CN112368302B

CN112368302B - 分离剂

Info

Publication number: CN112368302B
Application number: CN201980043779.6A
Authority: CN
Inventors: 熊田阳一; 大仓裕道; 内村诚一
Original assignee: Daicel Corp; Kyoto Institute of Technology NUC
Current assignee: Daicel Corp; Kyoto Institute of Technology NUC
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2019-07-01
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2039-07-01
Also published as: EP3816188B1; EP3816188A1; JPWO2020004668A1; WO2020004668A1; CN112368302A; EP3816188A4; US20210269476A1; JP7370538B2

Abstract

本发明的课题是提供针对目标物质的动态结合量(DBC)得到提高的分离剂，利用下述分离剂来解决该课题，所述分离剂包含担载体和蛋白质，该蛋白质为规定的蛋白质，该担载体的表面与该蛋白质中的该被添加的赖氨酸残基通过化学键而结合。

Description

分离剂

技术领域

本发明涉及分离剂。

背景技术

为了改良亲和层析用柱的性能，迄今为止进行了各种技术的开发。例如，通过将在蛋白A中存在有多个的赖氨酸残基全部取代为其他氨基酸残基，并且向末端重新赋予赖氨酸残基，从而能够介由其侧链的ε氨基而将该蛋白A固定于担载体。就如上所述地制造的柱而言，针对目标物质的结合容量·结合效率被最大化(专利文献1)。

另一方面，已知有下述方法：将抗体的可变区制成单链抗体(single chain Fv，scFv)，通过噬菌体展示法使其提呈于噬菌体的表面，选择与所期望的抗原结合的噬菌体。若对所选择的噬菌体的基因进行分析，则可以确定编码能与抗原结合的单链抗体的DNA序列。而且，使用能与抗原结合的单链抗体，将能够制造该抗原的分离剂。要使用单链抗体来制造抗原的分离剂时，通常使单链抗体结合于分离剂的担载体来进行制造(专利文献2、3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2017-070289号公报

专利文献2：国际公开第2017/082213号

专利文献3：国际公开第2017/082214号

发明内容

发明要解决的课题

本申请的发明人发现，在为了制造从两种以上的水溶性物质的混合液中分离目标物质的分离剂而使单链抗体结合于担载体的表面时，若介由单链抗体原本包含的赖氨酸残基来使其结合，则根据单链抗体所包含的氨基酸序列的不同，存在针对目标物质的分离剂的动态结合量(Dynamic Binding Capacity,DBC)降低的情况。

本发明的课题是提供针对目标物质的动态结合量(DBC)得到提高的分离剂。

用于解决课题的手段

本申请的发明人发现，作为前述分离剂，通过采用下述构成(1)～(3)，能够解决前述课题。

(1)分离剂所包含的单链抗体原本包含的赖氨酸残基被赖氨酸残基以外的氨基酸残基取代。

(2)在分离剂所包含的蛋白质的C末端含有包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列。

(3)担载体的表面与该包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列中的赖氨酸残基通过化学键而结合。

具体而言，如下所述。

一种分离剂，其为包含担载体和蛋白质的分离剂，

该蛋白质包含：

从N末端起依次排列的、序列号1所示的氨基酸序列、序列号2所示的氨基酸序列、及序列号3所示的氨基酸序列，或者

从N末端起依次排列的、序列号3所示的氨基酸序列、序列号17所示的氨基酸序列、及序列号1所示的氨基酸序列；和

位于其C末端的、包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列，

所述蛋白质中，该序列号1所示的氨基酸序列、该序列号2所示的氨基酸序列、该序列号17所示的氨基酸序列、及该序列号3所示的氨基酸序列所包含的全部赖氨酸残基均被赖氨酸残基以外的氨基酸残基取代，

该担载体的表面与该包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列中的赖氨酸残基通过化学键而结合。

另外，本发明的其他方式为一种方法，其使用前述分离剂，从两种以上的水溶性物质的混合液中分离前述蛋白质所结合的水溶性物质。

另外，本发明的其他方式为一种蛋白质，其包含：

位于其C末端的、包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列，

所述蛋白质中，该序列号1所示的氨基酸序列、该序列号2所示的氨基酸序列、该序列号17所示的氨基酸序列、及该序列号3所示的氨基酸序列所包含的全部赖氨酸残基均被赖氨酸残基以外的氨基酸残基取代。

