JP6805831B2 - 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質、およびそれを用いたアフィニティ分離剤、液体クロマトグラフィー用カラム - Google Patents

Description

本発明は、免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質、および該タンパク質を免疫グロブリン結合性アフィニティリガンドとするアフィニティ分離剤、さらには液体クロマトグラフィー用カラムに関するものである。

抗体は、抗原と呼ばれる物質に特異的に結合する機能、および、他の生体分子や細胞と協同して抗原性を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。抗体という名は、このような抗原に結合するという機能を重視した名前であり、物質としては「免疫グロブリン」と呼ばれる。

近年、遺伝子工学、タンパク質工学、および、細胞工学の発展に伴い、抗体医薬と呼ばれる、抗体の有する機能を利用した医薬品の開発が盛んに行われている。抗体医薬は、従来の医薬と比べて、標的分子に対してより特異的に働くために、副作用をより軽減させ、かつ、高い治療効果が得られることが期待されており、実際に様々な病態の改善に寄与している。

一方、抗体医薬は、生体に大量に投与されることから、他の組換えタンパク質医薬品と比べた場合に、その純度が品質に与える影響は大きいと言われている。よって、純度の高い抗体を製造するために、抗体に対して特異的に結合する分子をリガンドとする吸着材料を利用する、アフィニティクロマトグラフィー等の手法が一般的に用いられている。

抗体医薬として開発されているのは、基本的にモノクローナルＩｇＧ抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産され、ＩｇＧ抗体にアフィニティを有するタンパク質を利用して精製されている。

ＩｇＧ抗体にアフィニティを有する免疫グロブリン結合性タンパク質として、プロテインＡがよく知られている。プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合性ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（非特許文献１）。抗体医薬製造工程における初期精製工程（キャプチャー工程）には、プロテインＡがリガンドとして水不溶性担体に固定化された、アフィニティクロマトグラフィー用カラムが一般的に利用されている。

このアフィニティクロマトグラフィー用カラムの性能を改良するために、近年、リガンドであるプロテインＡに関する種々の開発がなされ、タンパク質工学的に改変を加えた組換えプロテインＡを用いることが試みられている。

たとえば、組換えプロテインＡとしては、免疫グロブリン結合活性がないＸＭ領域を除去したプロテインＡ（ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）や、特許文献１に開示されるＢドメインに変異を導入した改変ドメインであるＺドメインを有するプロテインＡなどが知られている。

Ｚドメインは、Ｂドメインに対して２９位のグリシンをアラニンに置換する変異を導入した改変ドメインであり、Ｂドメインよりもアルカリ耐性が高いことが知られている。このようにリガンド機能向上のために、アルカリ耐性を高めた組換えプロテインＡや抗体の弱酸性溶出を可能にする組換えプロテインＡが開発されている。

特許文献２には、アルカリ耐性を高めるために、プロテインＡのＣ、Ｂ、ＺドメインのＮ末端３〜５つの連続したアミノ酸欠失を含むアフィニティークロマトグラフィーリガンドが開示されている。

特許文献３には、アルカリ安定性を高めるために、プロテインＡのドメインＣユニットの３位〜６位のＡｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎが欠失した配列を有するアフィニティークロマトグラフィーリガンドが開示されている。

特許文献４には、アルカリ耐性を高めるために、プロテインＡのＢ、Ｚドメインの３位と６位のアスパラギンを他のアミノ酸に置換した免疫グロブリン結合タンパク質が開示されている。
特許文献５には、弱酸性で抗体の脱離を可能にするために、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃドメインにおいてリジンおよびシステイン残基を含まない配列とした抗体認識結合タンパク質が開示されている。

米国特許第５１４３８４４号明細書 日本国特開２０１２−２５４９８１号公報 日本国特表２０１０−５０４７５４号公報 日本国特表２００５−５３８６９３号公報 日本国特開２０１３−２５６４８４号公報

Ｈｏｂｅｒ Ｓ．ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．，２００７，Ｖｏｌ．８４８，ｐ．４０−４７

本発明者らの検討により、組換えプロテインＡを製造する際に用いる宿主微生物が産生するプロテアーゼや、組換え培養細胞で生産されたＩｇＧ抗体を精製する場合の培養細胞が産生するプロテアーゼの作用により、リガンドであるプロテインＡが切断されて免疫グロブリン結合活性を大幅に低下するという問題があることを初めて見出した。

特に、組換えプロテインＡを培養液から精製する工程においてｐＨを高くしてイオン交換樹脂に吸着あるいは通液する際、また、精製前あるいは精製後に濃縮や脱塩などの工程を行う際、さらに、組換えプロテインＡを固定化した分離剤により免疫グロブリンを含む培養液から免疫グロブリンを精製する工程を行う際に、プロテアーゼによる切断が顕著に問題となることが明らかになった。

上記プロテアーゼの一つにセリンプロテアーゼがある。特許文献１〜４に開示される組換えプロテインＡでは、セリンプロテアーゼ耐性がなく、アフィニティクロマトグラフィー用カラムのリガンドとして用いることに問題がある。

また、本発明者らの検討に拠れば、特許文献５に開示されるリジン及びシステインを含まない組換えプロテインＡは、免疫グロブリン結合活性が十分でなく、特に多量体化したときには野生型に比べて免疫グロブリン結合活性が低く、そもそもアフィニティクロマトグラフィー用カラムのリガンドとしての機能を十分に果たすことができないという課題があることが新たに見出された。

また、上記問題を生じさせる他のプロテアーゼとしてはサーモリシンがある。サーモリシンは、バチルス属細菌由来の金属プロテアーゼであり、比較的温度の高い環境やｐＨの高い環境で活性が高くなる。特許文献１、３〜５に開示される組換えプロテインＡでは、サーモリシン耐性がないためインタクトな形でタンパク質を回収することができず、アフィニティクロマトグラフィー用カラムのリガンドとして用いることに問題がある。

また、本発明者らの検討に拠れば、特許文献２に開示される組換えプロテインＡはサーモリシン耐性があるものを含むが、免疫グロブリン結合活性が低下してしまい、そもそもアフィニティクロマトグラフィー用カラムのリガンドとしての機能を十分に果たすことができないという課題があることが新たに見出された。

そこで、本発明の課題は、プロテアーゼに耐性を有し、十分な免疫グロブリン結合活性を有する、アフィニティリガンドとして好適に用いることができるタンパク質を提供することにある。

特に、本発明の第１の課題は、プロテアーゼの中でも、特にセリンプロテアーゼに耐性を有し、十分な免疫グロブリン結合活性を有する、アフィニティリガンドとして好適に用いることができるタンパク質を提供することにある。

また、本発明の第２の課題は、プロテアーゼの中でも、特にサーモリシンに耐性を有し、十分な免疫グロブリン結合活性を有する、アフィニティリガンドとして好適に用いることができるタンパク質を提供することにある。

本発明者らは、上記第１の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、プロテインＡの特定のドメインのアミノ酸配列において、ドメインとドメインとを連結する領域にリジンを含まない場合にセリンプロテアーゼ耐性が向上することを見出し、本発明を完成させた。

また、本発明者らは、上記第２の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、プロテインＡの特定のドメインのアミノ酸配列において、ドメインとドメインとを連結する領域に疎水性アミノ酸を含まない場合にサーモリシン耐性が向上することを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、上記課題は以下の構成により達成される。
［１］配列番号１〜３に記載のプロテインＡのＥ、ＤおよびＡドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのアミノ酸配列において、１以上のリジンを含み、Ｃ末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
［２］−（１）配列番号４〜６に記載のプロテインＡのＢ、ＣおよびＺドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのアミノ酸配列において、１以上のリジンを含み、４位のリジンおよびＣ末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
［２］−（２）配列番号４〜６に記載のプロテインＡのＢ、ＣおよびＺドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのアミノ酸配列において、１以上のリジンを含み、各ドメインのＣ末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を連結箇所配列（第１連結エレメント）とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列（第１連結エレメント）のＣ末端のリジンおよび４位のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
［３］前記欠失または置換されている４位のリジンおよびＣ末端のリジンのうち、該４位のリジンおよび／または該Ｃ末端のリジンが欠失している、［１］または［２］に記載のタンパク質。
［４］各ドメインのＣ末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を連結箇所配列（第１連結エレメント）とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列（第１連結エレメント）は１以上のアミノ酸からなる、［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質。
［５］前記欠失または置換されている４位のリジンおよびＣ末端のリジンのうち、該４位のリジンおよび／または該Ｃ末端のリジンを親水性アミノ酸で置換したものである、［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質。
［６］ドメインを３つ以上有する、［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質。
［７］各ドメインのＣ末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を連結箇所配列（第１連結エレメント）とした場合、すべての連結箇所配列（第１連結エレメント）において、リジンが欠失または置換されている、［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質。
［８］前記タンパク質に含まれるドメインのすべてが、配列番号１〜６に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＺドメインのアミノ酸配列のいずれか１種類に由来する、［１］〜［７］のいずれかに記載のタンパク質。
［９］各ドメインのＣ末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を連結箇所配列（第１連結エレメント）とした場合、該連結箇所配列（第１連結エレメント）はリジンを含まないものである、［１］〜［８］のいずれかに記載のタンパク質。
［１０］各ドメインのＣ末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を連結箇所配列（第１連結エレメント）とした場合、該連結箇所配列（第１連結エレメント）はアルギニンを含まないものである、［１］〜［９］のいずれかに記載のタンパク質。
［１１］［１］〜［１０］のいずれかに記載のタンパク質をアフィニティリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティ分離剤。
［１２］［１１］に記載のアフィニティ分離剤を含み、少なくとも一つの容器を備えることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用カラム。

［１３］配列番号３〜６に記載のプロテインＡのＡ、Ｂ、ＣおよびＺドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有するタンパク質であって、各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を連結エレメント（第２連結エレメント）とした場合、少なくとも一つの連結エレメント（第２連結エレメント）は、１以上のアミノ酸からなり、かつ、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸により構成される変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）であることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
［１４］前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）が、Ａ、Ｂ、またはＣドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、１位のアラニンおよび／または５位のフェニルアラニンを欠失したものである［１３］に記載のタンパク質。
［１５］前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）が、Ｚドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、１位のバリンおよび／または５位のフェニルアラニンを欠失したものである［１３］に記載のタンパク質。
［１６］前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）が、Ａ、Ｂ、またはＣドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、１位のアラニンおよび／または５位のフェニルアラニンを疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換したものである［１３］または［１４］に記載のタンパク質。
［１７］前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）が、Ｚドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、１位のバリンおよび／または５位のフェニルアラニンを疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換したものである［１３］または［１５］に記載のタンパク質。
［１８］前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）で置換する疎水性アミノ酸以外のアミノ酸が、親水性アミノ酸である［１６］または［１７］に記載のタンパク質。
［１９］前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）が２以上のアミノ酸からなる［１３］〜［１８］のいずれかに記載のタンパク質。
［２０］ドメインを３つ以上有する［１３］〜［１９］のいずれか１項に記載のタンパク質。
［２１］すべての連結エレメント（第２連結エレメント）が変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）である［１３］〜［２０］のいずれかに記載のタンパク質。
［２２］前記タンパク質に含まれるドメインのすべてが、配列番号３〜６に記載のプロテインＡのＡ、Ｂ、ＣおよびＺドメインのアミノ酸配列のいずれか１種類に由来する［１３］〜［２１］のいずれかに記載のタンパク質。
［２３］少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列におけるＣ末端のリジンを欠失または置換したものである［１３］〜［２２］のいずれかに記載のタンパク質。
［２４］Ｃ末端側に前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）を結合するドメインにおいて、該ドメインのアミノ酸配列におけるＣ末端のリジンを欠失または置換したものである［２３］に記載のタンパク質。
［２５］前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）はリジンを含まないものである［１３］〜［２４］のいずれかに記載のタンパク質。
［２６］前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）はアルギニンを含まないものである［１３］〜［２５］のいずれかに記載のタンパク質。
［２７］［１３］〜［２６］のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを用いて、ブレビバチルス属細菌を形質転換し、培養を行うことによってタンパク質を製造する、［１３］〜［２６］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［２８］［１３］〜［２６］のいずれかに記載のタンパク質をアフィニティリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティ分離剤。
［２９］［２８］に記載のアフィニティ分離剤を含み、少なくとも１つの該アフィニティ分離剤が充填される容器を備えることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用カラム。

本発明の実施形態により、特定のプロテアーゼに耐性を有し、十分な免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質を提供することができる。このような本発明のタンパク質を用いることにより、免疫グロブリン結合活性に優れたアフィニティリガンドや耐久性に優れたアフィニティ分離剤を製造することができる。

特に、本発明の第１の実施形態により、プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼに耐性を有し、十分な免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質を提供することができる。このような本発明のタンパク質を用いることにより、免疫グロブリン結合活性に優れたアフィニティリガンドや耐久性に優れたアフィニティ分離剤を製造することができる。

また、本発明の第２の実施形態により、プロテアーゼ、特にサーモリシンに耐性を有し、免疫グロブリンとの結合能力を有するタンパク質を提供することができる。このような本発明のタンパク質を用いることにより、免疫グロブリンとの結合能力に優れたアフィニティリガンドや耐久性に優れたアフィニティ分離剤を製造することができる。

