CN106353440A - 多柱色谱法的优化操作结合能力 - Google Patents

多柱色谱法的优化操作结合能力 Download PDF

Info

Publication number
CN106353440A
CN106353440A CN201610642206.3A CN201610642206A CN106353440A CN 106353440 A CN106353440 A CN 106353440A CN 201610642206 A CN201610642206 A CN 201610642206A CN 106353440 A CN106353440 A CN 106353440A
Authority
CN
China
Prior art keywords
time
post
staying
loading
product
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610642206.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106353440B (zh
Inventor
X·乔卡
K·K·罗杰
M·J·斯科菲尔德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sedolis Stede chromatographic system Co., Ltd
Original Assignee
Pall Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pall Corp filed Critical Pall Corp
Publication of CN106353440A publication Critical patent/CN106353440A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106353440B publication Critical patent/CN106353440B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/60—Construction of the column
    • G01N30/6034—Construction of the column joining multiple columns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8658—Optimising operation parameters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N30/46—Flow patterns using more than one column
    • G01N30/461—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1864—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N2030/382—Flow patterns flow switching in a single column
    • G01N2030/385—Flow patterns flow switching in a single column by switching valves
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N2030/628—Multiplexing, i.e. several columns sharing a single detector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/889—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 monitoring the quality of the stationary phase; column performance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N30/46—Flow patterns using more than one column
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于多柱色谱(MCC)法的优化操作结合能力的方法。

