CN107249709B - 基于压力探测的自动化层析柱切换控制 - Google Patents

基于压力探测的自动化层析柱切换控制 Download PDF

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Abstract

本发明的某些实施例提供了一种用于监测柱中的层析介质的饱和水平的方法，该方法包括：测量未加载柱的入口处的第一压力；测量加载柱的入口处的第二压力；以及比较第一压力测量结果和第二压力测量结果来确定层析介质的饱和水平。本发明的实施例还提供了用于控制层析系统的相关方法，和用于控制周期逆流层析系统的方法，以及适合连同新颖方法使用的层析系统。

Description

基于压力探测的自动化层析柱切换控制
技术领域
本发明涉及一种用于确定层析柱的结合容量的方法、层析系统以及用于控制层析系统的方法。
背景技术
用于溶质的层析柱的结合容量是过程层析中的很重要因素。结合容量直接地影响层析步骤的生产率和成本。结合容量按照动态/穿透容量限定或限定为最大结合容量。动态容量取决于溶液流过装填有层析介质的柱所处的条件，诸如，限定为柱容积和供给流率之间的比率的停留时间。如果停留时间无限长，则最大结合容量代表柱的穿透容量。初始穿透容量限定为在溶质首次在流出物中探测到的时间点处由柱占有的结合溶质的量。穿透容量还可限定为给定穿透百分比下的容量，其中百分比代表以供给中存在的溶质的百分比表达的来自柱中的流出物中存在的结合溶质的量。根据此限定，最大结合容量将等于100%穿透下的穿透容量，即，没有更多溶质可结合至柱的点。因此，为了确定最大容量，穿透容量在不同的穿透水平下测量，其中该水平由样本加载期间在来自柱的流出物中测得的溶质的浓度的水平限定。通常，这些浓度由放置在流出物管线中的探测器连续地监测穿过的流中的信号来确定。这些浓度(信号)相对于时间(或加载的容积或质量)的图表称为穿透曲线。层析图上的穿透的位置和其形状关于多少溶质可结合在柱上，以及所有吸附位点多快溶质饱和。其还示出了在任何给定时间还有多少溶质可结合至柱。
存在杂质时的溶质的穿透结合容量是开发纯化规程时优化的最关键参数之一。由于杂质大多数具有与溶质类似的光吸收性能，故确定结合穿透容量是冗长且艰苦的工作。在典型的实验中，来自柱的流出物以一系列小部分收集，其随后使用高分辨率的技术(诸如HPLC)来针对溶质分析。因此，确定层析柱的结合容量是相当复杂的。在供给溶液浓度在供给施加到层析柱上期间随机变化的情况下，真实的穿透容量不可能测量到。如果一个人想要在最佳过程条件下操作柱，则后者是很重要的。例如，可示出在某些条件下，当所关心的溶质在柱流出物中达到其浓度的某一值(例如，其初始浓度的10%)时，获得捕集层析步骤的最大生产率。如果穿透容量根据上文描述的方法确定，而如果供给浓度或过程条件(包括流率和/或层析介质性能)以不可预计的方式随时间变化，则不可能在准确的10%穿透下终止柱的加载。
此外，在变化的过程条件下确定不同穿透水平的穿透容量在连续层析的情况下很重要。
在连续层析中，若干相同的柱以允许柱取决于方法要求而串联和/或并联操作的布置来连接。因此，所有柱都可在原则上同时运行，但方法步骤略微移位。程序可重复，使得各个柱在过程中加载、洗脱和再生若干次。相比于'常规'层析，其中单个层析循环基于若干连贯的步骤，诸如，加载、清洗、洗脱和再生，在基于多个相同的柱的连续层析中，所有这些步骤同时发生，但各自在不同的柱上。连续层析操作导致层析树脂的较好使用、减少处理时间和降低缓冲物要求，它们所有都有益于过程经济性。有时，连续层析称为模拟移动床(SMB)层析。模拟移动床层析是周期逆流过程的示例，因为包括该系统的所有层析柱都周期地同时沿与样本流相对的方向移动。柱的明显移动通过至/从柱的入口和出口流的适当再引导来实现。
