JP5626526B2 - アフィニティークロマトグラフィー用充填剤 - Google Patents
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Description
架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有ビニル単量体を含む単量体混合物の共重合体を含有する多孔性母粒子であって、
前記多孔性母粒子にリガンドが結合しており、
前記多孔性母粒子は、該多孔性母粒子に含まれるエポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有する。
(式中、Rは4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜300個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、R2はプロテインAのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも1個含む50〜500個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す(ここで、R2がRに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。)。)
(式中、R1は4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜100個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し(ここで、R1において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がrと結合する。)、rはTEVドメインを含む7〜200個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。)
(式中、Rは4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜300個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、R2はプロテインAのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも1個含む50〜500個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す(ここで、R2がRに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。)。)
(式中、R1は4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜100個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し(ここで、R1において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がrと結合する。)、rはTEVドメインを含む7〜200個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。)
1.1.多孔性母粒子
1.1.1.構成
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤(多孔性母粒子)は、架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有ビニル単量体を含む単量体混合物の共重合体から主に構成されるのが好ましい。
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤として使用される多孔性母粒子は、例えば公知のシード重合、懸濁重合などにより製造することができる。シード重合法として、特公昭57−24369号公報記載の二段膨潤重合法も好適に用いられる。重合に際しては、上記単量体の他、水、ポロジェンを必須成分とし、重合開始剤、高分子分散剤、界面活性剤、塩、シード粒子などを必要に応じて使用する。
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤には、リガンドが結合している。
リガンドとしては、標的物に対してアフィニティーを有するものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、プロテインA、プロテインG、アビジン等のタンパク質;インシュリン等のペプチド;モノクロナール抗体等の抗体;酵素;ホルモン;DNA;RNA;ヘパリン、ルイスX、ガングリオシド等の糖質;イミノジ酢酸、合成色素、2−アミノフェニル硼素酸、4−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
好ましいリガンドの一例であるイムノグロブリン結合タンパク質(以下、「タンパク質1」ともいう。)は、下記一般式(1)で表される。
(式中、Rは4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜300個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、R2はプロテインAのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも1個含む50〜500個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す(ここで、R2がRに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。)。)
(式中、R1は4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜100個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し(ここで、R1において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がrと結合する。)、rはTEVドメインを含む7〜200個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。)
(式中、Rは4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜300個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、R2はプロテインAのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも1個含む50〜500個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す(ここで、R2がRに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。)。)
