JP6612242B2 - 自動化された多段階精製システム及び多段階クロマトグラフィー精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、多段階クロマトグラフィー精製に関し、さらに具体的には、別々の供給源からの標的分子の精製を互いに別個に実施するための２以上の精製セグメントを備える自動化された多段階クロマトグラフィー精製システムに関する。

今日の薬剤の研究において、多くのタンパク質を短時間で精製することに対する要求が高まっている。しかし、タンパク質の精製は時間がかかり、多くの手作業を必要とする。

例えば、治療用抗体の形態のタンパク質は、医薬品市場において最も急成長している部門の１つである。この部門の成長により、より速く、より良い抗体の選択及びキャラクタリゼーションのために、初期の候補を調製及び分析するための効率的でコストを節減できる新しいプラットフォームの開発が必要になってきている。通常、タンパク質は、そのタンパク質の遺伝子を含む組換えプラスミドを挿入することによって、関心のあるタンパク質を生成するよう操作された哺乳類又は細菌の細胞株を用いて、細胞培養により生成される。用いられる細胞株は生物なので、動物血清の製剤から通常は補給される糖類、アミノ酸及び増殖因子を含む複合増殖培地を与えなければならない。細胞に与えた化合物の混合物及び細胞自体の副産物から、調製及び分析に十分な純度まで所望のタンパク質を分離することは大変な課題を投げかける。

細胞片からのタンパク質の精製手順は、初めにタンパク質の発現部位によって決まる。一部のタンパク質は、細胞から周囲の増殖培地に直接分泌させられる；他のタンパク質は細胞内で作られる。後者のタンパク質では、精製プロセスの第１ステップは細胞を溶解するものであり、これは、機械的なせん断、浸透圧ショック又は酵素処理を含む様々な方法で行うことができる。このような破壊は、細胞の全内容物をホモジネートに放出し、加えて、サイズが小さいために除去が難しい細胞内の断片を生じる。これらは一般に、遠心分離又は濾過によって除去される。規模は小さいが、同じ問題が、タンパク質の生成試験の過程における細胞の自然死、及び細胞内の宿主細胞のタンパク質の放出によって直接分泌されたタンパク質においても起こる。

結果として、現在用いられている典型的な精製プロセスには以下のステップが含まれる：
・細胞内タンパク質を回収するための細胞溶解、又は分泌されたタンパク質の場合、培地からのタンパク質の回収
・関心のあるタンパク質を含む澄んだサンプルを得るための、例えば、分画遠心又は濾過を用いる細胞片の除去
・関心のあるタンパク質を他のタンパク質及びサンプル中の他の様々な不純物から分離するための、多段階プロセスにおける様々なクロマトグラフィー媒体の使用。

クロマトグラフ法では通常、タンパク質の混合物を、それらの電荷、疎水性度又はサイズに基づいて分離する。これらの技術それぞれについて、異なるクロマトグラフィー樹脂がいくつか利用できて、関与する特定のタンパク質に対して精製スキームを的確に合わせることができる。これらの分離法それぞれの本質は、タンパク質を異なる速度で長いカラムの下方に移動させて、カラムの下方にさらに進むほど物理的な分離が向上したり、又は、タンパク質を分離媒体に選択的に付着させた後、異なる溶媒で異なるように溶出させたりすることである。場合によっては、不純物が特異的にカラムに付着し、かつ関心のあるタンパク質がカラムに付着しないとき、すなわち、関心のあるタンパク質が「フロースルー」中に存在するとき、所望のタンパク質は不純物から分離される。

イオン交換クロマトグラフィーは、交換可能な対イオンにちなんで名付けられた、イオン化する分子の精製に適用できる方法である。イオン化した分子は、その電荷を帯びた基と、固相支持基材に結合した反対の電荷を帯びた分子との非特異的な静電的相互作用に基づいて分離され、それによって、さらに強く固相と相互作用するイオン化した分子を遅らせる。電荷を帯びた基の数、それぞれの基の電荷、及び電荷を帯びた固相基材との相互作用をめぐって競争する分子の特性に従って、各タイプのイオン化した分子の実効電荷及び基材に対するその親和力は変化する。これらの相違が、イオン交換クロマトグラフィーによる様々な分子タイプの分離をもたらす。イオン交換クロマトグラフィーを用いる典型的なタンパク質精製では、哺乳類の細胞培養中などの、宿主細胞由来の多くのタンパク質の混合物がイオン交換カラムにかけられる。非結合分子が洗い流された後、ステップモード又は勾配モードで、ｐＨ、対イオン濃度などを変更することによって条件が調整されて、非特異的に保持又は遅らせられたイオン化した関心のあるタンパク質が固相から遊離し、異なる電荷特性を有するタンパク質から分離される。陰イオン交換クロマトグラフィーは、特定の分離プロセスのｐＨ及び条件下で、固相基材に結合した正の電荷を帯びた分子との相互作用をめぐって、関心のあるアニオン分子が負の対イオンと競争するものである。対照的に、陽イオン交換クロマトグラフィーは、特定の分離プロセスのｐＨ及び条件下で、固相基材に結合した負の電荷を帯びた分子をめぐって、関心のあるカチオン分子が正の対イオンと競争するものである。混合モードイオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン及び陰イオン交換クロマトグラフィー媒体の組合せを同じステップで使用するものである。特に、「混合モード」は、陽イオン交換部分及び／又は陰イオン交換部分及び疎水性相互作用部分の混合物と共有結合した固相支持基材を指す。

アフィニティークロマトグラフィーは、精製されるタンパク質と固定された捕捉剤の間の特異的構造依存性（すなわち、空間的に相補的な）相互作用を利用し、抗体などの一部のタンパク質に対する標準的な精製の選択肢である。例えば、プロテインＡは、抗体（Ｆｃ領域を含む。）などのタンパク質のアフィニティークロマトグラフィーに有用な吸着剤である。プロテインＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質であり、抗体のＦｃ領域に高い親和性（ヒトＩｇＧに対して約１０^-8Ｍ）で結合する。

別のクロマトグラフ法は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。タンパク質精製プロセス及びクロマトグラフィープロセスのさらに詳細な説明は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎなどを含む、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓが提供している本分野の一連のハンドブック（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている場合がある。

したがって、典型的な精製プロセス １以上の遠心分離ステップ及び濾過ステップ、並びに２以上のクロマトグラフィー分離法（アフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（Ｉ ＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）及び順相クロマトグラフィー（ＮＰＣ）など）。

通常、名前が付けられた方法はそれぞれ、異なる動作（緩衝液、ｐＨ、伝導度）条件を必要とし、クロマトグラフ分離を実施する前にサンプル調製をすることになる。

述べた通り、クロマトグラフィー精製プロトコルは、１以上の精製ステップを含んでもよく、一例では、プロトコルは、一般に捕捉、中間精製及びポリッシングと呼ばれる３つの精製ステップを含む。表１は、様々なクロマトグラフィー精製方法を選定するための相対的な特性、及び３ステッププロトコルの異なる精製ステップにおける相対的な使用を示す。クロマトグラフィー精製プロトコルを設計するとき、各精製ステップを計画する際に考慮すべき次の重要な４つの性能パラメータがある：分解能、容量、速度及び回収。これら４つのパラメータのいずれか１つの最適化はその他を犠牲することによってのみ実現することができて、各精製ステップは妥協案になる。各パラメータの重要性は各精製ステップの目的に応じて変わり、例えば、精製ステップが捕捉、中間精製又はポリッシングなどに用いられるかどうかによって変わる。精製方法は、各精製ステップの目的を達成するよう選択及び最適化されるべきである。回収は、最適化されるべき重要なパラメータでないことがあるにもかかわらず、どのような調製状況においても、特に価値の高い製品の製造においては重要になり、そのときは、捕捉ステップを最適化する間に、回収について評価することが重要である。

容量と分解能の最適なバランスはそれぞれの場合において決められなければならない。捕捉段階のように、選択性は、標的分子に対する高い結合能を実現するためだけでなく、重要になる。しかし、大部分の捕捉ステップとは対照的に、溶出中の選択性は重要であり、通常、連続勾配法又は多段階の溶出法を適用することによって達成される。

様々な精製方法を通じて利用できる様々な選択性に加えて、精製効率は、それぞれの方法で利用できる様々なクロマトグラフィー媒体の選択に大きく左右される。効率、流動抵抗、選択性及び容量は媒体間で異なる。媒体の粒径は、効率及び流動抵抗に強い影響を与える。