図１は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのアミノ酸配列比較表である。なお、「−（ハイフン）」はＣドメインのアミノ酸残基と同じであることを示し、「／（斜線）」はアミノ酸欠失を示す。 図２は、４量体のタンパク質をリガンドとして担体に固定化した場合であって、非固定化ドメインは形成されない場合の模式図である。 図３（Ａ）〜（Ｃ）は、４量体のタンパク質をリガンドとして担体に固定化した場合であって、非固定化ドメインが１つ以上存在する場合の模式図である。 図４（Ａ）、図４（Ｂ）は、４量体のタンパク質をリガンドとして担体に固定化した場合であって、非固定化ドメインが１つ以上存在する場合の模式図である。 図５（Ａ）、図５（Ｂ）は、４量体のタンパク質をリガンドとして担体に固定化した場合であって、固定化用タグを導入して担体との結合を形成しており、すべてのドメインが非固定化ドメインとなる場合の模式図である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
なお、本発明の実施形態は、特定のプロテアーゼに耐性を有し、十分な免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質に関するものである。
本発明の第１の実施形態は、プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼに耐性を有し、十分な免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質に関するものである。
また、本発明の第２の実施形態は、プロテアーゼ、特にサーモリシンに耐性を有し、免疫グロブリンとの結合能力を有するタンパク質に関するものである。

なお、本明細書において、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化された、または、ペプチド結合によって連結されたポリペプチド鎖も、「タンパク質」という用語に包含される。

また、「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。

［本発明の第１の実施形態］
＜タンパク質＞
本発明の第１の実施形態における第１の態様のタンパク質は、配列番号１〜３に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、およびＡドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有し、該ドメインの少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列において、１以上のリジンを含み、Ｃ末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする。

本発明の第１の実施形態における第２の態様のタンパク質は、配列番号４〜６に記載のプロテインＡのＢ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有し、該ドメインの少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列において、１以上のリジンを含み、４位のリジンおよびＣ末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする。

本発明の第１の実施形態における第３の態様のタンパク質は、配列番号４〜６に記載のプロテインＡのＢ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有し、該ドメインの少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列において１以上のリジンを含み、各ドメインのＣ末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を連結箇所配列（第１連結エレメント）とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列（第１連結エレメント）のＣ末端のリジンおよび４位のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする。

以下、本明細書においては、本発明の第１の実施形態における第１の態様、第２の態様、および第３の態様のタンパク質を総称して、本発明の第１の実施形態のタンパク質とする。

プロテインＡは、免疫グロブリン結合性ドメインが５個つながった形で構成されるタンパク質である。複数の微生物がプロテインＡを発現するが、プロテインＡを発現する微生物として、例えば、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。

配列番号１〜６に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインは、免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができる免疫グロブリン結合性タンパク質であり、いずれのドメインも、免疫グロブリンのＦｃ領域、Ｆａｂ領域、および、Ｆａｂ領域中の特にＦｖ領域の、各々の領域に対して結合する。

図１の配列比較表に示すように、プロテインＡ由来の、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインは、互いに相同性の高いアミノ酸配列を有しており、６０％以上のアミノ酸配列同一性を有している。なお、ハイフン（−）はＣドメインのアミノ酸残基とおなじであることを示す。

「プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかに由来するドメイン」とは、野生型の各ドメインのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するドメインを指し、Ｆｃ領域への結合能を有しているタンパク質をコードする限り、野生型の各ドメインのアミノ酸配列に後述する変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）以外の変異が入っていてもよい。

つまり、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかのアミノ酸配列は、変異を導入する前のアミノ酸配列（野生型アミノ酸配列）であり、「プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかに由来するドメイン」のアミノ酸配列はＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインの野生型アミノ酸配列そのもの、または野生型アミノ酸配列に後述する変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）を含む、ならびに／もしくは、部分的なアミノ酸の置換、挿入、欠失、および、化学修飾により改変されたものを指す。

ここで、プロテインＡのＺドメインは、ＢドメインにＡ１ＶとＧ２９Ａという変異を導入して得られたものであり、天然のプロテインＡには存在しないドメインであるが、本明細書においては、配列番号６に示したアミノ酸配列をＺドメインの野生型アミノ酸配列と称する。

本明細書では、アミノ酸配列中の特定アミノ酸の位置は、野生型アミノ酸配列のＮ末端を１位として順次番号を付して特定する。通常、各ドメインのアミノ酸配列のＮ末端を１位とする。プロテインＡのＢ、Ｃ、およびＺドメインのＮ末端から４番目のアミノ酸である４位はリジンである。ここで、図１に示す通りＥドメインは、他のドメインと相同性の高い領域を基準にして、１位および２位のアミノ酸残基が欠失しているものとして取り扱う。また、図１に示す通りＤドメインは、他のドメインと相同性の高い領域を基準にして、Ｎ末端から３番目〜５番目のアミノ酸残基が挿入されているものとして取り扱う。

本明細書中では、アミノ酸について、その正式名称で記載しないときは、慣用の一文字略号で表す。また、アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型、または、非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のグリシン（Ｇｌｙ）をアラニン（Ａｌａ）に置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。

本発明の第１の実施形態のタンパク質は、上述した「プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかに由来するドメイン」を単ドメインとして２つ以上有する多量体タンパク質（複ドメイン型タンパク質）である。好ましくは３つ以上であり、より好ましくは４つ以上であって、好ましくは１０以下、より好ましくは８つ以下、さらに好ましくは６つ以下である。

これらの多量体タンパク質は、単一の免疫グロブリン結合性ドメインの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、種類の異なる免疫グロブリン結合性ドメインの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。好ましくは、本発明の第１の実施形態のタンパク質に含まれるドメインのすべてが、配列番号１〜６に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＺドメインのいずれか１種類に由来するホモポリマーである。

本発明の第１の実施形態におけるタンパク質は、２つ以上のドメインのＣ末端とＮ末端が連結し、連結箇所配列（第１連結エレメント）を構成している。ここで、本明細書において「連結箇所配列（第１連結エレメント）」とは、各ドメインのアミノ酸配列におけるＣ末端のリジンおよびそれに連結するＮ末端の１位から５位までの配列を指す。

つまり、２つのドメインが連結する箇所の、Ｃ末端側の１アミノ酸残基とＮ末端側の５アミノ酸残基との計６アミノ酸残基の配列が連結箇所配列（第１連結エレメント）となる。ここで、Ｎ末端側のアミノ酸配列はＢ、Ｃ、Ｚで保存されているアミノ酸配列を基準とし、当該配列の５アミノ酸残基を指すものとする。

よって、図１に示す通り、Ｅドメインは基準となるＮ末端側の配列のうち、Ｎ末端から２アミノ酸残基が欠失した配列をしていることから、Ｅドメインを含む場合には、連結箇所配列（第１連結エレメント）は、Ｃ末端側の１アミノ酸残基とＮ末端側の３アミノ酸残基との計４アミノ酸残基の配列を指すものとする。

また、図１に示す通り、Ｄドメインは基準となるＮ末端側の配列に（ ）で示す３アミノ酸残基を挿入した配列をしていることから、本タンパク質がＤドメインを含む場合には、ドメイン間の連結部分にＣ末端側の１アミノ酸残基とＮ末端側の８アミノ酸残基との計９アミノ酸残基を含むこととなる。ただし、ＤドメインのＮ末端側に挿入されている、「ＡＱＱ」の３アミノ酸残基は本発明の効果に特に影響しないと考えられることから、本明細書においてはＢ、Ｃ、Ｚで保存されているアミノ酸配列を基準とし、連結箇所配列（第１連結エレメント）に含まれるＤドメインのＮ末端の１位から５位のアミノ酸配列は、下記に示す５アミノ酸残基を指すものとする。

ｎ量体タンパク質においてはｎ−１個の連結箇所配列（第１連結エレメント）が存在する。
図１に示した通り、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＺドメインのいずれについても、Ｃ末端はリジン（Ｋ）である。よって、上述の連結箇所配列（第１連結エレメント）には、必ずリジン（Ｋ）を含むこととなる。

また、以下に示す配列が、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列である。Ｅドメインは１および２位のアミノ酸残基が存在せず３つのアミノ酸からなり、リジン（Ｋ）を含まない。Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれの配列も５つのアミノ酸からなり、Ｄ、Ａドメインはリジン（Ｋ）を含まず、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインは４位にリジン（Ｋ）を含んでいる。

ドメインＥ Ａ Ｑ Ｈ
ドメインＤ Ａ Ｄ Ｎ Ｎ Ｆ
ドメインＡ Ａ Ｄ Ｎ Ｎ Ｆ
ドメインＢ Ａ Ｄ Ｎ Ｋ Ｆ
ドメインＣ Ａ Ｄ Ｎ Ｋ Ｆ
ドメインＺ Ｖ Ｄ Ｎ Ｋ Ｆ

本発明の第１の実施形態における第１および第３の態様のタンパク質においては、少なくとも一つの連結箇所配列（第１連結エレメント）は部分的なアミノ酸の置換、挿入、欠失、および、化学修飾により改変された変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）であり、野生型アミノ酸配列に存在するリジンを含まないアミノ酸配列であることを特徴としている。変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）は、リジン（Ｋ）を含まないことが好ましく、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸により構成される配列であることがより好ましく、１以上のアミノ酸からなることが好ましい。

一方、本発明の第１の実施形態における第２の態様のタンパク質においては、少なくとも一つのＢ、Ｃ、およびＺドメインのアミノ酸配列において、４位のリジンおよびＣ末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴としている。よって、該ドメインが複数連結していることにより、第３の態様の変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）を構成することとなる。加えて、タンパク質の最もＮ末端側またはＣ末端側に位置するドメインが該ドメインである場合には、末端部分は変異連結箇所配列を形成しないが、後述するアフィニティリガンドが担体に固定化されて得られるアフィニティ分離剤において、タンパク質の該ドメインのＮ末端側またはＣ末端側を担体に固定化することにより、タンパク質と担体との結合、および固定化されたドメインとその他のドメインとの結合を安定に維持することができる。

ここで、本発明の第１の実施形態において「変異」とは、野生型アミノ酸配列に対して行われる部分的なアミノ酸の置換、挿入、欠失、および、化学修飾による改変を意味し、「変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）」とは野生型アミノ酸配列の連結箇所配列（第１連結エレメント）に、特定の「変異」が挿入された配列を言う。また、「変異ドメイン」とは各ドメインの野生型アミノ酸配列に、特定の「変異」が挿入されたドメインを言う。

本発明の第１の実施形態における第１および第３の態様のタンパク質に含まれる連結箇所配列（第１連結エレメント）のうち少なくとも一つが変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）であればよいが、３量体以上のタンパク質の場合には２つ以上が変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）であることが好ましく、ｎ量体タンパク質の場合にはｎ−１個が変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）あること、つまり全ての連結箇所配列（第１連結エレメント）が変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）であることがより好ましい。
よって、本発明の第１の実施形態のタンパク質では、すべての連結箇所配列（第１連結エレメント）において、リジンが欠失または置換されていることが好ましい。

後述するアフィニティ分離剤において、担体に固定化されたリガンドがプロテアーゼによる切断を受けないためには、本発明の第１の実施形態のタンパク質における、最もＮ末端側のドメインの４位のリジン、または最もＣ末端側のＣ末端のリジンが欠失または置換されていることが好ましい。

よって、本発明の第１の実施形態における第２の態様のタンパク質に含まれるドメインのうち、少なくとも一つが４位のリジンおよびＣ末端のリジンが欠失または置換されたドメイン（変異ドメイン）であればよいが、タンパク質の最もＮ末端側のドメインまたは最もＣ末端側のドメインが変異ドメインであることが好ましく、後述する固定化ドメインが変異ドメインであることが好ましい。また、３量体以上のタンパク質の場合には固定化ドメインおよびそれに連結する２つ以上が変異ドメインであることが好ましく、ｎ量体タンパク質の場合には固定化ドメインおよびそれに連結するｎ−２個以上のドメインが変異ドメインであることが好ましく、全てのドメインが変異ドメインであることが最も好ましい。

連結箇所配列（第１連結エレメント）は各ドメインのアミノ酸配列におけるＣ末端の１アミノ酸残基および１位から５位までの配列からなるが、この配列に対して置換、挿入、欠失、および、化学修飾により改変を行い、好ましくは１以上のアミノ酸からなり、好ましくはリジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸により構成される配列である。

本発明者らの検討により、トリプシンやプラスミンなどのセリンプロテアーゼによって切断を受けやすい箇所が、連結箇所配列（第１連結エレメント）中の野生型アミノ酸配列で存在する特定の位置のリジン（Ｋ）のＣ末端側であることが明らかになった。このことより、連結箇所配列（第１連結エレメント）に存在する特定のリジン（Ｋ）を含まないようなアミノ酸で構成される変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とすると、セリンプロテアーゼによるタンパク質の切断を顕著に抑制可能であることを見出した。

具体的には、野生型アミノ酸配列の連結箇所配列（第１連結エレメント）におけるＫを、欠失および／または置換することにより変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とすることができる。好ましくはＫ以外のアミノ酸により構成される変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とすることであり、より好ましくはＫおよびＲ以外のアミノ酸により構成される変異連結エレメントとすることである。