Description

多柱色谱法的优化操作结合能力
发明背景
柱色谱分离典型地使用柱，所述柱具有入口和出口并包含吸附剂，所述吸收剂用于结合在样品流体中存在的希望的分子(目标产物)，使得随着流体流经所述柱，目标产物被结合并与样品流体中的其它分子分离。
柱色谱周期涉及相继实施的数个阶段。“装载”阶段涉及通过使样品流体(进料)经过入口来装载所述柱，使得进料与吸附剂接触，并结合一定量的目标产物。结合至柱中的吸附剂的目标产物的量称为柱的结合能力。未结合的目标产物以及其它分子(可以包括污染物)与流体一起经过出口。色谱周期的其它阶段例如包括洗涤所述柱、洗脱目标产物、再生吸附剂和使所述柱平衡。
多柱色谱(MCC)涉及装载两个或更多个串联连接的色谱柱，其中进料样品由第一色谱柱(包含吸附剂)的入口，经过第一柱的出口并进入第二色谱柱(包含吸附剂)的入口，经过第二柱的出口，等等，取决于连接了多少个柱。这允许第一柱过载，并且经过第一柱的目标产物(否则将损失成为废弃物)被后续的柱捕集。在MCC中，可装载一个柱，同时所述周期中的另一个阶段可以在另一个柱中实施。当第一柱过载并且目标产物传递至第二柱时，这可被称为“第二程”，因为过载的目标产物传递至第二柱内。取决于柱的数量，因为过载的目标产物传递至第三柱内，可以存在第三程，等等。对于完整的色谱周期，每个柱必须经历每个阶段，例如“第二程”(先前柱的过载)、“装载”(直接装载到柱中的进料)、洗涤、洗脱、再生和平衡。
然而，MCC复杂，并且存在对于改进的MCC方法发展的需求。
发明概述
在一种实施方式中，公开了一种多柱色谱(MCC)法的优化操作结合能力的方法，所述方法包括(a)以第一停留时间和/或第一流速在柱上装载目标产物；(b)以第二停留时间和/或第二流速在柱上装载目标产物，其中第一停留时间和/或第一流速不同于第二停留时间和/或第二流速；(c)对于第一停留时间和/或第一流速以及第二停留时间和/或第二流速，产生穿透曲线；和(d)确定MCC法的优化操作结合能力。典型地，第二停留时间约为第一停留时间的两倍，和/或第二流速约为第一流速的一半。
在一种实施方式中，所述方法进一步包括(b’)以第三停留时间和/或第三流速在柱上装载目标产物，其中第三停留时间和/或第三流速不同于第一和第二停留时间和/或第一和第二流速；(c’)对于第一停留时间和/或第一流速、第二停留时间和/或第二流速以及第三停留时间和/或第三流速，产生穿透曲线；和(d’)确定MCC法的优化操作结合能力。典型地，第三停留时间约为第一停留时间的三倍，和/或第三流速约为第一流速的三分之一。
在另一种实施方式中，用于多柱色谱(MCC)法的优化操作结合能力的方法包括(a)串联连接至少两个相等尺寸的柱；(b)以恒定流速在柱上装载目标产物，从而提供经过所述柱的预定停留时间；和(c)确定MCC法的最优操作结合能力。
附图说明
图1A、1B和1C图示出在单个MCC色谱周期中流经3个柱(“装载”、“第二程”和“其余”)，其中“其余”涉及洗涤、洗脱、再生和平衡。
图2示出通过如在实施例1、3、6和7中描述的UV检测产生的说明性穿透曲线。
图3示出通过如在实施例2、4、5和8中描述的分级和定量产生的说明性穿透曲线。
图4A说明性地示出两个互连的柱，每个均连接至UV检测器；图4B示出由每个检测器产生的说明性穿透曲线。这些曲线可被用于计算在最后发生产物穿透之前，结合至第一柱的量；图4C说明性地示出停留时间和柱的数量之间关系的图示。
图5说明性地示出对于如在实施例1和3-7中描述的双柱和三柱来说，操作结合能力与总停留时间的关系。
图6示出对于如在实施例1和3-7中描述的双柱和三柱来说，理论生产率与总停留时间的关系。
图7说明性地示出对于如在实施例2和8中描述的双柱和三柱来说，操作结合能力与总停留时间的关系。
图8示出对于如在实施例2和8中描述的双柱和三柱来说，理论生产率与总停留时间的关系。
图9示出提供可用于选择MCC法策略的最优生产率的预测模型，其中方法建模策略适用于由在单柱上实施的13个饱和穿透试验产生的穿透曲线。
发明详述
根据本发明，确定MCC法的最优操作结合能力。由此，在根据本发明方法的一种实施方式中，在单柱上以不同的停留时间和/或不同的流速实施两个或更多个(典型地2至12个)装载试验，从而确定MCC法的最优操作结合能力。可替换地，在另一种实施方式中，可以串联地布置相等尺寸的两个或更多个柱(“菊花链”)，并且可保持流动恒定，从而提供用以确定最优操作结合能力的希望停留时间。
根据本发明的实施方式，柱并不总是必须装载目标产物至饱和。例如，在所述柱的出口处实现10％或20％的穿透是足够的。
所述方法的实施方式可以包括分析用于穿透的洗脱物级分，或者使用与洗脱线相关联的检测器来确定目标产物在洗脱线中的存在。
有利地，MCC法中，所确定的最优操作结合能力表示恰在串联的最后柱的穿透之前，由第一柱结合的目标产物的量。优选地，操作参数(例如在某流速范围内，待在多柱法中装载的产物最优量)可以使用数个在单柱上实施的简单试验来确定。操作能力的精确预测能够评估许多其它的多柱法参数，例如生产率、周期时间、总柱数和/或缓冲应用。一系列流速范围的使用所提供的数据点可被拟合并内插从而根据停留时间优化一个或多个目标参数。
其它的优点例如包括，如果MCC法涉及脆性蛋白质的快速加工，那么用户可以精确地指出哪个操作参数来实现最快的加工时间。如果时间不太重要，并且方法的焦点在于性能利用，那么性能利用可被优化。如果关注成本，那么加工经济型软件可被用于使成本最小化。如果需要，可以优化生物制药生产场地中与多柱色谱法相关的任何项目。
在一种实施方式中，提供了一种多柱色谱(MCC)法的优化操作结合能力的方法，所述方法包括(a)以第一停留时间和/或第一流速在柱上装载目标产物；(b)以第二停留时间和/或第二流速在柱上装载目标产物，其中第一停留时间和/或第一流速不同于第二停留时间和/或第二流速；(c)对于第一停留时间和/或第一流速以及第二停留时间和/或第二流速，产生穿透曲线；和(d)确定MCC法的优化操作结合能力。典型地，第二停留时间约为第一停留时间的两倍，和/或第二流速约为第一流速的一半。
在一种实施方式中，MCC法包括N个柱，并且确定单个柱的第一停留时间和/或第一流速，而且第二停留时间和/或第二流速等于贯穿经过N个柱的停留时间和/或流速。
在一种实施方式中，所述方法进一步包括(b’)以第三停留时间和/或第三流速在柱上装载目标产物，其中第三停留时间和/或第三流速不同于第一和第二停留时间和/或第一和第二流速；(c’)对于第一停留时间和/或第一流速、第二停留时间和/或第二流速以及第三停留时间和/或第三流速，生成穿透曲线；和(d)确定MCC的最优操作结合能力。典型地，第三停留时间约为第一停留时间的三倍，和/或第三流速约为第一流速的三分之一。
在另一种实施方式中，多柱色谱(MCC)法的优化操作结合能力的方法包括(a)串联连接至少两个相等尺寸的柱；(b)以恒定流速在柱上装载目标产物，从而提供经过所述柱的预定停留时间；和(c)确定MCC法的最优操作结合能力。
在一个实例中使用两个柱系统，如果需要，在所述方法开始时，第一装载步骤可以具有提高的装载，其中所述装载为X+Y，表示结合至第一柱的量(柱“A”中的量“X”)和结合至第二柱的量(柱“B”中的量“Y”)。有利地，这可以“迫使”所述系统以稳定状态立即启动，避免在某些方法中会观察到的至稳定状态的过渡。
为了提供用以理解本发明的框架，并且使用图1作为参考，期望以稳定状态操作MCC，使得每个柱被相同地处理，并且每个周期是相同的。这确保了生产率和产物质量保持一致。在图1中，当B柱移出装载区域，随着所述柱进入其余阶段(并随后被洗脱)，结合至柱的目标产物的量被从所述系统去除。为了使操作处于稳定状态，来自进料样品的相同量的目标产物必须在下一个装载周期中添加回所述系统。这就确定了所述方法以什么样的结合能力来操作，即操作结合能力。操作能力被定义为每升吸附剂所结合的目标产物克数。当串联的第二柱被装载(接收第二程)直至恰在产物穿透之前发生理想的操作结合能力。在理想的操作结合能力下，尽可能多的目标产物将被结合至柱内，所述柱直接接受进料样品装载，而无任何产物损失。
在流经单柱和装载区域的时间之后，柱(图1A-1C中的柱A)起初作为串联的第二柱而启动。如此，柱A接收源自串联的第一柱、装载柱(直接接收进料)、柱B的流过物。装载柱起初将结合所有的目标产物，使得至柱A上的(第二程)装载将不包含目标产物。当所述装载柱接近并随后超过其动态结合能力时，目标产物将开始流过装载柱。由此，第二程柱将开始以零浓度接收产物，但是在一段时间之后，随着越来越多的目标产物穿透第一柱，装载浓度将开始增加。在该阶段完成之后，处于第二程的柱变为装载柱，并且其直接接收装载。在所述柱上装载的目标产物浓度是相对高和恒定的。
目标在于将尽可能多的目标产物施加至装载柱，而不损失任何目标产物。因此，恰在目标从第二程柱穿透(或者如果存在多于两个串联的柱，串联连接最后的柱)之前，停止装载。由于多步装载，确定在MCC法中装载的量是复杂的，即在直接装载之前，柱将处于第二程中。这使得理解方法应当以什么样的操作结合能力被实施富有挑战性。考虑到停留时间，所述挑战变得更加复杂。增加停留时间可以提高容量，并且减少停留时间将降低容量。然而，增加停留时间通过减慢经过柱的流速来实现，并且对于装载步骤来说，这要求时间增长。
因为生产率可被理解为容量/周期时间，所以导致提高的容量的长停留时间还会增加周期时间。发明人已经认识到这样的两个因素，性能和周期时间，均受到停留时间的影响，并且认识到存在优化停留时间来实施MCC方法，从而在最优生产率下进行操作。发明人令人惊讶地并且出乎意料地发现这种多阶段装载并不会对柱的容量产生影响，或者对目标产物由柱穿透产生影响。由此，发明人认识到，如果柱被串联连接(并且直接装载至饱和(不存在数值变化以模拟柱的反向运动))，恰在串联的最后的柱穿透之前，由第一柱结合的目标产物的量为理想操作结合能力。所述方法被优化：装载更多的目标产物导致目标产物损失，装载较少的目标产物导致少于最优化的柱使用。
根据本发明使用如下的定义。
分批色谱法-在单柱上实施的传统色谱法，达到饱和并在所述柱内产生结合曲线，所述结合曲线几乎等同于在多柱捕集方法中迭代装载的(串联连接的)柱的结合曲线。
结合能力或容量-每毫升的吸附剂结合的目标或产物的mg数。
穿透曲线-随着用流体在入口处装载柱，所述柱在出口处的产物浓度图(可以相对于时间、装载质量或装载体积绘图)。
穿透试验-其中使用产物来过载柱以便确保产物在出口处穿透，从而获得穿透曲线图的试验(柱典型地装载至其动态结合能力的100％)。
捕集效率-在柱的入口处由吸附剂结合的所装载的产物的百分比。
柱饱和-其中柱接近其动态结合能力的约100％并且在入口处装载额外的产物将不会导致更高容量的点。
周期时间-一个柱完成整套色谱单元操作(装载、洗涤、洗脱、再生和平衡)所需要的时间的量。
动态结合能力-在流动相中的产物流过固定相的条件下，每毫升的吸附剂结合的产物的mg数。
流过物-离开使用进料物质进行装载的柱的出口的产物总量。
装载停留时间-进料物质(包含产物)被装载至柱上的停留时间条件。
装载时间-在多柱色谱法的装载阶段中，装载第一柱所需要的时间量。
装载区域-多柱色谱法的装载阶段，其中两个或更多个柱(串联连接的)直接或间接接收进料物质。
柱的数量-操作多柱色谱法所需要的总柱数(填充给定量的吸附剂体积)。
操作结合能力-装载的产物量除以柱体积。
生产率-每升吸附剂每小时处理的产物克数(操作结合能力/周期时间)。
停留时间-流动相中末相互作用的颗粒经过固定相的体积所花费的时间量(吸附剂体积/流速)。
其余或其余过程-色谱法周期中，未涉及将产物装载至吸附剂上的所有步骤(洗涤、洗脱、再生、平衡)。
其余停留时间-其余过程条件下的停留时间。
吸附剂/树脂-由涂覆有配位体的小的多孔聚合物珠组成的材料，其具有在色谱法中对于从流动相捕集产物所必须的希望的化学性。
静态结合能力-在非流动的条件下固定相能够结合的产物的量。
启动结合能力-为了以稳定状态开始多柱法所要求装载的产物量。
稳定状态-多柱法中不变化的条件，其中容量、纯度和生产率在不同的周期之间恒定。
10％DBC的80％-在柱的出口处达到10％进料浓度所要求的体积的80％(典型地用作为评估0％动态结合能力，其中在柱的出口处不会测量到产物。)
为了进一步理解本发明如上所述的框架，在具有两个柱的MCC法中，在产物由串联的第二(最后)柱穿透之前，测量结合至第一柱的量可以使用串联连接的两个柱来完成，其中在每个柱的末端具有产物的检测器。这允许人们使用置于所述两个柱之间的检测器，追踪第一柱的产物穿透。产物穿透可表示为流过物中的产物浓度与时间(或者所装载的产物的装载量)的关系图。使用这样的图，称为穿透曲线，通常看到其中整个目标被结合的开始阶段，所以检测器处的浓度为零。当产物穿透并绘图时，形状经常接近s形。图中穿透曲线上方的图中的面积表示结合至所述柱的物质的量。曲线下方的面积表示流经所述柱的材料的量。这种单独的穿透显示出对于单柱操作来说停止装载的最优时间，即恰在产物穿透之前。
