CN102165312A - 亲合层析用填充剂 - Google Patents

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Abstract

亲合层析用填充剂是含有包含交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物的多孔性母粒子，配体结合在所述多孔性母粒子上，所述多孔性母粒子具有使该多孔性母粒子所含的环氧基开环而得到的开环环氧基。

Description

亲合层析用填充剂
技术领域
本发明涉及亲合层析用填充剂，尤其是涉及结合有对于抗体纯化有用的特定配体的亲合层析用填充剂。
背景技术
所谓亲合层析，是将与以分离和纯化作为目的的物质特异性结合的物质(配体)固定在不溶性载体上，使用填充了这样获得的配体固定化载体的柱的层析，可用于例如，蛋白质、核酸等生物体相关物质的分离和纯化(日本特开平6-281638号公报)。
作为亲合层析用填充剂，以琼脂糖凝胶为代表的糖链的交联粒子得到广泛使用，但是它存在着一旦高速流过含有分离和纯化对象分子的溶液，粒子就发生变形，柱压力增高，分离和纯化的时间效率差这样的问题。
另一方面，作为能够以较高流速使用的亲合层析用填充剂，有AppliedBiosystems公司制造的POROS(商品名)。该填充剂使用以疏水性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物作为主要成分的母粒子。该填充剂存在着被认为主要由母粒子引起的发生非特异吸附的情况，而且，如果以高流速使用，就会有结合容量降低的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供至今还没有的即使是在高流速下的分离和纯化，也可以维持高配体结合容量的亲合层析用填充剂。
本发明的一个方式涉及的亲合层析用填充剂是含有包含交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物的多孔性母粒子，配体与前述多孔性母粒子结合，前述多孔性母粒子具有通过使该多孔性母粒子所含的环氧基开环而得到的开环环氧基。
在上述亲合层析用填充剂中，可以含有取代或非取代的2，3-二羟基丙基作为前述开环环氧基。
上述亲合层析用填充剂中，前述配体可以是含有蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。
此时，前述蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域，可以是选自A结构域、B结构域、C结构域、D结构域、E结构域、和Z结构域中的至少1种。
上述亲合层析用填充剂中，前述配体可以是用下述通式(1)表示的免疫球蛋白结合蛋白质。
R-R2·····(1)
(式中，R表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～300个氨基酸构成的氨基酸序列，R2表示至少含有一个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50～500个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端))。
此时，上述通式(1)中，R-可以是下述通式(2)表示的基团。
R1-r-·····(2)
(式中，R1表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～100个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R1中，前述组氨酸连续部位的末端与r结合)，r表示包含TEV结构域的由7～200个氨基酸构成的任意的氨基酸序列)。
而且，此时，前述配体是，上述通式(1)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一个可以含有结构域t的配体，所述结构域t包含选自赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1种氨基酸且由1～50个氨基酸构成。
此外，上述亲合层析用填充剂中，前述配体可以是下述通式(3)表示的免疫球蛋白结合蛋白质。
R2-R·····(3)
(式中，R表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～300个氨基酸构成的氨基酸序列，R2表示至少含有1个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50～500个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端))。
此时，上述通式(3)中，-R可以是下述通式(4)表示的基团。
-r-R1·····(4)
(式中，R1表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～100个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R1中，前述组氨酸连续的部位的末端与r结合)，r表示包含TEV结构域的由7～200个氨基酸构成的任意的氨基酸序列)。
而且，此时，前述配体可以是，上述通式(3)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一个含有结构域t的配体，所述结构域t包含选自赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1种氨基酸且由1～50个氨基酸构成。
本发明中，所谓“蛋白质”，是指具有肽结构单元的所有分子，它是包括了，例如，对天然型蛋白质的部分片段或天然型蛋白质的氨基酸序列进行了人工改变后的变异体的概念。而且，所谓“免疫球蛋白结合结构域”表示单独具有免疫球蛋白结合活性的多肽的功能单元，所谓“免疫球蛋白结合蛋白质”表示与免疫球蛋白具有特异的亲和性，且含有“免疫球蛋白结合结构域”的蛋白质。
而且，本发明中，所谓“TEV结构域”，是指被TEV(烟草蚀刻病毒，Tobacco Etch Virus)蛋白酶识别的切断部位。
根据上述亲合层析用填充剂，其是含有包含交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物的多孔性母粒子，配体与前述多孔性母粒子结合，前述多孔性母粒子具有通过使该多孔性母粒子所含的环氧基开环而得到的开环环氧基，因此在亲合层析中，即使在高流速下的分离和纯化中，也可以维持高配体结合容量，而这在以前是无法实现的。
