CN107428807A - 对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质和使用它的亲和分离剂、液相色谱柱 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供对丝氨酸蛋白酶或者嗜热菌蛋白酶具有耐性且具有免疫球蛋白结合活性、可适合作为亲和配体使用的蛋白质。本发明的一个实施方式是具有2个以上的来源于蛋白A的E、D和A结构域的氨基酸序列中的任一个的结构域、在该结构域的至少一个氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且C末端的赖氨酸缺失或者被替换的、对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质;或者具有2个以上的来源于蛋白A的B、C和Z结构域中的任一个的结构域、在该结构域的至少一个氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸缺失或者被替换的、对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及与免疫球蛋白特异性结合的蛋白质和以该蛋白质为免疫球蛋白结合性亲和配体的亲和分离剂、以及液相色谱柱。
背景技术
抗体具有与被称为抗原的物质特异性结合的功能和与其它的生物体分子、细胞协同地将具有抗原性的因子去毒·除去的功能。抗体这个名称是强调这种与抗原结合的功能的名字,作为物质,被称为“免疫球蛋白”。
近年来,随着基因工程、蛋白质工程和细胞工程的发展,被称为抗体药物的利用抗体所具有的功能的医药品的开发盛行。由于与现有的药物相比,抗体药物更加特异性地作用于靶分子,所以预期副作用更少,且得到好的治疗效果,实际上有助于各种病症的改善。
另一方面,由于抗体药物被大量给予生物体,所以与其它的重组蛋白质药品相比时,可以说其纯度对品质的影响大。因此,为了制造纯度高的抗体,一般采用利用吸附材料的亲和色谱等方法,该吸附材料以与抗体特异性结合的分子为配体。
作为抗体药物开发的基本上是单克隆IgG抗体,采用重组培养细胞技术等大量生产,利用对IgG抗体具有亲和性的蛋白质进行纯化。
作为对IgG抗体具有亲和性的免疫球蛋白结合性蛋白质,熟知有蛋白A。蛋白A是由革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生产的细胞壁蛋白质的1种,由信号序列S、5个免疫球蛋白结合性结构域(E结构域、D结构域、A结构域、B结构域、C结构域)和细胞壁结合结构域即XM区域构成(非专利文献1)。在抗体药物制造工序的初始纯化工序(捕获工序)中,一般利用将蛋白A作为配体固定于水不溶性担载体而得的亲和色谱柱。
为了改进该亲和色谱柱的性能,近年来,进行了与作为配体的蛋白A有关的各种开发,尝试了使用蛋白质工程性地加入了改变的重组蛋白A。
例如,作为重组蛋白A,已知有除去了无免疫球蛋白结合活性的XM区域的蛋白A(rProtein A Sepharose(注册商标)、GE HealthCare Japan公司制)、专利文献1公开的具有向B结构域导入了变异而得的修饰结构域即Z结构域的蛋白A等。
Z结构域是对B结构域导入了将第29位的甘氨酸替换成丙氨酸的变异而得的修饰结构域,与B结构域相比耐碱性高。如此,为了提高配体功能,开发了耐碱性提高的重组蛋白A、能够使抗体在弱酸性时溶出的重组蛋白A。
在专利文献2中,为了提高耐碱性,公开了包含蛋白A的C、B、Z结构域的N末端3~5个连续的氨基酸缺失的亲和色谱配体。
在专利文献3中,为了提高碱稳定性,公开了具有蛋白A的结构域C单元的3位~6位的Asn-Lys-Phe-Asn缺失的序列的亲和色谱配体。
在专利文献4中,为了提高耐碱性,公开了将蛋白A的B、Z结构域的3位和6位的天冬酰胺替换成其它的氨基酸的免疫球蛋白结合蛋白质。
在专利文献5中,为了能以弱酸性使抗体脱离,公开了在蛋白A的E、D、A、B、C结构域中不含赖氨酸和半胱氨酸残基的序列的抗体识别结合蛋白质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利第5143844号说明书
专利文献2:日本特开2012-254981号公报
专利文献3:日本特表2010-504754号公报
专利文献4:日本特表2005-538693号公报
专利文献5:日本特开2013-256484号公报
非专利文献
非专利文献1:Hober S.et.al,J.Chromatogr.B.,2007,Vol.848,p.40-47
发明内容
经过本发明人等的研究,首次发现了如下问题:由于制造重组蛋白A时使用的宿主微生物所产生的蛋白酶或将由重组培养细胞生产的IgG抗体纯化时的培养细胞所产生的蛋白酶的作用,作为配体的蛋白A被切断,免疫球蛋白结合活性大幅降低。
明确了特别是在从培养液纯化重组蛋白A的工序中提高pH使其吸附或流经离子交换树脂的时刻,另外在纯化前或纯化后进行浓缩、脱盐等工序的时刻,以及利用固定了重组蛋白A的分离剂进行从含有免疫球蛋白的培养液纯化免疫球蛋白的工序的时刻,蛋白酶所致的切断成为显著的问题。
作为上述蛋白酶之一,有丝氨酸蛋白酶。专利文献1~4所公开的重组蛋白A没有丝氨酸蛋白酶耐性,作为亲和色谱柱的配体使用存在问题。
另外,根据本发明人等的研究,新发现了专利文献5中公开的不含赖氨酸和半胱氨酸的重组蛋白A存在如下问题:免疫球蛋白结合活性不充分,特别是多聚体化时与野生型相比免疫球蛋白结合活性低,终究无法充分发挥作为亲和色谱柱的配体的功能。
另外,作为产生上述问题的其它的蛋白酶,有嗜热菌蛋白酶。嗜热菌蛋白酶是来源于芽孢杆菌属细菌的金属蛋白酶,在温度高的环境、pH高的环境下活性高。由于专利文献1、3~5中公开的重组蛋白A没有嗜热菌蛋白酶耐性,所以无法以完好的形态回收蛋白质,作为亲和色谱柱的配体使用存在问题。
另外,根据本发明人等的研究,新发现了专利文献2中公开的重组蛋白A虽包含具有嗜热菌蛋白酶耐性的蛋白,但存在免疫球蛋白结合活性降低,终究无法充分发挥作为亲和色谱柱的配体的功能这样的课题。
因此,本发明的课题在于提供对蛋白酶具有耐性且具有充分的免疫球蛋白结合活性、可适合作为亲和配体使用的蛋白质。
特别地,本发明的第1课题在于提供对蛋白酶中特别是丝氨酸蛋白酶具有耐性且具有充分的免疫球蛋白结合活性、可适合作为亲和配体使用的蛋白质。
另外,本发明的第2课题在于提供对蛋白酶中特别是嗜热菌蛋白酶具有耐性且具有充分的免疫球蛋白结合活性、可适合作为亲和配体使用的蛋白质。
本发明人等为了解决上述第1课题进行了深入研究,结果发现在蛋白A的特定结构域的氨基酸序列中,连接结构域与结构域的区域不含赖氨酸时丝氨酸蛋白酶耐性提高,从而完成了本发明。
另外,本发明人等为了解决上述第2课题进行了深入研究,结果发现在蛋白A的特定结构域的氨基酸序列中,连接结构域与结构域的区域不含疏水性氨基酸时嗜热菌蛋白酶耐性提高,从而完成了本发明。
即,上述课题通过以下的构成来实现。
[1]一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质,其特征在于,具有2个以上来源于序列号1~3记载的蛋白A的E、D和A结构域中任一个的结构域,在该结构域的至少一个氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且C末端的赖氨酸缺失或者被替换。
[2]-(1)一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质,其特征在于,具有2个以上来源于序列号4~6记载的蛋白A的B、C和Z结构域中任一个的结构域,在该结构域的至少一个氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸缺失或者被替换。
[2]-(2)一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质,其特征在于,具有2个以上来源于序列号4~6记载的蛋白A的B、C和Z结构域中任一个的结构域,在该结构域的至少一个氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列(第1连接元件)时,至少一个该连接位置序列(第1连接元件)的C末端的赖氨酸和第4位的赖氨酸缺失或者被替换。
[3]根据[1]或[2]所述的蛋白质,其中,在上述缺失或者被替换的第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸中,该第4位的赖氨酸和/或该C末端的赖氨酸缺失。
[4]根据[1]~[3]中任一项所述的蛋白质,其中,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列(第1连接元件)时,至少一个该连接位置序列(第1连接元件)由1个以上的氨基酸构成。
[5]根据[1]~[4]中任一项所述的蛋白质,其中,在上述缺失或者被替换的第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸中,用亲水性氨基酸替换该第4位的赖氨酸和/或该C末端的赖氨酸。
[6]根据[1]~[5]中任一项所述的蛋白质,其中,具有3个以上的结构域。
[7]根据[1]~[6]中任一项所述的蛋白质,其中,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列(第1连接元件)时,在全部的连接位置序列(第1连接元件)中,赖氨酸缺失或者被替换。
[8]根据[1]~[7]中任一项所述的蛋白质,其中,上述蛋白质所包含的全部结构域来源于序列号1~6记载的蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域的氨基酸序列中任1种。
[9]根据[1]~[8]中任一项所述的蛋白质,其中,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列(第1连接元件)时,该连接位置序列(第1连接元件)不含赖氨酸。
[10]根据[1]~[9]中任一项所述的蛋白质,其中,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列(第1连接元件)时,该连接位置序列(第1连接元件)不含精氨酸。
[11]一种亲和分离剂,其特征在于,将[1]~[10]中任一项所述的蛋白质作为亲和配体,固定于由水不溶性的基材构成的担载体。
[12]一种液相色谱柱,其特征在于,包括[11]所述的亲和分离剂,具备至少一个容器。
[13]一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质,其特征在于,具有2个以上来源于序列号3~6记载的蛋白A的A、B、C和Z结构域中任一个的结构域,将各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接元件(第2连接元件)时,至少一个连接元件(第2连接元件)是由1个以上的氨基酸构成且由疏水性氨基酸以外的氨基酸构成的变异连接元件(变异第2连接元件)。
[14]根据[13]所述的蛋白质,其中,上述变异连接元件(变异第2连接元件)由A、B或者C结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成,缺失了第1位的丙氨酸和/或第5位的苯丙氨酸。
[15]根据[13]所述的蛋白质,其中,上述变异连接元件(变异第2连接元件)由Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成,缺失了第1位的缬氨酸和/或第5位的苯丙氨酸。
[16]根据[13]或[14]所述的蛋白质,其中,上述变异连接元件(变异第2连接元件)由A、B或者C结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成,用疏水性氨基酸以外的氨基酸替换了第1位的丙氨酸和/或第5位的苯丙氨酸。
[17]根据[13]或[15]所述的蛋白质,其中,上述变异连接元件(变异第2连接元件)由Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成,用疏水性氨基酸以外的氨基酸替换了第1位的缬氨酸和/或第5位的苯丙氨酸。
[18]根据[16]或[17]所述的蛋白质,其中,在上述变异连接元件(变异第2连接元件)中替换的疏水性氨基酸以外的氨基酸为亲水性氨基酸。
[19]根据[13]~[18]中任一项所述的蛋白质,其中,上述变异连接元件(变异第2连接元件)由2个以上的氨基酸构成。
[20]根据[13]~[19]中任1项所述的蛋白质,其中,具有3个以上的结构域。
[21]根据[13]~[20]中任一项所述的蛋白质,其中,全部的连接元件(第2连接元件)为变异连接元件(变异第2连接元件)。
[22]根据[13]~[21]中任一项所述的蛋白质,其中,上述蛋白质所包含的全部结构域来源于序列号3~6记载的蛋白A的A、B、C和Z结构域的氨基酸序列中任1种。
[23]根据[13]~[22]中任一项所述的蛋白质,其中,缺失或者替换了至少一个结构域的氨基酸序列中的C末端的赖氨酸。
[24]根据[23]所述的蛋白质,其中,在C末端侧结合上述变异连接元件(变异第2连接元件)的结构域中,缺失或者替换了该结构域的氨基酸序列中的C末端的赖氨酸。
[25]根据[13]~[24]中任一项所述的蛋白质,其中,上述变异连接元件(变异第2连接元件)不含赖氨酸。
[26]根据[13]~[25]中任一项所述的蛋白质,其中,上述变异连接元件(变异第2连接元件)不含精氨酸。
[27][13]~[26]中任一项所述的蛋白质的制造方法,使用包含编码[13]~[26]中任一项所述的蛋白质的DNA的载体,转化短芽孢杆菌属细菌,进行培养,由此制造蛋白质。
