KR20190076046A - 단백질 용액의 탈염 공정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미세기공 음이온 및 양이온 교환 수지를 사용하여 단백질 용액을 탈염하는 신규 방법을 제공한다. 또한, 생물 약제 용액을 탈염하는 연속 공정이 개발되었다. 생물 약제 용액의 탈염 공정에 사용되는 장치도 개발되었다.
Description
본 발명은 일반적으로 생물 약제(biopharmaceutical) 바이오 처리 분야에 관한 것으로, 특히 생물 약제 용액에서 염 농도를 감소시키는 것에 관한 것이다. 본원에는 생물 약제 용액을 탈염하는 공정과 이 공정에 사용되는 장치가 포함된다.
염분 농도 및 타입에 민감한 유닛 조작을 상호 연결하기 위해 생물 처리에서 탈염이 필요하다. 단백질 리폴딩과 같은 많은 유닛 조작은 이온 교환 크로마토그래피(IEX)와 같은 후속 단계를 방해하는 높은 염 농도를 필요로 한다.
재조합 단백질은 비교적 순수한 형태 및 고농도로 발효 배지(fermentation broth)로부터 쉽게 분리될 수 있는 봉입체(IBs)로서 종종 대장균에서 생산된다. 그러나, 봉입체는 불용성의 폴딩되지 않은 단백질 응집체로 이루어져 있으며, 고유한 단백질 구조를 얻기 위해 추가로 가용화 및 리폴딩되어야 한다. 업계에서 적용되는 단백질 리폴딩의 가장 간단하고 가장 일반적인 방법은 염 농도가 높은 버퍼가 필요한 희석에 이어 높은 카오트로픽 조성(chaotropic composition)을 갖는 버퍼에서 재용해시키는 것이다. 이러한 공정으로 인해 높은 염 농도를 갖는 다음의 유닛 조작을 위한 공급 스트림이 생기므로 이온 교환은 단백질 회수에 적합한 옵션이 아니다. 따라서, 경제적이지 않을 수 있는 단백질 포집을 위해 다른 유형의 크로마토그래피가 사용되어야 하거나, 이온 교환 수지에 효율적으로 결합할 수 있도록 용액의 염 농도를 낮춰야 한다. 전도도의 이러한 감소는 일반적으로 희석 또는 정용여과(diafiltration)에 의해 이루어진다.
또한, 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)에서, 단백질은 높은 염 농도에서 결합된다. 용출은 염을 낮춤으로써 효율적이지만 단백질은 용출 구배 전면에서 용출된다. 따라서 단백질은 여전히 높은 염 농도로 존재하고 전도도를 낮추지 않고 이온 교환기에 로딩할 수 없다. 전도도가 증가함에 따라, 결합 부위의 정전기 차폐로 인해 종래의 이온 교환기의 결합 용량이 엄청나게 감소하고, 저염 농도만이 효율적으로 포집될 수 있다는 것이 널리 알려져 있다. 그러나 대부분의 경우 이러한 불리한 상황은 비용-집중적인 수지인 포집 단계에서 친화성 크로마토그래피를 적용하거나 희석, 투석 여과 또는 투석과 같은 부가적인 공정 단계를 도입함으로써 극복된다.
또 다른 가능성은 단백질 용액의 탈염에 사용된 혼합 이온-교환기이다 (Hashimoto, K., S. Adachi 및 Y. Shirai, Simulated Moving-Bed Absorber를 이용한 단백질의 연속 탈염, Agricultural and Biological Chemistry, 1988). 52 (9) : p.2161-2167). 이러한 혼합 이온 교환기에는 두 가지 주요 단점이 있다. 처음에는 단순히 재생할 수 없으며 두 번째 pH는 조절할 수 없다. 단백질 용액의 버퍼 조성에 따라, pH는 산성 또는 염기성 조건에서 실질적으로 움직일 것이고 결과적으로 로버스트(robust)하지 않은 공정을 유도할 것이다.
따라서, 단백질 용액과 같은 생물 약제 용액을 탈염하는 대안적인 방법을 제공할 필요가 있다. 우리는 탈이온화, 세척, 및 회분 또는 연속 모드에서의 재생을 포함하는 통합 공정 및 이러한 공정에서 사용하기 위한 장치를 개발하였다.
또한, 본 발명은 단백질 용액의 연속적인 후속 처리 방법을 제공한다. 연속적인 후속 처리는 생물 약제 산업에서 여전히 큰 잠재력을 지니고는 있지만 거의 적용되지 않는다. 식품 및 화학 산업과 같은 다른 산업 분야에서 이미 수행된 것처럼, 통합 공정으로 매우 효율적이고 유연한 제조가 가능하다. 장비 크기 축소, 버퍼 절약, 최적화된 주기 시간 및 생산성 향상으로 인해 투자 및 운영 비용을 줄일 수 있다. 현재 생물 약제 생산을 위해 산업적 규모로 적용되지는 않지만 이 주제는 학계와 산업계의 많은 연구자들의 관심을 불러 일으켰다.
요약
추가 처리용 탈염된 생물 약제 용액을 제공하기 위하여, 용액을 미세기공 음이온 및 양이온 교환기 세트에 첨가하는 단계를 포함하는 공정이 개발되었다. 바람직한 설정에서, 생물 약제는 미세기공 음이온 교환기를 포함하는 제 1 용기에 첨가 된 다음, 생성된 용액을 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 제 2 용기로 이송하고, 이어서 생성된 탈염된 생물 약제 용액을 수집한다. 본 발명의 공정으로부터 생성된 탈염된 생물 약제 용액은 추가 처리를 위해 직접 사용될 수 있거나 또는 미세기공 음이온 교환기 및 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 제 1 용기 세트와 동일한 제 2 용기 세트로 이송할 수 있다. 이 과정은 하나 또는 여러 개의 추가 용기 세트로 반복될 수 있다. 또한, 미세기공 교환 수지를 포함하는 용기들은 재사용을 위해 개별적으로 재생할 수 있으며, NaOH로 미세기공 음이온 교환기를 갖는 용기 및 HCl로 미세기공 양이온 교환기를 갖는 용기이다. 탈염된 약제는 위에서 기술된 바와 같이 새로운 용기 세트 또는 수집 전에 재생 용기에 적용될 수 있다.
또한, 도 1a에 도시된 이 기본 설정은 도 14 및 도 15에서와 같이 생물 약제 용액을 탈염하는 공정에서 사용되는 용기들의 다양한 대체 구성을 개발하게 되었다. 특히, 제 1 용기 세트가 재생되는 동안 생물 약제의 공급물이 제 1 용기 세트로부터 제 2 용기 세트로 되돌릴 수 있는 연속 공정이 효율적이었지만, 생물 약제 공급 용액의 연속적인 유동 및 탈염된 생물 약제 용액의 수집을 가능하게 한다. 이 연속 설정은 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 또는 추가 용기 세트를 첨가하여 여러 용기 세트와 함께 사용하도록 확장할 수 있다.
그러한 설정은 (1) 미세기공(micropore) 음이온 교환기를 포함하는 용기에 이어 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 제 2 용기로 이루어진 제 1 용기 세트에 생물 약제 용액 (공급 용액)을 첨가하는 단계, (2) 생성된 탈염된 생물 약제 용액을 수집하는 단계, (3) 단계 (2)에서의 탈염된 생물 약제용액을 미세기공 음이온 교환기를 포함하는 용기에 이어 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 용기로 이루어진 제 1 용기 세트와 동일한 제 2 용기 세트에 동시에 첨가하면서 미세기공 음이온 교환기를 NaOH로, 양이온 미세기공 교환기를 HCL로 재생시키는 단계를 포함하는 생물 약제 용액의 탈염 공정을 허용한다. 단계 (3)에서 제 2 용기 세트로부터 생성된 탈염된 생물 약제 용액은 재생된 제 1 용기 세트로 다시 향하게 할 수 있고, 단계 (1)-(3)은 생물 약제 용액에서 염의 전량이 완전히 제거될 때까지 반복될 수 있다. 동시에 제 2 교환기 세트가 재생될 수 있고, 제 2 미세기공 음이온 교환기는 NaOH로 제 2 미세기공 양이온 교환기는 HCl로 재생된다. 다시 한번, 이 공정은 병렬로 사용되는 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 또는 추가 용기 세트를 포함하도록 확장되어 탈염된 생물 약제 용액을 재생된 하나의 용기 세트에 로딩하면서 동시에 여러 용기 세트를 재생할 수 있게 한다.
본원에 기술된 공정은 미세기공 교환을 위한 임의의 용기, 예컨대 컬럼 또는 멤브레인 또는 모노리스를 함유하는 하우징을 사용할 수 있다. 상기 공정은 단백질 용액과 같은 탈염이 필요한 모든 생물 약제 용액에 적용될 수 있다. 바람직한 단백질 용액은 리폴딩 용액, 소수성 상호 작용 크로마토그래피의 용액, 이온 교환 크로마토그래피에서 생성된 단백질, 단백질의 염석에서 생성된 용액 또는 수성 2 상 추출로부터 생성된 용액을 포함하는 군에서 선택된다. 상기 용액 중의 단백질의 예는 scFv, 항체, 나노바디, 2가 항체, 3가 항체, 카멜리드 항체, 항체 접합체, 사이토카인 및 펩타이드 호르몬이다. 추가 후속 공정을 위해, 본 발명의 탈염된 생물 약제는 거대기공 수지로 통과될 수 있다.
따라서, 본 발명은 단백질 용액이 음이온 교환기에서 양이온 교환기로 통과 할 수 있고 양이온 교환기를 통과한 후에 수집될 수 있는 수단으로서 미세기공 양이온 교환기(CEX)를 포함하는 용기 (2)에 연결된 미세기공 음이온 교환기(AEX)를 포함하는 용기 (1)로 구성된 용기 세트를 포함하는 생물 약제 용액을 탈염하기 위한 장치에 관한 것이다. 이 장치에서, 단백질 용액이 제 1 용기 세트에서 제 2 용기 세트로 통과할 수 있는 수단으로서 제 1 용기 세트가 미세기공 양이온 교환기(CEX)를 포함하는 용기 (2)에 연결된 미세기공 음이온 교환기(AEX)를 포함하는 용기 (1)로 구성된 제 2, 제 3, 제 4 또는 다중의 동일한 용기 세트에 연결될 수 있다. 본 발명의 장치의 상이한 구성이 도 14에 도시되어 있다. 또는 특정 생물 약제 용액의 경우 도 15와 같이 CEX에 이어 AEX로 순서를 바꿀 수 있다.
도 1a: PCCC 설정으로 불리는 시차 주기(staggered cycle)를 통한 미세기공 이온교환기를 사용한 연속 탈이온화 도식.
도 1b: 시차 주기 작동에서 미세기공 이온교환 수지를 이용한 연속 탈염 운전의 흐름도
도 2: 시간 경과에 따른 공정 순서. 공급하는 동안 컬럼의 초기 세척 단계 (중간에 있는 막대들)에서도 컬럼이 상호 연결되며, 반면에 재생 및 다음 세척 단계는 단일 컬럼(분리되어 있는 막대들)에서 상에서 수행되었다.
도 3: 탈이온화 주기 동안 개별 단계의 도면, 좁은 줄무늬는 제거된 기둥의 초기 기공 부피를 나타낸다. 넓은 줄무늬는 세척 동안 수집된 동일한 부피를 나타낸다.
도 4: 탈이온화 운전의 크로마토그램은 마라톤 A2 (CV 3.7 ml) 및 세파비즈 (CV 6.2 ml)에서 18 cm/h로 수행된다. scFv 리폴딩 용액 (UV280 = 180 mAU, Cond. = 11 mS/cm, pH = 10.5)의 로딩.