附图说明
[图1]图1是表示本发明的合成例1中制备的免疫球蛋白结合蛋白质(SPAK、SPAC、SPAKK、SPATK)的氨基酸序列的图。
[图2]图2是表示本发明的合成例1中制备的免疫球蛋白结合蛋白质(SPA2K、SPA3K、SPA-His-C、SPA-His-N)的氨基酸序列的图。
[图3]图3是说明分别插入于3种表达载体(pETM-11、pETM-10和pET29)中的编码本发明的合成例1中涉及的免疫球蛋白结合蛋白质的DNA片段的构成的图。
具体实施方式
本发明的一个实施方式涉及的亲合层析用填充剂是含有包含交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物的多孔性母粒子，配体与多孔性母粒子结合，多孔性母粒子具有通过使该多孔性母粒子所含的环氧基开环而得到的开环环氧基。
1.亲合层析用填充剂
1.1.多孔性母粒子
1.1.1.构成
本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂(多孔性母粒子)优选主要由含有交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物构成。
作为上述交联性乙烯基单体，合适的是芳香族聚乙烯基单体、脂肪族聚乙烯基单体，作为芳香族聚乙烯基单体，优选二乙烯基苯，并且作为脂肪族聚乙烯基单体，优选多元(甲基)丙烯酸酯化合物。作为多元(甲基)丙烯酸酯化合物，可以列举乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，4-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6-己二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯等，特别优选三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯。
上述含环氧基的乙烯基单体是分子中含有环氧基的乙烯基单体，可以列举，例如，(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、α-(甲基)丙烯基-ω-缩水甘油基聚乙二醇等(甲基)丙烯酸酯类；乙烯基苄基缩水甘油醚等芳香族乙烯基化合物等，特别优选甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙烯基苄基缩水甘油醚。
作为本实施方式涉及的亲合层析用填充剂，优选使用含有优选20～50重量％的交联性乙烯基单体与50～80重量％的含环氧基的乙烯基单体的共聚物的多孔质有机聚合物粒子。在此，交联性乙烯基单体如果不到单体总量的20重量％，填充剂的强度就差，因此会存在高流速下，填充剂被破坏，柱压力上升的情况，另一方面，交联性乙烯基单体如果超过单体总量的50重量％，就会存在难以控制细孔径，结合容量降低的情况。
本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂也可以含有其它乙烯基单体作为共聚物成分，其它乙烯基单体的含量优选是0～30重量％。
本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂优选具有20～80μm，更优选具有30～60μm的粒径(体积平均粒子径)。粒径如果不到20μm，在高流速下柱压力变高，不耐用。如果粒径超过80μm，结合容量就差。而且，本发明中所谓“粒径”，是用激光衍射/散射粒度分布测定装置获得的体积平均粒径。
本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂优选具有50～150m2/g，更优选80～120m2/g的比表面积。在此，比表面积如果不到50m2/g，就会有结合容量差的情况，另一方面，如果超过150m2/g，填充剂强度就差，因此会存在高流速下填充剂被破坏，柱压力上升的情况。本发明中所谓“比表面积”，是将通过水银孔隙率计获得的细孔径为10～5000nm的细孔所具有的表面积除以粒子的干燥重量所得的值。
本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂优选具有100～400nm，更优选200～300nm的体积平均细孔径。在此，体积平均细孔径如果不到100nm，就会存在高流速下结合容量显著降低的情况，另一方面，如果超过400nm，就会存在不论流速如何，结合容量有可能降低的情况。本发明中所谓“体积平均细孔径”，是通过水银孔隙率计获得的细孔径为10～5000nm的细孔的体积平均细孔径。
在满足上述范围的粒径、比表面积、和细孔径分布时，成为纯化对象溶液流路的粒子间的间隙和粒子内的较大的细孔径，与纯化对象分子的结合表面积的平衡达到最佳化，高流速下的结合容量维持在高水平。
本实施方式中涉及的作为亲合层析用填充剂使用的多孔性母粒子的一个具体例，可以列举例如，含有20～50重量％的交联性乙烯基单体与50～80重量％的含环氧基的乙烯基单体的共聚物，粒径为20～80μm，比表面积为50～150m2/g，体积平均细孔径为100～400nm的多孔性有机聚合物粒子。
而且，用水银孔隙率计测定本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂时的细孔径为10～5000nm的细孔的浸入体积(细孔体积)优选为1.3～2.5mL/g。
1.1.2.制造
本实施方式中涉及的作为亲合层析用填充剂使用的多孔性母粒子可以通过例如公知的种子聚合、悬浮聚合等来制造。作为种子聚合法，还可以适当地使用日本特公昭57-24369号公报记载的二段膨胀聚合法。聚合时，除上述单体以外，将水、致孔剂(Porogen)作为必需成分，根据需要使用聚合引发剂、高分子分散剂、表面活性剂、盐、种子粒子等。