加えて、本発明者らの検討によれば、野生型アミノ酸配列の連結箇所配列（第１連結エレメント）以外に存在するＫおよびＲはセリンプロテアーゼによる切断を受けにくいため本発明の第１の実施形態のタンパク質の各ドメインに存在していてもよいだけでなく、本発明の第１の実施形態のタンパク質が十分な免疫グロブリン結合活性を有するためには、少なくとも一つのドメインにおいて１以上のリジンを含んでいる必要があることを見出した。

連結箇所配列（第１連結エレメント）以外に存在するリジンは、野生型アミノ酸配列におけるリジンが保存されていることが好ましく、好ましくは２つ以上が保存されていることであり、より好ましくは３つ以上が保存されていることであり、最も好ましくは４つのリジンが野生型アミノ酸配列と同じ位置で含まれることが好ましい。保存されるＫとしては、３５位のリジンが保存されているのが最も好ましい。

連結箇所配列（第１連結エレメント）以外に存在するリジンが十分な免疫グロブリン結合活性を有するために必要である理由は明らかになっていないが、野生型プロテインＡの抗体認識部位近傍のリジンは抗体と静電的な相互作用をしていると考えられている。このことより、野生型プロテインＡの抗体認識部位の働きを損なわない範囲で、置換、挿入などの変異により野生型アミノ酸配列に存在しないリジンを含んでいても構わないが、野生型アミノ酸配列に存在しないリジンを含まないことが好ましい。
以下に、変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）の具体的な例について説明する。

連結箇所配列（第１連結エレメント）のアミノ酸の一部を欠失させて変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とする場合には、変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）は１以上のアミノ酸からなることを必須とする。本発明者らの検討に拠れば、連結箇所配列（第１連結エレメント）に含まれる６つ全てのアミノ酸を欠失させた場合には、目的とする免疫グロブリンへの結合能力が著しく低下し、当該タンパク質をアフィニティリガンドとして用いると免疫グロブリンとの結合能力が不十分であることが明らかとなった。

一般に免疫グロブリンは各ドメインよりも大きく、結合した免疫グロブリン同士の立体障害により各ドメインと結合可能な数は限られている。そのため、各ドメインと免疫グロブリンが結合した際に、連結箇所配列（第１連結エレメント）が存在せず隣接するドメインが近すぎると、免疫グロブリンが結合可能な空間が不足し、１ドメイン当たりの免疫グロブリン結合数が低下することによるものと推察される。変異連結箇所配列（第１連結エレメント）は好ましくは１以上、より好ましくは２以上のアミノ酸からなると、目的とする免疫グロブリンへの結合能力がより高くなる傾向があり好ましい。

本発明の第１の実施形態における第１の態様のタンパク質では、連結箇所配列（第１連結エレメント）がプロテインＡのいずれかのドメインのＣ末端のリジン（Ｋ）とＥ、Ｄ、およびＡドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなっている。そのため、野生型アミノ酸配列の連結箇所配列（第１連結エレメント）には、Ｋが１つ含まれている。よって、変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）は、連結するドメインのＣ末端のリジン（Ｋ）を欠失したものであることが好ましい。

例えば、プロテインＡのＡドメインが２つ連結してできる連結箇所配列（第１連結エレメント）を変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とする場合には、Ｃ末端のリジン（Ｋ）を欠失させたアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン（Ｎ）、フェニルアラニン（Ｆ）の５つのアミノ酸からなる配列や、Ｃ末端のＫに加えて１位のＡおよび５位のＦを欠失させ、Ｄ、Ｎ、Ｎの３つのアミノ酸からなる配列などが好ましい例として挙げられる。

本発明の第１の実施形態における第２、３の態様のタンパク質では、連結箇所配列（第１連結エレメント）がプロテインＡのいずれかのドメインのＣ末端のリジン（Ｋ）とＢ、Ｃ、およびＺドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなっている。そのため、野生型アミノ酸配列の連結箇所配列（第１連結エレメント）には、Ｃ末端と４位の２つのＫが含まれている。よって、変異連結箇所配列（第１連結エレメント）は、連結するドメインのＣ末端のリジン（Ｋ）および４位のリジン（Ｋ）を欠失したものであることが好ましい。

例えば、プロテインＡのＢドメインが２つ連結してできる連結箇所配列（第１連結エレメント）を変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とする場合には、Ｃ末端のリジン（Ｋ）および４位のリジン（Ｋ）の２つのアミノ酸を欠失させたアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、フェニルアラニン（Ｆ）の４つのアミノ酸からなる配列や、Ｃ末端のＫおよび４位のＫに加えて１位のＶおよび５位のＦを欠失させ、Ｄ、Ｎの２つのアミノ酸からなる配列などが好ましい例として挙げられる。また、連結箇所配列（第１連結エレメント）に含まれるＫのどちらか一方を後述する方法で置換する場合には、Ｃ末端のＫのみを欠失させたり、４位のＫのみを欠失させてもよい。

アミノ酸の置換は、元のアミノ酸を削除し、同じ位置に別のアミノ酸を追加する変異のことを意味する。追加される別のアミノ酸は特に限定されるものではなく、例えば、天然のタンパク質構成アミノ酸、タンパク質非構成アミノ酸、非天然アミノ酸が挙げられる。この中でも、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。

ただし、連結箇所配列（第１連結エレメント）のアミノ酸を置換して変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とする場合には、変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）にはリジン（Ｋ）を含まないような配列とする必要がある。更にアルギニン（Ｒ）も含まないような配列であれば、アルギニンを認識するプロテアーゼに対する耐性も向上し好ましい。

従って、置換により導入されるアミノ酸としては、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）などの親水性アミノ酸；システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）などの中性アミノ酸のいずれかであることが好ましい。この中でも、親水性アミノ酸のいずれかであることがより好ましい。

さらには、アルカリ性条件下での安定性が向上する観点で、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）が好ましい。

本発明の第１の実施形態における第１の態様のタンパク質では、野生型アミノ酸配列の連結箇所配列（第１連結エレメント）には、Ｋが１つ含まれており、変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）は、連結するドメインのＣ末端のリジン（Ｋ）を置換したものであることが好ましい。

例えば、プロテインＡのＡドメインが２つ連結してできる連結箇所配列（第１連結エレメント）を変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とする場合には、Ｃ末端のリジン（Ｋ）を、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸で置換したものであることが好ましい。

具体的には、Ｃ末端のリジン（Ｋ）をアスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）やヒスチジン（Ｈ）で置換した配列や、Ｃ末端のＫに加えて１位のＡおよび５位のＦを、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）やヒスチジン（Ｈ）で置換した配列などが好ましい例として挙げられる。

本発明の第１の実施形態における第２の態様のタンパク質では、野生型アミノ酸配列の連結箇所配列（第１連結エレメント）には、Ｃ末端と４位の２つのＫが含まれおり、変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）は、連結するドメインのＣ末端のリジン（Ｋ）および４位のリジン（Ｋ）を置換したものであることが好ましい。

例えば、プロテインＡのＢドメインが２つ連結してできる連結箇所配列（第１連結エレメント）を変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とする場合には、Ｃ末端のリジン（Ｋ）および４位のリジン（Ｋ）を、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸で置換したものであることが好ましい。具体的には、Ｃ末端のリジン（Ｋ）および４位のリジン（Ｋ）をアスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）やヒスチジン（Ｈ）で置換した配列や、Ｃ末端のＫおよび４位のＫに加えて１位のＶおよび５位のＦを、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）やヒスチジン（Ｈ）で置換した配列などが好ましい例として挙げられる。

また、連結箇所配列（第１連結エレメント）に含まれるどちらか一方のＫを前述した方法で欠失する場合には、Ｃ末端のＫのみを置換したり、４位のＫのみを置換してもよい。

変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）には、野生型アミノ酸配列に含まれる５つのアミノ酸に加えて、追加のアミノ酸配列が挿入されていてもよい。

本発明の第１の実施形態におけるタンパク質においては、Ｃ末端のリジン（Ｋ）および／または４位のリジン（Ｋ）を欠失または置換して変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とすれば、セリンプロテアーゼに対する耐性を高めることができる。さらに本発明の第１の実施形態のタンパク質では、末端のＫおよび／または４位のＫが欠失して、４つのアミノ酸からなる変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とすると、トリプシンやプラスミンなどのセリンプロテアーゼ耐性をさらに高めることができ好ましい。

さらに、理由は定かではないが、野生型アミノ酸配列の連結箇所配列（第１連結エレメント）中のＫに加えて他のいくつかのアミノ酸を欠失させて、好ましくは３つ、より好ましくは２つのアミノ酸からなる変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）とすると、セリンプロテアーゼ耐性がさらに高まる傾向があるため好ましい。これは、連結箇所配列（第１連結エレメント）が短くなることで、プロテアーゼとの物理的な接触が抑制されることによるものと推察される。

本発明の第１の実施形態におけるタンパク質はセリンプロテアーゼに対する耐性に加えて、他のプロテアーゼに対する耐性を有していてもよい。例えば、変異連結箇所配列（変異第１連結エレメント）が、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸から構成される場合には、サーモリシンに対する耐性を有するため好ましい。

変異結合箇所配列（変異第１連結エレメント）以外に導入されるアミノ酸配列の改変は、特に限定されるものではなく、野生型アミノ酸配列を有するタンパク質に比べて、同等またはそれ以上に、免疫グロブリンのＦａｂ領域に対する親和性が低下し、かつ免疫グロブリンに親和性を有していればよい。

変異結合箇所配列（変異第１連結エレメント）以外の部分のアミノ酸配列は、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかの野生型アミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の配列同一性を有し、その結果、本発明の第１の実施形態におけるタンパク質がＦｃ領域への結合能を有していればよい。

変異を導入して得られるタンパク質の各ドメインは、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＺドメインのいずれかの野生型アミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上のアミノ酸の配列同一性を示す。

上述のタンパク質の具体例として、配列番号４８〜５７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。

本発明の第１の実施形態におけるタンパク質はプロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼに耐性を有することを特徴とする。セリンプロテアーゼとは、トリプシン、プラスミンなどが例として挙げられ、通常、大腸菌などの微生物やＣＨＯ細胞などの培養細胞で生成、蓄積されるプロテアーゼである。

例えば、本発明の第１の実施形態におけるタンパク質を作製する場合には、通常、後述するように、大腸菌などの微生物を宿主とする形質転換体を利用し、形質転換体の細胞内または細胞外にタンパク質を蓄積させて、回収する。目的とするタンパク質を蓄積・回収する際には、宿主となる微生物が生産するプロテアーゼの影響を受けることがある。

また、本発明の第１の実施形態におけるタンパク質を免疫グロブリン結合性アフィニティリガンドとしてアフィニティ分離剤を作製し、免疫グロブリンを精製するために使用する場合には、該アフィニティ分離剤に通過させる免疫グロブリン産生したＣＨＯ細胞などの培養上清中に含まれるプロテアーゼの影響を受けることがある。

本発明者らの検討に拠れば、野生型アミノ酸配列を有する多量体タンパク質では、該多量体タンパク質を蓄積・回収した場合に、培養途中、及び回収後の精製・濃縮等の工程でプロテアーゼの影響により切断を受け、目的の多量体タンパク質を得られないことが分かった。

また、野生型アミノ酸配列を有する多量体タンパク質をリガンドとしてアフィニティ分離剤を作製した場合、免疫グロブリン精製用に使用する時にリガンドである多量体タンパク質がプロテアーゼの影響により切断を受け、免疫グロブリン結合性を十分に発揮しないことが明らかになった。これは、プロテアーゼの中でも大腸菌などの微生物やＣＨＯ細胞などの培養細胞などが生産するセリンプロテアーゼの影響によるものであり、各ドメインのアミノ酸配列の中でも特定の部分で切断を受けていることが、初めて明らかとなった。

これらの検討結果を考慮して、連結箇所配列（第１連結エレメント）に特定の改変を加えた本発明の第１の実施形態におけるタンパク質は、培養途中、及び回収後の精製・濃縮等の工程においてセリンプロテアーゼによる切断を受けることがなく、蓄積・回収を行うことができる。

また、本発明の第１の実施形態における多量体タンパク質をリガンドとしてアフィニティ分離剤を作製した場合、セリンプロテアーゼの影響を受けることなく、十分な免疫グロブリン結合性を発揮し、目的の免疫グロブリンを精製することが可能である。

免疫グロブリンの精製工程などで用いた場合にプロテアーゼの影響を受けることなくリガンドが安定に機能することができるという効果を顕著に奏する点で、本発明の第１の実施形態におけるタンパク質は、担体に結合しない非固定化ドメインを１つ以上含むことが好ましく、より好ましくは２つ以上、ｎ量体のタンパク質の場合にはｎ−１個以上が非固定化ドメインであることが好ましく、最も好ましくはｎ個の全てが非固定化ドメインである。

本発明の第１の実施形態におけるタンパク質が、後段で詳述する非固定化ドメインを含むためには、少なくとも一つ以上のドメインのアミノ酸配列において、アミノ酸の置換や挿入などにより固定化に有用なアミノ酸残基を導入したり、固定化に有用なアミノ酸を欠失させたり、固定化用タグを導入したりすることによって、作製することができる。
本発明の第１の実施形態におけるタンパク質が非固定化ドメインを含むことにより、配向性を調整して担体に固定化することができ、より高い免疫グロブリン結合性を発揮することができるため好ましい。

また、本発明の第１の実施形態におけるアフィニティ分離剤は、繰り返し使用した場合であってもとしても、リガンドの免疫グロブリン結合性が低下することなく、効率的に免疫グロブリンを精製することが可能である。