도 5: 주기 당 24 ml 리폴딩 용액을 공급하는 연속 탈이온화 운전의 크로마토그램. 회색 배경은 탈이온화 리폴딩 용액의 수집을 나타낸다. 초기 리폴딩 샘플 : UV280 188 mAU, Cond. 10.0 mS/cm, pH 10.4. 빨간 선(가장 낮은)은 전도도, 녹색 선은 (가장 높은) pH, 그리고 청색 선(중간)은 UV280이다.
도 6 : 주기 시간 비교 : 회분 대 연속 모드 (시차 주기).
도 7a : scFv A4-LCHC의 평형 결합능을 위한 미세기공 이온교환 수지의 스크리닝. 녹색 줄무늬 막대 : 음이온 교환기를 갖는 리폴딩 용액을 직접 포집. 노란 막대 : 양이온 교환기를 갖는 탈이온화 리폴딩 용액 포집.
도 7b : 시험된 다른 거대기공 이온교환 수지의 리스트.
도 8 : 미처리된 scFv 리폴딩 용액으로 탈염된 용액을 혼합하여 pH와 전도도에 미치는 영향.
도 9 : 분석 단백질 L 모노리스 운전 크로마토그램. 피크를 통과하는 유동의 불순물, 용출 피크 내 scFv
도 10 : 리폴딩 조건에서 scFv의 가장 낮은 단백질 결합 특성을 위한 미세기공 양이온 교환 수지의 스크리닝.
도 11 : pH 2.5에서 scFv의 가장 낮은 단백질 결합 특성을 위한 미세기공 양이온 교환 수지의 스크리닝.
도 12 : 리폴딩 조건에서 scFv의 가장 낮은 단백질 결합 특성을 위한 미세기공 음이온 교환 수지의 스크리닝.
도 13 : pH 2.5에서 scFv의 가장 낮은 단백질 결합 특성을 위한 미세기공 음이온 교환 수지의 스크리닝.
도 14 : 음이온 교환 후 양이온 교환이 가능한 다양한 탈염 공정 구성.
도 15 : 양이온 교환 후 음이온 교환이 가능한 다양한 탈염 공정 구성.
도 16 : 가능한 연속 탈염 공정 구성 : A) 음이온 및 양이온 교환기로 구성된 두 세트의 컬럼을 사용하는 시차 주기, B) 동일한 컬럼 세트를 갖는 PCCC, C) 4개의 컬럼 각각을 갖는 음이온 및 양이온 SMB 시스템으로 구성된 트윈 SMB.
도 17 : hFGF-2 용액을 공급하는 연속 탈염 운전의 크로마토그램. 회색 배경은 탈이온화 용액의 수집을 나타낸다. 초기 hFGF-2 용액 : 전도도 44.15 mS/cm, pH 6.5.
도 18 : GFP 용액을 공급하는 연속 탈염 운전의 크로마토그램. 회색 배경은 탈이온화 리폴딩 용액의 수집을 나타낸다. 초기 GFP 용액 : 전도도 10.0 mS/cm, pH 7.3.
도 19 : 재용해된 mAb 용액을 공급하는 연속 탈염 운전의 크로마토그램. 회색 배경은 탈이온화 리폴딩 용액의 수집을 나타낸다. 초기 mAb 용액 : 전도도 21.0 mS/cm, pH 7.6.
도 1b: 시차 주기 작동에서 미세기공 이온교환 수지를 이용한 연속 탈염 운전의 흐름도
도 2: 시간 경과에 따른 공정 순서. 공급하는 동안 컬럼의 초기 세척 단계 (중간에 있는 막대들)에서도 컬럼이 상호 연결되며, 반면에 재생 및 다음 세척 단계는 단일 컬럼(분리되어 있는 막대들)에서 상에서 수행되었다.
도 3: 탈이온화 주기 동안 개별 단계의 도면, 좁은 줄무늬는 제거된 기둥의 초기 기공 부피를 나타낸다. 넓은 줄무늬는 세척 동안 수집된 동일한 부피를 나타낸다.
도 4: 탈이온화 운전의 크로마토그램은 마라톤 A2 (CV 3.7 ml) 및 세파비즈 (CV 6.2 ml)에서 18 cm/h로 수행된다. scFv 리폴딩 용액 (UV280 = 180 mAU, Cond. = 11 mS/cm, pH = 10.5)의 로딩.
도 5: 주기 당 24 ml 리폴딩 용액을 공급하는 연속 탈이온화 운전의 크로마토그램. 회색 배경은 탈이온화 리폴딩 용액의 수집을 나타낸다. 초기 리폴딩 샘플 : UV280 188 mAU, Cond. 10.0 mS/cm, pH 10.4. 빨간 선(가장 낮은)은 전도도, 녹색 선은 (가장 높은) pH, 그리고 청색 선(중간)은 UV280이다.
도 6 : 주기 시간 비교 : 회분 대 연속 모드 (시차 주기).
도 7a : scFv A4-LCHC의 평형 결합능을 위한 미세기공 이온교환 수지의 스크리닝. 녹색 줄무늬 막대 : 음이온 교환기를 갖는 리폴딩 용액을 직접 포집. 노란 막대 : 양이온 교환기를 갖는 탈이온화 리폴딩 용액 포집.
도 7b : 시험된 다른 거대기공 이온교환 수지의 리스트.
도 8 : 미처리된 scFv 리폴딩 용액으로 탈염된 용액을 혼합하여 pH와 전도도에 미치는 영향.
도 9 : 분석 단백질 L 모노리스 운전 크로마토그램. 피크를 통과하는 유동의 불순물, 용출 피크 내 scFv
도 10 : 리폴딩 조건에서 scFv의 가장 낮은 단백질 결합 특성을 위한 미세기공 양이온 교환 수지의 스크리닝.
도 11 : pH 2.5에서 scFv의 가장 낮은 단백질 결합 특성을 위한 미세기공 양이온 교환 수지의 스크리닝.
도 12 : 리폴딩 조건에서 scFv의 가장 낮은 단백질 결합 특성을 위한 미세기공 음이온 교환 수지의 스크리닝.
도 13 : pH 2.5에서 scFv의 가장 낮은 단백질 결합 특성을 위한 미세기공 음이온 교환 수지의 스크리닝.
도 14 : 음이온 교환 후 양이온 교환이 가능한 다양한 탈염 공정 구성.
도 15 : 양이온 교환 후 음이온 교환이 가능한 다양한 탈염 공정 구성.
도 16 : 가능한 연속 탈염 공정 구성 : A) 음이온 및 양이온 교환기로 구성된 두 세트의 컬럼을 사용하는 시차 주기, B) 동일한 컬럼 세트를 갖는 PCCC, C) 4개의 컬럼 각각을 갖는 음이온 및 양이온 SMB 시스템으로 구성된 트윈 SMB.
도 17 : hFGF-2 용액을 공급하는 연속 탈염 운전의 크로마토그램. 회색 배경은 탈이온화 용액의 수집을 나타낸다. 초기 hFGF-2 용액 : 전도도 44.15 mS/cm, pH 6.5.
도 18 : GFP 용액을 공급하는 연속 탈염 운전의 크로마토그램. 회색 배경은 탈이온화 리폴딩 용액의 수집을 나타낸다. 초기 GFP 용액 : 전도도 10.0 mS/cm, pH 7.3.
도 19 : 재용해된 mAb 용액을 공급하는 연속 탈염 운전의 크로마토그램. 회색 배경은 탈이온화 리폴딩 용액의 수집을 나타낸다. 초기 mAb 용액 : 전도도 21.0 mS/cm, pH 7.6.
본 발명은 생물 약제 용액, 바람직하게는 미세기공 이온교환 수지를 사용하는 단백질 용액 및 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 장치에 대한 신규하고 대안적인 탈염 또는 탈이온화 공정을 제공한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "탈이온화" 및 "탈염"은 상호교환적으로 사용되고 생물 약제 용액 중에 존재하는 양전하 및 음전하 이온의 제거를 나타낸다.
공정
본 발명에서는 생물 약제 용액, 바람직하게는 단백질 용액에 존재하는 양전하 및 음전하 이온을 제거하여 음이온 (AEX) 및 양이온 교환 (CEX)을 수행하는 공정을 개발하였다. 바람직한 구현예에서, 단백질 용액은 리폴딩 용액이다. 본 발명으로 이어진 실험에서, AEX는 CEX 앞에 배치되었는데, 이러한 형태에서 흡수 동안의 pH 전이가 더 잘 조절될 수 있고 시험된 단백질에 보다 유리하다는 것을 발견했기 때문이다. 그러나 AEX 및 CEX의 구성은 또한 탈염될 용액의 pH, 용액 내의 이온의 양 및 표적 분자의 pH 민감성에 따라 교환될 수 있다. 예를 들어, 모놀리스 음이온 교환기 배지에서 흡착되고 용출되는 플라스미드 DNA는 높은 염 농도로 그리고 가능하게는 변성 조건에서 용액 중에 존재한다. 그러므로 염 농도는 제거되어야 한다. 플라스미드 DNA는 낮은 pH에 민감하지 않으므로 CEX는 또한 이러한 구성에서 AEX 앞에 배치될 수 있다.
청구된 공정의 제 1 양태에서, 생물 약제 용액 (공급 스트림)이 AEX 컬럼에 첨가되고 AEX 컬럼에서의 아웃풋이 CEX 컬럼에 첨가되도록 2개의 미세기공 컬럼을 직렬로 (AEX에 이어 CEX) 운전하도록 연결하였다. 탈염 또는 탈이온화된 생물 약제 용액으로도 불리는, 생성된 생물 약제 용액은 추가 공정을 위해 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 공정은 고-염 생물 약제 용액을 AEX 컬럼에 첨가하는 단계, 생성된 용액을 CEX 컬럼으로 이송하는 단계, 생성된 탈염된 용액을 회수하는 단계로 이루어진다 (도 14 구성 1 참조). 그러나, 상이한 구성의 동일한 미세기공 수지를 사용하는 것이 가능할 것이다. 예를 들어, AEX-CEX-AEX-CEX의 순차 배열에서 4개의 작은 컬럼이 사용될 수 있으며, 이는 pH 값 및 pH 편위의 급격한 감소를 방지한다 (도 14 구성 2 참조). 현재의 공정 설계에서, 생물 약제 용액의 pH 값은 OH- 이온을 갖는 현재 음이온 교환으로 인해 초기에 증가하지만, H+ 이온을 갖는 양이온 교환에 의해 저하된다 (도 4 참조). 작은 컬럼이 연속적으로 연결되면, pH 변화는 덜 극단적일 것이다 - 특히, pH 민감성 단백질의 경우 이 배열이 더 유리하다 (도 5 참조).
공정 강화는 4개, 6개, 8개 또는 10개 또는 2개 컬럼의 추가 배수를 사용하여 수행할 수 있다. 이 컬럼들은 공정 시간과 수지 부피를 추가로 줄이기 위해 시차 주기 작동에서 연속적으로 수행될 수 있다. 테스트된 강화 공정 설정은 각각 음이온 교환기와 양이온 교환기 각각을 포함하는 두 컬럼 세트를 기반으로 한다. 이 세트는 교대로 로딩되어 생물 약제 용액을 지속적으로 공급할 수 있다. 생물 약제 용액은 한 세트의 음이온 및 양이온 교환 컬럼에서 탈염되지만, 다른 한 세트의 컬럼은 세척, 재생 및 재평형화되어 생물 약제 용액의 연속 공급을 가능하게 한다. 시차 주기의 개념은 도 1에 개략적으로 설명되어 있다. 한 세트의 컬럼을 단백질 용액으로 연속적으로 로딩하는 동안, 다른 세트는 개별적으로 재생된다.