作为致孔剂(Porogen)，可以列举脂肪族或芳香族烃类、酯类、酮类、醚类、醇类等有机溶剂。作为这种有机溶剂，可以列举例如，甲苯、乙苯、异丙苯、正丙苯、正丁苯、叔丁苯、仲丁苯、异丁苯、二甲苯、乙基甲苯、甲基异丙苯、叔丁基甲苯、二异丙苯、均三甲苯、环己烷、辛烷、异辛烷、乙酸丁酯、邻苯二甲酸二甲酯、甲乙酮、2-辛酮、3-辛酮、4-辛酮、二异丁基酮、2-壬酮、3-壬酮、4-壬酮、5-壬酮、2-癸酮、3-癸酮、4-癸酮、5-癸酮、2-甲壬酮、3-甲壬酮、4-甲壬酮、5-甲壬酮、6-甲壬酮、佛尔酮、异佛尔酮、苯乙酮、二丁基醚、1-己醇、2-辛醇、癸醇、月桂醇、环己醇等，优选以具有碳原子数为2以上的烷基的芳香族烃类作为主要成分的溶剂、以碳原子数为8以上的酮类作为主要成分的溶剂，最优选以异丙苯和/或二异丁基酮作为主要成分的溶剂。通过根据单体的组成对上述致孔剂(Porogen)的量和种类进行选择，可以获得本实施方式中涉及的填充剂所必需的细孔径分布和比表面积。
作为聚合引发剂，优选过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化2-乙基己酸叔丁酯、3，5，5-三甲基己酰过氧化物等的过氧化物类引发剂、偶氮二异丁腈、偶氮二异戊腈等偶氮类引发剂。将这些聚合引发剂溶解于单体混合物或致孔剂(Porogen)中来供给聚合体系。
作为高分子分散剂，可以使用皂化度为80～95％的聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮等水溶性聚合物。作为表面活性剂，可以使用十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯十二烷基醚硫酸酯盐等阴离子性表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚等非离子性表面活性剂等。作为盐，可以适当使用氯化钠、硫酸钠等。作为种子粒子，可以使用分子量为1000～100000左右的聚苯乙烯粒子、聚(甲基)丙烯酸烷基酯粒子等。种子聚合中，通过调整种子粒子的大小和量、单体的量、致孔剂(Porogen)的量，可以获得本发明的填充剂所需要的粒径。悬浮聚合中，通过调整高分子分散剂和表面活性剂的种类和量、搅拌速度、搅拌叶轮和聚合容器的形状和大小，可以获得本发明的填充剂所需要的粒径。
聚合结束后，通过用种子粒子和/或致孔剂(Porogen)的良溶剂进行清洗，而获得所希望的细孔径分布的多孔性母粒子。
1.1.3.与配体的结合
配体结合在本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂上。
作为配体的结合方法，可以列举，例如，(1)利用多孔性母粒子所含的环氧基直接作为配体的结合位点的方法(例如日本特表2006-511935号中记载的方法)；(2)用甲苯磺酰基等对将多孔性母粒子中所含的环氧基开环而生成的醇羟基进行活化之后，结合配体的方法；用氧化剂对该醇羟基进行氧化开裂，然后结合配体的方法(例如日本特开2007-211076号、日本特开2008-032411号中记载的方法)；(3)从多孔性母粒子中所含的环氧基或由该环氧基开环而生成的基团进一步延伸连接子，配体通过该连接子与多孔性母粒子结合的方法(例如特开2008-032411号、特开平10-195099号、特开2004-331953号中记载的方法)。
在任意一种结合法中，在作为亲合层析用填充剂使用前，表面的环氧基实质上开环。也就是说，本实施方式中涉及的亲合层析用填充剂具有开环环氧基。该开环环氧基如上所述，通过在配体与多孔性母粒子结合之前或之后，使多孔性母粒子中所含的环氧基开环而获得。本发明中所谓“开环环氧基”是指使环氧基开环所得的基团，更具体的是指，例如通过使氢氧化物离子、氯化物离子、具有巯基或氨基等的亲核性化合物等与环氧基反应，使环氧基开环所得的基团。
环氧基开环而生成的醇羟基起着使共聚物表面亲水化，防止蛋白质等的非特异吸附，并且使水中的粒子的韧性提高，防止高流速下的粒子被破坏的作用。作为多孔性母粒子中环氧基的开环方法，可以列举，例如，在水溶剂中，用酸或碱，加热或室温下搅拌的方法。此外，还可以用巯基乙醇等具有巯基的阻断剂或单乙醇胺等具有氨基的阻断剂，使环氧基开环。
如上述(1)～(3)中说明的那样，开环环氧基，可以是例如，使环氧基开环而生成的基团、使配体结合在该开环而生成的基团上的基团、和通过连接子使配体结合在该开环而生成的基团上的基团中的任意一种，优选它们中的至少1种。此时，从可以使共聚物表面亲水化，更有效地防止蛋白质等的非特异吸附这一点上考虑，优选多孔性母粒子含有取代或非取代的2，3-二羟基丙基来作为开环环氧基。非取代的2，3-二羟基丙基可以通过例如，使缩水甘油基通过水解来开环的方式获得。取代的2，3-二羟基丙基可以通过例如，把缩水甘油基用巯基乙醇等具有巯基的阻断剂或单乙醇胺等具有氨基的阻断剂进行开环而获得。
1.2.配体
作为配体，如果是对目标物具有亲合性的物质，其种类就没有特别限制，可以使用例如，蛋白质A、蛋白质G、抗生物素蛋白等蛋白质；胰岛素等肽；单克隆抗体等抗体；酶；激素；DNA；RNA；肝素、路易斯X(LewisX)、神经节苷脂等糖类；亚氨基二乙酸、合成色素、2-氨基苯硼酸、4-氨基苄脒、谷胱甘肽、生物素以及它们的衍生物这样的低分子化合物。上述例示的配体可以使用它们的整体，但也可以使用通过重组、酶法等获得的它们的片段。此外，还可以是人工合成的肽或肽衍生物。
作为适于抗体纯化的配体，是蛋白质A和蛋白质G，更优选是蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域，最优选是在蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域末端上添加了含有4个以上连续的组氨酸单元的肽的蛋白质，作为这种蛋白质，可以列举，例如，后述通式(1)或(3)表示的免疫球蛋白结合蛋白质。
1.2.1.免疫球蛋白结合蛋白质
作为优选的配体的一个例子的免疫球蛋白结合蛋白质(以下，也称为“蛋白质1”)。由下述通式(1)表示。
R-R2·····(1)
(式中，R表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～300个氨基酸构成的氨基酸序列，R2表示至少含有1个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50～500个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端))。
上述通式(1)中，R表示的氨基酸序列中所含的氨基酸的数目优选为8～100个，R中所含的组氨酸连续的部位的组氨酸数目优选是4～8个。此外，上述通式(1)中，R2表示的氨基酸序列中所含的氨基酸数目优选为120～480个。
此外，上述通式(1)中，R-优选是下述通式(2)表示的基团。
R1-r-·····(2)