Bishop等人("Simulated Moving Bed technology in BiopharmaceuticalProcessing"，Bischops, M.和Pennings, M., Recovery Biological Products XI,(2003) Banff, Alberta, Canada)公开了一种基于模拟移动床(SMB)技术的连续层析方法，其成功地用于利用蛋白A亲和树脂的实验室规模的IgG纯化。尽管实际上由SMB提供的多柱和多区域连续途径极大地提高过程效率，但SMB系统迄今并未用于大规模的cGMP生物制药生产，主要是因为从硬件和操作视角两者的系统复杂性。操作视角是特别受关注的，因为连续方法更复杂，且需要许多操作(步骤)来在很精确预先限定的时间点同时发生。相比于批量层析，解决过程可变性的安全因素的实施对于连续过程不是推荐的，因为按限定，它们依据只有对系统的输入没有可变性时才建立的稳态的假定来操作。
Heeter等人(Heeter, G.A.和Liapis, A.I., J. Chrom A, 711 (1995))提出了作为典型四区域SMB系统的备选的基于三柱周期逆流层析(3C-PCC)原理的方法。后来，Lacki等人("Protein A Counter-Current Chromatography for Continuous AntibodyPurification"，Lacki, K.M.和Bryntesson, L.M., ACS (2004) Anaheim, CA USA)描述了使用此3C-PCC系统来用于IgG吸附至MabSelectTM亲和树脂。该3C-PCC方法需要比典型四区域SMB系统较简单的硬件和较容易的操作，直接地降低与固定设备和系统维护相关联的成本。
实际上，模拟移动床技术已经在各种其他领域中使用了几十年。例如，US 3291726(Universal Oil Products)早在1966年就描述了用于石油化学工业的连续模拟逆流吸附过程。
历史上，可靠的连续过程的基本因素是：1)使用的柱的质量，且更具体是柱之间的类似性或甚至等同性，2)恒定的供给成分，以及3)硬件可靠性，更具体是由泵输送的恒定流率。如果柱不是相同的，则通常用于设计连续层析过程的理论计算将是不正确的，且设置有效且稳健的连续层析过程将变得很难。如果供给浓度和流率以非预期方式随时间变化，则同理适用。因此，对于以相同的柱扩大规模的考虑，系统中的可靠的泵是基本的。然而，为了获得可重复的结果，向柱装填层析介质很复杂。板的数目或其他装填性能的甚至很小的差异都可对最终结果具有巨大影响。此外，由于层析树脂的容量通常在树脂寿命/使用期间改变，故针对新鲜树脂选择的过程条件将不适用于已经使用若干次的树脂。如果供给溶液浓度也将变化，则设计将一直在其最佳值操作的有效连续层析过程将甚至更复杂。
最近，Bangtsson P.等人提供了一种探测层析柱变得饱和至将满足过程目标(例如，产量或生产率)的水平时的时间点的方法(US 20120091063)。在该方法中，饱和水平的探测基于加载柱之前和之后的来自供给和流出物的UV信号的比较。尽管已经证实该解决方案对于许多分离任务是稳健的，但对于产物浓度较低和/或杂质浓度较高的情况，该方法的高适用性可证实为受限的。需要的是开发一种可有效地监测无论是单柱设置还是多柱系统中的层析介质的饱和水平的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于确定和监测柱中的层析介质的饱和水平/结合容量的可靠和动态的方法。
因此，一方面，本发明提供了一种监测柱中的层析介质的饱和水平的方法，该方法包括：测量未加载柱的入口处的第一压力；测量加载柱的入口处的第二压力；以及比较第一压力测量结果和第二压力测量结果来确定层析介质的饱和水平。
在某些实施例中，通过连续测量第二压力，在层析过程期间连续地监测饱和水平。在某些实施例中，该方法还包括将压力差计算为层析过程期间的两个不同时间点处的第一压力和第二压力之间的差异；以及使用压力差来确定柱的饱和点(f)。
在某些实施例中，该方法还包括：分别测量来自未加载柱和加载柱的流出物管线的压力；以及通过利用来自流出物管线的对应压力调整第一压力和第二压力来生成未加载柱和加载柱的校正的压力；其中比较步骤比较校正的第一压力和第二压力。
