KR101987400B1 - 다중 컬럼 크로마토그래피 방법에 대한 작동 결합 용량의 최적화 - Google Patents

다중 컬럼 크로마토그래피 방법에 대한 작동 결합 용량의 최적화 Download PDF

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Abstract

다중 컬럼 크로마토그래피(MCC) 방법에 대한 작동 결합 용량을 최적화하는 방법이 개시된다.

Description

다중 컬럼 크로마토그래피 방법에 대한 작동 결합 용량의 최적화 {OPTIMIZING OPERATING BINDING CAPACITY FOR A MULTIPLE COLUMN CHROMATOGRAPHY PROCESS}
본 발명은 다중 컬럼 크로마토그래피 방법에 대한 작동 결합 용량을 최적화하는 방법에 관한 것이다.
컬럼 크로마토그래피 분리는 전형적으로 유입구 및 배출구를 가지고, 샘플 유체 중에 존재하는 소망하는 분자(표적 물질)를 결합하기 위한 흡착제를 함유하는 컬럼을 이용하여, 유체가 컬럼을 통과할 때 상기 표적 물질이 결합되고, 상기 샘플 유체 중의 다른 분자들로부터 분리되도록 한다.
컬럼 크로마토그래피 싸이클은 차례로 수행되는 몇몇의 단계들을 수반한다. "로딩" 단계는 상기 샘플 유체(피드)가 유입구를 통과해 흐르도록 하는 것에 의해 컬럼을 로딩하여, 상기 피드가 흡착제와 접촉하고, 상당량의 표적 물질이 결합되도록 하는 단계를 수반한다. 상기 컬럼 내 흡착제에 결합되는 표적 물질의 양은 상기 컬럼의 결합 용량으로 지칭된다. 비결합된 표적 물질, 그리고 (오염 물질을 포함할 수 있는) 다른 분자들은, 유체와 함께 배출구를 통과해 흐른다. 상기 크로마토그래피 싸이클 내 다른 단계들은 예를 들어, 컬럼을 세척하는 단계, 표적 물질을 용출하는 단계, 흡착제를 재생시키는 단계, 및 컬럼을 평형화하는 단계를 포함한다.
다중 컬럼 크로마토그래피(MCC)는 직렬로 연결된 2 개 이상의 크로마토그래피 컬럼들을 로딩하는 단계를 수반하고, 여기서 피드 샘플은 (흡착제를 함유하는) 제1 크로마토그래피 컬럼의 유입구를 통과하여, 상기 제1 컬럼의 배출구를 통과하여, (흡착제를 함유하는) 제2 크로마토그래피 컬럼의 유입구로 들어가서, 상기 제2 컬럼의 배출구를 통과하고, 이는 연결된 컬럼의 개수에 따라 계속된다. 이는 상기 제1 컬럼이 과로드(over-loaded)되도록 하고, (그렇지 않으면, 분실되어 버려질 수 있는) 상기 제1 컬럼으로부터 흐르는 표적 물질이 이후의 컬럼에 의해 포착된다. MCC에서는, 싸이클 내 다른 단계가 다른 컬럼 상에서 수행되는 동안, 하나의 컬럼이 로딩될 수 있다. 제1 컬럼이 과로드되고, 상기 표적 물질이 제2 컬럼으로 넘어가는 경우, 이는 상기 과로드된 표적 물질이 제2 컬럼 내로 흐르는 것인 "제2 패스"로 지칭될 수 있다. 컬럼들의 수에 따라, 상기 과로드된 표적 물질이 제3 컬럼 내로 흐르는 제3 패스 등이 있을 수 있다. 완벽한 크로마토그래피 싸이클을 위해, 각각의 컬럼들이 각각의 단계들, 예를 들어, "제2 패스"(이전의 컬럼으로부터의 과로드), "로드"(컬럼 내로 직접 로딩된 피드), 세척, 용출, 재생, 및 평형화를 거쳐 진행되어야 한다.
그러나, MCC는 복잡하고, 향상된 MCC 방법 개발을 위한 요구가 있다.
일 구현예에서, 다중 컬럼 크로마토그래피(MCC) 방법에 대한 작동 결합 용량을 최적화하는 방법으로서, (a) 표적 물질을 제1 체류 시간 및/또는 제1 유량으로 컬럼 상에 로딩하는 단계; (b) 상기 표적 물질을 제2 체류 시간 및/또는 제2 유량으로 컬럼 상에 로딩하는 단계로, 상기 제1 체류 시간 및/또는 제1 유량은 제2 체류 시간 및/또는 제2 유량과 상이한 단계; (c) 상기 제1 체류 시간 및/또는 제1 유량과 제2 체류 시간 및/또는 제2 유량에 대한 파과 곡선(breakthrough curves)을 발생시키는 단계; 및 (d) 상기 MCC 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 전형적으로, 상기 제2 체류 시간은 제1 체류 시간의 약 2 배이고 및/또는 상기 제2 유량은 제1 유량의 약 1/2 배이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 (b') 상기 표적 물질을 제3 체류 시간 및/또는 제3 유량으로 컬럼 상에 로딩하는 단계로, 상기 제3 체류 시간 및/또는 제3 유량은 제1 및 제2 체류 시간 및/또는 제1 및 제2 유량과 상이한 단계; (c') 상기 제1 체류 시간 및/또는 제1 유량과 제2 체류 시간 및/또는 제2 유량과 제3 체류 시간 및/또는 제3 유량에 대한 파과 곡선을 발생시키는 단계; 및 (d) 상기 MCC 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량을 결정하는 단계를 더 포함한다. 전형적으로, 상기 제3 체류 시간은 제1 체류 시간의 약 3 배이고 및/또는 상기 제3 유량은 제1 유량의 약 1/3 배이다.
다른 구현예에서, 다중 컬럼 크로마토그래피(MCC) 방법에 대한 작동 결합 용량을 최적화하는 방법은 (a) 2 개 이상의 동일한 크기의 컬럼들을 직렬로 연결하는 단계; (b) 표적 물질을 일정한 유량으로 상기 컬럼들 상에 로딩하여, 상기 컬럼들을 통과하는 예정된 체류 시간을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 MCC 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량을 결정하는 단계를 포함한다.
도 1a, 1b, 및 1c는 단일 MCC 크로마토그래피 싸이클 중에 3 개의 컬럼들을 통과하는 흐름("로드", "제2 패스", 및 "휴지(rest)")을 도표로 나타낸다(여기서, "휴지"는 세척, 용출, 재생, 및 평형화를 지칭함).
도 2는 실시예 1, 3, 6, 및 7에 기술된 UV 검출을 통해 발생한 예시적인 파과 곡선을 도시한다.
도 3은 실시예 2, 4, 5, 및 8에 기술된 분별 및 수량화를 통해 발생한 예시적인 파과 곡선을 도시한다.
도 4a는 예시적으로, 각각 UV 검출기에 연결된, 2 개의 상호 연결된 컬럼들을 도시하고; 도 4b는 각각의 검출기에 의해 생성된 예시적인 파과 곡선들을 도시한다. 이 곡선들은 마지막 컬럼 상에서 결과물 파과(product breakthrough)가 발생하기 전에 제1 컬럼에 결합된 양을 계산하기 위해 사용될 수 있고; 도 4c는 예시적으로, 체류 시간 및 컬럼의 개수들 간의 관계의 도해적인 표현을 도시한다.
도 5는 실시예 1 및 3 내지 7에 기술된 2 개 및 3 개의 컬럼들에 대한 예시적인 작동 결합 용량 대 총 체류 시간을 도시한다.
도 6은 실시예 1 및 3 내지 7에 기술된 2 개 및 3 개의 컬럼들에 대한 이론적인 생산성 대 총 체류 시간을 도시한다.
도 7은 실시예 2 및 8에 기술된 2 개 및 3 개의 컬럼들에 대한 예시적인 작동 결합 용량 대 총 체류 시간을 도시한다.
도 8은 실시예 2 및 8에 기술된 2 개 및 3 개의 컬럼들에 대한 이론적인 생산성 대 총 체류 시간을 도시한다.
도 9는 MCC 방법 전략을 선택하기 위해 사용 가능한 최적의 생산성을 제공하는 예측 모델을 도시하고, 상기 방법 전략 모델링은 단일 컬럼 상에서 수행되는 13 회의 포화 파과 실험들에서 발생한 파과 곡선들에 적용된다.
본 발명에 따르면, MCC 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량이 결정된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법의 일 구현예에서, 2 회 이상(전형적으로, 2 내지 12 회)의 로딩 실험이 상이한 체류 시간 및/또는 상이한 유량으로 단일 컬럼 상에 수행되어 상기 MCC 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량을 결정한다. 대안적으로, 다른 구현예에서, 2 개 이상의 동일한 크기의 컬럼들이 직렬로("데이지 체인 방식으로(daisy chained)") 배치되고, 흐름이 일정하게 유지되어 최적의 작동 결합 용량을 결정하기 위한 소망하는 체류 시간을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 컬럼은 항상 상기 표적 물질로 포화까지 로딩되어야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 컬럼의 배출구에서 10% 또는 20%의 파과를 얻는 것이 충분할 수 있다.
상기 방법의 구현예들은 파과에 대한 용출액 분획을 분석하는 것 또는 용출액 라인과 연결된 검출기를 사용하여 용출액 라인 내에 표적 물질의 존재를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
유리하게는, 결정된 최적의 작동 결합 용량은 MCC 방법에서, 일련의 컬럼들 중 마지막 컬럼의 파과 바로 직전에 제1 컬럼에 의해 결합된 표적 물질의 양을 나타낸다. 바람직하게는, (예를 들어, 다중-컬럼 방법에서 다양한 유량에 대한 로딩될 결과물의 최적 양과 같은) 작동 파라미터는 단일 컬럼 상에서 수행되는 몇몇 간단한 실험을 사용하여 결정될 수 있다. 작동 용량의 정확한 예측은, 많은 다른 다중-컬럼 방법 파라미터들, 예를 들어, 생산성, 싸이클 시간, 컬럼의 총 개수, 및/또는 버퍼 이용의 추정을 가능하게 한다. 다양한 유량의 이용은 체류 시간의 함수로서의 하나 이상의 관심 파라미터들을 최적화하기위해 맞춰지고(fit) 내삽될 수 있는 데이터 지점을 제공한다.
추가적인 이점은, 예를 들어, 상기 MCC 방법이 연성의 단백질의 급속한 처리 단계를 수반하는 경우, 사용자가 가장 빠른 처리 시간을 얻기위해 필요한 작동 파라미터들을 정확히 찾아낼 수 있는 것을 포함한다. 만일 시간이 덜 중요하고, 방법의 포커스가 설비 가동률(capacity utilization)인 경우, 설비 가동률이 최적화될 수 있다. 비용이 관심사인 경우, 비용을 최소화하기 위해, 공정 경제적인 소프트웨어가 이용될 수 있다. 소망되는 경우, 생물 약제학 생산 현장 내에서의 다중-컬럼 크로마토그래피 방법과 연관된 어떠한 것이라도 최적화될 수 있다.
일 구현예에서, 다중 컬럼 크로마토그래피(MCC) 방법에 대한 작동 결합 용량을 최적화하는 방법으로서, (a) 표적 물질을 제1 체류 시간 및/또는 제1 유량으로 컬럼 상에 로딩하는 단계; (b) 상기 표적 물질을 제2 체류 시간 및/또는 제2 유량으로 컬럼 상에 로딩하는 단계로, 상기 제1 체류 시간 및/또는 제1 유량은 제2 체류 시간 및/또는 제2 유량과 상이한 단계; (c) 상기 제1 체류 시간 및/또는 제1 유량과 제2 체류 시간 및/또는 제2 유량에 대한 파과 곡선을 발생시키는 단계; 및 (d) 상기 MCC 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 전형적으로, 상기 제2 체류 시간은 제1 체류 시간의 약 2 배이고 및/또는 상기 제2 유량은 제1 유량의 약 1/2 배이다.
일 구현예에서, 상기 MCC 방법은 N 개의 컬럼들을 포함하고, 상기 제1 체류 시간 및/또는 제1 유량은 단일 컬럼에서 결정되고, 상기 제2 체류 시간 및/또는 제2 유량은 N 개의 컬럼들에 걸친 체류 시간 및/또는 유량과 동일하다.
일 구현예에서, 상기 방법은 (b') 상기 표적 물질을 제3 체류 시간 및/또는 제3 유량으로 컬럼 상에 로딩하는 단계로, 상기 제3 체류 시간 및/또는 제3 유량은 제1 및 제2 체류 시간 및/또는 제1 및 제2 유량과 상이한 단계; (c') 상기 제1 체류 시간 및/또는 제1 유량과 제2 체류 시간 및/또는 제2 유량과 제3 체류 시간 및/또는 제3 유량에 대한 파과 곡선을 발생시키는 단계; 및 (d) 상기 MCC 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량을 결정하는 단계를 더 포함한다. 전형적으로, 상기 제3 체류 시간은 제1 체류 시간의 약 3 배이고 및/또는 상기 제3 유량은 제1 유량의 약 1/3 배이다.
다른 구현예에서, 다중 컬럼 크로마토그래피(MCC) 방법에 대한 작동 결합 용량을 최적화하는 방법은 (a) 2 개 이상의 동일한 크기의 컬럼들을 직렬로 연결하는 단계; (b) 표적 물질을 일정한 유량으로 상기 컬럼들 상에 로딩하여, 상기 컬럼들을 통과하는 예정된 체류 시간을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 MCC 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량을 결정하는 단계를 포함한다.
일 실시예로서 2 개의 컬럼 시스템을 사용하는 것은, 소망하는 경우, 방법의 초기 단계에서, 제1 로드 단계가 증가된 로드를 가질 수 있고, 여기서 상기 로드는, 제1 컬럼에 결합된 양(컬럼 "A" 내 양 "X") 및 제2 컬럼에 결합된 양(컬럼 "B" 내 양 "Y")을 나타내는 X + Y이다. 유리하게는, 이는 상기 시스템이 즉시 정상 상태에서 시작하도록 "강요"할 수 있어, 일부 방법에서 관찰될 수 있는 정상 상태로의 전이를 피할 수 있다.