(式中，R1表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～100个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R1中，前述组氨酸连续的部位的末端与r结合)，r表示含有TEV结构域的由7～200个氨基酸构成的任意氨基酸序列)。
上述通式(2)中，R1表示的氨基酸序列所含的氨基酸数目优选为4～25个，R1所含的组氨酸连续的部位的组氨酸数目优选为4～8个，r表示的氨基酸序列所含的氨基酸的数目优选为10～50个。
作为优选的配体的另一个例子的免疫球蛋白结合蛋白质(以下，也称为“蛋白质2”)。由下述通式(3)表示。
R2-R·····(3)
(式中，R表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～300个氨基酸构成的氨基酸序列，R2表示至少含有1个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50～500个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端))。
上述通式(3)中，R表示的氨基酸序列中所含的氨基酸的数目优选为8～100个，R中所含的组氨酸连续的部位的组氨酸数目优选是4～8个。此外，上述通式(1)中，R2表示的氨基酸序列中所含的氨基酸数目优选为120～480个。
上述通式(3)中，-R优选是下述通式(4)表示的基团。
-r-R1·····(4)
(式中，R1表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～100个氨基酸构成的氨基酸序列(在此，R1中，前述组氨酸连续的部位的末端与r结合)，r表示含有TEV结构域的由7～200个氨基酸构成的任意氨基酸序列)。
上述通式(4)中，R1表示的氨基酸序列所含的氨基酸数目优选为4～25个，r中所含的组氨酸连续的部位的组氨酸数目优选为4～8个，r表示的氨基酸序列中所含的氨基酸的数目优选为10～50个。
上述通式(1)和上述通式(3)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一个优选含有包含选自赖氨酸、精氨酸、和半胱氨酸中的1种氨基酸的由1～50个氨基酸构成的结构域t。此时，在上述氨基酸序列中可以含有多个相同或不同的结构域t。
此外，如上述通式(2)和上述通式(4)所示，r表示的氨基酸序列中可以含有TEV结构域。通过使r表示的氨基酸序列中含有TEV结构域，可以通过被TEV蛋白酶切断来进行R与R2的分离，而且TEV结构域是用于实现本发明效果(固定化到载体上的量多，而且提高该载体的免疫球蛋白保持能力)的优选序列。此外，r表示的氨基酸序列中可以含有TEV结构域的变异体(Mutant)(与能否被该TEV蛋白酶切断无关，与TEV结构域的氨基酸序列具有70％以上，优选90％以上的同源性)。
构成本发明蛋白质1或2的氨基酸的总个数通常为70～1000，在与粒子结合的用途中使用时，优选是80～600。
1.2.1.1.免疫球蛋白结合结构域
蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域优选是选自A结构域、B结构域、C结构域、D结构域、和E结构域、和Z结构域中的至少一种。A结构域、B结构域、C结构域、D结构域、和E结构域的结构域氨基酸序列记载于例如，Moks T，Abrahms L，et al.，Staphylococcal protein A consists of fiveIgG-binding domains，Eur J Biochem.1986，156，637-643的图1中。将该文献通过这种参照的方式包含在公开内容中。此外，由与上述文献中记载的各结构域的氨基酸序列具有70％以上(优选90％以上)同源性的氨基酸序列构成的蛋白质也可以作为本发明中蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域来使用。
本实施方式中涉及的免疫球蛋白结合蛋白质可以具有多个相同或不同种类的免疫球蛋白结合结构域。例如，蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域可以为(D结构域-A结构域)n(在此，n表示1以上的整数(优选1～6)，D结构域与A结构域之间可以存在任意氨基酸序列)，也就是说，可以为含有包含A结构域和D结构域的重复单元的结构域。
此外，蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域可以是天然型的免疫球蛋白结合结构域，或者，也可以是重组型的免疫球蛋白结合结构域。在此，重组型的免疫球蛋白结合结构域在免疫球蛋白结合活性方面可以作为与改变前的免疫球蛋白结合结构域同等的结构域来对待，例如，优选与天然型蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列保持70％以上(优选90％以上)的同源性。作为具体例子，除了Nilsson B.之外，还可以列举蛋白质工程(Protein engineering)，1987年，第1卷，2号，107-113页中记载的Z结构域、Hober S等人的美国专利申请2006/0194955A1中记载的具有耐碱性的Z结构域的变异体(mutant)。将上述文献通过这种参照的方式包含在公开内容中。此外，由与上述文献中记载的各结构域的氨基酸序列具有70％以上(优选90％以上)同源性的氨基酸序列构成的蛋白质也可以作为本发明中蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域来使用。
1.2.1.2.蛋白质1或2的制造
作为用于制造本发明的蛋白质1或2的标准技术，可以利用记载于例如，Frederick M.Ausbel等人的Current Protocols In Molecular Biology或Sambrook等人编辑的《分子克隆》(冷泉港出版社，第3版，2001)等中的公知的基因重组技术。例如，本发明的蛋白质1或2可以使用美国专利第5151350号说明书中记载的基因重组技术来制造。也就是说，通过将用含有编码作为目标的改变蛋白质(蛋白质1或2)的核酸序列的表达载体转化到大肠杆菌等宿主，并且用适当的液体培养基培养该细胞，可以从培养后的细胞中，大量且经济地获得本发明的蛋白质1或2。作为优选的表达载体，可以使用可在细菌内复制的已知载体中的任意一种，可以列举，例如，美国专利第5151350号说明书中记载的质粒或Sambrook等人编辑的《分子克隆》(冷泉港出版社，第3版，2001)等中记载的质粒。此外，为了通过将核酸导入到细菌中来转化细菌，可以使用本技术领域中已知的任意一种方法，例如，可以利用Sambrook等人编辑的《分子克隆》(冷泉港出版社，第3版，2001)等中记载的公知方法。培养转化的细菌，回收表达的蛋白质的方法对于本领域技术人员来说是公知的。
