WO2010035756A1 - イムノグロブリン結合タンパク質 - Google Patents

イムノグロブリン結合タンパク質 Download PDF

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WO2010035756A1
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amino acid
immunoglobulin binding
acid sequence
protein
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スンチェン リ シャン
グラサス テオファニス
リ シン
勇 王
孝広 河合
哲夫 福田
功二 田守
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Jsr株式会社
ザ ユニバーシティ オブ ウエスタン オンタリオ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)

Definitions

  • the present invention relates to an immunoglobulin binding protein.
  • affinity chromatography One method for producing a highly pure protein is affinity chromatography.
  • a target protein is separated from contaminants by adsorbing the target protein on a target substance-capturing support in which a molecule having specific and reversible affinity for the target protein is bound as a ligand.
  • Proteins are often used as ligands at that time.
  • An example of a protein used as a ligand is protein A.
  • Protein A is a protein derived from Staphylococcus aureus and has a repeating structure of five immunoglobulin binding domains having homology called A domain, B domain, C domain, D domain, and E domain.
  • the immunoglobulin binding domain of protein A is known to bind to immunoglobulin with only one domain (Nilsson B. et al., Protein Engineering, 1987, 1st Vol. 2, No. 107-113).
  • protein A for example, genetic recombination has been attempted in order to facilitate production and to allow modification of the amino acid sequence (US Pat. No. 5,151,350).
  • recombinant protein A containing an immunoglobulin binding domain whose amino acid sequence is partially modified is widely used as a ligand for affinity chromatography.
  • the present invention relates to an immunoglobulin binding that functions as a ligand in a carrier for capturing a target substance for affinity chromatography, for example, so that the amount immobilized on the carrier is large and the immunoglobulin retention ability of the carrier can be enhanced.
  • the immunoglobulin binding protein according to one embodiment of the present invention is represented by the following general formula (1).
  • RR 2 (1) (Wherein R represents an amino acid sequence consisting of 4 to 300 amino acids including a continuous site of 4 to 20 histidines, and R 2 represents 50 to 500 including at least one immunoglobulin binding domain of protein A) (Wherein the terminal where R 2 binds to R is the terminal of the immunoglobulin binding domain).
  • the immunoglobulin binding protein can be a group represented by the following general formula (2) in the general formula (1).
  • R 1 represents an amino acid sequence consisting of 4 to 100 amino acids including a site in which 4 to 20 histidines are continuous (wherein, in R 1 , the end of the site in which the histidines are continuous is r and And r represents an arbitrary amino acid sequence consisting of 7 to 200 amino acids including the TEV domain.)
  • the immunoglobulin binding protein is one type in which at least one of the amino acid sequence represented by R and the amino acid sequence represented by R 2 in the general formula (1) is selected from lysine, arginine, and cysteine. And a domain t consisting of 1 to 50 amino acids including
  • the immunoglobulin binding protein according to another embodiment of the present invention is represented by the following general formula (3).
  • R 2 -R (3) (Wherein R represents an amino acid sequence consisting of 4 to 300 amino acids including a continuous site of 4 to 20 histidines, and R 2 represents 50 to 500 including at least one immunoglobulin binding domain of protein A) (Wherein the terminal where R 2 binds to R is the terminal of the immunoglobulin binding domain).
  • the immunoglobulin binding protein may be a group represented by the following general formula (4) in the general formula (3).
  • R 1 represents an amino acid sequence consisting of 4 to 100 amino acids including a site in which 4 to 20 histidines are continuous (wherein, in R 1 , the end of the site in which the histidines are continuous is r and And r represents an arbitrary amino acid sequence consisting of 7 to 200 amino acids including the TEV domain.)
  • the immunoglobulin binding protein is one type in which at least one of the amino acid sequence represented by R and the amino acid sequence represented by R 2 in the general formula (3) is selected from lysine, arginine, and cysteine. And a domain t consisting of 1 to 50 amino acids including
  • the left end indicates the N-terminal and the right end indicates the C-terminal.
  • the immunoglobulin binding domain of the protein A is an A domain, a B domain, a C domain, a D domain, an E domain, and a Z domain. It can be at least one selected from In this case, the immunoglobulin binding domain of the protein A may be (D domain-A domain) n (n represents an integer of 1 or more).
  • the nucleic acid according to another embodiment of the present invention encodes the immunoglobulin binding protein or an equivalent functional variant thereof.
  • a gene expression system according to another embodiment of the present invention includes the nucleic acid.
  • protein refers to any molecule having a peptide structural unit, for example, a concept including a partial fragment of a natural protein or a variant obtained by artificially modifying the amino acid sequence of a natural protein.
  • the “immunoglobulin binding domain” represents a functional unit of a polypeptide having immunoglobulin binding activity alone, and the “immunoglobulin binding protein” has a specific affinity for immunoglobulin, and Represents a protein comprising an “immunoglobulin binding domain”.
  • TEV domain refers to a site cleaved by TEV (Tobacco Etch Virus) protease.
  • the immunoglobulin binding protein can function as a ligand in a carrier for capturing a target substance for affinity chromatography, for example, by being represented by the general formula (1) or the general formula (3). That is, by using the immunoglobulin binding protein as a ligand in the carrier, the amount immobilized on the carrier can be increased, and the immunoglobulin retaining ability of the carrier can be enhanced. Thereby, since the capture amount of the target substance can be increased, the binding capacity of the target substance can be increased.