본 발명을 이해하고, 도 1을 참조로 이용하기 위한 틀을 제공하기 위해서는, 각각의 컬럼이 동일하게 처리되고, 각각의 싸이클이 동일하도록 MCC를 정상-상태에서 작동하는 것이 바람직하다. 이는 생산성 및 결과물의 품질이 반드시 일정하게 유지되게 한다. 도 1에서, B 컬럼이 로드 존(load zone)의 밖으로 이동할 경우, 컬럼에 결합된 표적 물질의 양은 컬럼이 휴지 단계에 들어감으로써 시스템으로부터 제거된다(그리고 이후에 용출된다). 정상 상태에서의 작동을 위해, 상기 피드 샘플로부터의 동일한 양의 표적 물질이 다음 로딩 싸이클 내 시스템으로 돌아가서 추가되어야 한다. 이는 방법이 작동되는 결합 용량, 즉, 작동 결합 용량을 확인한다. 상기 작동 용량은 1 리터의 흡착제 당 결합된 표적 물질의 그램으로 정의된다. (제2패스를 받아들이는) 일련의 컬럼들 중 제2 컬럼이 결과물 파과 직전까지 로딩되는 경우, 이상적인 작동 결합 용량이 나타난다. 이상적인 작동 결합 용량에서 가능한 많은 표적 물질이 어떠한 결과물 손실도 없이 직접 피드 샘플 로드를 받아들이는 컬럼 내에서 결합될 것이다.
단일 컬럼을 통한 흐름과 그것의 상기 로드 존에서의 시간 이후에, 처음에는 컬럼(도 1a 내지 1c의 컬럼 A)이 일련의 컬럼들 중 제2 컬럼으로 출발한다. 그렇게, 상기 컬럼 A가 일련의 컬럼들 중 제1 컬럼, (직접 피드를 받아들이는) 로드 컬럼, 컬럼 B로부터의 통과액을 받아들인다. 처음에는 상기 로드 컬럼이 상기 표적 물질 전부에 결합하여, 컬럼 A 상의 로드(제2 패스)가 표적 물질을 함유하지 않을 것이다. 상기 로드 컬럼이 다가가고, 이후에 그것의 동적 결합 용량을 초과하면서, 표적 물질이 상기 로드 컬럼을 통과해 흐르기 시작할 것이다. 따라서, 상기 제2 패스 컬럼이 처음에는 농도 0의 결과물을 받아들일 것이나, 잠시 후에 상기 로드 농도는 점점 더 많은 표적 물질이 제1 컬럼을 파과할수록 증가하기 시작할 것이다. 이 상(phase)이 완료된 후에, 제2 패스 내에 있던 컬럼이 로드 컬럼이 되고, 그것은 직접 로드를 받아들인다. 상기 컬럼 상에 로딩된 표적 물질 농도는 상대적으로 높고 일정하다.
어떠한 표적 물질 손실도 없이, 가능한 많은 표적 물질을 로드 컬럼에 도포하는 것이 소망하는 바이다. 따라서, 제2 패스 컬럼(또는 2 개를 초과하는 일련의 컬럼들이 있다면, 일련의 컬럼들에 연결된 마지막 컬럼)으로부터의 표적의 파과 훨씬 이전에 로딩이 정지된다. MCC 방법 중 로드하는 양을 결정하는 것은 다중-단계 로딩, 즉, 컬럼이 직접 로드되기 이전에 제2 패스 중에 있을 것이기 때문에 복잡하다. 이는 어떤 작동 결합 용량에서 방법이 수행되어야 하는지 이해하는 것을 어렵게 한다. 상기 도전은 체류 시간 때문에 훨씬 더 복잡해진다. 체류 시간을 증가시키는 것은 용량을 증가시킬 수 있고, 체류 시간을 낮추는 것은 용량을 감소시킬 수 있다. 그러나, 체류 시간을 증가시키는 것은 컬럼 상의 유량을 늦추는 것에 의해 이루어지고, 이는 로드 단계의 증가된 시간을 요구한다.
생산성은 용량/싸이클 시간으로 이해될 수 있기 때문에, 증가된 용량을 야기하는 긴 체류 시간은 싸이클 시간 또한 증가시킨다. 발명자들은 이 2 개의 인자들, 용량 및 싸이클 시간이 둘다 체류 시간에 의해 영향을 받는다는 것을 깨달았고, 최적의 생산성에서 작동하기 위해 MCC 방법을 수행하기 위한 최적의 체류 시간이 있다는 것을 깨달았다. 본 발명자들은 놀랍고 뜻밖에도 이 다중-상 로드가 컬럼의 용량 상에 또는 컬럼으로부터의 표적 물질의 파과 상에 영향을 가지지 않았음을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 만약 컬럼들이 직렬로 연결된다면, (그리고 (컬럼들의 반대 방향의 움직임을 조절하기 위한 밸브 스위칭 없이) 곧바로 로드되어 포화된다면) 일련의 컬럼들 중 마지막 컬럼의 파과 바로 직전에 제1 컬럼에 의해 결합된 표적 물질의 양이 이상 작동 결합 용량이라는 것을 깨달았다. 상기 방법은 최적화된다: 더 많은 표적 물질을 로딩하면 표적 물질 손실을 야기하고, 더 적은 표적 물질을 로딩하면 최적의 컬럼 이용보다 낮은 이용을 야기한다.
하기의 정의는 본 발명에 의하여 사용된다.
회분식 크로마토그래피(batch chromatography) - 포화를 위해 단일 컬럼 상에 수행되는 전통적인 크로마토그래피 방법이며, 다중-컬럼 포착 방법에서 반복적으로 로딩된 (직렬로 연결된) 컬럼들의 결합 프로파일과 거의 동일한 컬럼 내 결합 프로파일을 생산하는 것.
결합 용량 또는 용량(binding capacity or capacity) - 1 밀리리터의 흡착제 당 결합된 표적 또는 결과물의 mg.
파과 곡선(breakthrough curve) - 컬럼의 유입구에서 유체가 로딩되는 동안 컬럼의 배출구에서의 결과물 농도의 플롯(시간, 로드된 질량, 또는 로드된 부피에 대하여 플롯될 수 있음).
파과 실험(breakthrough experiment) - 배출구에서 반드시 결과물 파과가 되어, 파과 곡선의 플롯이 얻어질 수 있도록 하기 위하여(컬럼은 전형적으로 그것의 동적 결합 용량의 100%까지 로드됨), 컬럼에 결과물이 과로딩되는 실험.
포착 효율(capture efficiency) - 흡착제에 의해 결합된 컬럼의 유입구에서 로드된 결과물의 백분율.
컬럼 포화(column saturation) - 상기 컬럼이 거의 그것의 동적 결합 용량의 100%이고, 유입구에서 추가적인 결과물을 로딩하여도 더 많은 용량을 야기하지 않는 지점.
싸이클 시간(cycle time) - 크로마토그래피 유닛 작동의 전체 세트(로드, 세척, 용출, 재생 및 평형화)를 완료하기 위해 하나의 컬럼에 요구되는 시간의 양.
동적 결합 용량(dynamic binding capacity) - 이동상 내 결과물이 고정상을 지나 유동하는 조건 하에서 1 밀리리터의 흡착제 당 결합된 결과물의 mg.
통과액(flow-through) - 피드 물질로 로딩 중에 컬럼의 배출구를 빠져나간 결과물의 합.
로드 체류 시간(load residence time) - (결과물을 함유하는) 피드 물질이 컬럼 상에 로딩되는 체류 시간 조건.
로드 시간(load time) - 다중-컬럼 크로마토그래피 방법의 로드 상(load phase)에서 제1 컬럼을 로드하기 위해 요구되는 시간의 양.
로드 존(load zone) - (직렬로 연결된) 2 개 이상의 컬럼들이 피드 물질을 직접적으로 또는 간접적으로 받아들이는 다중-컬럼 크로마토그래피 방법의 로드 상.
컬럼의 개수(number of columns) - 다중-컬럼 크로마토그래피 방법을 작동하기 위해 요구되는 (주어진 양의 흡착제 부피로 채워진) 총 컬럼들.
작동 결합 용량(operating binding capacity) - 컬럼 부피에 의해 나누어져 로딩된 결과물의 양.
생산성(productivity) - 시간 당 1 리터의 흡착제 당 처리된 결과물의 그램(작동 결합 용량/싸이클 시간)
체류 시간(residence time) - 이동상 내 비 상호 작용 입자가 고정상의 부피를 통과하는데 걸리는 시간의 양(흡착제 부피/유량).
휴지 또는 휴지 방법(rest or resting process) - 흡착제 상에 결과물을 로딩하는 단계를 수반하지 않는 크로마토그래피 싸이클 내 모든 단계들(세척, 용출, 재생, 평형화).
휴지 체류 시간(rest residence time) - 휴지 방법에서의 체류 시간 조건.
흡착제/수지(sorbent/resin) - 크로마토그래피 방법에서 이동상으로부터 결과물을 포착하기 위해 소망하는 화학적 필요를 가지는 리간드로 코팅된 작은 다공성 폴리머 비드로 구성된 물질.
고정된 결합 용량(static binding capacity) - 흐름이 없는 조건 하에서 고정상이 결합할 수 있는 결과물의 양.
개시 결합 용량(start-up binding capacity) - 정상 상태에서 다중-컬럼 방법을 개시하기 위해 로드하는데 요구되는 결과물의 양.
정상 상태(steady state) - 용량, 순도, 및 생산성이 매 싸이클마다 일정한 다중-컬럼 방법 내에서의 불변의 조건.
10% DBC의 80%(80% of 10% DBC) - (컬럼의 배출구에서 측정 가능한 결과물이 없는 0% 동적 결합 용량의 추정으로 전형적으로 사용되는) 컬럼의 배출구에서 10%의 피드 농도를 얻기 위해 요구되는 부피의80%.
전술한 본 발명을 이해하기 위한 틀에 더하여, 2 개의 컬럼들에 의한 MCC 방법에서, 일련의 컬럼들 중 제2(마지막) 컬럼으로부터의 결과물의 파과 이전에 제1 컬럼에 결합된 양을 측정하는 것은 각각의 컬럼의 단부에서 결과물 검출기와 직렬로 연결된 2 개의 컬럼들을 이용하여 성취될 수 있다. 이는 2 개의 컬럼들 사이에 위치한 검출기를 이용하여 제1 컬럼의 결과물 파과를 따라가도록 한다. 상기 결과물 파과는 통과액 중 결과물 농도 대 시간(또는 로딩된 결과물의 로드 양)의 그래프로 나타낼 수 있다. 파과 곡선이라고 불리는 이러한 그래프에서, 초기 상은 전체 표적이 결합하는, 그래서 검출기에서의 농도가 0인 곳에서 보통 보여진다. 결과물이 파과하고 그래프로 플롯될 때, 그 형상은 종종 S자형으로 다가온다. 상기 파과 곡선 위의 그래프 영역은 컬럼에 결합된 물질의 양을 나타낸다. 상기 곡선 아래의 영역은 컬럼을 통과하여 흐르는 물질의 양을 나타낸다. 이 단일 파과는 단일 컬럼 작동에 대한 로딩을 멈추기 위한 최적의 시간, 즉 결과물 파과 바로 직전을 보여준다.
그러나, 다중-컬럼 작동에서, 결과물이 일련의 컬럼들 중 마지막 컬럼에서 파과하기 시작할 때까지, 상기 제1 컬럼은 연속하여 로딩된다. 따라서, 결과물이 파과하는 시간(또는 로딩된 결과물의 부피 또는 양)을 확인하기 위해, 일련의 컬럼들 중 마지막 컬럼 후에 검출기가 요구된다. 이 정보는 표적의 농도 대 시간의 차트 상에 시간(및 그래서 로딩된 양)을 제한함으로써 제1 컬럼의 영역 파과를 억제하기 위해 사용된다. 이는 제2 컬럼의 파과 이전에 제1 컬럼에 결합된 표적 물질의 양인 작동 용량의 결정이 가능하게 한다.
대안적으로, (i) 상기 로드 컬럼의 파과 곡선은 단부에 검출기가 있는 단일 컬럼을 사용함으로써 측정될 수 있고, (ii) 다른 파과 곡선은 직렬의2 개 이상의 컬럼들을 상기 컬럼들의 단부에서 단일 검출기와 연결함으로써 결정될 수 있다.
뜻밖에, 상기 결과물 파과 곡선의 형상이 컬럼을 로딩할 때 쓰인 체류 시간에 거의 완전히 의존한다는 인식에 기반하여, 파과 곡선을 발생시키기 위한 다른 선택이 발견되었다. 이 놀라운 결과는, 각각의 컬럼 후 검출기를 각각 가지는 2 개의 컬럼들 대신에, 단지 단일 컬럼 및 상기 컬럼 후의 단일 검출기에 의한 2 개의 파과 곡선들의 발생을 가능하게 한다. MMC 환경을 모사하기 위해 하나의 파과 곡선이 선택된 체류 시간에서 수행되고, 일련의 2 개의 컬럼들을 모사하기 위해, 다른 파과 곡선이 선택된 체류 시간의 2 배의 시간에서 수행된다. 상기 선택된 체류 시간에서의 파과 곡선을 사용하여 일련의 컬럼들 중 제1 컬럼일 수 있는 것에 결합된 양을 계산하고, 여기서 상기 파과 곡선 위의 영역은 상기 컬럼에 결합된 양을 나타낸 것이다.