이 개념은 과량의 양이온을 함유하는 단백질 용액에 대해 다음과 같이 실현되었다. 리폴딩 용액의 연속 로딩을 가능하게 하기 위해, 공급물의 속도는 재생의 전체 지속 기간을 커버하도록 조정되었다. 제한 단계는 양이온 교환기의 재생이었다. 대부분의 양이온이 리폴딩 용액에 존재하기 때문에 음이온 교환기에 비해 큰 컬럼 부피가 필요했다.
도 2 및 도 3에서 시간 경과에 따른 공정의 순차적 배열이 표시된다. 한 컬럼 세트 (1)를 로딩하는 동안, 다른 세트를 먼저 세정하여 컬럼 (2)으로부터 잔류 단백질을 씻어내고, 동시에 음이온 교환기를 NaOH (3)로, 양이온 교환기를 HCl (4)로 재생시켰다. 재생 후, 두 컬럼을 5CV 물 (5/6)로 세척하였다. 이후에, 그 순서는 다른 세트에서 반대로 반복되었다.
도 4는 회분식 방식으로 직렬 연결된 2개의 컬럼에 단백질 용액을 로딩할 때의 크로마토그램을 보여준다. 단백질이 280 nm에서 UV 신호의 증가에 의해 인식되는 즉시, 탈염된 용액의 수집이 시작되었다. pH 값의 급격한 증가는 컬럼 포화 및 탈이온화 주기의 종료를 나타낸다.
연속 모드에서, 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 연속 공급 스트림으로 탈이온화 생물 약제 용액을 얻을 수 있으며, 이는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 리폴딩 용액을 공급하는 연속 탈이온화 운전의 크로마토그램이다. 연속 탈염은 연속 작업으로 미세기공 이온교환 컬럼으로 공정을 운전하여 수행되었다. 컬럼을 연속적으로 로딩하였으나, 탈염된 용액은 연속적으로 수집되지 않았다. 도 5의 회색 막대는 탈염된 용액이 수집된 기간을 나타낸다. 단백질 프론트(front)가 미세기공 비드가 채워진 컬럼을 떠날 때 급격한 저하로 탈이온화하는 동안 전체 운전을 통한 전도도는 2mS/cm 이하 및 pH는 약 4로 유지될 수 있다. 이 과정은 리폴딩 용액에 존재하는 두 가지 유형의 이온을 제거하기 위해 미세기공 음이온 및 양이온 교환기를 사용한다. AEX 및 CEX 수지의 재생은 각각 HCl 및 NaOH로 달성되었다. 양이온 교환기의 재생이 제한 공정 단계이기 때문에 공급 흐름을 연속적으로 흐르게 하고 모든 다른 공정 단계를 커버하기 위해 공급 유속을 줄이는 것이 필요했다. 상기 실시예 5와 마찬가지로, 실시예 7 및 9에서는, 시차 주기 연속 탈염 또한 GFP 및 모노클로날 항체 각각에서 수행하였고, 그 결과는 각각 도 17 및 18에 나타내었다. 구체적으로, 실시예 7에서 단백질 프론트(front)가 미세기공 비드가 채워진 컬럼을 떠날 때 급격한 강하로 탈이온화하는 동안 전체 운전을 통한 전도도는 2mS/cm 이하 및 pH 값이 약 4로 유지될 수있다. 실시예 9에서, 단백질 프론트(front)가 미세기공 비드가 채워진 컬럼을 떠날 때 급격한 강하로 탈이온화하는 동안 전체 운전을 통한 전도도는 1 mS/cm 이하 및 pH는 약 4로 유지될 수 있다.
연속 작동 중 주기 시간 tcycle은 가장 긴 공정 단계에 의해 정의된다. 컬럼의 로딩 tload은 tcycle = tload = twash + tregen + tre - equilibration으로 표현되는 다른 공정 단계와 동시에 완료되어야 한다. 여기서 twash는 세척 시간이고, tregen는 재생 시간이고, tre -equiiibration는 pH 값이 안정될 때까지 물로 컬럼을 다시 헹구기 위해 필요한 시간이다. 우리의 경우, 제한 단계는 리폴딩 용액 중의 양이온의 고농도에 기인한 양이온 교환기 컬럼의 재생이었다. 한 세트의 로딩 및 재생을 커버하는 한 사이클은 실시예 5에서 약 40분이 걸렸지만, 실시예 7 및 9에서는 약 30분이었다. 따라서, 본 발명의 공정에서, 상기 재생은 20-50분, 바람직하게는 25-45분, 가장 바람직하게는 35분 이내에 달성될 수 있다.
비교 : 연속
모드
vs
. 회분
모드
연속으로 컬럼을 운전하면 회분 모드에 비해 주기 시간이 단축된다. 회분 모드에서 로딩 및 재생 단계는 연속적으로 수행되어야 하며 연속 작동에서는 병렬로 수행될 수 있다. 전체 공정은 실시예 5에 따라 약 40분, 실시예 7 및 9에서 약 30분의 사이클(주기) 시간을 허용하는 양이온 교환기의 재생 시간으로 제한된다. 이와 대조적으로 회분 모드에서 로딩, 세척, 재생 및 재평형을 포함하는 시퀀스는 66분 후에 완료된다. 따라서, 시차 주기는 공정 시간을 적어도 38.5% 이상, 그리고 50% 이상까지 향상시킨다. 이는 도 6에서도 설명된다.
단축된 공정 시간으로 생산성이 향상되었다. 회분식 작동 대신 연속 작동을 사용하면 생산성을 21.8 ml/h에서 35.6 ml/h로 높일 수 있다. 이는 163%의 생산성 증가를 나타낸다.
도 6에서, 회분 모드와 연속 모드를 비교하여, 1회 운전은 연속 모드에서 약 30-40 분이 걸리고 회분 모드에서는 60분 이상 걸리는 것을 볼 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 공정은 연속 모드로 수행된다. 연속 탈염 공정은 회분 작동에 비해 주기 시간을 감소시킨다. 회분식 모드에서 로딩 및 재생 단계는 연속적으로 수행되어야 하며, 연속 작동에서는 병렬로 수행될 수 있다. 전체 공정 시간은 실시예 5에서 40.5분, 실시예 9에서 32분, 실시예 7에서 28분의 주기 시간을 허용하는 양이온 교환기의 재생 시간에 의해 제한된다. 이와 대조적으로, 회분 모드에서 50 cm/h 로딩 시 로딩, 세척, 재생 및 재평형을 포함하는 시퀀스가 66분 후에 완료되었다. 따라서, 시차 주시 작동은 처리 시간을 38.5% 이상 향상시켰다. 공정 시간 단축으로 생산성이 향상되었다. 회분식 작동 대신 연속 작동을 채택하여 생산성이 21.8 ml/h에서 35.6 ml/h로 증가하여 생산성이 163%로 향상되었다. 탈염 공정의 생산성을 더욱 향상시키기 위해 제 3 컬럼 세트를 구현할 수 있다. 이 시나리오에서는 제 2 컬럼 및 이어서 제 3 컬럼 세트가 제 1 컬럼을 재생하는 동안 로딩된다. 따라서 양이온 교환기의 재생은 더 이상 제한적인 단계가 아니며 로딩 속도는 최대로 증가될 수 있다 (도 14, 구성 7 참조). 추가 컬럼이 있어도 공정은 여전히 간단하고 쉽게 설계하고 확장할 수 있다.
HPLC 분석에 따르면 탈염 공정 동안 단백질의 손실은 최소화되지만, 추가로 약 75%의 불순물이 초기 리폴딩 용액에 비해 제거되었고, 그래서 탈염은 단백질 용액에 추가적인 이점을 제공한다. 도 9에서, 초기 리폴딩 용액은 탈염된 단백질 용액과 비교된다. 불순물의 농도는 단백질 L 모노리스의 용출 피크에 의한 플로우 스루( flow through) 및 단백질 농도(scFv)에 의해 측정되었다. 초기 리폴딩 용액의 불순물은 탈염 공정 동안 상당히 고갈되었다. 싱글 값은 표 1-3에서도 볼 수 있다.
본 발명의 추가 양태에서, 거대기공 이온 교환 수지를 사용하여 단백질을 포집하기 전에 탈염되고 미처리된 용액을 혼합하는 것이 가능하다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 미처리된 리폴딩 용액의 10%가 탈염된 단백질 용액과 블렌딩될 때 단백질 용액의 pH 값은 거의 10까지 점프하고, 미처리된 리폴딩 용액의 블렌딩으로 전도도가 꾸준히 상승한다. 이는 본 발명의 공정의 매우 효과적인 특성을 보여준다. 탈이온화 단계를 어느 정도 우회하여, 버퍼 용량 및 전도도는 필요에 따라 제어되어 일정한 아웃렛 흐름을 유도할 수 있다.
상이한 구성의 음이온 및 양이온 교환기가 도 14 및 도 15에 도시되어 있으며, 아래에서 더 자세히 논의될 것이다. 이러한 상이한 구성은 생물 약제 용액을 탈염시키는 본 발명의 방법의 유용성을 예시한다.
생물 약제 용액
본 발명의 공정에 사용하기 위한 생물 약제 용액은 추가 공정을 위해 감소될 필요가 있는 상승된 염 농도를 갖는 생물 약제 용액으로 정의된다. 하나의 구현예에서, 상기 생물 약제 용액은 플라스미드 DNA 용액이다. 바람직한 구현예에서, 상기 생물 약제 용액은 단백질 용액이다. 하나의 양태에서, 상기 단백질 용액은 리폴딩 용액 (실시예 1)이다. 또 다른 양태에서, 상기 단백질 용액은 단백질이 높은 염 농도에서 결합되는 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC)에 기인한다. 용출은 염 농도를 낮춤으로써 이루어지지만 단백질은 일반적으로 구배 전면에서 용출되어 높은 염 농도에서 여전히 존재하며 전도도를 낮추지 않고 IEX에 로딩할 수 없다 (실시예 5). 본 발명의 공정은 또한 이온교환 크로마토그래피(IEX, 실시예 6, 7 참조) 후에 단백질을 탈염시키는데 사용될 수 있다. 추가 실시예에서, 결정화 및 단백질 염석화 방법에 있어서, 고농도의 코스모트로픽(kosmotropic) 염을 갖는 용액이 첨가된다. 단백질의 재용해 후 용액은 여전히 높은 전도성을 갖는다 (실시예 8, 9 참조). 따라서 탈염 공정은 리폴딩 용액에만 적용할 수 있는 것이 아니며, 증가된 염 농도가 추가 공정을 위해 감소될 필요가 있는 단백질 용액에 사용될 수 있다. "증가된 염 농도"라는 용어는 후속 생물 공정에 의도된 양과 비교하여 공급 용액에 존재하는 염의 양을 의미한다. 예를 들어, 단백질 리폴딩 용액은 100 mM 내지 1000 mM의 다양한 염을 포함하고, 단백질은 200 내지 750 mM의 NaCl 농도에서 이온교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출되고, 황산 암모늄으로 염석된 단백질 침전물은 200 mM의 염 함량을 갖는 재용해 용액에 존재할 수 있다. 용어 "미처리된 단백질 용액"은 탈염 처리되지 않은 공급 용액을 말한다.