  • FIG. 1 is a view showing the amino acid sequences of immunoglobulin binding proteins (SPAK, SPAC, SPAKK, SPATK) prepared in Synthesis Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing amino acid sequences of immunoglobulin binding proteins (SPA2K, SPA3K, SPA-His-C, SPA-His-N) prepared in Synthesis Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the structure of a DNA fragment encoding the immunoglobulin binding protein according to Synthesis Example 1 of the present invention, which is inserted into each of three types of expression vectors (pETM-11, pETM-10 and pET29). is there.
  • Immunoglobulin binding protein The immunoglobulin binding protein (hereinafter also referred to as “protein 1”) according to one embodiment of the present invention is represented by the following general formula (1).
  • RR 2 (1) (Wherein R represents an amino acid sequence consisting of 4 to 300 amino acids including a continuous site of 4 to 20 histidines, and R 2 represents 50 to 500 including at least one immunoglobulin binding domain of protein A) (Wherein the terminal where R 2 binds to R is the terminal of the immunoglobulin binding domain).
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R is preferably 8 to 100, and the number of histidines at sites where histidines contained in R are continuous is 4 to 8 It is preferable that In the general formula (1), the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R 2 is preferably 120 to 480.
  • R- is preferably a group represented by the following general formula (2).
  • R 1 represents an amino acid sequence consisting of 4 to 100 amino acids including a site in which 4 to 20 histidines are continuous (wherein, in R 1 , the end of the site in which the histidines are continuous is r and And r represents an arbitrary amino acid sequence consisting of 7 to 200 amino acids including the TEV domain.)
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R 1 is 4 to 25, the number of histidine site histidine continuous contained in R 1 is 4- The number is preferably 8.
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by r is preferably 10-50.
  • protein 2 An immunoglobulin binding protein (hereinafter also referred to as “protein 2”) according to another embodiment of the present invention is represented by the following general formula (3).
  • R 2 -R (3) (Wherein R represents an amino acid sequence consisting of 4 to 300 amino acids including a continuous site of 4 to 20 histidines, and R 2 represents 50 to 500 including at least one immunoglobulin binding domain of protein A) (Wherein the terminal where R 2 binds to R is the terminal of the immunoglobulin binding domain).
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R is preferably 8 to 100, and the number of histidines at sites where histidines contained in R are continuous is 4 to 8 It is preferable that In the general formula (1), the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R 2 is preferably 120 to 480.
  • -R is preferably a group represented by the following general formula (4).
  • R 1 represents an amino acid sequence consisting of 4 to 100 amino acids including 4 to 20 consecutive histidines (wherein, in R 1 , the end of the site where the histidine continues is bound to r) And r represents an arbitrary amino acid sequence consisting of 7 to 200 amino acids including the TEV domain.
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R 1 is preferably 4 to 25, and the number of histidines at sites where histidines contained in r are continuous is 4 to 8
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by r is preferably 10 to 50.
  • one amino acid at least one of the amino acid sequence represented by amino acid sequence and R 2 is represented by R is, selected lysine, arginine, and cysteine It preferably contains a domain t consisting of 1 to 50 amino acids including In this case, the same or different domain t may be contained in the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence represented by r may contain a TEV domain. Since the TEV domain is contained in the amino acid sequence represented by r, it is possible to separate R and R 2 by cleavage with TEV protease, and the TEV domain has the effect of the present invention (immobilization on a carrier). This is a preferable sequence for realizing a large amount and increasing the ability of the carrier to retain immunoglobulin).
  • a TEV domain mutant (mutant) (regardless of whether the mutant can be cleaved by TEV protease or not, it is 70% or more, preferably 90% Having the above-mentioned homology).
  • the total number of amino acids constituting the immunoglobulin binding protein according to this embodiment is usually 70 to 1000, and preferably 80 to 600 when used for binding to particles.
  • the immunoglobulin binding domain of protein A is preferably at least one selected from the A domain, B domain, C domain, D domain, E domain, and Z domain.
  • amino acid sequences of A domain, B domain, C domain, D domain, and E domain are, for example, Moks T, Abrahms L, et al., Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains, Eur J Biochem. 1986, 156, It is described in Fig. 1 of 637-643.
  • the document is included in the disclosure by this reference.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more (preferably 90% or more) homology with the amino acid sequence of each domain described in the above document should also be used as an immunoglobulin binding domain of protein A in the present invention. Can do.
  • the immunoglobulin binding protein according to this embodiment may have a plurality of the same or different types of immunoglobulin binding domains.
  • the immunoglobulin binding domain of protein A is (D domain-A domain) n (where n is an integer of 1 or more (preferably 1 to 6), and any number between D domain and A domain)
  • the amino acid sequence of A domain and D domain may be included.
  • the immunoglobulin A binding domain of protein A may be a natural immunoglobulin binding domain or a recombinant immunoglobulin binding domain.
  • the recombinant immunoglobulin binding domain can be treated as equivalent to the immunoglobulin binding domain before modification in immunoglobulin binding activity.
  • the amino acid of the immunoglobulin binding domain of natural protein A It is preferable to maintain a homology of 70% or more (preferably 90% or more) with the sequence.
  • Specific examples include the Z domain described in Nilson B. et al., Protein Engineering, 1987, Vol. 1, No. 2, pages 107-113, USA by Hober S et al. Examples include Z domain mutants having alkali resistance described in Patent Application 2006 / 0194955A1.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more (preferably 90% or more) homology with the amino acid sequence of each domain described in the above document should also be used as an immunoglobulin binding domain of protein A in the present invention. Can do.