[28]一种亲和分离剂,其特征在于,将[13]~[26]中任一项所述的蛋白质作为亲和配体,固定于由水不溶性的基材构成的担载体。
[29]一种液相色谱柱,其特征在于,包括[28]所述的亲和分离剂,具备至少一个填充该亲和分离剂的容器。
根据本发明的实施方式,能够提供对特定的蛋白酶具有耐性且具有充分的免疫球蛋白结合活性的蛋白质。通过使用这样的本发明的蛋白质,能够制造免疫球蛋白结合活性优异的亲和配体、耐久性优异的亲和分离剂。
特别是根据本发明的第1实施方式,能够提供对蛋白酶、特别是丝氨酸蛋白酶具有耐性且具有充分的免疫球蛋白结合活性的蛋白质。通过使用这样的本发明的蛋白质,能够制造免疫球蛋白结合活性优异的亲和配体、耐久性优异的亲和分离剂。
另外,根据本发明的第2实施方式,能够提供对蛋白酶、特别是嗜热菌蛋白酶具有耐性且具有与免疫球蛋白结合的能力的蛋白质。通过使用这样的本发明的蛋白质,能够制造与免疫球蛋白结合的能力优异的亲和配体、耐久性优异的亲和分离剂。
附图说明
图1是葡萄球菌(Staphylococcus)的蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域的氨基酸序列比较表。应予说明,“-(连字符)”表示与C结构域的氨基酸残基相同,“/(斜线)”表示氨基酸缺失。
图2是以四聚体的蛋白质为配体固定于担载体且没有形成非固定结构域时的示意图。
图3中的(A)~(C)是以四聚体的蛋白质为配体固定于担载体且存在1个以上的非固定结构域时的示意图。
图4中的(A)、图4中的(B)是以四聚体的蛋白质为配体固定于担载体且存在1个以上的非固定结构域时的示意图。
图5中的(A)、图5中的(B)是以四聚体的蛋白质为配体固定于担载体且导入固定用标签形成与担载体的结合、全部的结构域为非固定结构域时的示意图。
具体实施方式
以下,对本发明的实施方式进行详细说明。
应予说明,本发明的实施方式涉及对特定的蛋白酶具有耐性且具有充分的免疫球蛋白结合活性的蛋白质。
本发明的第1实施方式涉及对蛋白酶、特别是丝氨酸蛋白酶具有耐性且具有充分的免疫球蛋白结合活性的蛋白质。
另外,本发明的第2实施方式涉及对蛋白酶、特别是嗜热菌蛋白酶具有耐性且具有与免疫球蛋白结合的能力的蛋白质。
应予说明,本说明书中,“蛋白质”这个术语是指包括具有多肽结构的所有分子,片断化的或者利用肽键连接的多肽链也包含在“蛋白质”这个术语中。
另外,“结构域”是蛋白质的高级结构上的单位,由数十到数百的氨基酸残基序列构成,是足以呈现一些物理化学或者生物化学的功能的蛋白质的单位。
[本发明的第1实施方式]
<蛋白质>
本发明的第1实施方式中的第1方式的蛋白质其特征在于,具有2个以上来源于序列号1~3记载的蛋白A的E、D和A结构域中任一个的结构域,在该结构域的至少一个结构域的氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且C末端的赖氨酸缺失或者被替换。
本发明的第1实施方式中的第2方式的蛋白质其特征在于,具有2个以上来源于序列号4~6记载的蛋白A的B、C和Z结构域中任一个的结构域,在该结构域的至少一个结构域的氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸缺失或者被替换。
本发明的第1实施方式中的第3方式的蛋白质其特征在于,具有2个以上来源于序列号4~6记载的蛋白A的B、C和Z结构域中任一个的结构域,在该结构域的至少一个结构域的氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列(第1连接元件)时,至少一个该连接位置序列(第1连接元件)的C末端的赖氨酸和第4位的赖氨酸缺失或者被替换。
以下,在本说明书中,将本发明的第1实施方式中的第1方式、第2方式和第3方式的蛋白质统称为本发明的第1实施方式的蛋白质。
蛋白A是以5个免疫球蛋白结合性结构域连接的形式构成的蛋白质。多种微生物表达蛋白A,作为表达蛋白A的微生物,例如可举出葡萄球菌(Staphylococcus)。
序列号1~6记载的蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域是能够与免疫球蛋白的互补决定区(CDR)以外的区域结合的免疫球蛋白结合性蛋白质,任一结构域均能与免疫球蛋白的Fc区域、Fab区域和Fab区域中的特别是Fv区域这样的各区域结合。
如图1的序列比较表所示,来源于蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域具有彼此相同性高的氨基酸序列,具有60%以上的氨基酸序列同源性。应予说明,连字符(-)表示与C结构域的氨基酸残基相同。
“来源于蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域中任一个的结构域”是指具有如下氨基酸序列的结构域,该氨基酸序列来源于野生型的各结构域的氨基酸序列,只要能编码具有与Fc区域结合的能力的蛋白质,则可以向野生型的各结构域的氨基酸序列中导入后述的变异连接位置序列(变异第1连接元件)以外的变异。
换言之,蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域中任一个的氨基酸序列是导入变异前的氨基酸序列(野生型氨基酸序列),而“来源于蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域中任一个的结构域”的氨基酸序列是指E、D、A、B、C和Z结构域的野生型氨基酸序列本身、或者在野生型氨基酸序列中包含后述的变异连接位置序列(变异第1连接元件)和/或经过部分的氨基酸的替换、插入、缺失和化学修饰而被改变的氨基酸序列。
这里,蛋白A的Z结构域是向B结构域导入A1V和G29A这样的变异而得到的,是天然的蛋白A中不存在的结构域,但本说明书中,将序列号6表示的氨基酸序列称为Z结构域的野生型氨基酸序列。
本说明书中,氨基酸序列中的特定氨基酸的位置是将野生型氨基酸序列的N末端作为第1位依次编号进行确定的。通常,将各结构域的氨基酸序列的N末端作为第1位。从蛋白A的B、C和Z结构域的N末端开始第4个氨基酸即第4位为赖氨酸。这里,如图1所示,E结构域作为以与其它的结构域相同性高的区域为基准、第1位和第2位的氨基酸残基缺失的结构域来对待。另外,如图1所示,D结构域作为以与其它的结构域相同性高的区域为基准、插入了从N末端数的第3个~第5个氨基酸残基的结构域来对待。
本说明书中,关于氨基酸,没有用其正式名称记载时,用惯用的一个字符简称来表示。另外,关于替换氨基酸的变异的表述,在替换位置的编号前标注野生型或者非变异型的氨基酸,在替换位置的编号后标注变异了的氨基酸来进行表述。例如,将29位的甘氨酸(Gly)替换成丙氨酸(Ala)的变异记载为G29A。
本发明的第1实施方式的蛋白质是将上述的“来源于蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域中任一个的结构域”作为单结构域而具有2个以上的多聚体蛋白质(多结构域型蛋白质)。优选为3个以上,更优选为4个以上,优选为10个以下,更优选为8个以下,进一步优选为6个以下。
这些多聚体蛋白质可以是单一的免疫球蛋白结合性结构域的连接体即同源二聚体、同源三聚体等同源多聚体,也可以是种类不同的免疫球蛋白结合性结构域的连接体即异源二聚体、异源三聚体等异源多聚体。优选是本发明的第1实施方式的蛋白质所包含的全部结构域来源于序列号1~6记载的蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域中任1种的同源多聚体。
对于本发明的第1实施方式中的蛋白质而言,2个以上的结构域的C末端与N末端连接,构成了连接位置序列(第1连接元件)。这里,本说明书中“连接位置序列(第1连接元件)”是指各结构域的氨基酸序列中的C末端的赖氨酸和与其连接的N末端的第1位~第5位的序列。
换言之,2个结构域连接的位置的C末端侧的1个氨基酸残基和N末端侧的5个氨基酸残基的总计6个氨基酸残基的序列是连接位置序列(第1连接元件)。这里,N末端侧的氨基酸序列是以在B、C、Z中被保留的氨基酸序列为基准指该序列的5个氨基酸残基。
由此,如图1所示,由于E结构域是在作为基准的N末端侧的序列中从N末端缺失了2个氨基酸残基而得的序列,所以包含E结构域的情况下,连接位置序列(第1连接元件)是指C末端侧的1个氨基酸残基和N末端侧的3个氨基酸残基的总计4个氨基酸残基的序列。
另外,如图1所示,由于D结构域是在作为基准的N末端侧的序列中插入了()表示的3个氨基酸残基而得的序列,所以本蛋白质包含D结构域的情况下,成为在结构域间的连接部分包含C末端侧的1个氨基酸残基和N末端侧的8个氨基酸残基的总计9个氨基酸残基。其中,认为在D结构域的N末端侧插入的“AQQ”这3个氨基酸残基对本发明的效果没有特别影响,所以在本说明书中以在B、C、Z中被保留的氨基酸序列为基准,连接位置序列(第1连接元件)所包含的D结构域的N末端的第1位~第5位的氨基酸序列是指下述所示的5个氨基酸残基。
n聚体蛋白质中存在n-1个连接位置序列(第1连接元件)。
如图1所示,蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域中任一个的C末端都为赖氨酸(K)。因此,上述的连接位置序列(第1连接元件)中必然包含赖氨酸(K)。
另外,以下所示的序列是蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列。E结构域不存在第1位和第2位的氨基酸残基,由3个氨基酸构成,不含赖氨酸(K)。D、A、B、C和Z结构域中的任一个序列均由5个氨基酸构成,D、A结构域不含赖氨酸(K),B、C和Z结构域在第4位包含赖氨酸(K)。
本发明的第1实施方式中的第1和第3方式的蛋白质,其特征在于,至少一个连接位置序列(第1连接元件)是经过部分的氨基酸的替换、插入、缺失和化学修饰而改变的变异连接位置序列(变异第1连接元件),是不含存在于野生型氨基酸序列的赖氨酸的氨基酸序列。变异连接位置序列(变异第1连接元件)优选不含赖氨酸(K),更优选为由赖氨酸(K)和精氨酸(R)以外的氨基酸构成的序列,优选由1个以上的氨基酸构成。
另一方面,本发明的第1实施方式中的第2方式的蛋白质,其特征在于,在至少一个B、C和Z结构域的氨基酸序列中,第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸缺失或者被替换。因此,通过将多个该结构域连接起来而构成第3方式的变异连接位置序列(变异第1连接元件)。此外,位于蛋白质的N最末端侧或者C最末端侧的结构域是该结构域的情况下,末端部分不形成变异连接位置序列,但在后述的亲和配体固定于担载体而得到的亲和分离剂中,通过将蛋白质的该结构域的N末端侧或者C末端侧固定于担载体,能够稳定地维持蛋白质与担载体的结合和被固定的结构域与其它的结构域的结合。
这里,在本发明的第1实施方式中“变异”是指对野生型氨基酸序列进行的经过部分的氨基酸的替换、插入、缺失和化学修饰而带来的改变,“变异连接位置序列(变异第1连接元件)”是指在野生型氨基酸序列的连接位置序列(第1连接元件)中插入了特定的“变异”而得的序列。另外,“变异结构域”是指在各结构域的野生型氨基酸序列中插入了特定的“变异”而得的结构域。
本发明的第1实施方式中的第1和第3方式的蛋白质所包含的连接位置序列(第1连接元件)中至少一个为变异连接位置序列(变异第1连接元件)即可,但三聚体以上的蛋白质的情况下优选2个以上为变异连接位置序列(变异第1连接元件),n聚体蛋白质的情况下更优选n-1个为变异连接位置序列(变异第1连接元件),换言之更优选全部的连接位置序列(第1连接元件)为变异连接位置序列(变异第1连接元件)。
因此,对于本发明的第1实施方式的蛋白质而言,优选在全部的连接位置序列(第1连接元件)中,赖氨酸缺失或者被替换。
在后述的亲和分离剂中,为了使固定于担载体的配体不被蛋白酶切断,优选本发明的第1实施方式的蛋白质中的N最末端侧的结构域的第4位的赖氨酸或者C最末端侧的C末端的赖氨酸缺失或者被替换。
因此,在本发明的第1实施方式中的第2方式的蛋白质所包含的结构域中,至少一个为第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸缺失或者被替换的结构域(变异结构域)即可,但优选蛋白质的N最末端侧的结构域或者C最末端侧的结构域为变异结构域,优选后述的固定结构域为变异结构域。另外,三聚体以上的蛋白质的情况下,优选固定结构域和与其连接的2个以上为变异结构域,n聚体蛋白质的情况下,优选固定结构域和与其连接的n-2个以上的结构域为变异结构域,最优选全部的结构域为变异结构域。
连接位置序列(第1连接元件)由各结构域的氨基酸序列中的C末端的1个氨基酸残基和第1位~第5位的序列构成,通过替换、插入、缺失和化学修饰对该序列进行改变,优选由1个以上的氨基酸构成,优选为由赖氨酸(K)和精氨酸(R)以外的氨基酸构成的序列。
根据本发明人等的研究,清楚了容易被胰蛋白酶、纤溶酶等丝氨酸蛋白酶切断的位置是连接位置序列(第1连接元件)中的野生型氨基酸序列中存在的特定的位置的赖氨酸(K)的C末端侧。由此发现如果成为由不包含连接位置序列(第1连接元件)中存在的特定的赖氨酸(K)这样的氨基酸构成的变异连接位置序列(变异第1连接元件),则能够明显抑制蛋白质被丝氨酸蛋白酶切断。
具体而言,通过将野生型氨基酸序列的连接位置序列(第1连接元件)中的K缺失和/或替换能够制成变异连接位置序列(变异第1连接元件)。优选形成由K以外的氨基酸构成的变异连接位置序列(变异第1连接元件),更优选形成由K和R以外的氨基酸构成的变异连接元件。
此外,根据本发明人等的研究,发现在野生型氨基酸序列的连接位置序列(第1连接元件)以外存在的K和R不易被丝氨酸蛋白酶切断,因此不仅也可以存在于本发明的第1实施方式的蛋白质的各结构域,而且为了使本发明的第1实施方式的蛋白质具有充分的免疫球蛋白结合活性,有必要至少一个结构域中包含1个以上的赖氨酸。