也就是说，本发明的另一个实施方式中涉及的核酸对免疫球蛋白结合蛋白质(蛋白质1或2)或其等功能变异体进行编码。本发明中，免疫球蛋白结合蛋白质的所谓“等功能变异体(functional variant)”是指，通过部分氨基酸的添加、删除、取代、氨基酸残基的化学修饰等而被改变的免疫球蛋白结合蛋白质，与改变前的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列保持70％以上，优选90％以上的同源性，而且在免疫球蛋白结合活性方面，可以作为与改变前的免疫球蛋白结合蛋白质同等的蛋白质来对待。
具体而言，由于蛋白质A的1个免疫球蛋白结合结构域是由约60个氨基酸构成的小蛋白质，因此可以，例如将编码所希望的氨基酸序列的DNA分割成数十个碱基构成的合成寡核苷酸来进行合成，通过由DNA连接酶进行的连接反应将它们连接起来插入质粒中，获得作为目标的表达载体。此时，以在大肠杆菌中有效表达该蛋白质为目的，使用采用大肠杆菌的最适密码子的核酸序列，是对于本领域技术人员而言一般进行的方法。此外，如后述的本发明的实施例中所示，可以从金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)的基因组DNA中，使用PCR(聚合酶链式反应)技术，构建编码所希望的氨基酸序列的DNA序列。
而且，如上所述，本发明的蛋白质1或2可以是含有1个以上(优选2～12个，更优选2～5个)的免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。编码这种蛋白质的cDNA，可以通过串联地连接规定个数的编码1个免疫球蛋白结合结构域的cDNA(互补DNA)来容易地制成。通过将这样制成的cDNA插入适当的表达质粒中来利用，可以容易地制造含有1个以上的免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。
例如，后述的实施例中所示的具有序列号1～8的氨基酸序列的蛋白质、或由序列号1～8中缺失、取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的且具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质，可以作为本发明的免疫球蛋白结合蛋白质来适当使用。
1.2.1.3.作用效果
使用本发明的蛋白质1或2作为配体的填充剂与亲合层析中以往的填充剂相比，免疫球蛋白结合蛋白质的保持量多，而且该蛋白质的保持能力好。因此，由于能够提高目标蛋白质的捕捉量，从而可以增大目标蛋白质(抗体)的结合容量。其结果是，能够有效地以低成本大量地纯化出纯度高的目标蛋白质。
2.实施例
以下，列举实施例，更具体地说明本实施方式中这种亲合层析用填充剂。而且，以下记载是概括性表示本发明的方式，没有特殊理由，这种记载不限定本发明。
2.1.评价方法
2.1.1.粒径
用激光衍射/散射粒度分布测定装置(Beckman Coulter公司制造LS13320)，测定粒子的体积平均粒径。
2.1.2.比表面积、体积平均细孔径、细孔径众数值
使在后述的合成例4～8和比较合成例1中分别制备的亲合层析用填充剂在40℃下真空干燥24小时而获得干燥粒子，用水银孔隙率计(岛津制作所社制造AutoPore IV9520)求出干燥粒子的比表面积、体积平均细孔径、和细孔径众数值。测定范围在细孔径范围下规定为10～5000nm。
2.1.3.结合容量
2.1.3.1.测定法1
使用GE Healthcare Bioscience公司制造的AKTAprime plus，测定线流速150cm/hr和500cm/hr、1000cm/hr下人IgG抗体的结合容量。柱容量为1mL，人IgG抗体(Lampire Biological Laboratories公司制)采用用25mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)稀释成1mg/mL的制品，用吸光度监控器，根据洗脱前端浓度突破(breakthrough)5w/v％时的人IgG抗体吸附量和填充剂体积，求出结合容量。
2.1.3.2.测定法2
用内径0.5cm、高度5cm的柱，采用GE Healthcare Bioscience公司制AKTAprime plus，测定线流速300cm/hr下人IgG抗体的结合容量。人IgG抗体(Lampire Biological Laboratories公司制)采用用25mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)稀释到1mg/mL的制品，用吸光度监控器，根据洗脱前端浓度突破10w/v％时的人IgG抗体吸附量和填充剂体积，求出结合容量。
2.2.实验例
2.2.1.合成例1(免疫球蛋白结合蛋白质的制备)
通过后述的制备例1～4，制备具有图1和图2所示的氨基酸序列的免疫球蛋白结合蛋白质(SPAK(序列号1)、SPAC(序列号2)、SPAKK(序列号3)、SPATK(序列号4)、SPA2K(序列号5)、SPA3K(序列号6)、SPA-His-C(序列号7)、SPA-His-N(序列号8))。
而且，图1和图2中，R和R2与上述通式(1)或上述通式(2)中的R和R2对应(R1、R2和r对应于上述通式(2)或上述通式(4)中的R1、R2和r)，r中的下划线表示TEV结构域(TEV蛋白酶(肽键水解合成酶)切断部位)，R2中的下划线表示域间连接子或C末端连接子(结构域t)，参照表2)。
通过MALDI-TOF质谱分析，确认了这些蛋白质各个氨基酸序列一致，具有图1和图2所示的氨基酸序列。
2.2.1.1.制备例1(PCR扩增和限制性内切酶的消化)
通过PCR来扩增金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus，ATCC，10832)来源的蛋白质A(D结构域+A结构域)的cDNA。为了辅助后述的亚克隆，引物(参照表2)被设计成具有对应的限制性内切酶部位。