大きいビーズを用いる媒体は、カラムが低効率（ピークが幅広い。）かつ低背圧になる一方、小さいビーズは高効率かつ高背圧になる。精製プロセスの初期（例えば、捕捉段階）は、サンプル体積が大きく、サンプルは速やかに安定化される必要があるため、高い速度が必要であることが多い。分解能はそれほど重視されない。高流量で低背圧になる大きい粒子を用いるクロマトグラフィー媒体が選択されるべきである。ポリッシング段階では、焦点が高純度に置かれ、これは、効率が高い、すなわち、小さいビーズを用いるクロマトグラフィー媒体で得られる。これらの媒体は、より低い流量及び高圧に耐えるカラムが必要になる可能性がある、より高い背圧を与える。これらの制限は、この段階におけるサンプル体積及び量がより小さいため許容される。

簡単なバッチクロマトグラフィー法は、実験室規模のタンパク質の精製及び工業用途においてよく受け入れられている；しかし、この技術は処理時間が長く、運用コストが高いため、労働集約的で費用がかかる（例えば、大量の溶媒、高価な樹脂及びハードウェア）。この方法も、動作条件（例えば、生成物の力価、滞留時間及び供給速度（８０％の動的結合能値から出発した生成物の損失）の影響を受けやすい。代替の半連続の技術がいくつか同様に開発されたが、これは、以下のような２つ又は３つの異なるクロマトグラフィーモードを接続することを意味する。
・ＷＯ２０１１／０３７５２２には、入口に接続された出口である２以上の分離ユニットを備える分離システムが開示されている。すべてのカラムはインラインで接続される。
・ＷＯ２０１１／０１７５１４には、タンク又は緩衝液交換ステップを保有する必要のないアフィニティークロマトグラフィーステップ及び２つのイオン交換クロマトグラフィーステップの組合せが開示されている。
・ＷＯ９３０７１６８には、１つのタンパク質を実質的に連続的に分離し、分析するための先行技術の自動化されたクロマトグラフィーシステムの一例が開示されており、このシステムには、サンプル流入手段、第１液体クロマトグラフィーカラム、サンプル流入手段をカラムに接続するマルチポート注入バルブ、マルチポートバルブを介して溶液をカラムへ圧力可変で送り出すためのポンプ手段、及びシステム制御プログラムのシーケンスを指定するためのプログラム手段が含まれる。

しかし、これらのどれも連続的な供給は可能にならない。

ＷＯ２０１３０５０１０４には、３つの分離カラムのみを必要とする連続クロマトグラフィープロセスを実行できる先行技術の自動化された工業的規模のクロマトグラフィーシステムが開示されている。このプロセスは、２つのクロマトグラフステップを含む２ステップの方法である。第１のクロマトグラフステップ（捕捉）は、好ましくは２つの分離カラムで交互に連続して実施される；第２のクロマトグラフステップ（ポリッシング）は、第３カラムで同様に連続して実施される。しかし、このシステムも、上述の自動化された精製システムも、１つの同じシステムを用いて、自動化された効率のよい形での複数の異なるサンプルの精製は可能にならない。

クロマトグラフィー媒体（樹脂）の現場洗浄（ＣＩＰ）は、最終的なバイオ医薬品の完全性及び安全にとって重要である。供給物質の供給源に応じて、様々なタイプの不純物は、除去されない場合、クロマトグラフィー媒体内に捕集されて、あるサイクルから次のサイクルに持ち越される恐れがある。そのキャリーオーバー物質は、生成物又は生成物の変異体である可能性がある。

欧州特許出願公開第２６８２１６８号明細書

本発明の目的は、クロマトグラフィー精製システムを提供することであり、このシステムは、先行技術の１以上の欠点を克服する。この目的は、独立項に定義されるクロマトグラフィー精製システムによって達成される。

本クロマトグラフィー精製システムの１つの利益は、細胞培養から直接の複数の異なる標的分子を効率よく無人精製できるようになることである。

本発明並びにその別の特徴及び利点のより完全な理解は、以下の発明を実施するための形態及び図面を参照することによって得られるであろう。

クロマトグラフィーシステムの一実施形態の概略図である。 異なるローター位置に位置するローターを備えるロータリーバルブの実施形態の概略図である。 異なるローター位置に位置するローターを備えるロータリーバルブの実施形態の概略図である。 異なるローター位置に位置するローターを持つロータリーバルブの実施形態の概略図である。 異なるローター位置に位置するローターを持つロータリーバルブの実施形態の概略図である。 クロマトグラフィーシステムの別の実施形態の概略図である。 ロータリーバルブの代替の実施形態の概略図である。２ステップ精製プロセスの概略図である。 ロータリーバルブの代替の実施形態の概略図である。２ステップ精製プロセスの概略図である。 ロータリーバルブの代替の実施形態の概略図である。２ステップ精製プロセスの概略図である。 図４ａ〜図４ｃの２ステップ精製プロセスを実施するための流体回路の概略図である。 図４ａ〜図４ｃの２ステップ精製プロセスを実施するための流体回路の概略図である。 図４ａ〜図４ｃの２ステップ精製プロセスを実施するための流体回路の概略図である。 図４ａ〜図４ｃの２ステップ精製プロセスを実施するための流体回路の概略図である。 ロータリーバルブの代替の実施形態の概略図である。 ロータリーバルブの代替の実施形態の概略図である。 ロータリーバルブの代替の実施形態の概略図である。 ロータリーバルブの代替の実施形態の概略図である。 多段階精製システムの１つの概略実施形態を示す図である。 ２ステップ精製システムの１つの概略実施形態を示す図である。 バルブ配列を示す図である。 ２ステップ精製システムの別の概略実施形態を示す図である。 図９又は図１０のシステムにおける並列の２ステップ精製プロセスの様々なステップを示す概略図である。

図１は、以下を備えるクロマトグラフィーシステム１９０の一実施形態の概略を示す：
・流体供給源Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２からの入力流体を選択するよう配列された２つの三方入力バルブ１６０及び１６１
・２つのシステムポンプ１５０及び１５１
・システムポンプ後の流路のシステム圧力を示すための圧力センサー２００、
・ポンプによって供給される流体の適切な混合を確実にするためのミキサー２１０、
・サンプルを流体流路に注入するための注入バルブ２２０、
・流体流路のカラム２４０を選択的に接続／切断するためのカラム接続バルブ２３０。
・プレカラム圧力センサー２３５及びポストカラム圧力センサー２３６
・カラムからの出力を検知するための紫外線（ＵＶ）モニター２５０。
・伝導度モニター２６０、
・ｐＨモニター２６５、
・例えば、フラクションコレクター２８０、廃液容器などに接続される２以上の出力位置を持つ出力選択バルブ２７０、及び
・システム内の液流を制御するためのポンプ及びバルブ、並びに液流をモニターするためのセンサー及びモニターに接続されたシステムコントローラ１０（接続は点線３１０で示している）。

図１のクロマトグラフィーシステムは、クロマトグラフィーシステムがどのように設計されてもよいかを示す一般的な例を表し、他の実施形態は、２以上のいくつかの構成要素を備える異なる設計のものでもよく、場合によっては、構成要素の一部がなくてもよい。一実施形態では、クロマトグラフィーシステムは液体クロマトグラフィーシステムである。

図２ａ〜図２ｄは、例えば、上述によるクロマトグラフィーシステムにおいて用いられてもよいバルブ１０の概略を開示する。バルブ１０は、ポート１３１ａ、１３２ａ、１３３ａ及び１３４ａを備えるステーター、並びにステーターに面した表面に形成された溝１４０、１４１ａ及び１４１ｂ（点線で示す）を備えるローターを備えるロータリーバルブである。バルブ１０は、係属中の特許出願ＰＣＴ／ＳＥ２０１３／０５０９８５（この出願は参照により本明細書に組み込まれる。）にさらに詳細に開示されている。

第１ローター位置では、図２ａに示す通り、バルブ１０は、構成要素ポート１３３ａ及び１３４ａをバイパスするように配列される。流体流は入口ポート１３１ａに入り、第１オリフィス１３１ｂを介して斜めのローター溝１４０を通り、出口ポート１３２ａを通って（第２オリフィス１３２ｂを介して）バルブを出る。バルブの他のポート及び溝は第１ローター位置では動作しておらず、すなわち、構成要素はバイパスされている。