发明的效果

根据本发明，能够提供针对目标物质的动态结合量(DBC)得到提高的分离剂。另外，能够提供使用该分离剂从两种以上的水溶性物质的混合液中分离目标物质的方法。

附图说明

[图1]为示出本发明的一个实施方式涉及的、在亲和层析用柱上固定的蛋白质的量与10％动态结合量(DBC)的关系的图表。

[图2-1]为示出本发明的一个实施方式涉及的、序列号1所示的氨基酸序列及与其实质上相同的氨基酸序列的图。

[图2-2]为示出本发明的一个实施方式涉及的、序列号3所示的氨基酸序列及与其实质上相同的氨基酸序列的图。

具体实施方式

本发明包括：涉及分离剂的发明(第一发明)；以及，涉及使用了该分离剂的、从两种以上的水溶性物质的混合液中分离前述蛋白质所结合的水溶性物质的方法的发明(第二发明)。

单链抗体在该技术领域中作为低分子抗体中的一种，有时被称为单链Fv(singlechain Fv,scFv)等。另外，本说明书中记载的单链抗体也包括来源于兔的单链抗体，但这只不过是单链抗体来源于兔的情况的一个例子，本说明书中记载的单链抗体并不限定于来源于兔的单链抗体。

<1.第一发明>

本发明的第一发明为一种分离剂，

其为包含担载体和蛋白质的分离剂，

该蛋白质包含：

位于其C末端的、包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列，

[担载体]

本发明的第一发明中使用的担载体优选为水不溶性担载体。作为水不溶性担载体，可举出玻璃珠、硅胶等无机担载体、由交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子、结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类形成的有机担载体、以及通过它们的组合而得到的有机-有机、有机-无机等的复合担载体等，其中，亲水性担载体由于非特异吸附较少、本发明的第一发明中使用的蛋白质的选择性良好而优选。此处所谓亲水性担载体，表示将构成担载体的化合物制成平板状时的与水的接触角为60度以下的担载体。作为这样的担载体，可举出纤维素、壳聚糖、葡聚糖等多糖类、聚乙烯醇、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物皂化物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸接枝化聚乙烯、聚丙烯酰胺接枝化聚乙烯、玻璃等。

作为市售品，可例举作为多孔质纤维素凝胶的GCL2000、GC700，将烯丙基葡聚糖与亚甲基双丙烯酰胺通过共价键交联而成的Sephacryl S-1000，作为丙烯酸酯系的担载体的Toyopearl，作为琼脂糖系的交联担载体的SepharoseCL4B，作为用环氧基进行了活化的聚甲基丙烯酰胺的Eupergit C250L等。但是，在本发明的第一发明中，并不仅限定于这些担载体、活化担载体。上述的担载体可以各自单独使用，也可以将任意的2种以上混合。另外，作为本发明的第一发明中使用的水不溶性担载体，从该分离剂的使用目的及方法来看，期望其表面积大，优选具有大量的适当大小的细孔，即优选为多孔质。

作为担载体的形态，为珠状、纤维状、膜状(也包括中空纤维)等均可，可以选择任意的形态。从具有特定的排阻极限分子量的担载体的制作容易性考虑，特别优选采用珠状。对于珠状的平均粒径而言，为10～2500μm时易于使用，尤其是从容易介由所添加的赖氨酸残基而将本发明的第一发明中所使用的蛋白质向担载体表面进行固定化的方面考虑，优选为25～800μm的范围。

此外，在担载体表面存在能用于与本发明的第一发明所使用的蛋白质中的前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列中的赖氨酸残基之间的化学键合反应的官能团时是合适的。作为这些官能团的代表例，可举出羟基、氨基、醛基、羧基、巯基、硅醇基、酰胺基、环氧基、琥珀酰亚胺基、酸酐基、碘乙酰基等。

[所添加的赖氨酸与担载体表面的化学键合]