在某些实施例中，该方法还包括：测量来自周期逆流PCC系统中的各个层析柱的第一压力和第二压力，以及与第一压力一起使用这些第二压力来在层析过程期间连续地确定PCC系统的不同层析柱的饱和水平。
本发明的另一个目的在于提供一种层析系统来实现确定和监测柱中的层析介质的饱和水平/结合容量的方法。因此，本发明的另一个方面提供了一种包括至少一个层析柱的层析系统，该系统还包括：适于在供给泵和该至少一个柱的入口之间测量供给管线处的第一压力和第二压力的第一探测器，其中第一压力针对未加载柱测量且第二压力针对加载柱测量；适于测量来自系统的第一柱的流出物管线处的压力的可选的第二探测器；以及连接到探测器上且适于基于比较第一压力和第二压力来确定第一柱的饱和水平的确定单元。
在某些实施例中，层析系统的确定单元适于在层析过程期间基于由第一探测器和/或第二探测器测得的压力来连续地确定该至少一个柱的饱和水平。在某些实施例中，确定单元进一步适于将压力差计算为层析过程期间的两个不同时间点处的第一压力和第二压力之间的差异；以及使用压力差来确定柱的饱和点。在某些实施例中，确定单元适于使用测得的压力来针对各个柱确定校正的第一压力和第二压力，其分别为来自供给管线的第一压力和第二压力减去流出物管线处的压力；以及比较校正的第一压力和第二压力。在某些实施例中，确定单元进一步适于将压力差计算为层析过程期间的两个不同时间点处的校正的第一压力和校正的第二压力之间的差异；以及使用压力差来确定柱的饱和点。
在某些实施例中，层析系统包括周期逆流系统中的至少两个柱，且还包括其他探测器，各个其他柱之后各一个探测器，各个其他探测器适于测量来自各个其他柱的流出物管线处的另一压力，各个探测器连接到确定单元上，确定单元适于在层析过程期间基于由第一探测器、第二探测器和其他探测器测得的压力连续地确定各个层析柱的饱和水平。
在某些实施例中，层析系统还包括控制单元，其连接到确定单元上，且适于在层析过程期间连续地监测确定的饱和水平，且取决于确定的饱和水平而实时控制不同层析过程步骤的开始和停止。
在本发明的一个实施例中，层析系统是周期逆流系统。
本发明的另一个目的在于提供一种用于控制层析系统的可靠和动态的方法。因此，一方面，本发明提供了一种用于控制包括至少一个柱的层析系统的方法，其包括以下步骤：根据本发明的某些方面确定该至少一个层析柱的饱和水平；以及根据确定的饱和水平来控制不同层析过程步骤的开始和停止。在某些实施例中，该方法特征在于，在层析过程期间连续地确定饱和水平，且根据确定的饱和水平实时控制不同层析过程步骤的开始和停止。
本发明的另一个目的在于提供一种用于控制周期逆流层析系统的可靠和动态的方法。因此，一方面，本发明提供了一种用于控制包括至少两个柱的周期逆流层析系统的方法，包括以下步骤：从系统中的各个柱测量代表未加载柱的第一压力；从系统中的各个柱测量代表加载柱的第二压力；根据本发明的某些实施例确定各个层析柱的饱和水平；以及取决于确定的饱和水平控制至柱以及柱之间的供给。
在某些实施例中，用于控制周期逆流层析系统的方法特征在于，在层析过程期间连续地确定饱和水平，以及取决于确定的饱和水平实时控制至柱以及柱之间的供给。
在某些实施例中，用于控制周期逆流层析系统的方法还包括，取决于确定饱和水平来控制供给泵和缓冲物泵的流率。
在某些实施例中，用于控制周期逆流层析系统的方法还包括，通过根据确定的饱和水平调整不同的柱应当在加载区域多久和处于哪个位置来补偿不同的柱性能和/或流率的任何差异。
附图说明
图1示意性地示出了根据本发明的包括一个层析柱和两个探测器的层析系统。
图2为根据图1的层析系统设计的比较从探测器获得的UV信号对压力信号的图表。
图3示意性地示出了根据本发明的包括四个探测器的三柱周期逆流(3C-PCC)系统。
图4a、b和c示意性地示出了图3的三个阀。
图5为比较从3C-PCC系统中的三个探测器获得的UV信号对压力信号的图表。实线：UV信号；虚线：压力信号。
具体实施方式