  • the immunoglobulin binding protein according to this embodiment can be produced using a gene recombination technique described in US Pat. No. 5,151,350. That is, by transforming an expression vector containing a nucleic acid sequence encoding a target modified protein into a host such as E. coli and culturing the cell in an appropriate liquid medium, the cultured cell is transformed into the present embodiment.
  • Such immunoglobulin binding proteins can be obtained in large quantities and economically.
  • one immunoglobulin binding domain of protein A is a small protein consisting of about 60 amino acids
  • DNA encoding a desired amino acid sequence is divided into synthetic oligonucleotides consisting of several tens of bases. Then, they are ligated by a ligation reaction with DNA ligase and inserted into a plasmid, whereby a target expression vector can be obtained.
  • a target expression vector can be obtained.
  • it is a method generally performed by those skilled in the art to employ a nucleic acid sequence using an optimal codon of Escherichia coli.
  • the immunoglobulin binding protein according to the present embodiment may be a protein containing one or more immunoglobulin binding domains (preferably 2 to 12, more preferably 2 to 5).
  • a cDNA encoding such a protein can be easily prepared by linking a predetermined number of cDNAs (complementary DNAs) encoding one immunoglobulin binding domain in series. By inserting the cDNA thus prepared into an appropriate expression plasmid and using it, a protein containing one or more immunoglobulin binding domains can be easily produced.
  • a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 8 shown in Examples described later, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NOs: 1 to 8, and A protein having immunoglobulin binding activity can be suitably used as the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • a ligand for purifying a target protein by binding it to a carrier in affinity chromatography can be mentioned.
  • ligand refers to a protein that specifically and reversibly binds to a target protein in affinity chromatography.
  • the carrier using the immunoglobulin-binding protein according to the present embodiment as a ligand has a larger amount of immunoglobulin-binding protein compared to the conventional carrier in affinity chromatography, and has the ability to retain the protein.
  • the capture amount of the target protein can be increased, the binding capacity of the target protein (antibody) can be increased.
  • a high-purity target protein can be purified efficiently, at low cost and in large quantities.
  • nucleic acid encodes the immunoglobulin binding protein or an equivalent functional variant thereof.
  • “functional variant” of an immunoglobulin-binding protein is an immunoglobulin-binding protein that has been altered by partial amino acid addition, deletion, substitution, chemical modification of amino acid residues, or the like. And having at least 70%, preferably 90% or more homology with the amino acid sequence of the immunoglobulin binding protein before modification, and having the same immunoglobulin binding activity as that of the immunoglobulin binding protein before modification. It means something that can be handled.
  • a gene expression system according to another embodiment of the present invention includes a nucleic acid encoding the immunoglobulin binding protein or an equivalent functional variant thereof.
  • any known vector that can replicate in bacteria can be used.
  • Preferred expression vectors for example, a plasmid that is described in U.S. Patent No. 5,151,350, as described in, Molecular Cloning of Sambrook et al., Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3 rd edition, 2001) Plasmids.
  • Any method known in the art may be used to transform a bacterium by introducing a nucleic acid into the bacterium, for example, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, edited by Sambrook et al. 3 rd edition, 2001) can be utilized known methods described in the like. Methods for cultivating transformed bacteria and recovering the expressed protein are well known to those skilled in the art.
  • R and R 2 correspond to R and R 2 in the general formula (1) or the general formula (2) (R 1, R 2 and r are the general formula (2) or corresponds to R 1, R 2 and r in the general formula (4).), underlined in r indicates a TEV domain (TEV protease (peptide bond hydrolysis synthase) cleavage site), in R 2 The underlined portion indicates an interdomain linker or C-terminal linker (domain t), see Table 2.
  • TEV domain TEV protease (peptide bond hydrolysis synthase) cleavage site
  • DNA fragments encoding SPAK, SPAC, SPA2K, SPA3K, SPAKK, and SPATK were digested with restriction enzymes NcoI and HindIII (New-England Bio Bio Lab) to produce vector pETM-11. (See FIG. 3, obtained from kind giftof D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, yGermany).
  • the DNA fragment encoding SPA-His-N was digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and vector pETM-10 (see FIG. 3, kindkingift of D. Shibly, EMBL Heidelberg , Obtained from Heidelberg, Germany).
  • SPA-His-C which is an immunoglobulin binding protein having a histag (a peptide consisting of 6 histidine residues) at the C-terminus
  • the vector pET29 (see FIG. 3, see Novagen). Used).
  • the restriction enzymes used in this vector pET29 were NdeI (New-England Bio Bio Lab) and Xho I (New-England Bio Bio Lab).
  • All three types of expression vectors shown in FIG. 3 contain a kanamycin resistance gene as a selection marker.
  • Tev represents a TEV protease recognition site (amino acid sequence: ENLYFQG). TEV protease recognizes the amino acid sequence ENLYFQG and cleaves between Q and G.
  • the restriction enzyme was introduced by designing a pair of primers based on the SPAK insertion sequence. PCR amplification was performed using primers (SEQ ID NOs: 9 to 17) shown in Table 2.
  • the SPA-His-N DNA fragment can also be obtained directly by digesting a plasmid containing SPAK with a restriction enzyme (Table 1).