作为使担载体表面与本发明的第一发明中所使用的蛋白质介由该蛋白质中的前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列中的赖氨酸残基进行化学键合的方法(固定化方法)，可举出介由该赖氨酸残基的ε氨基进行化学键合的方法，例如，可举出通过以往的偶联法使其共价键合于担载体的方法等。作为偶联法，可举出通常在将蛋白质、肽固定于担载体的情况下采用的方法。例如，可举出下述方法：使担载体与溴化氰、表氯醇、二缩水甘油基醚、对甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯、肼、高碘酸钠等反应来进行活化(或者，向担载体表面导入反应性官能团)，并与赖氨酸残基进行偶联反应的方法；向存在担载体和赖氨酸残基的体系中加入碳二亚胺这样的缩合试剂、或者如戊二醛这样在分子中具有多个官能团的试剂，进行缩合、交联从而实施的方法。其中，更优选使用在分离剂的灭菌时或利用时、赖氨酸残基不会容易地自担载体脱离的结合方法。另外，可以在赖氨酸残基与担载体之间导入由多个原子形成的间隔物分子，也可以将赖氨酸残基直接固定于担载体。

作为使担载体表面与本发明的第一发明中所使用的蛋白质介由该蛋白质中的前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列中的赖氨酸残基进行化学键合的方法的具体例，可举出实施例中记载那样的、使用HiTrap NHS-activated HP柱(GE Healthcare)的固定化方法。

[蛋白质]

本发明的第一发明中使用的蛋白质包含：

位于其C末端的、包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列，

前述序列号1所示的氨基酸序列为专利文献2、3中记载的单链抗体R3-26中的重链(H链)的可变区(V_H结构域)的氨基酸序列。

前述序列号3所示的氨基酸序列为专利文献2、3中记载的单链抗体R3-26中的轻链(L链)的可变区(V_L结构域)的氨基酸序列。

前述序列号2所示的氨基酸序列、前述序列号17所示的氨基酸序列为专利文献2、3中记载的单链抗体R3-26中的将V_H结构域与V_L结构域连接的接头序列。

本发明的第一发明中使用的蛋白质介由前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列中的赖氨酸残基而与担载体的表面通过化学键结合。前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列的氨基酸残基数目优选为3个残基以上，更优选为4个残基以上，进一步优选为5个残基以上。另一方面，从使其与其他的接头氨基酸序列、蛋白质结合的观点考虑，优选为1000个残基以下，更优选为100个残基以下，进一步优选为15个残基以下。

另外，前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列中的赖氨酸残基的个数优选为4以上，更优选为5以上，上限优选为1000以下，更优选为100以下，进一步优选为10以下。另外，在添加有多个赖氨酸残基的情况下，各个赖氨酸残基不必连续(相邻)，只要能够发挥本发明的效果，则也可以在其间含有赖氨酸残基以外的氨基酸残基，但优选连续(相邻)。

前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列优选为在连续的3个以上赖氨酸残基的N末端侧存在AAAGGGGS(序列号13)、在C末端侧存在IE的氨基酸序列。

参照专利文献2、3可以理解，单链抗体R3-26识别来源于人血清的IgG多克隆抗体并进行结合。此外，参照专利文献2、3可以理解，单链抗体R3-26识别选自由作为其亚型的来源于人血清的IgG1多克隆抗体、来源于人血清的IgG2多克隆抗体、来源于人血清的IgG3多克隆抗体、及来源于人血清的IgG4多克隆抗体组成的组中的一种以上的抗体并进行结合。单链抗体R3-26为来源于兔的单链抗体，但对单链抗体所来源的动物没有特别限制。作为单链抗体所来源的动物，例如，可举出人、大鼠、小鼠、兔、鸡、山羊、绵羊、牛、马、狗、猫、猴等。

本发明的第一发明中使用的蛋白质中，序列号1所示的氨基酸序列、序列号2所示的氨基酸序列、序列号17所示的氨基酸序列、及序列号3所示的氨基酸序列中包含的赖氨酸残基全部被赖氨酸残基以外的氨基酸残基取代。作为该赖氨酸残基以外的氨基酸残基，优选为半胱氨酸残基以外的氨基酸残基，作为其具体例，可举出精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、谷氨酸残基。

序列号1所示的氨基酸序列也可以是与其实质上等同的氨基酸序列，只要能够发挥本发明的效果即可。

所谓与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列，是虽然并非序列号1所示的氨基酸序列、但能够发挥本发明的效果的氨基酸序列，是对除了V_H结构域的CDR区域之外的氨基酸序列进行比较时按逐渐更优选的顺序而具有70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的同源性的氨基酸序列。