如表1所示，分别编码SPAK、SPAC、SPA2K、SPA3K、SPAKK、和SPATK的DNA片段由限制性内切酶NcoI和HindIII(New-England BioLab制)所消化，并被插入到载体pETM-11(参照图3，以馈赠形式从D.Shibly，EMBL Heidelberg，Heidelberg，Germany获得)中。
而且，如表1所示，编码SPA-His-N的DNA片段由限制性内切酶NcoI和HindIII所消化，并被插入到载体pETM-10(参照图3，以馈赠形式从D.Shibly，EMBL Heidelberg，Heidelberg，Germany获得)中。
并且，如表1所示，为了形成在C末端上具有组氨酸标签(由组氨酸6残基构成的肽)的免疫球蛋白结合蛋白质的SPA-His-C，使用载体pET29(参照图3，Novagen公司制造)。可以对载体pET29使用的限制性内切酶是NdeI(New-England Bio Lab制造)和XhoI(New-England Bio Lab制造)。
而且，图3中所示的3种表达载体全都含有卡那霉素抗性基因作为选择性标记。
此外，图3所示的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列中，“Tev”表示TEV蛋白酶识别部位(氨基酸序列：ENLYFQG)。TEV蛋白酶识别氨基酸序列ENLYFQG，将Q与G之间切断。
通过设计基于SPAK插入序列的1对引物，而导入上述限制性内切酶。此外，使用表2所示的引物(序列号9～17)来进行PCR扩增。
而且，SPA-His-N的DNA片段还可以通过用限制性内切酶(表1)消化含有SPAK的质粒来直接获得。本合成例中，SPA-His-N的DNA片段通过用限制性内切酶(表1)消化含有SPAK的质粒来直接获得。
[表1]
[表2]
Figure BPA00001331791000162
表中，斜体字表示的文字表示导入于引物区域的限制性内切酶位点。
在含有金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)的染色体组DNA模板(500ng/μl)0.5μl、各引物5pl、10×Pfu缓冲液(Fermentas制)5μl、和Pfu聚合酶(Fermentas制)(5个单位/μl)1μl的PCR扩增溶液中加入无菌水，使最终的液体体积达到50μl。PCR扩增的条件如下所示：94℃下1分钟、然后94℃下30秒、56℃下1分钟、72℃下1分钟的30个循环，最后于72℃下10分钟。用PX2 Thermal Cycler PCR装置(Thermo ElectronCorporation制造)进行该PCR反应。
2.2.1.2.制备例2(连接和转化)
被限制性内切酶消化的DNA片段的连接，用T4DNA连接酶(NewEngland Biolab制造)100-200个单元/ml和5×连接酶缓冲液(New EnglandBiolab公司制造)，于12℃下进行12-16小时。为了质粒的转化，使用大肠杆菌DH5-α株细胞(New England Biolab制造)。
2.2.1.3.制备例3(质粒DNA的制备和序列分析)
选择阳性菌落，用Mini Prep Kit(Qiagen公司制造)提取质粒DNA。对于该质粒DNA，为了确认插入的DNA片段是否是正确的序列，用3730NDA测序仪(Applied Biosystems制造)进行序列分析。
2.2.1.4.制备例4(免疫球蛋白结合蛋白质的表达和纯化)
在大肠杆菌(BL21株)细胞(STRATAGENE制造)内，于18℃加入1mM的IPTG(Sigma-Aldrich制)，使重组型免疫球蛋白结合蛋白质表达15小时。在诱导前，在37℃下温育上述细胞直至吸光度(OD600)达到约0.6。蛋白质表达后，回收细胞，在pH8.0的Tris缓冲液中破碎。
获得的重组型免疫球蛋白结合蛋白质用Ni亲合层析(Ni-NTA(氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid))粒子，QIAGEN公司制造)进行纯化。用阴离子交换层析(Q-Sepharose FF，GE Bioscience公司制造)，在pH7.5的HEPES缓冲液中对纯化的免疫球蛋白结合蛋白质再进行纯化。
2.2.2.合成例2(免疫球蛋白结合蛋白质向粒子上的固定化)
2.2.2.1.固定化例1
通过悬浮聚合制作由甲基丙烯酸缩水甘油酯·三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯共聚物构成的多孔粒子(以下，记为PB)。PB的平均粒径为33μm，比表面积为83m2/g。制备将400mg的PB、36mg的SPAK分散在16mL的硼酸缓冲液(pH8.5)中的混合液，于4℃颠倒混合24小时，使SPAK与PB结合。然后，添加0.8mL的10％巯基乙醇水溶液，4℃下颠倒混合6小时，使残余的环氧基开环，阻断，用20％乙醇水溶液清洗，获得了380mg的SPAK结合多孔粒子(SPAK-PB)。用Thermo Scientific Pierce BCAProtein Assay kit进行定量测定时，与前述粒子结合的SPAK的量是29mg/g粒子。
2.2.2.2.固定化例2
50mM Tris盐酸、0.5mM EDTA、和1mM DTT的缓冲液(pH8.0)中，使被TEV蛋白酶消化的SPAK通过Ni-NAT柱(容量：4mL)，回收SPAK的组氨酸标签部位被切断的粗SPAKwoHis。对该粗SPAKwoHis在10mMHEPES缓冲液(pH7.5)中进行12小时透析，制备结合到粒子的实验用SPAKwoHis。SPAKwoHis的氨基酸序列如下。
SPAKwohis(全氨基酸序列)(序列号18)
GAMAKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSL
接着，除了使用SPAKwoHis来代替上述固定化例1中的SPAK以外，按照与上述固定化例1同样的方式，获得了380mg的SPAKwoHis结合多孔粒子(SPAKwoHis-PB)。结合到前述粒子上的SPAKwoHis的量是6mg/g粒子。
2.2.2.3.固定化例3
除了使用SPATK来代替上述固定化例1中的SPAK以外，按照上述固定化例1同样的方式，获得了380mg的SPATK结合多孔粒子(SPATK-PB)。结合到前述粒子上的SPATK的量是36mg/g粒子。
2.2.3.试验例(免疫球蛋白G(IgG)结合量的测定)
2.2.3.1.测定例1