図２ｂは、第２ローター位置のバルブ１０を示し、ローター１２の相互接続経路は、入口ポート１３１ａと構成要素供給ポート１３３ａを相互接続し、構成要素戻りポート１３４ａと出口ポート１３２ａを相互接続する。このローター位置では、構成要素は、順方向の流れ接続で流体流に接続される。さらに具体的には、平行溝１４１ａは、入口ポートのバルブオリフィス１３１ｂ及び構成要素供給ポート１３３ａのバルブオリフィス１３３ｂを相互接続し、一方、他の平行溝１４１ｂは、構成要素戻りポート１３４ａのバルブオリフィス１３４ｂ及び出口ポート１３２ａのバルブオリフィス１３２ｂを相互接続する。

図２ｃは、第３ローター位置のバルブ１０を示し、ローター１２の相互接続経路は、入口ポート１３１ａと構成要素戻りポート１３４ａを相互接続し、構成要素供給ポート１３３ａと出口ポート１３２ａを相互接続する。このローター位置では、構成要素は、逆方向の流れ接続で流体流に接続される。さらに具体的には、平行溝１４１ａは、入口ポートのバルブオリフィス１３１ｂ及び構成要素戻りポート１３４ａのバルブオリフィス１３４ｂを相互接続し、一方、他の平行溝１４１ｂは、構成要素供給ポート１３３ａのバルブオリフィス１３３ｂ及び出口ポート１３２ａのバルブオリフィス１３２ｂを相互接続する。

図２ｄは、第４ローター位置のバルブ１０を示し、ローター１２の相互接続経路は、構成要素供給ポート１３３ａと構成要素戻りポート１３４ａを相互接続し、これにより、主入口ポート１３１ａと出口ポート１３２ａの間の流路を相互接続する。

図３は、２つのシステムポンプ１５０及び１５１への流体供給源Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２からの入力流体を選択するよう配列された２つの入力三方バルブ１６０及び１６１を備えるクロマトグラフィーシステム１９０の別の実施形態の概略を示す。クロマトグラフィーシステム１９０は、以下をさらに備えてもよい：
・システムポンプ後の流路のシステム圧力を示すための圧力センサー２００、
・ポンプによって供給される流体の適切な混合を確実にするためのミキサー２１０、
・サンプルを流体流路に注入するための注入バルブ２２０、
・流体流路のカラム２４０を選択的に接続／切断するためのカラム接続バルブ２３０。
・カラムからの出力を検知するための紫外線（ＵＶ）モニター２５０。
・伝導度モニター２６０、及び
・例えば、フラクションコレクター２８０、廃液容器などに接続される２以上の出力位置を持つ出力選択バルブ２７０。

図３は、クロマトグラフィーシステムの一実施形態を示し、本バルブ１０は２つの異なる位置で用いられ、すなわち、図６ａ〜図６ｂに開示されている通りのカラム接続バルブ２３０として、図７ａ〜図７ｃに開示されている通りの出力選択バルブ２７０として用いられる。

図１及び図３のクロマトグラフィーシステムは、クロマトグラフィーシステムがどのように構成されてもよいかを示す一般的な例を表し、他の実施形態は、２以上のいくつかの構成要素を備える異なる設計のものでもよく、場合によっては、構成要素の一部がなくてもよい。一実施形態では、クロマトグラフィーシステムは液体クロマトグラフィーシステムである。

ロータリーバルブ１０の汎用性をいくつかの具体的な応用例でさらに例示し、ここではバルブが、流路設計及びすべての動作において大きな利益をもたらす。図４ａ〜図４ｃは、ロータリーバルブ１０を用いる配列によって簡略化されてもよい２ステップ精製プロセスの概略を示す。このタイプの２ステップ精製プロセスでは、図４ａに示す第１ステップは通常、第１カラムＡ２４０（例えば、アフィニティーカラムなど）内でタンパク質などの標的サンプルを捕捉するものである。標的サンプルの捕捉をモニターするために、ＵＶモニター２５０が、カラムＡに続く流路に接続される。捕捉段階プロセスは、従来通り、洗浄段階を含んでもよく、非標的分子などがカラムＡから洗い流され、また、洗浄段階は、ＵＶモニターによってモニターされ、すべての非標的分子が洗い流されたときを判定する。捕捉／洗浄段階の間、第２カラムＢは、図４ａに示す通り接続されない。ＵＶモニターからの出力信号が、捕捉／洗浄段階が完了したことを示すとき、次の段階は、カラムＡから標的サンプルを溶出し、カラムＢを用いてこれをさらに精製することである。カラムＡから標的サンプルを溶出するために、溶出緩衝液などが供給源に供給され、これにより、標的サンプルがカラムＡから遊離される。溶出段階の間、標的サンプルがＵＶモニターに達するときに知らせるために、カラムＡからの出力はＵＶモニターを用いてモニターされ、これにより、カラムＢが、図４ｂに示す通り、ＵＶモニターに続く流体流路に接続されて標的サンプルを受け、次に、すべての標的サンプルがカラムＢに負荷されるとき、溶出プロセスを中断し、第２精製ステップである第３段階を開始する。第２精製ステップでは、図４ｃに示す通り、カラムＡは好ましくは流路から切断され、溶出緩衝液は通常、第２精製緩衝液で置換されて、カラムＢにおいてクロマトグラフ精製を進める。このステップでは、カラムＢの出力端にＵＶモニターを導入することによってカラムＢからの出力をモニターすることが望ましい。したがって、第３段階では、カラムＢとＵＶモニターの論理順序は、先のステップと比べて変更する必要がある。利用できる別々の２つのＵＶモニターがない限り、２つの流体構成要素の論理順序を切り替えるプロセスは、いくつかのバルブ構成要素を必要とする些細でない動作である。さらに、場合によっては、カラムＡから溶出された標的サンプルをできるだけ速やかにカラムＢに導入して、緩衝液をできるだけ速やかに変えることが望ましい（例えば、溶出中に用いられる緩衝液がタンパク質を不安定にする恐れがあるため）。

図５ａから図５ｄは、本設計の３つのロータリーバルブ１０ａ〜１０ｃを備える配列を用いて、２ステップ精製プロセスをどのように設計することができるかを示す例である。この配列では、３つのロータリーバルブ１０ａ〜１０ｃが供給源から出口に直列に接続される。カラムＡ２４０は、図２ａから図２ｄに開示されている通り、カラムＡの接続及び流路からの切断を可能にするバルブ１０ａの２つの構成要素供給ポート及び戻りポートの間に接続される。第２カラムＢ２４０は、第２バルブ１０ｂ及び第３バルブ１０ｃそれぞれの構成要素供給ポートの間に接続され、ＵＶモニター２５０は、第２バルブ１０ｂ及び第３バルブ１０ｃそれぞれの構成要素戻りポートの間に接続される。この配列によって、ただ２つのバルブを用いて、カラムＢとＵＶモニターの論理順序の効率的な切り替えが可能になる一方、両方の構成要素のバイパス並びに構成要素と流路との個々の接続も可能になる。

図５ａにおいて、３つすべてのバルブ１０ａ〜１０ｃはバイパスモード（第１位置）に配列されており、これにより、流体流は供給源から出口へ直進する。図５ｂは、捕捉／洗浄段階及び初期の溶出段階を表し、ここで流体流は、カラムＡ及びＵＶモニター内に導かれる一方、カラムＢは切断されたままである。これは、バルブ１０ａを第２位置に、バルブ１０ｂを第３位置に、バルブ１０ｃを第２位置に設定することによって実現される。図５ｃは、標的サンプルがＵＶモニターによって検出され、第２カラムＢがＵＶモニターの後に接続された溶出段階を表す。これは、バルブ１０ａを第２位置に保ち、バルブ１０ｂを第３位置に保ち、バルブ１０ｃを第３位置に設定することによって実現される。第２位置から第３位置へのバルブ１０ｃの位置のみの切り替えによるＵＶモニター後のカラムＢの接続に留意されたい。図５ｄは、カラムＡが流路から切断されており、カラムＢとＵＶモニターの論理順序が切り替えられた第２精製ステップを表す。これは、バルブ１０ａを第１位置に、バルブ１０ｂを第２位置に、バルブ１０ｃを第２位置に設定することによって実現される。