作为这样的氨基酸序列，例如，可举出序列号18(同源性：79.3％)、序列号19(同源性：79.3％)、序列号20(同源性：88.6％)、序列号21(同源性：86.2％)、序列号22(同源性：81.6％)、序列号23(同源性：81.8％)、序列号24(同源性：80.5％)、序列号25(同源性：81.6％)。另外，与上述各氨基酸序列具有优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的同源性的氨基酸序列也包含在与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列中。

另外，序列号3所示的氨基酸序列也可以是与其实质上等同的氨基酸序列，只要能够发挥本发明的效果即可。

所谓与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列，是虽然并非序列号3所示的氨基酸序列、但能够发挥本发明的效果的氨基酸序列，是对除了V_L结构域的CDR区域之外的氨基酸序列进行比较时按逐渐更优选的顺序而具有70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的同源性的氨基酸序列。

作为这样的氨基酸序列，例如，可举出序列号26(同源性：78.0％)、序列号27(同源性：89.0％)、序列号28(同源性：86.4％)、序列号29(同源性：81.3％)、序列号30(同源性：87.9％)、序列号31(同源性：85.7％)、序列号32(同源性：82.4％)、序列号33(同源性：92.3％)。另外，与上述各氨基酸序列具有优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的同源性的氨基酸序列也包含在与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列中。

另外，对于与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列、与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列而言，也可以是下述氨基酸序列：在设想为已将序列号1所示的氨基酸序列与序列号3所示的氨基酸序列连结的情况时，在该连结成的氨基酸序列整体之间以将V_H结构域的CDR区域的氨基酸序列及V_L结构域的CDR区域的氨基酸序列除外的方式算出的、基于NCBI的BLOSUM62的同源性评分(score)值按逐渐更优选的顺序为500以上、550以上、600以上、650以上、700以上的氨基酸序列。另外，也可以是在该连结成的氨基酸序列整体之间以将V_H结构域的CDR区域的氨基酸序列及V_L结构域的CDR区域的氨基酸序列除外的方式算出的同源性按逐渐更优选的顺序为70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的氨基酸序列。

作为这样的氨基酸序列，例如为：

作为与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号18，作为与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号26(同源性评分值：718，同源性：78.70％)，

作为与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号19，作为与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号27(同源性评分值：762，同源性：84.30％)，

作为与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号20，作为与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号28(同源性评分值：807，同源性：87.50％)，

作为与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号21，作为与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号29(同源性评分值：737，同源性：80.90％)，

作为与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号22，作为与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号30(同源性评分值：763，同源性：84.80％)，

作为与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号23，作为与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号31(同源性评分值：766，同源性：83.80％)，

作为与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号24，作为与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号32(同源性评分值：740，同源性：81.50％)，

作为与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号25，作为与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的序列号33(同源性评分值：744，同源性：87.10％)。

另外，与上述各氨基酸序列具有优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的同源性的氨基酸序列也分别包含在与序列号1所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列、与序列号3所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列中。

序列号2所示的氨基酸序列也可以是与其实质上等同的氨基酸序列，只要能够发挥本发明的效果即可。

所谓与序列号2所示的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列，是虽然并非序列号2所示的氨基酸序列、但能够发挥本发明的效果的氨基酸序列，是与序列号2所示的氨基酸序列具有优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的同源性的氨基酸序列。

这对于序列号17所示的氨基酸序列、前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列而言也是同样的。

图2-1示出序列号1所示的氨基酸序列及与其实质上相同的氨基酸序列，图2-2示出序列号3所示的氨基酸序列及与其实质上相同的氨基酸序列。各图中的克隆号为专利文献2、3中记载的各单链抗体的克隆号，各序列为该各单链抗体中的V_H结构域和V_L结构域的序列。以各结构域中的CDR区域和FR区域也明了的方式进行了记载。

另外，对于序列号1所示的氨基酸序列而言，只要能够发挥本发明的效果，则也可以是其中的1至多个氨基酸进行了取代、缺失、插入及/或添加而成的氨基酸序列。所谓1至多个，按逐渐更优选的顺序为1～12个、1～10个、1～5个、1～3个。

另外，对于序列号3所示的氨基酸序列而言，只要能够发挥本发明的效果，则也可以是其中的1至多个氨基酸进行了取代、缺失、插入及/或添加而成的氨基酸序列。所谓1至多个，按逐渐更优选的顺序为1～12个、1～10个、1～5个、1～3个。