为了避开关于现有技术所述论述的困难，由本发明提供基于类反馈控制原理的实时控制算法。因此，用于在该过程的任何给定时刻评估不同的柱的状态的方法是特别关注的。例如，获知特定穿透水平下的层析柱的结合容量将允许一个人评估柱是否还可结合溶质以及在柱达到完全饱和之前还可结合多少溶质。类似地，从过程产量视角看首要关注的是获知是否达到初始穿透容量，因为在该点上，将在来自柱的流出物流中发现溶质，且如果不采取适当的动作，则将导致浪费，或将与其他非结合的成分收集在一起。
因此，本发明的实施例提供了一种基于监测饱和的柱上的压力降低和使用该信息来探测期望的穿透点而探测柱饱和水平或穿透的方法。这可通过(1)探测压力降低的确切值，或(2)探测随时间和/或施加的容积或质量变化的压力降低的变化速率来实现。本发明的另一个实施例提供了一种用于探测柱饱和水平或穿透的较简单的方法。因此，探测可基于将来自未加载柱的压力与加载柱的压力相比较。"未加载柱"意思是未加载待分离的样本或在目标化合物或杂质的任何穿透之前不久的相同的柱。备选地，"未加载柱"可为装填与分离柱相同类型的树脂且与相同的柱平衡缓冲物平衡的相同的柱。
图1示意性地示出了根据本发明的实施例的简单层析系统的一部分。该层析系统包括一个层析柱1。它还包括连接到层析柱1的入口端5上的供给管线3。待经过柱1的样本可穿过供给管线3加入。该系统还包括连接到相对端(即，层析柱1的出口端7)上的流出物管线9。经过层析柱1的样本可经过流出物管线9。层析系统包括沿供给管线3定位在某处(优选接近柱1的入口端5)的第一探测器11。第一探测器11适于探测供给管线中的信号。此外，层析系统包括第二探测器13，其沿流出物管线9定位在某处(优选接近柱1的出口端7)，且适于探测流出物信号。第一探测器11和第二探测器13适合为相同类型的探测器。在某些实施例中，第一探测器和第二探测器是压力传感器，即，测量样本的压力。压力传感器是公知的，且备选地可称为压力换能器、压力发射器、压力发送器、压力指示器、压强计和压力计等。其他可能类型的探测器测量UV、pH、传导性、光散射、荧光、IR或可见光。如果系统中的不同探测器不是相同类型的探测器，则探测到的信号在用于根据本发明的其他计算时需要关联。
此外，根据本发明，第一探测器11和/或第二探测器13连接到确定单元15上。该单元分析第一探测器11和第二探测器13中探测到的信号，以便确定层析柱的结合容量。
在本发明的另一个实施例中，相比于图1中所示的层析系统，该层析系统包括沿供给管线定位在某处(优选接近柱的入口端)的单个探测器。该探测器适于在层析过程期间探测供给管线中的压力信号，而不论是柱未加载时或是柱加载时。在某些实施例中，探测器是压力传感器。此外，探测器连接到确定单元上，确定单元分析探测器中探测到的信号，以便确定层析柱的结合容量和/或饱和水平。
在本发明的另一个实施例中，相比于图1和上文所示的备选层析系统，层析系统还可包括沿柱的供给管线定位在某处的另一个探测器。探测器适于探测与供给管线中的压力不同的信号。此外，层析系统包括另一个探测器，其沿流出物管线定位在某处，且适于探测除压力外的流出物信号。这些探测器可适合为相同类型的探测器。在某些实施例中，探测器测量UV、pH、传导性、光散射、荧光、IR或可见光。此外，这些探测器还连接到确定单元上。该单元分析探测到的信号，且与压力信号一起使用这些信号来评估层析柱的结合容量和/或饱和水平。
为了展示本发明的某些实施例，在图2，以示出一定时间内的信号强度的图表，示出了探测到的压力信号，且与UV信号相比较。图2示出了曲线，其代表：前柱UV信号(21，供给信号)、后柱UV信号(25，流出物信号)、和供给管线上测得的压力信号(28)。
曲线21和25用于确定代表供给中的产物的总浓度的UV值(27)。通过遵循21和25之间的差异的变化，一个人可监测来自柱的流出物流中的产物的浓度，且使用其计算柱中产物饱和的水平(US 20120091063)。供给信号21基本上是直线，因为供给样本在该情况下和在该时间窗口期间成分是恒定的。一旦样本中的一些经过柱1且进入第二探测器13定位之处的流出物管线9的通道，则流出物信号23在a点处将从零开始上升。信号然后将上升，直到其变平到稳定阶段25的点b。该稳定阶段25在供给中的所有非结合成分经过柱时上升。当信号23又开始上升时，穿透点c在稳定阶段25之后进一步限定。这是由于实际上，柱1中的层析介质开始变得饱和且应当结合在柱中的样本的部分中的一些开始穿透柱。当信号23接近信号21时，进一步限定穿透点d。该点限定为饱和点，且代表层析介质以样本的结合组分几乎完全饱和的时刻。