そのため、本発明の第１の実施形態におけるタンパク質は免疫グロブリンのＦｃ領域への結合活性が十分高くアフィニティリガンドとして好適に用いることができるだけでなく、リガンドとして安定して繰り返し使用することが可能であり、工業的に有利である。

ここで、本明細書においてセリンプロテアーゼ耐性があるかどうかは、次の方法で確認する。２ｍｇ／ｍＬのリガンド溶液１０μＬに１〜１０ｍｇ／ｍＬのセリンプロテアーゼ溶液を２μＬ添加した溶液を、３７℃、１５時間加熱した際に、切断されていないリガンドが多いほど好ましい。セリンプロテアーゼ溶液の濃度は、プロテアーゼの種類によって適宜設定すればよく、例えば、トリプシンは１ｍｇ／ｍＬとすることが好ましく、プラスミンは１０ｍｇ／ｍＬとすることが好ましい。

セリンプロテアーゼ耐性があるものとしては、切断されていないリガンドを８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上保持していることである。なお、切断されているかどうかは、一般に用いられる電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認する。

［本発明の第２の実施形態］
＜タンパク質＞
本発明の第２の実施形態におけるタンパク質は、配列番号３〜６に記載のプロテインＡのＡ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有し、各ドメインを連結する連結エレメント（第２連結エレメント）のうち少なくとも一つは、１以上のアミノ酸からなり、かつ疎水性アミノ酸以外のアミノ酸により構成される変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）であることを特徴とする。

プロテインＡは、免疫グロブリン結合性ドメインが５個つながった形で構成されるタンパク質である。複数の微生物がプロテインＡを発現するが、プロテインＡを発現する微生物として、例えば、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。

配列番号３〜６に記載のプロテインＡのＡ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインは、免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができる免疫グロブリン結合性タンパク質であり、いずれのドメインも、免疫グロブリンのＦｃ領域、Ｆａｂ領域、および、Ｆａｂ領域中の特にＦｖ領域の、各々の領域に対して結合する。

図１の配列比較表に示すように、プロテインＡ由来の、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインは、互いに相同性の高いアミノ酸配列を有しており、８０％以上のアミノ酸配列同一性を有している。なお、ハイフン（−）はＣドメインのアミノ酸残基と同じであることを示す。

「プロテインＡのＡ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかに由来するドメイン」とは、野生型の各ドメインのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するドメインを指し、Ｆｃ領域への結合能を有しているタンパク質をコードする限り、野生型の各ドメインのアミノ酸配列に後述する変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）以外の変異が入っていてもよい。

つまり、プロテインＡのＡ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかのアミノ酸配列は、変異を導入する前のアミノ酸配列（野生型アミノ酸配列）であり、「プロテインＡのＡ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかに由来するドメイン」のアミノ酸配列は、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインの野生型アミノ酸配列そのもの、または野生型アミノ酸配列に後述する変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）を含む、ならびに／もしくは、部分的なアミノ酸の置換、挿入、欠失、および、化学修飾により改変されたものを指す。

ここで、プロテインＡのＺドメインは、ＢドメインにＡ１ＶとＧ２９Ａという変異を導入して得られたものであり、天然のプロテインＡには存在しないドメインであるが、本明細書においては、配列番号６に示したアミノ酸配列をＺドメインの野生型アミノ酸配列と称する。

本発明の第２の実施形態におけるタンパク質は、上述した「プロテインＡのＡ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかに由来するドメイン」を単ドメインとして２つ以上有する多量体タンパク質（複ドメイン型タンパク質）である。好ましくは３つ以上であり、より好ましくは４つ以上であって、好ましくは１０以下、より好ましくは８つ以下、さらに好ましくは６つ以下である。

これらの多量体タンパク質は、単一の免疫グロブリン結合性ドメインの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、種類の異なる免疫グロブリン結合性ドメインの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。好ましくは、本発明の第２の実施形態におけるタンパク質に含まれるドメインのすべてが、配列番号３〜６に記載のプロテインＡのＡ、Ｂ、ＣおよびＺドメインのアミノ酸配列のいずれか１種類に由来するホモポリマーである。

本発明の第２の実施形態におけるタンパク質は、２つ以上のドメインのＣ末端とＮ末端が連結し、連結エレメント（第２連結エレメント）を構成する。ここで、本発明の第２の実施形態において「連結エレメント（第２連結エレメント）」とは、各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を指す。

つまり、Ｎ末端側に他のドメインを連結するドメインにおいては、当該ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列が連結エレメント（第２連結エレメント）となる。よって、ｎ量体タンパク質においてはｎ−１個の連結エレメント（第２連結エレメント）が存在する。

以下に示す配列が、プロテインＡのＡ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列である。いずれの配列も５つのアミノ酸からなり、疎水性アミノ酸であるアラニン（Ａ）および／またはフェニルアラニン（Ｆ）を含んでいる。

ドメインＡ Ａ Ｄ Ｎ Ｎ Ｆ
ドメインＢ Ａ Ｄ Ｎ Ｋ Ｆ
ドメインＣ Ａ Ｄ Ｎ Ｋ Ｆ
ドメインＺ Ｖ Ｄ Ｎ Ｋ Ｆ

本発明の第２の実施形態におけるタンパク質においては、少なくとも一つの連結エレメント（第２連結エレメント）は部分的なアミノ酸の置換、挿入、欠失、および、化学修飾により改変された変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）であることを特徴としている。変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）とは、１以上のアミノ酸からなり、かつ疎水性アミノ酸以外のアミノ酸により構成される配列である。

本発明の第２の実施形態におけるタンパク質に含まれる連結エレメント（第２連結エレメント）のうち少なくとも一つが変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）であればよいが、３量体以上のタンパク質の場合には２つ以上が変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）であることが好ましく、ｎ量体タンパク質の場合にはｎ−１個が変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）であること、つまり全ての連結エレメント（第２連結エレメント）が変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）であることがより好ましい。

連結エレメント（第２連結エレメント）は各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなるが、この配列に対して置換、挿入、欠失、および、化学修飾により改変を行い、１以上のアミノ酸からなり、かつ疎水性アミノ酸以外のアミノ酸により構成される配列が変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）である。

本発明者らの検討により、サーモリシンによって切断を受けやすい箇所が、連結エレメント（第２連結エレメント）中の疎水性アミノ酸のＮ末端側であることが明らかになった。このことより、連結エレメント（第２連結エレメント）を疎水性アミノ酸以外のアミノ酸により構成される変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）とすると、サーモリシンによるタンパク質の切断を顕著に抑制可能であることを見出した。

具体的には、野生型アミノ酸配列の連結エレメント（第２連結エレメント）におけるＡおよびＦを、欠失および／または置換することにより、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）とすることが好ましい。

ここで、本明細書における「疎水性アミノ酸」とはアラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）、バリン（Ｖ）を指し、「疎水性アミノ酸以外のアミノ酸」とは、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）などの親水性アミノ酸；システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）などの天然型の中性的なアミノ酸や；アセチルリジン、アジド−Ｚ−リジン、グルタミン酸５−メチル、アスパラギン酸５−メチルなどの非天然型の中性的なアミノ酸を指す。
以下に、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）の具体的な例について説明する。

連結エレメント（第２連結エレメント）のアミノ酸の一部を欠失させて変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）とする場合には、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）は１以上のアミノ酸からなることを必須とする。本発明者らの検討に拠れば、連結エレメント（第２連結エレメント）に含まれる５つ全てのアミノ酸を欠失させた場合には、目的とする免疫グロブリンへの結合能力が著しく低下し、当該タンパク質をアフィニティリガンドとして用いると免疫グロブリンとの結合能力が不十分であることが明らかとなった。特に、アフィニティ分離剤として使用する精製条件によってその差が顕著に表れる。

一般に免疫グロブリンは各ドメインよりも大きく、結合した免疫グロブリン同士の立体障害により各ドメインと結合可能な数は限られている。そのため、各ドメインと免疫グロブリンが結合した際に、連結エレメント（第２連結エレメント）が存在せず隣接するドメインが近すぎると、免疫グロブリンが結合可能な空間が不足し、１ドメイン当たりの免疫グロブリン結合数が低下することによるものと推察される。変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）は種々の精製条件において免疫グロブリンとの結合能力に優れるとの理由から１以上のアミノ酸からなることを必須とし、２以上のアミノ酸からなると、目的とする免疫グロブリンへの結合能力がより高くなる傾向があり好ましい。

変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）がプロテインＡのＡ、Ｂ、およびＣドメインのいずれかに由来するドメインに含まれる場合には、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）は、Ａ、Ｂ、またはＣドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、１位のアラニンおよび／または５位のフェニルアラニンを欠失したものであることが好ましい。

例えば、１位のアラニン（Ａ）および５位のフェニルアラニン（Ｆ）の２つのアミノ酸を欠失させたアスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）の３つのアミノ酸からなる配列や、１位のＡおよび５位のＦに加えて４位のＫを欠失させ、Ｄ、Ｎの２つのアミノ酸からなる配列などが好ましい例として挙げられる。また、連結エレメント（第２連結エレメント）に含まれる疎水性アミノ酸を後述する方法で置換する場合には、１位のＡのみを欠失させたり、５位のＦのみを欠失させてもよい。

変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）がプロテインＡのＺドメインに由来するドメインに含まれる場合には、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）は、Ｚドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、１位のバリンおよび／または５位のフェニルアラニンを欠失したものであることが好ましい。

例えば、１位のバリン（Ｖ）および５位のフェニルアラニン（Ｆ）の２つのアミノ酸を欠失させたアスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）の３つのアミノ酸からなる配列や、１位のＶおよび５位のＦに加えて４位のＫを欠失させ、Ｄ、Ｎの２つのアミノ酸からなる配列などが好ましい例として挙げられる。また、連結エレメント（第２連結エレメント）に含まれる疎水性アミノ酸の一部を後述する方法で置換する場合には、１位のＶのみを欠失させたり、５位のＦのみを欠失させてもよい。

アミノ酸の置換は、元のアミノ酸を削除し、同じ位置に別のアミノ酸を追加する変異のことを意味する。追加される別のアミノ酸は特に限定されるものではなく、例えば、天然のタンパク質構成アミノ酸、タンパク質非構成アミノ酸、非天然アミノ酸が挙げられる。この中でも、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。

ただし、連結エレメント（第２連結エレメント）のアミノ酸を置換して変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）とする場合には、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）には疎水性アミノ酸を含まないような配列とする必要がある。従って、置換により導入されるアミノ酸としては、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）などの親水性アミノ酸；システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）などの中性的なアミノ酸のいずれかであることが好ましい。この中でも、親水性アミノ酸のいずれかであることがより好ましい。

さらには、アルカリ性条件下での安定性が向上する観点で、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）が好ましい。
また、その他のプロテアーゼ、例えば後述するセリンプロテアーゼ、への耐性が向上する観点で、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）が好ましい。

変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）がプロテインＡのＡ、Ｂ、およびＣドメインのいずれかに由来するドメインに含まれる場合には、前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）は、Ａ，Ｂ，またはＣドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、１位のアラニンおよび／または５位のフェニルアラニンを、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換したものであることが好ましい。

例えば、１位のアラニン（Ａ）および５位のフェニルアラニン（Ｆ）の２つのアミノ酸を疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換した配列や、１位のＡおよび５位のＦに加えて４位のＫを、Ｋを除く疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換した配列などが好ましい例として挙げられる。また、連結エレメント（第２連結エレメント）に含まれる疎水性アミノ酸の一部を前述した方法で欠失する場合には、１位のＡのみを置換したり、５位のＦのみを置換してもよい。

変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）がプロテインＡのＺドメインに由来するドメインに含まれる場合には、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）は、Ｚドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、１位のバリンおよび／または５位のフェニルアラニンを、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換したものであることが好ましい。

例えば、１位のバリン（Ｖ）および５位のフェニルアラニン（Ｆ）の２つのアミノ酸を疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換した配列や、１位のＶおよび５位のＦに加えて４位のＫを、Ｋを除く疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換した配列などが好ましい例として挙げられる。また、連結エレメント（第２連結エレメント）に含まれる疎水性アミノ酸の一部を前述した方法で欠失する場合には、１位のＶのみを置換したり、５位のＦのみを置換してもよい。

変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）には、野生型アミノ酸配列に含まれる５つのアミノ酸に加えて、追加のアミノ酸配列が挿入されていてもよい。例えば、連結エレメント（第２連結エレメント）に含まれる疎水性アミノ酸の一部を前述した方法で置換した配列に、更に疎水性アミノ酸以外のアミノ酸を挿入し、６以上のアミノ酸からなる変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）とすることも出来る。

また、連結エレメント（第２連結エレメント）に含まれる疎水性アミノ酸の一部を前述した方法で欠失した配列から、更に一部または全部のアミノ酸を欠失し、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸からなる任意の変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）を挿入することも出来る。また、リジン残基のアセチル化やプロリン残基のヒドロキシル化などの化学修飾なども、抗体との結合性などに影響のない範囲で可能である。

ただし、得られるタンパク質の立体構造が大きく変化すると、目的とする免疫グロブリンへの親和性及び結合能に変化を与える可能性があることから、野生型アミノ酸配列の連結エレメント（第２連結エレメント）にさらに追加のアミノ酸配列を挿入しないことが好ましい。