对于在连接位置序列(第1连接元件)以外存在的赖氨酸,优选保留野生型氨基酸序列中的赖氨酸,优选保留2个以上,更优选为3个以上,最优选在与野生型氨基酸序列相同的位置包含4个赖氨酸。作为被保留的K,最优选保留第35位的赖氨酸。
虽然不清楚为了具有充分的免疫球蛋白结合活性而需要存在于连接位置序列(第1连接元件)以外的赖氨酸的理由,但认为野生型蛋白A的抗体识别部位附近的赖氨酸与抗体发生静电相互作用。由此,在不损害野生型蛋白A的抗体识别部位的功能的范围,也可以通过替换、插入等变异包含野生型氨基酸序列中不存在的赖氨酸,但优选不包含野生型氨基酸序列中不存在的赖氨酸。
以下,对变异连接位置序列(变异第1连接元件)的具体例进行说明。
使连接位置序列(第1连接元件)的氨基酸的一部分缺失而制成变异连接位置序列(变异第1连接元件)时,变异连接位置序列(变异第1连接元件)必须由1个以上的氨基酸构成。根据本发明人等的研究,可知连接位置序列(第1连接元件)所包含的6个氨基酸全部缺失时,作为目标的与免疫球蛋白的结合能力明显下降,如果使用该蛋白质作为亲和配体则与免疫球蛋白的结合能力不充分。
一般而言,免疫球蛋白比各结构域大,因结合的免疫球蛋白彼此的空间位阻导致能与各结构域结合的个数受限。因此,推测这是由于各结构域与免疫球蛋白结合时,如果不存在连接位置序列(第1连接元件)而相邻的结构域过近,则能结合免疫球蛋白的空间不足,每1个结构域的免疫球蛋白结合数降低。如果变异连接位置序列(第1连接元件)由优选为1个以上、更优选为2以上的氨基酸构成,则作为目标的与免疫球蛋白的结合能力有更加变高的趋势,因而优选。
对于本发明的第1实施方式中的第1方式的蛋白质而言,连接位置序列(第1连接元件)由蛋白A的任一结构域的C末端的赖氨酸(K)和E、D和A结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成。因此,野生型氨基酸序列的连接位置序列(第1连接元件)中包含1个K。因此,优选变异连接位置序列(变异第1连接元件)是使连接的结构域的C末端的赖氨酸(K)缺失而得到的。
例如,将2个蛋白A的A结构域连接成的连接位置序列(第1连接元件)制成变异连接位置序列(变异第1连接元件)时,作为优选的例子,可举出缺失了C末端的赖氨酸(K)而由丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、天冬酰胺(N)、苯丙氨酸(F)这5个氨基酸构成的序列,在C末端的K缺失的基础上还缺失第1位的A和第5位的F而由D、N、N这3个氨基酸构成的序列等。
对于本发明的第1实施方式中的第2、3的方式的蛋白质而言,连接位置序列(第1连接元件)由蛋白A的任一结构域的C末端的赖氨酸(K)和B、C和Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成。因此,野生型氨基酸序列的连接位置序列(第1连接元件)中包含C末端和第4位的2个K。因此,优选变异连接位置序列(第1连接元件)缺失连接的结构域的C末端的赖氨酸(K)和第4位的赖氨酸(K)。
例如,将2个蛋白A的B结构域连接成的连接位置序列(第1连接元件)制成变异连接位置序列(变异第1连接元件)时,作为优选的例予,可举出缺失了C末端的赖氨酸(K)和第4位的赖氨酸(K)这2个氨基酸而由丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、苯丙氨酸(F)这4个氨基酸构成的序列,在C末端的K和第4位的K缺失的基础上还缺失第1位的V和第5位的F而由D、N这2个氨基酸构成的序列等。另外,用后述的方法替换连接位置序列(第1连接元件)所包含的K中的某一个时,可以仅缺失C末端的K,也可以仅缺失第4位的K。
氨基酸的替换是指去掉原来的氨基酸,在相同的位置追加其它的氨基酸的变异。被追加的其它的氨基酸没有特别限定,例如可举出天然的蛋白质的构成氨基酸、蛋白质的非构成氨基酸、非天然氨基酸。其中,从基因工程的生产的观点考虑,可优选使用天然型氨基酸。
其中,替换连接位置序列(第1连接元件)的氨基酸而制成变异连接位置序列(变异第1连接元件)时,需要使变异连接位置序列(变异第1连接元件)成为不含赖氨酸(K)的序列。如果是进一步不含精氨酸(R)的序列,则对识别精氨酸的蛋白酶的耐性也提高,因而优选。
因此,作为通过替换被导入的氨基酸,只要为赖氨酸(K)和精氨酸(R)以外的氨基酸就没有特别限定,优选天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)等亲水性氨基酸;半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、蛋氨酸(M)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)等中性氨基酸中的任一个。其中,更优选亲水性氨基酸中的任一个。
此外,从提高碱性条件下的稳定性的观点考虑,优选天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)。
对于本发明的第1实施方式中的第1方式的蛋白质而言,野生型氨基酸序列的连接位置序列(第1连接元件)中包含1个K,优选变异连接位置序列(变异第1连接元件)是替换了连接的结构域的C末端的赖氨酸(K)而成的。
例如,将2个蛋白A的A结构域连接成的连接位置序列(第1连接元件)制成变异连接位置序列(变异第1连接元件)时,优选用赖氨酸(K)和精氨酸(R)以外的氨基酸替换C末端的赖氨酸(K)。
具体而言,作为优选的例子,可举出用天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)替换C末端的赖氨酸(K)而成的序列,用天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)替换C末端的K以及第1位的A和第5位的F而成的序列等。
对于本发明的第1实施方式中的第2方式的蛋白质而言,野生型氨基酸序列的连接位置序列(第1连接元件)中包含C末端和第4位的2个K,优选变异连接位置序列(变异第1连接元件)是替换了连接的结构域的C末端的赖氨酸(K)和第4位的赖氨酸(K)而成的。
例如,将2个蛋白A的B结构域连接成的连接位置序列(第1连接元件)制成变异连接位置序列(变异第1连接元件)时,优选用赖氨酸(K)和精氨酸(R)以外的氨基酸替换C末端的赖氨酸(K)和第4位的赖氨酸(K)。具体而言,作为优选的例子,可举出用天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)替换C末端的赖氨酸(K)和第4位的赖氨酸(K)而成的序列,用天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)替换C末端的K和第4位的K以及第1位的V和第5位的F而成的序列等。
另外,用上述的方法使连接位置序列(第1连接元件)所包含的某一个K缺失时,也可以仅替换C末端的K,或者仅替换第4位的K。
在变异连接位置序列(变异第1连接元件)中,在野生型氨基酸序列所包含的5个氨基酸的基础上可以插入追加的氨基酸序列。
在本发明的第1实施方式的蛋白质中,如果将C末端的赖氨酸(K)和/或第4位的赖氨酸(K)缺失或者替换而制成变异连接位置序列(变异第1连接元件),则能够提高对丝氨酸蛋白酶的耐性。此外在本发明的第1实施方式的蛋白质中,如果使末端的K和/或第4位的K缺失而制成由4个氨基酸构成的变异连接位置序列(变异第1连接元件),则能够进一步提高胰蛋白酶、纤溶酶等丝氨酸蛋白酶耐性,因而优选。
此外,虽然理由尚不确定,但如果除野生型氨基酸序列的连接位置序列(第1连接元件)中的K以外还缺失其它的几个氨基酸而制成由优选为3个、更优选为2个氨基酸构成的变异连接位置序列(变异第1连接元件),则丝氨酸蛋白酶耐性有进一步提高的趋势,因而优选。推测这是由于通过使连接位置序列(第1连接元件)变短,抑制与蛋白酶的物理接触。
本发明的第1实施方式的蛋白质除对丝氨酸蛋白酶具有耐性以外,还可以对其它的蛋白酶具有耐性。例如,变异连接位置序列(变异第1连接元件)由疏水性氨基酸以外的氨基酸构成时,对嗜热菌蛋白酶具有耐性,因而优选。
向变异结合位置序列(变异第1连接元件)以外导入的氨基酸序列的改变没有特别限定,只要与具有野生型氨基酸序列的蛋白质相比,对免疫球蛋白的Fab区域的亲和性同等或者其以上地降低,且对免疫球蛋白具有亲和性即可。
变异结合位置序列(变异第1连接元件)以外的部分的氨基酸序列与蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域中任一个的野生型氨基酸序列具有优选为85%以上、更优选为90%以上的序列同源性,其结果,本发明的第1实施方式的蛋白质可以具有与Fc区域结合的能力。
导入变异而得的蛋白质的各结构域与蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域中任一个的野生型氨基酸序列显示优选为85%以上、更优选为90%以上的氨基酸的序列同源性。
作为上述的蛋白质的具体例,可举出由序列号48~57记载的氨基酸序列构成的蛋白质。
本发明的第1实施方式的蛋白质,其特征在于,对蛋白酶特别是丝氨酸蛋白酶具有耐性。对于丝氨酸蛋白酶,可举出胰蛋白酶、纤溶酶等作为例子,通常是在大肠杆菌等微生物、CHO细胞等培养细胞中生成、蓄积的蛋白酶。
例如,制作本发明的第1实施方式的蛋白质时,通常,如下所述,利用以大肠杆菌等微生物为宿主的转化体,使蛋白质在转化体的细胞内或者细胞外蓄积而回收。蓄积·回收目标蛋白质时,有时受作为宿主的微生物所生产的蛋白酶的影响。
另外,将本发明的第1实施方式的蛋白质作为免疫球蛋白结合性亲和配体来制作亲和分离剂而用于纯化免疫球蛋白时,有时受通过该亲和分离剂的产生免疫球蛋白的CHO细胞等的培养上清液中所含的蛋白酶的影响。
根据本发明人等的研究,可知对于具有野生型氨基酸序列的多聚体蛋白质而言,在蓄积·回收该多聚体蛋白质时,在培养中途和回收后的纯化·浓缩等工序中受蛋白酶的影响被切断,得不到目标多聚体蛋白质。
另外,可知将具有野生型氨基酸序列的多聚体蛋白质作为配体制作亲和分离剂时,为了纯化免疫球蛋白而使用时,作为配体的多聚体蛋白质受蛋白酶的影响被切断,无法充分发挥免疫球蛋白结合性。首次发现了这是受蛋白酶中由大肠杆菌等微生物、CHO细胞等培养细胞等生产的丝氨酸蛋白酶的影响,在各结构域的氨基酸序列中在特定的部分被切断。
基于这些研究结果,在连接位置序列(第1连接元件)中加入了特定的改变而得到的本发明的第1实施方式的蛋白质在培养中途和回收后的纯化·浓缩等工序中不会被丝氨酸蛋白酶切断,能够进行蓄积·回收。
另外,将本发明的第1实施方式的多聚体蛋白质作为配体制作亲和分离剂时,不受丝氨酸蛋白酶的影响,能够发挥充分的免疫球蛋白结合性,纯化目标免疫球蛋白。
为了让在免疫球蛋白的纯化工序等中使用时不受蛋白酶的影响而使配体稳定地发挥功能这个效果显著发挥,优选本发明的第1实施方式的蛋白质包含1个以上的不与担载体结合的非固定结构域,更优选为2个以上,为n聚体的蛋白质的情况下,优选n-1个以上为非固定结构域,最优选n个全部为非固定结构域。
为了使本发明的第1实施方式的蛋白质包含后面详述的非固定结构域,可以通过氨基酸的替换、插入等在至少1个以上的结构域的氨基酸序列中导入对固定有用的氨基酸残基,或者使对固定有用的氨基酸缺失,或者导入固定用标签而制作。
通过使本发明的第1实施方式的蛋白质包含非固定结构域,能够调整取向性而固定于担载体,能够更好地发挥免疫球蛋白结合性。
另外,即便本发明的第1实施方式的亲和分离剂反复使用时,配体的免疫球蛋白结合性也不会降低,能够有效地纯化免疫球蛋白。
因此,本发明的第1实施方式的蛋白质与免疫球蛋白的Fc区域的结合活性足够高,不仅可适合用作亲和配体,而且作为配体稳定能够反复使用,在工业上有利。
这里,在本说明书中,是否具有丝氨酸蛋白酶耐性用如下的方法确认。将向2mg/mL的配体溶液10μL中添加2μL的1~10mg/mL的丝氨酸蛋白酶溶液而得的溶液在37℃加热15小时的情况下,没有被切断的配体越多越好。丝氨酸蛋白酶溶液的浓度根据蛋白酶的种类适当地设定即可,例如,胰蛋白酶优选为1mg/mL,纤溶酶优选为10mg/mL。
作为具有丝氨酸蛋白酶耐性的指标,保留了80%以上、优选为85%以上、更优选为90%以上的没有被切断的配体。应予说明,是否被切断是通过一般使用的电泳法(SDS-PAGE)来确认的。
[本发明的第2实施方式]
<蛋白质>
本发明的第2实施方式的蛋白质其特征在于,具有2个以上来源于序列号3~6记载的蛋白A的A、B、C和Z结构域中任一个的结构域,在连接各结构域的连接元件(第2连接元件)中至少一个是由1个以上的氨基酸构成且由疏水性氨基酸以外的氨基酸构成的变异连接元件(变异第2连接元件)。
蛋白A是以5个免疫球蛋白结合性结构域连接的形式构成的蛋白质。多种微生物表达蛋白A,作为表达蛋白A的微生物,例如可举出葡萄球菌(Staphylococcus)。
序列号3~6记载的蛋白A的A、B、C和Z结构域是能够与免疫球蛋白的互补决定区(CDR)以外的区域结合的免疫球蛋白结合性蛋白质,任一结构域均能与免疫球蛋白的Fc区域、Fab区域和Fab区域中的特别是Fv区域这样的各个区域进行结合。
如图1的序列比较表所示,来源于蛋白A的A、B、C和Z结构域具有彼此相同性高的氨基酸序列,具有80%以上的氨基酸序列同源性。应予说明,连字符(-)表示与C结构域的氨基酸残基相同。
“来源于蛋白A的A、B、C和Z结构域中任一个的结构域”是指具有如下氨基酸序列的结构域,该氨基酸序列来源于野生型的各结构域的氨基酸序列,只要能编码具有与Fc区域结合的能力的蛋白质,则在野生型的各结构域的氨基酸序列中可以导入后述的变异连接元件(变异第2连接元件)以外的变异。