상기 체류 시간의 2 배의 시간에서의 파과는 일련의 컬럼들 중 제2 컬럼을 나타낸 것이며, 결과물 손실의 발생 없이 통과해 흐르면서 얼마나 많은 결과물이 MCC에 로딩될 수 있는지 알려주기 위해 요구된다. 이 파과 정보를 사용하여 얼마나 많은 결과물이 로딩되는지에 관한 제한을 결정하고, 초기 파과 곡선에 대한 로딩 시간 또는 양 제한을 계산하한다. 이 2 개의 파과 곡선들을 이용하여, 제2 컬럼의 파과 이전에 제1 컬럼에 결합된 양인 작동 결합 용량을 결정할 수 있다. 이는 일련의 3개 이상의 컬럼들까지 확장될 수 있다. 예시적으로, 일련의 3 개의 컬럼들에 대해, 제2 파과 곡선이 선택된 체류 시간의 3 배의 시간 등에서 수행될 수 있다.
이 틀을 유념하면서, MCC 방법의 생산성을 최적화하는 것이 기술될 수 있다. 전술한 틀은 단일 체류 시간에서 작동 결합 용량을 결정하는 것을 기술한다. 그러나, MCC 방법을 보다 더 최적화하기 위해서는, 일련의 체류 시간이 조사되어야 한다. 보다 긴 체류 시간이 보다 높은 컬럼 용량으로 이어질 수 있기 때문이다. 그러나, 보다 긴 체류 시간은, 보다 낮은 로드 유량의 대가로, 싸이클 시간을 증가시킨다. 생산성은 용량을 싸이클 시간으로 나눈 것과 같기 때문에, 체류 시간은 분자(용량)와 분모(싸이클 시간)을 바꾼다. 게다가, 로드 존에 더 많은 컬럼들을 추가하는 것의 이점이 있는지 여부를 결정하는 것이 유리하다. 통과액 내 결과물을 포착하기 위해 일련의 컬럼들 중 추가된 컬럼들이 있음에 따라, 일련의 컬럼들 중 제1 컬럼이 더 오랫동안 로딩될 수 있기 때문에, 더 많은 컬럼들을 추가하는 것은 높은 용량으로 이어질 수도 있다. 그러나, 상기 로드 존에 컬럼들을 더 추가하는 것은 증가된 싸이클 시간을 야기한다. 따라서, 체류 시간 뿐만 아니라, 로드 존 내 컬럼들의 개수도 최대 생산성(최적화된 MCC 방법)을 결정하기 위해 평가되어야 한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 용량은 2배 이상, 바람직하게는 3 배 이상의 체류 시간에서 측정된다. 이는 용량 대 체류 시간에 대해 창출되는 모델을 가능하게 한다.
일련의 3 개(또는 3 개 초과)의 컬럼들에 대비되는 일련의 2 개의 컬럼들의 이점을 이해하기 위해, 파과 곡선이 이 상황을 모델링하기 위해 제공될 수 있다.
예를 들어, 단일 컬럼을 살펴보면, 파과 곡선은 0.5, 1, 및 1.5 분의 체류 시간으로 수행될 수 있다. 상기 컬럼에 결합된 양은 상기 파과 곡선 위의 영역에 의해 나타낼 수 있다. 그러나, (MCC 방법에서) 마지막 컬럼의 결과물 파과를 나타내는 제2 파과 곡선은 로드를 제한하는 것이 요구되고, 그렇지 않다면, 단일 컬럼의 파과량이 MCC 방법에 전이될 때, 결과물은 손실될 것이다.
결과물이 파과하게 되는 지점을 결정하기 위해, 일련의 2 개의 컬럼들에 상응하는 파과 곡선들이 선택된 체류 시간(상기 예에서, 0.5, 1, 및 1.5 분)의 2 배의 시간에서 수행되어, 1, 2 및 3 분의 체류 시간에서 파과 곡선을 제공할 수 있다. 상응하는 일련의 3 개의 컬럼들을 모델링하기 위해, 파과 곡선은 체류 시간의 3 배의 시간 (1.5 분 (3 x 0.5 분), 3 분 (3 x 1 분) 및 4.5 분 (3 x 1.5 분)) 등에서 수행될 수 있다.
(이 부분에서 볼드체로 강조표시되어 있는) 체류 시간에서 겹침 또는 중복이 있을 수 있기 때문에, 체류 시간(0.5 분 (1X), 1 분 (2X) 및1.5 분 (3X))을 선택함으로써, 실험적 공간을 모델링하기 위해 요구되는 파과 곡선의 총 개수를 6개로 제한하는 것이 가능하다. 전술한 예에 더하여, MCC 방법에서 결과물이 제1 컬럼에 어떻게 결합되는지를 결정하기 위해, 파과 곡선은 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분에서 발생될 수 있다. 따라서, 상기 곡선 위의 영역은 상기 컬럼에 의해 결합된 양과 같다. 그러나, 결과물이 마지막 컬럼 상에서 파과하지 않도록 로딩을 멈추는 지점을 결정하기 위해 추가적인 파과 곡선이 요구된다. 2 개의 컬럼을 로딩하는 것에 대해, 이는 1 분 (2 x 0.5), 2 분 (2 x 1) 및 3 분 (2 x 1.5)에서의 추가적인 파과 곡선 세트를 발생시킴을 의미한다. 3 개의 컬럼들을 로딩하는 것에 대해, 1.5 분 (3 x 0.5), 3 분 (3 x 1) 및 4.5 분 (3 x 1.5)의 체류 시간에서의 다른 파과 곡선 세트가 요구된다. 1 분, 1.5 분, 및 3 분의 체류 시간의 파과 곡선이 반복되기 때문에, 상기 실험은 한번 수행될 수 있지만, 상기 결과들은 1 개를 초과하는 시나리오들에 적용될 수 있다. 결과적으로, 6 개의 단일 컬럼 파과 곡선 만이 요구된다.
각각의 파과 실험에 대해, 상기 컬럼은 포화 지점에 도달할 때까지 로딩된다. (예를 들어, 세척, 용출, 재생, 및 평형화와 같은)상기 방법 싸이클의 휴지가 기술자들에 의해 특정된 조건을 사용하여 컬럼 상에서 수행된다.
만일 표적 파과를 검출하기 위해 어떠한 구체적인 검출기도 존재하지 않는다면, 로딩 단계 중에 컬럼을 빠져나가는 용출액은 분별된다. 전형적으로, 약 25 내지 50 개의 분획은 잘 나타난 파과 곡선을 얻기에 충분히 큰 샘플 세트를 야기한다. 상기 분획 내 표적의 농도는 그 적용에 적합한 분석적 기법을 사용하여 수량화된다.
이 데이터로부터 체류 시간에 대한 작동 결합 용량의 의존을 관찰하는 것이 가능하다. 최적의 체류 시간 및 생산성이 일련의 표준식들을 채용함으로써 결정될 수 있다:
1. 로드 시간 = 작동 결합 용량 x 체류 시간 / 역가(titer)
2. 싸이클 시간 = 로드 시간 + 휴지 시간
3. 생산성 = 작동 결합 용량 / 싸이클 시간.
피드를 받아들이는 직렬로 연결된 N 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법에 대한 로딩 용량을 결정하기 위해, 주어진 체류 시간 및 체류 시간의 N배를 사용하여 한 쌍의 파과 곡선을 획득하였다. 한 쌍의 곡선들이 x축으로서의 시간 및 y축으로서의 농도에서 플롯된다. 보다 큰 체류 시간의 파과 곡선은 N 개의 컬럼 방법 대 시간에서 마지막 컬럼의 배출구에서의 결과물 파과의 진행을 추정한다. 이 곡선은 결과물이 컬럼의 배출구에서 막 파과하려는 시간, T의 지점을 선택하기 위해 사용된다.
상기 곡선은 (i) 결과물 농도가 피드 샘플 내 결과물 농도의 10%에 도달하는 시간 T10%를 결정하고, (ii) T10%의 80%로서의 T를 계산하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 곡선은 (i) 결과물 농도가 피드 샘플 내 결과물 농도의 5%에 도달하는 시간 T5%를 결정하고, (ii) T5%의 75%로서의 T를 계산하는데 사용될 수 있다. T는 한 쌍의 곡선 중 제2 파과(보다 더 낮은 체류 시간에서의 것)에 대한 적분 상한선으로 사용된다. 이 파과 곡선은 0부터 미리 정의된 상한선 T까지 적분되고, 통과액 내 존재하는 결과물의 양을 나타낸다. 상기 로딩 용량은 하기와 같다: {[(로딩된 결과물의 질량) - (통과액 내 결과물의 질량)] / (컬럼 부피)}. 로딩된 결과물의 질량의 계산은 {(피드의 농도) * (로딩된 부피 - 공극(void) 부피)}에 의해 주어진다.
이 절차는 3 개의 로딩 용량들이 3 개의 주어진 체류 시간과 연관되도록 2 개의 컬럼 로딩과 연관된 모든 파과 곡선의 쌍에 적용될 수 있다. 상기 용량들은 체류 시간에 대하여 플롯될 수 있고, 용량 값을 맞춰진 지점들 사이에 내삽하기 위해, 2차 다항식을 사용하여 맞춰질 수 있다. 이 단계들은 용량들 대 체류 시간의 2 개의 플롯들을 야기하는 3 개의 컬럼 로딩에 대한 동일한 곡선을 발생시키기 위해 반복된다. 내삽된 용량들을 사용하여 하기와 같은 로드 시간을 계산한다: {(용량 * 체류 시간) / (피드 역가)}.
상기 로드 시간을 사용하여 {(로드 시간) + (세척/용출/재생/평형화 단계들을 수행하는 시간)}인 싸이클 시간을 계산한다. 상기 싸이클 시간은 내삽된 다양한 용량들에 대해 계산된다.
각 체류 시간과 연관된 생산성은 {(용량) / (싸이클 시간)}과 같고, 이론적인 생산성 대 체류 시간의 플롯을 야기하는 내삽된 용량들의 범위를 위해 계산된다.
방법을 시행하기 위해 요구되는 총 컬럼들의 개수는 로딩된 컬럼들의 개수와, 로딩이 연속적이고 중단되지 않도록 싸이클(세척/용출/재생)의 휴지에서 요구되는 컬럼들의 개수를 더한 합이다. 이는 {(싸이클 시간) / (로드 시간)}과 같고, 요구되는 총 컬럼들의 개수에 대한 연속적인 값의 세트를 발생시킨다.
컬럼들의 계산된 총 개수를 비연속적인 한자리 수 값으로 만들기 위해, 컬럼들의 총 개수에 대해 계산된 값들을 올림(round up)하고, 그 값들을 생산성에 대한 식 {(생산성) * (총 # 컬럼들) / [(총 # 컬럼들)의 올림]}에 다시 넣어 인수분해함으로써, 유휴 시간(idle time)을 싸이클 시간에 더한다. 이는 이론적인 생산성에 대한 계산을 실제 생산성으로 변환한다.
따라서, 일련의 체류 시간에서 작동 결합 용량을 측정함으로써, MCC 작동에 대한 최적의 생산성이 그 생산성에서의 작동을 위한 다양한 파라미터들에 따라 계산될 수 있다. 중요한 파라미터들은 예를 들어, 작동 결합 용량, 체류 시간, 로드 존 내 컬럼들의 개수, 및 싸이클 시간을 포함한다. 이 접근은 상이한 결과물 역가에 적용될 수 있다. 유리하게는, 생산성의 견고함이 결정될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 보다 높은 역가를 제조하기 위해 업스트림 방법을 향상시키는 것의 이점들 또한 확인될 수 있다.
다양한 흡착제(예를 들어, 비드)를 포함하는 다양한 크로마토그래피 컬럼들이 본 발명에서의 사용에 적합하고, 당업계에 알려져 있다.
몇몇 구현예들에서, 상기 크로마토그래피 컬럼들은 예를 들어, 상기 흡착제(들)가 디바이스 제작자에 의해 하우징 내에 밀봉된, 선조립된 컬럼들이다. 몇몇 다른 구현예들에서, 상기 흡착제(들)가 최종 사용자에 의해 하우징 내에 밀봉된다. 상기 디바이스는 다양한 유체의 처리, 예를 들어, 유체 내 존재하는 하나 이상의 소망하는 물질들을 정화하고 농축시키기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 상기 디바이스는 생물 약제학 산업에서 사용되는 유체, 예를 들어, 단백질성 물질, 예를 들어, 항체(예를 들어, 단일 클론 항체), 또는 성장 인자와 같은 재조합 단백질과 같은 바람직한 물질을 포함하는 유체들을 처리하는 방법에 적합할 수 있다.
상기 흡착제(들)는 임의의 소망하는 특징, 예를 들어, 크로마토그래피 타입, 및 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 당업계에 알려져 있는 시판되는 비드를 포함하는 여러 가지의 비드를 가질 수 있다. 예를 들어, 여러 가지의 이온-교환 비드가 사용될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 상기 흡착제는 생리적 pH 및/또는 이온 강도 하에서 기능할 수 있다. 적합한 흡착제(예를 들어, 수지)는 하전된(예를 들어, 양전하로 하전되거나 또는 음전하로 하전된 매질), 혼합형 크로마토그래피 매질, 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 매질, 친화 크로마토그래피 (예를 들어, 고정화 금속 친화 크로마토그래피(IMAC)) 매질, 생물특이적 (예를 들어, 고정화 단백질 A) 친화 크로마토그래피 매질, 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC) 매질, 및 황친화성(thiophilic) 크로마토그래피(TC) 매질을 포함한다.
하기의 실시예들은 본 발명을 예시하나, 그것의 범위를 제한하는 임의의 방법으로서 해석되어서 안되는 것은 물론이다.
하기의 각각의 실시예들에서, 최저 체류 시간은 상기 흡착제의 물리적 제한에 기반하여 선택된다. 최고 체류 시간은 1.5 분을 초과하는 체류 시간이 생산성에서 현저한 이점을 제공하지 못할 것이라는 가정에 기반하여 선택된다.
실시예 1 내지 9에서, (3 개의) 작동 용량들의 세트가 총 체류 시간에 대하여 플롯되고, OBC 값을 맞춰진 지점들 사이에 내삽하기 위해, 2차 다항식을 사용하여 맞춰질 수 있다. OBC 값은, 가장 정확한 적합도를 제공하지만 적절히 시행하기 위해 더 많은 실험 수고를 요할 수 있는 A - Be -C(t) 형태의 지수 함수를 포함하여 다양한 식을 사용하여 맞춰질 수 있다.