다음은 탈염될 단백질의 예이다: 리폴딩 용액, 소수성 상호 작용 크로마토그래피로부터의 용액, 이온 교환 크로마토그래피에서 생성된 단백질, 단백질의 염석에서 생성된 용액, 수성 2-상 추출물에서 생성된 용액, 및 scFv, 항체, 나노바디, 2가 항체, 3가 항체, 카멜리드 항체, 항체 컨쥬게이트, 사이토카인 및 펩타이드 호르몬을 포함하는 생물 약제 조성물.
미세기공 수지
"미세기공 수지(micropore resin)"는 lUPAC에 따라 2 nm 미만의 작은 기공 크기를 갖는 이온교환 수지로 정의된다 (Characterization of porous solids, E.d. S. Sing and K. Unger). 이는 작은 분자만이 기공에 들어갈 수 있다는 것을 의미하는 반면, 단백질과 같은 더 큰 분자는 제외된다. 미세기공 이온교환 수지는 시판되며 일반적으로 물을 탈염하는데 사용된다 (Thorborg, C, H. (1971 ) Desalting and Purifying Water by Continuous Ion Exchange, U.S. Patent No 3,607,739).
비드의 표면 상에 단백질의 낮은 흡착력을 갖는 미세기공 수지를 실시예 4에 기재된 바와 같은 19가지 상이한 수지를 스크리닝함으로써 선택하였다. 평형 결합능은 단백질 결합 특성이 가장 낮은 수지를 찾기 위해 측정되었다. 이 실험의 결과는 도 10-13에서 볼 수 있다. 구체적으로는, 결합 거동은 pH 전이에 따라 변하기 때문에, 실험은 높은 pH 값 (원래 리폴딩 용액에서와 같이 10.5)과 pH 2.5 (탈이온화 후 대략 pH 값)에서 수행되었다. 도 10 및 도 11은 상이한 미세기공 양이온 교환기의 스크리닝 결과를 도시한다.
그래프는 pH 10.5와 pH 2.5 두 경우 모두에서 대부분의 단백질이 Dowex 50WX2와 결합하여 가장 우월한 작용을 한다는 것을 보여준다. 또한 Lanxess의 수지 (Lewatit S2568)는 단백질 흡착성이 매우 높다. 이와 대조적으로, Mitsubishi의 디아이온 세파비즈(Diaion Sepabeads) SK1 10은 두 경우 모두에서 가장 적은 단백질을 흡착하여 시험된 수지 중에서 가장 잘 수행되었다.
도 12 및 도 13에서 알 수 있는 바와 같이, 음이온 제거 (AEX)에 대해 몇몇 양으로 대전된 미세기공 수지의 그룹이 유사하게 수행되었지만, 강염기 음이온 교환 수지인 마라톤 A2 미세기공 수지(Dow Chemical Company, 독일)를 음이온 제거에 사용하여 아래에 설명된 실험을 수행하기로 결정하였다. 이 겔 타입 물질은 이온 교환 용량이 1.2 eq/l인 기능기로서 디메틸에탄올 아민을 갖는 스티렌-디비닐벤젠을 기재로 하였다. 평균 비드 크기는 500-600 μm, 기공 크기는 1.0-1.5 nm, 부피 밀도는 690 g/l이며, quoted water 유지율은 45-54%이다. 이 수지는 염화물 형태로 전달되었다. 4% (v/v) 수산화 나트륨 용액으로 헹구어 수소 형태를 얻었다. 그러나, Lewatit S6368 (Lanxess)과 Dowex 1X2-400을 제외한, 실시예 4에서 시험되고 도 3 및 4에 나열된 다른 수지도 동일하게 적합할 것이다.
음으로 대전된 미세기공 수지로서, Mitsubishi의 디아이온 세파비즈 SK1 10은 두 경우 모두 최소 단백질을 흡착하여 이온 교환 용량이 > 2 eq/l (CEX)인 양이온 제거를 위해 시험된 수지 중에서 가장 잘 수행되었다. 이 강산성 이온교환 물질은 또한 매트릭스이지만 술폰산기를 활성 그룹으로 스티렌-디비닐벤젠을 갖는 겔형 수지였다. 평균 비드 크기는 약 1.0 nm의 기공 크기를 갖는 400 μm, 벌크 밀도는 845 g/l이며 quoted water 유지율은 35-45 %였다. 이 수지는 나트륨 형태로 전달되었다. 5% (v/v) 염산으로 세척하여 수소 형태를 얻었다.
원칙적으로, 상기 정의된 미세기공 수지는 높은 단백질 흡착 특성을 갖지 않는다고 가정할 때 본 발명에서 사용될 수 있다.
거대기공(Macropore) 수지
"거대기공 수지(Macropore resin)"는 lUPAC에 따라 50 nm 이상의 크기를 갖는 이온 교환 수지로 정의되며(Characterization of porous solids, E.d. S. Sing and K. Unger), 단백질이 비드 내부로 확산되도록 한다. 이는 단백질이 수지에 포집된다는 의미이다. 탈염 후 단백질 포집을 위해 거대기공 수지 (IEX)를 사용할 수 있다.
하기 기술된 실험에서 모델 단백질을 포집하기 위해, 상이한 IEX 수지가 시험되었다. scFv의 비-처리되고 탈염된 리폴딩 용액으로 로딩된 다양한 거대기공 이온교환기의 평형 결합 용량의 비교를 실험예 2에 나타내었다. 회분 실험에서 다양하고 상이한 거대기공 이온교환기의 평형 결합 능력을 측정하였다. 수지를 리폴딩 샘플과 함께 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 엔드-오버 로테이터 (end-over-end rotator) (5 rpm) 상에서 일정한 운동을 하였다. 단백질 흡착량(q)은 다음 식에 따른 이동상 부피 Vmobiie phase과 고정상 부피 Vresin 사이의 관계를 고려하여 초기 및 최종 단백질 농도 c를 질량 평형화하여 계산하였다.
이 테스트의 결과는 도 4에 보여주었다.
탈이온화가
포집에
미치는 영향
도 7a에서, scFv의 비-처리되고 탈이온화된 리폴딩 용액이 로딩된 상이한 거대기공 이온교환기의 평형 결합 용량의 비교를 나타내었다. 리폴딩 용액이 수지에 직접 로딩될 때 약 5 mg/ml의 q 값이 얻어짐을 보여준다 (줄무늬 막대). 반대로 염 농도가 감소하면 25-35 mg/ml까지 증가시킬 수 있다(채워진 막대). 리폴딩은 단백질의 등전점 보다 높은 10.5의 pH 값에서 일어난다. 따라서 이러한 조건에서 단백질은 음전하를 띠며 음이온 교환 수지 (줄무늬 막대)에서만 결합할 수 있다. 탈염 공정 중 pH 전이로 인해 단백질은 등전점 이하의 산성 용액에 존재한다. 따라서, 거대기공 수지의 단백질 결합 용량을 탈이온화 후의 양이온 교환기 (채워진 막대) 상에서 시험하였다. 거대기공 수지의 경우 시료의 최적 전도도는 4mS/cm 미만이다.
장치 및 대체 구성
본 발명은 또한 미세기공 양이온 교환 수지에 연속적으로 연결된 미세기공 음이온 교환 수지를 포함하는 단백질 용액을 탈염하는 장치에 관한 것이다. 기본 설정은 도 14C에 나타내었다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 공정에 따른 탈염은 양이온 및 음이온을 음이온 (AEX) 및 양이온 교환 (CEX) 비드 상에 결합시킴으로써 달성된다. 일부 생물 약제의 경우 반대 방향, CEX에 이어 AEX가 바람직할 수 있다. 비드 또는 베드는 아래에 설명된 바와 같이 상이한 구성으로 배열될 수 있다.
아래 실험예 1-9에서 미세기공 수지를 컬럼에 충전되었으나 멤브레인이나 모노리스도 똑같이 적용하였다. 컬럼의 크기는 제거해야 하는 각각의 단백질 용액 내의 음이온 및 양이온의 농도에 따라 설계되어야 한다. 다음 실험예 1-9에서는 고해상도 (HR) 컬럼이 사용되었다 (1.6 cm i.d., GE Healthcare, Sweden). HR 컬럼은 고성능 미디어를 갖는 대규모 어플리케이션용이다. 그러나, 미세기공 음이온 또는 양이온 교환기의 패킹을 허용하는 임의의 용기, 예컨대 컬럼 또는 멤브레인 또는 모노리스를 함유하는 하우징이 적합할 수 있다.
실험실 규모의 탈염은 대개 1ml에서 100ml 사이의 스케일의 컬럼에서 수행된다. 그러나 공정의 확장은 가능하다. 파일럿 및 산업용 스케일 탈염은 100 ml에서 2000 리터까지 할 수 있다. 예를 들어, scFv 봉입체(IB)의 대규모 생산은 1000 리터 생물 반응기에서 수행된다. 30g/l의 세포 건조 중량 및 3g/l의 봉입체 농도가 달성될 수 있다. 그 결과 총 IB 양은 3kg이 된다. IB는 15리터의 재용해 버퍼에 현탁되고, 원심분리되고, 이어서 리폴딩 버퍼에서 1 : 20으로 추가 희석되어 300리터의 리폴딩 회분(batch)을 생성한다. 1.1리터 음이온 교환기와 3.6리터 양이온 교환기가 각각 있는 컬럼에서 탈염을 수행할 수 있다.
AEX
-
CEX의
스택
양이온 및 음이온을 제거하는 기능은 양이온 교환 베드가 음이온 교환 베드를 뒤잇는 순차적인 베드 형태로 또는 거꾸로 배열될 수 있다. 이 구성에서 재생은 훨씬 더 쉽게 가능하다. 스택은 다중 컬럼, 다중 멤브레인 또는 다중 모노리스의 시퀀스로 만들 수 있다. 다시, 양이온 교환기 또는 음이온 교환기를 함유하는 컬럼/멤브레인의 크기는 단백질 용액으로부터 제거되어야 하는 양이온 및 음이온의 양에 의해 결정된다.
가능한 연속 구성
탈염을 연속적으로 수행하기 위해 몇몇 컬럼 배열이 가능하다.
시차 주기 (도 1a, 15A)
하나의 컬럼 세트(AEX 및 CEX)가 직렬 연결로 로딩되는 동안 다른 세트는 개별적으로 재생된다 (실시예 1, 7 및 9에서 설명).
PCCC
(
Periodic
Counter
Current
Chromatography
) (도 15B)
컬럼 용량이 제1 컬럼 서트를 제 2 세트와 상호 연결하여 완전히 이용되는 접근법의 공정 강화는 브레이크쓰루(breakthrough)가 제 2 세트에 로딩되는 동안 완전히 포화된다.
SMB
(
Simulated
Moving
Bed
) (도 15 C)
완벽한 탈이온화를 위해서는 2개의 SMB 시스템이 필요하다. 하나의 시스템은 4개의 컬럼의 음이온 교환기 및 다른 하나의 양이온 교환기를 각각 포함한다. 제 1 시스템의 추출이 제 2 시스템에 로딩된다. 상이한 컬럼들 사이의 전환 시간은 버퍼 소비가 최소화되는 방식으로 변경될 수 있다.
VariCol
보다 유연한 연속 시스템은 SMB 원리를 기반으로 하는 VariCol 기술로 표현된다. 그러나 4 존(zone) SMB와 달리 이 공정에서 밸브는 비동기적으로 전환된다. 이는 한 번에 존 당 하나 또는 두 개의 컬럼만 있는 것은 아님을 의미한다.