换言之,蛋白A的A、B、C和Z结构域中任一个的氨基酸序列是导入变异前的氨基酸序列(野生型氨基酸序列),而“来源于蛋白A的A、B、C和Z结构域中任一个的结构域”的氨基酸序列是指A、B、C和Z结构域的野生型氨基酸序列本身、或者在野生型氨基酸序列中包含后述的变异连接元件(变异第2连接元件)和/或经过部分的氨基酸的替换、插入、缺失和化学修饰而被改变的氨基酸序列。
这里,蛋白A的Z结构域是对B结构域导入A1V和G29A这样的变异而得到的,是天然的蛋白A中不存在的结构域,但本说明书中,将序列号6表示的氨基酸序列称为Z结构域的野生型氨基酸序列。
本发明的第2实施方式的蛋白质是将上述的“来源于蛋白A的A、B、C和Z结构域中任一个的结构域”作为单结构域而具有2个以上的多聚体蛋白质(多结构域型蛋白质)。优选为3个以上,更优选为4个以上,优选为10个以下,更优选为8个以下,进一步优选为6个以下。
这些多聚体蛋白质可以是单一的免疫球蛋白结合性结构域的连接体即同源二聚体、同源三聚体等同源多聚体,也可以是种类不同的免疫球蛋白结合性结构域的连接体即异源二聚体、异源三聚体等异源多聚体。优选为本发明的第2实施方式的蛋白质所包含的结构域全部来源于序列号3~6记载的蛋白A的A、B、C和Z结构域的氨基酸序列中任1种的同源多聚体。
对于本发明的第2实施方式的蛋白质而言,2个以上的结构域的C末端与N末端连接而构成连接元件(第2连接元件)。这里,在本发明的第2实施方式中“连接元件(第2连接元件)”是指各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列。
换言之,在N末端侧连接其它结构域的结构域中,该结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列成为连接元件(第2连接元件)。因此,在n聚体蛋白质中存在n-1个连接元件(第2连接元件)。
以下所示的序列是蛋白A的A、B、C和Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列。任一序列均由5个氨基酸构成,包含作为疏水性氨基酸的丙氨酸(A)和/或苯丙氨酸(F)。
本发明的第2实施方式的蛋白质,其特征在于,至少一个连接元件(第2连接元件)是经过部分的氨基酸的替换、插入、缺失和化学修饰而被改变的变异连接元件(变异第2连接元件)。变异连接元件(变异第2连接元件)是由1个以上的氨基酸构成且由疏水性氨基酸以外的氨基酸构成的序列。
本发明的第2实施方式的蛋白质所包含的连接元件(第2连接元件)中至少一个为变异连接元件(变异第2连接元件)即可,但为三聚体以上的蛋白质的情况下优选2个以上为变异连接元件(变异第2连接元件),n聚体蛋白质的情况下更优选n-1个为变异连接元件(变异第2连接元件),换言之更优选全部的连接元件(第2连接元件)为变异连接元件(变异第2连接元件)。
连接元件(第2连接元件)由各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成,但经过替换、插入、缺失和化学修饰对该序列进行改变而由1个以上的氨基酸构成且由疏水性氨基酸以外的氨基酸构成的序列是变异连接元件(变异第2连接元件)。
根据本发明人等的研究,发现容易被嗜热菌蛋白酶切断的位置是连接元件(第2连接元件)中的疏水性氨基酸的N末端侧。由此,如果使连接元件(第2连接元件)成为由疏水性氨基酸以外的氨基酸构成的变异连接元件(变异第2连接元件),则能够明显地抑制蛋白质被嗜热菌蛋白酶切断。
具体而言,优选通过将野生型氨基酸序列的连接元件(第2连接元件)中的A和F缺失和/或替换而制成变异连接元件(变异第2连接元件)。
这里,本说明书中的“疏水性氨基酸”是指丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)、缬氨酸(V),“疏水性氨基酸以外的氨基酸”是指精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)等亲水性氨基酸;半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、蛋氨酸(M)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)等天然型的中性氨基酸;乙酰基赖氨酸、叠氮-Z-赖氨酸、谷氨酸5-甲酯、天冬氨酸5-甲酯等非天然型的中性氨基酸。
以下,对变异连接元件(变异第2连接元件)的具体例进行说明。
使连接元件(第2连接元件)的氨基酸的一部分缺失而制成变异连接元件(变异第2连接元件)时,变异连接元件(变异第2连接元件)必须由1个以上的氨基酸构成。根据本发明人等的研究,可知使连接元件(第2连接元件)所包含的5个氨基酸全部缺失时,作为目标的与免疫球蛋白的结合能力明显降低,如果使用该蛋白质作为亲和配体则与免疫球蛋白的结合能力不充分。特别是根据作为亲和分离剂使用的纯化条件,其差别表现得明显。
一般而言,免疫球蛋白比各结构域大,因结合的免疫球蛋白彼此的空间位阻导致能与各结构域结合的个数受限。因此,推测这是由于各结构域与免疫球蛋白结合时,如果不存在连接元件(第2连接元件)而相邻的结构域过近,则能结合免疫球蛋白的空间不足,每1个结构域的免疫球蛋白结合数降低。从在各种纯化条件中与免疫球蛋白的结合能力优异这个理由考虑,变异连接元件(变异第2连接元件)必须由1个以上的氨基酸构成,如果由2个以上的氨基酸构成,则作为目标的与免疫球蛋白的结合能力有变高的趋势,因而优选。
变异连接元件(变异第2连接元件)被包含在来源于蛋白A的A、B、和C结构域中任一个的结构域时,优选变异连接元件(变异第2连接元件)由A、B或者C结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成且缺失了第1位的丙氨酸和/或第5位的苯丙氨酸。
例如,作为优选的例子,可举出缺失了第1位的丙氨酸(A)和第5位的苯丙氨酸(F)这2个氨基酸而由天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)这3个氨基酸构成的序列,在第1位的A和第5位的F缺失的基础上还缺失第4位的K而由D、N这2个氨基酸构成的序列等。另外,用后述的方法替换连接元件(第2连接元件)所包含的疏水性氨基酸时,可以仅缺失第1位的A,也可以仅缺失第5位的F。
变异连接元件(变异第2连接元件)被包含在来源于蛋白A的Z结构域的结构域时,优选变异连接元件(变异第2连接元件)由Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成且缺失了第1位的缬氨酸和/或第5位的苯丙氨酸。
例如,作为优选的例子,可举出缺失了第1位的缬氨酸(V)和第5位的苯丙氨酸(F)这2个氨基酸而由天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)这3个氨基酸构成的序列,在第1位的V和第5位的F缺失的基础上还缺失第4位的K而由D、N这两个氨基酸构成的序列等。另外,用后述的方法替换连接元件(第2连接元件)所包含的疏水性氨基酸的一部分时,可以仅缺失第1位的V,也可以仅缺失第5位的F。
氨基酸的替换是指去除原来的氨基酸在相同的位置追加其它的氨基酸的变异。被追加的其它的氨基酸没有特别限定,例如可举出天然的蛋白质构成氨基酸、蛋白质非构成氨基酸、非天然氨基酸。其中,从基因工程的生产的观点考虑,可优选使用天然型氨基酸。
其中,替换连接元件(第2连接元件)的氨基酸而制成变异连接元件(变异第2连接元件)时,需要使变异连接元件(变异第2连接元件)成为不含疏水性氨基酸这样的序列。因此,作为通过替换导入的氨基酸,只要为疏水性氨基酸以外的氨基酸就没有特别限定,优选精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)等亲水性氨基酸;半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、蛋氨酸(M)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)等中性的氨基酸中的任一种。其中,更优选为亲水性氨基酸中的任一种。
此外,从提高在碱性条件下的稳定性的观点考虑,优选精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)。
另外,从提高对其它的蛋白酶例如后述的丝氨酸蛋白酶的耐性的观点考虑,优选天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)。
变异连接元件(变异第2连接元件)被包含在来源于蛋白A的A、B和C结构域中任一个的结构域时,优选上述变异连接元件(变异第2连接元件)由A、B或者C结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成且用疏水性氨基酸以外的氨基酸替换了第1位的丙氨酸和/或第5位的苯丙氨酸。
例如,作为优选的例子,可举出用疏水性氨基酸以外的氨基酸替换了第1位的丙氨酸(A)和第5位的苯丙氨酸(F)这2个氨基酸而得的序列,用除K以外的疏水性氨基酸以外的氨基酸替换了第1位的A和第5位的F以及第4位的K而得的序列等。另外,用上述的方法使连接元件(第2连接元件)所包含的疏水性氨基酸的一部分缺失的情况下,可以仅替换第1位的A,也可以仅替换第5位的F。
变异连接元件(变异第2连接元件)被包含在来源于蛋白A的Z结构域的结构域时,优选变异连接元件(变异第2连接元件)由Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成且用疏水性氨基酸以外的氨基酸替换了第1位的缬氨酸和/或第5位的苯丙氨酸。
例如,作为优选的例子,可举出用疏水性氨基酸以外的氨基酸替换了第1位的缬氨酸(V)和第5位的苯丙氨酸(F)这2个氨基酸而得的序列,用除K以外的疏水性氨基酸以外的氨基酸替换了第1位的V和第5位的F以及第4位的K而得的序列等。另外,用上述的方法使连接元件(第2连接元件)所包含的疏水性氨基酸的一部分缺失的情况下,可以仅替换第1位的V,也可以仅替换第5位的F。
在变异连接元件(变异第2连接元件)中,除野生型氨基酸序列所包含的5个氨基酸以外,还可以插入追加的氨基酸序列。例如,也可以在用上述的方法替换了连接元件(第2连接元件)所包含的疏水性氨基酸的一部分而得的序列中进一步插入疏水性氨基酸以外的氨基酸而制成由6个以上的氨基酸构成的变异连接元件(变异第2连接元件)。
另外,也可以从用上述的方法使连接元件(第2连接元件)所包含的疏水性氨基酸的一部分缺失而得的序列中进一步缺失一部分或者全部的氨基酸,并插入由疏水性氨基酸以外的氨基酸构成的任意的变异连接元件(变异第2连接元件)。另外,在不影响与抗体的结合性等的范围还可以进行赖氨酸残基的乙酰化、脯氨酸残基的羟基化等化学修饰等。
其中,如果得到的蛋白质的立体结构大幅变化,则有可能使作为目标的与免疫球蛋白的亲和性和结合能力变化,因此优选不向野生型氨基酸序列的连接元件(第2连接元件)中进一步插入追加的氨基酸序列。
作为构成经过替换、插入等导入了变异的变异连接元件(变异第2连接元件)的氨基酸,只要为疏水性氨基酸以外的氨基酸就没有特别限定,优选为精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)等亲水性氨基酸,更优选为天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)。
在变异连接元件(变异第2连接元件)以外导入的氨基酸序列的改变没有特别限定,只要与具有野生型氨基酸序列的蛋白质相比,对免疫球蛋白具有同等或者其以上的亲和性和结合能力即可。
变异连接元件(变异第2连接元件)以外的部分的氨基酸序列与蛋白A的A、B、C和Z结构域中任一个的野生型氨基酸序列具有优选为85%以上、更优选为90%以上的序列同源性,其结果,本发明的第2实施方式的蛋白质可以具有与Fc区域结合的能力。
导入变异而得的蛋白质的各结构域与蛋白A的A、B、C和Z结构域中任一个的野生型氨基酸序列显示优选为85%以上、更优选为90%以上的氨基酸的序列同源性。
除与免疫球蛋白的亲和性和结合能力以外,作为有用的配体的特性指标,可举出耐碱性、弱酸性溶出性。为了改进这些特性,改变变异连接元件(变异第2连接元件)以外的氨基酸序列在本发明中能够兼具,可以说是优选的方式。
耐碱性是指浸渍在0.1N的NaOH、0.5N的NaOH等碱溶液中时,维持高的与免疫球蛋白的亲和性和结合能力。由此,使用具有耐碱性的蛋白质作为亲和配体制成分离剂时,即便反复用碱溶液清洗也能够维持高的分离纯化能力。应予说明,已知C结构域和Z结构域原本就具有高的耐碱性,在耐碱性方面是优选的序列。
另外,弱酸性溶出性是指用固定有亲和配体的分离剂吸附纯化免疫球蛋白时,通常在酸性时溶出的免疫球蛋白能够在更高pH的温和条件下溶出。由此,溶出时能够抑制蛋白质凝聚之类的变性。专利文献5、国际公开第2010/118699号等中记载的赋予弱酸性溶出性的变异在本发明中能够兼具,可以说是优选的方式。
作为上述的蛋白质的具体例,可举出由序列号105~115记载的氨基酸序列构成的蛋白质。
本发明的第2实施方式的蛋白质其特征在于对蛋白酶、特别是嗜热菌蛋白酶具有耐性。制作本发明的第2实施方式的蛋白质时,如下所述,通常利用以微生物为宿主的转化体,使蛋白质蓄积在转化体的细胞内或者细胞外而回收。在蓄积·回收目标蛋白质时,有时受到作为宿主的微生物所生产的蛋白酶的影响。
根据本发明人等的研究,可知利用上述的方法蓄积·回收具有野生型氨基酸序列的多聚体蛋白质时,在培养中途和回收后的纯化·浓缩等的工序中受蛋白酶的影响被切断,得不到目标多聚体蛋白质。首次发现这是受蛋白酶中芽孢杆菌属细菌等产生的嗜热菌蛋白酶的影响,在各结构域的氨基酸序列中在特定的部分被切断。