대안적으로, 사용자들은 2차 다항식에 의한 내삽을 통해 OBC 값의 근사치를 내는 대신, 더 많은 파과 실험을 수행하여 총 체류 시간의 범위에 걸쳐 실제 OBC 값을 발견할 수 있다.
생산성에 기반한 (체류 시간의 범위에 걸쳐) 계산된 다중-컬럼 방법들의 세트로부터 방법 시나리오를 선택한다. 대안적으로, 본 방법의 구현예를 사용하여 모델링되는 각각의 시나리오를 임의의 전문적인 소프트웨어에 입력하여 제품의 공정 비용을 추정하고 비용 절감을 최적화할 수 있다.
실시예 1 내지 4 및 9는 단일 컬럼을 이용하고, 실시예 5 내지 8은 다중 데이지 체인 컬럼들을 이용한다.
실시예 1
이 실시예는 하나의 컬럼(MabSelect SuRe 사전 포장된 하이-트랩 컬럼들(0.962 mL))을 이용하고; 정화된 IgG2 단일 클론 항체(2 mg/mL 농도) 및 1 개의 직렬 UV 검출기를 사용하여, 본 발명의 일 구현예에 따른 OBC를 결정하는 것을 설명한다.
(1) 3 개의 파과 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 단일 컬럼 상에서 수행한다. (2) 추가적인 3 개의 실험들을 2 분, 3 분, 및 4.5 분의 체류 시간에서 수행하였다.
전형적으로, 로드 존 내 2 개 및 3 개의 컬럼들의 모델링에서, 회분식 파과 실험을 또한, (1)에서 특정된 체류 시간의 2 배 및 3 배의 시간에서 총 9 개의 실험들에 대해 수행한다. 그러나, 선택된 체류 시간 중에 겹침 또는 중복(겹침 시간을 설명하는 하기 표 1)이 있기 때문에, (2)에서 수행된 실험들에 더하여 3 개의 파과 실험들 만을 수행하였다.
체류 시간
선택된 체류 시간 2 개의 컬럼 로드 존 3 개의 컬럼 로드 존
0.5 1 1.5
1 2 3
1.5 3 4.5
로드 존 내 N 개의 컬럼들을 모델링하기 위해, 회분식 파과 실험들을 (1)에서 특정된 체류 시간의 N 배의 시간에서 수행하였다.
상기 컬럼들을 하기 표 2에서 요약된 각각의 로딩 단계들 사이에서 세척, 용출, 재생, 및 평형화(총괄하여 "휴지"기로 지칭됨)하였다.
완충제 / 용액 단계 길이 (CV) 체류 시간 (분)
세척 1 1X PBS 5 0.5
세척 2 1X PBS + 0.5M NaCl 10 0.5
세척 3 1X PBS 5 0.5
용출 완충제 100 mM 아세트산
pH 3.0 		10 0.5
CIP 0.1M NaOH 10 1
재-평형화
(Re-equil.) 		1X PBS 10 0.5
각각의 회분식 파과 실험 중의 로딩 단계에서, 상기 컬럼을 포화(즉, 컬럼 밖으로 배출되는 결과물의 농도가 컬럼에 유입되는 결과물의 농도와 같은 상태)에 도달할 때까지 로딩하였다.
상기 컬럼의 배출구에서의 농도를 직렬 UV 검출기를 사용하여 측정하였다. 상기 결과물 파과 대 시간을 소프트웨어에 의해 기록하고, 작동 결합 용량 계산을 위해 추출하였다. 예시적인 곡선을 도 2에 도시하였다.
로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 결과물 파과를 이해하기 위해 체류 시간에 따라 파과 곡선을 둘씩 짝을 지웠다. 예를 들어, 0.5 분의 선택된 체류 시간에 상응하는 파과 곡선은 1 분의 체류 시간에 상응하는 파과 곡선과 짝을 지웠다. 2 배의 체류 시간에서 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법 중의 시간 상에서 어떻게 결과물이 파과하는지 모사하는 것이 가능하다. 이를 (1)에 기재된 모든 선택된 체류 시간들에 대해 행하였다.
파과 곡선은 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법을 모사하기 위해 체류 시간에 따라 둘씩 짝을 지웠다. 예를 들어, 0.5 분의 선택된 체류 시간에 상응하는 파과 곡선은 1.5 분의 체류 시간에 상응하는 파과 곡선과 짝을 지웠다. 3 배의 체류 시간에서 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법 중의 시간 상에서 어떻게 결과물이 파과하는지 모사하는 것이 가능하다.
상기 로드 존 내 N 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법에 대한 이상적인 작동 결합 용량은 N 번째 컬럼의 배출구에서 파과가 나타나기 바로 직전에 제1 컬럼에 결합된 양이다. 이전의 두 단락에서, 체류 시간은, (도 4a 및 도 4b에 묘사된 바와 같이) 일반적으로 2 개의 컬럼들을 데이지 체인 방식에 의해 결합하고, 결과물 파과를 추적하기 위해 2 개의 UV 검출기들을 채용함으로써 발생될 수 있는 파과 곡선을 모사하기 위해 사용된다. 단일 컬럼 상에서 체류 시간을 변화시킴으로써, (도 4c에 묘사된 바와 같이) 다중 컬럼들에 걸친 결과물 파과를 모사하는 것이 가능하다.
상기에서 확인된 한 쌍의 곡선들 중 더 큰 체류 시간에 상응하는 각각의 파과 곡선을 사용하여 결과물이 막 파과하려는 시간, tDBC를 결정하였다.
10% 결과물 파과를 제조하기 위해 요구되는 결과물 질량의 80%가 로딩된 시간을 확인함으로써 tDBC를 계산하였다.
tDBC를 각 쌍의 곡선 중 두번째 파과(보다 낮은 체류 시간에 상응하는 것)에 대한 적분 상한선으로 사용하였다. 이 파과 곡선을 0부터 미리 정의된 상한선 f R * tDBC까지 적분하여, 하기 Equation 1(여기서, m FT 는 통과액 내 결과물의 양이며, C out 은 상기에서 확인된 한 쌍의 곡선들 중 보다 낮은 시간에 상응하는 파과 곡선을 나타냄)에서 나타난 통과액 내 존재하는 결과물의 양을 결정하였다.
Figure 112016052570549-pat00001
로딩된 결과물의 양, m L 을 하기 Equation 2(여기서, C O 는 피드 농도, v L 은 로딩되었던 부피이며, v O 는 상기 컬럼 내의 공극 부피임)에서 나타난 식을 적용함으로써 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00002
이상적인 작동 결합 용량(OBC)을 하기 Equation 3 내 식을 적용함으로써 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00003
전술한 방법을 파과 곡선의 모든 쌍에 적용하여 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 상응하는 3 개의 작동 결합 용량들 및 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법에 상응하는 3 개의 작동 결합 용량들을 발생시켰다.
(3 개의) 작동 용량들의 각 세트를 총 체류 시간에 대하여 플롯하고, OBC 값을 맞춰진 지점들 사이에 내삽하기 위해, 2차 다항식을 사용하여 맞추었다(fit). 가장 정확한 적합도를 제공하지만 적절히 시행하기 위해 더 많은 실험 수고를 요할 수 있는 A - Be -C(t) 형태의 지수 함수를 포함하여 다양한 식을 사용하여, OBC 값을 맞출 수 있다. 작동 결합 용량 대 총 체류 시간의 예를 도 5에 도시하였다.
상기 내삽된 작동 결합 용량을 사용하여 하기 Equation 4(여기서, RT는 1 개의 컬럼에 걸친 체류 시간(총 체류 시간이 아님)이고, C O 는 피드 농도임)의 식을 적용함으로써 총 체류 시간의 범위 상에서 로드 시간을 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00004
상기 로드 시간을 사용하여 총 체류 시간의 범위 상에서 싸이클 시간을 계산하였다. 상기 계산은 (하기)Equation 5(여기서, t C 는 싸이클 시간과 같고, t L 은 로드 시간과 같고, N L 은 로드 존 내 컬럼들의 개수와 같고, t R 은 휴지 시간 또는 세척, 용출, 및 재생을 수행하기 위한 시간과 같음)에서 나타난다.
Figure 112016052570549-pat00005
각 체류 시간과 연관된 생산성을 (하기)Equation 6(여기서 P는 생산성임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00006
이론적인 생산성 대 총 체류 시간의 플롯을 도 6에 도시하였다.
방법을 시행하기 위해 요구되는 총 컬럼들의 개수는 로딩된 컬럼들의 개수와, 로딩이 연속적이고 중단되지 않도록 휴지(세척/용출/재생)에서 요구되는 컬럼들의 개수를 더한 합이다. 이는 (하기)Equation 7(여기서, N C 는 컬럼들의 총 개수임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00007
상기 싸이클 시간은 컬럼들의 개수에 의해 나누어질 수 있어야 한다. 나누어질 수 있지 않은 상황에서는, 유휴 시간을 싸이클 시간에 더하였다. 싸이클 시간을 증가시키면 생산성이 감소된다. 상기 실제 생산성(P actual )은 (하기)Equation 8을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00008
생산성에 기반한 ((1)에 기재된 체류 시간의 범위에 걸쳐)계산된 다중-컬럼 방법들의 세트로부터 방법 시나리오를 선택하였다. 대안적으로, 이 구현예의 방법을 사용하여 모델링되는 각각의 시나리오는 임의의 전문적인 소프트웨어에 입력되어 제품의 공정 비용을 추정하고 비용 절감을 최적화할 수 있다.
실시예 2
이 실시예는 하나의 컬럼(MabSelect SuRe 사전 포장된 하이-트랩 컬럼들(0.962 mL))을 이용하고; 정화된 IgG2 단일 클론 항체(CHO 피드 스톡 중 2.2 mg/mL 농도) 및 시판되는 바이오 센서를 사용한 분획의 수량화를 사용하여 본 발명의 일 구현예에 따른 OBC를 결정하는 것을 설명한다.
(1) 3 개의 파과 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 단일 컬럼 상에서 수행한다. (2) 추가적인 3 개의 실험들을 2 분, 3 분, 및 4.5 분의 체류 시간에서 수행하였다.
전형적으로, 로드 존 내 2 개 및 3 개의 컬럼들의 모델링에서, 회분식 파과 실험을 또한, (1)에서 특정된 체류 시간의 2 배 및 3 배의 시간에서 총 9 개의 실험들에 대해 수행하였다. 그러나, 선택된 체류 시간 중에 겹침 또는 중복(겹침 시간을 설명하는 하기 표 3)이 있기 때문에, (2)에서 수행된 실험들에 더하여 3 개의 파과 실험들 만을 수행하였다.
체류 시간
선택된 체류 시간 2 개의 컬럼 로드 존 3 개의 컬럼 로드 존
0.5 1 1.5
1 2 3
1.5 3 4.5
로드 존 내 N 개의 컬럼들을 모델링하기 위해, 회분식 파과 실험들을 (1)에서 특정된 체류 시간의 N 배의 시간에서 수행하였다.
상기 컬럼들을 하기 표 4에서 요약된 각각의 로딩 단계들 사이에서 세척, 용출, 재생, 및 평형화(총괄하여 "휴지"기로 지칭됨) 하였다.
완충제 / 용액 단계 길이 (CV) 체류 시간 (분)
세척 1 1X PBS 5 0.5
세척 2 1X PBS + 0.5M NaCl 10 0.5
세척 3 1X PBS 5 0.5
용출 완충제 100 mM 아세트산
pH 3.0 		10 0.5
CIP 0.1M NaOH 10 1
재-평형화
(Re-equil.) 		1X PBS 10 0.5
각각의 회분식 파과 실험 중의 로딩 단계에서, 상기 컬럼을 포화(즉, 컬럼 밖으로 배출되는 결과물의 농도가 컬럼에 유입되는 결과물의 농도와 같은 상태), 또는 120 mg/mL의 흡착제에 도달할 때까지 로딩하였다.
상기 컬럼의 배출구에서의 농도를 AKTA™ Avant(GE Healthcare Lifesciences사)를 사용하여 60 개의 1 mL 분획들로 분별하였다. 각각의 분획을 희석액(Pall ForteBio 유한회사, Menlo Park, 캘리포니아)을 사용하여 10배 희석시키고, 농도를 단백질 A 바이오 센서(Pall ForteBio 유한회사, Menlo Park, 캘리포니아)를 사용하여 수량화하였다. 농도 값을 작동 결합 용량 계산을 위해 시간에 대하여 플롯하고, 예시적인 추출된 파과 곡선을 도 3에 도시하였다.
로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 결과물 파과를 이해하기 위해 체류 시간에 따라 파과 곡선을 둘씩 짝지웠다. 예를 들어, 0.5 분의 선택된 체류 시간에 상응하는 파과 곡선은 1 분의 체류 시간에 상응하는 파과 곡선과 짝지웠다. 2 배의 체류 시간에서 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법 중의 시간 상에서 어떻게 결과물이 파과하는지 모사하는 것이 가능하다. 이를 (1)에 기재된 모든 선택된 체류 시간들에 대해 행하였다.
로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법을 모사하기 위해 체류 시간에 따라 파과 곡선을 둘씩 짝을 지웠다. 예를 들어, 0.5 분의 선택된 체류 시간에 상응하는 파과 곡선은 1.5 분의 체류 시간에 상응하는 파과 곡선과 짝지웠다. 3 배의 체류 시간에서 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법 중의 시간 상에서 어떻게 결과물이 파과하는지 모사하는 것이 가능하다.