라인이 상이한 시간에 이동하기 때문에 존 사이의 컬럼 분포는 특정 기간 동안 동일하게 유지되지 않는다. 존 길이를 시간에 따라 변경함으로써 무제한의 구성이 가능하다 (실시예 8 참조).
요약하면, 본 발명의 공정 및 장치는 추가의 바이오공정을 위해 단백질 용액을 탈염하는 효율적이고 저렴한 방법을 제공한다.
본 출원의 가능성을 조사하기 위해, 하기 실시예 1-4에 대장균에서 IB로 표시되는 항체(scFv)의 단쇄 가변 단편의 리폴딩 용액을 사용하였다. 먼저, 리폴딩된 단백질이 탈염 없이 거대기공 이온교환기에 결합하는 능력을 시험하였고, 단백질 용액을 본 발명에 따른 미세기공 이온교환기에 의해 탈염시킨 다음, 이 용액을 사용하여 거대기공 이온 교환기 상에서 탈염된 단백질 용액의 결합능을 측정하였다. 도 7a는 탈염 후 거대기공 이온 교환기에 훨씬 더 많은 단백질이 결합할 수 있음을 보여준다. 실시예 5에서, 본 발명의 공정을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC)에서의 단백질 용액에 적용하였다. 실시예 6 및 7에서는, 이온교환 크로마토그래피 (IEX) 후 녹색 형광 단백질 (GFP)을 탈염시켰으며, 실시예 8 및 9에서 단백질은 염석 후 탈염되었다.
실시예
실시예
1
대장균에서 봉입체로 생산된 재조합 단백질은 - 모델 단백질로서 scFv로 기술된 바와 같이 - 재용해되어 원래 구조를 얻기 위해 리폴딩되어야 한다. 이 두 공정 단계 후에 높은 염 농도로 존재된다.
단쇄
항체 (
scFv
)의
리폴딩
scFv는 봉입체 (IB)의 형태로 대장균에서 과발현되었다. scFv의 IB를 6M 구아니딘 하이드로 클로라이드 (GuHCI), 100mM 트리스-염기, 5mM EDTA, 20mM DTT (pH 8.5)를 함유하는 재용해 버퍼에 용해시켰다. Ultra Turrax(Polytron PT1200C from Kinematic AG, 1 19 Switzerland)를 사용하여 20% (w/v) IB 현탁액을 제조하였다. 약간의 쉐이킹 하에 45분간 인큐베이션한 후, 용액을 버킷 원심분리기(Model 5415R from Eppendorf, Germany)로 4 ℃에서 20분간 12000 g 원심분리하였다. 상등액을 0.22 μ 시린지 필터를 통해 추가로 여과하였다.
scFv의 리폴딩은 리폴딩 버퍼 (3M 우레아, 0.5M 트리스, 50mM 글리신, 2mM 시스틴, pH 10.5)에서 재용해된 IB를 20배 희석하여 수행하였다. 최대 아웃풋을 보장하기 위해, 용액을 4시간 동안 48시간 동안 인큐베이션하였다.
미세기공 이온교환기를 이용한
탈이온화
공정
이 과정은 리폴딩 용액에 존재하는 두 가지 유형의 이온을 제거하기 위해 미세기공 음이온 및 양이온 교환기를 사용한다. 두 개의 컬럼은 직렬로 운전되도록 연결되며, 이때 음이온 교환기가 먼저 배치된다. 이 설정은 도 1a와 1b에 나와 있다. 리폴딩 탱크로부터의 단백질 용액을 한 세트의 미세기공 이온교환(IEX) 컬럼 상에 로딩하고, 나머지 두 컬럼은 개별적으로 세척, 재생 및 재평형되었다. 탈염된 단백질 용액은 거대기공 IEX 컬럼에 직접 포집될 수 있으며, 심지어는 처리되지 않은 리폴딩 용액으로 어느 정도 혼합될 수도 있다.
연속 작동은 4개의 옥타브 펌프가 장착된 셈바 옥타브 10 크로마토그래피 시스템 (Semba Biosciences, USA)에서 수행되었다. 강한 미세기공 음이온 교환 수지 (Dow Chemical, Germany)인 마라톤 A2와 강력한 미세기공 양이온 교환 수지인 디아이온 세파비즈 SK110 (Mitsubishi Chemical, Inc.)이 각각 4개의 HR 컬럼 (1.6 cm diameter from GE Healthcare, Sweden)에 충전되어 사용되었다. 온라인 모니터링을 가능하게 하는 아웃렛 스트림 E는 Akta Avant 시스템(GE Healthcare, Sweden)의 pH 및 전도도 프로브뿐만 아니라 UV 검출기에도 연결되었다.
컬럼 부피(CV)은 동적 결합 용량 및 리폴딩 용액 내의 각각의 이온 농도에 따라 조정되었다.
CVMarathonA2 = 3.7 ml (DBC10% = 0.79 eq/l)
CVsepabeadsSK110 = 12 ml (DBC10% = 1.26 eq/l)
수지의 재생은 5 CV 이상의 5% HCl과 4% NaOH 각각, 및 5 CV 이상의 물로 연속 세척 단계를 통해 달성되었다.
다음 설정이 선택되었다:
인렛(inlets) : A NaOH 아웃렛(outlets) : E 탈이온화된 리폴딩 용액
B HCl F 폐기물
C 공급물(Feed) G 폐기물
D H20 H 폐기물
컬럼 C1 세트 1 음이온 교환기
C2 세트 1 양이온 교환기
C3 세트 2 음이온 교환기
C4 세트 2 양이온 교환기
재생 및 모든 세척 단계는 100 cm/h의 속도로 수행되는 반면, 공급물은 조정되어야 했다. 양이온 교환기의 재생이 제한 공정 단계이기 때문에, 공급물 흐름을 연속적으로 운전하고 모든 다른 공정 단계를 커버하기 위해 공급물의 유속을 18 cm/h로 줄이는 것이 필요했다.
연속 작동 중 주기 시간 t cycle 는 가장 긴 공정 단계에 의해 정의된다.
컬럼을 로딩하는 t load 은 t cycle = t load = t wash + t regen + t re - equilibration 로 표현된 다른 프로세스 단계와 동시에 완료되어야 하며, 여기서 t wash 는 세척 시간이고, t regen 은 재생을 위한 시간이며, t re - equilibration 은 pH 값이 안정될 때까지 물로 컬럼을 다시 헹구기 위해 필요한 시간이다. 본 발명의 경우, 제한 단계는 리폴딩 용액 중의 양이온의 고농도에 기인된 양이온 교환기 컬럼의 재생이었다. 한 세트의 로딩과 재생을 커버하는 1 주기가 40.54분 걸렸다.
연속 탈이온화 공정은 다음 단계 및 부피를 포함한다 :
공정 단계 부피 기간
Vo*까지 공급 7.0 ml 10.14 분
브레이크쓰루(breakthrough)*까지 공급 17.0 ml 30 . 41 분
(탈이온화) 40.54 분
세척 (탈이온화) 7.0 ml 1.79 분
세척 중단 8.7 ml 2.89 분
재생 NaOH 수용액 18.5 ml 5.52 분
세척 AEX 18.5 ml 5.52 분
재생 HCl 60.0 ml 17.91 분
세척 CEX 60.0 ml 17 . 91 분
40.50 분
* 브레이크쓰루(breakthrough) 실험 데이터
도 2에 시간 경과에 따른 전체 공정의 순차적 배열이 표시되어 있다: 한 컬럼 세트를 로딩하는 동안 (1), 다른 세트를 상기 컬럼에서 잔류 단백질을 세척하기 위해 직렬의 형태로 씻어 내고 (2), 이어서 음이온 교환기를 NaOH (3) 및 양이온 교환기를 HCl (4)로 재생시켰다. 재생 후, 두 컬럼을 5CV 물로 세척하였다 (5/6). 완료되면 순서가 다른 세트에서 반대로 반복된다. 더 나은 이해를 위해, 상이한 단계가 도 3에 도시된 도 2에 추가되었다. 도 4는 탈이온화 실험의 결과의 대표적인 크로마토그램을 도시한다.
연속 탈이온화 공정의 크로마토그램은 도 5에 설명되어 있다. 컬럼은 운전 시작 시 완전히 평형 상태가 아니므로 공정 정상 상태가 될 때까지 한 사이클이 걸렸다. 상기한 바와 같이, 컬럼은 중단없이 로딩되었지만, 탈이온화된 용액은 연속적으로 수집되지 않았다. 그래프의 회색 막대는 탈이온화 용액이 수집된 기간을 나타낸다. 탈이온화 동안 전체 운전을 통한 전도도는 2mS/cm 이하로, pH 값은 약 4로 유지될 수 있었다. UV 신호의 인공물은 밸브 전환 때문일 가능성이 크다.
풀(pool)의 오프라인 분석 결과 약 0.4 mS/cm의 성공적인 탈이온화가 확인되었다 (아래 표 1 참조). 또한, HPLC 분석에 따르면, 공정 중에 단백질이 손실되지 않았지만, 초기 리폴딩 샘플에 비해 약 75%의 불순물이 제거되었다.
비교 : 연속
모드
vs
. 회분
모드
연속으로 컬럼을 실행하면 회분 모드에 비해 사이클 시간이 단축된다. 회분 모드에서 로딩 및 재생 단계는 연속하여 수행되어야 하며 연속 작동에서는 병렬로 실행될 수 있다. 전체 공정은 40.5분의 주기 시간을 허용하도록 양이온 교환기의 재생 시간을 제한한다. 회분 모드에서 50cm/h 로딩 시 로딩, 세척, 재생 및 재평형을 포함한 시퀀스는 66분 후에 완료된다. 따라서 시차 주기는 공정 시간을 38.5%까지 향상시킨다. 이것은 도 6에서도 설명된다.
공정 시간이 단축됨으로써 생산성이 향상되었다. 회분 모드 대신 연속 모드를 사용하면 생산성을 21.8 ml/h에서 35.6 ml/h로 높일 수 있다. 이는 163%의 생산성 증가를 나타낸다.
실시예
2
거대기공 이온교환 수지 시험
회분 실험에서 다양하고 상이한 거대기공 이온교환기의 평형 결합능을 측정하였다. 이러한 스크리닝 실험은 진공 매니 폴드와 연결하여 Deep Well 필터 플레이트 (Screening Devices, Netherlands)에서 수행되었다. 한정된 침전 층 농도를 갖는 수지 슬러리를 웰로 이송하였다. 수지를 리폴딩 샘플과 함께 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 엔드-오버-로테이터(end-over-end rotator) (5 rpm) 상에서 일정한 운동을 하였다. 단백질 흡착 량 (q)은 다음 식에 따른 이동상 부피 Vmobile phase과 고정상 부피 Vresin 사이의 관계를 고려하여 초기 및 최종 단백질 농도 c를 질량 평형화하여 계산하였다.
이 시험의 결과는 도 4에 나타내었다.
탈이온화가
포집에
미치는 영향
도 7a는 scFv의 비-처리되고 탈이온화된 리폴딩 용액이 로딩된 상이한 거대기공 이온교환기의 평형 결합 용량의 비교를 나타낸다. 리폴딩 용액이 수지에 직접 로딩될 때 약 5 mg/ml의 q 값이 얻어지며 (줄무늬 막대), 염 농도가 감소하면 25-35 mg/ml까지 증가할 수 있음을 보여준다 (채워진 막대). 리폴딩은 단백질의 등전점 보다 높은 10.5의 pH 값에서 일어난다. 따라서 이러한 조건에서 단백질은 음전하를 띠며 음이온교환 수지 (줄무늬 막대)에서만 결합할 수 있다. 탈염 공정 중 pH 전이로 인해 단백질은 등전점 이하의 산성 용액에 존재한다. 따라서, 거대기공 수지의 단백질 결합 용량을 탈이온화 후의 양이온 교환기 (채워진 막대) 상에서 시험하였다.