上述の実施形態は、流路内の構成要素の論理順序の切り替えが有益であるときの使用の一例を表し、この配列は、この機能が有用である任意の応用においてさらに用いられてもよい。図５ａから図５ｄに従って２つの構成要素に接続される２つのバルブ１０ｂ及び１０ｃを用いて、流路内の構成要素の論理順序を変更することにより、各ステップにおいて利用できる構成要素の使用を最適化する様々な流路構成を生み出すことができる。例えば、ＵＶモニター、出口バルブ又はカラムの位置を変更して、現在の応用に最適にすることができる。上述から明らかなように、流路内の構成要素の論理順序を変更するためのこのような配列は一般に、第１ロータリーバルブ１０ａ及び第２ロータリーバルブ１０ｂ並びに第１及び第２流体構成要素を備える流体回路によって実現することができて、
−第２バルブの入口ポートは、第１バルブの出口ポートに接続され、
−第１流体構成要素は、第１バルブの構成要素供給ポートと第２バルブの構成要素供給ポートの間に接続され、
−第２の流体構成要素は、第１バルブの構成要素戻りポートと第２バルブの構成要素戻りポートの間に接続される。

さらに、本バルブ１０は、図６ａ及び図６ｂに示す通り、２つの独立した流体流路間のスイッチとして用いられてもよく、供給源Ａ及びＢは構成要素ポートにそれぞれ接続され、カラムＡ及びＢは入口及び出口にそれぞれ接続される。この構成では、バルブによって、供給源Ａ又はＢとそれぞれのカラムＡ及びＢとの選択的な接続が可能になる。このような配列が有用であろう応用の１つは、他のカラム（例えば、バイオプロセス生産流路）でクロマトグラフプロセスを並行して実行しながら、１つのカラムのコンディショニングを実施することであり、コンディショニングされたカラムは、クロマトグラフィープロセス、及び洗浄又は置換のために切断された他のカラムに切り替えられてもよい。

図７ａ〜図７ｂは別の具体的な応用例の概略を示し、その後の第２精製ステップを実施するための、溶出されたサンプル分画がサンプルループ内に保管される代替の２ステップ精製プロセスを可能にするために、本バルブ１０が、図１のクロマトグラフィーシステム１９０の流路内の代替の位置に導入されている。図７ａ及び図７ｂのシステム１９０では、注入バルブ２２０の入口ポートに接続された出口ポートを備えるバルブ２１５が注入バルブ２２０の前の流路に導入されている。ミキサー２１０は、バルブ２１５の構成要素ポートの１つと注入バルブ２２０の第２入口ポートとの間に接続される。バルブ２１５の他の構成要素ポートは、出力選択バルブ２７０の出口ポートに接続される。さらに、図７ａ及び図７ｂでは、ループバルブ３００は、注入バルブのそれぞれの出口及び入口に接続される。開示されている実施形態では、ループバルブ３００に接続された８つのサンプルループ３１０が示されており、それぞれが、本分野の一般的な方法による後段の精製のためのサンプル体積を捕集することができる。代替の実施形態では、ループ機能は注入バルブ２２０に組み込まれてもよい。図３と比較して、カラム選択バルブ２３０は、カラムＡ及びＢ２４０で示す２以上のカラムを流体流路に接続することができるバルブによって置き換えられる。

図７ａは、標的サンプルが流体流路に導入され、カラムＡ内で捕捉及び洗浄される第１精製ステップの概略を示し、液流が矢印で示されている。図９及び図１０に示される上述の例と同様に、初期の溶出のために、同じ構成が、任意選択で流路に接続されたミキサーと共に初めに用いられる。第１の標的サンプルがＵＶモニター２５０によって検出されるとき、バルブ２１５及び２７０が図７ｂに示すそれぞれの位置にシフトされ、これにより、溶出されたサンプルの流れを注入バルブ２２０に再導入するための平行な流路が作り出される。この再注入プロセスの間、バルブ２１５内及び注入バルブ２２０内の両方に２つの平行な流体流路があり、溶出されたサンプルの流れは、所望の分画がサンプルループ３１０内に捕集及び保管されるループバルブ３００の入口に導かれる。注入バルブ２２０内のバルブ流路の概略を図７ｂに破線で示す。前述の通り、サンプルループ３１０内に保管された溶出された分画は、引き続きカラムＢなどを用いてさらに精製されてもよい。

図５ａ〜図５ｄ及び図７ａ〜図７ｂの両方の実施形態は、汎用バルブ１０又は同様の能力を備えるバルブを用いて完全に自動化された２ステップ精製プロセスを実施する方法の例を示す。

上述のクロマトグラフィー構成の構成要素の一部が再配列され、別の構成要素がいくつか加えられる別の実施形態では、複数の細胞培養供給などからタンパク質などの複数の標的分子を直接、別個に精製することができる完全に自動化された２ステップ精製システムを提供することが可能である。

この実施形態は、手作業の量の削減及び処理時間短縮のためのタンパク質精製の並列化の両方が可能な、高い堅牢性及び信頼性が組合せられたシステムを提供する。一実施形態では、システムは、限られた手動操作で設定され、次に、さらに手動で操作することなく自動で、かつ完全に無人で互いに隔離された複数のタンパク質を精製してもよい。システム構成はさらに、分析、調製、さらには治療の目的のために数種の異なるタンパク質が互いに分離、精製される大規模な生物製剤の製造において用いられてもよい。

一実施形態では、清澄でない複数の抗体供給など、例えば、全細胞を含む（ｍＡｂ又はポリクローナル）からの標的分子の自動化された直接精製を可能にするシステム構成が提供され、そのそれぞれの供給源からの各標的分子の精製は、同じ精製ユニットが順番に用いられても隔離され続け、他の供給源の成分による汚染が避けられる。システムは、親和力に基づく他の技術に適用可能であってもよい。本発明の実施形態では、１つを超える標的分子、例えば、（ｍＡｂ又はポリクローナル）を無人で精製することが可能である。いくつかの実施形態では、システム構成により、複数の標的分子、例えば、（ｍＡｂ又はポリクローナル）供給の２ステップ精製及び分画が無人で可能になる。

さらに、複数のｍＡｂ供給精製が連続的に進行するための複数の自動化された安全機構が提供されてもよい。

図８に概略が開示されている一実施形態では、供給源４０６ａ〜ｅからの標的分子を精製するための複数の隔離された多段階精製サイクルを実行するよう配列された
・システム４００の構成要素を制御するための命令を格納するメモリ（図示せず）を備えるシステムコントローラ４０１、
・精製ステップに各々対応する２以上の精製セクション４１０、４１５、４２０、
・精製を進めるための１以上のポンプ４２５、
・２以上のバルブ４０７、４１１ａ、ｂ、４２１ａ、ｂを備える、システム４００内の流体流を制御するためのバルブ配列を備える自動化された多段階クロマトグラフィー精製システム４００が提供され、
精製セクション４１０の１つは、２以上の捕捉カラム４１２ａ〜ｃを備える捕捉セクションであって、バルブ配列４１１ａ、ｂは、各捕捉カラムを
・それぞれの標的分子を捕捉するために、供給源４０６ａ〜ｅの１つにカラムを流体接続する捕捉流路と、
・捕捉された標的分子を後段の精製ステップへ溶出するとともに、後段の捕捉段階のためにカラム４１２ａ〜ｃを調製するための溶出液流路と
に交互に接続するように配列され、捕捉セクション４１０に続く精製セクション４１５又は４２０の少なくとも１つは、捕捉カラムの数よりも少ない数の溶出液精製流路を備え、各溶出液精製流路は精製カラム４１７又は４２２ａ、ｂを備えていて、捕捉セクションからの溶出液流は、後段の精製を隔離し続けるために溶出液精製流路内で中間洗浄により連続的に精製され、
各精製セクションは、中間サンプル保管構成要素なしで後段の精製セクションと直接流体連絡している。

図８に開示されている自動化された多段階クロマトグラフィー精製システム４００は、本発明の主概念をより明確に開示するために非常に簡略化されており、システムを実施するためにどの特徴及び構成要素が必要になるかを当業者なら容易に理解するであろう。図９などを参照して、さらに詳しい実施形態を示す。自動化された多段階クロマトグラフィー精製システム４００の主な特徴の１つは、限られた数のシステム構成要素及び精製ユニット（例えば、クロマトグラフィーカラム）を用いて、それぞれの供給源４０６ａ〜ｅからの標的分子を非常に効率的に精製するための複数の多段階精製サイクルを自動的に実行する一方、サンプル間の汚染を避けるために、システムによって処理された先の供給の他の分子又は成分から各標的分子を依然として隔離し続けるよう配列されていることである。本発明の文脈において、隔離という用語は、クロストーク又は相互汚染を避けるための特定の応用に必要な任意の程度の化学的な隔離を指し、異なる応用においては異なっていてもよい。さらに、本発明によるシステムは、先行技術において一般に用いられるサンプルループなどのいかなる中間サンプル保管構成要素もなく、自動化された多段階精製を実施するよう配列されることに留意されたい。その代わり、各精製セクションは、後段の精製セクションと直接流体連絡している。

