JP5571552B2 - クロマトグラフィー法 - Google Patents
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Description
用語“供給液”は、分離されるべき2つまたはそれ以上の化合物を含有する液体のことをいう。この文脈において、用語“化合物”は、分子、化学的化合物、細胞などのいずれかの構成要素について、幅広い意味で使用される。
用語“再生”は本明細書中において、クロマトグラフィーにおいて再び有用であるようにするために、吸着材を処理するプロセスのことを意味する。このように、“再生”は、化合物の溶出としても知られる、結合された化合物の放出、ならびに適切な吸着バッファーを用いた再平衡化が含まれうる。以下において検討されるように、“再生”にはまた、適所でのクリーニング(cleaning in place;CIP)もまた含まれる可能性がある。
用語“フロープログラミング”は、供給液をクロマトグラフィーカラムに適用するあいだの、供給液流速の計画的な変化を意味する。
発明の詳細な説明
このように、第1の側面において、本発明は、供給液から少なくとも1つの標的化合物を分離するための方法に関し、この方法は、標的化合物の結合の後に少なくとも1つの吸着材を洗浄し、そしてこの吸着材からの洗浄液の排出物を続いて前記の洗浄により除去された標的化合物を結合させるために別の吸着材上を通過させる、疑似移動床式プロセス(simulated moving bed process)である方法である。洗浄液を移動させるこの吸着材は、都合よくは、標的化合物が何も未だ結合していない新しい吸着材である。結果的に、供給液がシステム中の別の吸着材に振り向けられる場合には常に、その吸着材は、結合した少量の標的化合物を既に有している。このように、本発明は、標的化合物の効率的な回収を可能にする。
(a) 少なくとも1つの標的化合物を含む供給液を、第1の吸着材を横断して通過させ、そして流出物を第1の吸着材から第2の吸着材へと移動させる工程;
(b) 供給液を第2の吸着材へと振り向け、そして洗浄液を標的化合物が結合した第1の吸着材を横断して通過させる工程;
(c) 洗浄液流出物を第3の吸着材へと移動させ、そしてその後第2の吸着材からの流出物を第3の吸着材へと移動させる工程;
(d) 第1の吸着材を再生させる工程;
(e) 供給液を第3の吸着材へと振り向け、そして洗浄液を標的化合物が結合した第2の吸着材を横断して通過させる工程;
(f) 洗浄液流出物を第1の吸着材へと移動させ、そしてその後第3の吸着材からの流出物を第1の吸着材へと移動させる工程;
(g) 第2の吸着材を再生させる工程;
(h) 供給液を第1の吸着材へと振り向け、そして洗浄液を標的化合物が結合した第3の吸着材を横断して通過させる工程;
(i) 洗浄液流出物を第2の吸着材へと移動させ、そしてその後第1の吸着材からの流出物を第2の吸着材へと移動させる工程;
(j) 第3の吸着材を再生させる工程;
(k) 工程(b)-工程(j)を繰り返す工程;
ここで、少なくとも1つの標的化合物を工程(d)、工程(g)および/または工程(j)において回収する;
工程を含む。
[図面の簡単な説明]
図1は、3クロマトグラフィーカラム周期的逆流(3C-PCC)システムを使用した、本発明の一態様のスキーム図を示す。
図3は、図1のシステムにおいて、3C-PCCシステムの操作のあいだのステージの一つのあいだの、供給液およびバッファー洗浄液のための流路を示す。
図5は、図1のシステムにおいて、AKTATM探索プラットフォーム(GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden)に基づく、本発明の3C-PCCの図を示す。
図7は、図1のシステムにおいて、本発明の3C-PCCシステム上での4.66全周期のあいだの、3つのカラム全てからの流出流における記録シグナルを示す。
実施例1