  • the SPA-His-N DNA fragment was obtained directly by digesting the plasmid containing SPAK with restriction enzymes (Table 1).
  • PCR amplification solution containing 0.5 ⁇ l of Straphylococcus aureus genomic DNA template (500 ng / ⁇ l), 5 pl of each primer, 5 ⁇ l of 10 ⁇ Pfu buffer (manufactured by Fermentas), and 1 ⁇ l of Pfu polymerase (manufactured by Fermentas) (5 units / ⁇ l) Sterile water was added to bring the final volume to 50 ⁇ l.
  • the conditions for PCR amplification are as follows: 94 ° C for 1 minute, then 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute 30 cycles, and finally 72 ° C for 10 minutes.
  • This PCR reaction was carried out with a PX2 Thermal Cycler PCR device (manufactured by Thermo-Electron Corporation).
  • Recombinant immunoglobulin binding protein is obtained from E. coli.
  • E. coli BL21 strain cells (manufactured by STRATAGENE)
  • 1 mM IPTG manufactured by Sigma-Aldrich
  • the cells Prior to induction, the cells were incubated at 37 ° C. until the absorbance (OD600) reached approximately 0.6. After protein expression, the cells were collected and disrupted in Tris buffer at pH 8.0.
  • the obtained recombinant immunoglobulin binding protein was purified by Ni affinity chromatography (Ni-NTA (nitrilotriacetic acid) particles, manufactured by Qiagen).
  • Ni-NTA nitrilotriacetic acid
  • the purified immunoglobulin binding protein was further purified in an HEPES buffer at pH 7.5 by anion exchange chromatography (Q-Sepharose FF, manufactured by GE Bioscience).
  • SPAK digested with TEV protease was passed through a Ni-NAT column (volume: 4 mL) in 50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, and 1 mM DTT buffer (pH 8.0) to cleave the his tag site of SPAK. Crude SPAKwoHis was recovered. This crude SPAKwoHis was dialyzed for 12 hours in 10 mM HEPES buffer (pH 7.5) to prepare SPAKwoHis for particle binding experiments.
  • the amino acid sequence of SPAKwoHis is as follows.
  • SPAKwohis total amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) GAMAKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEGSK
  • SPAKwoHis-bound porous particles SPAKwoHis-PB
  • SPAKwoHis-PB SPAKwoHis-bound porous particles
  • Immobilization example 3 380 mg of SPATK-bound porous particles (SPATK-PB) were obtained in the same manner as in Immobilization Example 1 except that SPATK was used instead of SPAK in Immobilization Example 1. The amount of SPATK bound to the particles was 36 mg / g particles.
  • Test example (measurement of binding amount of immunoglobulin G (IgG)) 4.2.1. Measurement example 1 SPAK-PB was packed in a column having an inner diameter of 0.5 cm and a height of 5 cm, and the binding capacity of human IgG antibody at a linear flow rate of 300 cm / hr was measured using AKTAprime plus manufactured by GE Healthcare Bioscience. Human IgG antibody (manufactured by Lampire Biological Laboratories) diluted to 1 mg / mL with 25 mM citrate buffer (pH 6.0) was used, and the elution tip concentration was 10 w / v% break on the absorbance monitor. The binding capacity was determined from the amount of human IgG antibody adsorbed and the volume of SPAK-PB at the time of through (breakthrough), and found to be 30 mg / mL.
  • IgG immunoglobulin G
  • Measurement example 2 The binding capacity of SPATK-PB human IgG antibody was determined in the same manner as in Measurement Example 1 except that SPATK-PB was used in place of SPAK-PB in Measurement Example 1. The result was 35 mg / mL. It was.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made.
  • the present invention also includes configurations that are substantially the same as the configurations described in the embodiments (for example, configurations that have the same functions, methods, and results, or configurations that have the same purposes and results).
  • the invention includes a configuration in which a non-essential part of the configuration described in the embodiment is replaced.
  • the present invention includes a configuration that achieves the same effect as the configuration described in the embodiment or a configuration that can achieve the same object.
  • the invention includes a configuration in which a known technique is added to the configuration described in the embodiment.