然而，使用多柱操作时，装载串联的第一柱直至产物开始穿透串联的最后柱。由此，在串联的最后柱之后，需要检测器来确定当产物穿透时的时间(或者所装载的产物的体积或量)。该信息被用于在目标浓度与时间的关系图上通过限制时间(以及因此所装载的量)来约束第一柱的穿透面积。这允许确定操作能力，所述操作能力为在穿透第二柱之前，结合至第一柱的目标的量。
可替换地，(i)装载柱的穿透曲线可以通过使用单柱以及其后的检测器来测定，并且(ii)其它的穿透曲线可以通过串联连接两个或更多个柱以及在所述柱末端的单独的检测器来测定。
出乎意料地，发现了用于产生穿透曲线的另一种方式，其基于这样的认识，即产物穿透曲线的形状几乎完全依赖于装载柱时所采用的停留时间。该令人惊讶的结果能够仅使用单柱以及在所述柱之后单独的检测器来产生两个穿透曲线，而不是使用两个柱，在每个柱之后均具有检测器。为了模仿MMC情况，一个穿透曲线以所选择的停留时间来实施，并且为了模仿两个串联柱，另一个穿透曲线以两倍于所选择的停留时间来实施。在所选择的停留时间下的穿透曲线用于计算串联的第一柱所结合的量，其中穿透曲线上方的面积表示结合至柱的量。在双倍停留时间下的穿透表示串联的第二柱，并且有必要示出在MMC中可以装载多少产物，而不导致产物损失至流过物。该穿透信息用于确定装载多少产物的极限，并计算对于初始穿透曲线的装载时间或者量极限。使用这两个穿透曲线，能够确定在穿透第二柱之前结合至第一柱的量，其为操作结合能力。这可扩展至三个或更多个串联的柱。说明性地，对于三个串联的柱来说，第二穿透曲线将以三倍于所选择的停留时间来实施，等等。
根据这种框架，可以描述MCC法的优化生产率。上述框架以单独的停留时间确定操作结合能力。然而，为了更好地优化MCC法，应当研究一系列的停留时间。这是因为更长的停留时间可能导致更高的柱容量。然而，更长的停留时间是以更低的装载流速为代价的，这增加了周期时间。因为生产率等于容量除以周期时间，所以停留时间改变分子(容量)和分母(周期时间)。另外，有利的是，确定将更多个柱添加至装载区域是否有益。添加更多个柱也可能导致更高的容量，因为串联的第一柱可被装载甚至更长的时间，因为存在额外的串联柱来捕集流过物中的产物。然而，将更多个柱添加至装载区域导致周期时间增长。据此，应当评价停留时间以及装载区域中柱的数目以确定最大生产率(优化MCC法)。
根据本发明方法的优选实施方式，对于至少两个、并优选三个或更多个停留时间测量容量。这允许产生容量和停留时间的关系模型。
为了理解两个相对于三个(或更多个)串联柱的优势，提供穿透曲线来模拟这些方案。
例如，对于单柱来说，穿透曲线可以以0.5、1和1.5分钟的停留时间来实施。结合至所述柱的量将通过穿透曲线上方的区域来表示。然而，需要表示最后柱的产物穿透(在MCC法中)的第二穿透曲线来限制装载，否则，当由单柱穿透量转移至MCC法时，产物将会损失。
为了确定产物将穿透的点，与两个串联柱相应的穿透曲线将以两倍于所选择的停留时间(在上文的实例中，0.5、1和1.5分钟)来实施，从而提供1、2和3分钟的停留时间的穿透曲线。为了模拟相应的三个串联柱，穿透曲线将以三倍的停留时间(1.5分钟(3×0.5分钟)、3分钟(3×1分钟)和4.5分钟(3×1.5分钟))来实施，等等。
通过选择停留时间(0.5分钟(1倍)、1分钟(2倍)和1.5分钟(3倍))，可以将模拟试验空间所要求的穿透曲线总数限定至六，因为会存在停留时间的重叠或重复(在本部分中加粗高亮显示)。对于如上的实例，为了确定在MCC法中产物如何结合至第一柱，可以以0.5分钟、1分钟和1.5分钟来产生穿透曲线。由此，曲线上方的面积等于由柱所结合的量。然而，需要附加的穿透曲线来确定停止装载的点，使得产物在最后柱上不穿透。对于两个柱装载来说，这意味着以1分钟(2×0.5)、2分钟(2×1)和3分钟(2×1.5)产生附加的一套穿透曲线。对于三柱装载来说，在1.5分钟(3×0.5)、3分钟(3×1)和4.5分钟(3×1.5)要求另一套穿透曲线。因为1分钟、1.5分钟和3分钟停留时间穿透曲线为重复的，可进行一次试验但结果可适用于多于一个方案实施。结果，仅需要六个单柱的穿透曲线。
对于每个穿透试验来说，装载所述柱，直至其达到饱和点。方法周期的其余部分(例如洗涤、洗脱、再生和平衡)使用由技术人员所指定的条件在柱上实施。
如果不存在特定的检测器来检测目标穿透，那么就将在装载步骤期间离开所述柱的流出物分级。典型地，约25-50份产生足够大的样品组以得到良好表示的穿透曲线。以份数表示的目标浓度使用适用于这种应用的分析技术来量化。
由该数据，可以观察到操作结合能力与停留时间的依赖关系。最优停留时间和生产率可以通过采用一系列标准等式来确定：
1、装载时间＝操作结合能力乘以停留时间除以滴定量
2、周期时间＝装载时间加上其余时间
3、生产率＝操作结合能力除以周期时间。
为了确定用串联连接的接收进料的N个柱的多柱法的装载能力，使用用给定的停留时间和N倍于所述停留时间获得的一对穿透曲线。该对曲线使用时间作为x轴和浓度作为y轴一起来绘图。具有更长停留时间的穿透曲线评价在N柱法中最后柱的出口处产物穿透的发展与时间的关系。该曲线用于选择产物将穿透所述柱出口的时间点、T。
所述曲线可被用于：(i)确定时间T10％，产物浓度在该时间下达到进料样品中产物浓度的10％，和(ii)计算T，其为T10％的80％。可替换地，所述曲线可被用于：(i)确定时间T5％，产物浓度在该时间下达到进料样品中产物浓度的5％，和(ii)计算T，其为T10％的75％。T被用作为对所述配时的第二穿透的积分上限(在更短停留时间下的)。这种穿透曲线从零积分至预定上限T，并表示在流过物中存在的产物的量。装载能力等于：{[(所装载的产物质量)-(流过物中的产物质量)]/(柱体积)}。计算所装载的产物质量由{(进料浓度)*(装载体积-空隙体积)}给出。
该步骤可用于与双柱装载相关的每对穿透曲线，使得三个装载能力与三个给出的停留时间相关。所述能力可以相对于停留时间绘图并使用二次多项式拟合以便在拟合的点之间插入容量值。重复这些步骤以对三柱装载产生相同的曲线获得两个容量与停留时间关系图。内插的容量用于计算装载时间，其等于：{(容量*停留时间)/(进料滴定量)}。
装载时间被用于计算周期时间，其等于{(装载时间)+(实施洗涤/洗脱/再生/平衡步骤的时间)}。对内插的容量的范围计算周期时间。
与每个停留时间相关的生产率等于{(容量)/(周期时间)}，并对内插的容量范围进行计算，获得理论生产率与停留时间的关系图。
运行所述方法所需要的总柱数为正被装载的柱的总数加上在周期的其余部分中(洗涤/洗脱/再生)所需要的柱的数目，使得装载为连续的和未间断的。这等于{(周期时间)/(装载时间)}，并对于所需要的总柱数产生非离散的一系列数值。
为了使所计算的总柱数为离散的单独数值，停机时间被加入至周期时间，通过上舍入所计算的总柱数的数值，并将它们因式分解回用于生产率的等式{(生产率)*(总#柱数)/[上舍入(总#柱数)]}。这将理论生产率的计算值转化为实际生产率。
由此，通过测量一系列停留时间的操作结合能力，可以计算用于操作MCC的最优生产率以及用于在该生产率下操作的多个参数。重要的参数例如包括操作结合能力、停留时间、装载区域中的柱数和周期时间。这种方法可用于不同的产物滴定量。有利地，可确定生产率的稳固性。可替换地，或者另外地，也可确定改善上游方法以产生更高滴定量的优点。
包括多种吸附剂(例如珠)的广泛范围的色谱柱适合在本发明中使用，并且其是本领域已知的。
在某些实施方式中，色谱柱为预组装柱，例如，其中，吸附剂通过设备制造商密封在壳体中。在某些其它的实施方式中，吸附剂通过终端用户密封在壳体中。所述设备可适用于处理多种流体，例如用以净化和/或浓缩在流体中存在的一种或多种目标材料。例如，所述设备可适用于处理工艺流体，例如在生物制药工业中使用的流体，例如包括希望的物质的流体，所述希望的物质例如为蛋白质材料例如抗体(例如单克隆抗体)，或者重组蛋白质例如生长因子。
吸附剂可以具有任何希望的特征，例如色谱类型，并且根据本发明可以使用多种珠，包括市售珠，并且是本领域已知的。例如，可以使用多种离子交换珠。在某些实施方式中，吸附剂可以在生理pH和/或离子强度下起作用。合适的吸附剂(例如树脂)包括带电荷的(例如带正电的或者带负电的介质)、混合模式色谱介质、疏水相互作用色谱(HIC)介质、亲和色谱(例如固定化金属亲和色谱(IMAC))介质、生物特异性(例如固定化蛋白质A)亲和色谱介质、疏水电荷感应色谱(HCIC)介质和嗜硫色谱(TC)介质。
下文的实施例进一步描述了本发明，但是当然，不应当认为以任何方式限制本发明的范围。
在每个下文的实施例中，基于吸附剂的物理限制选择最短的停留时间。最长的停留时间基于如下的假设来选择，即大于1.5分钟的停留时间将不会提供显著的生产率优势。
在实施例1-9中，一系列的(三个)操作能力相对于总停留时间来作图，并使用二次多项式拟合以便在拟合点之间插入OBC值。OBC值可以使用多种等式来拟合，包括A-Be-C(t)形式的指数函数，其将提供最精确的拟合，但是可能需要更多的试验尝试来恰当地实施。
可替换地，用户可以实施更多的穿透试验，并在总停留时间范围内寻找实际的OBC，而非通过使用二次多项式插值法对OBC值进行近似。
方法方案基于生产率选自一系列经计算的多柱法(在整个停留时间范围内)。可替换地，使用所述方法的实施方式进行模拟的每个方案可被输入至任何个性化软件中以评估产品的方法成本并优化以节约成本。
实施例1-4和9使用单柱，并且实施例5-8采用菊花链多柱。
实施例1
本实施例证明了根据本发明的一种实施方式来确定OBC，使用一个柱(MabSelectSuRe预填充高截留(Hi-Trap)柱(0.962mL))；使用纯化的IgG2单克隆抗体(2mg/mL浓度)和一个在线UV检测器。
(1)在单柱上，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验。(2)以2分钟、3分钟和4.5分钟停留时间实施附加的三个试验。
典型地，在模拟装载区域中的双柱和三柱时，还以两倍和三倍于在(1)中指定的停留时间来实施分批穿透试验，总共进行9个试验。然而，在所选择的停留时间之间存在重叠或重复(下表说明了重叠时间)，从而除了在(2)中实施的那些，仅再实施三个穿透试验。
停留时间
所选择的 双柱装载区域 三柱装载区域
0.5 1 1.5
1 2 3
1.5 3 4.5
为了模拟装载区域中的N个柱，分批穿透试验以N倍于在(1)中指定的停留时间来实施。
在每个装载步骤之间，对所述柱进行如在下表中所列出的洗涤、洗脱、再生和平衡(总称为“其余”过程)。
缓冲液/溶液 步骤长度(CV) 停留时间(分钟)
洗涤1 1倍PBS 5 0.5
洗涤2 1倍PBS+0.5M NaCl 10 0.5
洗涤3 1倍PBS 5 0.5
洗脱缓冲液 100mM乙酸pH3.0 10 0.5
CIP 0.1M NaOH 10 1
再平衡 1倍PBS 10 0.5
对于在每个分批穿透试验中的装载步骤，装载所述柱直至达到饱和(即，其中离开柱的产物浓度等于进入柱的产物浓度的条件)。
使用在线UV检测器来测量在所述柱出口处的浓度。产物穿透与时间的关系通过软件来记录并输出，用于计算操作结合能力。说明性的曲线在图2中示出。
穿透曲线根据停留时间而配对，以便理解对于在装载区域中具有两个柱的方法的产物穿透。例如，与所选择的0.5分钟停留时间相应的穿透曲线和与1分钟停留时间相应的穿透曲线进行配对。在双倍停留时间下，可以模拟在装载区域中具有两个柱的多柱方法中，产物如何随着时间穿透。对在(1)中列出的所有所选择的停留时间都如此进行。
穿透曲线根据停留时间进行配对，以便模拟在装载区域中具有三个柱的方法。例如，与所选择的0.5分钟停留时间相应的穿透曲线和与1.5分钟停留时间相应的穿透曲线配时。在三倍停留时间下，可以模拟在装载区域中具有三个柱的多柱方法中，产物如何随着时间穿透。
对于在装载区域中具有N个柱的多柱方法来说，理想的操作结合能力为恰在第N个柱的出口处发生穿透之前，结合至第一柱的量。在之前的两段中，使用停留时间来模拟穿透曲线，其将通常由菊花链双柱产生，并采用两个UV检测器来追踪产物穿透(如在图4A和4B中所描述的)。通过改变单柱上的停留时间，可以模拟贯穿多柱的产物穿透(如在图4C中所描述的)。
与如上确定的所述配对之外的、与更长的停留时间相应的各穿透曲线被用于确定产物将要穿透的时间，tDBC。
tDBC通过确定装载用于产生10％产物穿透所需要的产物质量的80％的时间来计算。