使用SPAK-PB，用2.1.3.1.测定法1的栏中记载的方法，求出SPAK-PB的人IgG抗体的结合容量，其是30mg/mL。
2.2.3.2.测定例2
除了使用SPATK-PB来代替上述测定法1中的SPAK-PB以外，按照与上述测定法1一样的方式，求出SPATK-PB的人IgG抗体的结合容量(用2.1.3.1.测定法1的栏中记载的方法计算出)，结果是35mg/mL。
2.2.3.3.测定例3
在上述测定法1中，除了使用SPAKwoHis-PB来代替SPAK-PB以外，按照与上述测定法1一样的方式，求出SPAKwoHis-PB的人IgG抗体的结合容量(用2.1.3.1.测定法1的栏中记载的方法计算出)，结果是6mg/mL。
2.2.4.合成例3(亲合层析用填充剂的制备)
(i)多孔性母粒子的合成 使甲基丙烯酸缩水甘油酯(Mitsubishi Rayon公司制造)60g和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(Sartomer公司制造)40g溶解于二异丁基酮(三井化学社制造)173g和苯乙酮(和光纯药工业社制造)67g中，添加1g的2，2’-偶氮异丁腈(和光纯药工业社制造)，制备有机单体溶液。
接着，在3000g的纯水中添加聚乙烯醇(KURARAY社制PVA-217)12g、十二烷基硫酸钠(花王社制Emaar 10G)1g和氯化钠31g，搅拌一晚，制备水溶液。
然后，在7L可拆式烧瓶(separable flask)内投入获得的水溶液，安装温度计、搅拌叶轮和冷却管，置于温水浴中，在氮气氛围下，以825rpm开始搅拌。接着，再用温水浴加温可拆式烧瓶(separable flask)，水溶液的温度达到85℃时，用滴液漏斗在该水溶液中添加上述有机单体溶液，进行5小时搅拌。
然后，冷却反应液后，将这种反应液转移到5L的聚丙烯制瓶中，静置直至粒子悬浮，从下方吸出多余的水，废弃。再在该反应液中加入丙酮，使粒子沉淀。然后，静置反应液3分钟，用倾析法除去丙酮。重复进行2次这种操作之后，加水，使粒子沉淀。接着，静置3分钟，进行倾析法。重复2次这种操作，清洗粒子。进而，用丙酮再次置换粒子的分散液，风干一晚后，用真空干燥机进行干燥，获得了多孔性母粒子1(86g)。
(ii)配体的制作
将上述合成例1中制备的SPAK当作以下配体1。
(iii)多孔性母粒子和配体的结合
制备350mg的多孔性母粒子1和32mg的配体1分散在18mL的硼酸缓冲液(pH8.5)中的混合液，4℃下颠倒混合20小时，使配体1与多孔性母粒子1结合。然后，用由0.5mol/L巯基乙醇和0.5mol/L氯化钠构成的水溶液20mL清洗2次后，在由0.5mol/L巯基乙醇和0.5mol/L氯化钠构成的pH8.5的缓冲液20mL中，于室温下颠倒混合4小时，使余下的环氧基开环，并阻断。用20％乙醇水溶液清洗，获得了320mg的亲合层析用填充剂1。
(iv)评价
亲合层析用填充剂1的粒径为43μm，比表面积为64m2/g，体积平均细孔径为235nm，细孔径众数值为130nm，体积平均细孔径/细孔径众数值为1.8。结合容量(用2.1.3.2.测定法2的栏中记载的方法计算出)在线流速150cm/hr时为26mg/mL，500cm/hr时为23mg/mL，1000cm/hr时为22mg/mL。
2.2.5.合成例4
使用二异丁基酮115g和苯乙酮45g来代替合成例3中的二异丁基酮173g和苯乙酮67g，将反应容器变更为带有挡板的可拆式烧瓶(separableflask)以代替可拆式烧瓶(separable flask)，除此以外，以与合成例3一样的方式，合成多孔性母粒子，结合配体，获得了亲合层析用填充剂2。
亲合层析用填充剂2的粒径为33μm，比表面积为83m2/g，体积平均细孔径为146nm，细孔径众数值为40nm，体积平均细孔径/细孔径众数值为3.7。结合容量(用2.1.3.2.测定法2的栏中记载的方法计算出)在线流速150cm/hr时为32mg/mL，500cm/hr时为20mg/mL，1000cm/hr时为14mg/mL。
2.2.6.合成例5
除了合成例3中(多孔性母粒子与配体的结合)变更为以下次序之外，按照与合成例3一样的方式，获得了亲合层析用填充剂3。
(i)多孔性母粒子与配体的结合
在250mLPE瓶中装入10g的多孔性母粒子1，使之分散于纯水80g中，添加10g的0.1M硫酸。通过对该液体在60℃进行5小时颠倒混和，使多孔性母粒子1的环氧基开环。然后，用桐山漏斗过滤后，用纯水和乙腈清洗，分散于乙腈200g中。通过在其中加入1.3g的甲苯磺酰氯、1.3g的三丙胺、0.8g的三甲胺盐酸盐，室温下搅拌5小时，对羟基进行甲苯磺酰化。然后，将其过滤后，用乙腈和水清洗，分散于90g的pH9.5的硼酸缓冲液中，获得了10g的甲苯磺酰化多孔性母粒子1的分散液。制备400mg的甲苯磺酰化多孔性母粒子1和36mg的配体1分散于16mL的硼酸缓冲液中的混合液，于37℃，颠倒混合20小时，使配体1与甲苯磺酰化多孔性母粒子1结合。接着，添加0.8mL的10％单乙醇胺水溶液，37℃下颠倒混合6小时，阻断残余的甲苯磺酰基，用20％乙醇水溶液清洗，获得了380mg的亲合层析用填充剂3。
(ii)评价
亲合层析用填充剂3的粒径为43μm，比表面积为64m2/g，体积平均细孔径为235nm，细孔径众数值为130nm，体积平均细孔径/细孔径众数值为1.8。结合容量(用2.1.3.2.测定法2中记载的方法计算出)在线流速150cm/hr时为25mg/mL，500cm/hr时为21mg/mL，1000cm/hr时为20mg/mL。
2.2.7.合成例6
除了使用异丙苯140g和苯乙酮20g代替合成例3中的二异丁基酮173g和苯乙酮67g以外，按照与合成例3一样的方式，合成多孔性母粒子，将配体与该多孔性母粒子结合，获得了亲合层析用填充剂4。
亲合层析用填充剂4的粒径为39μm，比表面积为91m2/g，体积平均细孔径为128nm，细孔径众数值为33nm，体积平均细孔径/细孔径众数值为3.9。结合容量(用2.1.3.2.测定法2的栏中记载的方法计算出)在线流速150cm/hr时为19mg/mL，线流速500cm/hr时为8mg/mL，1000cm/hr时为6mg/mL。
2.2.8.合成例7
使用三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯15g和乙二醇二甲基丙烯酸酯25g来代替三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯40g，使用二异丁基酮115g和苯乙酮45g来代替二异丁基酮173g和苯乙酮67g，除此之外，按照与合成例3一样的方式，合成多孔性母粒子，将配体与该多孔性母粒子结合，获得了亲合层析用填充剂5。