另外，对于序列号2所示的氨基酸序列而言，只要能够发挥本发明的效果，则也可以是其中的1至多个氨基酸进行了取代、缺失、插入及/或添加而成的氨基酸序列。所谓1至多个，按逐渐更优选的顺序为1～3个、1～2个、1个。

另外，对于序列号17所示的氨基酸序列而言，只要能够发挥本发明的效果，则也可以是其中的1至多个氨基酸进行了取代、缺失、插入及/或添加而成的氨基酸序列。所谓1至多个，按逐渐更优选的顺序为1～3个、1～2个、1个。

另外，对于前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列而言，只要能够发挥本发明的效果，则也可以是其中的1至多个氨基酸进行了取代、缺失、插入及/或添加而成的氨基酸序列。所谓1至多个，按逐渐更优选的顺序为1～[前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列的氨基酸残基数目的10％]个、1～[前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列的氨基酸残基数目的5％]个、1～[前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列的氨基酸残基数目的2.5％]个、1～[前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列的氨基酸残基数目的1％]个、1个。需要说明的是，将尾数进上来。

上述的序列号1所示的氨基酸序列中的1至多个氨基酸的取代、缺失、插入及/或添加是包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质的功能维持正常的保守性突变。

代表性的保守性突变为保守性取代。所谓保守性取代，在取代部位为芳香族氨基酸的情况下是Phe、Trp、Tyr间彼此取代的突变，在取代部位为疏水性氨基酸的情况下是Leu、Ile、Val间彼此取代的突变，在取代部位为极性氨基酸的情况下是Gln、Asn间彼此取代的突变，在取代部位为碱性氨基酸的情况下是Lys、Arg、His间彼此取代的突变，在取代部位为酸性氨基酸的情况下是Asp、Glu间彼此取代的突变，在取代部位为具有羟基的氨基酸的情况下是Ser、Thr间彼此取代的突变。

作为保守性取代，具体而言，可举出从Ala向Ser或Thr的取代，从Arg向Gln、His或Lys的取代，从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代，从Asp向Asn、Glu或Gln的取代，从Cys向Ser或Ala的取代，从Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代，从Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代，从Gly向Pro的取代，从His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代，从Ile向Leu、Met、Val或Phe的取代，从Leu向Ile、Met、Val或Phe的取代，从Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代，从Met向Ile、Leu、Val或Phe的取代，从Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，从Ser向Thr或Ala的取代，从Thr向Ser或Ala的取代，从Trp向Phe或Tyr的取代，从Tyr向His、Phe或Trp的取代，以及，从Val向Met、Ile或Leu的取代。

这对于序列号2所示的氨基酸序列、序列号17所示的氨基酸序列、序列号3所示的氨基酸序列、前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列而言也是同样的。

另外，只要发挥本发明的效果，则也可以在前述包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列的C末端附加His标签、GST标签、FLAG标签等标签。这些标签可以包含赖氨酸残基。

单链抗体R3-26可以通过专利文献2、3中记载的方法获得，也可以通过已知的基因工程方法、蛋白质工程方法等获得。

另外，包含与单链抗体R3-26的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的蛋白质也可以通过专利文献2、3中记载的方法获得，还可以通过已知的基因工程方法、蛋白质工程方法等对单链抗体R3-26的氨基酸序列进行修饰从而获得。

对于任一者而言，只要结果能得到包含单链抗体R3-26、或与单链抗体R3-26的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列的蛋白质即可，其方法没有限制。

此外，本发明的第一发明中使用的蛋白质可以通过利用已知的基因工程方法、蛋白质工程方法等对单链抗体R3-26的氨基酸序列或与单链抗体R3-26的氨基酸序列实质上等同的氨基酸序列进行修饰从而获得，只要结果能得到包含目标氨基酸序列的蛋白质即可，其方法没有限制。

[动态结合量(Dynamic Binding Capacity,DBC)]

在蛋白质向担载体上的固定量、流速等条件相同的情况下，本发明的第一发明涉及的分离剂的动态结合量(DBC)较之介由单链抗体R3-26的氨基酸序列中原本的赖氨酸残基而使该单链抗体结合于担载体表面的分离剂的动态结合量(DBC)而言不小、即更大或相同。