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Abstract

イムノグロブリン結合タンパク質は下記一般式（１）または（３）で表される。 Ｒ－Ｒ２・・・・・（１） （式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。） Ｒ２－Ｒ・・・・・（３） （式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）

Description

イムノグロブリン結合タンパク質
　本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質に関する。
　近年、医学、薬学、生物学などの分野において、純度が高いタンパク質試薬が求められている。また、抗体医薬などバイオ医薬の開発の活況に伴い、純度が高いタンパク質を効率良く、低コストでかつ大量に得る方法が求められている。
　純度の高いタンパク質を製造する方法の一つとして、アフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。アフィニティクロマトグラフィーでは、目的タンパク質に特異的かつ可逆的な親和性を示す分子をリガンドとして結合させた目的物質捕捉用担体に目的タンパク質を吸着させることにより、目的タンパク質を夾雑物から分離させる。その際のリガンドとしてタンパク質が用いられることが多い。リガンドとして用いられるタンパク質としては、例えばプロテインＡが挙げられる。
　プロテインＡは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のタンパク質であり、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメインと呼ばれる相同性を有する５つのイムノグロブリン結合ドメインの繰り返し構造を有する。
　プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、１個のドメインのみでイムノグロブリンに結合することが知られている（ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング(Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ)、１９８７年、第１巻、２号、１０７－１１３頁）。プロテインＡについては、例えば、生産しやすくするために、またアミノ酸配列の改変ができるようにするために、遺伝子組み換えが試みられている（米国特許第５１５１３５０号明細書）。天然型のプロテインＡだけでなく、アミノ酸配列が部分的に改変されたイムノグロブリン結合ドメインを含む組換え型のプロテインＡも、アフィニティクロマトグラフィー用のリガンドとして広く利用されている。
　上述したように、近年、純度の高いタンパク質を効率良く、低コストでかつ大量に精製することが求められている。
　本発明は、例えばアフィニティクロマトグラフィー用の目的物質捕捉用担体におけるリガンドとして機能することにより、当該担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めることができるイムノグロブリン結合タンパク質を提供する。
　本発明の一態様にかかるイムノグロブリン結合タンパク質は、下記一般式（１）で表される。
　Ｒ－Ｒ２　・・・・・（１）
　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
　上記イムノグロブリン結合タンパク質は、上記一般式（１）において、Ｒ－は下記一般式（２）で表される基であることができる。
　Ｒ１－ｒ－　・・・・・（２）
　（式中、Ｒ１は４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
　また、上記イムノグロブリン結合タンパク質は、上記一般式（１）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１～５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むものであることができる。
　本発明の他の一態様にかかるイムノグロブリン結合タンパク質は、下記一般式（３）で表される。
　Ｒ２－Ｒ　・・・・・（３）
　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
　上記イムノグロブリン結合タンパク質は、上記一般式（３）において、－Ｒは下記一般式（４）で表される基であることができる。
　－ｒ－Ｒ１　・・・・・（４）
　（式中、Ｒ１は４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
　また、上記イムノグロブリン結合タンパク質は、上記一般式（３）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１～５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むものであることができる。
　なお、上記一般式（１）および一般式（３）において、左端がＮ末端を示し、右端がＣ末端を示すものとする。
　上記一般式（１）および一般式（３）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質において、前記プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、およびＺドメインから選ばれる少なくとも１種であることができる。この場合、前記プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、（Ｄドメイン－Ａドメイン）ｎ（ｎは１以上の整数を示す。）であることができる。
　本発明の他の一態様にかかる核酸は、上記イムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする。
　本発明の他の一態様にかかる遺伝子発現系は、上記核酸を含む。
　本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。また、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位を表し、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、かつ、「イムノグロブリン結合ドメイン」を含むタンパク質を表す。
　また、本発明において、「ＴＥＶドメイン」とは、ＴＥＶ（Tobacco Etch Virus）プロテアーゼによる切断部位をいう。
　上記イムノグロブリン結合タンパク質は、上記一般式（１）または上記一般式（３）で表されることにより、例えばアフィニティクロマトグラフィー用の目的物質捕捉用担体におけるリガンドとして機能することができる。すなわち、上記イムノグロブリン結合タンパク質を当該担体におけるリガンドとして使用することにより、当該担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めることができる。これにより、目的物質の捕捉量を高めることができるため、目的物質の結合容量を高めることができる。
図１は、本発明の合成例１で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＫ、ＳＰＡＣ、ＳＰＡＫＫ、ＳＰＡＴＫ）のアミノ酸配列を示す図である。 図２は、本発明の合成例１で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡ２Ｋ、ＳＰＡ３Ｋ、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－Ｃ、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－Ｎ）のアミノ酸配列を示す図である。 図３は、３種類の発現ベクター（ｐＥＴＭ－１１、ｐＥＴＭ－１０およびｐＥＴ２９）にそれぞれ挿入された、本発明の合成例１に係るイムノグロブリン結合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントの構成を説明する図である。
　以下、本発明の一実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質、核酸、および遺伝子発現系について具体的に説明する。
　１．イムノグロブリン結合タンパク質
　本発明の一実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質１」ともいう。）は、下記一般式（１）で表される。
　Ｒ－Ｒ２　・・・・・（１）
　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
　上記一般式（１）において、Ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は８～１００個であることが好ましく、Ｒに含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４～８個であることが好ましい。また、上記一般式（１）において、Ｒ２で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１２０～４８０個であることが好ましい。
　また、上記一般式（１）において、Ｒ－は下記一般式（２）で表される基であることが好ましい。
　Ｒ１－ｒ－　・・・・・（２）
　（式中、Ｒ１は４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