tDBC用作为对于每个配对(与停留时间下限相应的)，第二次穿透的积分上限。该穿透曲线从零积分至预定上限fR*tDBC，用以确定如在等式1中所示的在流过物中存在的产物量，其中mFT为流过物中的产物量，并且Cout表示与如上定义的所述配对之外的较低停留时间相应的穿透曲线。
等式1：
所装载的产物量，mL通过采用在等式2中所示的通式来计算，其中C0为进料浓度，vL为所装载的体积，并且vo为所述柱内的空隙体积。
等式2：mL＝C0*(vL-vo)
理想操作结合能力(OBC)通过采用等式3的通式来计算。
等式3：OBC＝(mL-mFT)/vCol
如上所述的方法被用于每对穿透曲线，以产生与在装载区域中具有双柱的方法相应的三个操作结合能力，以及与在装载区域中具有三柱的方法相应的三个操作结合能力。
每个系列的(三个)操作能力均相对于总停留时间来绘图，并使用二次多项式拟合以便在拟合点之间插入OBC值。OBC值可以使用多个等式来拟合，包括A-Be-C(t)形式的指数函数，其将提供最精确的拟合，但是可能要求更多的试验尝试来恰当地实施。在图5中示出操作结合能力与总停留时间关系的一个实例。
使用内插的操作结合能力通过采用等式4的通式来计算在总停留时间范围内的装载时间，其中RT为经过一个柱的停留时间(而不是总停留时间)，并且C0为进料浓度。
等式4：tL＝OBC*RT/C0
使用装载时间来计算总停留时间范围内的周期时间。在等式5(下文)中示出的计算适用于各个停留时间，其中tC等于周期时间，tL等于装载时间，NL等于装载区域中的柱数，并且tR等于其余时间或者实施洗涤、洗脱和再生的时间。
等式5：tC＝tL*NL+tR
与每个停留时间相关的生产率使用等式6(下文)来计算，其中P为生产率。
等式6：P＝OBC/tC
理论生产率与总停留时间的关系图在图6中示出。
运行所述方法所需要的总柱数为正被装载的柱数加上在其余部分中(洗涤/洗脱/再生)需要的柱数的总和，使得装载为连续的和未间断的。这使用等式7(下文)来计算，其中NC为总柱数。
等式7：NC＝上舍入(tC/tL)
周期时间必须是可除以柱数的。对于不可相除的情况，将停机时间加入至周期时间。增加周期时间降低了生产率。实际生产率使用等式8(下文)来计算。
等式8：P实际＝OBC/(NC*tL)
方法方案选自所述一系列基于生产率计算的多柱法(在(1)中列出的整个停留时间范围内)。可替换地，使用所述方法的这种实施方式模拟的每个方案可被输入至任何个性化软件中，以评估产品的方法成本并优化以节约成本。
实施例2
本实施例证明了根据本发明的一种实施方式来确定OBC，使用单柱(MabSelectSuRe预填充高截留(Hi-Trap)柱(0.962mL))；使用纯化的单克隆IgG2抗体(约2.2mg/mL浓度，在CHO原料中)，并使用市售生物传感器量化分级。
(1)在单柱上，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施穿透试验。(2)以2分钟、3分钟和4.5分钟停留时间实施附加的三个试验。
典型地，在模拟装载区域中的双柱和三柱时，分批穿透试验还以两倍和三倍于在(1)中指定的停留时间来实施，总共进行9次试验。然而，在所选择的停留时间之间存在重叠或重复(下表说明了重叠时间)，从而除了在(2)中实施的那些以外，仅再实施三个穿透试验。
停留时间
所选择的 双柱装载区域 三柱装载区域
0.5 1 1.5
1 2 3
1.5 3 4.5
为了模拟装载区域中的N个柱，分批穿透试验以N倍于在(1)中指定的停留时间来实施。
在每个装载步骤之间，对所述柱进行如在下表中所列出的洗涤、洗脱、再生和平衡(总称为“其余”过程)。
缓冲/溶液 步骤长度(CV) 停留时间(分钟)
洗涤1 1倍PBS 5 0.5
洗涤2 1倍PBS+0.5M NaCl 10 0.5
洗涤3 1倍PBS 5 0.5
洗脱缓冲 100mM乙酸pH3.0 10 0.5
CIP 0.1M NaOH 10 1
再平衡 1倍PBS 10 0.5
对于在每个分批穿透试验中的装载步骤，装载所述柱直至达到饱和(即离开柱的产物浓度等于进入柱的产物浓度的条件)，或者约120mg/mL的吸附剂。
在所述柱出口处的浓度使用AKTATM Avant(GE Healthcare Lifesciences)分级为60个1mL级分。每个级分使用稀释剂(Pall ForteBio LLC，Menlo Park，CA)稀释10倍，并且浓度使用蛋白质A生物传感器(Pall ForteBio LLC，Menlo Park，CA)来量化。浓度值相对于时间进行绘图，用于计算操作结合能力，并且说明性地输出的穿透曲线在图3中示出。
穿透曲线根据停留时间配对，以便理解用于在装载区域具有两个柱的方法的产物穿透。例如，将与所选择的0.5分钟停留时间相应的穿透曲线和与1分钟停留时间相应的穿透曲线配对。在双倍停留时间下，可以模拟在装载区域中具有双柱的多柱方法中产物如何随着时间穿透。对在(1)中列出的所有所选择的停留时间进行上述操作。
穿透曲线根据停留时间配对，以便模拟在装载区域具有三个柱的方法。例如，将与所选择的0.5分钟停留时间相应的穿透曲线和与1.5分钟停留时间相应的穿透曲线配对。在三倍停留时间下，可以模拟在装载区域中具有三个柱的多柱方法中产物如何随着时间穿透。
对于在装载区域具有N个柱的多柱法来说，理想的操作结合能力为恰在第N个柱的出口处发生穿透之前，结合至第一柱的量。在前述的两段中，停留时间被用于模拟穿透曲线，其将通常由菊花链双柱产生，并采用两个UV检测器来追踪产物穿透，如在图4A和4B中所描述。通过改变单柱上的停留时间，可以模拟经过多柱的产物穿透，如在图4C中所描述。
在如上确定的所述配对之外，与更长的停留时间相应的每个穿透曲线被用于确定产物将要穿透的时间，tDBC。
tDBC通过确定装载用于产生10％产物穿透所需要的产物质量的80％的时间来计算。
tDBC被用作为在每个配对之外(与停留时间下限相应的一个)的第二次穿透的积分上限。该穿透曲线从零积分至预定上限fR*tDBC，以确定如在等式1中所示的在流过物中存在的产物量，其中mFT为流过物中的产物量，并且Cout表示与如上定义的所述配对之外的停留时间下限相应的穿透曲线。
等式1：
所装载的产物量，mL通过采用在等式2中所示的通式来计算，其中C0为进料浓度，vL为所装载的体积，并且vo为所述柱内的空隙体积。
等式2：mL＝C0*(vL-vo)
理想操作结合能力(OBC)通过采用等式3的通式来计算。
等式3：OBC＝(mL-mFT)/vCol
如上所述的方法被用于每对穿透曲线，以产生与在装载区域中具有双柱的方法相应的三个操作结合能力，以及与在装载区域中具有三柱的方法相应的三个操作结合能力。
每个系列的(三个)操作能力均相对于总停留时间来绘图，并使用二次多项式拟合以便在拟合点之间插入OBC值。OBC值可以使用多个等式来拟合，包括A-Be-C(t)形式的指数函数，其将提供最精确的拟合，但是可能需要更多的试验尝试来恰当地实施。在图7中示出操作结合能力与总停留时间关系的一个实例。
使用内插的操作结合能力在总停留时间范围内通过采用等式4的通式来计算装载时间，其中RT为经过一个柱的停留时间(不是总停留时间)，并且C0为进料浓度。
等式4：tL＝OBC*RT/C0
装载时间被用于计算总停留时间范围内的周期时间。在等式5(下文)中示出的计算被用于每个停留时间，其中tC等于周期时间，tL等于装载时间，NL等于装载区域中的柱数，并且tR等于其余时间或者实施洗涤、洗脱和再生的时间。
等式5：tC＝tL*NL+tR
与每个停留时间相关的生产率使用等式6(下文)来计算，其中P为生产率。
等式6：P＝OBC/tC
理论生产率与总停留时间的关系图在图8中示出。
运行所述方法所需要的总柱数为正被装载的柱数加上在其余部分中(洗涤/洗脱/再生)需要的柱数的总和，使得装载为连续的和未间断的。这使用等式7(下文)来计算，其中NC为总柱数。
等式7：NC＝上舍入(tC/tL)
周期时间必须是可除以柱数的。对于不可相除的情况，将停机时间加入至周期时间。增加周期时间降低了生产率。实际生产率使用等式8(下文)来计算。
等式8：P实际＝OBC/(NC*tL)
实施例3
本实施例证明了根据本发明的一种实施方式来确定OBC，使用一个柱(MabSelectSuRe预填充高截留(Hi-Trap)柱(0.962mL))；使用纯化的IgC2单克隆抗体(2mg/mL浓度)，并量化洗脱物(其中，以级分收集、稀释和使用线下检测器测量洗脱物)，而不是对穿透曲线进行积分。
(1)在单柱上，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个装载试验。(2)以1分钟、1.5分钟、2分钟、3分钟和4.5分钟停留时间实施五个穿透试验。
对于在每个分批穿透试验中的装载步骤，装载所述柱直至达到饱和(即离开柱的产物浓度等于进入柱的产物浓度的条件)。
在所述柱出口处的浓度使用在线UV检测器来测量。产物穿透与时间的关系通过软件来记录并输出，用于计算操作结合能力。说明性的曲线在图2中示出。
装载时间tDBC通过确定装载用于产生10％产物穿透所需要的产物质量的80％的时间，使用每个穿透试验的穿透曲线来计算。
为了确定在装载区域中具有双柱的方法的操作结合能力(OBC)，所述柱以经选择的停留时间(例如0.5分钟)来装载并使用通过取得曲线的所述10％穿透的80％来确定的装载时间，所述曲线通过以双倍选择装载停留时间(例如0.5*2＝1分钟停留时间)装载所述柱来产生。对于在(1)中所指定的一系列所选择的装载停留时间，对总共三个单柱的试验进行重复。
在装载后，使用缓冲液洗脱所述柱，其确保回收95％至100％的结合材料，并且测量洗脱物以确定多少被结合至所述柱。所结合的量等于在装载区域中具有双柱的MCC法的操作结合能力。
在装载区域中具有N柱的多柱法的理想操作结合能力为恰在第N个柱的出口处发生穿透之前，结合至第一柱的量。在之前的两段中，停留时间被用于模拟穿透曲线，其通常由菊花链双柱产生，并采用两个UV检测器来追踪产物穿透，如在图4B中所描述(下部曲线)。该穿透曲线被用于确定注射(图4A中，第一柱中的X加上第二柱中的Y)经过串联的第一柱的量。停留时间下降为原来的二分之一，并且将所述柱装载(X+Y)的量。流过物的量等于Y，结合的量等于X并代表操作结合能力或OBC。
对三个试验中的每一个量化洗脱物，产生三个OBC，每个相应于所选择的停留时间，其可被绘图并使用二次多项式拟合以便在拟合点之间插入OBC值。
OBC值可以使用多个等式来拟合，包括A-Be-C(t)形式的指数函数，其将提供最精确的拟合，但是需要更多的试验尝试来恰当地实施。在图5中示出操作结合能力与总停留时间关系的一个实例。
使用由与三倍于所选择停留时间相应的穿透曲线计算的装载时间来重复用于一系列所选择的装载停留时间的试验，以便模拟在装载区域中具有三个柱的方法。
洗脱和量化洗脱物适用于重复的试验，以便绘制OBC与停留时间的关系图，所述停留时间与装载区域中的三个柱相应。
上图的内插的操作结合能力可被用于计算在总停留时间范围内的装载时间，通过采用等式1(下文)的通式，其中RT为经过单柱的停留时间(不是总停留时间)，并且C0为进料浓度。
等式1：tL＝OBC*RT/C0
装载时间被用于计算总停留时间范围内的周期时间。在等式2(下文)中示出的计算适用于每个停留时间，其中tC等于周期时间，tL等于装载时间，NL等于装载区域中的柱数，并且tR等于其余时间或者实施洗涤、洗脱和再生的时间。
等式2：tC＝tL*NL+tR
与每个停留时间相关的生产率使用等式3(下文)来计算，其中P为生产率。理论生产率与总停留时间的关系图在图6中示出。
等式3：P＝OBC/tC
运行所述方法所需要的总柱数为正被装载的柱数加上在其余部分中(洗涤/洗脱/再生)需要的柱数的总和，使得装载为连续的和未间断的。这使用等式4(下文)来计算，其中NC为总柱数。
等式4：NC＝上舍入(tC/tL)
周期时间必须是可除以柱数的。对于不可相除的情况，将停机时间加入至周期时间。增加周期时间降低了生产率。实际生产率使用等式5(下文)来计算。
等式5：P实际＝OBC/(NC*tL)
实施例4
本实施例证明了根据本发明的一种实施方式来确定OBC，使用一个柱(MabSelectSuRe预填充高截留(Hi-Trap)柱(0.962M1))；使用纯化的单克隆抗体(2mg/mL浓度)，并通过使用市售生物传感器进行分级来量化洗脱。
(1)在单柱上，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验。(2)以1分钟、1.5分钟、2分钟、3分钟和4.5分钟停留时间实施五个穿透试验。
对于在每个分批穿透试验中的装载步骤，装载所述柱直至达到饱和(即离开柱的产物浓度等于进入柱的产物浓度的条件)。