曲线28代表柱的供给施加期间在供给管线上测得的压力的变化。加载阶段期间的压力的稳定升高允许了使柱上和/或供给管线中测得的压力与以产物饱和的柱关联。压力曲线(28)还可用于探测来自柱的产物的各种穿透水平，例如由点e和f代表的水平，如使用US 20120091063中的deltaUV方法另外测得的那样(点c和d)。在一个实施例中，如果UV曲线是已知的，则压力曲线和UV曲线(25)的穿透部分之间的关联可建立。在另一个实施例中，压力的变化(曲线28)通过执行实验来与柱饱和水平关联，在实验中，柱加载不同量的产物，测量压力，且以从来自柱的流出物收集的小部分来确定产物的浓度。用于层析系统的测得的压力可例如取决于树脂的多孔性、树脂的颗粒尺寸、供给的粘性、柱的长度和宽度而改变。
根据本发明，在任何给定的时间点，可计算Deltasignal，其限定为例如在给定时间下测得的例如点(e)或(f)处的信号减去之前时间测得的信号(g)之间的信号差异。可计算Deltasignalmax，其限定为完全柱饱和下测得的信号减去样本施加开始(点g)处测得的信号。例如，该Deltasignal然后可用于限定饱和点和穿透点的适合水平。穿透点可适合限定为Deltasignalmax的某一预先限定的百分比，例如，1%-10%的范围或更适合是1%-3%的范围中的某处，且饱和点可适合限定为Deltasignalmax的某一预先限定的百分比，例如，60%-90%的范围或更适合是70%-80%的范围中的某处。在其他实施例中，穿透点可适合限定为Deltasignal的某一预先限定的水平。
确定穿透点和饱和点的该途径的一个优点在于这可自动地实时完成，且其独立于供给浓度。
在本发明的另一方面，结合容量(例如，穿透和饱和点)的这些确定用于自动地控制不同层析过程步骤的开始和停止，即，在已经达到某一穿透或饱和点水平时，控制系统可控制层析系统，以进行至下一个过程步骤，诸如，将柱流出物再引导至不同的收集点，或停止加载步骤和开始柱清洗步骤。
在本发明的另一方面，层析系统包括所谓的周期逆流(PCC)系统中的多于一个层析柱。在周期逆流系统中，大部分时间，供给经过串联连接的至少两个柱。该串联通常称为加载区域，柱加入加载区域/从加载区域除去分别基于串联的最后的柱和第一柱的预定穿透和饱和点。在图3中，示意性地示出了包括三个柱的根据本发明的此系统。本发明的益处在该示例中甚至更确切，因为PCC系统中的一个常见问题在于，为了能够得到有效的系统操作，用于系统中的柱需要尽可能相同，且供给成分和流率应当恒定，或至少其随过程时间的变化应当预先获知。利用本发明，柱结合容量和/或流率中的任何差异可通过根据确定的穿透和饱和点调整不同的柱应当在加载区域中多久以及处于哪个位置来补偿。
在图3中，供给泵31示为经由第一探测器33连接到第一阀组35上。缓冲物泵37也连接到该第一阀组35上。第一阀组35经由第一T阀41进一步连接到第一柱39的入口上。第一柱39的出口端通过第二探测器45连接到第二T阀43上。第一阀组35经由第二阀组49进一步连接到第二柱47的入口上。第二柱47的出口端经由第三探测器53连接到第三阀组51上。此外，第三T阀55连接在第二T阀43和第三阀组51之间。第三T阀55还连接到第四T阀57上，第四T阀57还连接到第一T阀41和第二阀组49上。由此，来自第一柱39的流出物可通过T阀43、55、57和阀组49引导至第二柱47的入口。