상기 로드 존 내 N 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법에 대한 이상적인 작동 결합 용량은 N 번째 컬럼의 배출구에서 파과가 나타나기 바로 직전에 제1 컬럼에 결합된 양이다. 이전의 두 단락에서, 체류 시간은, 도 4a 및 도 4b에 묘사된 바와 같이 일반적으로 2 개의 컬럼들을 데이지 체인 방식에 의해 결합하고, 결과물 파과를 추적하기 위해 2 개의 UV 검출기들을 채용함으로써 발생될 수 있는 파과 곡선을 모사하기 위해 사용된다. 단일 컬럼 상에서 체류 시간을 변화시킴으로써, 도 4c에 묘사된 바와 같은 다중 컬럼들에 걸친 결과물 파과를 모사하는 것이 가능하다.
상기에서 확인된 한 쌍의 곡선 중 더 큰 체류 시간에 상응하는 각각의 파과 곡선을 사용하여 결과물이 막 파과하려는 시간, tDBC를 결정하였다.
10% 결과물 파과를 제조하기 위해 요구되는 결과물 질량의 80%가 로딩된 시간을 확인함으로써 tDBC를 계산하였다.
tDBC를 각 쌍의 곡선중 두번째 파과(보다 낮은 체류 시간에 상응하는 것)에 대한 적분 상한선으로 사용하였다. 이 파과 곡선은 0부터 미리 정의된 상한선 f R * tDBC까지 적분되어, 하기 Equation 1(여기서, m FT 는 통과액 내 결과물의 양이며, C out 은 상기에서 확인된 한 쌍의 곡선 중 보다 낮은 시간에 상응하는 파과 곡선을 나타냄)에서 나타난 통과액 내 존재하는 결과물의 양을 결정하였다.
Figure 112016052570549-pat00009
로딩된 결과물의 양, m L 을 하기 Equation 2(여기서, C O 는 피드 농도, v L 은 로딩되었던 부피이며, v O 는 상기 컬럼 내의 공극 부피임)에서 나타난 식을 적용함으로써 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00010
상기 이상적인 작동 결합 용량(OBC)을 하기 Equation 3 내 식을 적용함으로써 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00011
전술한 방법을 파과 곡선의 모든 쌍에 적용하여 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 상응하는 3 개의 작동 결합 용량들 및 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법에 상응하는 3 개의 작동 결합 용량들을 발생시켰다.
(3 개의) 작동 용량들의 각 세트를 총 체류 시간에 대하여 플롯하고, OBC 값을 맞춰진 지점들 사이에 내삽하기 위해, 2차 다항식을 사용하여 맞추었다(fit). 가장 정확한 적합도를 제공하지만 적절히 시행하기 위해 더 많은 실험 수고를 요할 수 있는 A - Be -C(t) 형태의 지수 함수를 포함하여 다양한 식을 사용하여, OBC 값을 맞출 수 있다. 작동 결합 용량 대 총 체류 시간의 예를 도 7에 도시하였다.
상기 내삽된 작동 결합 용량을 사용하여 하기 Equation 4(여기서, RT는 1 개의 컬럼에 걸친 체류 시간(총 체류 시간이 아님)이고, C O 는 피드 농도임)의 식을 적용함으로써 총 체류 시간의 범위 상에서 로드 시간을 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00012
상기 로드 시간을 사용하여 총 체류 시간의 범위 상에서 싸이클 시간을 계산하였다. 상기 계산은 (하기)Equation 5(여기서, t C 는 싸이클 시간과 같고, t L 은 로드 시간과 같고, N L 은 로드 존 내 컬럼들의 개수와 같고, t R 은 휴지 시간 또는 세척, 용출, 및 재생을 수행하기 위한 시간과 같음)에서 나타난다.
Figure 112016052570549-pat00013
각 체류 시간과 연관된 생산성을 (하기)Equation 6(여기서 P는 생산성임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00014
이론적인 생산성 대 총 체류 시간의 플롯을 도 8에 도시하였다.
방법을 시행하기 위해 요구되는 총 컬럼들의 개수는 로딩된 컬럼들의 개수와, 로딩이 연속적이고 중단되지 않도록 휴지(세척/용출/재생)에서 요구되는 컬럼들의 개수를 더한 합이다. 이는 (하기)Equation 7(여기서, N C 는 컬럼들의 총 개수임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00015
상기 싸이클 시간은 컬럼들의 개수에 의해 나누어질 수 있어야 한다. 나누어질 수 있지 않은 상황에서는, 유휴 시간을 싸이클 시간에 더하였다. 싸이클 시간을 증가시키면 생산성이 감소된다. 상기 실제 생산성(P actual )은 (하기)Equation 8을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00016
실시예 3
이 실시예는, 하나의 컬럼(MabSelect SuRe 사전 포장된 하이-트랩 컬럼들(0.962 mL))을 이용하고; 정화된 IgG2 단일 클론 항체(2 mg/mL 농도) 및 파과 곡선의 적분 대신 용출(여기서, 상기 용출은 분획으로 수집되고, 희석되고, 오프-라인 검출기를 사용하여 검출됨)의 수량화를 사용하여 본 발명의 일 구현예에 따른 OBC를 결정하는 것을 설명한다.
(1) 3 개의 로드 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 단일 컬럼 상에서 수행하였다. (2) 5 개의 파과 실험들을 1 분, 1.5 분, 2 분, 3 분, 및 4.5 분의 체류 시간에서 수행하였다.
각각의 회분식 파과 실험 중의 로딩 단계에서, 상기 컬럼을 포화(즉, 컬럼 밖으로 배출되는 결과물의 농도가 컬럼에 유입되는 결과물의 농도와 같은 상태)에 도달할 때까지 로딩하였다.
상기 컬럼의 배출구에서의 농도를 직렬 UV 검출기를 사용하여 측정하였다. 상기 결과물 파과 대 시간을 소프트웨어에 의해 기록하고, 작동 결합 용량 계산을 위해 추출하였다. 예시적인 곡선을 도 2에 도시하였다.
상기 로드 시간, tDBC를 각각의 파과 실험으로부터의 파과 곡선을 사용하여 10% 결과물 파과를 제조하기 위해 요구되는 결과물 질량의 80%가 로딩된 시간을 확인함으로써 계산하였다.
상기 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 작동 결합 용량(OBC)을 결정하기 위해, 상기 컬럼을 선택된 체류 시간(예를 들어, 0.5 분)에서 상기 선택된 로드 체류 시간의 2 배의 시간(예를 들어, 0.5*2 = 1 분의 체류 시간)에서 컬럼을 로딩함으로써 발생한 10% 파과 곡선의 80%에 의해 결정된 로드 시간을 사용하여 로딩하였다. 이를 3 개의 단일 컬럼 실험 전부에 대해 (1)에서 특정된 1 세트의 선택된 로드 체류 시간 동안 반복하였다.
로딩 후에, 상기 컬럼을 결합된 물질의 95% 내지 100%의 회수를 보장하는 완충제를 사용하여 용출시키고, 컬럼에 결합된 양을 결정하기 위해 상기 용출을 측정하였다. 결합된 양은 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 MCC 방법에 대한 작동 결합 용량과 같다.
상기 로드 존 내 N 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법에 대한 이상적인 작동 결합 용량은 N 번째 컬럼의 배출구에서 파과가 나타나기 바로 직전에 제1 컬럼에 결합된 양이다. 이전의 두 단락에서, 체류 시간은, 도 4b에 묘사된 바(아래 곡선)와 같이 일반적으로 2 개의 컬럼들을 데이지 체인 방식에 의해 결합하고, 결과물 파과를 추적하기 위해 2 개의 UV 검출기들을 채용함으로써 발생될 수 있는 파과 곡선을 모사하기 위해 사용된다. 이 파과 곡선을 사용하여 일련의 컬럼들 중 제1 컬럼을 통해 주입되는 양(도 4a에서 제1 컬럼 중 X + 제2 컬럼 중 Y)을 결정하였다. 상기 체류 시간을 2배 감소시키고, 상기 컬럼을 이 양(X+Y)으로 로딩하였다. 통과해 흐르는 양은 Y와 같고, 결합되는 양은 X와 같으며, 작동 결합 용량 또는 OBC를 나타낸다.
3 개의 각 실험들에 대한 용출을 수량화하는 것은 3개의 OBC를 생성하고, 각각은 OBC 값을 맞춰진 지점들 사이에 내삽하기 위해 플롯되고 2차 다항식을 사용하여 맞춰질 수 있는 선택된 체류 시간에 각각 상응한다.
가장 정확한 적합도를 제공하지만 적절히 시행하기 위해 더 많은 실험 수고를 요할 수 있는 A - Be -C(t) 형태의 지수 함수를 포함하여 다양한 식을 사용하여, OBC 값을 맞출 수 있다. 작동 결합 용량 대 총 체류 시간의 예를 도 5에 도시하였다.
로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법들을 모델링하기 위해 선택된 체류 시간의 3 배의 시간에 상응하는 파과 곡선으로부터 계산되는 로드 시간을 사용하여 선택된 로드 체류 시간의 세트에 대한 실험을 반복하였다.
상기 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 상응하는 체류 시간에 대한 OBC를 플롯하기 위해, 용출 및 상기 용출을 수량화하는 것을 반복된 실험들에 적용하였다.
상기 그래프로부터의 내삽된 작동 결합 용량들을 사용하여 하기 Equation 4(여기서, RT는 1 개의 컬럼에 걸친 체류 시간(총 체류 시간이 아님)이고, C O 는 피드 농도임)의 식을 적용함으로써 총 체류 시간의 범위 상에서 로드 시간을 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00017
상기 로드 시간을 사용하여 총 체류 시간의 범위 상에서 싸이클 시간을 계산하였다. 상기 계산은 각 체류 시간에 적용되는 (하기)Equation 5(여기서, t C 는 싸이클 시간과 같고, t L 은 로드 시간과 같고, N L 은 로드 존 내 컬럼들의 개수와 같고, t R 은 휴지 시간 또는 세척, 용출, 및 재생을 수행하기 위한 시간과 같음)에서 나타난다.
Figure 112016052570549-pat00018
각 체류 시간과 연관된 생산성을 (하기)Equation 6(여기서 P는 생산성임)을 사용하여 계산하였다. 이론적인 생산성 대 총 체류 시간의 플롯을 도 6에 도시하였다.
Figure 112016052570549-pat00019
방법을 시행하기 위해 요구되는 총 컬럼들의 개수는 로딩된 컬럼들의 개수와, 로딩이 연속적이고 중단되지 않도록 휴지(세척/용출/재생)에서 요구되는 컬럼들의 개수를 더한 합이다. 이는 (하기)Equation 7(여기서, N C 는 컬럼들의 총 개수임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00020
상기 싸이클 시간은 컬럼들의 개수에 의해 나누어질 수 있어야 한다. 나누어질 수 있지 않은 상황에서는, 유휴 시간을 싸이클 시간에 더하였다. 싸이클 시간을 증가시키면 생산성이 감소된다. 상기 실제 생산성(P actual )을 (하기)Equation 8을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00021
실시예 4
이 실시예는, 하나의 컬럼(MabSelect SuRe 사전 포장된 하이-트랩 컬럼들(0.962 mL))을 이용하고; 정화된 IgG2 단일 클론 항체(2 mg/mL 농도) 및 시판되는 바이오 센서를 사용한 분별을 통한 용출의 수량화를 사용하여 본 발명의 일 구현예에 따른 OBC을 결정하는 것을 설명한다.
(1) 3 개의 로드 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 단일 컬럼 상에서 수행하였다. (2) 5 개의 파과 실험들을 1 분, 1.5 분, 2 분, 3 분, 및 4.5 분의 체류 시간에서 수행하였다.
각각의 회분식 파과 실험 중의 로딩 단계에서, 상기 컬럼을 포화(즉, 컬럼 밖으로 배출되는 결과물의 농도가 컬럼에 유입되는 결과물의 농도와 같은 상태)에 도달할 때까지 로딩하였다.
상기 컬럼의 배출구에서의 농도를 AKTA™ Avant(GE Healthcare Lifesciences사)를 사용하여 60 개의 1 mL 분획들로 분별하였다. 각각의 분획을 희석액(Pall ForteBio 유한회사, Menlo Park, 캘리포니아)을 사용하여 10배 희석되고, 농도는 단백질 A 바이오 센서(Pall ForteBio 유한회사, Menlo Park, 캘리포니아)를 사용하여 수량화하였다. 농도 값을 작동 결합 용량 계산을 위해 시간에 대하여 플롯하고, 예시적인 추출된 파과 곡선을 도 3에 도시하였다.
상기 로드 시간, tDBC를 각각의 파과 실험으로부터의 파과 곡선을 사용하여 10% 결과물 파과를 제조하기 위해 요구되는 결과물 질량의 80%가 로딩된 시간을 확인함으로써 계산하였다.
상기 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 작동 결합 용량(OBC)을 결정하기 위해, 상기 컬럼을 선택된 체류 시간(예를 들어, 0.5 분)에서 상기 선택된 로드 체류 시간의 2 배의 시간(예를 들어, 0.5*2 = 1 분의 체류 시간)에서 컬럼을 로딩함으로써 발생한 10% 파과 곡선의 80%에 의해 결정된 로드 시간을 사용하여 로딩하였다. 이를 3 개의 단일 컬럼 실험 전부에 대해 (1)에서 특정된 1 세트의 선택된 로드 체류 시간 동안 반복하였다.
로딩 후에, 상기 컬럼을 결합된 물질의 95% 내지 100%의 회수를 보장하는 완충제를 사용하여 용출시키고, 컬럼에 결합된 양을 결정하기 위해 상기 용출을 측정하였다. 결합된 양은 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 MCC 방법에 대한 작동 결합 용량과 같다.
상기 로드 존 내 N 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법에 대한 이상적인 작동 결합 용량은 N 번째 컬럼의 배출구에서 파과가 나타나기 바로 직전에 제1 컬럼에 결합된 양이다. 이전의 두 단락에서, 체류 시간은, 도 4b에 묘사된 바(아래 곡선)와 같이 일반적으로 2 개의 컬럼들을 데이지 체인 방식에 의해 결합하고, 결과물 파과를 추적하기 위해 2 개의 UV 검출기들을 채용함으로써 발생될 수 있는 파과 곡선을 모사하기 위해 사용된다. 이 파과 곡선은 일련의 컬럼들 중 제1 컬럼을 통해 주입되는 양(도 4a에서 제1 컬럼 중 X 더하기 제2 컬럼 중 Y)을 결정하기 위해 사용된다. 상기 체류 시간을 2배 감소시키고, 상기 컬럼을 이 양(X+Y)으로 로딩하였다. 통과해 흐르는 양은 Y와 같고, 결합되는 양은 X와 같으며, 작동 결합 용량 또는 OBC를 나타낸다.