在所述柱出口处的浓度使用AKTATM Avant(GE Healthcare Lifesciences)分级为60个1mL的级分。每个级分使用稀释剂(Pall ForteBio LLC，Menlo Park，CA)稀释10倍，并且浓度使用蛋白质A生物传感器(Pall ForteBio LLC，Menlo Park，CA)来量化。浓度值相对于时间进行绘图，用于计算操作结合能力，并且说明性地输出的穿透曲线在图3中示出。
装载时间tDBC通过确定装载用于产生10％产物穿透所需要的产物质量的80％的时间，使用每个穿透试验的穿透曲线来计算。
为了确定在装载区域中具有双柱的方法的操作结合能力(OBC)，所述柱以经选择的停留时间(例如0.5分钟)来装载并使用通过取得曲线的所述10％穿透的80％来确定的装载时间，所述曲线通过以双倍选择装载停留时间(例如0.5*2＝1分钟停留时间)装载所述柱来产生。对于在(1)中所指定的一系列所选择的装载停留时间，对总共三个单柱试验进行重复。
在装载后，使用缓冲液洗脱所述柱，其确保回收95％至100％的结合材料，并且测量洗脱物以确定多少被结合至所述柱。所结合的量等于在装载区域中具有双柱的MCC法的操作结合能力。
在装载区域中具有N柱的多柱法的理想操作结合能力为恰在第N个柱的出口处发生穿透之前，结合至第一柱的量。在前述的两段中，停留时间被用于模拟穿透曲线，其将通常由菊花链双柱产生，并采用两个UV检测器来追踪产物穿透，如在图4B中所描述(下部曲线)。穿透曲线被用于确定注入(图4A中，第一柱中的X加上第二柱中的Y)经过串联的第一柱的量。停留时间下降为原来的二分之一，并且所述柱装载(X+Y)的量。流过物的量等于Y，结合的量等于X并代表操作结合能力或OBC。
对三个试验中的每一个量化洗脱物，产生三个OBC，每个相应于所选择的停留时间，其可被绘图并使用二次多项式拟合以便在拟合点之间插入OBC值。
OBC值可以使用多个等式来拟合，包括A-Be-C(t)形式的指数函数，其将提供最精确的拟合，但是需要更多的试验尝试来恰当地实施。在图5中示出操作结合能力与总停留时间关系的一个实例。
使用由与三倍于所选择停留时间相应的穿透曲线计算的装载时间来重复用于一系列所选择的装载停留时间的试验，以便模拟在装载区域中具有三个柱的方法。
洗脱和量化洗脱物适用于重复试验，以便绘制OBC与停留时间的关系图，所述停留时间与装载区域中的三个柱相应。
由上图内插的操作结合能力可用于计算在总停留时间范围内的装载时间，通过采用等式1(下文)的通式，其中RT为经过一个柱的停留时间(不是总停留时间)，并且C0为进料浓度。
等式1：tL＝OBC*RT/C0
装载时间可用于计算总停留时间范围内的周期时间。在等式2(下文)中示出的计算适用于每个停留时间，其中tC等于周期时间，tL等于装载时间，NL等于装载区域中的柱数，并且tR等于其余时间或者实施洗涤、洗脱和再生的时间。
等式2：tC＝tL*NL+tR
与每个停留时间相关的生产率使用等式3(下文)来计算，其中P为生产率。理论生产率与总停留时间的关系图在图6中示出。
等式3：P＝OBC/tC
运行所述方法所需要的总柱数为正被装载的柱数加上在其余部分中(洗涤/洗脱/再生)需要的柱数的总和，使得装载为连续的和未间断的。这使用等式4(下文)来计算，其中NC为总柱数。
等式4：NC＝上舍入(tC/tL)
周期时间必须是可除以柱数的。对于不可相除的情况，将停机时间加入至周期时间。增加周期时间降低了生产率。实际生产率使用等式5(下文)来计算。
等式5：P实际＝OBC/(NC*tL)
实施例5
本实施例证明了根据本发明的一种实施方式来确定OBC，使用双柱和三柱(MabSelect SuRe预填充高截留(Hi-Trap)柱(0.962mL))；使用纯化的IgG2单克隆抗体(2mg/mL浓度)菊花链一起，并通过使用市售生物传感器进行分级来量化洗脱。
(1a)在菊花链双柱上一起，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验。(1b)在菊花链三柱上一起，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验。
在菊花链柱出口处的浓度使用AKTATM Avant(GE Healthcare Lifesciences)分级为60个1mL的级分。每个级分使用包括吐温20和牛血清白蛋白(BSA)的稀释剂(PallForteBio LLC，Menlo Park，CA)稀释10倍，并且浓度使用蛋白质A生物传感器(PallForteBio LLC，Menlo Park，CA)来量化。浓度值相对于时间进行绘图，用于计算操作结合能力，并且说明性地输出的穿透曲线在图3中示出。
装载时间tDBC通过确定装载用于产生10％产物穿透所需要的产物质量的80％的时间，使用每个穿透试验(1a；1b)的穿透曲线来计算。
为了确定在装载区域中具有双柱的方法的操作结合能力(OBC)，单柱以经选择的停留时间(例如0.5分钟)来装载并使用通过取得曲线的所述10％穿透的80％来确定的装载时间，所述曲线通过装载菊花链双柱(具有相同的单独停留时间)来产生。对于在(1a)中所指定的一系列所选择的装载停留时间，对总共三个单柱的试验进行重复。
为了确定在装载区域中具有三个柱的方法的操作结合能力(OBC)，单柱以所选择的停留时间(例如0.5分钟)来装载，使用通过取得曲线的所述10％穿透的80％来确定的装载时间，所述曲线通过装载菊花链三柱(具有相同的单独停留时间)来产生。对于在(1b)中所指定的一系列所选择的装载停留时间，对总共三个单柱的试验进行重复。
在装载后，使用缓冲液洗脱所述柱，其确保回收95％至100％的结合材料，并且测量洗脱物以确定多少被结合至所述柱。所结合的量等于在装载区域中具有双柱、以及在装载区域中具有三柱的MCC法的操作结合能力。
在装载区域中具有N柱的多柱法的理想操作结合能力为恰在第N个柱的出口处发生穿透之前，结合至第一柱的量。在(1a)和(1b)中，穿透曲线由菊花链双柱和三柱产生，并采用一个UV检测器来追踪产物穿透，如在图4A和4B中所描述(下部曲线)。随后，在单独的试验中，所述柱被分开，并且当产物将穿透菊花链构型的最后柱的时候，及时地装载至该点。在装载后，结合至所述柱的材料量通过量化洗脱物来确定。这为在最后柱上发生穿透之前结合至第一柱的量X。
对两个系列的三个试验中的每一个量化洗脱，产生三个OBC，每个相应于所选择的停留时间，其可被绘图并使用二次多项式拟合以在拟合点之间插入OBC值。
OBC值可以使用多个等式来拟合，包括A-Be-C(t)形式的指数函数，其将提供最精确的拟合，但是需要更多的试验尝试来恰当地实施。在图5中示出操作结合能力与总停留时间关系的一个实例。
使用由与菊花链三柱相应的穿透曲线计算的装载时间来重复试验，以便模拟在装载区域中具有三柱的方法。洗脱和量化洗脱物适用于重复试验，以便绘制OBC与停留时间的关系图，其与装载区域中的三柱相应。
由上图的内插的操作结合能力可用于计算在总停留时间范围内的装载时间，通过采用等式1(下文)的通式，其中RT为经过一个柱的停留时间(不是总停留时间)，并且C0为进料浓度。
等式1：tL＝OBC*RT/C0
装载时间被用于计算总停留时间范围内的周期时间。在等式2(下文)中示出的计算适用于每个停留时间，其中tC等于周期时间，tL等于装载时间，NL等于装载区域中的柱数，并且tR等于其余时间或者实施洗涤、洗脱和再生的时间。
等式2：tC＝tL*NL+tR
与每个停留时间相关的生产率使用等式3(下文)来计算，其中P为生产率。理论生产率与总停留时间的关系图在图5中示出。
等式3：P＝OBC/tC
运行所述方法所需要的总柱数为正被装载的柱数加上在其余部分中(洗涤/洗脱/再生)需要的柱数的总和，使得装载为连续的和未间断的。这使用等式4(下文)来计算，其中NC为总柱数。
等式4：NC＝上舍入(tC/tL)
周期时间必须是可除以柱数的。对于不可相除的情况，将停机时间加入至周期时间。增加周期时间降低了生产率。实际生产率使用等式5(下文)来计算。
等式5：P实际＝OBC/(NC*tL)
实施例6
本实施例证明了根据本发明的一种实施方式来确定OBC，使用双柱和三柱(MabSelect SuRe预填充高截留(Hi-Trap)柱(0.962mL))；使用纯化的IgG2单克隆抗体(2mg/mL浓度)菊花链一起，并量化洗脱物(使用线下UV检测器)，而不是对穿透曲线进行积分。
(1a)在菊花链双柱上一起，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验。(1b)在菊花链三柱上一起，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验。
使用在线UV检测器来测量在菊花链柱出口处的浓度。产物穿透与时间的关系通过软件来记录并输出，用于计算操作结合能力。说明性的曲线在图2中示出。
装载时间tDBC通过确定装载用于产生10％产物穿透所需要的产物质量的80％的时间，使用每个穿透试验((1a)；(1b))的穿透曲线来计算。
为了确定在装载区域中具有双柱的方法的操作结合能力(OBC)，单柱以经选择的停留时间(例如0.5分钟)来装载，使用通过取得曲线的所述10％穿透的80％来确定的装载时间，所述曲线通过装载菊花链双柱(具有相同的单独停留时间)来产生。对于在(1a)中所指定的一系列所选择的装载停留时间，对总共三个单柱的试验进行重复。
为了确定在装载区域中具有三个柱的方法的操作结合能力(OBC)，以所选择的停留时间(例如0.5分钟)来装载单柱，使用通过取得曲线的所述10％穿透的80％来确定的装载时间，所述曲线通过装载菊花链三柱(具有相同的单独停留时间)来产生。对于在(1b)中所指定的一系列所选择的装载停留时间，对总共三个单柱的试验进行重复。
在装载后，使用缓冲液洗脱所述柱，其确保回收95％至100％的结合材料，并且测量洗脱物以确定多少被结合至所述柱。所结合的量等于在装载区域中具有双柱、以及在装载区域中具有三柱的MCC法的操作结合能力。
在装载区域中具有N柱的多柱法的理想操作结合能力为恰在第N个柱的出口处发生穿透之前，结合至第一柱的量。在(1a)和(1b)中，穿透曲线由菊花链双柱和三柱产生，并采用一个UV检测器来追踪产物穿透，如在图4A和4B中所描述(下部曲线)。随后，在单独的试验中，所述柱被分开，并当产物将穿透菊花链构型的最后柱的时候，及时地装载至该点。在装载后，结合至所述柱的材料量通过量化洗脱物来确定。这为在在最后柱上发生穿透之前结合至第一柱的量X。
对两个系列的三个试验中的每一个量化洗脱物，每个相应于所选择的停留时间，其可被绘图并使用二次多项式拟合以在拟合点之间插入OBC值。
OBC值可以使用多个等式来拟合，包括A-Be-C(t)形式的指数函数，其将提供最精确的拟合，但是需要更多的试验尝试来恰当地实施。在图5中示出操作结合能力与总停留时间关系的一个实例。
使用由与菊花链三柱相应的穿透曲线计算的装载时间来重复试验，以便模拟在装载区域中具有三柱的方法。洗脱和量化洗脱物适用于重复试验，以便绘制OBC与停留时间的关系图，其与装载区域中的三柱相应。
图形上方的内插的操作结合能力可被用于在总停留时间范围内计算装载时间，通过采用等式1(下文)的通式，其中RT为经过单柱的停留时间(不是总停留时间)，并且C0为进料浓度。
等式1：tL＝OBC*RT/C0
装载时间用于计算总停留时间范围内的周期时间。在等式2(下文)中示出的计算被用于每个停留时间，其中tC等于周期时间，tL等于装载时间，NL等于装载区域中的柱数，并且tR等于其余时间或者实施洗涤、洗脱和再生的时间。
等式2：tC＝tL*NL+tR
与每个停留时间相关的生产率使用等式3(下文)来计算，其中P为生产率。理论生产率与总停留时间的关系图在图6中示出。
等式3：P＝OBC/tC
运行所述方法所需要的总柱数为正被装载的柱数加上在其余部分中(洗涤/洗脱/再生)需要的柱数的总和，使得装载为连续的和未间断的。这使用等式4(下文)来计算，其中NC为总柱数。
等式4：NC＝上舍入(tC/tL)
周期时间必须是可除以柱数的。对于不可相除的情况，将停机时间加入至周期时间。增加周期时间降低了生产率。实际生产率使用等式5(下文)来计算。
等式5：P实际＝OBC/(NC*tL)
实施例7
本实施例证明了根据本发明的一种实施方式来确定OBC，使用菊花链双柱和三柱(MabSelect SuRe预填充高截留(Hi-Trap)柱(0.962mL))；使用纯化的IgG2单克隆抗体(2mg/mL浓度)和一个在线UV检测器。