此外，第一阀组35经由第五T阀61连接到第三柱59的入口上。第三柱59的出口端经由第四探测器65连接到第六T阀63上。此外，第七T阀67连接在第三阀组51和第六T阀63之间。第七T阀67还连接到第八T阀69上，第八T阀69还连接到第二阀组49和第五T阀61上。由此，来自第二柱47的流出物可引导至第三柱59的入口。来自第三柱59的流出物可经由阀63、67、51、55、57和41引导至第一柱59的入口。第一阀组35的构造在图4a中示意性示出，第二阀组49的构造在图4b中示意性示出，且第三阀组51的构造在图4c中示意性示出。在这些图中，各组的四个框代表T阀(三通阀)。此外，根据本发明，第一探测器33、第二探测器45、第三探测器53和第四探测器65所有都连接到确定单元71上。确定单元适于使用来自探测器的探测到的信号来确定三个不同的柱的穿透和饱和点。确定单元71和所有阀组和T阀和泵进一步连接到控制单元73(所有连接都未在图中示出)上，控制单元73适于按照何时将柱从加载区域除去/将柱加入加载区域、改变流率、开始新清洗步骤等来控制层析系统。探测器33、45、53、65在一个实施例中是压力传感器。之前已经论述了可用于本发明的探测器的其他示例。
在本发明的一个实施例中，在图3的系统中执行的层析过程包括：
(a)利用第一探测器33连续地监测供给管线中、以及来自柱39、47、59(利用第二探测器45、第三探测器53和第四探测器65)中的每一个的流出物中的信号，且计算各个柱39、47、59的校正的信号；
(b)使包括至少一种目标化合物的供给经过第一吸附剂(第一柱39中的层析介质)，且在针对第一吸附剂测得的校正的信号(如上文关于图2描述的那样限定)达到预定值x1时，将来自第一吸附剂的流出物引导至第二吸附剂(第二柱47中的层析介质)；
(c)将供给再引导至第二吸附剂，且使清洗液体经过第一吸附剂，当针对第一吸附剂获得的校正的信号达到预定值x2时，目标化合物已经结合第一吸附剂；
(d)将清洗液体流出物引导至第三吸附剂(第三柱59中的层析介质)，且随后当针对第二吸附剂获得的校正的信号达到预定值x1时，将来自第二吸附剂的流出物引导至第三吸附剂；
(e)再生第一吸附剂；
(f)将供给再引导至第三吸附剂，且使清洗液体经过第二吸附剂，当针对第二吸附剂获得的校正的信号达到预定值x2时，目标化合物已经结合第二吸附剂；
(g)将清洗液体流出物引导至第一吸附剂，且随后在针对第三吸附剂获得的校正的信号达到预定值x1时，将来自第三吸附剂的流出物引导至第一吸附剂；
(h)再生第二吸附剂；
(i)将供给再引导至第一吸附剂，且使清洗液体经过第三吸附剂，当针对第三吸附剂获得的校正的信号达到预定值x2时，目标化合物已经结合第三吸附剂；
(j)将清洗液体流出物引导至第二吸附剂，且随后在针对第一吸附剂获得的校正的信号达到预定值x1时，将来自第一吸附剂的流出物引导至第二吸附剂；
(k)再生第三吸附剂；
(l)重复步骤(b)-(k)；
其中至少一种目标化合物在步骤(d)、(g)和/或(j)中收集。x1和x2的预定值分别代表穿透和饱和点。
在操作逆流系统时，本发明允许使用不同的柱，因为柱性能的任何差异可通过基于针对柱中的每一个测得的Deltasignal和Deltsignalmax自动地调整穿透和饱和切换点来补偿。其还允许了当供给浓度的非预期变化发生为供给浓度的任何变化时操作逆流系统，且因此加载到各个柱中的质量的变化可通过基于Deltasignal(其自动地补偿加载到柱上的目标量的变化)自动地调整穿透和饱和切换点来补偿。
在本发明的另一个实施例中，包括多于2个层析柱的层析系统可用于从源自灌注细胞培养的供给流的产物的直接捕集。对于本领域的技术人员，公知的是此流中的组分的浓度将随时间而变化，且在没有自动化控制算法的情况下，在没有由于错误地预先分配的再引导点而引起的产物的显著产物损失的风险的情况下，层析系统的操作将是不可能的。
示例
本示例仅出于示范性目的而提供，且不应当解释为限制如由所附权利要求限定的本发明。