对于本发明的第一发明涉及的分离剂的动态结合量(DBC)而言，例如，以[流速1.0mL/min时的10％DBC(mg/mL)]/[蛋白质向柱上的固定化量(mg)]的值计，为介由单链抗体R3-26的氨基酸序列中原本的赖氨酸残基而使该单链抗体结合于担载体表面的分离剂的动态结合量(DBC)的优选1.00倍以上、更优选1.20倍以上、进一步优选1.40倍以上、更进一步优选1.60倍以上。

本发明的第一发明涉及的分离剂的动态结合量(DBC)可以通过已知的方法测定，例如，可以通过实施例中记载的方法测定。

<2.第二发明>

本发明的第二发明为一种方法，其使用本发明的第一发明涉及的分离剂，从两种以上的水溶性物质的混合液中分离前述蛋白质所结合的水溶性物质。

两种以上的水溶性物质中的一种优选为来源于人血清的IgG多克隆抗体，更优选为选自由作为其亚型的来源于人血清的IgG1多克隆抗体、来源于人血清的IgG2多克隆抗体、来源于人血清的IgG3多克隆抗体、及来源于人血清的IgG4多克隆抗体组成的组中的一种以上的抗体。

本发明的第二发明涉及的方法中，除了在适于分离水溶性物质的条件下进行以外，还可以通过与在担载体上固定有抗体的通常的亲和层析同样的操作，来进行试样的分析、前述蛋白质所结合的水溶性物质从试样中的分离。

<3.第三发明>

本发明的其他方式为一种蛋白质，其包含：

位于其C末端的、包含3个以上赖氨酸残基的氨基酸序列，

关于本方式涉及的蛋白质的详情援引本发明的第一发明的说明中的“蛋白质”栏的说明。

因此，本方式涉及的蛋白质具有与来源于人血清的IgG多克隆抗体结合的活性。此外，还具有与选自由作为其亚型的来源于人血清的IgG1多克隆抗体、来源于人血清的IgG2多克隆抗体、来源于人血清的IgG3多克隆抗体、及来源于人血清的IgG4多克隆抗体组成的组中的一种以上的抗体结合的活性。

实施例

以下，通过实施例来更具体地说明本发明，但本发明不限定于下述的实施例，只要不脱离其主旨即可。

[制造例1]

参考专利文献2、3构建了下述载体，所述载体用于由编码含有包含从N末端起依次排列的序列号1所示的氨基酸序列、序列号2所示的氨基酸序列及序列号3所示的氨基酸序列的蛋白质(专利文献2、3中记载的单链抗体R3-26)、和位于其C末端侧的序列号4所示的接头氨基酸序列的蛋白质的DNA(序列号9)表达该蛋白质。

将上述含有包含从N末端起依次排列的序列号1所示的氨基酸序列、序列号2所示的氨基酸序列及序列号3所示的氨基酸序列的蛋白质、和其C末端侧的序列号4所示的接头氨基酸序列的氨基酸序列所组成的氨基酸序列作为序列号5。

需要说明的是，所构建的表达载体以在N末端融合有周质转运信号(pelB Leadersignal)序列、在前述序列号4所示的接头氨基酸序列的C末端侧融合有组氨酸标签(6×His-tag)的形式进行表达。表达后，蛋白质转移至周质，pelB Leader signal序列被信号肽酶切断。

利用所构建的表达载体对大肠杆菌Rosetta(DE3)进行转化，将该转化后的大肠杆菌在LB琼脂平板(50mg/L氨苄西林)上进行培养。将得到的单菌落在LB培养基10mL(50mg/L氨苄西林)中培养一夜。利用得到的培养液在50mL Overnight Express TB培养基(MerckMillipore)中植菌，在37℃、200rpm的条件下培养24小时。

对得到的培养液进行离心分离(10000rpm，4℃，15分钟)，得到培养上清液。使该培养上清液从孔径0.45μm的亲水性Durapore膜(Merck Millipore)通过从而进行过滤，将其滤液上样到HisTrap FF crude柱(GE Healthcare)中，将蛋白质捕获在柱上。所捕获的蛋白质用0.4M咪唑进行洗脱。另外，利用DC Protein assay(Biorad)对洗脱后的蛋白质浓度进行定量。进而，通过SDS-PAGE来确认洗脱液中的蛋白质的纯度。将回收的蛋白质溶液的溶剂置换为PBST，如后所述地，利用BiacoreX-100测定解离常数K_D。