실시예
3
샘플 분석
실시예 1의 scFv 모델 단백질의 정량화는 CIM r-단백질 L 모놀리스 디스크 (BIA Separations, Slovenia)를 사용하여 애질런트 (Agilent) 1100 시스템 (Agilent, Germany) 상에서 HPLC 측정에 의해 수행되었다. 30 mM 소듐 포스페이트, 러닝 버퍼로 pH 6에서 1 M NaCl 및 용출액으로서 러닝 버퍼에 용해된 4.5 M GuHCI (Ultrol Grade, Merck, Germany)를 사용하는 방법에 대해 결합-용출(Bind-Elute 원리를 적용하였다. 1분 내지 3분 사이의 용출 단계 (100% B)를 수행하여 1ml/분의 유속에서 7분의 총 분석 시간을 가능하게 하였다. 주입 부피를 100 ㎕로 설정하고 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 샘플을 분석 전에 0.22 μm 시린지 필터로 여과하였다. pH 값 및 전도도의 오프라인 측정은 세븐 멀티 벤치탑 미터(Seven Multi benchtop meter, Mettler-Toledo, Switzerland)로 수행되었다.
이 방법으로 scFv 농도를 측정하고 불순물의 상대 함량을 평가하였다. 모노리스의 단백질 L 리간드는 항체의 카파-경쇄에 매우 특이적으로 결합하는 반면 다른 단백질은 결합하지 않으므로 크로마토그램의 플로우스루(flow through)에서 발견될 수 있다. 이 방법은 scFv 표준 곡선을 사용하여 보정되었다. 표준 물질은 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG에서 친절하게 제공하였다. 순도는 각각의 피크 면적을 전체 면적으로 나누어 계산하였다.
실시예
4
미세기공 이온교환기의 스크리닝
탈염 단계 동안 생성물의 손실을 최소화하기 위해 다양하고 상이한 미세 기공 수지를 스크리닝하였다. 평형 결합능이 가장 낮은 단백질 결합 성질을 갖는 수지를 찾기 위해 측정되었으며, q 값은 수지 건조 물질 1mg당 흡착 단백질 mg에 기초한다.
pH 변화에 따라 결합 거동이 변하기 때문에 실험은 높은 pH 값 (원래 리폴딩 용액에서와 같이 10.5)과 pH 2.5(탈이온화 후 대략 pH 값)에서 수행되었다. 도 10 및 도 11은 상이한 미세기공 양이온 교환기의 스크리닝 결과를 도시한다.
그래프는 pH 10.5와 pH 2.5 두 경우 모두가 대부분의 단백질이 Dowex 50WX2와 결합하여 가장 우월한 작용을 한다는 것을 보여준다. 또한 Lanxess의 수지 (Lewatit S2568)는 단백질 흡착성이 매우 높다. 이와 대조적으로, Mitsubishi의 디아이온 세파비즈 SK1 10은 두 경우 모두에서 가장 적은 단백질을 흡착하여 시험된 수지 중에서 가장 잘 수행되었다.
다양하고 상이한 미세기공 음이온 교환 수지를 사용하여 스크리닝을 위한 동일한 실험 장치를 수행하였다. 상기 발견은 각각 도 12 및 도 13에 도시된다. 두 pH 값 모두에서 Lanxess의 음이온 교환기(Lewatit S6368)는 고단백질 흡착과 바람직하지 않은 거동을 나타내는 Dowex 1X2-400을 다시 나타냈다. 몇 가지 수지 그룹이 두 pH 값에서 비슷하게 잘 수행되었지만 마라톤 A2를 사용하기로 결정하였다.
실시예
5
소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 후 단백질의 탈염 프로토콜 1
용해성 감마-인터페론은 HIC 컬럼으로 포집되었다. 용출은 염을 낮춤으로써 이루어지지만, 단백질은 구배의 전면에서 용출되어 있어 여전히 높은 염 농도로 존재한다. 재조합 인간 감마-인터페론 (INF-γ)은 1리터 생물 반응기 내 대장균 BL21에서 발현되었다. 세포를 고압 균질기에 의해 파쇄하였다. 균질물을 벤치탑 원심분리기에서 원심분리하여 투명화시켰다. 황산암모늄 (1M)을 투명화된 상층액에 첨가하였다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 다시 제거하고, 투명화된 용액을 HIC 컬럼에 로딩하였다. 실험실 컬럼 (2.6 cm I.D. x 100 mm)에 Toyopearl Phenyl 600 M (Tosoh Bioscience)을 채웠다. 컬럼을 25 mM Tris pH 7.5 중의 1M 황산암모늄 버퍼 (버퍼 A) 로 평형시켰다. 그런 다음 컨디셔닝된 상등액을 컬럼에 로딩하고 로딩 후 2 컬럼 부피 버퍼 A로 세척하였다. 세척 후 단백질을 버퍼 A 및 버퍼 B (25mM Tris pH 7.5)로 제조된 10 컬럼 부피의 선형 구배로 용출시켰다. 용출은 280 nm에서 온라인 UV-모니터에 의해 기록되었다. 용출된 피크를 모아서 PCCC 설정에서 양이온 교환기인 도웩스 마라톤 C와 음이온 교환기인 디아이온 세파비즈 PA312로 채워진 혼합층 이온교환기로 추가 탈염시켰다 (도 1 참조). 이 구성에서는 각각 음이온과 양이온으로 구성된 2세트의 컬럼이 사용된다.
실시예
6
소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 후 단백질의 탈염 프로토콜 2
용해성 감마-인터페론은 HIC 컬럼으로 포집되었다. 용출은 염을 낮춤으로써 이루어지지만, 단백질은 구배의 전면에서 용출되어 있어 여전히 높은 염 농도로 존재한다. 재조합 인간 감마-인터페론 (INF-γ)은 1리터 생물 반응기 내 대장균 BL21에서 발현되었다. 세포를 고압 균질기에 의해 파쇄하였다. 균질물을 벤치탑 원심분리기에서 원심분리하여 투명화시켰다. 황산암모늄 (1M)을 투명화된 상등액에 첨가 하였다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 다시 제거하고, 투명화된 용액을 HIC 컬럼에 로딩하였다. 실험실 컬럼 (2.6 cm I.D. x 100 mm)에 Toyopearl Phenyl 600 M (Tosoh Bioscience)을 채웠다. 컬럼을 25 mM 트리스 pH 7.5 중의 1M 황산암모늄 버퍼 (버퍼 A) 로 평형시켰다. 그런 다음 컨디셔닝된 상등액을 컬럼에 로딩하고 로딩 후 2 컬럼 부피 버퍼 A로 세척하였다. 세척 후 단백질을 버퍼 A 및 버퍼 B (25mM 트리스 pH 7.5)로 제조된 10 컬럼 부피의 선형 구배로 용출시켰다. 용출은 280 nm에서 온라인 UV-모니터에 의해 기록되었다. 용출된 피크를 모아서 PCCC 설정에서 양이온 교환기인 도웩스 마라톤 C와 음이온 교환기인 디아이온 세파비즈 PA312로 채워진 혼합층 이온교환기로 추가 탈염시켰다 (도 1 참조). 이 구성에서는 각각 음이온과 양이온으로 구성된 2세트의 컬럼이 사용된다.
재조합 인간 섬유아세포 성장 인자 2 (hFGF-2)는 10L 생물 반응기 내 대장균 BL21 (DE3)에서 생산되었다. 생성물은 세포질에서 가용성 형태로 발현되었다. 고압 균질화에 의해 세포를 수거하고 파쇄하였다. 균질화된 25% 세포 현탁액(50 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.02% (v/v) Tween 20, pH 8.0)을 제조하고 GEA Panda Plus로 균질기(GEA, Germany)로 각각 70 및 700 바를 적용하는 2-단계 균질화로 분해시켰다. 균질액은 Heraeus Multifuge (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 45분 동안 4 ℃에서 18590g 원심분리하여 투명화시켰다. 투명화된 균질액을 사용할 때까지 -20 ℃에서 냉동 보관하였다.
사용하기 전에 투명한 균질액을 4 ℃에서 밤새 해동하고 18590g (4 ℃에서 45분)으로 다시 원심분리하고 0.22 μm의 필터 캡슐(Fluorodyne® EX EDF Membrane in Mini Kleenpak? Capsules with 230 cm², Pall, USA)을 통해 여과하였다. 균질액 중의 hFGF-2를 카르복시메틸세파로스 패스트 플로우 (GE Healthcare, Sweden) 컬럼으로 포집하였다. 이 목적을 위해 컬럼 직경이 10 mm이고 부피가 11.8 ml인 Tricorn 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하였다. 적용된 방법은 표 2에 나와 있다. 유속은 77 cm/h로 설정되었다.
| METHOD BLOCK | BUFFER | DURATION |
| 평형 | 100 mM 인산나트륨, pH 7.0 | 2 CV |
| 로딩 | 0.2 μm 여과된 hFGF-2 균질액 | 10 CV |
| 세척 | 100 mM 인산나트륨, pH 7.0 | 5 CV |
| 용출 | 0 - 1 M NaCl (0-100% B)의 구배 평형 버퍼 (B) 중 1M NaCl |
2 CV 1CV |
| 재-평형 | 100 m 인산나트륨, pH 7.0 | 1 CV |
용출 피크를 모으고 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 기반으로 한 다음 정제 단계에 사용하였다. Toyopearl Hexyl-650C 수지 및 7.9ml (컬럼 직경 10mm)의 컬럼 부피로 충전된 Tricorn 컬럼 (GE Healthcare)을 이 목적으로 사용하였다. 적용된 방법은 표 3에 나와 있다. 로딩이 38 cm/h의 유속에서 수행되는 동안 유속은 77 cm/h로 설정되었다.
로딩 물질의 pH를 6.0으로 감소시키고 1.65 M 시트르산 나트륨을 첨가하였다. 로딩 전에 상기 물질을 또한 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다.
| METHOD BLOCK | BUFFER | DURATION |
| 평형 | 10 mM 인산나트륨, 1.65M 시트르산 나트륨, pH 6.0 | 2 CV |
| 로딩 | 0.2 μm 여과된 FGF-2 포집 용출 1.65M 시트르산 나트륨, pH 6.0 |
1 CV |
| 세척 | 10 mM 인산나트륨, 1.65 M 시트르산 나트륨, pH 6.0 | 3 CV |
| 용출 | 1.65 M - 0 M 시트르산 나트륨 (0-100% B)의 구배 10 mM 인산나트륨, pH 6.0 용출 버퍼 (B) |
5 CV 3CV |
| 재-평형 | 10 mM 인산나트륨, 1.65M 시트르산 나트륨, pH 6.0 | 1 CV |
용출 피크를 모아서 탈염 실험에 사용하였다. 모든 샘플을 역상 HPLC로 분석하였다. 최종 물질의 pH는 6.5이고 전도도는 44.15 mS/cm이었다. 연속 탈염 작동은 4개의 옥타브 펌프가 장착된 셈바 옥타브 10 크로마토그래피 시스템 (Semba Biosciences)에서 수행되었다. 4개의 HR 컬럼 (GE Healthcare사의 직경 1.6 cm)은 강한 미세기공 음이온 교환 수지 (Mitsubishi Chemical, Japan)인 디아이온 PA312 (CI) 및 약한 미세기공 양이온 교환 수지 (Mitsubishi Chemical, 일본)인 디아이온 WK40L (H), 각각으로 충전되었다. 온라인 모니터링을 가능하게 하는 아웃렛 스트림은 Akta Avant 시스템 (GE Healthcare)의 pH 및 전도도 프로브뿐만 아니라 UV 검출기에도 연결되었다.