置換、挿入などにより変異を導入された変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）を構成するアミノ酸としては、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、好ましくはアルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）などの親水性アミノ酸であり、より好ましくはアスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）である。

変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）以外に導入されるアミノ酸配列の改変は、特に限定されるものではなく、野生型アミノ酸配列を有するタンパク質に比べて、同等またはそれ以上に免疫グロブリンに親和性及び結合能を有していればよい。

変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）以外の部分のアミノ酸配列は、プロテインＡのＡ、Ｂ、Ｃ、およびＺドメインのいずれかの野生型アミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の配列同一性を有し、その結果、本発明の第２の実施形態におけるタンパク質がＦｃ領域への結合能を有していればよい。

変異を導入して得られるタンパク質の各ドメインは、プロテインＡのＡ、Ｂ、ＣおよびＺドメインのいずれかの野生型アミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上のアミノ酸の配列同一性を示す。

免疫グロブリンへの親和性及び結合能以外に有用なリガンドの特性指標として、耐アルカリ性や弱酸性溶出性が挙げられる。これらを改良するために、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）以外のアミノ酸配列の改変をすることは、本発明においては両立可能であり、好ましい形態といえる。

耐アルカリ性とは、０．１Ｎ ＮａＯＨや０．５Ｎ ＮａＯＨなどのアルカリ溶液に浸漬した際に、免疫グロブリンとの親和性及び結合能を高く維持していることをいう。これにより、耐アルカリ性を有するタンパク質をアフィニティリガンドとして用いて分離剤とした際に、アルカリ溶液での洗浄を繰り返しても高い分離精製能を維持することができる。なお、ＣドメインおよびＺドメインはもともと高い耐アルカリ性を有していることが知られており、耐アルカリ性においては好ましい配列である。

また弱酸性溶出性とは、アフィニティリガンドを固定化した分離剤にて免疫グロブリンを吸着精製する際に、通常、酸性で溶出する免疫グロブリンを、より高いｐＨのマイルドな条件で溶出可能であることをいう。これにより、溶出する際にタンパク質の凝集といった変性を抑えることが可能である。特許文献５や国際公開第２０１０／１１８６９９号などに記載されている弱酸性溶出性を付与する変異は、本発明においては両立可能であり好ましい形態といえる。

上述のタンパク質の具体例として、配列番号１０５〜１１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。

本発明の第２の実施形態におけるタンパク質はプロテアーゼ、特にサーモリシンに耐性を有することを特徴とする。本発明の第２の実施形態におけるタンパク質を作製する場合に、通常、後述するように、微生物を宿主とする形質転換体を利用し、形質転換体の細胞内または細胞外にタンパク質を蓄積させて、回収する。目的とするタンパク質を蓄積・回収する際には、宿主となる微生物が生産するプロテアーゼの影響を受けることがある。

本発明者らの検討に拠れば、野生型アミノ酸配列を有する多量体タンパク質を上記の方法により蓄積・回収した場合に、培養途中、及び回収後の精製・濃縮等の工程でプロテアーゼの影響により切断を受け、目的の多量体タンパク質を得られないことが分かった。これは、プロテアーゼの中でもバチルス属細菌などが生産するサーモリシンの影響によるものであり、各ドメインのアミノ酸配列の中でも特定の部分で切断を受けていることが、初めて明らかとなった。

これらの検討結果を考慮して、連結エレメント（第２連結エレメント）に特定の改変を加えた本発明の第２の実施形態におけるタンパク質は、培養途中、及び回収後の精製・濃縮等の工程においてサーモリシンによる切断を受けることがなく、蓄積・回収を行うことができる。そのため、本発明の第２の実施形態におけるタンパク質は免疫グロブリンのＦｃ領域への結合活性が十分高くアフィニティリガンドとして好適に用いることができるだけでなく、高効率で生産可能であり、工業的に有利である。

ここで、本明細書においてサーモリシン耐性があるかどうかは、次の方法で確認する。２ｍｇ／ｍＬのリガンド溶液１０μＬに１ｍｇ／ｍＬのサーモリシン溶液を２μＬ添加した溶液を、３７℃、１５分間加熱した際に、切断されていないリガンドが多いほど好ましい。例えば切断されていないリガンドを８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上保持していることが好ましい。なお、切断されているかどうかは、一般に用いられる電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認する。

本発明の第２の実施形態におけるタンパク質は、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）を有することによりサーモリシンに対する耐性を有するが、さらに他のプロテアーゼに対する耐性を有するアミノ酸配列であることが好ましい。他のプロテアーゼとしては、例えばトリプシンやプラスミン等のセリンプロテアーゼが挙げられる。

本発明の第２の実施形態におけるタンパク質をリガンドとして用いたアフィニティ分離剤を用いて組換え培養細胞で生産されたＩｇＧ抗体を精製する場合にあっては、該培養細胞が産生するセリンプロテアーゼによってリガンドが切断され、十分な免疫グロブリン結合性を発揮できない可能性がある。よって、本発明の第２の実施形態におけるタンパク質が、さらにセリンプロテアーゼに対する耐性を有するアミノ酸配列であることが好ましい。

上記の理由により、少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列におけるＣ末端のリジンを欠失または置換したものであることが好ましい。本発明者らの検討により、トリプシンやプラスミンなどのセリンプロテアーゼによって切断を受けやすい箇所が、各ドメインの野生型アミノ酸配列で存在するＣ末端リジン（Ｋ）のＣ末端側であることが明らかになった。このことより、各ドメインの連結エレメント（第２連結エレメント）が結合するＣ末端リジン（Ｋ）を欠失または置換により含まないようなアミノ酸配列で構成されるとすると、セリンプロテアーゼによるタンパク質の切断を顕著に抑制可能であることを見出した。

より好ましくは、Ｃ末端側に前記変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）を結合するドメインにおいて、該ドメインのアミノ酸配列におけるＣ末端のリジンを欠失または置換したものである。

さらに好ましくは、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）にもリジンを含まないものである。先に示した通り、Ｂ、Ｃ、Ｚドメインの野生型アミノ酸配列では、連結エレメント（第２連結エレメント）中の４位にリジンを含んでいる。

本発明者らの検討により、連結エレメント（第２連結エレメント）中のリジンについても比較的セリンプロテアーゼによる切断を受けやすいことが明らかとなったので、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）においては、リジン（Ｋ）を欠失または置換することにより含まないようなアミノ酸配列とすることが好ましい。さらに好ましくは、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）はアルギニン（Ｒ）を含まないものである。
以下に、セリンプロテアーゼ耐性を有する変異連結エレメントの具体的な例について説明する。

各ドメインのＣ末端リジン（Ｋ）および／または連結エレメント（第２連結エレメント）のアミノ酸の一部を欠失させる場合が挙げられる。連結エレメント（第２連結エレメント）がＡドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなっている場合には、各ドメインのＣ末端のＫのみを欠失させればよい。

一方で、連結エレメント（第２連結エレメント）がＢ、Ｃ、およびＺドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなっている場合には、Ｃ末端と４位の２つのＫが含まれており、少なくともＣ末端のＫを欠失させることが好ましく、さらに連結エレメント（第２連結エレメント）中のＫも欠失させることがより好ましい。

例えば、プロテインＡのＢドメインが２つ連結してできる連結エレメント（第２連結エレメント）が疎水性アミノ酸の欠失により作製された変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）である場合、さらにＣ末端のリジン（Ｋ）を欠失させたアスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）の３つのアミノ酸からなる配列や、さらにＣ末端のリジン（Ｋ）および４位のリジン（Ｋ）の２つのアミノ酸を欠失させたアスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）の２つのアミノ酸からなる配列が、好ましい例として挙げられる。

また、Ｃ末端のＫおよび連結エレメント（第２連結エレメント）に含まれるＫのどちらか一方を後述する方法で置換する場合には、Ｃ末端のＫのみを欠失させたり、４位のＫのみを欠失させてもよい。

各ドメインのＣ末端リジン（Ｋ）および／または連結エレメント（第２連結エレメント）のアミノ酸の一部を置換する場合には、元のアミノ酸を削除し、同じ位置に別のアミノ酸を追加することが挙げられる。追加される別のアミノ酸は特に限定されるものではなく、例えば、天然のタンパク質構成アミノ酸、タンパク質非構成アミノ酸、非天然アミノ酸が挙げられる。この中でも、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。

ただし、連結エレメント（第２連結エレメント）のアミノ酸を置換して変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）とする場合には、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で構成されることが必要であり、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）にはリジン（Ｋ）を含まないような配列とすることが好ましい。更にアルギニン（Ｒ）も含まないような配列であれば、アルギニンを認識するプロテアーゼに対する耐性も向上し好ましい。

従って、置換により導入されるアミノ酸としては、疎水性アミノ酸、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）などの親水性アミノ酸；システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）などの中性アミノ酸のいずれかであることが好ましい。この中でも、上記の親水性アミノ酸のいずれかであることがより好ましい。さらには、アルカリ性条件下での安定性が向上する観点で、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）が好ましい。

連結エレメント（第２連結エレメント）がＡドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなっている場合には、各ドメインのＣ末端のＫのみを置換すればよい。一方で、連結エレメント（第２連結エレメント）がＢ、Ｃ、およびＺドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなっている場合には、Ｃ末端と４位の２つのＫが含まれており、少なくともＣ末端のＫを置換することが好ましく、さらに連結エレメント（第２連結エレメント）中のＫも置換することがより好ましい。

例えば、プロテインＡのＢドメインが２つ連結してできる連結エレメント（第２連結エレメント）が疎水性アミノ酸の置換により作製された変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）である場合、さらにＣ末端のリジン（Ｋ）を疎水性アミノ酸、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸で置換したものであることが好ましく、さらにＣ末端のリジン（Ｋ）および４位のリジン（Ｋ）の２つのアミノ酸を疎水性アミノ酸、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸で置換したものであることがより好ましい。具体的には、１位のＶおよび５位のＦに加えてＣ末端のＫおよび４位のＫを、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）やヒスチジン（Ｈ）で置換した配列などが好ましい例として挙げられる。

また、Ｃ末端のＫおよび連結エレメント（第２連結エレメント）に含まれるどちらか一方のＫを前述した方法で欠失する場合には、Ｃ末端のＫのみを置換したり、４位のＫのみを置換してもよい。

上記の変異を加入することにより、本発明の第２の実施形態におけるタンパク質はセリンプロテアーゼに耐性を有することが可能となる。セリンプロテアーゼとは、トリプシン、プラスミンなどが例として挙げられ、通常、大腸菌などの微生物やＣＨＯ細胞などの培養細胞で生成、蓄積されるプロテアーゼである。

本発明の第２の実施形態におけるタンパク質を免疫グロブリン結合性アフィニティリガンドとしてアフィニティ分離剤を作製し、免疫グロブリンを精製するために使用する場合には、該アフィニティ分離剤に通過させる抗体産生したＣＨＯ細胞などの培養上清中に含まれるプロテアーゼの影響を受けることがある。

本発明者らの検討に拠れば、セリンプロテアーゼの影響により、各ドメインのアミノ酸配列の中でも特定の部分で切断を受けていることが、初めて明らかとなった。これらの検討結果を考慮して、セリンプロテアーゼに耐性を有するアミノ酸配列に改変された本発明の第２の実施形態におけるタンパク質をリガンドとしてアフィニティ分離剤を作製した場合、セリンプロテアーゼの影響を受けることなく、十分な免疫グロブリン結合性を発揮し、目的の免疫グロブリンを精製することが可能である。

また、本発明の第２の実施形態におけるアフィニティ分離剤は、繰り返し使用した場合であっても、リガンドの免疫グロブリン結合性が低下することなく、効率的に免疫グロブリンを精製することが可能である。

そのため、本発明の第２の実施形態におけるタンパク質は免疫グロブリンのＦｃ領域への結合活性が十分高くアフィニティリガンドとして好適に用いることができるだけでなく、リガンドとして安定して繰り返し使用することが可能であり、工業的に有利である。

ここで、本明細書においてセリンプロテアーゼ耐性があるかどうかは、次の方法で確認する。２ｍｇ／ｍＬのリガンド溶液１０μＬに１〜１０ｍｇ／ｍＬのセリンプロテアーゼ溶液を２μＬ添加した溶液を、３７℃、１５時間加熱した際に、切断されていないリガンドが多いほど好ましい。セリンプロテアーゼ溶液の濃度は、プロテアーゼの種類によって適宜設定すればよく、例えば、トリプシンは１ｍｇ／ｍＬとすることが好ましく、プラスミンは１０ｍｇ／ｍＬとすることが好ましい。

セリンプロテアーゼ耐性があるものとしては、切断されていないリガンドを８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上保持していることが好ましい。なお、切断されているかどうかは、一般に用いられる電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認する。

＜タンパク質の製造方法＞
本発明の第１の実施形態及び第２の実施形態のタンパク質（本発明のタンパク質）の製造方法について以下に説明する。
本発明のタンパク質は、上記のタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを作製し、該ＤＮＡを翻訳して製造することができる。具体的には、該ＤＮＡを含むベクターを用いて、宿主となる微生物を形質転換した形質転換体、または該ＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系を利用して製造することができる。

本発明のタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡは、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ゲノムＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該ＤＮＡを構成する塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。

本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに部位特異的に変異を導入する方法としては、以下のように、遺伝子組換え技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。

すなわち、遺伝子組換え技術による変異の導入は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。

また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、タンパク質をコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。