该示例示出了用于使用根据本发明的三柱周期逆流(3C-PCC)系统(即，在该示例中，探测器是UV探测器或压力传感器)在蛋白A层析树脂上从包含MAb和宿主细胞蛋白的混合物纯化单克隆抗体(MAb)的连续主要捕集步骤。更具体而言，三个类似的柱装填有蛋白A层析树脂MabSelectTM SuRe LX(GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)。柱连接到ÄKTATM PCC(GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)层析系统上，该层析系统配置成三柱周期逆流系统3C-PCC，具有基于三个柱中的每一个之前和之后测得的UV或压力信号的连续比较的自动化控制功能。来自各个探测器的吸收率使用UNICORNTM软件(GEHealthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)记录。UNICORNTM还用于控制所有泵和阀。来自蛋白A柱MAb的洗脱剂收集在单个池中。
以下的单柱层析循环用作以连续方式操作三柱ÄKTAPCC系统的基础：a)与缓冲物A的5柱容积(CV)的柱平衡；2)加载有供给的柱；3)以5CV的缓冲物A的柱清洗；4)以1CV的缓冲物的柱清洗；5)以4CV的缓冲物C的柱洗脱；6)以2CV的缓冲物D的柱剥离；7)以3CV的缓冲物的柱CIP。所有步骤在0.94 mL/min流率下执行。
溶液的成分在以下给出：
缓冲物A：PBS缓冲物，pH7.4
缓冲物B：50 mM醋酸盐缓冲物，pH6
缓冲物C：50 mM醋酸盐缓冲物，pH3.5
缓冲物D：100 mM醋酸盐，pH2.9
缓冲物E：100 mM NaOH
供给：包含宿主细胞蛋白质的澄清的细胞培养流体中的~2.00 g/L MAb。
包含供给的几百毫升的溶液连续地供给到上文描述的实验性3C-PCC设置中。供给溶液的吸收率和压力由定位在供给管线中的第一探测器连续地测量。纯化的MAb通过将缓冲物B施加到饱和的柱来以离散方式从系统洗脱。饱和柱在洗脱步骤之前清洗。
图5示出了使用三柱周期逆流系统在蛋白A柱上连续捕集单克隆抗体期间获得的部分数据。如针对三个不同的加载循环测得的随UV信号变化的压力的对应变化得到很好记录。各个循环结束时的初始压力升高和压力降低由于关于PCC操作期间的相应流路的打开和闭合的系统配制效果。
尽管已经示出和描述了本发明的特定实施例，但本领域的技术人员将清楚的是，可进行变化和改型，而不脱离本发明的教导内容。前面描述和附图中阐释的主题仅为了说明提供而不作为限制。在基于现有技术以其适当的视角查阅时，本发明的实际范围旨在限定于以下权利要求中。

Claims (22)

1.一种用于监测柱中的层析介质的饱和水平的方法，所述方法包括：
测量未加载柱的入口处的第一压力；
测量加载柱的入口处的第二压力；以及
比较第一压力测量结果和第二压力测量结果以确定所述层析介质的饱和水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过连续地测量所述第二压力，在层析过程期间连续地监测饱和水平。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
分别测量来自所述未加载柱和所述加载柱的流出物管线的压力；以及
通过利用来自所述流出物管线的对应压力调整所述第一压力和所述第二压力来生成所述未加载柱和所述加载柱的校正的压力；
其中比较步骤比较校正的第一压力和第二压力。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将压力差计算为所述层析过程期间的两个不同时间点处的所述第一压力和所述第二压力之间的差异；以及使用所述压力差来确定所述柱的饱和点(f)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，测量来自周期逆流PCC系统中的各个层析柱的第一压力和第二压力，且与所述第一压力一起使用这些第二压力，以在所述层析过程期间连续地确定所述PCC系统的不同层析柱的饱和水平。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一压力和所述第二压力使用相同类型的探测器来测量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一压力和所述第二压力使用压力传感器来测量。