システムコントローラ４０１は、例えば、コンピュータ、タブレット端末、組み込み処理装置など、自動化の分野において一般に用いられる任意のタイプのコントローラでもよい。本明細書に提示のフロースキームに従ってシステムを制御するために、システムコントローラ４０１は、システム４００の構成要素を制御するための命令を格納するメモリ（図示せず）を備え、メモリは、利用できる従来の任意のメモリでもよい。システムコントローラ４０１は、電線、無線など、図８に破線で示す任意の適した手段によってシステムの構成要素に接続され、さらに、遠隔記憶装置、コンピュータなどの周辺装置に接続されてもよい。図８の多段階クロマトグラフィー精製システム４００には３つの精製セクション４１０、４１５、４２０があるが、述べた通り、多段階精製は、２つから複数の異なる、又は同様の精製セクションを備えてもよく、セクションのそれぞれは、上に開示されている通りの当業者によって理解される精製ステップに相当してもよい。図８には、精製を進めるための単一のポンプ４２５の概略が開示されているが、本発明の異なる例では、特定の構成に従って自動化された動作をもたらす任意の適した数のポンプが必要に応じて存在することがある。同様に、システム４００内の流体流を制御するための限られた数のバルブ（バルブ４０７、４１１ａ、ｂ、４２１ａ、ｂ）を備えるバルブ配列の概略も示されており、任意の適した数又はタイプのバルブが存在してもよい。いくつかの実施形態では、いくつかの流体制御プロセスの組み込まれた機能を提供することができるマルチポートバルブが備えられてもよい。

本発明の実施形態では、精製セクション４１０の１つは、上述の通り２以上の捕捉カラム４１２ａ〜ｃを備える捕捉セクションであり、捕捉ステップは、異なるクロマトグラフィー技術の範囲で実施されてもよい。一実施形態では、捕捉カラムは、関心のあるタンパク質を捕捉するよう配列されたアフィニティークロマトグラフィーカラムである。捕捉カラムに適した捕捉媒体の選択並びに後段の精製セクションの選択は、本分野の一般的な方法に従って行われ、例えば、上述のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのハンドブックに開示されている。ハイスループットを達成するために、１つのカラムに捕捉された標的分子が溶出されてもよい一方、別のカラムでその後の標的分子が捕捉されるように、又は別のカラムが現場洗浄され、平衡化されるなどするように、２以上の捕捉カラム４１２ａ〜ｃが交互に用いられる。述べた通り、標的分子が汚染されないようにするため、各捕捉カラムは、現場洗浄プロセス及び平衡プロセスにより、後段の捕捉段階のために調製され、後段の精製を隔離し続ける。このようなプロセスは、それ自体当技術分野において既知である。

捕捉ステップは、その後のステップよりも時間がかかることが多く、関与する異なる段階、例えば、捕捉、溶出及び洗浄はすべて、順番に実施される必要があるため、開示されている実施形態では、一般的に、後段の精製セクションの流路の数と比べて、捕捉カラムを備えた捕捉流路がさらに多く存在する。しかし、同様にその後のセクションは、特定の精製タイプのセクションの特性及び関与する処理時間に応じて複数の流路を有してもよい。したがって、本発明は、一般的な用語では、複数のサンプル供給を処理する全サイクルタイムを削減することが可能であるとき、部分的に並列化されたセクションを提供することにより、多段階精製プロセスの効率を最適化する新規の方法を提供する。したがって、図８に概略を示す実施形態では、捕捉セクション４１０に続く精製セクション４１５及び４２０は、捕捉カラムの数よりも少ない数の溶出液精製流路を備える。

一実施形態では、精製セクションの１つは、１以上のゲル濾過カラムを備えるが、上で論じた通り、他のカラムタイプが選択されてもよい。

一実施形態では、図９から図１５の実施形態に関してさらに詳細に論じる通り、システムは、供給源及び捕捉セクションの間に配列された供給フィルターセクションを備えてもよく、供給フィルターセクションは、各供給流のための清浄なフィルターを選択的に導入するよう配列される。供給流の濾過に適したフィルターを備えると、清澄でない細胞培地又は溶解物をシステムに直接供給することにより、本発明による多段階精製プロセスを実行できるようになることが明らかになっている。

一部のタイプの精製ステップは特定の緩衝特性を必要とするため、溶出流の１以上の緩衝液パラメータを後段の精製セクションに適した条件に変えるために、コンディショニング流を溶出液流に供給するよう配列された溶出コンディショニング供給源をシステムに備えてもよい。その後のすべてのステップを、例えば、緩衝特性のコンディショニングによる可能性のある沈殿物から保護するために、システムは、溶出コンディショニング供給源及び後段の精製セクションの間に配列された溶出液フィルターセクションを備えてもよく、溶出液フィルターセクションは、各溶出流のための清浄なフィルターを選択的に導入するよう配列される。システムはさらに、精製プロセスの状態の入力を行うために、システムコントローラに接続された１以上のセンサーを備えてもよく、センサーは、ｐＨセンサー、伝導度センサー、ＵＶ吸収センサー、空気センサーなどの群から選択される。

さらに、以下を備える自動化されたクロマトグラフィーシステムを用いて、供給源からの標的分子を精製するための複数の隔離された多段階精製サイクルを含む自動化された多段階クロマトグラフィー精製方法が提供される：
システムの構成要素を制御するための命令を格納するメモリを備えるシステムコントローラ、
精製ステップに各々対応する２以上の精製セクション
（精製セクションの１つは、２以上の捕捉カラムを備える捕捉セクションであり、
捕捉セクションに続く精製セクションの少なくとも１つは、捕捉カラムの数よりも少ない数の溶出液精製流路を備え、各溶出液精製流路は精製カラムを備え、
各精製セクションは、中間サンプル保管構成要素なしで後段の精製ステップと直接流体連絡している。）、
精製を進めるための１以上のポンプ、及び
システム内の流体流を制御するための２以上のバルブを備えるバルブ配列。

方法は、
各捕捉カラムを
それぞれの標的分子を捕捉するために、供給源の１つにカラムを流体接続する捕捉流路と、
捕捉された標的分子を後段の精製ステップへ溶出するとともに、後段の捕捉段階のためにカラムを調製するための溶出液流路とに交互に接続する工程と、
標的分子を隔離し続けるためにその後の各精製の前に各溶出液精製流路が洗浄される溶出液精製流路内で、捕捉セクションからの溶出液流を連続的に精製する工程とを含む。

図９は、細胞培養などからタンパク質などの標的分子を直接精製することができる、このような自動化された２ステップ精製システム５００の概略図を示す。図８の実施形態の以下の説明では、ｍＡｂ供給からｍＡｂを精製するためのシステムが開示されているが、述べた通り、ｍＡｂは、２ステップ以上のクロマトグラフィー精製によって精製することができる任意の標的分子でもよい。

この構成には、２つの独立した流れが含まれる。
・捕捉流（実線の流路）。例えば、アフィニティーカラムにｍＡｂを捕捉するためにｍＡｂ供給を進める。
・溶出流（点線の流路）。捕捉ステップからのｍＡｂの溶出を進め、例えば、ゲル濾過カラムに負荷する。用いられるカラムのゲル濾過及びＣＩＰ。

捕捉動作及び溶出流の両方を同時に実行するために、２つの捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂが用いられ、これらは、２つの捕捉カラムバルブ５９０及び６００それぞれ（例えば、図６ａ及び図６ｂに開示されているバルブ１０であるが、他のバルブも等しく有用であることがある。）によって、２つの流路間で切り替えることができる。２つのバルブは、供給の負荷又はｍＡｂの溶出のために用いられることになる２つの捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂの１つを制御するために用いられる。２つの並流構成を扱うバルブ１０の能力によって、これが可能になる。代替の実施形態では、開示されている実施形態では２つのバルブによって提供される対応する機能を提供するよう配列される１つの多機能バルブが提供される。