また、本発明の単量体タンパク質（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体タンパク質をコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体タンパク質をコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。

多量体タンパク質をコードするＤＮＡを作製する方法は、これら連結する方法に限らない。例えば、プロテインＡをコードするＤＮＡ（例えば、国際公開第２００６／００４０６７号）に上記の変異導入法を適用することで作製することも可能である。

また、多量体タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体タンパク質をコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組換えを誘発する可能性があるので、好ましくは連結されている単量体タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、より好ましくは８５％以下であることが好ましい。

ベクターは、前述したタンパク質、または、その部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、前述したタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡを、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができる。

遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社製）、および、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）のベクターなどが挙げられる。

ベクターとしては、形質転換の宿主としてブレビバチルス属細菌を使用する場合には、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、または、ｐＨＹ５００（日本国特開平２−３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（日本国特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（日本国特開平７−１７０９８４号公報）、ｐＨＴ２１０（日本国特開平６−１３３７８２号公報）、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（日本国特開２００２−２３８５６９号公報）などが挙げられる。

宿主となる細胞へ本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを導入することにより形質転換体を得ることができる。宿主へのベクターの形質転換の方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

また、ベクターを宿主で維持する方法としては、例えば、細胞内でゲノム（染色体）から独立してベクターの自律複製により維持する方法や、作製した遺伝子をゲノム（染色体）に組み込み、ゲノムの複製に依存して維持する方法などが挙げられる。

宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、好ましくは、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。より好ましくは、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のグラム陽性菌がよい。さらに好ましくは、プロテインＡの大量生産への適応例（国際公開第２００６／００４０６７号）が公知である、ブレビバチルス属細菌がよい。

ブレビバチルス属細菌としては、限定されないが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ、Ｂ．ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｆｏｒｍｏｓｕｓ、Ｂ．ｉｎｖｏｃａｔｕｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｒｅｕｓｚｅｒｉ、Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒが例示される。

好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス４７株（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７０）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）およびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）が例示される。

生産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株、高発現株、または、芽胞形成能欠失株のような変異株（または、誘導株）を使用してもよい。具体的に挙げれば、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（日本国特開平６−２９６４８５号公報）や、芽胞形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（国際公開第２００５／０４５００５号公報）が使用できる。

本発明のタンパク質は、形質転換体、または上記のＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系を利用して製造することができる。

形質転換体を使用してタンパク質を製造する場合、タンパク質は、形質転換体の細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収することができる。細胞内に蓄積すると、発現タンパク質の酸化を防ぐことができ、培地成分との副反応もない点で有利であり、ペリプラズム領域内に蓄積すると、細胞内プロテアーゼによる分解を抑えることができる点で有利である。

一方、形質転換体の細胞外にタンパク質を分泌すると、菌体破砕や抽出の工程が不要となるため、製造コストが抑えられる点で有利である。一方で、プロテアーゼも分泌する宿主の場合、培養途中で目的とするタンパク質が分解される可能性がある。

具体的方法として、タンパク質が培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合には、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。このときプロテアーゼも溶出してくると、目的とするタンパク質が分解される可能性がある。

組換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組換えタンパク質を回収することができる。

本発明のタンパク質を無細胞タンパク質合成系により製造する場合、無細胞タンパク質合成系としては、細胞抽出液を使用してインビトロでタンパク質を合成する系であれば特に限定されず、例えば、原核細胞由来、植物細胞由来、高等動物細胞由来の合成系などを使用することができる。

本発明のタンパク質は、前記した形質転換体を培地で培養し、他のタンパク質との融合タンパク質の形態で発現させ、該培養物から該融合タンパク質を採取し、該融合タンパク質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のタンパク質を採取することにより製造することもできる。

前記した形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、該タンパク質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。

具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。

大腸菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、特に限定されないが、例えば、ＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ１％）、または、２ｘＹＴ培地（トリプトン１．６％、酵母エキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。

ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、特に限定されないが、例えば、ＴＭ培地（ペプトン１％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．２％、グルコース１％；ｐＨ７．０）、または、２ＳＬ培地（ペプトン４％、酵母エキス０．５％、グルコース２％；ｐＨ７．２）等が挙げられる。

さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的タンパク質の分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわちＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。

さらに、本発明のタンパク質を正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。分子シャペロンは、例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のタンパク質と共存させることができる。タンパク質の正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法も可能であるが、これらに限定されるものではない。

組換えタンパク質は、培養温度は１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより製造することができる。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。

組換えタンパク質の精製はアフィニティクロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。

得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。

＜アフィニティ分離剤＞
本発明のタンパク質をアフィニティリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化することにより、本発明のアフィニティ分離剤を得ることができる。ここで、「アフィニティリガンド」とは、抗原と免疫グロブリンの結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質（官能基）を指す用語であり、本明細書においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。

本発明に用いる水不溶性の基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。

市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００（生化学工業株式会社製）、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−１０００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）（東ソー株式会社製）、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ４Ｂ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）（ＪＮＣ株式会社製）などを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。

また、本発明に用いる水不溶性担体は、本発明のアフィニティ分離剤の使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが好ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。

リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、カルボアミド基、ポリエチレンオキシ基、または、チオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。

カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。

また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。したがって、固定化のために、本発明のタンパク質に対して、化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。

固定化に有用なアミノ酸残基を付加した場合、付加したアミノ酸残基を固定化用タグと称する。固定化用タグはアミノ酸残基を１以上の任意の数だけ付加でき、付加する位置はリガンドのＮ末端側および／またはＣ末端側が挙げられる。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むリジン（Ｋ）や、側鎖にチオール基を含むシステイン（Ｃ）が挙げられる。

一方、担体にリガンドを直接固定化する方法としては、リガンドのアミノ酸配列の任意の箇所に、固定化に有用なアミノ酸を置換・挿入することが挙げられる。

本発明の本質は、本発明においてタンパク質に付与した効果が、該タンパク質をリガンドとして固定化した分離剤（マトリックス）においても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。

本発明のアフィニティ分離剤におけるリガンドと担体の固定化様式としては、多点固定と単点固定が挙げられる。多点固定とはリガンド本体および／または固定化タグが２点以上で担体と化学結合して固定化している様式をいい、単点固定とはリガンド本体または固定化タグが１点で担体と化学結合して固定化している様式をいう。

リガンドが担体に結合して固定化された場合、リガンドに含まれる２以上のドメインは、それぞれ固定化ドメインと非固定化ドメインに区別される。ここでいう固定化ドメインとは、担体と多点あるいは単点で結合しているドメインであり、非固定化ドメインとは担体と結合していないドメインである。

本発明のアフィニティ分離剤においては、抗体の精製工程などで用いた場合にプロテアーゼの影響を受けることなくリガンドが安定に機能することができるという効果を顕著に奏する点で、リガンドは非固定化ドメインを１つ以上含むことが好ましく、好ましくは２つ以上、ｎ量体のリガンドの場合にはｎ−１個以上が非固定化ドメインであることが好ましく、最も好ましくはｎ個の全てが非固定化ドメインである。

担体に固定化されたリガンドにおける固定化ドメイン−非固定化ドメインのパターンとしては、以下の４つが挙げられる。
（１）リガンド中のすべてのドメインが固定化ドメインである場合
（２）リガンド中のＮ末端および／またはＣ末端側のドメインが１つ以上固定化ドメインである場合
（３）リガンド中の両末端以外のドメインが１つ以上固定化ドメインである場合
（４）リガンドのＮ末端および／またはＣ末端に固定化用タグを導入し、固定化ドメインが存在しない場合

以下、４量体のタンパク質をリガンドとして担体に固定化した場合の模式図である図２〜５を例にして説明するが、２量体以上のタンパク質であれば同様に考えられる。なお、図２〜５において、４量体に含まれる４つのドメインを、ぞれぞれａ〜ｄと示し、第１および第２連結エレメントに相当するアミノ酸配列を、ａ〜ｄを繋ぐ実線で示した。なお、ａ〜ｄのアミノ酸配列は同一であっても、異なっていてもよく、ａとｄはそれぞれＣ末端側またはＮ末端側のどちらの場合でも同様に考えることができる。

上記（１）の場合には、非固定化ドメインは形成されない。例えば図２に模式的に示される場合であり、ａ〜ｄのすべてのドメインが担体に結合しているため、アフィニティ分離剤を精製工程で使用する際にプロテアーゼの影響で連結エレメントが切断されても、リガンドは担体に結合したまま機能することができる。

上記（２）の場合には、非固定化ドメインが１つ以上存在する場合であり、図３（Ａ）〜（Ｃ）に模式的に示される。図３（Ａ）では、リガンドのＮ末端またはＣ末端から２つのドメイン（ａ，ｂ）が担体に結合する固定化ドメインであり、反対側の末端の２つのドメイン（ｃ，ｄ）が担体に結合しない非固定化ドメインである。この場合、ａとｂの連結エレメントが切断されてもリガンドは機能することができるが、ｂとｃまたはｃとｄの連結エレメントが切断されるとｃとｄは担体から脱離してリガンドとしての機能を果たさなくなるため好ましくない。

図３（Ｂ）では、リガンドのＮ末端またはＣ末端のドメイン（ａ）が担体に結合する固定化ドメインであり、それに連結する３つのドメイン（ｂ，ｃ，ｄ）が担体に結合しない非固定化ドメインである。この場合、ａとｂ、ｂとｃまたはｃとｄの何れの連結エレメントが切断されても、ｂ〜ｄは担体から脱離してリガンドとしての機能を果たさなくなるため好ましくない。なかでもａとｂの連結エレメントのように固定化ドメインと非固定化ドメインとの連結エレメントが切断されると、該非固定化ドメインに連続して結合するドメインも機能しなくなるため特に問題となる。

図３（Ｃ）では、リガンドのＮ末端およびＣ末端のドメイン（ａ，ｄ）が担体に結合する固定化ドメインであり、その間の２つのドメイン（ｂ，ｃ）が担体に結合しない非固定化ドメインである。この場合、ａとｂ、ｂとｃまたはｃとｄの何れか２つ以上の連結エレメントが切断されれば、ｂ，ｃは担体から脱離してリガンドとしての機能を果たさなくなるため好ましくない。

上記（３）の場合には、非固定化ドメインが１つ以上存在する場合であり、図４（Ａ）、図４（Ｂ）に模式的に示される。図４（Ａ）では、リガンドのＮ末端とＣ末端の中間に存在する１つのドメイン（ｃ（ｂでも同様））が担体に結合する固定化ドメインであり、両末端の２つのドメイン（ａ，ｄ）とそれに連結する１つのドメイン（ｂ（ｃでも同様））が担体に結合しない非固定化ドメインである。この場合、ａとｂ、ｂとｃまたはｃとｄの何れの連結エレメントが切断されても、ａ，ｂ，ｄは担体から脱離してリガンドとしての機能を果たさなくなるため好ましくない。なかでもｂとｃ、ｃとｄの連結エレメントのように固定化ドメインと非固定化ドメインとの連結エレメントが切断されるのが特に問題となる。

図４（Ｂ）では、リガンドのＮ末端とＣ末端の中間に存在する２つのドメイン（ｂ，ｃ）が担体に結合する固定化ドメインであり、両末端の２つのドメイン（ａ，ｄ）が担体に結合しない非固定化ドメインである。この場合、ｂとｃの連結エレメントが切断されてもリガンドは機能することができるが、ａとｂまたはｃとｄの連結エレメントが切断されるとｃとｄは担体から脱離してリガンドとしての機能を果たさなくなるため好ましくない。

上記（４）の場合には、固定化用タグを導入して担体との結合を形成しており、すべてのドメインが非固定化ドメインとなる場合であって、図５（Ａ）、図５（Ｂ）に模式的に示される。図５（Ａ）では、リガンドのＮ末端またはＣ末端のドメイン（ａ）の末端配列に固定化用タグを導入して担体に結合させている。この場合、ａとｂ、ｂとｃまたはｃとｄの何れの連結エレメントが切断されてもｂ〜ｄは担体から脱離してリガンドとしての機能を果たさなくなる好ましくない。固定化タグを有するａを固定化ドメインとして考えると、ａとｂとの連結エレメントの切断が上述した図３（Ｂ）と同様に特に問題となる。加えて、ａの末端配列がプロテアーゼで切断されるとすべてのドメインが脱離してリガンドとして機能しなくなるため特に問題となる。このため、ａの固定化用タグを連結する末端（Ｃ末端またはＮ末端）配列において、プロテアーゼ耐性を付与するための変異が導入されている必要がある。

図５（Ｂ）では、リガンドのＮ末端およびＣ末端のドメイン（ａ，ｄ）の末端配列に固定化用タグを導入して担体に結合させている。この場合も、固定化タグを有するａ，ｄを固定化ドメインとして考えると、上述した図３（Ｃ）と同様の問題がある。加えて、ａおよびｄの末端配列がプロテアーゼで切断されるとすべてのドメインが脱離してリガンドとして機能しなくなるため特に問題となる。このため、ａ，ｄの固定化用タグを連結する末端（Ｃ末端およびＮ末端）配列において、プロテアーゼ耐性を付与するための変異が導入されている必要がある。

上述のことより、本発明の第１の実施形態における第１、第３の態様、及び第２の実施形態のタンパク質における変異結合エレメント位置としては、好ましくは固定化ドメインと非固定化ドメインの間や、非固定化ドメインと非固定化ドメインの間に有することである。より好ましくは少なくとも固定化ドメインと非固定化ドメインの間に有することであり、さらに好ましくは非固定化ドメインと非固定化ドメインの間にも有することである。