컬럼의 부피(CV)는 그들의 결합능과 hFGF-2 용액의 이온 농도에 따라 조정되었다.
CVDiaionPA312 = 8.04 ml (1.2 meq/ml)
CVDiaionWK40L = 4.02 ml (4.4 meq/ml)
탈염 공정은 시차 주기 모드로 작동되었다: 한 세트의 컬럼이 로딩되는 동안, 두 번째 세트는 재생되었고 그 반대도 마찬가지였다.
수지의 재생은 7 CV (NaOH) 및 8 CV (HCl) 이상 각각 5% HCl 및 4% NaOH로 달성되었으며, 이어서 8 CV (AEX) 및 12 CV (CEX) 이상의 물로 세척 단계가 이루어졌다.
재생은 100 cm/h의 속도로 수행되었고, 수집 단계는 50 cm/h에서, 세척 단계는 200 cm/h로 진행되는 반면, 공급물은 6.2 cm/h로 조정되었다.
1세트의 로딩 및 재생을 포함하는 1 주기가 31.8분 걸렸다.
HIC 폴리싱으로부터 유도된 hFGF-2 용액의 연속 탈염 공정의 크로마토그램을도 17에 나타내었다.
풀의 오프라인 전도도 측정은 hFGF-2 용액의 염 농도가 상당히 낮아질 수 있음을 확인하였다 (표 4 참조).
|
pH
[-] |
전도도
[ mS /cm] |
|
| hFGF -2 용액 | 6.5 | 44.15 |
| Cycle 1 | 5.4 | 5.56 |
| Cycle 2 | 5.2 | 13.13 |
| Cycle 3 | 5.3 | 0.12 |
| Cycle 4 | 5.0 | 3.29 |
| Cycle 5 | 5.1 | 8.42 |
| Cycle 6 | 5.0 | 11.20 |
| Cycle 7 | 5.2 | 9.00 |
| Cycle 8 | 5.8 | 9.84 |
실시예
7
이온교환 크로마토그래피 (
IEX
) 후 단백질의 탈염 프로토콜 1
녹색 형광 단백질 (GFP)은 대장균에서 생산되며 이온교환기에서 포집되어야 한다. 투명한 균질액의 전도도는 경제적인 방식으로 이온-교환기에 직접 로딩하기에는 너무 높다. 포집 단계 이후의 용출은 NaCl로 수행되고 단백질은 높은 전도도를 갖는 용액에 존재하며 탈염 없이 이온-교환기로 추가 처리할 수 없다.
GFP는 가용성 형태로 대장균 HMS 174 (DE3)에서 발현된다. 세포를 고압 균질화기에 의해 분해시킨다. 균질액을 5000g에서 30분간 원심분리기로 투명화시킨다. 투명화된 상등액은 각각 4개 컬럼(Amberlite IRA-458로 충전된 2개의 양이온 교환 컬럼 및 Dowex Marathon MSC로 포장된 2개의 음이온 교환 컬럼)으로 이루어진 2세트의 컬럼을 사용하여 시차 주기 공정에 의해 탈염된다. 탈염된 단백질 용액을 이온교환 컬럼에 로딩하였다. 컬럼은 Q 세파로스 FF로 충전되었다. 컬럼을 트리스 버퍼 pH 7.5 (버퍼 A)로 평형시킨다. 로딩된 컬럼을 버퍼 A로 세척한 후, 40% 버퍼 B 및 60% 버퍼 A (1M NaCl을 보충한 버퍼 A)로 단계 구배로 용출시켰다. 용출된 분획을 수집하고, 동일한 설정에 의해 추가로 탈염시켰다.
실시예
8
이온교환 크로마토그래피 (
IEX
) 후의 단백질 탈염 프로토콜 2
녹색 형광 단백질 (GFP)은 가용성 형태로 대장균 HMS 174 (DE3)에서 과발현되었다. 세포를 수거하고 균질화 버퍼 (50 mM 트리스, 50 mM NaCl, pH 8.0)에 25% 슬러리 중에 현탁시켰다. GEA 판다 플러스 균질화기 (GEA, Germany)를 사용하여 각각 70 및 700 bar를 적용하여 2-단계 균질화를 수행하였다. 균질액은 Heraeus Multifuge(Thermo Scientific, USA)로 4 ℃에서 45분 동안 18590g 원심분리하여 투명시켰다. 투명된 균질액을 사용할 때까지 -20 ℃에서 냉동 보관하였다.
사용하기 전에 깨끗한 균질액을 4 ℃에서 밤새 해동하고 18590g (4 ℃에서 45분)으로 다시 원심분리하고 0.22 μm의 필터 캡슐(Fluorodyne® EX EDF Membrane in Mini Kleenpak™ Capsules with 230 cm2, Pall, USA)을 통해 여과하였다. 최종 로딩 용액은 전도도가 10.0 mS/cm로 pH 7.3의 50 mM Tris, 50 mM NaCl에서 4.1 mg/ml GFP로 구성되었다.
연속 작동은 4개의 옥타브 펌프가 장착된 셈바 옥타브 10 크로마토그래피 시스템 (Semba Biosciences)에서 수행되었다. 4개의 HR 컬럼(1.6 cm diameter from GE Healthcare)에 Amberlite IRA-400 (CI), 강한 미세기공 음이온 교환 수지 (Sigma-Aldrich, USA) 및 Diaion WK40L (G), 약한 미세기공 양이온 교환 수지 (Mitsubishi Chemical, Japan) 각각으로 포장하였다. 온라인 모니터링을 가능하게 하는 출구 스트림은 Akta Avant 시스템 (GE Healthcare)의 pH 및 전도도 프로브 뿐만 아니라 UV 검출기에도 연결되었다.
컬럼의 부피(CV)는 이들의 결합능과 단클론항체 용액에서의 각각의 이온 농도에 따라 조정되었다.
CVAmberlite = 8.04 ml (1.4 meq/ml)
CVDiaionWK40L = 4.02 ml (4.4 meq/ml)
탈염 공정은 시차 주기 모드로 작동되었다: 한 세트의 컬럼이 로딩되는 동안, 두 번째 세트는 재생되었고 그 반대도 마찬가지였다.
수지의 재생은 5 CV 이상으로 5% HCl 및 4% NaOH 및, 이어서 5 CV 이상의 물로 세척 단계가 이루어졌다. 재생은 100 cm/h의 속도로 수행되었고, 세척 단계는 200 cm/h로 진행되는 반면, 공급물은 30 cm/h로 조정되었다.
1세트의 로딩 및 재생을 포함하는 1 주기가 27.6분 걸렸다. GFP 용액의 연속 탈염 공정의 크로마토그램을 도 18에 나타내었다. GFP가 490 nm에서 특이 흡수를 나타내는 경우, 이 신호는 또한 그래프에 그려진다.
이전의 실험에서와 같이, 컬럼을 중단 없이 로딩하였지만, 탈이온화된 용액을 연속적으로 수집하지 않았다. 그래프의 회색 막대는 탈이온화 용액이 수집된 기간을 나타낸다. 전체 탈염 작업을 통한 전도도는 2mS/cm 이하로 유지될 수 있으며 pH 값은 약 3.5-4.0으로 유지될 수 있다. 밸브 전환으로 인한 인공물도 발견되었고 도 18에서 전도성 스파이크로 볼 수 있다. 이 스파이크는 염 농도가 높기 때문이 아니라 단지 인공물에 불과하다.
풀의 오프라인 분석은 성공적인 탈이온화를 확인하였다 (표 5 참조). GFP 농도는 485 nm의 여기 파장 및 520 nm의 파장에서 방출로 형광을 측정하여 평가하였다. 이러한 측정에 따르면, 탈염 동안 단백질의 약 10%가 손실되었다.
|
pH
[-] |
전도도
[ mS /cm] |
GFP
농도
[mg/ml] |
GFP
회수율
[%] |
|
| GFP 용액 | 7.3 | 10.0 | 4.12 | |
| Cycle 1 | 9.4 | 0.49 | 3.41 | 82.8 |
| Cycle 2 | 9.6 | 0.53 | 3.59 | 87.1 |
| Cycle 3 | 9.6 | 0.98 | 3.63 | 88.1 |
| Cycle 4 | 9.6 | 1.05 | 3.69 | 89.6 |
| Cycle 5 | 9.4 | 1.54 | 3.65 | 88.6 |
| Cycle 6 | 9.7 | 1.45 | 3.95 | 95.9 |
| Cycle 7 | 9.7 | 1.72 | 3.93 | 95.4 |
| Cycle 8 | 9.7 | 1.74 | 3.89 | 94.4 |
실시예
9
염석 후 단백질 탈염 프로토콜 1
서브클래스 IgG1의 CHO 세포 배양 상등액 유래 모노클로날 항체는 1.5 황산나트륨으로 염석된다. GE 헬쓰케어 (GE, Uppsala, Sweden)의 중공사막 미세여과 카트리지 (0.45 μm 기공 크기 및 110 cm²표면적)를 사용하여 미세여과하여 침전물을 수거한다. 침전물을 25 mM 히스티딘 퓨퍼 pH 7.0으로 재용해시킨 후, 단백질 용액은 여전히 높은 염 농도를 가지므로 SMB(Simulated moving bed)/Varicol 형태로 4개의 음이온-교환 컬럼과 4개의 양이온-교환 컬럼에 의해 추가 탈염되었다.
실시예
10
염석 후 단백질 탈염 프로토콜 2
항-TNFα 모노클로날 항체 (mAb)를 CHO K1 세포 배양물에서 생성시켰다. 세포를 원심분리 (200g에서 15분간)에 의해 제거하고, 상등액을 추가로 사용하였다. 모든 원심분리 단계는 Heraeus Multifuge (Thermo Scientific, USA)으로 수행하였다. 사용하기 전, 상등액을 4 ℃에서 10,000g에서 10분간 다시 원심분리하였다.
4 ℃에서 3.9M의 농도로 포화된 황산암모늄 용액을 제조하였다. 황산암모늄 용액을 2시간 내에 최종 농도 50%에 도달할 때까지 mAb 상등액에 4 ℃에서 일정하게 교반하면서 천천히 첨가하였다 (총 작업 부피 4리터). 침전 공정을 4 ℃에서 밤새 교반하도록 허용하였다. 침전된 펠렛을 4 ℃에서 30분 동안 18590g 원심분리하여 분리하였다. 상등액을 버리고 항체를 함유하는 펠렛을 용해 버퍼 (68.5 mM 염화나트륨, 1.35 mM 염화칼륨, 6 mM 인산염, pH 7.4) 500 ml에 재용해시켰다. 생성된 항체 용액은 1.74mg/ml의 농도, 7.0의 pH 값 및 8 mS/cm의 전도도를 가졌다. 항체 용액을 0.22 ㎛ 필터 (Fluorodyne® EX EDF Membrane in Mini Kleenpak™ Capsules with 230 cm2, Pall, USA)로 여과한 후 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다.