(式中、R1は4〜20個の連続したヒスチジンを含む4〜100個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し(ここで、R1において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がrと結合する。)、rはTEVドメインを含む7〜200個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。)
プロテインAのイムノグロブリン結合ドメインは、Aドメイン、Bドメイン、Cドメイン、Dドメイン、およびEドメイン、およびZドメインから選ばれる少なくとも1種であることが好ましい。Aドメイン、Bドメイン、Cドメイン、Dドメイン、およびEドメインのドメインのアミノ酸配列は例えば、Moks T, Abrahms L, et al.,Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains, Eur J Biochem. 1986, 156, 637-643のFig.1に記載されている。該文献はこの参照により開示に含まれる。また、上記文献に記載された各ドメインのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは90%以上)の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発明におけるプロテインAのイムノグロブリン結合ドメインとして使用することができる。
本発明のタンパク質1または2を製造するための標準技術としては、例えば、Frederick M. AusbelらによるCur rent Protocols In Molecular BiologyやSambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。例えば、本発明のタンパク質1または2は、米国特許第5,151,350号明細書に記載されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。すなわち、目的の改変タンパク質(タンパク質1または2)をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、当該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、本発明のタンパク質1または2を大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第5,151,350号明細書に記載されているプラスミドや、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、細菌中に核酸を導入することにより細菌を形質転換させるためには、当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。
本発明のタンパク質1または2をリガンドとして用いた充填剤は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて、従来の充填剤と比較してイムノグロブリン結合タンパク質の保持量が多く、かつ、当該タンパク質の保持能に優れている。これにより、目的タンパク質の捕捉量を高めることができるため、目的タンパク質(抗体)の結合容量を増大させることができる。その結果、純度の高い目的タンパク質を効率良く、低コストでかつ大量に精製することができる。
以下、本実施形態にかかるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
2.1.1.粒径
レーザ回折散乱式粒度分布測定装置(ベックマン・コールター社製 LS13320)により、粒子の体積平均粒径を測定した。
後述する合成例4〜8および比較合成例1でそれぞれ調製された、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を40℃で24時間真空乾燥させて乾燥粒子を得、水銀ポロシメーター(島津製作所社製 オートポアIV9520)にて乾燥粒子の比表面積、体積平均細孔径、および細孔径最頻値を求めた。測定範囲は細孔径範囲で10〜5000nmとした。
2.1.3.1.測定法1
GEヘルスケアバイオサイエンス社製AKTAprime plusを用いて、線流速150cm/hrおよび500cm/hr、1000cm/hrにおけるヒトIgG抗体の結合容量を測定した。カラム容量は1mL、ヒトIgG抗体(ランパイアバイオロジカルラボラトリーズ(Lampire Biological Laboratories)社製)は25mMクエン酸緩衝液(pH6.0)で1mg/mLに希釈したものを使用し、吸光度モニターで溶出先端濃度5w/v%ブレークスルー(破過)のときのヒトIgG抗体吸着量と充填剤体積から結合容量を求めた。
内径0.5cm、高さ5cmのカラムにて、GEヘルスケアバイオサイエンス社製AKTAprime plusを用いて、線流速300cm/hrにおけるヒトIgG抗体の結合容量を測定した。ヒトIgG抗体(ランパイアバイオロジカルラボラトリーズ(Lampire Biological Laboratories)社製)は25mMクエン酸緩衝液(pH6.0)で1mg/mLに希釈したものを使用し、吸光度モニターで溶出先端濃度10w/v%ブレークスルーのときのヒトIgG抗体吸着量と充填剤体積から結合容量を求めた。
2.2.1.合成例1(イムノグロブリン結合タンパク質の調製)
後述する調製例1〜4により、図1および図2に示されるアミノ酸配列を有するイムノグロブリン結合タンパク質(SPAK(配列番号1)、SPAC(配列番号2)、SPAKK(配列番号3)、SPATK(配列番号4)、SPA2K(配列番号5)、SPA3K(配列番号6)、SPA−His−C(配列番号7)、SPA−His−N(配列番号8))を調製した。
Straphylococcus aureus(ATCC, 10832)由来のプロテインA(Dドメイン+Aドメイン)のcDNAをPCRによって増幅した。プライマー(表2参照)は、後述するサブクローニングを補助するために対応する制限酵素部位を有するように設計された。
制限酵素で消化されたDNAフラグメントのライゲーションは、T4DNAリガーゼ(New England Biolab製)100−200ユニット/mlおよび5×リガーゼ緩衝液(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolab)社製)を用いて12℃で12−16時間行われた。プラスミドの形質転換のために、E.coliDH5−α株細胞(New England Biolab製)を使用した。
陽性コロニーを選択し、ミニプレップキット(Mini Prep Kit)(キアゲン(Qiagen)社製)によってプラスミドDNAを抽出した。このプラスミドDNAについて、挿入されたDNAフラグメントが正しい配列であるかどうかを確認するために、3730 NDA Sequencer(Applied Biosystems製)で配列解析を行った。
組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を、E.coli(BL21株)細胞(STRATAGENE製)内にて18℃で1mMのIPTG(Sigma−Aldrich製)を添加し、15時間発現させた。誘導に先立って、吸光度(OD600)が約0.6に到達するまで上記細胞を37℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、pH8.0のトリス緩衝液中で破砕した。