２つの流路の説明。

捕捉流（実線の流路）。

構成のこの部分の目的は、無人で連続して隔離される形で未処理の抗体供給を取り入れ、これらをアフィニティーカラムに負荷して、関心のある標的分子を捕捉カラムに結合させることである。別の目的は、複数の供給の処理を可能にすることであり、これは以下によって実現される：第１に、使用する供給を選択し、また、容器が空のとき、及び空気がシステムに入ったときに検知することができる入口バルブを用いる。第２に、複数のフィルターを扱い、各供給を新しいフィルターに導くことができるカラムバルブを用いる。カラムバルブは、差圧（ｄｅｌｔａ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を見ることによってフィルターの状態をモニターするためにも用いられる。

図８に開示されている自動化された２ステップ精製システム５００の捕捉流セクションは以下を備える：
・未処理のｍＡｂ供給が入った４つのｍＡｂ供給容器５２０ａ〜ｄ。
・以下のために配列された４以上の入口ポート及び１つの出口ポートを備える捕捉流入口バルブ５３０：
ｏ使用するｍＡｂ供給容器５２０ａ〜ｄを選択
・以下のために配列された空気検出器５４０
・緩衝液への変更をトリガーする。
・流路に入る空気を洗い流す。
・緩衝液で洗浄する
・以下のために配列された捕捉流ポンプ５５０：
ｏそれぞれのｍＡｂ供給容器５２０ａ〜ｄからのｍＡｂ供給を捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂへポンプで送る
・未処理のｍＡｂ供給を濾過するために配列され、かつバルブ捕捉流入口バルブ５３０による新しいｍＡｂ供給容器５２０ａ〜ｄの選択に応答して新しいフィルター５７０ａ〜ｄの選択を可能にするために配列されたフィルター選択セクション５７５。

ｏｍＡｂ供給を濾過するときに使用するフィルター５７０ａ〜ｄを選択できるよう配列された２つのフィルター選択バルブ５６０及び５８０を備える。
・ｍＡｂ供給１回あたり１つのフィルターを用いる（１回の使用）。

ｏ一実施形態では、フィルターセクションは、フィルター前後の圧力を測定して、例えば、フィルターの状態を診断するために用いられてもよいフィルターの差圧を与えるよう配列された圧力センサー（図示せず）を備える。
・捕捉カラムセクション５１５は以下を備える：
ｏ２つの捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂ
ｏ捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂの入力端に接続され、かつ捕捉及び溶出それぞれのためにどちらの捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂを用いるかを選択するよう配列された第１捕捉カラムバルブ５９０。図８から明らかであり、かつ以下でさらに詳細に開示されるように、２つのカラムの１つが捕捉流位置で接続されるときに、他のカラムが溶出流位置で接続されるように第１捕捉カラムバルブ５９０は配列される。

ｏ第１捕捉カラムバルブ５９０と、各捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂとの間に接続され、捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂの上向流、下向流又はバイパスを可能にする、図２ａから図２ｄに開示されている任意選択のカラム制御バルブ（一例を図９に示す）。

ｏ捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂのそれぞれの出力端にそれぞれ接続され、並びに捕捉のために廃液出口に接続された捕捉カラム５１０ａ又は５１０ｂからの流れを導くよう配列され、かつ溶出のために溶出捕集流路（以下でより詳しく開示される。）に接続された捕捉カラム５１０ａ又は５１０ｂからの流れを導くよう配列された第２捕捉カラムバルブ６００。

ｏサンプルポンプ流は廃液に導かれる。
溶出流（点線の流路）。

流れのこの部分の目的は、無人で連続して捕捉カラム５１０ａ又は５１０ｂに捕捉された標的タンパク質を溶出し、緩衝液条件を調整し、凝集の可能性を検知し、溶出された標的タンパク質の濾過によりゲル濾過カラムを保護し、ゲル濾過を実施し、両方のカラムのカラムＣＩＰを実施することにより新たなラウンドのために調製し、これらのカラムを再平衡化することである。

溶出プロセスの間、適切な溶出緩衝液が溶出緩衝液供給源７１０ａ〜ｄに供給され、供給源は溶出選択バルブ７２０により選択される。溶出緩衝液供給源７１０ａ〜ｄは、例えば、以下のための流体を含んでもよい：
・洗浄捕捉
・溶出捕捉
・ゲル濾過
・ＣＩＰ
溶出選択バルブ７２０の出口は溶出ポンプ７３０に接続され、このポンプは、捕捉カラムセクション５１５の第１捕捉カラムバルブ５９０の溶出入口に溶出緩衝液を供給し、これにより、溶出緩衝液は、捕捉された化学種の溶出のために、溶出流位置で接続された捕捉カラム５１０ａ又は５１０ｂに供給される。溶出プロセスの間、溶出流位置で接続された捕捉カラム５１０ａ又は５１０ｂの出口は、第２捕捉カラムバルブ６００により、溶出されたサンプルの第２ステップ精製を実施するよう配列された溶出精製セクション７６０に導かれる。さらに、システムに空気が入るのを防ぐ任意選択の空気センサー（図示せず）、及び、例えば、捕捉カラム及びゲル濾過カラム内の圧力をモニターするためのシステム圧力センサー（図示せず）が提供されてもよい。

溶出精製セクション７６０は、溶出流の緩衝液パラメータを調整するために、緩衝液供給源７５０から調整緩衝液を供給するための緩衝液調整ポンプ７４０の形態で溶出コンディショニング供給源を備える。開示されている実施形態では、調整緩衝液がＴ字路６１０で溶出流に導入され、これにより、溶出流と調整緩衝液が混合されるが、調整緩衝液は任意の適した方法で導入されてもよく、積極的又は受動的に混合されてもよい。調整緩衝液の流量は、生じる混合溶出流が第２精製ステップに望ましい特性を有するように制御される。一実施形態では、溶出は低ｐＨで行われ、緩衝液調整ポンプ７４０を用いてシステム流に緩衝液が導入され、これによりｐＨは、その後の第２精製ステップに望ましいレベルまで上昇する。調整緩衝液の導入は凝集体の生成をもたらす恐れがあるため、溶出精製セクション７６０は、第２精製カラム６８０（例えば、ゲル濾過カラム）を保護するため、調整後に導入される恐れのある凝集体を検知するためのセンサー６２０、及び流れ内の凝集体の検出に応答して凝集体フィルター６４０ａ〜ｄを溶出流に導入するためのフィルターバルブ６７０を備えてもよい。一実施形態では、センサー６２０は、多波長で吸光度をモニターすることができる多波長ＵＶモニターでもよい。例えば、モニタリングは、２８０ｎｍ及び６００ｎｍで実施されてもよく、これにより、２８０ｎｍで、溶出流中のタンパク質の存在をモニターし、６００ｎｍで、可能性のある凝集体によって引き起こされる光散乱をモニターする。

開示されている実施形態では、フィルターバルブ６７０は、ループ位置にフィルターを備えたループバルブであり、標的タンパク質が捕捉カラムから溶出され、同時にゲル濾過カラムに負荷される時間中、フィルターはインラインに配置される。一実施形態では、例えば、用いられるフィルターによって引き起こされる背圧の上昇を防ぐために、凝集体が検出されないとき、及び、凝集体などが生成するリスクがないプロセスステップの間、フィルター６４０ａ〜ｃをバイパスするようにフィルターバルブ６７０が配列される。一実施形態では、自動化されたプロセスの間、（例えば、ゲル濾過の形態の）第２精製の前に、緩衝液条件調整が終了し、捕捉カラムがオフラインにされ、溶出ポンプ７３０によって供給される緩衝液が変更される。ループバルブは、サンプルが捕捉カラムから溶出しており、同時にゲル濾過カラムに負荷されるときに、使用するフィルターを選択するために用いられる。一実施形態では、サンプル間の汚染を防ぐため、同じフィルターは、個々のｍＡｂ溶出のためだけに用いられ、すなわち、１回の使用である。ｍＡｂのピークがゲル濾過カラムに入ったときはフィルターがバイパスされる。

既に述べた通り、第２精製ユニット６８０は、捕捉カラムから溶出される化学種をさらに分離することができる任意の適したタイプのゲル濾過カラムでもよい。第２精製ユニット６８０の後、溶出される化学種の吸収の１以上の波長で吸光度をモニターできる第２ＵＶモニター、及び、関連する分画を、例えば、マルチウォールプレート７０５などの中に捕集するためのフラクションコレクター７００が備えられてもよい。例えば、モニタリングは、溶出流中のタンパク質の存在をモニターするために、２８０ｎｍで実施されてもよい。一実施形態では、インラインのゲル濾過カラム及び第２ＵＶモニターをオフラインにするために、図５ａ〜図５ｄに開示されているバルブ配列などによって、第２精製カラム６８０及び第１ＵＶモニター６２０が流体接続されてもよい。溶出されたｍＡｂの先頭がこのバルブに達するとき、ゲル濾過カラムはインラインにされ、ｐＨ調整が始まり、インラインプレゲル濾過フィルターがインラインにされる。溶出されたｍＡｂの末端がこのバルブに達するとき、ｐＨ調整が止まり、インラインプレゲル濾過フィルターがオフラインにされ、捕捉カラムがオフラインにされ、緩衝液の交換（ｃｈａｎｇｅ ｏｆｆ ｂｕｆｆｅｒ）が行われる。