3 개의 각 실험들에 대한 용출을 수량화하는 것은 3개의 OBC를 생성하는데, 각각은 OBC 값을 맞춰진 지점들 사이에 내삽하기 위해 플롯되고 2차 다항식을 사용하여 맞춰질 수 있는 선택된 체류 시간에 각각 상응한다.
가장 정확한 적합도를 제공하지만 적절히 시행하기 위해 더 많은 실험 수고를 요할 수 있는 A - Be -C(t) 형태의 지수 함수를 포함하여 다양한 식을 사용하여, OBC 값을 맞출 수 있다. 작동 결합 용량 대 총 체류 시간의 예를 도 5에 도시하였다.
선택된 로드 체류 시간의 세트에 대한 실험을 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법들을 모델링하기 위해 선택된 체류 시간의 3 배의 시간에 상응하는 파과 곡선으로부터 계산되는 로드 시간을 사용하여 반복하였다.
용출 및 상기 용출을 수량화하는 것을 상기 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 상응하는 체류 시간에 대한 OBC를 플롯하기 위해, 반복된 실험들에 적용하였다.
그래프로부터의 상기 내삽된 작동 결합 용량들을 사용하여 하기 Equation 4(여기서, RT는 1 개의 컬럼에 걸친 체류 시간(총 체류 시간이 아님)이고, C O 는 피드 농도임)의 식을 적용함으로써 총 체류 시간의 범위 상에서 로드 시간을 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00022
상기 로드 시간을 사용하여 총 체류 시간의 범위 상에서 싸이클 시간을 계산하였다. 상기 계산은 각 체류 시간에 적용되는 (하기)Equation 5(여기서, t C 는 싸이클 시간과 같고, t L 은 로드 시간과 같고, N L 은 로드 존 내 컬럼들의 개수와 같고, t R 은 휴지 시간 또는 세척, 용출, 및 재생을 수행하기 위한 시간과 같음)에서 나타난다.
Figure 112016052570549-pat00023
각 체류 시간과 연관된 생산성을 (하기)Equation 6(여기서 P는 생산성임)을 사용하여 계산하였다. 이론적인 생산성 대 총 체류 시간의 플롯을 도 6에 도시하였다.
Figure 112016052570549-pat00024
방법을 시행하기 위해 요구되는 총 컬럼들의 개수는 로딩된 컬럼들의 개수와, 로딩이 연속적이고 중단되지 않도록 휴지(세척/용출/재생)에서 요구되는 컬럼들의 개수를 더한 합이다. 이는 (하기)Equation 7(여기서, N C 는 컬럼들의 총 개수임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00025
상기 싸이클 시간은 컬럼들의 개수에 의해 나누어질 수 있어야 한다. 나누어질 수 있지 않은 상황에서는, 유휴 시간을 싸이클 시간에 더하였다. 싸이클 시간을 향상시키는 것은 생산성을 감소시킨다. 상기 실제 생산성(P actual )을 (하기)Equation 8을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00026
실시예 5
이 실시예는 2 개 및 3 개의 컬럼들(MabSelect SuRe 사전 포장된 하이-트랩 컬럼들(0.962 mL))을 이용하고; 데이지 체인 방식에 의해 함께 결합된 정화된 IgG2 단일 클론 항체(2 mg/mL 농도) 및 시판되는 바이오 센서를 사용한 분별을 통한 용출의 수량화를 사용하여 본 발명의 일 구현예에 따른 OBC을 결정하는 것을 설명한다.
(1a) 3 개의 파과 실험들을 체인 내 단일 컬럼에 걸쳐 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 데이지 체인 방식에 의해 함께 결합된 2 개의 컬럼들 상에서 수행하였다. (1b) 3 개의 파과 실험들을 체인 내 단일 컬럼에 걸쳐 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 데이지 체인 방식에 의해 함께 결합된 3 개의 컬럼들 상에서 수행하였다.
상기 데이지 체인 컬럼들의 배출구에서의 농도를 AKTA™ Avant(GE Healthcare Lifesciences사)를 사용하여 60 개의 1 mL 분획들로 분별하였다. 각각의 분획을 Tween 20 및 보빈 세럼 알부민(bovine serum albumin)(BSA)을 포함하는 희석액(Pall ForteBio 유한회사, Menlo Park, 캘리포니아)을 사용하여 10배 희석시키고, 농도를 단백질 A 바이오 센서(Pall ForteBio 유한회사, Menlo Park, 캘리포니아)를 사용하여 수량화하였다. 농도 값을 작동 결합 용량 계산을 위해 시간에 대하여 플롯하고, 예시적인 추출된 파과 곡선을 도 3에 도시하였다.
상기 로드 시간, tDBC를 각각의 파과 실험(1a; 1b)으로부터의 파과 곡선을 사용하여 10% 결과물 파과를 제조하기 위해 요구되는 결과물 질량의 80%가 로딩된 시간을 확인함으로써 계산하였다.
상기 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 작동 결합 용량(OBC)을 결정하기 위해, 단일 컬럼을 2 개의 데이지 체인 컬럼들(동일한 개별적인 체류 시간을 가짐)을 로딩함으로써 발생한 10% 파과 곡선의 80%에 의해 결정된 로드 시간을 사용하여 선택된 체류 시간(예를 들어, 0.5 분)에서 로딩하였다. 이를 3 개의 단일 컬럼 실험 전부에 대해 (1a)에서 특정된 1 세트의 선택된 로드 체류 시간 동안 반복하였다.
상기 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 작동 결합 용량(OBC)을 결정하기 위해, 단일 컬럼을 선택된 체류 시간(예를 들어, 0.5 분)에서 3 개의 데이지 체인 컬럼들(동일한 개별적인 체류 시간을 가짐)을 로딩함으로써 발생한 10% 파과 곡선의 80%에 의해 결정된 로드 시간을 사용하여 로딩하였다. 이를 3 개의 단일 컬럼 실험 전부에 대해 (1b)에서 특정된 세트의 선택된 로드 체류 시간 동안 반복하였다.
로딩 후에, 상기 컬럼을 결합된 물질의 95% 내지 100%의 회수를 보장하는 완충제를 사용하여 용출시키고, 컬럼에 결합된 양을 결정하기 위해 상기 용출을 측정하였다. 결합된 양은 로드 존 내 2 개의 컬럼들 및 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 MCC 방법에 대한 작동 결합 용량과 같다.
상기 로드 존 내 N 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법에 대한 이상적인 작동 결합 용량은 N 번째 컬럼의 배출구에서 파과가 나타나기 바로 직전에 제1 컬럼에 결합된 양이다. (1a) 및 (1b)에서, 도 4a 및 도 4b에 묘사된 바(아래 곡선)와 같이 2 개의 컬럼들을 데이지 체인 방식에 의해 결합하고, 결과물 파과를 추적하기 위해 2 개의 UV 검출기들을 채용함으로써 파과 곡선을 발생시킨다. 이후, 분리 실험에서, 결과물이 데이지 체인 구성 중 마지막 컬럼에서 파과할 때의 지점에서, 상기 컬럼들을 분리하고 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼에 결합하는 물질의 양은 용출을 수량화함으로써 결정하였다. 이는 파과가 마지막 컬럼 상에서 나타나기 이전에 제1 컬럼에 결합돤 양 X이다.
2 세트의 3 개의 각 실험들에 대한 용출을 수량화하는 것은 3개의 OBC를 생성하고, 각각은 OBC 값을 맞춰진 지점들 사이에 내삽하기 위해 플롯되고 2차 다항식을 사용하여 맞춰질 수 있는 선택된 체류 시간에 각각 상응한다.
가장 정확한 적합도를 제공하지만 적절히 시행하기 위해 더 많은 실험 수고를 요할 수 있는 A - Be -C(t) 형태의 지수 함수를 포함하여 다양한 식을 사용하여, OBC 값을 맞출 수 있다. 작동 결합 용량 대 총 체류 시간의 예를 도 5에 도시하였다.
로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법들을 모델링하기 위해 3 개의 데이지 체인 컬럼들에 상응하는 파과 곡선으로부터 계산되는 로드 시간을 사용하여 선택된 로드 체류 시간의 세트에 대한 실험을 반복하였다. 상기 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 상응하는 체류 시간에 대한 OBC를 플롯하기 위해, 반복된 실험들에 용출 및 상기 용출을 수량화하는 것을 적용하였다.
그래프로부터의 상기 내삽된 작동 결합 용량들을 사용하여 하기 Equation 4(여기서, RT는 1 개의 컬럼에 걸친 체류 시간(총 체류 시간이 아님)이고, C O 는 피드 농도임)의 식을 적용함으로써 총 체류 시간의 범위 상에서 로드 시간을 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00027
상기 로드 시간을 사용하여 총 체류 시간의 범위 상에서 싸이클 시간을 계산하였다. 상기 계산은 각 체류 시간에 적용되는 (하기)Equation 5(여기서, t C 는 싸이클 시간과 같고, t L 은 로드 시간과 같고, N L 은 로드 존 내 컬럼들의 개수와 같고, t R 은 휴지 시간 또는 세척, 용출, 및 재생을 수행하기 위한 시간과 같음)에서 나타난다.
Figure 112016052570549-pat00028
각 체류 시간과 연관된 생산성을 (하기)Equation 6(여기서 P는 생산성임)을 사용하여 계산하였다. 이론적인 생산성 대 총 체류 시간의 플롯을 도 5에 도시하였다.
Figure 112016052570549-pat00029
방법을 시행하기 위해 요구되는 총 컬럼들의 개수는 로딩된 컬럼들의 개수와, 로딩이 연속적이고 중단되지 않도록 휴지(세척/용출/재생)에서 요구되는 컬럼들의 개수를 더한 합이다. 이는 (하기)Equation 7(여기서, N C 는 컬럼들의 총 개수임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00030
상기 싸이클 시간은 컬럼들의 개수에 의해 나누어질 수 있어야 한다. 나누어질 수 있지 않은 상황에서는, 유휴 시간을 싸이클 시간에 더하였다. 싸이클 시간을 증가시키면 생산성이 감소된다. 상기 실제 생산성(P actual )을 (하기)Equation 8을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00031
실시예 6
이 실시예는 2 개 및 3 개의 컬럼들(MabSelect SuRe 사전 포장된 하이-트랩 컬럼들(0.962 mL))를 이용하고; 데이지 체인 방식에 의해 함께 결합된 정화된 IgG2 단일 클론 항체(2 mg/mL 농도) 및 파과 곡선의 적분 대신 용출의 수량화(오프-라인 검출기를 사용함)를 사용하여 본 발명의 일 구현예에 따른 OBC를 결정하는 것을 설명한다.
(1a) 3 개의 파과 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 데이지 체인 방식에 의해 함께 결합된 2 개의 컬럼들 상에서 수행하였다. (1b) 3 개의 파과 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 데이지 체인 방식에 의해 함께 결합된 3 개의 컬럼들 상에서 수행하였다.
상기 데이지 체인 컬럼들의 배출구에서의 농도를 직렬 UV 검출기를 사용하여 측정하였다. 상기 결과물 파과 대 시간을 소프트웨어에 의해 기록하고, 작동 결합 용량 계산을 위해 추출하였다. 예시적인 곡선을 도 2에 도시하였다.
상기 로드 시간, tDBC를 각각의 파과 실험(1a; 1b)으로부터의 파과 곡선을 사용하여 10% 결과물 파과를 제조하기 위해 요구되는 결과물 질량의 80%가 로딩된 시간을 확인함으로써 계산하였다.
상기 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 작동 결합 용량(OBC)을 결정하기 위해, 단일 컬럼을 2 개의 데이지 체인 컬럼들(동일한 개별적인 체류 시간을 가짐)을 로딩함으로써 발생한 10% 파과 곡선의 80%에 의해 결정된 로드 시간을 사용하여 선택된 체류 시간(예를 들어, 0.5 분)에서 로딩하였다. 이를 3 개의 단일 컬럼 실험 전부에 대해 (1a)에서 특정된 세트의 선택된 로드 체류 시간 동안 반복하였다.
상기 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 작동 결합 용량(OBC)을 결정하기 위해, 단일 컬럼을 3 개의 데이지 체인 컬럼들(동일한 개별적인 체류 시간을 가짐)을 로딩함으로써 발생한 10% 파과 곡선의 80%에 의해 결정된 로드 시간을 사용하여 선택된 체류 시간(예를 들어, 0.5 분)에서 로딩하였다. 이를 3 개의 단일 컬럼 실험 전부에 대해 (1b)에서 특정된 세트의 선택된 로드 체류 시간 동안 반복하였다.
로딩 후에, 상기 컬럼을 결합된 물질의 95% 내지 100%의 회수를 보장하는 완충제를 사용하여 용출시키고, 컬럼에 결합된 양을 결정하기 위해 상기 용출을 측정하였다. 결합된 양은 로드 존 내 2 개의 컬럼들 및 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 MCC 방법에 대한 작동 결합 용량과 같다.
상기 로드 존 내 N 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법에 대한 이상 작동 결합 용량은 N 번째 컬럼의 배출구에서 파과가 나타나기 바로 직전에 제1 컬럼에 결합된 양이다. (1a) 및 (1b)에서, 도 4a 및 도 4b에 묘사된 바(아래 곡선)와 같이 2 개 및 3개의 컬럼들을 데이지 체인 방식에 의해 결합하고, 결과물 파과를 추적하기 위해 1 개의 UV 검출기들을 채용함으로써 파과 곡선을 발생시킨다. 이후, 분리 실험에서, 결과물이 데이지 체인 구성 중 마지막 컬럼에서 파과할 때의 지점에서, 상기 컬럼들을 분리하고 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼에 결합하는 물질의 양은 용출을 수량화함으로써 결정하였다. 이는 파과가 마지막 컬럼 상에서 나타나기 이전에 제1 컬럼에 결합돤 양 X이다.