　上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は４～２５個であることが好ましく、Ｒ１に含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４～８個であることが好ましく、ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１０～５０個であることが好ましい。
　本発明の他の一実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質２」ともいう。）は、下記一般式（３）で表される。
　Ｒ２－Ｒ　・・・・・（３）
　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
　上記一般式（３）において、Ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は８～１００個であることが好ましく、Ｒに含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４～８個であることが好ましい。また、上記一般式（１）において、Ｒ２で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１２０～４８０個であることが好ましい。
　また、上記一般式（３）において、－Ｒは下記一般式（４）で表される基であることが好ましい。
　－ｒ－Ｒ１　・・・・・（４）
　（式中、Ｒ１は４～２０個の連続したヒスチジンを含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
　上記一般式（４）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は４～２５個であることが好ましく、ｒに含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４～８個であることが好ましく、ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１０～５０個であることが好ましい。
　上記一般式（１）および上記一般式（３）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１～５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことが好ましい。この場合、上記アミノ酸配列中に同一または異なるドメインｔが複数含まれていてもよい。
　また、上記一般式（２）および上記一般式（４）に示されるように、ｒで表されるアミノ酸配列中にＴＥＶドメインが含まれていてもよい。ｒで表されるアミノ酸配列中にＴＥＶドメインが含まれていることにより、ＴＥＶプロテアーゼによる切断によってＲとＲ２との分離が可能になるうえ、ＴＥＶドメインは、本発明の効果（担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めること）を実現するために好ましい配列である。また、ｒで表されるアミノ酸配列中に、ＴＥＶドメインの変異体（Mutant）（該変異体は、ＴＥＶプロテアーゼで切断できるか否かと関係なくＴＥＶドメインのアミノ配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する。）が含まれていてもよい。
　本実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質を構成するアミノ酸の総個数は通常７０～１０００であり、粒子に結合させる用途に使用する場合、８０～６００であるのが好ましい。
　１．１．イムノグロブリン結合ドメイン
　プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、およびＺドメインから選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
　Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインのアミノ酸配列は例えば、Moks T, Abrahms L, et al.,Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains, Eur J Biochem. 1986, 156, 637-643のFig.1に記載されている。該文献はこの参照により開示に含まれる。また、上記文献に記載された各ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発明におけるプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとして使用することができる。
　本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質は、複数の同一または異なる種類のイムノグロブリン結合ドメインを有していてもよい。例えば、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、（Ｄドメイン－Ａドメイン）ｎ（ここで、ｎは１以上の整数（好ましくは１～６）を示し、ＤドメインとＡドメインとの間には任意のアミノ酸配列が存在していてもよい。）、すなわち、ＡドメインおよびＤドメインを含む繰り返し単位を含むものであってもよい。
　また、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、天然型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよいし、または、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよい。ここで、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合ドメインと同等のものとして扱うことができ、例えば、天然型のプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を保持することが好ましい。具体例としては、ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１９８７年、第１巻、２号、１０７－１１３頁に記載されているＺドメイン、Hober Sらによる米国特許出願２００６／０１９４９５５Ａ１に記載されているアルカリ耐性を有するＺドメインの変異体(mutant)が挙げられる。上記文献はこの参照により開示に含まれる。また、上記文献に記載された各ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発明におけるプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとして使用することができる。
　１．２．製造
　本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質を製造するための標準技術としては、例えば、Frederick M. AusbelらによるCurrent Protocols In Molecular BiologyやSambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。例えば、本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質は、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。すなわち、目的の改変タンパク質をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、当該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質を大量かつ経済的に取得することができる。
　具体的には、プロテインＡの１個のイムノグロブリン結合ドメインは約６０個のアミノ酸からなる小さなタンパク質であるため、例えば、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを数十塩基からなる合成オリゴヌクレオチドに分割して合成し、それらをＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応によって繋げてプラスミドに挿入することにより、目的の発現ベクターを取得することができる。その際に、当該タンパク質を大腸菌で効率良く発現させる目的で、大腸菌の至適コドンを用いた核酸配列を採用することは、当業者によって一般的に行われる方法である。また、後述する本発明の実施例に示されるようにStraphylococcus aureusのゲノムＤＮＡからＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）技術を用いて所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を構築することが可能である。
　また、上述したように、本実施形態にかかるイムノグロブリン結合タンパク質は、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上（好ましくは２～１２個、より好ましくは２～５個）を含むタンパク質であってもよい。この様なタンパク質をコードするｃＤＮＡは、１個のイムノグロブリン結合ドメインをコードするｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を所定の個数、直列に連結することにより、容易に作成することができる。こうして作成したｃＤＮＡを適切な発現プラスミドに挿入して利用することにより、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上含むタンパク質を容易に製造することができる。