亲合层析用填充剂5的粒径为32μm，比表面积为38m2/g，体积平均细孔径为329nm，细孔径众数值为302nm，体积平均细孔径/细孔径众数值为1.1。结合容量(用2.1.3.2.测定法2的栏中记载的方法计算出)在线流速150cm/hr时为10mg/mL，线流速500cm/hr时为9mg/mL，1000cm/hr时为8mg/mL。
2.2.9.合成例8
除了使用SPAKwoHis代替合成例3中配体1以外，按照与合成例3一样的方式获得亲合层析用填充剂6。
亲合层析用填充剂6的粒径为33μm，比表面积为83m2/g，体积平均细孔径为146nm，细孔径众数值为40nm，体积平均细孔径/细孔径众数为3.7。结合容量(用2.1.3.2.测定法2的栏中记载的方法计算出)在线流速150cm/hr时为8mg/mL，500cm/hr时为5mg/mL，1000cm/hr时为4mg/mL。
2.2.10.比较合成例1
评价不以乙烯基单体作为原料的，蛋白质A固定在交联琼脂糖上的亲合层析用填充剂(商品名“MabSelect Xtra”，GE Healthcare Bioscience公司制造)。结合容量(用2.1.3.2.测定法2的栏中记载的方法计算出)在线流速150cm/hr时为25mg/mL，在500cm/hr时为12mg/mL。而且，尽管想要使线流速达到1000cm/hr，但柱压力增高，线流速达不到1000cm/hr。
以上是本实施方式中涉及的说明。本发明不受上述实施方式的限制，而是可以进行进一步的各种变形。而且，本发明包括与实施方式中说明的构成实质上相同的构成(例如，功能、方法和结果相同的构成、或目的和结果相同的构成)。此外，本发明还包括对实施方式中说明的构成的非本质部分进行置换后的构成。而且，本发明包括能够与实施方式中说明的构成起到相同作用效果的构成或达到相同目的的构成。而且，本发明包括在实施方式说明的构成中添加了公知技术后的构成。
Figure ISB00000493692900011
Figure ISB00000493692900021
Figure ISB00000493692900031
Figure ISB00000493692900041
Figure ISB00000493692900061
Figure ISB00000493692900081

Claims (10)

1.亲合层析用填充剂，其是含有包含交联性乙烯基单体和含环氧基的乙烯基单体的单体混合物的共聚物的多孔性母粒子，
配体与所述多孔性母粒子结合，
所述多孔性母粒子具有通过使该多孔性母粒子所含的环氧基开环而获得的开环环氧基。
2.根据权利要求1所述的亲合层析用填充剂，其含有取代或非取代的2，3-二羟基丙基作为所述开环环氧基。
3.根据权利要求1或2所述的亲合层析用填充剂，所述配体是含有蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的亲合层析用填充剂，所述蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域是选自A结构域、B结构域、C结构域、D结构域、E结构域、和Z结构域中的至少1种。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的亲合层析用填充剂，所述配体是下述通式(1)表示的免疫球蛋白结合蛋白质：
R-R2·····(1)
式中，R表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～300个氨基酸构成的氨基酸序列、R2表示至少含有1个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50～500个氨基酸构成的氨基酸序列，在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端。
6.根据权利要求5所述的亲合层析用填充剂，上述通式(1)中，R-是下述通式(2)表示的基团：
R1-r-·····(2)
式中，R1表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～100个氨基酸构成的氨基酸序列，在此，R1中，所述组氨酸连续的部位的末端与r结合、r表示含有TEV结构域的由7～200个氨基酸构成的任意的氨基酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的亲合层析用填充剂，所述配体是所述通式(1)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一个含有结构域t的配体，所述结构域t包含选自赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1种氨基酸且由1～50个氨基酸构成。
8.根据权利要求1～4中任一项所述的亲合层析用填充剂，所述配体是下述通式(3)表示的免疫球蛋白结合蛋白质：
R2-R·····(3)
式中，R表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～300个氨基酸构成的氨基酸序列，R2表示至少含有1个蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域的由50～500个氨基酸构成的氨基酸序列，在此，R2与R结合的末端是免疫球蛋白结合结构域的末端。
9.根据权利要求8所述的亲合层析用填充剂，所述通式(3)中，-R是下述通式(4)表示的基团：
-r-R1·····(4)
式中，R1表示含有4～20个组氨酸连续的部位的由4～100个氨基酸构成的氨基酸序列，在此，R1中，所述组氨酸连续的部位的末端与r结合、r表示含有TEV结构域的由7～200个氨基酸构成的任意的氨基酸序列。
10.根据权利要求8或9所述的亲合层析用填充剂，所述配体是所述通式(3)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一个含有结构域t的配体，所述结构域t包含选自赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1种氨基酸且由1～50个氨基酸构成。
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