2 세트의 3 개의 각 실험들에 대한 용출을 수량화하는 것은 3개의 OBC를 생성하고, 각각은 OBC 값을 맞춰진 지점들 사이에 내삽하기 위해 플롯되고 2차 다항식을 사용하여 맞춰질 수 있는 선택된 체류 시간에 각각 상응한다.
가장 정확한 적합도를 제공하지만 적절히 시행하기 위해 더 많은 실험 수고를 요할 수 있는 A - Be -C(t) 형태의 지수 함수를 포함하여 다양한 식을 사용하여, OBC 값을 맞출 수 있다. 작동 결합 용량 대 총 체류 시간의 예를 도 5에 도시하였다.
로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법들을 모델링하기 위해 3 개의 데이지 체인 컬럼들에 상응하는 파과 곡선으로부터 계산되는 로드 시간을 사용하여 선택된 로드 체류 시간의 세트에 대한 실험을 반복하였다. 상기 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 상응하는 체류 시간에 대한 OBC를 플롯하기 위해, 반복된 실험들에 용출 및 상기 용출을 수량화하는 것을 적용하였다.
그래프로부터의 상기 내삽된 작동 결합 용량들을 사용하여 하기 Equation 4(여기서, RT는 1 개의 컬럼에 걸친 체류 시간(총 체류 시간이 아님)이고, C O 는 피드 농도임)의 식을 적용함으로써 총 체류 시간의 범위 상에서 로드 시간을 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00032
상기 로드 시간을 사용하여 총 체류 시간의 범위 상에서 싸이클 시간을 계산하였다. 상기 계산은 각 체류 시간에 적용되는 (하기)Equation 5(여기서, t C 는 싸이클 시간과 같고, t L 은 로드 시간과 같고, N L 은 로드 존 내 컬럼들의 개수와 같고, t R 은 휴지 시간 또는 세척, 용출, 및 재생을 수행하기 위한 시간과 같음)에서 나타난다.
Figure 112016052570549-pat00033
각 체류 시간과 연관된 생산성을 (하기)Equation 6(여기서 P는 생산성임)을 사용하여 계산하였다. 이론적인 생산성 대 총 체류 시간의 플롯을 도 6에 도시하였다.
Figure 112016052570549-pat00034
방법을 시행하기 위해 요구되는 총 컬럼들의 개수는 로딩된 컬럼들의 개수와, 로딩이 연속적이고 중단되지 않도록 휴지(세척/용출/재생)에서 요구되는 컬럼들의 개수를 더한 합이다. 이는 (하기)Equation 7(여기서, N C 는 컬럼들의 총 개수임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00035
상기 싸이클 시간은 컬럼들의 개수에 의해 나누어질 수 있어야 한다. 나누어질 수 있지 않은 상황에서는, 유휴 시간을 싸이클 시간에 더하였다. 싸이클 시간을 증가시키면 생산성이 감소된다. 상기 실제 생산성(P actual )을 (하기)Equation 8을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00036
실시예 7
이 실시예는 2 개 및 3 개의 데이지 체인 컬럼들(MabSelect SuRe 사전 포장된 하이-트랩 컬럼들(0.962 mL))을 이용하고; 정화된 IgG2 단일 클론 항체(2 mg/mL 농도) 및 1 개의 직렬 UV 검출기를 사용하여 본 발명의 일 구현예에 따른 OBC를 결정하는 것을 설명한다.
(1a) 3 개의 파과 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 단일 컬럼 상에서 수행하였다. (1b) 3 개의 파과 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 데이지 체인 방식에 의해 함께 결합된 2 개의 컬럼들 상에서 수행하였다(즉, 유량을 동일하게 유지하고, 각 컬럼에 걸친 체류 시간을 동일하게 유지하며, 총 합쳐진 체류 시간을 2 배로 함). (1c) 3 개의 파과 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 데이지 체인 방식에 의해 함께 결합된 3 개의 컬럼들 상에서 수행하였다(즉, 유량을 동일하게 유지하고, 각 컬럼에 걸친 체류 시간을 동일하게 유지하며, 총 합쳐진 체류 시간을 3 배로 함).
로드 존 내 N 개의 컬럼들을 모델링하기 위해, 회분식 파과 실험을 (1a)에서 특정된 체류 시간을 사용하여 N 개의 데이지 체인 컬럼들에서 수행하였다.
상기 컬럼들을 하기 표 5에서 요약된 각각의 로딩 단계들 사이에서 세척, 용출, 재생, 및 평형화(총괄하여 "휴지"기로 지칭됨)하였다.
완충제 / 용액 단계 길이 (CV) 체류 시간 (분)
세척 1 1X PBS 5 0.5
세척 2 1X PBS + 0.5M NaCl 10 0.5
세척 3 1X PBS 5 0.5
용출 완충제 100 mM 아세트산
pH 3.0 		10 0.5
CIP 0.1M NaOH 10 1
재-평형화
(Re-equil.) 		1X PBS 10 0.5
각각의 회분식 파과 실험 중의 로딩 단계에서, 상기 컬럼을 포화(즉, 컬럼 밖으로 배출되는 결과물의 농도가 컬럼에 유입되는 결과물의 농도와 같은 상태)에 도달할 때까지 로딩하였다.
상기 컬럼의 배출구에서의 농도를 직렬 UV 검출기를 사용하여 측정하였다. 상기 결과물 파과 대 시간을 소프트웨어에 의해 기록하고, 작동 결합 용량 계산을 위해 추출하였다. 예시적인 곡선을 도 2에 도시하였다.
로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 결과물 파과를 모사하기 위해 하나의 컬럼 및 2 개의 데이지 체인 컬럼들을 사용하여 발생한 파과 곡선들을 상호 간에(동일한 로드 유량을 공유함) 짝을 지웠다. 예를 들어, 하나의 컬럼 및 1 ml/분의 로드 유량을 사용하여 발생한 파과 곡선은 2 개의 컬럼들 및 1 ml/분의 로드 유량을 사용하여 발생한 파과 곡선과 짝을 지웠다. 이를 (1a)에서 선택된 체류 시간과 연관된 모든 로드 유량들에 대해 행하였다.
로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 결과물 파과를 모사하기 위해 하나의 컬럼 및 3 개의 데이지 체인 컬럼들을 사용하여 발생한 파과 곡선들을 상호 간에(동일한 로드 유량을 공유함) 짝을 지웠다. 예를 들어, 하나의 컬럼 및 1 ml/분의 로드 유량을 사용하여 발생한 파과 곡선은 2 개의 컬럼들 및 1 ml/분의 로드 유량을 사용하여 발생한 파과 곡선과 짝을 지웠다. 이를 (1a)에서 선택된 체류 시간과 연관된 모든 로드 유량들에 대해 행하였다.
상기 로드 존 내 N 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법에 대한 이상적인 작동 결합 용량은 N 번째 컬럼의 배출구에서 파과가 나타나기 바로 직전에 제1 컬럼에 결합된 양이다. 이전의 두 단락에서, 도 4a 및 도 4b에 묘사된 바(아래 곡선)와 같이 2 개 및 3 개의 컬럼들을 데이지 체인 방식에 의해 결합하고, 결과물 파과를 추적하기 위해 하나의 UV 검출기를 채용함으로써 파과 곡선을 발생시킨다. 이후, 분리 실험에서, 상기 컬럼들을 분리하고, 일련의 컬럼들 중 바로 제1 컬럼에 걸친 결과물 파과를 모사하여 도 4b(위 곡선)에 묘사된 곡선을 발생시키기 위해 단일 컬럼 상에서 상기 실험을 수행하였다.
상기에서 확인된 2 개 또는 3 개의 컬럼들에 상응하는 파과 곡선을 사용하여 결과물이 막 파과하려는 시간, tDBC를 결정할 수 있다.
10% 결과물 파과를 제조하기 위해 요구되는 결과물 질량의 80%가 로딩된 시간을 확인함으로써 tDBC를 계산하였다.
tDBC를 단일 유닛 컬럼을 로딩함으로써 발생한 파과에 대한 적분 상한선으로 사용하였다. 이 파과 곡선을 0부터 상한선 f R * tDBC까지 적분하여, 하기 Equation 1(여기서, m FT 는 통과액 내 결과물의 양이며, C out 은 주어진 로드 유량에서의 단일 유닛 컬럼에 상응하는 파과 곡선을 나타냄)에서 나타난 통과액 내 존재하는 결과물의 양을 결정하였다.
Figure 112016052570549-pat00037
로딩된 결과물의 양, m L 을 하기 Equation 2(여기서, C O 는 피드 농도, v L 은 로딩되었던 부피이며, v O 는 상기 컬럼 내의 공극 부피임)에서 나타난 식을 적용함으로써 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00038
상기 이상 작동 결합 용량(OBC)을 하기 Equation 3 내 식을 적용함으로써 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00039
전술한 방법을 파과 곡선의 모든 쌍에 적용하여 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 상응하는 3 개의 작동 결합 용량들 및 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법에 상응하는 3 개의 작동 결합 용량들을 발생시킨다.
(3 개의) 작동 용량들의 각 세트를 총 체류 시간에 대하여 플롯하고, OBC 값을 맞춰진 지점들 사이에 내삽하기 위해, 2차 다항식을 사용하여 맞출 수 있다. 가장 정확한 적합도를 제공하지만 적절히 시행하기 위해 더 많은 실험 수고를 요할 수 있는 A - Be -C(t) 형태의 지수 함수를 포함하여 다양한 식을 사용하여, OBC 값을 맞출 수 있다. 작동 결합 용량 대 총 체류 시간의 예를 도 5에 도시하였다.
상기 내삽된 작동 결합 용량을 사용하여 하기 Equation 4(여기서, RT는 1 개의 컬럼에 걸친 체류 시간(총 체류 시간이 아님)이고, C O 는 피드 농도임)의 식을 적용함으로써 총 체류 시간의 범위 상에서 로드 시간을 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00040
상기 로드 시간을 사용하여 총 체류 시간의 범위 상에서 싸이클 시간을 계산하였다. 상기 계산은 (하기)Equation 5(여기서, t C 는 싸이클 시간과 같고, t L 은 로드 시간과 같고, N L 은 로드 존 내 컬럼들의 개수와 같고, t R 은 휴지 시간 또는 세척, 용출, 및 재생을 수행하기 위한 시간과 같음)에서 나타난다.
Figure 112016052570549-pat00041
각 체류 시간과 연관된 생산성을 (하기)Equation 6(여기서 P는 생산성임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00042
이론적인 생산성 대 총 체류 시간의 플롯을 도 6에 도시하였다.
방법을 시행하기 위해 요구되는 총 컬럼들의 개수는 로딩된 컬럼들의 개수와, 로딩이 연속적이고 중단되지 않도록 휴지(세척/용출/재생)에서 요구되는 컬럼들의 개수를 더한 합이다. 이는 (하기)Equation 7(여기서, N C 는 컬럼들의 총 개수임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00043
상기 싸이클 시간은 컬럼들의 개수에 의해 나누어질 수 있어야 한다. 나누어질 수 있지 않은 상황에서는, 유휴 시간을 싸이클 시간에 더하였다. 싸이클 시간을 증가시키면 생산성이 감소된다. 상기 실제 생산성(P actual )은 (하기)Equation 8을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00044
실시예 8
이 실시예는 2 개 및 3 개의 데이지 체인 컬럼들(MabSelect SuRe 사전 포장된 하이-트랩 컬럼들(0.962 mL))을 이용하고; 정화된 IgG2 단일 클론 항체(CHO 피드 스톡 중 2.2 mg/mL 농도) 및 시판되는 바이오 센서를 사용한 분획의 수량화를 사용하여 본 발명의 일 구현예에 따른 OBC를 결정하는 것을 설명한다.
(1a) 3 개의 파과 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 단일 컬럼 상에서 수행하였다. (1b) 3 개의 파과 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 데이지 체인 방식에 의해 함께 결합된 2 개의 컬럼들 상에서 수행하였다(즉, 유량을 동일하게 유지하고, 각 컬럼에 걸친 체류 시간을 동일하게 유지하며, 총 합쳐진 체류 시간을 2 배로 함). (1c) 3 개의 파과 실험들을 0.5 분, 1 분, 및 1.5 분의 로드 체류 시간에서 데이지 체인 방식에 의해 함께 결합된 3 개의 컬럼들 상에서 수행하였다(즉, 유량을 동일하게 유지하고, 각 컬럼에 걸친 체류 시간을 동일하게 유지하며, 총 합쳐진 체류 시간을 3 배로 함).
로드 존 내 N 개의 컬럼들을 모델링하기 위해, 회분식 파과 실험을 (1a)에서 특정된 체류 시간을 사용하여 N 개의 데이지 체인 컬럼들에서 수행하였다.
상기 컬럼들을 하기 표 6에서 간단히 서술된 각각의 로딩 단계들 사이에서 세척, 용출, 재생, 및 평형화(총괄하여 "휴지"기로 지칭됨)하였다.
완충제 / 용액 단계 길이 (CV) 체류 시간 (분)
세척 1 1X PBS 5 0.5
세척 2 1X PBS + 0.5M NaCl 10 0.5
세척 3 1X PBS 5 0.5
용출 완충제 100 mM 아세트산
pH 3.0 		10 0.5
CIP 0.1M NaOH 10 1
재-평형화
(Re-equil.) 		1X PBS 10 0.5
각각의 회분식 파과 실험 중의 로딩 단계에서, 상기 컬럼을 포화(즉, 컬럼 밖으로 배출되는 결과물의 농도가 컬럼에 유입되는 결과물의 농도와 같은 상태)에 도달할 때까지 로딩하였다.