この実施例は、本発明による3カラム周期的逆流(3C-PCC)システムを使用した、プロテインAクロマトグラフィー樹脂上でのヒトポリクローナルIgGの精製のための連続的一次捕捉を示す。より具体的には、3つの1ミリリットルカラム(HiTrapTM)を、プロテインAクロマトグラフィー樹脂MabSelectTM(GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)を用いて詰めた。3カラム周期的逆流システム、3C-PCCに構成された特注改良版AKTAexplorerTM(GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)クロマトグラフィーシステム(図5)に対して、カラムを接続した。このシステムには、2つの独立したポンプ、3つのUV検出器、pH測定器および伝導率測定器、いくつかのロータリーバルブおよび流路分離器が含まれた。UV検出器は、カラムのそれぞれからの流出物が、UV検出器を介して通過されるように、配置された。各UV検出器からの吸収度、および廃棄物ラインで測定されたpHレベルおよび伝導率レベルを、UNICORNTMソフトウェア(GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)を用いて記録した。プロテインAカラムから溶出されたhIgGは、一つのプール中に回収された。
バッファーA:50 mMリン酸ナトリウム、150 mM NaCl、pH 7
バッファーB:0.1 Mクエン酸ナトリウム、pH = 3.5
バッファーC:50 mM NaOH
供給液:バッファーAに溶解した1.65 g/L Polynorm hIgG(Octopharm)
1.6 g/LのPolynorm hIgGを含有する400 mlの溶液を、上述した実験的3C-PCC設定中に連続的に供給する。精製されたhIgGを、飽和されたカラム中にバッファーBを適用することにより、このシステムから慎重に溶出した。図6において、1)第1のカラムへ供給液をローディングすること;2)第1のカラムと第2のカラムとを連続して接続すること;3)供給液を第2のカラム中に移動し、一方で第1のカラムを洗浄して第3のカラムへと移動させること;4)第2のカラムと第3のカラムとを連続して接続し、一方で供給液を適用すること;5)第1のカラムを再生すること;6)供給液を第3のカラムへと移動させ、そして第2のカラムを洗浄して第1のカラムへと移動させること;7)第3のカラムと第1のカラムとを連続して接続し、一方で供給液を連続して適用すること;8)第2のカラムを溶出すること;9)第2のカラムを再生すること;10)供給液を第1のカラムへと移動させ、一方で第3のカラムを洗浄して第2のカラムへと移動させること;からなる、起動時3C-PCCサイクルのあいだ、クロマトグラフィーカラムのそれぞれからの流出物において記録されたシグナルが示される。図6に示されるパターンの再現性は、図7に示し、ここで4.7周期の3C-PCCサイクルを示す14回の単回ローディングの間に記録されたUVシグナルが提示される。カラムのそれぞれからの流出物中のIgGの濃度を示すこのクロマトグラムは、図6および図7において示されるように、異なるUV検出器を使用して記録されたため、直接的には比較できるものではなかった。
この実施例は、本発明による3カラム周期的逆流(3C-PCC)システムを使用して、哺乳動物細胞培養上清からモノクローナル抗体(MAb)を精製するための、連続的一次捕捉工程を示す。より具体的には、本質的に実施例1において上述したように、3つの1ミリリットルカラム(HiTrapTM)を、MabSelectTMSuRe(GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)を用いて詰め、そして特注改良版AKTAexplorerTM(GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)クロマトグラフィーシステムに対して、カラムを接続した。
Claims (18)
- 供給液から少なくとも1つの標的化合物を分離するための疑似移動床式プロセス(simulated moving bed process)である方法であって、ここで、標的化合物の結合の後に少なくとも1つの吸着材を洗浄し、そしてこの吸着材からの洗浄液の排出物を続いて前記の洗浄により除去された標的化合物を結合させるために別の吸着材上を通過させ、
この方法は、連続して接続された3つまたはそれ以上の吸着材のうちの1またはそれ以上に対して、少なくとも1つの標的化合物を連続的に結合させ、そして標的化合物をこれら3つまたはそれ以上の吸着材から個別に溶出することを含み;結合の後、洗浄液を各吸着材を横断して通過させ、脱離された標的化合物および/または結合されなかった標的化合物を回収し、そしてその様な洗浄液の排出物を一連の吸着剤の次の次の吸着材に対して移動させ、洗浄した吸着材から標的化合物を溶出することによりこの標的化合物を回収する、前記方法。 - 以下の工程:
(a) 少なくとも1つの標的化合物を含む供給液を、第1の吸着材を横断して通過させ、そして流出物を第1の吸着材から第2の吸着材へと移動させる工程;
(b) 供給液を第2の吸着材へと振り向け、そして洗浄液を標的化合物が結合した第1の吸着材を横断して通過させる工程;
(c) 洗浄液流出物を第3の吸着材へと移動させ、そしてその後第2の吸着材からの流出物を第3の吸着材へと移動させる工程;
(d) 第1の吸着材を再生させる工程;
(e) 供給液を第3の吸着材へと振り向け、そして洗浄液を標的化合物が結合した第2の吸着材を横断して通過させる工程;
(f) 洗浄液流出物を第1の吸着材へと移動させ、そしてその後第3の吸着材からの流出物を第1の吸着材へと移動させる工程;
(g) 第2の吸着材を再生させる工程;
(h) 供給液を第1の吸着材へと振り向け、そして洗浄液を標的化合物が結合した第3の吸着材を横断して通過させる工程;
(i) 洗浄液流出物を第2の吸着材へと移動させ、そしてその後第1の吸着材からの流出物を第2の吸着材へと移動させる工程;
(j) 第3の吸着材を再生させる工程;そして
(k) 工程(b)〜工程(j)を繰り返す工程;
ここで、少なくとも1つの標的化合物を工程(d)、工程(g)および/または工程(j)において回収する;
を含む、請求項1に記載の方法。 - 供給液の振り向けが、バルブ手段により提供される、請求項1または2のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの吸着材が、クロマトグラフィー樹脂を詰められそして注入口および/または排出口にマルチポート手段を備えられたカラムである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 供給液の流速を調節して、各カラムの生産性を向上させる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 1またはそれ以上の追加の液体流の流速を調節する、請求項5に記載の方法。
- 洗浄工程を、異なるバッファーを用いて行う、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 各吸着材を、複数の洗浄工程により洗浄する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 連続して接続された少なくとも3つの吸着材を含み、各吸着材はカラム中に詰められたクロマトグラフィー樹脂であり、各吸着材に対して液体の注入および排出のための手段が備えられ、そして注入および排出のための該手段にはバルブ手段が備えられて、少なくとも3つの注入流ならびに少なくとも3つの排出流を付加することを可能し、該液体流は洗浄液流体を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法によって供給液から少なくとも1つの成分を分離するための液体クロマトグラフィーシステム。
- 各吸着材が、標的化合物の検出のための手段を備える、請求項9に記載のシステム。
- システムが、3つの吸着材を含む、請求項9または10に記載のシステム。
- 吸着材が、同種のクロマトグラフィー樹脂を詰められたクロマトグラフィーカラムなどの同一種の吸着剤である、請求項9〜11のいずれか1項に記載のシステム。
- 各吸着材の体積が>1リットルである、請求項9〜12のいずれか1項に記載のシステム。
- 各吸着材への注入流間でのバルブの切り替え、各吸着材からの排出流間でのバルブの切り替え、および/または少なくとも1つの液体流の流速を制御するポンプを調節するものである、請求項1〜8のいずれか1項に記載される方法を調節するためのコンピュータプログラム。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法における、クロマトグラフィー樹脂を詰められた既にパッキングされた少なくとも3つのクロマトグラフィーカラムの使用。
- カラムがイムノグロブリン−結合樹脂を詰められた、請求項15に記載の使用。
- カラムが、汚染物質−結合樹脂を詰められたものである、請求項15に記載の使用。
- 事前に詰められたクロマトグラフィーカラムが衛生的なものである、請求項15〜17のいずれか1項に記載の使用。
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