(1a)在菊花链单柱上一起，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验。(1b)在菊花链双柱上一起，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验(即流速保持相同，经过每个柱的停留时间保持相同，总结合停留时间为双倍)。(1c)在菊花链三柱上一起，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验(即流速保持相同，经过每个柱的停留时间保持相同，总结合停留时间为三倍)。
为了模拟装载区域中的N个柱，使用在(1a)中指定的停留时间在N个菊花链柱实施分批穿透试验。
在每个装载步骤之间，对所述柱进行如在下表中所列出的洗涤、洗脱、再生和平衡(总称为“其余”过程)。
缓冲液/溶液 步骤长度(CV) 停留时间(分钟)
洗涤1 1倍PBS 5 0.5
洗涤2 1倍PBS+0.5M NaCl 10 0.5
洗涤3 1倍PBS 5 0.5
洗脱缓冲液 100mM乙酸pH3.0 10 0.5
CIP 0.1M NaOH 10 1
再平衡 1倍PBS 10 0.5
对于在每个分批穿透试验中的装载步骤，装载所述柱直至达到饱和(即离开柱的产物浓度等于进入柱的产物浓度的条件)。
使用在线UV检测器来测量在所述柱出口处的浓度。产物穿透与时间的关系通过软件来记录并输出，用于计算操作结合能力。说明性的曲线在图2中示出。
对使用一个柱和菊花链双柱产生的穿透曲线彼此配对(共享相同的装载流速)，以便模拟在装载区域中具有双柱的方法的产物穿透。例如，使用一个柱产生并且装载流速为1ml/min的穿透曲线可与使用双柱产生并且装载流速为1ml/min的穿透曲线配对。对与在(1a)中所选择的停留时间相关的所有装载流速实施。
对使用一个柱和菊花链三柱产生的穿透曲线进行配对(共享相同的装载流速)，以便模拟在装载区域中具有三柱的方法的产物穿透。例如，使用一个柱产生并且装载流速为1ml/min的穿透曲线可与使用三柱产生并且装载流速为1ml/min的穿透曲线配时。对与在(1a)中所选择的停留时间相关的所有装载流速实施。
在装载区域中具有N柱的多柱法的理想操作结合能力为恰在第N个柱的出口处发生穿透之前，结合至第一柱的量。在之前的两段中，穿透曲线由菊花链双柱和三柱产生，并采用一个UV检测器来追踪产物穿透，如在图4A和4B中所描述(下部曲线)。随后，在单独的试验中，所述柱被分开，并在单独的单元柱上实施试验以便模拟经过串联的第一柱的产物穿透，从而产生在图4B中所描述的曲线(上部曲线)。
与如上所确定的双柱或三柱相应的穿透曲线可被用于确定产物将要穿透的时间tDBC。
tDBC通过确定装载用于产生10％产物穿透所需要的产物质量的80％的时间来计算。
tDBC被用作为对通过装载单独单元柱而产生的穿透的积分上限。该穿透曲线从零积分至上限fR*tDBC，以确定如在等式1中所示的在流过物中存在的产物量，其中mFT为流过物中的产物量，并且Cout表示以给定的装载流速的与单独单元柱相应的穿透曲线。
等式1：
所装载的产物量，mL通过采用在等式2中所示的通式来计算，其中C0为进料浓度，vL为所装载的体积，并且vo为所述柱内的空隙体积。
等式2：mL＝C0*(vL-vo)
理想操作结合能力(OBC)通过采用等式3的通式来计算。
等式3：OBC＝(mL-mFT)/vCol
如上所述的方法适用于每对穿透曲线，以产生与在装载区域中具有双柱的方法相应的三个操作结合能力，并产生与在装载区域中具有三柱的方法相应的三个操作结合能力。
每个系列的(三个)操作能力均相对于总停留时间来绘图，并使用二次多项式拟合以便在拟合点之间插入OBC值。OBC值可以使用多个等式来拟合，包括A-Be-C(t)形式的指数函数，其将提供最精确的拟合，但是需要更多的试验尝试来恰当地实施。在图5中示出操作结合能力与总停留时间关系的一个实例。
内插的操作结合能力用于通过采用等式4的通式来计算在总停留时间范围内的装载时间，其中RT为经过单柱的停留时间(不是总停留时间)，并且C0为进料浓度。
等式4：tL＝OBC*RT/C0
装载时间用于计算总停留时间范围内的周期时间。在等式5(下文)中示出的计算适用于每个停留时间，其中tC等于周期时间，tL等于装载时间，NL等于装载区域中的柱数，并且tR等于其余时间或者实施洗涤、洗脱和再生的时间。
等式5：tC＝tL*NL+tR
与每个停留时间相关的生产率使用等式6(下文)来计算，其中P为生产率。
等式6：P＝OBC/tC
理论生产率与总停留时间的关系图在图6中示出。
运行所述方法所需要的总柱数为正被装载的柱数加上在其余部分中(洗涤/洗脱/再生)需要的柱数的总和，使得装载为连续的和未间断的。这使用等式7(下文)来计算，其中NC为总柱数。
等式7：NC＝上舍入(tC/tL)
周期时间必须是可除以柱数的。对于不可相除的情况，将停机时间加入至周期时间。增加周期时间降低了生产率。实际生产系使用等式8(下文)来计算。
等式8：P实际＝OBC/(NC*tL)
实施例8
本实施例证明了根据本发明的一种实施方式来确定OBC，使用菊花链双柱和三柱(MabSelect SuRe预填充高截留(Hi-Trap)柱(0.962mL))；使用纯化的IgG2单克隆抗体(约2.2mg/mL浓度，在CHO原料中)，并使用市售生物传感器进分离。
(1a)在菊花链单柱上一起，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验。(1b)在菊花链双柱上一起，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验(即流速保持相同，经过每个柱的停留时间保持相同，总结合停留时间为双倍)。(1c)在菊花链三柱上一起，以0.5分钟、1分钟和1.5分钟的装载停留时间实施三个穿透试验(即流速保持相同，经过每个柱的停留时间保持相同，总结合停留时间为三倍)。
为了模拟装载区域中的N个柱，分批穿透试验使用在(1a)中指定的停留时间在N个菊花链柱实施。
在每个装载步骤之间，对所述柱进行如在下表中所列出的洗涤、洗脱、再生和平衡(总称为“其余”过程)。
缓冲液/溶液 步骤长度(CV) 停留时间(分钟)
洗涤1 1倍PBS 5 0.5
洗涤2 1倍PBS+0.5M NaCl 10 0.5
洗涤3 1倍PBS 5 0.5
洗脱缓冲液 100mM乙酸pH3.0 10 0.5
CIP 0.1M NaOH 10 1
再平衡 1倍PBS 10 0.5
对于在每个分批穿透试验中的装载步骤，装载所述柱直至达到饱和(即离开柱的产物浓度等于进入柱的产物浓度的条件)。
在所述柱出口处的浓度使用AKTATM Avant(GE Healthcare Lifesciences)分级为60个1mL级分。每个级分使用稀释剂(Pall ForteBio LLC，Menlo Park，CA)稀释10倍，并且浓度使用蛋白质A生物传感器(Pall ForteBio LLC，Menlo Park，CA)来量化。浓度值相对于时间进行绘图，用于计算操作结合能力，并且说明性地输出的穿透曲线在图3中示出。
对使用一个柱和菊花链双柱产生的穿透曲线进行配对(共享相同的装载流速)，以便模拟在装载区域中具有双柱的方法的产物穿透。例如，使用一个柱产生并且装载流速为1ml/min的穿透曲线可与使用双柱产生并且装载流速为1ml/min的穿透曲线配对。对与在(1a)中所选择的停留时间相关的所有装载流速实施。
对使用单柱和菊花链三柱产生的穿透曲线进行彼此配对(共享相同的装载流速)，以便模拟在装载区域中具有三柱的方法的产物穿透。例如，使用一个柱产生并且装载流速为1ml/min的穿透曲线可与使用双柱产生并且装载流速为1ml/min的穿透曲线配对。对与在(1a)中所选择的停留时间相关的所有装载流速实施。
在装载区域中具有N柱的多柱法的理想操作结合能力为恰在第N个柱的出口处发生穿透之前，结合至第一柱的量。在之前的两段中，穿透曲线由菊花链双柱和三柱产生，并采用一个UV检测器来追踪产物穿透，如在图4A和4B中所描述(下部曲线)。随后，在单独的试验中，所述柱被分开，并在单独单元柱上实施试验以便模拟经过串联的第一柱上的产物穿透，从而产生在图4B中所描述的曲线(上部曲线)。
与如上所确定的双柱或三柱相应的穿透曲线可被用于确定产物将要穿透的时间tDBC。
tDBC通过确定装载用于产生10％产物穿透所需要的产物质量的80％的时间来计算。
tDBC被用作为对通过装载单独单元柱而产生的穿透的积分上限。该穿透曲线从零积分至上限fR*tDBC，以确定如在等式1中所示的在流过物中存在的产物量，其中mFT为流过物中的产物量，并且Cout表示以给定的装载流速的与单独单元柱相应的穿透曲线。
等式1：
所装载的产物量，mL通过采用在等式2中所示的通式来计算，其中C0为进料浓度，vL为所装载的体积，并且vo为所述柱内的空隙体积。
等式2：mL＝C0*(vL-vo)
理想操作结合能力(OBC)通过采用等式3的通式来计算。
等式3：OBC＝(mL-mFT)/vCol
如上所述的方法适用于每对穿透曲线，以产生与在装载区域中具有双柱的方法相应的三个操作结合能力，并产生与在装载区域中具有三柱的方法相应的三个操作结合能力。
每个系列的(三个)操作能力均相对于总停留时间来绘图，并使用二次多项式拟合以便在拟合点之间插入OBC值。OBC值可以使用多个等式来拟合，包括A-Be-C(t)形式的指数函数，其将提供最精确的拟合，但是需要更多的试验尝试来恰当地实施。在图7中示出操作结合能力与总停留时间关系的一个实例。
内插的操作结合能力被用于通过采用等式4的通式来计算在总停留时间范围内的装载时间，其中RT为经过一个柱的停留时间(不是总停留时间)，并且C0为进料浓度。
等式4：tL＝OBC*RT/C0
装载时间被用于计算总停留时间范围内的周期时间。在等式5(下文)中示出的计算适用于每个停留时间，其中tC等于周期时间，tL等于装载时间，NL等于装载区域中的柱数，并且tR等于其余时间或者实施洗涤、洗脱和再生的时间。
等式5：tC＝tL*NL+tR
与每个停留时间相关的生产率使用等式6(下文)来计算，其中P为生产率。
等式6：P＝OBC/tC
理论生产率与总停留时间的关系图在图8中示出。
运行所述方法所需要的总柱数为正被装载的柱数加上在其余部分中(洗涤/洗脱/再生)需要的柱数的总和，使得装载为连续的和未间断的。这使用等式7(下文)来计算，其中NC为总柱数。
等式7：NC＝上舍入(tC/tL)
周期时间必须是可除以柱数的。对于不可相除的情况，将停机时间加入至周期时间。增加周期时间降低了生产率。实际生产率使用等式8(下文)来计算。
等式8：P实际＝OBC/(NC*tL)
实施例9
本实施例证明了使用本发明的实施方式精确地预测捕集效率。
以五个操作能力来实施四个MCC法(其中两个柱位于装载区域中，并且两个位于所述方法的其余部分中)。结果如下：
所有的测量捕集效率均位于预测的捕集效率的2％之内。这确认了用于计算OBC的方法几乎接近MCC法内的实际OBC。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，通过参考并入本文，引用程度如同各参考文献被单独和特别地说明以通过参考并入本文并且以其整体列举。
术语(冠词)“一个(a)”和“一种(an)”和“该(the)”以及类似的用语在描述本发明的上下文中(特别是在下面的权利要求的上下文中)被解释为覆盖单数和复数，除非本文另外说明或上下文明显矛盾。后接一系列的一个或多个项目的术语“至少一种”的(例如，“A和B中的至少一种”)的使用应理解为意味着选自所列项目中的一项(A或B)或两种或多种所列项目的任何组合(A和B)，除非在此另外说明或通过上下文看出明显矛盾。术语“包含”，“具有”“包括”和“含有”解释为开放式的术语(意指“包括，但不限于”，)，除非另外说明。本文中数值范围仅仅意指用作单独涉及的各个落入范围内的单个数值的简记方法，除非本文另外说明，各个单个的数值被合并到说明书中，如同其被本文单独引用。本文描述的所有方法可以按照任意合适的顺序实施，除非本文另外说明或上下文明显矛盾。任何一个和全部实例的使用，或本文提供的示例性语言(例如“如”、“例如”)，仅仅意指更好地阐明发明，而不对发明的范围施加限制，除非另外声明。说明书中没有语言被解释为表明任何未声明的成分是实施本发明必不可少的。
本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人所知的实施发明的最佳模式。这些优选实施方式中的变体对于阅读了前述说明书的普通技术人员来说是显而易见的。发明人预计本领域技术人员适当时会采用这种变体，并且发明人还倾向于与本文详细描述不同地实施的发明。因此，本发明包括适用的法律所允许的本文所附的权利要求中记载的主题的所有改进和等同物。此外，本发明包括上述元素在所有可能的变体中的任意组合，除非本文另外说明或上下文明显矛盾。