　例えば、後述する実施例において示される配列番号１～８のアミノ酸配列を有するタンパク質や、配列番号１～８において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合活性を有するタンパク質は、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質として好適に使用することができる。
　１．３．用途
　本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質の用途の一例としては、例えば、アフィニティクロマトグラフィーにおいて、目的タンパク質を担体に結合させて精製するためのリガンドが挙げられる。本発明において、「リガンド」とは、アフィニティクロマトグラフィーにおいて、目的タンパク質に特異的にかつ可逆的に結合するタンパク質をいう。ここで、本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとして用いた担体は、アフィニティクロマトグラフィーにおいて、従来の担体と比較してイムノグロブリン結合タンパク質の保持量が多く、かつ、当該タンパク質の保持能に優れている。これにより、目的タンパク質の捕捉量を高めることができるため、目的タンパク質（抗体）の結合容量を増大させることができる。その結果、純度の高い目的タンパク質を効率良く、低コストでかつ大量に精製することができる。
　２．核酸
　本発明の他の一実施形態にかかる核酸は、上記イムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする。
　本発明において、イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（functional variant）」とは、部分的なアミノ酸の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を保持し、かつ、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。
　３．遺伝子発現系
　本発明の他の一実施形態にかかる遺伝子発現系は、上記イムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする核酸を含む。本実施形態にかかる遺伝子発現系として、例えば、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができる。好ましい発現ベクターとしては、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、細菌中に核酸を導入することにより細菌を形質転換させるためには、当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。
　４．実施例
　以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例および比較例中の「％」および「部」は特記しない限り、それぞれ質量％および質量部であることを示している。
　４．１．実験例
　４．１．１．合成例１（イムノグロブリン結合タンパク質の調製）
　後述する調製例１～４により、図１および図２に示されるアミノ酸配列を有するイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＫ（配列番号１）、ＳＰＡＣ（配列番号２）、ＳＰＡＫＫ（配列番号３）、ＳＰＡＴＫ（配列番号４）、ＳＰＡ２Ｋ（配列番号５）、ＳＰＡ３Ｋ（配列番号６）、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－Ｃ（配列番号７）、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－Ｎ（配列番号８））を調製した。
　なお、図１および図２において、ＲおよびＲ２は上記一般式（１）または上記一般式（２）におけるＲおよびＲ２に対応し（Ｒ１、Ｒ２およびｒは上記一般式（２）または上記一般式（４）におけるＲ１、Ｒ２およびｒに対応する。）、ｒ中の下線部はＴＥＶドメイン（ＴＥＶプロテアーゼ（ペプチド結合加水分解合成酵素）切断部位）を示し、Ｒ２中の下線部はインタードメインリンカーまたはＣ末端リンカー（ドメインｔ）、表２参照）を示す。
　これらのタンパク質は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦマススペクトル分析により、それぞれアミノ酸配列が一致したことにより、図１および図２に示すアミノ酸配列を有することが確認された。
　４．１．１．１．調製例１（ＰＣＲ増幅および制限酵素の消化）
　Straphylococcus aureus（ＡＴＣＣ，　１０８３２）由来のプロテインＡ（Ｄドメイン＋Ａドメイン）のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。プライマー（表２参照）は、後述するサブクローニングを補助するために対応する制限酵素部位を有するように設計された。
　表１に示されるように、ＳＰＡＫ、ＳＰＡＣ、ＳＰＡ２Ｋ、ＳＰＡ３Ｋ、ＳＰＡＫＫ、およびＳＰＡＴＫをそれぞれコードするＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（New-England Bio Lab製）によって消化されて、ベクターｐＥＴＭ－１１（図３参照、kind gift of D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germanyから入手）に挿入された。
　また、表１に示されるように、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－ＮをコードするＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化されて、ベクターｐＥＴＭ－１０（図３参照、kind gift of D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germanyから入手）に挿入された。
　さらに、表１に示されるように、Ｃ末端にヒスタグ（ヒスチジン６残基からなるペプチド）を有するイムノグロブリン結合タンパク質であるＳＰＡ－Ｈｉｓ－Ｃを形成するために、ベクターｐＥＴ２９（図３参照、Novagen社製）が用いられた。このベクターｐＥＴ２９に用いられる制限酵素はＮｄｅＩ（New-England Bio Lab製）およびＸｈｏＩ（New-England Bio Lab製）であった。
　なお、図３に示される３種類の発現ベクターはすべて、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含む。
　また、図３に示されるイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列において、「Ｔｅｖ」はＴＥＶプロテアーゼ認識部位（アミノ酸配列：ＥＮＬＹＦＱＧ）を示す。ＴＥＶプロテアーゼはアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧを認識し、ＱとＧの間を切断する。
　上記制限酵素は、ＳＰＡＫの挿入配列に基づく１対のプライマーを設計することにより導入された。また、ＰＣＲ増幅は、表２に示されるプライマー（配列番号９～１７）を用いて行われた。
　なお、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－ＮのＤＮＡフラグメントは、ＳＰＡＫを含むプラスミドを制限酵素（表１）で消化することにより直接得ることもできる。本実施例では、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－ＮのＤＮＡフラグメントは、ＳＰＡＫを含むプラスミドを制限酵素（表１）で消化することにより直接得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Straphylococcus aureusのgenomic ＤＮＡテンプレート（５００ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、各プライマー５ｐｌ、１０×Ｐｆｕ緩衝液（Fermentas製）５μｌ、およびＰｆｕポリメラーゼ（Fermentas製）（５ユニット／μｌ）１μｌを含むＰＣＲ増幅溶液に滅菌水を加えて、最終的な液の体積を５０μｌとした。ＰＣＲ増幅の条件は以下の通りである：９４℃で１分、次に９４℃で３０秒、５６℃で１分、７２℃で１分の３０サイクル、最後に７２℃で１０分。このＰＣＲ反応をＰＸ２　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＰＣＲ装置（Thermo Electron Corporation製）にて行った。
　４．１．１．２．調製例２（ライゲーションおよび形質転換）
　制限酵素で消化されたＤＮＡフラグメントのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolab製）１００－２００ユニット／ｍｌおよび５×リガーゼ緩衝液（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolab）社製）を用いて１２℃で１２－１６時間行われた。プラスミドの形質転換のために、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５－α株細胞（New England Biolab製）を使用した。