연속 작동은 4개의 옥타브 펌프가 장착된 셈바 옥타브 10 크로마토그래피 시스템 (Semba Biosciences, USA)에서 수행되었다. 4개 HR 컬럼 (1.6 cm diameter from GE Healthcare, Sweden)은 강한 미세기공 음이온 교환 수지 (Sigma-Aldrich, USA)인 Amberlite IRA-400 (CI) 및 강한 미세기공 양이온 교환 수지 (Amberlite IRA-400 (CI))인 도웩스 마라톤 MSC 각각으로 충전되었다. 온라인 모니터링을 가능하게하는 아웃렛 스트림은 Akta Avant system (GE Healthcare, Sweden)의 pH 및 전도도 프로브뿐만 아니라 UV 검출기에 연결되었다.
컬럼 부피(CV)는 그들의 결합능 및 mAb 용액에서 각각의 이온 농도에 따라 조정되었다.
CVAmberlite = 6.43 ml (1.4 meq/ml)
CVMarathonMSC = 5.63 ml (1.6 meq/ml)
탈염 공정은 시차 주기 모드로 다시 작동되며, 한 세트의 컬럼이 로딩되고 두 번째 세트는 재생되고 반대의 경우도 마찬가지이다.
수지의 재생은 5 CV 이상 5% HCl 및 4% NaOH 각각 및 5 CV 이상의 물로 연속 세척 단계를 통해 달성되었다.
재생은 100 cm/h의 속도로 수행되었고, 세척은 200 cm/h로 단계가 진행되는 반면, 공급은 15 cm/h로 조정되었다.
1 세트의 로딩 및 재생을 포함하는 1 주기가 31.44분 걸렸다.
염석 후 mAb 용액의 연속 탈염 공정의 크로마토그램을 도 19에 나타내었다.
이전의 실험에서와 같이, 컬럼을 중단 없이 로딩하였지만, 탈이온화된 용액을 연속적으로 수집하지 않았다. 그래프의 회색 막대는 탈이온화 용액이 수집된 기간을 나타낸다. 전체 운전을 통한 전도도는 1 mS/cm 이하로, pH 값은 약 4로 유지될 수 있다. 밸브 전환의 인공물도 발견되었고 도 19에서 전도도 스파이크로 볼 수 있다. 이러한 스파이크는 높은 염 농도 때문이 아니라 단지 인공물일뿐이다.
풀의 오프라인 분석은 성공적인 탈이온화를 확인하였다 (표 6 참조). 모노리스 단백질 A CIM 디스크 (BIA Separations, Slovenia)를 사용하여 mAb 농도를 측정하였으며, 여기서 불순물 함량을 평가할 수 있었다. HPLC 분석에 따르면 공정 중에 사소한 단백질 손실만 기록되었지만 로딩된 mAb 용액에 비해 불순물의 약 60%가 고갈되었다.
|
pH
[-] |
전도도
[ mS /cm] |
mAb
농도
[ mg / ml ] |
mAb 회수율 [ % ] |
분순물
고갈 [ % ] |
|
| 재용해된 mAb 용액 | 7.00 | 21.00 | 1.74 | ||
| Cycle 1 | 3.87 | 0.17 | 1.74 | 100.0 | 60.9 |
| Cycle 2 | 3.49 | 0.29 | 1.42 | 81.6 | 72.5 |
| Cycle 3 | 3.54 | 0.33 | 1.77 | 101.7 | 58.4 |
| Cycle 4 | 4.14 | 0.13 | 1.34 | 77.0 | 71.3 |
| Cycle 5 | 3.55 | 0.32 | 1.89 | 108.6 | 55.6 |
| Cycle 6 | 3.67 | 0.25 | 1.85 | 106.3 | 62.2 |
| Cycle 7 | 3.55 | 0.33 | 2.00 | 114.9 | 54.8 |
| Cycle 8 | 3.63 | 0.26 | 1.61 | 92.5 | 62.4 |
Claims (15)
- a) 미세기공(micropore) 음이온 교환기를 포함하는 제 1 용기(1)에 단백질 용액을 첨가하는 단계,
b) 상기 생성된 용액을 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 제 2 용기(2)로 이송하는 단계,
c) 상기 생성된 탈염된 생물 약제 용액을 수집하는 단계
를 포함하는 단백질 용액의 탈염 공정.
- 제 1 항에 있어서,
d) 단계 (c)에서의 탈염된 단백질 용액을 미세기공 음이온 교환기를 포함하는 제 1 용기(1) 및 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 제 2 용기(2)를 포함하는 제 1 용기 세트와 동일한 제 2 용기 세트에 첨가하는 단계를 추가로 포함하되, 임의로 상기 단계 d)는 하나 또는 수 개의 추가 세트의 용기로 반복되는 공정.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
e) 제 1 용기(1)의 미세기공 음이온 교환기를 NaOH로, 제 2 용기(2)의 미세기공 양이온 교환기를 HCL로 재생시키는 단계;
f) 제 1 항의 공정에서 생성된 탈염된 단백질 용액을 단계 d)에서 재생된 미세기공 음이온 교환기를 포함하는 재생된 용기(1)에 첨가하는 단계; 및 그런 다음 생성된 용액을 단계 d)에서 재생된 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 재생된 제 2 용기(2)로 이송하는 단계; 및
g) 생성된 탈염된 단백질 용액을 수집하고, 임의로 다음 단계를 추가로 포함하는 단계;
h) 단계 g) 후, 제 1 용기(1)의 미세기공 음이온 교환기를 NaOH로, 제 2 용기(2)의 미세기공 양이온 교환기를 HCL로 재생시키는 단계; 및 그런 다음 i) 단계 g)에서 탈염된 단백질을 단계 h)에서 재생된 미세기공 음이온 및 양이온 교환기에 첨가하는 단계
를 추가로 포함하는 공정.
- 제 1 항에 있어서,
상기 공정은 연속적이며,
a) 미세기공 음이온 교환기를 포함하는 용기(1)에 이어 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 제 2 용기(2)를 포함하는 제 1 용기 세트에 단백질 용액(공급 용액)을 첨가하는 단계,
b) 생성된 탈염된 단백질 용액을 수집하는 단계,
c) 미세기공 음이온 교환기를 포함하는 용기에 이어 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 용기로 이루어진 제 1 용기 세트와 동일한 제 2 용기 세트에 단백질 용액 (공급 용액)을 동시에 첨가하면서, 미세기공 음이온 교환기를 NaOH로, 미세기공 양이온 교환기를 HCL로 재생시키는 단계,
d) 생성된 탈염된 단백질 용액을 제 2 용기 세트에서 수집하는 단계;
e) 제 2 미세기공 음이온 교환기를 NaOH로, 제 2 미세기공 양이온 교환기를 HCL로 재생시키되 단백질 용액 (공급 용액)을 동시에 상기 재생된 제 1 용기 세트로 다시 향하게 하고, 단백질 용액의 전량이 탈염될 때까지 단계 a) 내지 단계 d)를 반복하는 단계를 포함하되, 한 용기 세트에 로딩하는 동안 동시에 여러 용기 세트를 재생할 수 있도록 임의로 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 또는 추가 용기 세트가 병렬로 사용되는 공정.
- 제 1 항에 있어서,
a) 미세기공 음이온 교환기를 포함하는 용기(1)에 이어 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 제 2 용기(2)로 이루어진 제 1 용기 세트에 단백질 용액(공급 용액)을 첨가하는 단계,
b) 생성된 탈염된 단백질 용액을 수집하는 단계,
c) 단계 b)의 탈염된 단백질 용액을 미세기공 음이온 교환기를 포함하는 용기에 이어 미세기공 양이온 교환기를 포함하는 용기로 이루어진 제 1 용기 세트와 동일한 제 2 용기 세트에 동시에 첨가하면서, 미세기공 음이온 교환기를 NaOH로, 미세기공 양이온 교환기를 HCL로 재생시키는 단계,
d) 생성된 탈염된 단백질 용액을 제 2 용기 세트에서 수집하는 단계;
e) 제 2 미세기공 음이온 교환기를 NaOH로, 제 2 미세기공 양이온 교환기를 HCL로 재생시키되 단계 d)의 탈염된 생물 약제 용액을 동시에 상기 재생된 제 1 용기 세트로 다시 향하게 하고, 단백질 용액에서 염의 전량이 제거될 때까지 단계 a) 내지 단계 d)를 반복하는 단계를 포함하되, 탈염된 단백질 용액을 한 용기 세트에 로딩하면서 동시에 여러 세트의 용기를 재생할 수 있도록 임의로 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 또는 추가 용기 세트가 병렬로 사용되는 공정.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질 용액 (공급 용액)은 리폴딩 용액, 소수성 상호 작용 크로마토그래피의 용액, 이온 교환 크로마토그래피에서 생성된 단백질, 단백질의 염석에서 생성된 용액 또는 수성 2-상 추출에서 생성된 용액을 포함하는 군에서 선택되며, 가장 바람직하기로는 상기 단백질이 scFv, 항체, 나노바디, 2가 항체, 3가 항체, 카멜리드 항체, 항체 콘쥬게이트, 사이토카인 및 펩타이드 호르몬을 포함하는 공정.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
마지막 단계에서의 탈염된 단백질 용액을 거대기공(macropore) 수지에 첨가하는 단계; 및
거대기공 수지에서 분리된 단백질을 수집하는 단계
를 추가로 포함하는 공정.
- 제 7 항에 있어서,
상기 탈염된 단백질 용액은 거대기공 수지에 첨가하기 전에 미처리된 단백질 용액 (공급 용액)과 혼합되는 공정.
- 단백질 용액이 음이온 교환기에서 양이온 교환기로 통과하고 양이온 교환기를 통과한 후 수집될 수 있는 수단으로서 미세기공 음이온 교환기(AEX)를 포함하는 제 1 용기(1) 및 미세기공 양이온 교환기(CEX)를 포함하는 제 2 용기(2)로 구성된 제 1 용기 세트를 포함하는 단백질 용액의 탈염 장치.
- 제 9 항에 있어서,
단백질 용액이 제 1 용기 세트에서 제 2 용기 세트로 통과할 수 있는 수단으로서, 미세기공 음이온 교환기(AEX)를 포함하는 제 1 용기(1) 및 미세기공 양이온 교환기(CEX)를 포함하는 제 2 용기(2)로 구성된 제 2, 제 3, 제 4 또는 다중 동일한 용기 세트에 제 1 용기 세트가 연결되는 장치.
- 제 9 항에 있어서,
단백질 용액이 음이온 교환기에서 양이온 교환기로 통과할 수 있는 수단으로서, 미세기공 음이온 교환기(AEX)를 포함하는 제 1 용기(1) 및 미세기공 양이온 교환기(CEX)를 포함하는 제 2 용기(2)가 연결된 제 1 용기 세트 및 제 2, 제 3, 제 4, 제 5 또는 추가의 동일한 용기 세트를 포함하되, 상기 단백질의 공급 스트림은 제 1 용기 세트에서 제 2, 제 3, 제 4, 제 5 또는 추가의 동일한 직렬의 용기로 이동될 수 있는 장치.
- 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 용기는 멤브레인 또는 모노리스를 함유하는 하우징 또는 비드로 충전된 컬럼인 장치.
- 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
마지막 미세기공 양이온 교환기에 직렬로 연결된 거대기공 수지를 포함하는 용기를 추가로 포함하는 장치.
- a) 미세기공 음이온 수지를 포함하는 용기에 단백질 용액을 첨가하는 단계,
b) 단계 a)에서 생성된 단백질 용액을 미세기공 수지를 포함하는 용기에 첨가하는 단계,
c) 단계 b)에서 생성된 단백질 용액을 거대기공 수지를 포함하는 용기에 첨가하는 단계;
d) 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 단백질 용액에서 단백질을 얻는 방법.
- 제 14 항에 있어서,
상기 단계 a) 및 b)는 단계 c)로 진행하기 전에 반복되는 방법.
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