Claims (6)

1.用于多柱色谱(MCC)法的优化操作结合能力的方法，所述方法包括：
(a)以第一停留时间和/或第一流速将目标产物装载至柱上；
(b)以第二停留时间和/或第二流速将目标产物装载至柱上，其中第一停留时间和/或第一流速不同于第二停留时间和/或第二流速；
(c)对于第一停留时间和/或第一流速以及第二停留时间和/或第二流速，产生穿透曲线；和
(d)确定MCC法的最优操作结合能力。
2.权利要求1的方法，其中第二停留时间约为第一停留时间的两倍，和/或第二流速约为第一流速的一半。
3.权利要求1或2的方法，进一步包括
(b’)以第三停留时间和/或第三流速将目标产物装载至柱上，其中第三停留时间和/或第三流速不同于第一和第二停留时间和/或第一和第二流速；
(c’)对于第一停留时间和/或第一流速、第二停留时间和/或第二流速以及第三停留时间和/或第三流速，产生穿透曲线；和
(d’)确定MCC法的最优操作结合能力。
4.权利要求3的方法，其中第三停留时间约为第一停留时间的三倍，和/或第三流速约为第一流速的三分之一。
5.权利要求1的方法，其中MCC法包括N个柱，并且第一停留时间和/或第一流速对于单柱来确定，并且第二停留时间和/或第二流速等于经过N个柱的停留时间和/或流速。
6.用于多柱色谱(MCC)法的优化操作结合能力的方法，所述方法包括：
(a)串联连接至少两个相等尺寸的柱；
(b)以恒定流速将目标产物装载至柱上，从而提供经过所述柱的预定停留时间；和
(c)确定MCC法的最优操作结合能力。
CN201610642206.3A 2015-07-13 2016-05-31 多柱色谱法的优化操作结合能力 Active CN106353440B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/797,785 2015-07-13
US14/797,785 US11835501B2 (en) 2015-07-13 2015-07-13 Optimizing operating binding capacity for a multiple column chromatography process