考虑到这些研究结果,在连接元件(第2连接元件)中加入了特定的改变的本发明的第2实施方式的蛋白质在培养中途和回收后的纯化·浓缩等工序中不会被嗜热菌蛋白酶切断,能够进行蓄积·回收。因此,本发明的第2实施方式的蛋白质不仅与免疫球蛋白的Fc区域的结合活性足够高,可适合用作亲和配体,而且能够以高效率生产,在工业上有利。
这里,本说明书中,是否具有嗜热菌蛋白酶耐性用如下的方法确认。将在2mg/mL的配体溶液10μL中添加了2μL的1mg/mL的嗜热菌蛋白酶溶液而得的溶液在37℃加热15分钟时,没有被切断的配体越多越好。例如优选保留80%以上、优选为85%以上、更优选为90%以上的没有被切断的配体。应予说明,是否被切断利用通常使用的电泳法(SDS-PAGE)来确认。
本发明的第2实施方式的蛋白质通过具有变异连接元件(变异第2连接元件)而对嗜热菌蛋白酶具有耐性,但优选为进一步对其它的蛋白酶也具有耐性的氨基酸序列。作为其它的蛋白酶,例如可举出胰蛋白酶、纤溶酶等丝氨酸蛋白酶。
使用将本发明的第2实施方式的蛋白质用作配体的亲和分离剂来纯化由重组培养细胞生产的IgG抗体时,配体被该培养细胞产生的丝氨酸蛋白酶切断,可能无法发挥充分的免疫球蛋白结合性。因此,优选本发明的第2实施方式的蛋白质是进一步对丝氨酸蛋白酶也具有耐性的氨基酸序列。
基于上述的理由,优选至少一个结构域的氨基酸序列中的C末端的赖氨酸缺失或者被替换。根据本发明人等的研究,可知容易被胰蛋白酶、纤溶酶等丝氨酸蛋白酶切断的位置是各结构域的野生型氨基酸序列中存在的C末端赖氨酸(K)的C末端侧。由此,发现如果由利用缺失或者替换而不含各结构域的连接元件(第2连接元件)进行结合的C末端赖氨酸(K)这样的氨基酸序列构成,则能够明显抑制蛋白质被丝氨酸蛋白酶切断。
更优选在C末端侧结合上述变异连接元件(变异第2连接元件)的结构域中,缺失或者替换了该结构域的氨基酸序列中的C末端的赖氨酸。
进一步优选变异连接元件(变异第2连接元件)也不含赖氨酸。如上所述,对于B、C、Z结构域的野生型氨基酸序列而言,在连接元件(第2连接元件)中的第4位包含赖氨酸。
根据本发明人等的研究,可知连接元件(第2连接元件)中的赖氨酸较容易被丝氨酸蛋白酶切断,因此优选在变异连接元件(变异第2连接元件)中成为经过缺失或者替换不含赖氨酸(K)这样的氨基酸序列。进一步优选变异连接元件(变异第2连接元件)不含精氨酸(R)。
以下,对具有丝氨酸蛋白酶耐性的变异连接元件的具体例进行说明。
可举出使各结构域的C末端赖氨酸(K)和/或连接元件(第2连接元件)的氨基酸的一部分缺失的情况。连接元件(第2连接元件)由A结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成时,仅缺失各结构域的C末端的K即可。
另一方面,连接元件(第2连接元件)由B、C和Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成时,包括C末端和第4位的2个K,优选至少使C末端的K缺失,更优选使连接元件(第2连接元件)中的K也缺失。
例如,2个蛋白A的B结构域连接成的连接元件(第2连接元件)为通过疏水性氨基酸的缺失而制作的变异连接元件(变异第2连接元件)时,作为优选的例子,可举出进一步缺失了C末端的赖氨酸(K)而由天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)这3个氨基酸构成的序列,进一步缺失了C末端的赖氨酸(K)和第4位的赖氨酸(K)这2个氨基酸而由天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)这2个氨基酸构成的序列。
另外,用后述的方法替换C末端的K和连接元件(第2连接元件)所包含的K中的任一个时,可以仅缺失C末端的K,也可以仅缺失第4位的K。
替换各结构域的C末端赖氨酸(K)和/或连接元件(第2连接元件)的氨基酸的一部分时,可举出去除原来的氨基酸,在相同的位置追加其它的氨基酸。被追加的其它的氨基酸没有特别限定,例如可举出天然的蛋白质构成氨基酸、蛋白质非构成氨基酸、非天然氨基酸。其中,从基因工程的生产的观点考虑,可优选使用天然型氨基酸。
其中,替换连接元件(第2连接元件)的氨基酸而制成变异连接元件(变异第2连接元件)时,需由疏水性氨基酸以外的氨基酸构成,优选为变异连接元件(变异第2连接元件)不含赖氨酸(K)这样的序列。如果为还不含精氨酸(R)的序列,则对识别精氨酸的蛋白酶的耐性也提高,因而优选。
因此,作为通过替换被导入的氨基酸,只要为疏水性氨基酸、赖氨酸(K)和精氨酸(R)以外的氨基酸就没有特别限定,优选天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)等亲水性氨基酸;半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、蛋氨酸(M)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)等中性氨基酸中的任一种。其中,更优选上述的亲水性氨基酸中的任一种。此外,从提高在碱性条件下的稳定性的观点考虑,优选天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)。
连接元件(第2连接元件)由A结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成时,可以仅替换各结构域的C末端的K。另一方面,连接元件(第2连接元件)由B、C和Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成时,包括C末端和第4位的2个K,优选至少替换C末端的K,更优选也替换连接元件(第2连接元件)中的K。
例如,2个蛋白A的B结构域连接成的连接元件(第2连接元件)是通过疏水性氨基酸的替换而制作的变异连接元件(变异第2连接元件)时,优选进一步用疏水性氨基酸、赖氨酸(K)和精氨酸(R)以外的氨基酸替换C末端的赖氨酸(K),更优选进一步用疏水性氨基酸、赖氨酸(K)和精氨酸(R)以外的氨基酸替换C末端的赖氨酸(K)和第4位的赖氨酸(K)这2个氨基酸。具体而言,作为优选的例子,可举出用天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)替换第1位的V和第5位的F以及C末端的K和第4位的K而得的序列等。
另外,用上述的方法使C末端的K和连接元件(第2连接元件)所包含的某一个K缺失时,可以仅替换C末端的K,也可以仅替换第4位的K。
通过加入上述的变异,本发明的第2实施方式的蛋白质能够对丝氨酸蛋白酶具有耐性。对于丝氨酸蛋白酶,作为例子,可举出胰蛋白酶、纤溶酶等,通常是大肠杆菌等微生物、CHO细胞等培养细胞生成、蓄积的蛋白酶。
将本发明的第2实施方式的蛋白质作为免疫球蛋白结合性亲和配体制作亲和分离剂而用于纯化免疫球蛋白时,有时受通过该亲和分离剂的产生抗体的CHO细胞等的培养上清液中所含的蛋白酶的影响。
根据本发明人等的研究,首次发现了受丝氨酸蛋白酶的影响,在各结构域的氨基酸序列中在特定的部分被切断。考虑到这些研究结果,将被改变成对丝氨酸蛋白酶具有耐性的氨基酸序列的本发明第2实施方式的蛋白质作为配体制作亲和分离剂时,不会受丝氨酸蛋白酶的影响,能够发挥充分的免疫球蛋白结合性,纯化目标免疫球蛋白。
另外,即便反复使用本发明的第2实施方式的亲和分离剂时,配体的免疫球蛋白结合性也不会降低,能够有效地纯化免疫球蛋白。
因此,本发明的第2实施方式的蛋白质不仅与免疫球蛋白的Fc区域的结合活性足够高,可适合用作亲和配体,而且作为配体稳定,可反复使用,在工业上有利。
这里,本说明书中,是否具有丝氨酸蛋白酶耐性用如下的方法确认。将在2mg/mL的配体溶液10μL中添加了2μL的1~10mg/mL的丝氨酸蛋白酶溶液而得的溶液在37℃加热15小时的情况下,没有被切断的配体越多越好。丝氨酸蛋白酶溶液的浓度根据蛋白酶的种类适当地设定即可,例如,胰蛋白酶优选为1mg/mL,纤溶酶优选为10mg/mL。
作为具有丝氨酸蛋白酶耐性的指标,优选保留了80%以上、优选为85%以上、更优选为90%以上的没有被切断的配体。应予说明,是否被切断通过一般使用的电泳法(SDS-PAGE)来确认。
<蛋白质的制造方法>
以下对本发明的第1实施方式和第2实施方式的蛋白质(本发明的蛋白质)的制造方法进行说明。
本发明的蛋白质是制作具有编码上述蛋白质的碱基序列的DNA,并翻译该DNA而制造的。具体而言,可以利用使用包含该DNA的载体将作为宿主的微生物转化而得的转化体或者使用了该DNA的无细胞蛋白质合成体系来制造。
具有编码本发明蛋白质的碱基序列的DNA可以利用通常使用的公知方法例如聚合酶链反应(以下简称为PCR)法来获得。另外,也可以用公知的化学合成法合成,另外也可以由基因组DNA文库得到。构成该DNA的碱基序列的密码子可以被简并密码子替换,只要翻译时编码相同的氨基酸,则不必与本来的碱基序列相同。
作为向编码本发明蛋白质的DNA导入位点特异性变异的方法,如下可以利用基因重组技术、PCR法等进行。
即,利用基因重组技术的变异的导入例如可以利用盒式变异法进行,即在编码本发明蛋白质的基因中,在希望导入变异的目的部位的两侧存在适当的限制性内切酶识别序列的情况下,用上述限制性内切酶切断这些限制性内切酶识别序列部分,除去包含希望导入变异的部位的区域后,插入通过化学合成等仅在目的部位导入了变异的DNA片段。
另外,利用PCR的位点特异性变异的导入例如可以利用双引物法进行,即以编码蛋白质的双链质粒为模板,使用与+和-链互补的、包含变异的2种合成寡核苷酸引物进行PCR。
另外,也可以将编码本发明的单体蛋白质(1个结构域)的DNA按照期望的个数以串联的方式连接而制作编码多聚体蛋白质的DNA。例如,编码多聚体蛋白质的DNA的连接方法可以是向DNA序列导入适当的限制性内切酶的酶切位点,用DNA连接酶连接被限制性内切酶片段化的双链DNA。限制性内切酶的酶切位点可以为1种,也可以导入多个不同种类的限制性内切酶的酶切位点。
制作编码多聚体蛋白质的DNA的方法不限于这些连接的方法。例如,也可以在编码蛋白A的DNA(例如,国际公开第2006/004067号)中应用上述的变异导入法来制作。
另外,在编码多聚体蛋白质的DNA中,编码各单体蛋白质的碱基序列相同时,由于可能引起宿主的同源重组,所以优选编码被连接的单体蛋白质的DNA的碱基序列间的序列同源性为90%以下,更优选为85%以下。
载体包含:含有编码上述的蛋白质或其部分氨基酸序列的碱基序列的DNA;和与该碱基序列可工作连接的、在宿主中能发挥功能的启动子。通常可以通过将包含编码上述蛋白质的基因的DNA与适当的载体连接或插入而获得。
用于插入基因的载体只要能够在宿主中自主复制就没有特别限定,可以使用质粒DNA、噬菌体DNA作为载体。例如,使用大肠杆菌作为宿主时,可举出pQE系列载体(QIAGEN公司制)、pET系列载体(Merck公司制)和pGEX系列载体(GE HealthCare Japan株式会社制)等载体。
作为载体,使用短芽孢杆菌属细菌作为转化的宿主时,例如可举出作为枯草芽孢杆菌载体而公知的pUB110或者pHY500(日本特开平2-31682号公报)、pNY700(日本特开平4-278091号公报)、pNU211R2L5(日本特开平7-170984号公报)、pHT210(日本特开平6-133782号公报)或者作为大肠杆菌与短芽孢杆菌属细菌的穿梭载体的pNCMO2(日本特开2002-238569号公报)等。
通过向作为宿主的细胞导入包含编码本发明蛋白质的DNA的载体可以得到转化体。作为向宿主导入的载体的转化的方法,例如可举出使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法、农杆菌感染法、基因枪法或者聚乙二醇法等,但不限定于此。
另外,作为在宿主内维持载体的方法,例如可举出在细胞内从基因组(染色体)独立地通过载体的自主复制来维持的方法;将制作的基因重组到基因组(染色体),依赖于基因组的复制来维持的方法等。
作为宿主的细胞没有特别限定,从可廉价地大量生产的方面考虑,优选可恰当地使用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒杆菌属(Corynebacterium)等细菌(真细菌)。更优选可以是枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒杆菌属(Corynebacterium)等革兰氏阳性菌。进一步优选可以是大量生产蛋白A的适应例(国际公开第2006/004067号)公知的短芽孢杆菌属细菌。
作为短芽孢杆菌属细菌,没有限定,可例示土壤短芽孢杆菌(Brevibacillusagri)、波茨坦短芽孢杆菌(B.borstelensis)、短短芽孢杆菌(B.brevis)、中孢短芽孢杆菌(B.centrosporus)、桥石短芽孢杆菌(B.choshinensis)、美丽短芽孢杆菌(B.formosus)、污染短芽孢杆菌(B.invocatus)、侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporus)、沼泽短芽孢杆菌B.limnophilus、类短短芽孢杆菌(B.parabrevis)、罗伊氏短芽孢杆菌(B.reuszeri)、嗜热短芽孢杆菌(B.thermoruber)。
优选例示短短芽孢杆菌47株(JCM6285)、短短芽孢杆菌47K株(FERM BP-2308)、短短芽孢杆菌47-5Q株(JCM8970)、桥石短芽孢杆菌HPD31株(FERM BP-1087)和桥石短芽孢杆菌HPD31-OK株(FERM BP-4573)。
出于提高生产量等目的,可以使用上述短芽孢杆菌属细菌的蛋白酶缺陷株、高表达株或者芽胞形成能力缺失株这样的变异株(或者诱导株)。若具体举出,可使用来源于桥石短芽孢杆菌HPD31的蛋白酶变异株即桥石短芽孢杆菌HPD31-OK(日本特开平6-296485号公报)、不具有芽胞形成能力的桥石短芽孢杆菌HPD31-SP3(国际公开第2005/045005号公报)。