　４．１．１．３．調製例３（プラスミドＤＮＡの調製および配列解析）
　陽性コロニーを選択し、ミニプレップキット（Mini Prep Kit）（キアゲン（Qiagen）社製）によってプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡについて、挿入されたＤＮＡフラグメントが正しい配列であるかどうかを確認するために、3730 NDA Sequencer（Applied Biosystems製）で配列解析を行った。
　４．１．１．４．調製例４（イムノグロブリン結合タンパク質の発現および精製）
　組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞（STRATAGENE製）内にて１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した。
　得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質は、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ－ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）粒子、キアゲン社製）によって精製された。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ－セファロースＦＦ、ＧＥバイオサイエンス社製）によって、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液中でさらに精製された。
　４．１．２．合成例２（イムノグロブリン結合タンパク質の粒子への固定化）
　４．１．２．１．固定化例１
　グリシジルメタクリレート・トリメチロールプロパントリメタクリレート共重合体からなる多孔質粒子（以下、ＰＢと記す。）を懸濁重合により作製した。ＰＢの平均粒径は３３μｍ、比表面積は８３ｍ２／ｇであった。４００ｍｇのＰＢ、３６ｍｇのＳＰＡＫが１６ｍＬのホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）に分散した混合液を調製し、４℃で２４時間転倒混和し、ＳＰＡＫをＰＢに結合させた。次いで、１０％メルカプトエタノール水溶液０．８ｍＬを添加して４℃で６時間転倒混和し、残余のエポキシ基をブロッキングし、２０％エタノール水溶液で洗浄して、３８０ｍｇのＳＰＡＫ結合多孔質粒子（ＳＰＡＫ－ＰＢ）を得た。Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔで定量測定を行ったところ、前記粒子に結合したＳＰＡＫの量は２９ｍｇ／ｇ粒子であった。
　４．１．２．２．固定化例２
　５０ｍＭ トリス塩酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴのバーファー（ｐＨ８．０）中、ＴＥＶプロテアーゼで消化されたＳＰＡＫをＮｉ－ＮＡＴカラム（容量：４ｍＬ）に通過させて、ＳＰＡＫのヒスタグ部位が切断された粗ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを回収した。この粗ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバーファー（ｐＨ７．５）中で１２時間透析して、粒子への結合実験用ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを調製した。ＳＰＡＫｗｏＨｉｓのアミノ酸配列は以下の通りである。
ＳＰＡＫｗｏｈｉｓ（全アミノ酸配列）（配列番号１８）
GAMAKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEGSK
　次に、上記固定化例１で、ＳＰＡＫの代わりにＳＰＡＫｗｏＨｉｓを使用した以外は、上記固定化例１と同様にして、３８０ｍｇのＳＰＡＫｗｏＨｉｓ結合多孔質粒子（ＳＰＡＫｗｏＨｉｓ－ＰＢ）を得た。前記粒子に結合したＳＰＡＫｗｏＨｉｓの量は６ｍｇ／ｇ粒子であった。
　４．１．２．３．固定化例３
　上記固定化例１で、ＳＰＡＫの代わりにＳＰＡＴＫを使用した以外は、上記固定化例１と同様にして、３８０ｍｇのＳＰＡＴＫ結合多孔質粒子（ＳＰＡＴＫ－ＰＢ）を得た。前記粒子に結合したＳＰＡＴＫの量は３６ｍｇ／ｇ粒子であった。
　４．２．試験例（イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）結合量の測定）
　４．２．１．測定例１
　ＳＰＡＫ－ＰＢを内径０．５ｃｍ、高さ５ｃｍのカラムに充填し、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるヒトＩｇＧ抗体の結合容量を測定した。ヒトＩｇＧ抗体（ランパイアバイオロジカルラボラトリーズ（Ｌａｍｐｉｒｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）は２５ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈したものを使用し、吸光度モニターで溶出先端濃度１０ｗ／ｖ％ブレークスルー（破過）のときのヒトＩｇＧ抗体吸着量およびＳＰＡＫ－ＰＢ体積から結合容量を求めたところ、３０ｍｇ／ｍＬであった。
　４．２．２．測定例２
　上記測定例１で、ＳＰＡＫ－ＰＢの代わりにＳＰＡＴＫ－ＰＢを使用した以外は、上記測定例１と同様にして、ＳＰＡＴＫ－ＰＢのヒトＩｇＧ抗体の結合容量を求めたところ、３５ｍｇ／ｍＬであった。
　４．２．３．測定例３
　上記測定例１で、ＳＰＡＫ－ＰＢの代わりにＳＰＡＫｗｏＨｉｓ－ＰＢを使用した以外は、上記測定例１と同様にして、ＳＰＡＫｗｏＨｉｓ－ＰＢのヒトＩｇＧ抗体の結合容量を求めたところ、６ｍｇ／ｍＬであった。
　本実施形態に係る説明は以上である。本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらなる種々の変形が可能である。また本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

Claims (10)

  1. 　下記一般式（１）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質。
    　Ｒ－Ｒ２　・・・・・（１）
    　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
  2. 　上記一般式（１）において、Ｒ－は下記一般式（２）で表される基である、請求項１に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
    　Ｒ１－ｒ－　・・・・・（２）
    　（式中、Ｒ１は４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
  3. 　上記一般式（１）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１～５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むものである、請求項１または２に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  4. 　下記一般式（３）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質。
    　Ｒ２－Ｒ　・・・・・（３）
    　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
  5. 　上記一般式（３）において、－Ｒは下記一般式（４）で表される基である、請求項４に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
    　－ｒ－Ｒ１　・・・・・（４）
    　（式中、Ｒ１は４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
  6. 　上記一般式（３）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１～５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むものである、請求項４または５に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  7. 　前記プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、およびＺドメインから選ばれる少なくとも１種である、請求項１～６のいずれか１項に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  8. 　前記プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、（Ｄドメイン－Ａドメイン）ｎ（ｎは１以上の整数を示す。）である、請求項７に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のイムノグロブリン結合タンパク質またはその等機能変異体をコードする核酸。
  10. 　請求項９に記載の核酸を含む遺伝子発現系。
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