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106353440A true CN106353440A (zh) 2017-01-25
CN106353440B CN106353440B (zh) 2019-05-07

Family

ID=56080242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610642206.3A Active CN106353440B (zh) 2015-07-13 2016-05-31 多柱色谱法的优化操作结合能力

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11835501B2 (zh)
EP (1) EP3118620A1 (zh)
JP (1) JP6349571B2 (zh)
KR (1) KR101987400B1 (zh)
CN (1) CN106353440B (zh)
AU (2) AU2016203494A1 (zh)
CA (1) CA2930594C (zh)
SG (1) SG10201603826UA (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108169503A (zh) * 2018-01-12 2018-06-15 河北工业大学 基于微流控芯片的芳香族挥发性气体快速检测系统
CN114072217A (zh) * 2019-06-28 2022-02-18 信达生物制药(苏州)有限公司 组合式层析装置、无缝连接层析方法和生物制剂的纯化方法
US11835501B2 (en) 2015-07-13 2023-12-05 Sartorius Stedim Chromatography Systems Ltd. Optimizing operating binding capacity for a multiple column chromatography process

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3448928T1 (sl) 2016-04-29 2023-05-31 Nanopareil, Llc Hibridna membrana, ki vsebuje premreženo celulozo
WO2018111832A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Nanopareil, Llc Spinnerets and spinneret arrays for electrospinning and electrospinning machines
GB201710130D0 (en) * 2017-06-26 2017-08-09 Ge Healthcare Bioprocess R & D Ab A Method of seperation
JP7063759B2 (ja) * 2018-07-25 2022-05-09 株式会社日立プラントサービス 精製装置
EP3855179A4 (en) * 2018-09-21 2022-06-15 Hitachi High-Tech Corporation ANALYSIS DEVICE COMPRISING A LIQUID PHASE CHROMATOGRAPH, AND METHOD FOR ANALYSIS BY LIQUID PHASE CHROMATOGRAPHY
EP3943931A1 (en) * 2020-07-24 2022-01-26 Tata Consultancy Services Limited Methods and systems for determining multi-column chromatography process configuration
CN112451996B (zh) * 2020-11-10 2021-09-24 浙江大学 一种多柱连续流层析捕获蛋白的优化方法
KR20230060732A (ko) 2021-10-28 2023-05-08 주식회사 제이케이테크 빔 프로젝터용 스크린
CN114832439A (zh) * 2022-06-07 2022-08-02 杭州奕安济世生物药业有限公司 一种自动控制连续层析上样载量的方法和层析方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999034220A3 (en) * 1997-12-31 1999-09-02 Genentech Inc Real-time monitoring of an analyte by chromatography using an on-line assay
CN102472731A (zh) * 2009-06-26 2012-05-23 通用电气健康护理生物科学股份公司 色谱系统中的方法
CN102909105A (zh) * 2012-10-31 2013-02-06 江南大学 一种脱除木糖发酵液中盐分的方法及装置
CN103180727A (zh) * 2010-10-27 2013-06-26 通用电气健康护理生物科学股份公司 具有保护柱的色谱系统
US20140299547A1 (en) * 2013-04-08 2014-10-09 Chromacon Ag Chromatographic purification method

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4802981A (en) 1987-11-04 1989-02-07 Oros Systems Limited Automatic chromatography apparatus
DE19711083C2 (de) 1997-03-18 1999-04-29 Sartorius Gmbh Vorrichtung und Verfahren für die adsorptive Stofftrennung mit Adsorptionsmembranen
US6153438A (en) 1997-04-30 2000-11-28 Hewlett-Packard Company Retention factor database
DE10128546A1 (de) 2001-06-13 2002-12-19 Merck Patent Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur automatischen, optimierten Durchführung chromatographischer Analysen
US6494078B1 (en) 2001-06-25 2002-12-17 Agilent Technologies, Inc. Retention-time locked comprehensive multidimensional gas chromatography
DE10149256A1 (de) 2001-10-05 2003-04-17 Merck Patent Gmbh Alkalistabile hydrophile Sorbentien für die Ionenaustauschchromatographie
US6691053B2 (en) 2001-11-30 2004-02-10 Agilent Technologies, Inc. Method of matching retention times among multiple chromatographic system
US9766217B2 (en) 2006-09-08 2017-09-19 Novo Nordisk A/S Methods of optimizing chromatographic separation of polypeptides
WO2008145270A1 (de) 2007-05-25 2008-12-04 Merck Patent Gmbh Mischpfropfpolymere für die kationenaustauschchromatographie
JP5626526B2 (ja) 2008-09-25 2014-11-19 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
WO2010072546A1 (en) 2008-12-04 2010-07-01 Vrije Universiteit Brussel A chromatographic separation device with variable length and a method for its use
US9527010B2 (en) 2009-09-25 2016-12-27 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Separation system and method
CN102362177B (zh) 2010-01-26 2015-11-25 全技术联合公司 优化液相色谱系统中的梯度的方法
WO2011147974A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Dsm Ip Assets B.V. Retention time locking for multi-dimensional gas chromatography
FR2967082B1 (fr) 2010-11-09 2016-12-09 Nicolas Sebastien Fauquet Procede de separation par chromatographie continue a haut debit
US8802448B2 (en) 2011-07-27 2014-08-12 Pall Corporation Mixed mode ligands
CN103906708B (zh) 2011-10-28 2015-09-23 旭硝子硅素技术株式会社 二氧化硅球状体及亲和载体
EP2656892A1 (en) 2012-04-23 2013-10-30 Merck Patent GmbH Chromatography method
US11835501B2 (en) 2015-07-13 2023-12-05 Sartorius Stedim Chromatography Systems Ltd. Optimizing operating binding capacity for a multiple column chromatography process

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999034220A3 (en) * 1997-12-31 1999-09-02 Genentech Inc Real-time monitoring of an analyte by chromatography using an on-line assay
CN102472731A (zh) * 2009-06-26 2012-05-23 通用电气健康护理生物科学股份公司 色谱系统中的方法
CN103180727A (zh) * 2010-10-27 2013-06-26 通用电气健康护理生物科学股份公司 具有保护柱的色谱系统
CN102909105A (zh) * 2012-10-31 2013-02-06 江南大学 一种脱除木糖发酵液中盐分的方法及装置
US20140299547A1 (en) * 2013-04-08 2014-10-09 Chromacon Ag Chromatographic purification method

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BISSCHOPS M 等: "The impact of continuous multicolumn chromatography on biomanufacturing efficiency", 《PHARMACEUTICAL BIOPROCESSING》 *
张惠灵 等: "离子交换法处理电镀废水的工艺研究", 《湖北农业科学》 *
李森 等: "吸附融合菌的固定化及对铬吸附特性研究", 《环境工程学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11835501B2 (en) 2015-07-13 2023-12-05 Sartorius Stedim Chromatography Systems Ltd. Optimizing operating binding capacity for a multiple column chromatography process
CN108169503A (zh) * 2018-01-12 2018-06-15 河北工业大学 基于微流控芯片的芳香族挥发性气体快速检测系统
CN108169503B (zh) * 2018-01-12 2024-02-02 河北工业大学 基于微流控芯片的芳香族挥发性气体快速检测系统
CN114072217A (zh) * 2019-06-28 2022-02-18 信达生物制药(苏州)有限公司 组合式层析装置、无缝连接层析方法和生物制剂的纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
US11835501B2 (en) 2023-12-05
US20240085388A1 (en) 2024-03-14
AU2016203494A1 (en) 2017-02-02
CN106353440B (zh) 2019-05-07
US20170016864A1 (en) 2017-01-19
JP2017049227A (ja) 2017-03-09
AU2021236507B2 (en) 2023-04-13
CA2930594C (en) 2019-09-03
KR101987400B1 (ko) 2019-06-10
SG10201603826UA (en) 2017-02-27
AU2021236507A1 (en) 2021-10-28
KR20170008148A (ko) 2017-01-23
EP3118620A1 (en) 2017-01-18
CA2930594A1 (en) 2017-01-13
JP6349571B2 (ja) 2018-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106353440A (zh) 多柱色谱法的优化操作结合能力
Moser et al. Immunoaffinity chromatography: an introduction to applications and recent developments
Calderilla et al. 3D printed device including disk-based solid-phase extraction for the automated speciation of iron using the multisyringe flow injection analysis technique
US20210080434A1 (en) Chromatography System with Guard Columns
Gunasena et al. Organic monoliths for hydrophilic interaction electrochromatography/chromatography and immunoaffinity chromatography
JP2009539101A (ja) 等電点電気泳動による分離装置
Hahn et al. Calibration‐free inverse modeling of ion‐exchange chromatography in industrial antibody purification
CN101939648A (zh) 生物靶标的免疫磁性捕获和成像
CN105418730A (zh) 一种基于磁珠法的抗体纯化方法
CN102653558B (zh) 一种单链抗体及其在检测黄曲霉毒素中的应用
CN204882575U (zh) 一种用于肝素结合蛋白荧光免疫层析法定量检测试剂盒的检测板
Borrmann et al. Phenomena and modeling of hydrophobic interaction chromatography
González-González et al. Recent advances in antibody-based monolith chromatography for therapeutic applications
Yang et al. Pending templates imprinted polymers—hypothesis, synthesis, adsorption, and chromatographic properties
CN106984067A (zh) 一种赭曲霉毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途
Wang et al. Tuning the fabrication of knotted reactors via 3D printing techniques and materials
Pavan et al. Phospho‐l‐tyrosine‐agarose chromatography: Adsorption of human IgG and its proteolytic fragments
CN101685095A (zh) 三聚氰胺免疫检测条
Ščančar et al. Monolithic chromatography for elemental and speciation analysis
CN113341014B (zh) 连续流层析装置和方法
EP4286842A1 (en) Computer-implemented method, computer program product, control device and system for controlling a chromatography system
JP2012122845A (ja) クロマトグラムシミュレーション方法、システム、およびプログラム、ゲルろ過カラムの設計方法、並びにシミュレーション結果の評価方法
Bouzige et al. Immunoextraction of pesticides at the trace level in environmental matrices
CN108061798B (zh) 检测HBsAg/anti-HBs复合物体系中有效成分的量的方法和应用
CN103724401B (zh) 一种用于脂溶性农药残留非竞争检测的肽配体制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20200716

Address after: Hertfordshire

Patentee after: Sedolis Stede chromatographic system Co., Ltd

Address before: New York, USA

Patentee before: Parr