本发明的蛋白质可以利用转化体或者使用了上述DNA的无细胞蛋白质合成系统来制造。
利用转化体制造蛋白质时,蛋白质可以蓄积在转化体的细胞内(包含细胞周质区域内)或者培养溶液(细胞外)而被回收。如果在细胞内蓄积,则在能够防止表达的蛋白质的氧化,还不与培养基成分发生副反应方面有利,如果在细胞周质区域内蓄积,则在能够抑制细胞内蛋白酶所致的分解方面有利。
另一方面,如果在转化体的细胞外分泌蛋白质,则不需要菌体粉碎、提取的工序,因此在抑制制造成本方面有利。另一方面,在还分泌蛋白酶的宿主的情况下,在培养中途目标蛋白质可能被分解。
作为具体的方法,蛋白质在培养细胞内(包含细胞周质区域内)蓄积的情况下,例如,可以通过离心分离、过滤等方法从培养液采集菌体,接着利用超声波粉碎法、法式压滤法等粉碎该菌体和/或添加表面活性剂等使其溶解,由此回收在细胞内蓄积生产的蛋白质。此时如果蛋白酶也溶出,则目标蛋白质可能被分解。
分泌生产重组蛋白质时,在培养结束后,可以用离心分离、过滤等一般分离方法将培养细胞与包含分泌生产的蛋白质的上清液分离,回收所生产的重组蛋白质。
通过无细胞蛋白质合成系统制造本发明的蛋白质时,作为无细胞蛋白质合成系统,只要是使用细胞提取液在体外(in vitro)合成蛋白质的系统就没有特别限定,例如,可以使用来源于原核细胞、植物细胞、高等动物细胞的合成系统等。
本发明的蛋白质也可以通过如下方式制造:在培养基培养上述的转化体,以与其它蛋白质融合的蛋白的形态表达,从该培养物采集该融合蛋白,利用适当的蛋白酶切断该融合蛋白,采集所希望的蛋白质。
在培养基培养上述的转化体的方法根据在宿主的培养中使用的通常的方法进行。用于培养得到的转化体的培养基只要能够以高效率、高产量生产该蛋白质就没有特别限制。
具体而言,可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、聚胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白氨基酸等碳源、氮源。此外,根据需要添加钾盐、钠盐、磷酸盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐等无机盐类。使用营养缺陷型的宿主细胞时,可以添加生长繁殖所需的营养物质。另外,根据需要可以添加青霉素、红霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素等抗生素。
作为培养以大肠杆菌为宿主得到的转化体的培养基,没有特别限定,例如可举出LB培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl)或者2xYT培养基(1.6%胰蛋白胨、1.0%酵母提取物、0.5%NaCl)等。
作为培养以短芽孢杆菌属细菌为宿主得到的转化体的培养基,没有特别限定,例如可举出TM培养基(1%蛋白胨、0.5%肉提取物、0.2%酵母提取物、1%葡萄糖;pH7.0)或者2SL培养基(4%蛋白胨、0.5%酵母提取物、2%葡萄糖;pH7.2)等。
此外,为了抑制在菌体内外存在的来源于宿主的蛋白酶所致的该目标蛋白质的分解、低分子化,可以按适当的浓度添加公知的各种蛋白酶抑制剂,即苯甲基磺酰氟(PMSF)、苯甲脒(Benzamidine)、4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)、抗蛋白酶(Antipain)、糜蛋白酶抑素(Chymostatin)、亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)、胃酶抑素A(Pepstatin A)、磷酰二肽(Phosphoramidon)、抑肽酶(Aprotinin)、乙二胺四乙酸(EDTA)和/或其它市售的蛋白酶抑制剂。
此外,为了使本发明的蛋白质正确地折叠,例如,可以利用GroEL/ES、Hsp70/DnaK、Hsp90、Hsp104/ClpB等分子伴侣。分子伴侣可以通过例如共表达或者融合蛋白化等方法与本发明的蛋白质共存。以蛋白质的正确折叠为目的时,也可以采用向培养基中加入促进正确折叠的添加剂以及在低温下培养等方法,但并不限定于此。
重组蛋白质可以通过在培养温度为15~42℃、优选为20~37℃下,在通气搅拌条件下有氧培养数小时~数天来制造。根据具体情况,也可以阻断通气进行厌氧培养。
重组蛋白质的纯化可以单独或者适当地组合亲和色谱、阳离子或者阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱等来进行。
确认得到的纯化物质是否为目标蛋白质可以利用通常的方法,例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、N末端氨基酸序列分析、免疫印迹、酶联免疫吸附测定法(ELISA)等来进行。
<亲和分离剂>
将本发明的蛋白质作为亲和配体固定于由水不溶性的基材构成的担载体,能得到本发明的亲和分离剂。这里,“亲和配体”是指基于以抗原与免疫球蛋白的结合为代表的分子间的特异性亲和力,从某分子的集合中选择性捕获(结合)目标分子的物质(官能团)的术语,本说明书中,是指对免疫球蛋白特异性结合的蛋白质。本说明书中,在简记为“配体”的情况下,也与“亲和配体”的意思相同。
作为本发明中使用的由水不溶性的基材构成的担载体,可举出玻璃珠、二氧化硅凝胶等无机担载体;交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子;由结晶纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联右旋糖苷等多糖类构成的有机担载体;以及将它们组合而得的有机-有机、有机-无机等复合担载体等。
作为市售品,可例示作为多孔纤维素凝胶的GCL2000(生化学工业株式会社制)、烯丙基右旋糖苷和亚甲基双丙烯酰胺以共价键交联而成的Sephacryl(注册商标)S-1000(GEHealthCare Japan株式会社制)、作为丙烯酸酯系的担载体的Toyopearl(注册商标)(TOSOH株式会社制)、作为琼脂糖系的交联担载体的Sepharose(注册商标)CL4B(GE HealthCareJapan株式会社制)和作为纤维素系的交联担载体的Cellufine(注册商标)(JNC株式会社制)等。但是,本发明的水不溶性担载体并不仅限于例示的这些担载体。
另外,从本发明的亲和分离剂的使用目的和方法来看,优选本发明中使用的水不溶性担载体的表面积大,优选为具有大量适当大小的细孔的多孔物质。作为担载体的形态,珠状、单块状、纤维状、膜状(包括中空纤维)等均可,可选择任意的形态。
配体的固定方法例如可以利用存在于配体的氨基、羧基、羟基、碳酰胺基、聚乙烯氧基或者硫醇基通过以往的偶联法与担载体结合。
作为偶联法,可举出使担载体与溴化氰、表氯醇、二缩水甘油醚、对甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯、肼和高碘酸钠等反应而活化担载体(或向担载体表面导入反应性官能团),与作为配体固定的化合物进行偶联反应而固定的方法,另外,可举出向担载体和作为配体固定的化合物存在的体系中加入碳二亚胺这样的缩合试剂或者戊二醛这样在分子中具有多个官能团的试剂来进行缩合、交联而固定的方法。
另外,可以在配体与担载体之间导入由多个原子构成的间隔分子,也可以将配体直接固定于担载体。因此,为了固定,可以对本发明的蛋白质进行化学修饰,也可以加入对固定有用的氨基酸残基。
附加对固定有用的氨基酸残基时,将附加的氨基酸残基称为固定用标签。对于固定用标签,可以按照1个以上的任意个数附加氨基酸残基,附加的位置可举出配体的N末端侧和/或C末端侧。作为对固定有用的氨基酸,可举出在侧链具有对固定化的化学反应有用的官能团的氨基酸,例如可举出在侧链含有氨基的赖氨酸(K)、在侧链含有硫醇基的半胱氨酸(C)。
另一方面,作为将配体直接固定于担载体的方法,可举出在配体的氨基酸序列的任意位置替换·插入对固定有用的氨基酸。
本发明的本质是将本发明中赋予蛋白质的效果也同样赋予将该蛋白质作为配体固定的分离剂(基质),无论为了固定而进行何种修饰·改变,都包含在本发明的范围。
作为本发明的亲和分离剂中的配体与担载体的固定样式,可举出多点固定和单点固定。多点固定是指配体主体和/或固定标签以2点以上与担载体化学键合而固定的样式,单点固定是指配体主体或者固定标签以1点与担载体化学键合而固定的样式。
配体与担载体结合而被固定时,配体所包含的2个以上的结构域分别被区分成固定结构域和非固定结构域。这里提及的固定结构域是指以多点或单点与担载体结合的结构域,非固定结构域是指没有与担载体结合的结构域。
在本发明的亲和分离剂中,为了在抗体的纯化工序等中使用时,显著起到使配体不受蛋白酶的影响而能够稳定地发挥功能这个效果,优选配体包含1个以上的非固定结构域,优选包含2个以上,n聚体的配体的情况下,优选n-1个以上为非固定结构域,最优选n个全部为非固定结构域。
作为固定于担载体的配体中的固定结构域-非固定结构域的模式,可举出以下的4种。
(1)配体中的全部结构域为固定结构域的情况
(2)配体中的N末端和/或C末端侧的结构域为1个以上的固定结构域的情况
(3)配体中的两个末端以外的结构域为1个以上的固定结构域的情况
(4)在配体的N末端和/或C末端导入固定用标签,不存在固定结构域的情况
以下,以将四聚体的蛋白质作为配体而固定于担载体时的示意图即图2~5为例进行说明,只要为二聚体以上的蛋白质都同样地理解。应予说明,在图2~5中,将四聚体所包含的4个结构域分别表示为a~d,将与第1和第2连接元件相当的氨基酸序列用连接a~d的实线表示。应予说明,a~d的氨基酸序列可以相同,也可以不同,无论a和d分别是C末端侧或者N末端侧中的哪一种情况,均可以同样地理解。
上述(1)的情况下,没有形成非固定结构域。例如是图2示意性地表示的情况,由于a~d全部的结构域与担载体结合,所以在纯化工序中使用亲和分离剂时即便受蛋白酶的影响连接元件被切断,配体也能够在与担载体结合的状态下发挥功能。
上述(2)的情况下,是存在1个以上的非固定结构域的情况,以图3中的(A)~(C)示意性地表示。在图3的(A)中,配体的N末端或者C末端的2个结构域(a、b)是与担载体结合的固定结构域,相反侧的末端的2个结构域(c、d)是没有与担载体结合的非固定结构域。此时,即便a与b的连接元件被切断,配体也能够发挥功能,但如果b与c或者c与d的连接元件被切断,则c和d从担载体脱离无法发挥作为配体的功能,因而不优选。
在图3的(B)中,配体的N末端或者C末端的结构域(a)是与担载体结合的固定结构域,与其连接的3个结构域(b、c、d)是没有与担载体结合的非固定结构域。此时,无论是a与b、b与c或者c与d中的哪个连接元件被切断,b~d都会从担载体脱离无法发挥作为配体的功能,因而不优选。其中如果像a与b的连接元件这样固定结构域与非固定结构域的连接元件被切断,则与该非固定结构域连续结合的结构域也没有功能,因此尤其成为问题。
在图3的(C)中,配体的N末端和C末端的结构域(a、d)是与担载体结合的固定结构域,其间的2个结构域(b、c)是没有与担载体结合的非固定结构域。此时,如果a与b、b与c或者c与d中的任意2个以上的连接元件被切断,则b、c从担载体脱离无法发挥作为配体的功能,因而不优选。
上述(3)的情况下,是存在1个以上的非固定结构域的情况,以图4中的(A)、图4中的(B)示意性地表示。在图4的(A)中,存在于配体的N末端与C末端中间的一个结构域(c(b也是同样的))是与担载体结合的固定结构域,两个末端的2个结构域(a、d)和与其连接的1个结构域(b(c也是同样的))是没有与担载体结合的非固定结构域。此时,无论a与b、b与c或者c与d中的哪个连接元件被切断,a、b、d都会从担载体脱离无法发挥作为配体的功能,因而不优选。其中像b与c、c与d的连接元件这样固定结构域与非固定结构域的连接元件被切断尤其成为问题。
在图4的(B)中,存在于配体的N末端与C末端中间的2个结构域(b、c)是与担载体结合的固定结构域,两个末端的2个结构域(a、d)是没有与担载体结合的非固定结构域。此时,即便b与c的连接元件被切断,配体也能够发挥功能,但如果a与b或者c与d的连接元件被切断则c和d从担载体脱离无法发挥作为配体的功能,因而不优选。
上述(4)的情况是导入固定用标签形成与担载体的结合,全部的结构域为非固定结构域的情况,以图5中的(A)、图5中的(B)示意性地表示。在图5的(A)中,在配体的N末端或者C末端的结构域(a)的末端序列导入固定用标签使其与担载体结合。此时,无论a与b、b与c或者c与d中的哪个连接元件被切断,b~d都从担载体脱离无法发挥作为配体的功能,因而不优选。如果将具有固定标签的a认作固定结构域,则a与b的连接元件的切断与上述的图3中的(B)同样地尤其成为问题。此外,如果a的末端序列被蛋白酶切断则全部的结构域脱离无法作为配体发挥功能,因此尤其成为问题。因此,在a的连接固定用标签的末端(C末端或者N末端)序列中,需要导入用于赋予蛋白酶耐性的变异。
在图5的(B)中,在配体的N末端和C末端的结构域(a、d)的末端序列导入固定用标签使其与担载体结合。此时,如果将具有固定标签的a、d认作固定结构域,则存在与上述的图3(C)同样的问题。此外,如果a和d的末端序列被蛋白酶切断则全部的结构域脱离无法作为配体发挥功能,因此尤其成为问题。因此,在a、d的连接固定用标签的末端(C末端和N末端)序列中,需要导入用于赋予蛋白酶耐性的变异。
如上所述,作为本发明的第1实施方式中的第1、第3方式和第2实施方式的蛋白质中的变异结合元件位置,优选在固定结构域与非固定结构域之间、非固定结构域与非固定结构域之间具有。更优选至少在固定结构域与非固定结构域之间具有,进一步优选在非固定结构域与非固定结构域之间也具有。