8.一种包括至少一个层析柱的层析系统，还包括：
第一探测器，其适于测量在供给泵和所述至少一个层析柱的入口之间的供给管线处的第一压力和第二压力，其中所述第一压力针对未加载柱测量，且所述第二压力针对加载柱测量；
可选的第二探测器，其适于测量来自所述系统的第一柱的流出物管线处的压力；以及
确定单元，其连接到所述探测器上且适于基于比较所述第一压力和所述第二压力来确定所述第一柱的饱和水平。
9.根据权利要求8所述的层析系统，其特征在于，所述确定单元适于在层析过程期间基于由所述第一探测器和/或所述第二探测器测得的压力而连续地确定所述至少一个层析柱的饱和水平。
10.根据权利要求8所述的层析系统，其特征在于，所述层析系统包括周期逆流系统中的至少两个柱，且还包括其他探测器，各个其他柱之后各一个探测器，各个其他探测器适于测量来自各个其他柱的流出物管线处的另一压力，各个探测器连接到所述确定单元上，所述确定单元适于在层析过程期间基于由所述第一探测器、所述第二探测器和其他探测器测得的压力而连续地确定各个层析柱的饱和水平。
11.根据权利要求8所述的层析系统，其特征在于，所有所述探测器是相同类型的。
12.根据权利要求11所述的层析系统，其特征在于，所述探测器是压力传感器。
13.根据权利要求9所述的层析系统，其特征在于，所述确定单元适于使用测得的压力来针对各个柱确定校正的第一压力和校正的第二压力，其分别是来自所述供给管线的所述第一压力和所述第二压力减去所述流出物管线处的压力；以及比较所述校正的第一压力和所述校正的第二压力。
14.根据权利要求13所述的层析系统，其特征在于，所述确定单元进一步适于将压力差计算为所述层析过程期间的两个不同时间点处的所述校正的第一压力和所述校正的第二压力之间的差异；以及使用所述压力差来确定所述柱的饱和点(f)。
15.根据权利要求8所述的层析系统，其特征在于，所述层析系统还包括控制单元，其连接到所述确定单元上，且适于在层析过程期间连续地监测确定的饱和水平，且取决于所述确定的饱和水平而实时控制不同层析过程步骤的开始和停止。
16.根据权利要求9所述的层析系统，其特征在于，所述确定单元进一步适于将压力差计算为所述层析过程期间的两个不同时间点处的所述第一压力和所述第二压力之间的差异；以及使用所述压力差来确定所述柱的饱和点(f)。
17.一种用于控制包括至少一个柱的层析系统的方法，包括以下步骤：
根据权利要求1确定至少一个层析柱的饱和水平；以及
根据确定的饱和水平来控制不同层析过程步骤的开始和停止。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，在层析过程期间连续地确定饱和水平，且根据确定的饱和水平而实时控制不同层析过程步骤的开始和停止。
19.一种用于控制包括至少两个柱的周期逆流层析系统的方法，包括以下步骤：
从所述系统中的各个柱测量代表未加载柱的第一压力；
从所述系统中的各个柱测量代表加载柱的第二压力；
根据权利要求6确定各个层析柱的饱和水平；以及
取决于确定的饱和水平来控制至所述柱以及所述柱之间的供给。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，在层析过程期间连续地确定饱和水平，且取决于确定的饱和水平而实时控制至所述柱以及所述柱之间的供给。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法包括，取决于所述确定的饱和水平来控制供给泵和缓冲物泵的流率。
22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法包括，通过根据所述确定的饱和水平调整不同的柱应当在加载区域中多久以及处于哪个位置来补偿不同柱性能和/或流率的任何差异。
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