また、リガンドに固定化用タグを導入している場合には、固定化用タグを有するドメインを固定化ドメインとして、上記の範囲で好ましい形態を考えればよい。

発明の第１の実施形態における第２の態様のタンパク質における、４位のリジンおよびＣ末端のリジンが欠失または置換されたドメイン（変異ドメイン）の位置としては、少なくとも固定化ドメインが変異ドメインであることが好ましく、それに加えて固定化ドメインに直接連結する非固定化ドメインも変異ドメインであることがより好ましく、連続して連結する非固定化ドメインのうち固定化ドメインにより近いものが変異ドメインであることがさらに好ましい。

一方、固定化ドメインから最も離れた非固定化ドメインは他のドメインに連結しない側の末端はプロテアーゼの影響を受けても特に問題ないので、変異ドメインでなくてもよい。ただし、最も離れた非固定化ドメインが変異ドメインであれば、他のドメインとの連結箇所がプロテアーゼによる影響を受けることがないので好ましい。また、リガンドに固定化用タグを導入している場合には、固定化用タグを有するドメインを固定化ドメインとして、上記の範囲で好ましい形態を考えればよい。

リガンド中の担体と結合を形成する部位は特に限定されないが、好ましくはリガンド配列の末端である。末端で固定化することによりリガンドの自由度が高くなり、免疫グロブリンと結合可能な領域を広く保つことで、免疫グロブリンとの結合能を高く保つことが出来る。リガンドの末端であれば、Ｎ末端でもＣ末端でもどちらでもよい。

本発明のアフィニティ分離剤は、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合するものであることが好ましい。アフィニティ分離剤が結合する、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質としては、例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体が挙げられる。これらのタンパク質を、アフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。

なお、これらのタンパク質は一般にチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、メタノール資化性ピキア酵母、パン酵母、コウジカビなどを用いて作製されるが、それらの培養液中にプロテアーゼが存在した場合、本発明のアフィニティ分離剤はそのプロテアーゼによる劣化を最小限に抑えることができるため好ましい。

ここで「免疫グロブリンのＦｃ領域を含む抗体」としては、例えば、ＩｇＧが挙げられる。「抗体誘導体」とはＩｇＧ誘導体のことを指し、例えば、ヒトＩｇＧの一部のドメインを他生物種のＩｇＧ抗体のドメインに置き換えて融合させたキメラ抗体や、ヒトＩｇＧのＣＤＲ部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化抗体が挙げられる。

「断片抗体」としては、例えば、ヒトＩｇＧのＦａｂ領域のみからなるタンパク質が挙げられる。「断片抗体誘導体」としては、例えば、ヒトＩｇＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工抗体が挙げられる。なお、これらの抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体を総称する名称として「抗体様分子」という表現を、明細書中で使用する。

本発明のアフィニティ分離剤を使用して、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を分離することができる。具体的には本発明のアフィニティ分離剤を含み、少なくとも一つの該アフィニティ分離剤が充填される容器を備える液体クロマトグラフィー用カラムとすることができる。

Ｆｃ領域を含むタンパク質（上述の抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体）の分離は、すでに市販品として存在するプロテインＡカラムを用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順により達成することができる（参考文献１：Ｒｏｑｕｅ Ａ．Ｃ．Ａ．他著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ」、２００７年、１１６０巻、４４−５５頁）。

すなわち、抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明の液体クロマトグラフィー用カラムに通過させ、抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体を吸着させる。次いで、液体クロマトグラフィー用カラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。

この時点では所望の抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体はカラム内の本発明のアフィニティ分離剤に吸着されている。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液（該マトリックスからの解離を促進する物質を含む場合もある）をカラムに通液し、所望の抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体を溶出することにより、高純度な精製が達成される。

本発明のアフィニティ分離剤は、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。

一般的には、プロテインＡを構成する各々のドメインは、Ｆａｂ領域よりもＦｃ領域に対してより強く結合する（参考文献１）。したがって、本発明のタンパク質の「免疫グロブリンに対する親和性」は、本質的にはＦｃ領域に対する親和性を指す表現であり、Ｆａｂ領域に対する結合力のみが変化しても、免疫グロブリンに対する親和性の強さは大きく変化しない。本発明のタンパク質は、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインが有する、Ｆａｂ領域への２次的な親和性が低下しており、免疫グロブリンとの相互作用における２次的な結合の影響を排除できるという効果を奏する。

一方で、Ｆｃ領域への親和性は維持されているので、免疫グロブリン全体に対する親和性は維持されている。本発明のタンパク質が有する免疫グロブリンに対する親和性は、ヒト免疫グロブリンＧ製剤に対する親和性を後述のＢｉａｃｏｒｅシステムにより測定した時に、親和定数（ＫＡ）が１０^６（Ｍ^−１）以上であることが好ましく、１０^７（Ｍ^−１）以上であることがより好ましい。

本発明のタンパク質の、免疫グロブリンに対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などのバイオセンサーによって測定することができるが、測定方法はこれに限定されるものではない。

測定条件としては、プロテインＡが免疫グロブリンのＦｃ領域に結合した時の結合シグナルが検出できればよく、温度２０〜４０℃（一定温度）にて、ｐＨ６〜８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。

本発明のタンパク質が親和性を示す対象としては、例えば、Ｆａｂ領域、および、Ｆｃ領域を不足なく含有する免疫グロブリン分子、および、その誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のタンパク質は、Ｆｃ領域側の一部分を含むタンパク質に対しても親和性を有し、結合対象は、Ｆｃ領域を完全に含むタンパク質である必要はない。抗体の立体構造はすでに既知であるので、タンパク質工学的に本発明のタンパク質が結合する領域の立体構造を保持した上で、Ｆａｂ領域やＦｃ領域にさらなる改変（断片化など）を施すことは可能であり、本発明のタンパク質はそれらの派生物にも結合しうる。

また、本発明のタンパク質を固定化したアフィニティ分離剤の免疫グロブリンに対する結合能は、例えば、過剰の免疫グロブリン溶液中に浸漬した分離剤がどれくらいの免疫グロブリンを吸着可能か評価する静的吸着容量や、分離剤を充填したカラムに免疫グロブリン溶液を通液したときに破過する液量を評価する動的吸着容量などで比較評価可能であるが、これに限定されるものではない。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。

＜本発明の実施形態１の実施例＞
［作製例］
１）野生型プロテインＡ発現プラスミドの作製
５’側にｃａｔａｔｇ（ＮｄｅＩ）、３’側にｃｔｃｇａｇ（ＸｈｏＩ）を付加した野生型Ｃドメイン２量体（ＷＴ）をコードするＤＮＡ配列（配列番号７）を化学合成した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（ともにＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて消化後、精製・回収を行った。
なお、配列番号７はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＤＮＡ配列をもとに大腸菌発現用にコドン最適化を行って決定した。

タンパク質発現ベクターとして、Ｔ７プロモーターを持ち、マルチクローニングサイト下流に６ｘＨｉｓタグおよび終止コドンを持つベクターｐＥＴ２２ｂ（メルク社製）を選択した。ｐＥＴ２２ｂを制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（ともにＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて消化後、精製・回収を行った。
制限酵素処理した配列番号７のＤＮＡ断片とｐＥＴ２２ｂベクターを、ＤＮＡリガーゼ（ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて連結し、ＷＴ発現ベクターを構築した。
ＷＴ発現ベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９（ＴａＫａＲａ社製）の形質転換を行い、定法によりプラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。

２）プロテインＡ変異体（Ｍｕｔ）発現プラスミド作製
野生型Ｃドメイン２量体のアミノ酸配列の一部に欠失および／または置換の変異を有するタンパク質 Ｍｕｔ１〜Ｍｕｔ１３をコードするＤＮＡ配列（配列番号３４〜４６）を含む発現ベクターの作製を行った。Ｍｕｔ１〜１３発現ベクターは、表１に示す鋳型と合成オリゴヌクレオチドプライマーセット（配列番号８〜３３）の組み合わせによりクイックチェンジ法（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて作製した。クイックチェンジ法はＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のプロトコルに従い実施した。

得られたＭｕｔ１〜１３発現ベクターはＪＭ１０９（ＴａＫａＲａ社製）を形質転換することによって定法により増幅および抽出した。
得られたＭｕｔ１〜１３発現ベクターのＤＮＡ配列の解析はＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。発現ベクターのシークエンシングＰＣＲ反応はＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ．１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、付属プロトコルに従って行った。得られたシークエンシングＰＣＲ産物は定法により精製し、ＤＮＡ配列解析に用いた。
本実施によって得られたＭｕｔ１〜１３発現ベクターのうち、発現タンパク質をコードするＤＮＡ配列は配列番号３４〜４６で示される通りであった。

３）タンパク質の発現
Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（メルク社製）を、上記１）および２）で得られたＷＴ、Ｍｕｔ１〜１３発現ベクターで形質転換し、目的タンパク質であるＷＴ、Ｍｕｔ１〜１３をそれぞれ発現する形質転換体を得た。形質転換法はメルク社プロトコルに従った。
目的タンパク質を発現する形質転換体を５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で終夜培養して前培養液を得た。得られた前培養液１０ｍＬを５００ｍＬ ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン含有）に植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍでＯＤ６００≒０．６〜０．８になるまで培養した。イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、さらに培養を４時間継続した。培養終了後、遠心にて集菌した。

４）タンパク質の回収
上記３）で集菌した菌体を５０ｍＬの懸濁バッファー（５０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離して、上清画分と沈殿画分とに分画した。上清画分を懸濁バッファーで平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ５ｍＬカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に供し、平衡化バッファーで洗浄後、溶出バッファー（１７５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて目的タンパク質を溶出した。溶出された目的タンパク質を透析にて脱塩水に置換した。目的タンパク質はＡｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ １０Ｋ（メルクミリポア社製）を用いて約３０〜４０ｍｇ／ｍＬの濃度まで遠心濃縮した。濃縮後の目的タンパク質はＰＢＳバッファーを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。

精製終了後の目的タンパク質をＴｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｅ・パジェル Ｒ１５Ｓ；ＡＴＴＯ社製）に供し、分子量約１４０００Ｄａの位置にシングルバンドを確認した。ＷＴ発現ベクターを用いて得られた目的タンパク質は配列番号４７のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、Ｍｕｔ１〜１３発現ベクターを用いて得られた目的タンパク質は、それぞれ、配列番号４８〜６０のアミノ酸配列を有するタンパク質であった。
ＷＴの連結箇所配列（第１連結エレメント）近傍の配列、およびＭｕｔ１〜１３の変異連結エレメント近傍の配列を表２に示す。Ｃドメインの２量体のうち、Ｄ５８で示される位置のアミノ酸が１つ目のドメインのＣ末端であり、Ｄ１’で示される位置のアミノ酸が２つ目のドメインのＮ末端である。また「／（斜線）」はアミノ酸の欠失を表す。

［実施例１−１］
＜トリプシン耐性評価＞
１）プロテアーゼであるトリプシンへの耐性を以下の方法で評価した。
作製例で得られたＭｕｔ１のタンパク質とトリプシンとを混合し、３７℃で１５分間加熱した。配合量は以下の通りである。
・作製例１のタンパク質（２ｍｇ／ｍＬ、リン酸バッファー） １０μＬ
・希釈用バッファー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０） ２μＬ
・純水 ６μＬ
・トリプシン溶液（１ｍｇ／ｍＬ） ２μＬ

次に、電気泳動用の希釈液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２００ｍＭ ＤＴＴ、２０％ グリセロール、４％ ＳＤＳ、０．０１２％ ブロモフェノールブルー； ２ｘＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）を、得られた混合液に２０μＬ添加した。そのうち１０μＬをサンプルとして、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を実施した。比較として、サーモリシンを添加していない混合液の同量を同じゲル上にて電気泳動を実施した。

電気泳動後のゲルを染色し、トリプシン処理前後でのタンパク質の分解の有無を染色度により比較評価した。染色度とは電気泳動により得られた染色バンドの位置および強度をいう。
トリプシン処理前に比べてほとんど分解していないもの（染色度が９０％以上維持）を◎、分解が少ないもの（染色度が７０％以上９０％未満を維持）を○、分解が多いもの（染色度が３０％以上７０％未満を維持）を△、ほとんど分解しているもの（染色度が３０％未満）を×とした。
結果を表３に示した。

２）プロテアーゼであるプラスミンへの耐性を以下の方法で評価した。
トリプシン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をプラスミン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）に代えた以外は、トリプシン耐性への評価と同様にして評価した。結果を表３に示した。

＜免疫グロブリンの吸着能評価（ＳＢＣ）＞
作製例で得られたＭｕｔ１のタンパク質を、エポキシ基で活性化された多孔質アクリルビーズ１ｍＬに対し３ｍｇ固定化して分離剤とし、免疫グロブリンとの結合能を評価した。
常法に従い、分離剤との静的な吸着容量を評価した。結果を表３に示した。

［実施例１−２〜１−１０、比較例１−１〜１−４］
Ｍｕｔ１のタンパク質の代わりに、作製例で得られたＭｕｔ２〜１０を実施例１−２〜１−１０に、ＷＴを比較例１−１に、Ｍｕｔ１１〜１３を比較例１−２〜１−４に用いたこと以外は実施例１−１と同様にして、プロテアーゼ耐性評価と免疫グロブリンの吸着能評価を実施した。
結果を表３に示した。