另外,向配体导入固定用标签时,可以将具有固定用标签的结构域作为固定结构域,在上述的范围考虑优选的方式。
作为发明的第1实施方式中的第2方式的蛋白质中的第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸缺失或者被替换的结构域(变异结构域)的位置,优选至少固定结构域为变异结构域,更优选在此基础上与固定结构域直接连接的非固定结构域也是变异结构域,进一步优选在连续连接的非固定结构域中离固定结构域更近的非固定结构域也是变异结构域。
另一方面,对于离固定结构域最远的非固定结构域而言,即便没有与其它的结构域连接的一侧的末端受蛋白酶的影响也没有特别问题,所以可以不是变异结构域。但是,如果最远的非固定结构域为变异结构域,则与其它的结构域的连接位置不受蛋白酶的影响,因而优选。另外,向配体导入固定用标签时,可以将具有固定用标签的结构域作为固定结构域,在上述的范围考虑优选的方式。
配体中的与担载体形成结合的部位没有特别限定,优选在配体序列的末端。通过在末端固定,配体的自由度高,能够确保可与免疫球蛋白结合的区域广,能够确保与免疫球蛋白的结合能力高。如果是配体的末端,则N末端或C末端均可。
本发明的亲和分离剂优选是与包含免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质结合的亲和分离剂。作为亲和分离剂结合的包含免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质,例如可举出包含免疫球蛋白的Fc区域的抗体、抗体衍生物、抗体片段和抗体片段衍生物。可以利用亲和柱·色谱纯化法将这些蛋白质分离纯化。
应予说明,这些蛋白质一般可以使用来源于中国仓鼠卵巢的CHO细胞、小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0细胞、NS0细胞、甲醇营养型毕赤酵母、面包酵母、曲霉等来制作,在它们的培养液中存在蛋白酶时,本发明的亲和分离剂能够将该蛋白酶引起的劣化抑制到最小程度,因而优选。
这里,作为“包含免疫球蛋白的Fc区域的抗体”,例如可举出IgG。“抗体衍生物”是指IgG衍生物,例如可举出将人IgG的一部分结构域替换成其它物种的IgG抗体的结构域而融合成的嵌合型抗体、将人IgG的CDR部分替换成其它物种抗体的CDR部分而融合成的人源化抗体。
作为“抗体片段”,例如可举出仅由人IgG的Fab区域构成的蛋白质。作为“抗体片段衍生物”,例如可举出将人IgG的Fv区域和Fc区域融合成的人工抗体。应予说明,在说明书中使用“抗体样分子”这样的表达作为这些抗体、抗体衍生物、抗体片段和抗体片段衍生物的统一名称。
使用本发明的亲和分离剂能够分离包含免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质。具体而言可以制成包括本发明的亲和分离剂且具备至少一个填充该亲和分离剂的容器的液相色谱柱。
包含Fc区域的蛋白质(上述的抗体、抗体衍生物、抗体片段和抗体片段衍生物)的分离可以遵照基于亲和柱·色谱纯化法的步骤来实现,该亲和柱·色谱纯化法使用了已经作为市售品存在的蛋白A柱(参考文献1:Roque A.C.A.等著,“J.Chromatogr.A”,2007年,1160卷,第44-55页)。
即,将含有抗体、抗体衍生物、抗体片段和抗体片段衍生物的缓冲液调节成中性后,使该溶液通过本发明的液相色谱柱,吸附抗体、抗体衍生物、抗体片段和抗体片段衍生物。接下来,使适量的纯缓冲液通过液相色谱柱,清洗柱内部。
在此时,所希望的抗体、抗体衍生物、抗体片段和抗体片段衍生物被柱内的本发明的亲和分离剂吸附。接下来,使调节成适当的pH的酸性缓冲液(有时包含促进从该基质中解离的物质)流经柱,使所希望的抗体、抗体衍生物、抗体片段和抗体片段衍生物溶出,实现高纯度的纯化。
使缓冲液(有时是含有适当的改性剂或者有机溶剂的溶液)流经本发明的亲和分离剂对其进行清洗,可以再利用本发明的亲和分离剂,该缓冲液是完全不损害配体化合物、担载体的基材的程度的适当的强酸性或者强碱性的纯缓冲液。
一般而言,构成蛋白A的各个结构域与Fc区域的结合比与Fab区域的结合更强(参考文献1)。因此,本发明的蛋白质的“对免疫球蛋白的亲和性”本质上是指对Fc区域的亲和性的表述,即便仅与Fab区域的结合力发生变化,对免疫球蛋白的亲和性的强度也没有大的变化。对于本发明的蛋白质而言,蛋白A的免疫球蛋白结合结构域具有的、对Fab区域的次级亲和性(2次的な親和性)降低,起到能够排除与免疫球蛋白的相互作用中的次级结合(2次的な合)的影响这样的效果。
另一方面,由于维持了对Fc区域的亲和性,所以维持了对免疫球蛋白整体的亲和性。利用后述的Biacore系统测定对人免疫球蛋白G制剂的亲和性时,本发明的蛋白质所具有的对免疫球蛋白的亲和性的亲和常数(KA)优选为106(M-1)以上,更优选为107(M-1)以上。
本发明的蛋白质对免疫球蛋白的亲和性可以利用例如采用表面等离子体共振原理的Biacore(注册商标)系统(GE HealthCare Japan株式会社制)等生物传感器测定,但测定方法并不限定于此。
作为测定条件,只要能够检测出蛋白A与免疫球蛋白的Fc区域结合时的结合信号即可,可以在温度20~40℃(恒定温度)以pH6~8的中性条件进行测定由此简单地评价。
作为本发明的蛋白质显示亲和性的对象,例如可举出没有不足地含有Fab区域和Fc区域的免疫球蛋白分子及其衍生物,但并不限定于此。本发明的蛋白质对包含Fc区域侧的一部分的蛋白质也具有亲和性,结合对象不必是包含完整的Fc区域的蛋白质。由于抗体的立体结构已经是已知的,所以在蛋白质工程上保持本发明的蛋白质结合的区域的立体结构的基础上,可以对Fab区域、Fc区域实施进一步的改变(片段化等),本发明的蛋白质也可与它们的派生物结合。
另外,固定了本发明蛋白质的亲和分离剂对免疫球蛋白的结合能力例如可以用静态吸附容量和动态吸附容量等来比较评价,但并不限定于此,该静态吸附容量是评价浸渍在过量的免疫球蛋白溶液中的分离剂能够吸附多少免疫球蛋白;该动态吸附容量是评价免疫球蛋白溶液流经填充了分离剂的柱时穿过的溶液量。
实施例
以下,举出实施例对本发明进行更详细的说明,但本发明不受这些实施例限制。
<本发明的实施方式1的实施例>
[制作例]
1)制作野生型蛋白A表达质粒
化学合成在5’端附加了catatg(NdeI)、在3’端附加了ctcgag(XhoI)的、编码野生型C结构域二聚体(WT)的DNA序列(序列号7)。使用限制性内切酶NdeI和XhoI(均为ThermoScientific公司制)将得到的DNA片段消化后,进行纯化·回收。
应予说明,序列号7是以来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA序列为基础,为了大肠杆菌表达而进行密码子最优化而决定的。
作为蛋白质表达载体,选择具有T7启动子且在多克隆位点下游具有6xHis标签和终止密码子的载体pET22b(Merck公司制)。使用限制性内切酶NdeI和XhoI(均为ThermoScientific公司制)将pET22b消化后,进行纯化·回收。
使用DNA连接酶(LigaFast DNA快速连接系统,Promega公司制)将限制性内切酶处理过的序列号7的DNA片段和pET22b载体连接,构建WT表达载体。
使用WT表达载体进行大肠杆菌JM109(TaKaRa公司制)的转化,利用常规方法扩增和提取质粒DNA。
2)制作蛋白A变异体(Mut)表达质粒
制作包含编码蛋白质Mut1~Mut13的DNA序列(序列号34~46)的表达载体,该蛋白质Mut1~Mut13具有野生型C结构域二聚体的氨基酸序列的一部分缺失和/或被替换的变异。Mut1~13表达载体是利用表1所示的模板和合成寡核苷酸引物组(序列号8~33)的组合、使用快速突变法(QuikChange定点突变试剂盒,Agilent Technologies公司制)制作的。快速突变法是基于Agilent Technologies公司的规程实施的。
表1
得到的Mut1~13表达载体是通过转化JM109(TaKaRa公司制)从而利用常规方法进行扩增和提取的。
得到的Mut1~13表达载体的DNA序列的解析是使用DNA测序仪3130xl型基因分析仪(Applied Biosystems公司制)进行的。表达载体的测序PCR反应是使用Big DyeTerminator v.1.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems公司制)根据附件规程进行的。利用常规方法将得到的测序PCR产物纯化,用于DNA序列解析。
由本实施得到的Mut1~13表达载体中,编码表达蛋白质的DNA序列如序列号34~46所示。
3)蛋白质的表达
用上述1)和2)中得到的WT、Mut1~13表达载体将Rosetta(DE3)(Merck公司制)转化,得到分别表达目标蛋白质WT、Mut1~13的转化体。转化法基于Merck公司规程。
将表达目标蛋白质的转化体植入到含有50mg/L羧苄青霉素的LB培养基,在30℃整夜培养得到前培养液。将得到的前培养液10mL植入500mL的LB培养基(含有50mg/L羧苄青霉素),在30℃、130rpm培养直至OD600≈0.6~0.8。以最终浓度成为0.1mM的方式添加异丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG),再继续培养4小时。培养结束后,通过离心进行集菌。
4)蛋白质的回收
使上述3)中集菌的菌体悬浮于50mL的悬浮缓冲液(50mM咪唑,pH8.0,500mMNaCl),进行超声波粉碎。进行离心分离而分成上清液成分和沉淀成分。将上清液成分供给于用悬浮缓冲液平衡化了的HisTrap HP 5mL柱(GE HealthCare Japan公司制),用平衡化缓冲液清洗后,使用溶出缓冲液(175mM咪唑,pH8.0,500mM NaCl)使目标蛋白质溶出。通过透析将溶出的目标蛋白质替换成脱盐水。使用Amicon-Ultra 10K(Merck Millipore公司制)将目标蛋白质离心浓缩至约30~40mg/mL的浓度。使用PBS缓冲液将浓缩后的目标蛋白质制备成2mg/mL。
将纯化结束后的目标蛋白质供给于Tricine SDS-PAGE(e-PAGEL R15S;ATTO公司制),在分子量约14000Da的位置发现了单一条带。使用WT表达载体得到的目标蛋白质是具有序列号47的氨基酸序列的蛋白质,使用Mut1~13表达载体得到的目标蛋白质分别是具有序列号48~60的氨基酸序列的蛋白质。
将WT的连接位置序列(第1连接元件)附近的序列和Mut1~13的变异连接元件附近的序列示于表2。C结构域的二聚体中,D58表示的位置的氨基酸是第1个结构域的C末端,D1’表示的位置的氨基酸是第2个结构域的N末端。另外“/(斜线)”表示氨基酸的缺失。
表2
[实施例1-1]
<胰蛋白酶耐性评价>
1)用以下的方法评价对作为蛋白酶的胰蛋白酶的耐性。
将制作例中得到的Mut1的蛋白质和胰蛋白酶混合,在37℃加热15分钟。配合量如下。
·制作例1的蛋白质(2mg/mL,磷酸缓冲液) 10μL
·稀释用缓冲液(500mM,Tris-HCl,pH8.0) 2μL
·纯水 6μL
·胰蛋白酶溶液(1mg/mL) 2μL
接下来,向得到的混合液中添加20μL电泳用的稀释液(200mM Tris-HCl、pH6.8、200mM DTT、20%甘油、4%SDS、0.012%溴酚蓝;2x样品缓冲液)。取其中的10μL作为样本,用SDS聚丙烯酰胺凝胶实施电泳。作为比较,在相同的凝胶上对同量的没有添加嗜热菌蛋白酶的混合液实施电泳。
将电泳后的凝胶染色,根据染色度比较评价在胰蛋白酶处理前后有无蛋白质的分解。染色度是指通过电泳得到的染色带的位置和强度。
与胰蛋白酶处理前相比,将几乎没有分解的蛋白质(染色度维持90%以上)记为◎,将分解少的蛋白质(染色度维持70%以上且低于90%)记为○,将分解多的蛋白质(染色度维持30%以上且低于70%)记为△,将几乎都分解了的蛋白质(染色度低于30%)记为×。
将结果示于表3。
2)用以下的方法评价对作为蛋白酶的纤溶酶的耐性。
将胰蛋白酶溶液(1mg/mL)替换成纤溶酶溶液(10mg/mL),除此之外,与对胰蛋白酶耐性的评价同样地进行评价。将结果示于表3。
<免疫球蛋白的吸附能力评价(SBC)>
将3mg制作例中得到的Mut1的蛋白质固定于1mL被环氧基活化的多孔丙烯酸珠而制成分离剂,评价与免疫球蛋白的结合能力。
按照常规方法,评价与分离剂的静态吸附容量。将结果示于表3。
[实施例1-2~1-10、比较例1-1~1-4]
代替Mut1的蛋白质,在实施例1-2~1-10中使用制作例中得到的Mut2~10,在比较例1-1中使用WT,在比较例1-2~1-4中使用Mut11~13,除此之外,与实施例1-1同样地实施蛋白酶耐性评价和免疫球蛋白的吸附能力评价。
将结果示于表3。
表3
C末端的赖氨酸没有缺失或者没有被替换的比较例1-1~1-4的胰蛋白酶耐性、纤溶酶耐性均低,与此相对,C末端的赖氨酸缺失或者被替换的实施例1-1~1-10的胰蛋白酶耐性、纤溶酶耐性中某一个至少变高。实施例1-2和1-3的连接位置序列(第1连接元件)为2个氨基酸残基,较短,胰蛋白酶耐性进一步提高。
<本发明的实施方式2的实施例>
[制作例]
1)制作野生型蛋白A表达质粒
化学合成在5’端附加了catatg(NdeI)、在3’端附加了ctcgag(XhoI)的、编码野生型C结构域二聚体(WT)的DNA序列(序列号61)。使用限制性内切酶NdeI和XhoI(均为ThermoScientific公司制)将得到的DNA片段消化后,进行纯化·回收。
应予说明,序列号61是以来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA序列为基础,为了大肠杆菌表达而进行密码子最优化而决定的。
