7의 각 pH 별 완충액 100㎕을 첨가하여 2배 희석한 후, 다시 5,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 100㎕까지 농축하였다. 상기 과정을 7회 수행하여 UF/DF1를 완료하였다.
최대한 정확한 실험을 위해 micro-centricon, UF/DF1 주입시료, UF후 부피를 모두 무게로 측정하였다.
Name Buffer composition Measured value
pH Cond. (mS/cm)
Experiment 1 20mM Na-phosphate pH 6.0 5.988 1.61
Experiment 2 20mM Na-phosphate pH 6.5 6.519 1.89
Experiment 3 20mM Na-phosphate pH 7.0 7.000 2.53
Experiment 4 50mM Tris-HCl, 20mM NaCl pH 7.0 6.997 6.36
Experiment 5 50mM Tris-HCl, 20mM NaCl pH 7.5 7.504 5.84
상기 SE-HPLC 분석을 위한 integration event의 적용은 SOP에 정의된 integration event를 적용하여 aggregate 함량을 분석하였다.
그 결과를 표 8에 나타내었다.
Name No. SE-HPLC (%)
Aggregate AVG. Aggregate
50mM Tris-HCl, 20mM NaCl pH 7.5 1 5.24 5.44
2 4.76
3 6.33
50mM Tris-HCl, 20mM NaCl pH 7.0 1 4.82 4.68
2 4.64
3 4.59
20mM Na-phosphate pH 7.0 1 3.95 3.70
2 3.57
3 3.54
20mM Na-phosphate pH 6.5 1 3.09 2.98
2 2.92
3 2.95
20mM Na-phosphate pH 6.0 1 1.82 1.83
2 1.83
3 1.84
pH 조건 별 aggregation 함량 분석 결과, 표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 pH의 변화에 따라 aggregation 함량이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, pH 증가에 따른 UF/DF1 공정에서의 aggregate 함량증가의 유의성을 확인하기 위해 독립변수(pH)에 대한 직선성 확인 결과, Y= 2.4x-12.6의 직선의 방정식을 확인하였고, R2는 0.88을 확인하였다. 기울기의 값(2.4)이 양의 값을 가지기 때문에 X축의 독립변수(pH) 증가에 따라 Y축의 종속변수(aggregate 함량)가 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, Tris-HCl buffer를 이용한 pH 7.5 이상의 조건은 UF/DF1 단계에서 aggregates 함량이 증가하므로 공정 적용에 어려울 것으로 판단되었다. 반면, 20mM Na-phosphate pH 6.0 조건을 적용하는 것이 적합한 것으로 확인되었다.
실시예 7: 다층여과 필터링 공정
다층여과 필터는 정전기적 성질 등에 의해, 숙주 유래 DNA(HCD), 숙주 유래 단백질(HCP) 등을 감소시킬 수 있다. 이에, XOHC 형태의 다층여과 필터를 준비하고, 3차 정제수 및 20mM Sodium Phosphate(pH 6.0) 완충액을 흘려 치환하여 평형화하였다. 그 다음, 바이러스 불활성화시킨 후 여과 공정을 거친 실시예 6의 시료를 20mM Sodium Phosphate(pH 6.0) 완충액으로 치환한 후, 다층여과 필터에 흘려 100LMH(Liter/㎡/hour)의 유속으로 여과하였다. 여과가 완료된 시료를 모두 회수하여 하기 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 정제를 위한 시료로 사용하였다.
실시예 8: 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피
음이온 교환 컬럼은 등전점 이상에서 음이온을 띠는 단백질을 흡착시키므로, 등전점이 7 이상인 항체의 경우(베바시주맙의 경우, 등전점이 8.3), 중성 pH의 완충액을 사용하는 경우 본 항체는 음이온 교환 수지에는 붙지 않고 통과액(flow-through)으로 빠져나오게 된다. 이에, 본 발명의 제조 공정에 적합한 음이온 교환 수지 및 완충액 조건을 규명하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 본 실시예에서는 음이온 교환수지로서 생산스케일에서 많이 사용하고 있는 4급 아민(Quaternary amine) 계열의 Q 세파로스 패스트 플로우(Q sepharoseTMFastflow)를 이용하여 정제를 실시하였다.