2.2.2.1.固定化例1
グリシジルメタクリレート・トリメチロールプロパントリメタクリレート共重合体からなる多孔質粒子(以下、PBと記す。)を懸濁重合により作製した。PBの平均粒径は33μm、比表面積は83m2/gであった。400mgのPB、36mgのSPAKが16mLのホウ酸緩衝液(pH8.5)に分散した混合液を調製し、4℃で24時間転倒混和し、SPAKをPBに結合させた。次いで、10%メルカプトエタノール水溶液0.8mLを添加して4℃で6時間転倒混和し、残余のエポキシ基を開環、ブロッキングし、20%エタノール水溶液で洗浄して、380mgのSPAK結合多孔質粒子(SPAK−PB)を得た。Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay kitで定量測定を行ったところ、前記粒子に結合したSPAKの量は29mg/g粒子であった。
50mM トリス塩酸、0.5mM EDTA、および1mM DTTのバーファー(pH8.0)中、TEVプロテアーゼで消化されたSPAKをNi−NATカラム(容量:4mL)に通過させて、SPAKのヒスタグ部位が切断された粗SPAKwoHisを回収した。この粗SPAKwoHisを10mM HEPESバーファー(pH7.5)中で12時間透析して、粒子への結合実験用SPAKwoHisを調製した。SPAKwoHisのアミノ酸配列は以下の通りである。
SPAKwohis(全アミノ酸配列)(配列番号18)
GAMAKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEGSK
上記固定化例1で、SPAKの代わりにSPATKを使用した以外は、上記固定化例1と同様にして、380mgのSPATK結合多孔質粒子(SPATK−PB)を得た。前記粒子に結合したSPATKの量は36mg/g粒子であった。
2.2.3.1.測定例1
SPAK−PBを用いて、2.1.3.1.測定法1の欄に記載された方法にて、SPAK−PBのヒトIgG抗体の結合容量を求めたところ、30mg/mLであった。
上記測定法1で、SPAK−PBの代わりにSPATK−PBを使用した以外は、上記測定法1と同様にして、SPATK−PBのヒトIgG抗体の結合容量(2.1.3.1.測定法1の欄に記載された方法で算出)を求めたところ、35mg/mLであった。
上記測定法1で、SPAK−PBの代わりにSPAKwoHis−PBを使用した以外は、上記測定法1と同様にして、SPAKwoHis−PBのヒトIgG抗体の結合容量(2.1.3.1.測定法1の欄に記載された方法で算出)を求めたところ、6mg/mLであった。
(i)多孔性母粒子の合成 グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)60gおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート(サートマー社製)40gをジイソブチルケトン(三井化学社製)173gおよびアセトフェノン(和光純薬工業社製)67gに溶解させ、2、2’−アゾイソブチロニトリル(和光純薬工業社製)1gを添加し、有機モノマー溶液を調製した。
上記合成例1で調製されたSPAKを、以下リガンド1とする。
350mgの多孔性母粒子1と、32mgのリガンド1とが18mLのホウ酸緩衝液(pH8.5)に分散した混合液を調製し、4℃で20時間転倒混和し、リガンド1を多孔性母粒子1に結合させた。次いで、0.5mol/Lメルカプトエタノールと0.5mol/L塩化ナトリウムとからなる水溶液20mLで2回洗浄した後、0.5mol/Lメルカプトエタノールと0.5mol/L塩化ナトリウムとからなるpH8.5の緩衝液20mL中、室温で4時間転倒混和し、残余のエポキシ基を開環、ブロッキングした。20%エタノール水溶液で洗浄して、320mgのアフィニティークロマトグラフィー用充填剤1を得た。
アフィニティークロマトグラフィー用充填剤1の粒径は43μm、比表面積は64m2/g、体積平均細孔径は235nm、細孔径最頻値は130nm、体積平均細孔径/細孔径最頻値は1.8であった。結合容量(2.1.3.2.測定法2の欄に記載された方法で算出)は、線流速150cm/hrにおいて26mg/mL、500cm/hrにおいて23mg/mL、1000cm/hrにおいて22mg/mLであった。
合成例3で、ジイソブチルケトン173gおよびアセトフェノン67gの代わりにジイソブチルケトン115gおよびアセトフェノン45gを使用し、反応容器をセパラブルフラスコの代わりにバッフル付きセパラブルフラスコに変更した以外は、合成例3と同様にして、多孔性母粒子を合成、リガンドを結合して、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤2を得た。
合成例3における(多孔性母粒子とリガンドとの結合)を以下の手順に変更した以外は、合成例3と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤3を得た。
10gの多孔性母粒子1を250mLポリ瓶にいれて、純水80gに分散させ、0.1M硫酸を10g添加した。この液を60℃で5時間転倒混和することにより、多孔性母粒子1のエポキシ基を開環した。次いで、桐山ロートでろ過した後、純水とアセトニトリルで洗浄し、アセトニトリル200gに分散した。これに1.3gのトシルクロライド、1.3gのトリプロピルアミン、0.8gのトリメチルアミン塩酸塩を加え、室温で5時間攪拌することにより、水酸基をトシル化した。次いで、これをろ過した後、アセトニトリルと水で洗浄し、pH9.5のホウ酸緩衝液90gに分散し、10gのトシル化多孔性母粒子1の分散液を得た。400mgのトシル化多孔性母粒子1と、36mgのリガンド1とが16mLのホウ酸緩衝液に分散した混合液を調製し、37℃で20時間転倒混和し、リガンド1をトシル化多孔性母粒子1に結合させた。次いで、10%モノエタノールアミン水溶液0.8mLを添加して37℃で6時間転倒混和し、残余のトシル基をブロッキングし、20%エタノール水溶液で洗浄して、380mgのアフィニティークロマトグラフィー用充填剤3を得た。
アフィニティークロマトグラフィー用充填剤3の粒径は43μm、比表面積は64m2/g、体積平均細孔径は235nm、細孔径最頻値は130nm、体積平均細孔径/細孔径最頻値は1.8であった。結合容量(2.1.3.2.測定法2に記載された方法で算出)は、線流速150cm/hrにおいて25mg/mL、500cm/hrにおいて21mg/mL、1000cm/hrにおいて20mg/mLであった。
合成例3で、ジイソブチルケトン173gおよびアセトフェノン67gの代わりにクメン140gおよびアセトフェノン20gを使用した以外は、合成例3と同様にして、多孔性母粒子を合成し、該多孔性母粒子にリガンドを結合して、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤4を得た。
合成例3で、トリメチロールプロパントリメタクリレート40gの代わりにトリメチロールプロパントリメタクリレート15gおよびエチレングリコールジメタクリレート25gを、ジイソブチルケトン173gおよびアセトフェノン67gの代わりにジイソブチルケトン115gおよびアセトフェノン45gを使用した以外は、合成例3と同様にして、多孔性母粒子を合成し、該多孔性母粒子にリガンドを結合して、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤5を得た。