作为蛋白质表达载体,选择具有T7启动子且在多克隆位点下游具有6xHis标签和终止密码子的载体pET22b(Merck公司制)。使用限制性内切酶NdeI和XhoI(均为ThermoScientific公司制)将pET22b消化后,进行纯化·回收。
使用DNA连接酶(LigaFast DNA快速连接系统,Promega公司制)将限制性内切酶处理过的序列号61的DNA片段和pET22b载体连接,构建WT表达载体。
使用WT表达载体进行大肠杆菌JM109(TaKaRa公司制)的转化,利用常规方法扩增和提取质粒DNA。
2)制作蛋白A变异体(Mut)表达质粒
制作包含编码蛋白质Mut1~Mut14的DNA序列(序列号90~103)的表达载体,该蛋白质Mut1~Mut14具有野生型C结构域二聚体的氨基酸序列的一部分缺失和/或替换的变异。Mut1~14表达载体是利用表4所示的模板与合成寡核苷酸引物组(序列号62~89)的组合、使用快速突变法(QuikChange定点突变试剂盒,Agilent Technologies公司制)制作的。快速突变法按照Agilent Technologies公司的规程实施。
表4
得到的Mut1~14表达载体是将JM109(TaKaRa公司制)转化由此利用常规方法进行扩增和提取的。
得到的Mut1~14表达载体的DNA序列的解析使用DNA测序仪3130xl型基因分析仪(Applied Biosystems公司制)进行。表达载体的测序PCR反应使用Big Dye Terminatorv.1.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems公司制),根据附属规程进行。利用常规方法将得到的测序PCR产物纯化,用于DNA序列解析。
由本实施得到的Mut1~14表达载体中,编码表达蛋白质的DNA序列如序列号90~103所示。
3)蛋白质的表达
用上述1)和2)中得到的WT、Mut1~14表达载体将Rosetta(DE3)(Merck公司制)转化,得到分别表达目标蛋白质WT、Mut1~14的转化体。转化法遵照Merck公司规程。
将表达目标蛋白质的转化体植入含有50mg/L羧苄青霉素的LB培养基,在30℃整夜培养而得到前培养液。将得到的前培养液10mL植入500mL的LB培养基(含有50mg/L羧苄青霉素),在30℃、130rpm培养直至OD600≈0.6~0.8。以最终浓度成为0.1mM的方式添加异丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG),再继续培养4小时。培养结束后,通过离心进行集菌。
4)蛋白质的回收
使上述3)中集菌的菌体悬浮于50mL的悬浮缓冲液(50mM咪唑,pH8.0,500mMNaCl),进行超声波粉碎。进行离心分离而分成上清液成分和沉淀成分。将上清液成分供给于用悬浮缓冲液平衡化了的HisTrap HP 5mL柱(GE HealthCare Japan公司制),用平衡化缓冲液清洗后,使用溶出缓冲液(175mM咪唑,pH8.0,500mM NaCl)使目标蛋白质溶出。通过透析将溶出的目标蛋白质替换成脱盐水。使用Amicon-Ultra 10K(Merck Millipore公司制)将目标蛋白质离心浓缩至约30~40mg/mL的浓度。使用PBS缓冲液将浓缩后的目标蛋白质制备成2mg/mL。
将纯化结束后的目标蛋白质供给于Tricine SDS-PAGE(e-PAGEL R15S;ATTO公司制),在分子量约14000Da的位置发现了单一条带。使用WT表达载体得到的目标蛋白质是具有序列号104的氨基酸序列的蛋白质,使用Mut1~14表达载体得到的目标蛋白质分别是具有序列号105~118的氨基酸序列的蛋白质。
将WT的连接元件(第2连接元件)附近的序列和Mut1~14的变异连接元件(第2连接元件)附近的序列示于表5。在C结构域的二聚体中,D58表示的位置的氨基酸是第1个结构域的C末端,D1’表示的位置的氨基酸是第2个结构域的N末端。另外“/(斜线)”表示氨基酸的缺失。
表5
[实施例2-1]
<蛋白酶耐性评价>
1)用以下的方法评价对作为蛋白酶的嗜热菌蛋白酶的耐性。
将制作例中得到的Mut1的蛋白质和嗜热菌蛋白酶混合,在37℃加热15分钟。配合量如下。
·制作例1的蛋白质(2mg/mL,磷酸缓冲液) 10μL
·稀释用缓冲液(500mM Tris-HCl,pH8.0,5mM CaCl2) 2μL
·纯水 6μL
·嗜热菌蛋白酶溶液(1mg/mL) 2μL
接下来,向得到的混合液添加20μL电泳用的稀释液(200mM Tris-HCl、pH6.8、200mM DTT、20%甘油、4%SDS、0.012%溴酚蓝;2x样品缓冲液)。取其中的10μL作为样本,用SDS聚丙烯酰胺凝胶实施电泳。作为比较,在相同的凝胶上对同量的没有添加嗜热菌蛋白酶的混合液实施电泳。
将电泳后的凝胶染色,根据染色度比较评价在嗜热菌蛋白酶处理前后有无蛋白质的分解。染色度是指通过电泳得到的染色带的位置和强度。
与嗜热菌蛋白酶处理前相比,将几乎没有分解的蛋白质(染色度维持90%以上)记为◎,将分解少的蛋白质(染色度维持70%以上且低于90%)记为○,将分解多的蛋白质(染色度维持30%以上且低于70%)记为△,将几乎都分解了的蛋白质(染色度低于30%)记为×。
将结果示于表6。
2)用以下的方法评价对作为蛋白酶的胰蛋白酶的耐性。
将嗜热菌蛋白酶溶液(1mg/mL)变更为胰蛋白酶溶液(1mg/mL),除此之外,与对嗜热菌蛋白酶耐性的评价同样地进行评价。将结果示于表6。
3)用以下的方法评价对作为蛋白酶的纤溶酶的耐性。
将嗜热菌蛋白酶溶液(1mg/mL)变更为纤溶酶溶液(10mg/mL),除此之外,与对嗜热菌蛋白酶耐性的评价同样地进行评价。将结果示于表6。
<免疫球蛋白的吸附能力评价(SBC)>
将3mg制作例中得到的Mut1的蛋白质固定于1mL被环氧基活化的多孔丙烯酸珠而制成亲和分离剂,评价与免疫球蛋白的结合能力。按照常规方法,评价与分离剂的静态吸附容量。
将结果示于表6。
[实施例2-2~2-11、比较例2-1~2-4]
代替Mut1的蛋白质,在实施例2-2~2-11中使用制作例中得到的Mut2~11,在比较例2-1中使用WT,在比较例2-2~2-4中使用Mut12~14,除此之外,与实施例2-1同样地实施蛋白酶耐性评价和免疫球蛋白的吸附能力评价。
将结果示于表6。
表6
连接元件(第2连接元件)没有变异的比较例2-1的嗜热菌蛋白酶耐性低,与此相对,具有变异连接元件(变异第2连接元件)的实施例2-1~2-11的嗜热菌蛋白酶耐性高,且也维持了高的结合能力。比较例2-2和2-3中,虽然缺失了连接元件(第2连接元件)的第1位的疏水性氨基酸但由于具有第5位的疏水性氨基酸所以嗜热菌蛋白酶耐性低。比较例2-4中,由于连接元件(第2连接元件)的第1位和第5位的疏水性氨基酸缺失,所以嗜热菌蛋白酶耐性高,但由于连接元件(第2连接元件)的氨基酸个数少于1,所以结合能力降低。
采用特定的方式对本发明进行了详细的说明,但本领域技术人员清楚在不脱离本发明的意图和范围的情况下能够进行各种变更和变形。此外,本申请基于2015年2月5日申请的日本专利申请(日本特愿2015-021577)和2015年2月5日申请的日本专利申请(日本特愿2015-021578),引用其全部内容。
产业上的可利用性
根据本发明,能够提供对蛋白酶特别是对丝氨酸蛋白酶、嗜热菌蛋白酶具有耐性且具有与免疫球蛋白的结合能力的蛋白质,所以在制造与免疫球蛋白的结合能力优异的亲和配体或耐久性优异的亲和分离剂时可以使用本发明的蛋白质。
符号说明
1 结构域
2 第1或者第2连接元件
3 担载体表面
4 固定用标签
Claims (25)
1.一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质,其特征在于,具有2个以上来源于序列号1~3记载的蛋白A的E、D和A结构域中任一个的结构域,在该结构域的至少一个结构域的氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且C末端的赖氨酸缺失或者被替换。
2.一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质,其特征在于,具有2个以上来源于序列号4~6记载的蛋白A的B、C和Z结构域中任一个的结构域,在该结构域的至少一个结构域的氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸缺失或者被替换。
3.一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质,其特征在于,具有2个以上来源于序列号4~6记载的蛋白A的B、C和Z结构域中任一个的结构域,在该结构域的至少一个结构域的氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列时,至少一个该连接位置序列的C末端的赖氨酸和第4位的赖氨酸缺失或者被替换。
4.根据权利要求1~3中任1项所述的蛋白质,其中,在所述缺失或者被替换的第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸中,该第4位的赖氨酸和/或该C末端的赖氨酸缺失。
5.根据权利要求1~4中任1项所述的蛋白质,其中,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列时,至少一个该连接位置序列由1个以上的氨基酸构成。
6.根据权利要求1~5中任1项所述的蛋白质,其中,在所述缺失或者被替换的第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸中,用亲水性氨基酸替换该第4位的赖氨酸和/或该C末端的赖氨酸。
7.根据权利要求1~6中任1项所述的蛋白质,其中,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列时,在全部的连接位置序列中,赖氨酸缺失或者被替换。
8.根据权利要求1~7中任1项所述的蛋白质,其中,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列时,至少一个该连接位置序列不含赖氨酸。
9.根据权利要求1~8中任1项所述的蛋白质,其中,将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接位置序列时,至少一个该连接位置序列不含精氨酸。
10.一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质,其特征在于,具有2个以上来源于序列号3~6记载的蛋白A的A、B、C和Z结构域中任一个的结构域,将各结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列作为连接元件时,至少一个连接元件是由1个以上的氨基酸构成且是由疏水性氨基酸以外的氨基酸构成的变异连接元件。
11.根据权利要求10所述的蛋白质,其中,所述变异连接元件由A、B或者C结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成,至少一个变异连接元件的氨基酸序列中的第1位的丙氨酸和/或第5位的苯丙氨酸缺失。
12.根据权利要求10所述的蛋白质,其中,所述变异连接元件由Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成,至少一个变异连接元件的氨基酸序列中的第1位的缬氨酸和/或第5位的苯丙氨酸缺失。
13.根据权利要求10或11所述的蛋白质,其中,所述变异连接元件由A、B或者C结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成,用疏水性氨基酸以外的氨基酸替换了至少一个变异连接元件的氨基酸序列中的第1位的丙氨酸和/或第5位的苯丙氨酸。
14.根据权利要求10或12所述的蛋白质,其中,所述变异连接元件由Z结构域的氨基酸序列中的第1位~第5位的序列构成,用疏水性氨基酸以外的氨基酸替换了至少一个变异连接元件的氨基酸序列中的第1位的缬氨酸和/或第5位的苯丙氨酸。
15.根据权利要求13或14所述的蛋白质,其中,在所述变异连接元件中替换的疏水性氨基酸以外的氨基酸为亲水性氨基酸。
16.根据权利要求10~15中任1项所述的蛋白质,其中,缺失或者替换了至少一个结构域的氨基酸序列中的C末端的赖氨酸。
17.根据权利要求16所述的蛋白质,其中,在C末端侧结合所述变异连接元件的结构域中,缺失或者替换了该结构域的氨基酸序列中的C末端的赖氨酸。
18.根据权利要求10~17中任1项所述的蛋白质,其中,至少一个变异连接元件不含赖氨酸。
19.根据权利要求10~18中任1项所述的蛋白质,其中,至少一个变异连接元件不含精氨酸。
20.根据权利要求10~19中任1项所述的蛋白质,其中,至少一个变异连接元件由2个以上的氨基酸构成。
21.根据权利要求10~20中任1项所述的蛋白质,其中,全部的连接元件为变异连接元件。
22.根据权利要求1~21中任1项所述的蛋白质,其中,具有3个以上的结构域。
23.根据权利要求1~22中任1项所述的蛋白质,其中,所述蛋白质所包含的全部结构域来源于序列号1~6记载的蛋白A的E、D、A、B、C和Z结构域的氨基酸序列中任1种。
24.一种亲和分离剂,其特征在于,将权利要求1~23中任1项所述的蛋白质作为亲和配体,固定于由水不溶性的基材构成的担载体。
25.一种液相色谱柱,其特征在于,包括权利要求24所述的亲和分离剂,具备至少1个填充该亲和分离剂的容器。
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