さらに、システム５００は、例えば、伝導度のモニタリング又はｐＨのモニタリングなどのための任意の適したセンサーを備えてもよい。

システムはさらに、洗浄、コンディショニングなど、次の精製サイクルカラムＣＩＰ及び再平衡化などを開始するために、１つの供給容器５２０ａ〜ｄから別の供給容器への切り替えの間で、任意の必要な、又は所望のシステム調製サイクルを実施するよう配列される。開示されている実施形態では、このようなサイクルのほとんどが溶出セクションによって実施される。

図１のシステムと同様に、動作しているすべての構成要素が、システム内の液流を制御するためのポンプ及びバルブ、並びに流れをモニターするためのセンサー及びモニターに接続されたシステムコントローラ（図示せず）に接続される。

図１０には、図２ａ〜図２ｄに開示されているバルブ１０に基づく捕捉カラム選択バルブ配列の概略が開示されている。この配列には、第１捕捉カラムバルブ５９０と、各捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂとの間に接続され、捕捉カラム５１０ａ及び５１０ｂの上向流、下向流又はバイパスを可能にする、図２ａから図２ｄに開示されている別のカラム制御バルブ５９１ａ及び５９１ｂが備えられる。

図１１は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ｍｏｄｕｌａｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍに基づく自動化された２ステップ精製プロセスの流路配列の概略の例を示し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの製品モデルを参照する：
この構成には、２つの独立した流れが含まれる。
・サンプルポンプ流（青色の流路）。アフィニティーカラムにｍＡｂを捕捉するためにｍＡｂ供給を進める。
・システムポンプ流（緑色の流路）。捕捉ステップからのｍＡｂの溶出を進め、ゲル濾過カラムに負荷する。用いられるカラムのゲル濾過及びＣＩＰ。

この両方を同時に実行するために、２つの捕捉カラムが用いられ、２つの汎用バルブＶ９−Ｖカラムを利用して、供給の負荷又はｍＡｂの溶出のために用いられることになる捕捉カラムを決めることができる。これを可能にする２つの並流構成を扱えることがＶ９−Ｖの能力である。

２つの流路の説明。

サンプルポンプ流（青色の流路）。

構成のこの部分の目的は、無人で連続して未処理の抗体供給を取り入れ、これらをアフィニティーカラムに負荷して、関心のある標的分子を捕捉カラムに結合させることである。別の目的は、複数の供給の処理を可能にすることであり、これは以下によって実現される：第１に、使用する供給を選択し、また、容器が空のとき、及び空気がシステムに入ったときに検知することができる入口バルブを用いる。第２に、複数のフィルターを扱い、各供給を新しいフィルターに導くことができるカラムバルブを用いる。カラムバルブは、差圧を見ることによってフィルターの状態をモニターするためにも用いられる。
・未処理のｍＡｂ供給が入った容器。
・サンプルポンプ入口バルブＶ９−Ｓ
ｏ使用するｍＡｂ供給を選択
ｏ空気の検出
・緩衝液への変更をトリガーする。
・流路に入る空気を洗い流す。
・緩衝液で洗浄する
・サンプルポンプ
ｏｍＡｂ供給をポンプで送る
・カラムバルブＶ９−Ｃ
ｏｍＡｂ供給を濾過するときに使用するフィルターを選択。
・ｍＡｂ供給１回あたり１つのフィルターを用いる（１回の使用）。

ｏフィルター前後の圧力の測定。
・フィルターの状態を診断するために用いられるフィルターの差圧を与える。
・注入バルブＶ９−ｉｎｊ
ｏサンプル及びシステムポンプのためのポンプ洗浄命令の使用を可能にする。

ｏＶ９−Ｖ（１）の正しい入口に流れを導く
・汎用バルブＶ９−Ｖ（１）
ｏＶ９−Ｖ（１）を用いて、捕捉及び溶出のために使用されるカラムを選択する。
・汎用バルブＶ９−Ｖ（２）又はＶ９−Ｖ（３）
ｏカラムバルブとして動作し、上向流、下向流又はバイパスか判定する。汎用バルブＶ９−Ｖ（４）
ｏＶ９−Ｖ（４）を用いて、流れが廃液に進むか、システム流路に入るか選択する。

ｏサンプルポンプ流は廃液に導かれる。
・廃液の容器。
・サンプルポンプ流の終了。
システムポンプ流（緑色の流路）。

流れのこの部分の目的は、無人で連続してその捕捉された標的タンパク質を溶出し、緩衝液条件を調整し、凝集を伴う問題を検知し、溶出された標的タンパク質の濾過によりゲル濾過カラムを保護し、ゲル濾過を実施し、両方のカラムのカラムＣＩＰを実施することにより新たなラウンドのために調製し、これらのカラムを再平衡化することである。

溶出は、緩衝液を溶出緩衝液に変えるための入口バルブＶ９−Ａを用いて行われる。すべてのステップは、Ａ−システムポンプによって進められる。Ｂ−システムポンプは、溶出後に緩衝液条件を調整するために用いられる。溶出は低ｐＨで行われ、Ｂ−システムポンプを用いてシステム流に緩衝液が導入され、これによりｐＨが上昇する。これは、凝集体の生成をもたらす恐れがある。凝集体を検知するために、多波長で吸光度をモニターできるＵ９−Ｍが用いられる。２８０ｎｍ及び６００ｎｍでモニタリングが行われ、２８０ｎｍで、タンパク質の存在をモニターし、６００ｎｍで、凝集体によって引き起こされる光散乱をモニターする。

ゲル濾過カラムを凝集体から保護するために、フィルターを備えたループバルブが用いられ、我々の標的タンパク質が捕捉カラムから溶出され、同時にゲル濾過カラムに負荷される時間中、これらのフィルターはインラインに配置される。次に、用いられるフィルターによって引き起こされる背圧の上昇を防ぐために、このカラムはオフラインにされる。

ゲル濾過の前に、緩衝液条件調整が終了し、捕捉カラムがオフラインにされ、緩衝液の変更が行われる。Ａｆｔｅｒ ｆｏｌｌｏｗ ｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｅａｋ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｅ．
最後のカラムＣＩＰ及び再平衡化が実施される。
・捕捉洗浄のための緩衝液が入った容器。
・システムポンプ入口バルブＶ９−Ａ
ｏ使用する緩衝液の選択
・洗浄捕捉
・溶出捕捉
・ゲル濾過
・ＣＩＰ
ｏシステムに空気が入るのを防ぐ空気センサー
・システムポンプ
ｏ緩衝液をポンプで送る
・システム圧力センサー
ｏ捕捉カラム及びゲル濾過カラム内の圧力をモニターする
・注入バルブＶ９−ｉｎｊ
ｏサンプル及びシステムポンプのためのポンプ洗浄命令の使用を可能にする
ｏＶ９−Ｖ（１）の正しい入口に流れを導く
・汎用バルブＶ９−Ｖ（１）
ｏＶ９−Ｖ（１）を用いて、捕捉及び溶出のために使用されるカラムを選択する。
・汎用バルブＶ９−Ｖ（２）又はＶ９−Ｖ（３）
ｏカラムバルブとして動作し、上向流、下向流又はバイパスか判定する。
・汎用バルブＶ９−Ｖ（４）
ｏＶ９−Ｖ（４）を用いて、流れが廃液に進むか、システム流路に入るか選択する。

ｏシステムポンプ流はシステム流路に導かれる。
・インラインｐＨ調整
ｏシステムポンプＢ流を用いて流路にｐＨ調整緩衝液を導入する。

ｏ緩衝液は積極的又は受動的に混合される。
・ＵＶ及び可視のモニタリング。

ｏ２８０ｎｍ及び６００ｎｍの吸光度が測定される。
・２８０ｎｍで、タンパク質のピークに関する情報が得られる。
・６００ｎｍで、生成する恐れのある沈殿物に関する情報が得られる。
・ループバルブＶ９−Ｌ
ｏループバルブは、サンプルが捕捉カラムから溶出しており、同時にゲル濾過カラムに負荷されるときに、使用するフィルターを選択するために用いられる。
・ｍＡｂ溶出１回あたり１つのフィルターを用いる（１回の使用）。
・ｍＡｂのピークがゲル濾過カラムに入ったときはフィルターがバイパスされる。
・Ｘ入口バルブとして図示されている汎用バルブ。