合成例3で、リガンド1の代わりに、SPAKwoHisを用いた以外は、合成例3と同様にしてアフィニティークロマトグラフィー用充填剤6を得た。
ビニル単量体を原料としない架橋アガロースにプロテインAを固定したアフィニティークロマトグラフィー用充填剤(商品名「MabSelect Xtra」、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を評価した。結合容量(2.1.3.2.測定法2の欄に記載された方法で算出)は、線流速150cm/hrにおいて25mg/mL、500cm/hrにおいて12mg/mLであった。なお、線流速を1000cm/hrにしようとしたが、カラム圧力が高く、線流速は1000cm/hrに達しなかった。
Claims (11)
- 架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有ビニル単量体を含む単量体混合物の共重合体を含有する多孔性母粒子を含み、
前記多孔性母粒子にリガンドが結合しており、
前記多孔性母粒子は、該多孔性母粒子に含まれるエポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有する、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤。 - 前記開環エポキシ基として置換または非置換の2,3−ジヒドロキシプロピル基を含む、請求項1に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
- 前記リガンドが、プロテインAのイムノグロブリン結合ドメインを含むタンパク質である、請求項1または2に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
- 前記プロテインAのイムノグロブリン結合ドメインが、Aドメイン、Bドメイン、Cドメイン、Dドメイン、Eドメイン、およびZドメインから選ばれる少なくとも1種である、請求項3に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
- 前記リガンドが、下記一般式(1)で表されるイムノグロブリン結合タンパク質である、請求項1ないし4のいずれか1項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
R−R2 ・・・・・(1)
(式中、Rは4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜300個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、R2はプロテインAのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも1個含む50〜500個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す(ここで、R2がRに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。)。) - 上記一般式(1)において、R−は下記一般式(2)で表される基である、請求項5に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
R1−r− ・・・・・(2)
(式中、R1は4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜100個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し(ここで、R1において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がrと結合する。)、rはTEVドメインを含む7〜200個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。) - 前記リガンドは、上記一般式(1)において、Rで表されるアミノ酸配列およびR2で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる1種のアミノ酸を含む1〜50個のアミノ酸からなるドメインtを含むものである、請求項5または6に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
- 前記リガンドが、下記一般式(3)で表されるイムノグロブリン結合タンパク質である、請求項1ないし4のいずれか1項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
R2−R ・・・・・(3)
(式中、Rは4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜300個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、R2はプロテインAのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも1個含む50〜500個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す(ここで、R2がRに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。)。) - 上記一般式(3)において、−Rは下記一般式(4)で表される基である、請求項8に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
−r−R1 ・・・・・(4)
(式中、R1は4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜100個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し(ここで、R1において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がrと結合する。)、rはTEVドメインを含む7〜200個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。) - 前記リガンドは、上記一般式(3)において、Rで表されるアミノ酸配列およびR2で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる1種のアミノ酸を含む1〜50個のアミノ酸からなるドメインtを含むものである、請求項8または9に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
- 前記開環エポキシ基は、メルカプト基またはアミノ基を有する求核性化合物をエポキシ基と反応させた基である、請求項1ないし10のいずれか1項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
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