Ｃ末端のリジンが欠失または置換されていない比較例１−１〜１−４はトリプシン耐性、プラスミン耐性ともに低いのに対し、Ｃ末端のリジンが欠失または置換されている実施例１−１〜１−１０はトリプシン耐性、プラスミン耐性のどちらかが少なくとも高く改変されている。実施例１−２及び１−３は連結箇所配列（第１連結エレメント）が２アミノ酸残基と短く、トリプシン耐性が更に向上している。

＜本発明の実施形態２の実施例＞
［作製例］
１）野生型プロテインＡ発現プラスミドの作製
５’側にｃａｔａｔｇ（ＮｄｅＩ）、３’側にｃｔｃｇａｇ（ＸｈｏＩ）を付加した野生型Ｃドメイン２量体（ＷＴ）をコードするＤＮＡ配列（配列番号６１）を化学合成した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（ともにＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて消化後、精製・回収を行った。
なお、配列番号６１はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＤＮＡ配列をもとに大腸菌発現用にコドン最適化を行って決定した。

タンパク質発現ベクターとして、Ｔ７プロモーターを持ち、マルチクローニングサイト下流に６ｘＨｉｓタグおよび終止コドンを持つベクターｐＥＴ２２ｂ（メルク社製）を選択した。ｐＥＴ２２ｂを制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（ともにＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて消化後、精製・回収を行った。

制限酵素処理した配列番号６１のＤＮＡ断片とｐＥＴ２２ｂベクターを、ＤＮＡリガーゼ（ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて連結し、ＷＴ発現ベクターを構築した。
ＷＴ発現ベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９（ＴａＫａＲａ社製）の形質転換を行い、定法によりプラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。

２）プロテインＡ変異体（Ｍｕｔ）発現プラスミド作製
野生型Ｃドメイン２量体のアミノ酸配列の一部に欠失および／または置換の変異を有するタンパク質 Ｍｕｔ１〜Ｍｕｔ１４をコードするＤＮＡ配列（配列番号９０〜１０３）を含む発現ベクターの作製を行った。Ｍｕｔ１〜１４発現ベクターは、表４に示す鋳型と合成オリゴヌクレオチドプライマーセット（配列番号６２〜８９）の組み合わせによりクイックチェンジ法（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて作製した。クイックチェンジ法はＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のプロトコルに従い実施した。

得られたＭｕｔ１〜１４発現ベクターはＪＭ１０９（ＴａＫａＲａ社製）を形質転換することによって定法により増幅および抽出した。
得られたＭｕｔ１〜１４発現ベクターのＤＮＡ配列の解析はＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。発現ベクターのシークエンシングＰＣＲ反応はＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ．１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、付属プロトコルに従って行った。得られたシークエンシングＰＣＲ産物は定法により精製し、ＤＮＡ配列解析に用いた。
本実施によって得られたＭｕｔ１〜１４発現ベクターのうち、発現タンパク質をコードするＤＮＡ配列は配列番号９０〜１０３で示される通りであった。

３）タンパク質の発現
Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（メルク社製）を、上記１）および２）で得られたＷＴ、Ｍｕｔ１〜１４発現ベクターで形質転換し、目的タンパク質であるＷＴ、Ｍｕｔ１〜１４をそれぞれ発現する形質転換体を得た。形質転換法はメルク社プロトコルに従った。
目的タンパク質を発現する形質転換体を５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で終夜培養して前培養液を得た。得られた前培養液１０ｍＬを５００ｍＬ ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン含有）に植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍでＯＤ６００≒０．６〜０．８になるまで培養した。イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、さらに培養を４時間継続した。培養終了後、遠心にて集菌した。

４）タンパク質の回収
上記３）で集菌した菌体を５０ｍＬの懸濁バッファー（５０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離して、上清画分と沈殿画分とに分画した。上清画分を懸濁バッファーで平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ５ｍＬカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に供し、平衡化バッファーで洗浄後、溶出バッファー（１７５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて目的タンパク質を溶出した。溶出された目的タンパク質を透析にて脱塩水に置換した。目的タンパク質はＡｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ １０Ｋ（メルクミリポア社製）を用いて約３０〜４０ｍｇ／ｍＬの濃度まで遠心濃縮した。濃縮後の目的タンパク質はＰＢＳバッファーを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。
精製終了後の目的タンパク質をＴｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｅ・パジェル Ｒ１５Ｓ；ＡＴＴＯ社製）に供し、分子量約１４０００Ｄａの位置にシングルバンドを確認した。ＷＴ発現ベクターを用いて得られた目的タンパク質は配列番号１０４のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、Ｍｕｔ１〜１４発現ベクターを用いて得られた目的タンパク質は、それぞれ、配列番号１０５〜１１８のアミノ酸配列を有するタンパク質であった。
ＷＴの連結エレメント（第２連結エレメント）近傍の配列、およびＭｕｔ１〜１４の変異連結エレメント（第２連結エレメント）近傍の配列を表５に示す。Ｃドメインの２量体のうち、Ｄ５８で示される位置のアミノ酸が１つ目のドメインのＣ末端であり、Ｄ１’で示される位置のアミノ酸が２つ目のドメインのＮ末端である。また「／（斜線）」はアミノ酸の欠失を表す。

［実施例２−１］
＜プロテアーゼ耐性評価＞
１）プロテアーゼであるサーモリシンへの耐性を以下の方法で評価した。
作製例で得られたＭｕｔ１のタンパク質とサーモリシンとを混合し、３７℃で１５分間加熱した。配合量は以下の通りである。
・作製例１のタンパク質（２ｍｇ／ｍＬ、リン酸バッファー） １０μＬ
・希釈用バッファー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＣａＣｌ_２） ２μＬ
・純水 ６μＬ
・サーモリシン溶液（１ｍｇ／ｍＬ） ２μＬ
次に、電気泳動用の希釈液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２００ｍＭ ＤＴＴ、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０１２％ブロモフェノールブルー；２ｘＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）を、得られた混合液に２０μＬ添加した。そのうち１０μＬをサンプルとして、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を実施した。比較として、サーモリシンを添加していない混合液の同量を同じゲル上にて電気泳動を実施した。
電気泳動後のゲルを染色し、サーモリシン処理前後でのタンパク質の分解の有無を染色度により比較評価した。染色度とは電気泳動により得られた染色バンドの位置および強度をいう。
サーモリシン処理前に比べてほとんど分解していないもの（染色度が９０％以上維持）を◎、分解が少ないもの（染色度が７０％以上９０％未満を維持）を○、分解が多いもの（染色度が３０％以上７０％未満を維持）を△、ほとんど分解しているもの（染色度が３０％未満）を×とした。
結果を表６に示した。

２）プロテアーゼであるトリプシンへの耐性を以下の方法で評価した。
サーモリシン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をトリプシン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に変更した以外は、サーモリシン耐性への評価と同様にして評価した。結果を表６に示した。

３）プロテアーゼであるプラスミンへの耐性を以下の方法で評価した。
サーモリシン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をプラスミン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）に変更した以外は、サーモリシン耐性への評価と同様にして評価した。結果を表６に示した。

＜免疫グロブリンの吸着能評価（ＳＢＣ）＞
作製例で得られたＭｕｔ１のタンパク質を、エポキシ基で活性化された多孔質アクリルビーズ１ｍＬに対し３ｍｇ固定化してアフィニティ分離剤とし、免疫グロブリンとの結合能を評価した。常法に従い、分離剤との静的な吸着容量を評価した。
結果を表６に示した。

［実施例２−２〜２−１１、比較例２−１〜２−４］
Ｍｕｔ１のタンパク質の代わりに、作製例で得られたＭｕｔ２〜１１を実施例２−２〜２−１１に、ＷＴを比較例２−１に、Ｍｕｔ１２〜１４を比較例２−２〜２−４に用いたこと以外は実施例２−１と同様にして、プロテアーゼ耐性評価と免疫グロブリンの吸着能評価を実施した。
結果を表６に示した。

連結エレメント（第２連結エレメント）を変異させていない比較例２−１はサーモリシン耐性が低いのに対し、変異連結エレメント（変異第２連結エレメント）を有する実施例２−１〜２−１１は、サーモリシン耐性が高く、且つ結合能も高く維持されている。比較例２−２及び２−３は連結エレメント（第２連結エレメント）の１位の疎水性アミノ酸を欠失しているものの５位の疎水性アミノ酸を有するためサーモリシン耐性が低い。比較例２−４は連結エレメント（第２連結エレメント）の１位及び５位の疎水性アミノ酸を欠失しているためサーモリシン耐性が高いものの、連結エレメント（第２連結エレメント）のアミノ酸数が１より少ないため結合能が低下している。

本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１５年２月５日付で出願された日本特許出願（特願２０１５−０２１５７７）、および２０１５年２月５日付で出願された日本特許出願（特願２０１５−０２１５７８）に基づいており、その全体が引用により援用される。

本発明によれば、プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼやサーモリシンに耐性を有し、免疫グロブリンとの結合能力を有するタンパク質を提供することができるので、免疫グロブリンとの結合能力に優れたアフィニティリガンドや耐久性に優れたアフィニティ分離剤を製造する際に本発明のタンパク質を用いることができる。

１ ドメイン
２ 第１または第２連結エレメント
３ 担体表面
４ 固定化用タグ

Claims (24)

1. 配列番号１〜３に記載のプロテインＡのＥ、ＤおよびＡドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列において、１以上のリジンを含み、各ドメインのＣ末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を連結箇所配列とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列のＣ末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、プロテアーゼに耐性を有し、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
2. 配列番号４〜６に記載のプロテインＡのＢ、ＣおよびＺドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列において、１以上のリジンを含み、各ドメインのＣ末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を連結箇所配列とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列のＣ末端のリジンおよび４位のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、プロテアーゼに耐性を有し、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
3. 前記欠失または置換されている４位のリジンおよび／またはＣ末端のリジンのうち、該４位のリジンおよび／または該Ｃ末端のリジンが欠失している、請求項１または２に記載のタンパク質。
4. 少なくとも一つの前記連結箇所配列は１以上のアミノ酸からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
5. 前記欠失または置換されている４位のリジンおよび／またはＣ末端のリジンのうち、該４位のリジンおよび／または該Ｃ末端のリジンを親水性アミノ酸で置換したものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
6. すべての連結箇所配列において、リジンが欠失または置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
7. 少なくとも一つの前記連結箇所配列はリジンを含まないものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
8. 少なくとも一つの前記連結箇所配列はアルギニンを含まないものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
9. 配列番号３〜６に記載のプロテインＡのＡ、Ｂ、ＣおよびＺドメインのいずれかに由来するドメインを２つ以上有するタンパク質であって、各ドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列を連結エレメントとした場合、少なくとも一つの連結エレメントは、１以上のアミノ酸からなり、かつ、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸により構成される変異連結エレメントであることを特徴とする、プロテアーゼに耐性を有し、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
10. 前記変異連結エレメントが、Ａ、Ｂ、またはＣドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、少なくとも一つの変異連結エレメントのアミノ酸配列における１位のアラニンおよび／または５位のフェニルアラニンを欠失したものである、請求項９に記載のタンパク質。
11. 前記変異連結エレメントが、Ｚドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、少なくとも一つの変異連結エレメントのアミノ酸配列における１位のバリンおよび／または５位のフェニルアラニンを欠失したものである、請求項９に記載のタンパク質。
12. 前記変異連結エレメントが、Ａ、Ｂ、またはＣドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、少なくとも一つの変異連結エレメントのアミノ酸配列における１位のアラニンおよび／または５位のフェニルアラニンを疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換したものである、請求項９または１０に記載のタンパク質。
13. 前記変異連結エレメントが、Ｚドメインのアミノ酸配列における１位から５位までの配列からなり、少なくとも一つの変異連結エレメントのアミノ酸配列における１位のバリンおよび／または５位のフェニルアラニンを疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換したものである、請求項９または１１に記載のタンパク質。
14. 前記変異連結エレメントで置換する疎水性アミノ酸以外のアミノ酸が、親水性アミノ酸である、請求項１２または１３に記載のタンパク質。
15. 少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列におけるＣ末端のリジンを欠失または置換したものである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質。
16. Ｃ末端側に前記変異連結エレメントを結合するドメインにおいて、該ドメインのアミノ酸配列におけるＣ末端のリジンを欠失または置換したものである、請求項１５に記載のタンパク質。
17. 少なくとも一つの変異連結エレメントはリジンを含まないものである、請求項９〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
18. 少なくとも一つの変異連結エレメントはアルギニンを含まないものである、請求項９〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
19. 少なくとも一つの変異連結エレメントが２以上のアミノ酸からなる、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のタンパク質。
20. すべての連結エレメントが変異連結エレメントである、請求項９〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質。
21. ドメインを３つ以上有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
22. 前記タンパク質に含まれるドメインのすべてが、配列番号１〜６に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＺドメインのアミノ酸配列のいずれか１種類に由来する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
23. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載のタンパク質をアフィニティリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティ分離剤。
24. 請求項２３に記載のアフィニティ分離剤を含み、少なくとも１つの該アフィニティ分離剤が充填される容器を備えることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用カラム。

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