우선, 음이온 교환수지에 로딩하기 위한 샘플은, 상기 실시예에서와 같이, 배양 상등액에서 양이온 교환 컬럼, 바이러스 불활성화가 완료된 후, 1차 한외여과를 거친 다음, 50mM Sodium Phosphate(pH 6.0) 평형 완충액으로 치환하여 pH 6.0 및 전도도 1.4mS/cm로 준비하였다.
로딩량은 1L 수지 볼륨당 30g 이하의 단백질이었으며, 로딩 및 용출속도는 150cm/hr로 수행했고, A280nm에서의 흡광도가 상승하면 컬럼 관류물을 수집했다. 컬럼은 1M NaCl로 재생시킨 후 평형 완충액으로 평형화시켰다.
상기 실시예 7에 따라 제조된 베바시주맙 시료를 위와 같은 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여, pH 조건 별 단계 수율을 확인하였다.
그 결과를 표 9에 나타내었다.
pH Condition 단계 수율 (step yield(%))
6.0 96.6%
7.0 95.4%
7.5 93.2%
8.0 90.3%
8.5 62.8%
상기 표 9는 pH condition 차이에 따른 단계 수율 변화를 확인한 결과를 나타낸다. 표 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음이온 교환 크로마토그래피 수행 시 pH 6.0 내지 8.0 범위 내에서 90.0% 이상의 단계 수율을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 pH 6.0에서 가장 우수한 단계 수율을 나타내었음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 항체 및 하나 이상의 숙주세포 단백질(host cell protein, HCP)을 포함하는 pH 5.5 내지 7.0 및 전도도 7mS/cm 내지 8mS/cm인 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하고, 양이온 교환 컬럼을 세척 완충액으로 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법으로서,
    상기 세척 완충액으로 세척하는 단계는,
    1) 0mM 내지 38mM 염화 나트륨을 포함하는 pH 5.5 내지 7.0의 10mM 내지 50mM 인산염을 포함하는, 완충액으로 항체를 세척하는 단계;를 포함하며,
    상기 용출 완충액으로 용출시키는 단계는,
    1) 38mM 내지 50mM 염화 나트륨을 포함하는 pH 6.0 내지 7.0의 10mM 내지 50mM의 인산염을 포함하는, 10 내지 20 컬럼 부피의 완충액으로 항체를 제1 용출시키는 단계; 및
    2) 50mM 내지 60mM 염화 나트륨을 포함하는 pH 6.0 내지 7.0의 10mM 내지 50mM의 인산염을 포함하는, 5 내지 12 컬럼 부피의 완충액으로 항체를 제2 용출시키는 단계;를 포함하는, 항체의 정제 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 1) 0mM 내지 38mM 염화 나트륨을 포함하는 pH 5.5 내지 7.0의 10mM 내지 50mM 인산염을 포함하는, 완충액으로 항체를 세척하는 단계는 하기 3 단계를 포함하는 것인, 방법:
    a) 염화 나트륨을 포함하지 않고 pH 5.5 내지 7.0의 10mM 내지 50mM 인산염을 포함하는 세척 완충액으로 제1 차 세척하는 단계;
    b) 염화 나트륨을 포함하지 않고 pH 5.5 내지 7.0의 10mM 내지 50mM 인산염을 포함하는 세척 완충액으로 제2 차 세척하는 단계; 및
    c) 20 내지 38mM의 염화나트륨을 포함하는 pH 6.0 내지 7.0의 10mM 내지 50mM 인산염을 포함하는 세척 완충액으로 제3 차 세척하는 단계.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 등전점이 6 내지 11인 것인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 베바시주맙(Bevacizumab) 인 것인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온 교환 컬럼의 작용기는 카복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 양이온 교환 컬럼의 작용기가 설포네이트인 컬럼은, 프락토겔(Fractogel)TMEMD SO3인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 항체의 정제 방법은
    상기 용출시키는 단계를 통해 회수한 여과액을 한외여과 및 정용여과하는 단계; 및 다층여과 필터에 통과시켜 여과액을 회수하는 단계;를 더 포함하는 것인, 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 항체의 정제 방법은 다층여과 필터에 통과시켜 여과액을 회수하는 단계 이후 음이온 교환 컬럼을 이용하여 숙주세포 단백질을 제거하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
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