상기 컬럼의 배출구에서의 농도를 AKTA™ Avant(GE Healthcare Lifesciences사)를 사용하여 60 개의 1 mL 분획들로 분별하였다. 각각의 분획을 희석액(Pall ForteBio 유한회사, Menlo Park, 캘리포니아)을 사용하여 10배 희석시키고, 농도를 단백질 A 바이오 센서(Pall ForteBio 유한회사, Menlo Park, 캘리포니아)를 사용하여 수량화하였다. 농도 값을 작동 결합 용량 계산을 위해 시간에 대하여 플롯하고, 예시적인 추출된 파과 곡선을 도 3에 도시하였다.
로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 결과물 파과를 모사하기 위해 하나의 컬럼 및 2 개의 데이지 체인 컬럼들을 사용하여 발생한 파과 곡선들을 상호 간에(동일한 로드 유량을 공유함) 짝을 지웠다. 예를 들어, 하나의 컬럼 및 1 ml/분의 로드 유량을 사용하여 발생한 파과 곡선은 2 개의 컬럼들 및 1 ml/분의 로드 유량을 사용하여 발생한 파과 곡선과 짝을 지웠다. 이를 (1a)에서 선택된 체류 시간과 연관된 모든 로드 유량들에 대해 행하였다.
로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법에 대한 결과물 파과를 모사하기 위해 하나의 컬럼 및 3 개의 데이지 체인 컬럼들을 사용하여 발생한 파과 곡선들을 상호 간에(동일한 로드 유량을 공유함) 짝을 지웠다. 예를 들어, 하나의 컬럼 및 1 ml/분의 로드 유량을 사용하여 발생한 파과 곡선은 2 개의 컬럼들 및 1 ml/분의 로드 유량을 사용하여 발생한 파과 곡선과 짝을 지웠다. 이를 (1a)에서 선택된 체류 시간과 연관된 모든 로드 유량들에 대해 행하였다.
상기 로드 존 내 N 개의 컬럼들에 의한 다중-컬럼 방법에 대한 이상적인 작동 결합 용량은 N 번째 컬럼의 배출구에서 파과가 나타나기 바로 직전에 제1 컬럼에 결합된 양이다. 이전의 두 단락에서, 도 4a 및 도 4b에 묘사된 바(아래 곡선)와 같이 2 개 및 3 개의 컬럼들을 데이지 체인 방식에 의해 결합하고, 결과물 파과를 추적하기 위해 하나의 UV 검출기를 채용함으로써 파과 곡선을 발생시킨다. 이후, 분리 실험에서, 상기 컬럼들을 분리하고, 일련의 컬럼들 중 바로 제1 컬럼에 걸친 결과물 파과를 모사하여 도 4b(위 곡선)에 묘사된 곡선을 발생시키기 위해 단일 컬럼 상에서 상기 실험을 수행하였다.
상기에서 확인된 2 개 또는 3 개의 컬럼들에 상응하는 파과 곡선을 사용하여 결과물이 막 파과하려는 시간, tDBC를 결정할 수 있다.
10% 결과물 파과를 제조하기 위해 요구되는 결과물 질량의 80%가 로딩된 시간을 확인함으로써 tDBC를 계산하였다.
tDBC를 단일 유닛 컬럼을 로딩함으로써 발생한 파과에 대한 적분 상한선으로 사용하였다. 이 파과 곡선을 0부터 상한선 f R * tDBC까지 적분하여, 하기 Equation 1(여기서, m FT 는 통과액 내 결과물의 양이며, C out 은 주어진 로드 유량에서의 단일 유닛 컬럼에 상응하는 파과 곡선을 나타냄)에서 나타난 통과액 내 존재하는 결과물의 양을 결정하였다.
Figure 112016052570549-pat00045
로딩된 결과물의 양, m L 을 하기 Equation 2(여기서, C O 는 피드 농도, v L 은 로딩되었던 부피이며, v O 는 상기 컬럼 내의 보이드 부피임)에서 나타난 식을 적용함으로써 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00046
상기 이상 작동 결합 용량(OBC)을 하기 Equation 3 내 식을 적용함으로써 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00047
전술한 방법을 파과 곡선의 모든 쌍에 적용하여 로드 존 내 2 개의 컬럼들에 의한 방법에 상응하는 3 개의 작동 결합 용량들 및 로드 존 내 3 개의 컬럼들에 의한 방법에 상응하는 3 개의 작동 결합 용량들을 발생시킨다.
(3 개의) 작동 용량들의 각 세트를 총 체류 시간에 대하여 플롯하고, OBC 값을 맞춰진 지점들 사이에 내삽하기 위해, 2차 다항식을 사용하여 맞출 수 있다. 가장 정확한 적합도를 제공하지만 적절히 시행하기 위해 더 많은 실험 수고를 요할 수 있는 A - Be -C(t) 형태의 지수 함수를 포함하여 다양한 식을 사용하여, OBC 값을 맞출 수 있다. 작동 결합 용량 대 총 체류 시간의 예를 도 7에 도시하였다.
상기 내삽된 작동 결합 용량을 사용하여 하기 Equation 4(여기서, RT는 1 개의 컬럼에 걸친 체류 시간(총 체류 시간이 아님)이고, C O 는 피드 농도임)의 식을 적용함으로써 총 체류 시간의 범위 상에서 로드 시간을 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00048
상기 로드 시간을 사용하여 총 체류 시간의 범위 상에서 싸이클 시간을 계산하였다. 상기 계산은 (하기)Equation 5(여기서, t C 는 싸이클 시간과 같고, t L 은 로드 시간과 같고, N L 은 로드 존 내 컬럼들의 개수와 같고, t R 은 휴지 시간 또는 세척, 용출, 및 재생을 수행하기 위한 시간과 같음)에서 나타난다.
Figure 112016052570549-pat00049
각 체류 시간과 연관된 생산성을 (하기)Equation 6(여기서 P는 생산성임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00050
이론적인 생산성 대 총 체류 시간의 플롯을 도 8에 도시하였다.
방법을 시행하기 위해 요구되는 총 컬럼들의 개수는 로딩된 컬럼들의 개수와, 로딩이 연속적이고 중단되지 않도록 휴지(세척/용출/재생)에서 요구되는 컬럼들의 개수를 더한 합이다. 이는 (하기)Equation 7(여기서, N C 는 컬럼들의 총 개수임)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00051
상기 싸이클 시간은 컬럼들의 개수에 의해 나누어질 수 있어야 한다. 나누어질 수 있지 않은 상황에서는, 유휴 시간을 싸이클 시간에 더하였다. 싸이클 시간을 증가시키면 생산성이 감소된다. 상기 실제 생산성(P actual )은 (하기)Equation 8을 사용하여 계산하였다.
Figure 112016052570549-pat00052
실시예 9
이 실시예는 본 발명의 일 구현예를 사용하여 포착 효율(capture efficiency)을 정확히 예측하는 것을 설명한다.
4 개의 MCC 방법들(여기서, 2 개의 컬럼들은 로드 존 내에 있고, 2 개는 방법의 휴지 중에 있음)을 5 개의 작동 용량들에서 수행하였다. 결과들은 하기 표 7과 같다:
로딩량( OBC ) (mg/mL 수지) 예측된 포착 효율 (%) 실제 포착 효율 (%)
31.8 99.8 99.7
39.6 99.3 99.3
42.1 98.3 98
46.6 95 94.8
50.5 90 91.6
측정된 모든 포착 효율들은 예측된 포착 효율들의 2% 내이다. 이는 OBC를 계산하기 위해 사용된 방법이 MCC 방법 내의 실제의 OBC에 근접하여 근사치를 내고 있음이 확인된다.
본 명세서에서 인용된, 간행물, 특허출원 및 특허를 포함하는 모든 인용문헌은 인용에 의하여 본 명세서에 통합되는데, 이는, 각 문헌이 인용에 의하여 통합되는 것으로 개별적으로 그리고 구체적으로 표시되고 그 전체가 본 명세서에 기재되어 있는 것과 마찬가지의 효과를 갖는다.
본 발명을 기술하는 문맥에서(특히, 하기 청구항의 문맥에서), "하나의", "일", "상기", "적어도 하나의" 등의 용어 및 이와 유사한 단수 지시어의 사용은, 본 명세서에서 달리 표시되거나 문맥상 명백한 모순이 발생하지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 열거된 하나 이상의 항목의 앞에 나오는 "적어도 하나의"라는 용어의 사용(예를 들어, "적어도 하나의 A 및 B")은, 본 명세서에서 달리 표시되거나 문맥상 명백한 모순이 발생하지 않는 한, 열거된 항목들 중에서 선택된 하나의 항목(A 또는 B)을 의미하거나, 또는, 열거된 항목들의 둘 이상의 임의의 조합(A 및 B)을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. "포함하는(comprising 또는 including)", "갖는", "함유하는" 등의 용어는 개방형 종결용어(즉, "포함하되 이에 제한되지 않는"의 의미)인 것으로 해석되어야 한다. 다만, 달리 표시된 경우에는 그러하지 아니하다. 본 명세서에서의 수치 범위의 언급은, 본 명세서에 달리 표시되어 있지 않은 한, 그 범위 내에 들어오는 각각의 수치들을 개별적으로 일일이 언급하는 것의 축약법의 역할을 하고자 하는 것으로 단순히 의도되며, 각각의 개별적인 수치는, 마치 그것이 본 명세서에 개별적으로 언급된 것인 양, 본 명세서에 통합된다. 본 명세서에서 기술된 모든 방법은 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 다만, 달리 표시되거나 문맥상 명백히 모순되는 경우에는 그러하지 아니하다. 본 명세서에 제공된 임의의 모든 예들 또는 예시적인 표현(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하는 것으로 의도되며, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위에 제한을 부과하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 표현도, 임의의 청구되지 않은 요소를, 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 표시하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명을 수행하는데 있어서 본 발명자에게 알려진 베스트 모드를 포함하는 본 발명의 바람직한 구현예가 본 명세서에 기술되어 있다. 그러한 바람직한 구현예의 변형은, 앞에 기술된 상세한 설명을 읽은 당업자에게는 명백해질 것이다. 본 발명자들이 예상하기에, 당업자는 그러한 변형을 적절하게 채용할 수 있다. 본 발명자들이 의도하는 바는, 본 명세서에 구체적으로 기술된 것과 다른 방식으로도, 본 발명이 수행될 수 있다는 것이다. 따라서, 본 발명은, 관련 법규에 의하여 허용되는 바와 같이, 본 명세서에 첨부된 청구항에 언급된 주제에 대한 모든 변형예 및 균등물을 포함한다. 게다가, 앞에 기술된 요소들의 임의의 조합을 통한 모든 가능한 변형예도 본 발명의 범위에 속하며, 다만 본 명세서에 달리 표시되어 있거나 문맥상 명백하게 모순되는 경우에는 그러하지 아니하다.

Claims (6)

  1. 단일 컬럼을 사용하여 다중 컬럼 크로마토그래피(MCC) 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량을 결정하는 방법으로서, 상기 MCC 방법은 N 개의 컬럼을 포함하고, 상기 결정 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법:
    (a) 표적 물질을 제1 체류 시간 또는 제1 유량으로 제1 컬럼 상에 로딩하는 단계;
    (b) 상기 표적 물질을 제2 체류 시간 또는 제2 유량으로 상기 제1 컬럼 상에 로딩하는 단계로서, 상기 제1 체류 시간 또는 제1 유량은 상기 제2 체류 시간 또는 제2 유량과 상이한 단계;
    (c) 상기 제1 체류 시간 또는 제1 유량에 대한 제1 파과 곡선(breakthrough curve) 및 상기 제2 체류 시간 또는 제2 유량에 대한 제2 파과 곡선을 발생시키는 단계로서, 상기 제1 파과 곡선은 상기 제1 칼럼에 대한 표적 물질 파과를 나타내고, 상기 제2 파과 곡선은 상기 N 개의 컬럼 내의 N 번째 컬럼에 대한 표적 물질 파과를 나타내는 단계; 및
    (d) 상기 파과 곡선들을 사용하여 상기 N 번째 컬럼에서의 표적 물질 파과 이전의 상기 제1 컬럼의 표적 물질 로딩 용량을 결정하는 단계로서, 상기 제1 컬럼의 표적 물질 로딩 용량은 상기 MCC 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량과 동일한 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    N은 2이고, 상기 제2 체류 시간은 상기 제1 체류 시간의 2 배이거나 또는 상기 제2 유량은 상기 제1 유량의 1/2 배인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    N은 3이고, 상기 제2 체류 시간은 상기 제1 체류 시간의 3 배이거나 또는 상기 제2 유량은 상기 제1 유량의 1/3 배인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 MCC 방법은 N 개의 컬럼을 포함하고, 여기서 N은 2 이상이고, 상기 제1 체류 시간 또는 제1 유량은 단일 컬럼에서 결정되고, 상기 제2 체류 시간 또는 제2 유량은 N 개의 컬럼들에 걸친 체류 시간 또는 유량과 동일한 방법.
  5. 다중 컬럼 크로마토그래피(MCC) 방법에 대한 작동 결합 용량을 최적화하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법:
    (a) 동일한 크기의 제1 컬럼 및 제2 컬럼을 직렬로 연결하는 단계;
    (b) 표적 물질을 일정한 유량으로 상기 컬럼들 상에 로딩하여, 상기 컬럼들을 통과하는 예정된 체류 시간을 제공하는 단계;
    (c) 상기 예정된 체류 시간에 대한 파과 곡선을 발생시키는 단계로서, 상기 파과 곡선은 시간에 대한 표적 물질 농도의 함수로서 표적 물질 파과를 나타내는 단계; 및
    (d) 상기 파과 곡선을 사용하여 상기 제2 컬럼에서의 상기 표적 물질 파과 이전의 상기 제1 컬럼의 표적 물질 로딩 용량을 결정하는 단계로서, 상기 제1 컬럼의 표적 물질 로딩 용량은 상기 MCC 방법에 대한 최적의 작동 결합 용량과 동일한 단계.
  6. 삭제
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