ｏこのバルブは、インラインのゲル濾過カラム及び第２ＵＶモニターをオフラインにするために、汎用バルブとして用いられる。

ｏ溶出されたｍＡｂの先頭がこのバルブに達するとき、ゲル濾過カラムはインラインにされ、ｐＨ調整が始まり、インラインプレゲル濾過フィルターがインラインにされる。

ｏ溶出されたｍＡｂの末端がこのバルブに達するとき、ｐＨ調整が止まり、インラインプレゲル濾過フィルターがオフラインにされ、捕捉カラムがオフラインにされ、緩衝液の交換が行われる。
・伝導度のモニタリング
・ｐＨのモニタリング
・出口バルブＶ９−０
ｏフラクションコレクター、廃液又は出口１−１０に流れを導く
ｏピーク分画を扱う。
・クロマトグラフィーが行われた後、両方のカラムはＣＩＰが行われる。

図１２は、図９及び図１０に開示されている実施形態では実施される並列化されたワークフローを示す概略図である。この図において、上のカラムは、捕捉カラムＡから始まる流体流路を表し、下のカラムは、捕捉カラムＢから始まる流体流路を表す。この図では、以下の記号が用いられる：
・負荷供給１〜４＝＞供給源１〜４からの標的分子の捕捉。
・Ｗ＝＞緩衝液流供給による捕捉された標的分子の洗浄
・Ｅ＝＞溶出緩衝液供給による捕捉された標的分子の溶出
・ＣＩＰ＝＞捕捉カラムの現場洗浄
・ＣＩＰ／Ｅｑ＝＞ゲル濾過カラムの現場洗浄及び平衡化
図１２に示す通り、供給２からの標的分子の捕捉は、供給１の捕捉段階が終了するときなどと実質的に同時に開始される。開示されている例では、捕捉ステップの時間は他のステップに必要な総時間と等しく設定されているが、この時間は明らかに、異なる精製構成及びステップにおいては異なっていてもよい。

Claims (18)

1. 別々の供給源からの標的分子を精製するための複数の隔離された多段階精製サイクルを実行するよう配列された、自動化された多段階クロマトグラフィー精製システムであって、
   システムの構成要素を制御するための命令を格納するメモリを備えるシステムコントローラと、
   精製ステップに各々対応する２以上の精製セクションであって、該精製セクションの１つが、２以上の捕捉カラムを有する捕捉セクションである精製セクションと、
   精製を進めるための１以上のポンプと、
   システム内の流体流を制御するための２以上のバルブを備えるバルブ配列と
   を備えており、
   ２以上の捕捉カラム及びバルブ配列が、
   （ｉ）前記捕捉カラムの１つを、それぞれの標的分子を捕捉するために、別々の供給源の１つに捕捉流路を通じて接続し、
   （ｉｉ）捕捉された標的分子を前記捕捉カラムの別の１つから後段の精製ステップへ溶出液流路を通じて溶出するとともに、後段の捕捉段階のために溶出済みの前記捕捉カラムを調製する
   ように配列され、
   前記捕捉流路及び前記溶出液流路は、前記（ｉ）及び（ｉｉ）を同時に可能とする１つのバルブを共有し、
   捕捉セクションに続く精製セクションの少なくとも１つは、捕捉カラムの数よりも少ない数の溶出液精製流路を備え、各溶出液精製流路は精製カラムを備えていて、前記各捕捉カラムからの溶出液流は、後段の精製を隔離し続けるために溶出液精製流路内で該溶出液精製流路の中間洗浄により別々に精製され、
   各精製セクションは、中間サンプル保管構成要素なしで後段の精製セクションと直接流体連絡しているシステム。
2. 捕捉カラムがアフィニティークロマトグラフィーカラムである、請求項１に記載のシステム。
3. 精製セクションの１つが、１以上のゲル濾過カラムを備える、請求項１又は請求項２に記載のシステム。
4. 各供給流のための清浄なフィルターを選択的に導入するよう配列され、供給源及び捕捉セクションの間に配列された供給フィルターセクションを備える、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のシステム。
5. 溶出液流の１以上の緩衝液パラメータを後段の精製セクションに適した条件に変えるために、コンディショニング流を溶出液流に供給するよう配列された溶出コンディショニング供給源を備える、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のシステム。
6. 各溶出流のための清浄なフィルターを選択的に導入するよう配列され、溶出コンディショニング供給源及び後段の精製セクションの間に配列された溶出液フィルターセクションを備える、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のシステム。
7. 精製プロセスの状態の入力を行うために、システムコントローラに接続され、ｐＨセンサー、伝導度センサー、ＵＶ吸収センサー、空気センサーの群から選択される１以上のセンサーを備える、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載のシステム。
8. 後段の精製を隔離し続けるため、現場洗浄プロセス及び平衡プロセスによって、後段の捕捉段階のために捕捉カラムを調製するよう配列されている、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のシステム。
9. 溶出液精製流路の中間洗浄が、現場洗浄プロセス及び平衡プロセスを含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載のシステム。
10. 自動化クロマトグラフィーシステムを用いて、別々の供給源からの標的分子を精製するための複数の隔離された多段階精製サイクルを含む自動化された多段階クロマトグラフィー精製方法であって、自動化クロマトグラフィーシステムが、
    ・システムの構成要素を制御するための命令を格納するメモリを備えるシステムコントローラと、
    ・精製ステップに各々対応する２以上の精製セクションであって、各精製セクションが、中間サンプル保管構成要素なしで後段の精製ステップと直接流体連絡している、２以上の精製セクションが、
    ｉ．２以上の捕捉カラムを備える捕捉セクションを備え、
    ｉｉ．前記捕捉セクションに続く精製セクションの少なくとも１つが、捕捉カラムの数よりも少ない数の溶出液精製流路を備え、各溶出液精製流路は精製カラムを備えており、
    ・精製を進めるための１以上のポンプと、
    ・システム内の流体流を制御するための２以上のバルブを備えるバルブ配列と
    を備えており、当該方法が、
    （ｉ）捕捉流路を通じて各捕捉カラムの１つに標的分子を捕捉する工程と、
    （ｉｉ）溶出液流路を通じて、捕捉された標的分子を前記捕捉カラムの別の１つから溶出し、後段の捕捉段階のために溶出済みの前記捕捉カラムを調製する工程と、
    を含み、
    前記捕捉流路及び前記溶出液流路は、前記（ｉ）及び（ｉｉ）を同時に可能とする１つのバルブを共有しており、
    さらに、前記方法は、
    前記溶出液精製流路の１つにおいて、前記捕捉セクションからの各溶出液流を別々に精製する工程と
    標的分子を隔離し続けるためにその後の各精製の前に各溶出液精製流路を中間洗浄する工程と、
    を含んでいる、方法。
11. 捕捉カラムがアフィニティークロマトグラフィーカラムである、請求項１０に記載の方法。
12. 精製セクションの１つが、１以上のゲル濾過カラムを備える、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
13. 各供給流のための清浄なフィルターを選択的に導入するよう配列され、供給源及び捕捉セクションの間に配列された供給フィルターセクションを使用する濾過工程をさらに備える、請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 溶出液流の１以上の緩衝液パラメータを後段の精製セクションに適した条件に変えるために、コンディショニング流を溶出液流に供給するよう配列された溶出コンディショニング供給源を使用する工程をさらに備える、請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
15. 各溶出流のための清浄なフィルターを選択的に導入するよう配列され、溶出コンディショニング供給源及び後段の精製セクションの間に配列された溶出液フィルターセクションを使用する濾過工程をさらに備える、請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
16. クロマトグラフィーシステムが、精製プロセスの状態の入力を行うために、システムコントローラに接続され、ｐＨセンサー、伝導度センサー、ＵＶ吸収センサー、空気センサーの群から選択される１以上のセンサーをさらに備える、請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
17. 後段の捕捉段階のために捕捉カラムを調製する工程は、後段の精製を隔離し続けるため、現場洗浄プロセス及び平衡プロセスの実行を含む、
    請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
18. 溶出液精製流路の中間洗浄が、現場洗浄プロセス及び平衡プロセスを含む、請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。