[制造例2]

如下所述地对由制造例1中使用的序列号5所示的氨基酸序列形成的蛋白质进行修饰。将修饰蛋白质称为“R3-26 repCK+K”，将其氨基酸序列作为序列号6。

·在序列号1所示的氨基酸序列中，将由IMGT编号指定的14位的赖氨酸残基取代为苏氨酸残基，将由IMGT编号指定的48位的赖氨酸残基取代为谷氨酸残基，将由IMGT编号指定的72位、80位和90位的赖氨酸残基取代为精氨酸残基。

·在序列号2所示的氨基酸序列中，未进行氨基酸残基的取代。

·在序列号3所示的氨基酸序列中，将由IMGT编号指定的22位的赖氨酸残基取代为天冬酰胺残基，将由IMGT编号指定的51位的赖氨酸残基取代为精氨酸残基，将由IMGT编号指定的77位的赖氨酸残基取代为丝氨酸残基，将由IMGT编号指定的96位的半胱氨酸残基取代为丝氨酸残基。

·在序列号4所示的氨基酸序列中，从N末端侧至C末端侧依次为AAAGGGGSKIE(序列号14)。

需要说明的是，将编码R3-26 repCK+K的氨基酸序列的DNA的碱基序列作为序列号10。

[制造例3]

如下所述地对由制造例1中使用的序列号5所示的氨基酸序列形成的蛋白质进行修饰。将修饰蛋白质称为“R3-26 repCK+K3”，将其氨基酸序列作为序列号7。

·在制造例2中使序列号4所示的氨基酸序列为AAAGGGGSKKKIE(序列号15)，除此以外，与制造例2同样地操作。

需要说明的是，将编码R3-26 repCK+K3的氨基酸序列的DNA的碱基序列作为序列号11。

[制造例4]

如下所述地对由制造例1中使用的序列号5所示的氨基酸序列形成的蛋白质进行修饰。将修饰蛋白质称为“R3-26 repCK+K5”，将其氨基酸序列作为序列号8。

·在制造例2中使序列号4所示的氨基酸序列为AAAGGGGSKKKKKIE(序列号16)，除此以外，与制造例2同样地操作。

需要说明的是，将编码R3-26 repCK+K5的氨基酸序列的DNA的碱基序列作为序列号12。

使用了前述制造例1～4中得到的蛋白质的解离常数K_D的测定在以下的测定条件下进行。

传感器芯片：人IgG1偶联CM5

电泳缓冲液：PBST

结合时间(Binding time)：180sec

解离时间(Dissociation time)：600-800sec

洗脱：10mM甘氨酸，pH1.5

模式：单循环动力学模式

表1中汇总了制造例1～4中得到的蛋白质的制备时的收量和解离常数K_D的测定结果。与制造例1中得到的蛋白质相比，制造例2～4中得到的蛋白质均未观察到生产量的降低，解离常数K_D均为相同的量级。

由以上的结果可知，氨基酸序列的修饰不会导致其生产率和由解离常数K_D表示的结合能力出现显著降低。

[表1]

表1

[参考例1-1]

按照与制造例1同样的步骤进行，将通过超滤而回收的蛋白质溶液的溶剂置换为包含0.5M NaCl的0.2M碳酸氢钠缓冲液(pH8.3)。

(蛋白质向担载体上的固定化)

向HiTrap NHS-activated HP柱1mL(GE Healthcare)供给经纯化的蛋白质，介由该蛋白质所包含的赖氨酸残基的氨基而进行固定化。对于未反应的NHS酯，加入三羟甲基氨基甲烷来进行封闭。使前述蛋白质向柱上的固定化量为4.0mg。

(动态结合量的测定)

将固定有蛋白质的上述柱设置于色谱系统AKTA Purifier UPC10(GHHealthcare)，用PBS进行平衡化。以1mL/min的流速向其中持续供给已被制备成1mg/mL的来源于人血清的IgG多克隆抗体(WAKO)，得到穿透曲线。由得到的穿透曲线的10％穿透点的洗脱容量算出10％动态结合量(DBC)。

[参考例1-2]

使蛋白质向柱上的固定化量为5.0mg，除此以外，与参考例1-1同样地操作。

[比较例1]

作为蛋白质，使用制造例2中制造的蛋白质“R3-26 repCK+K”，除此以外，与参考例1-1同样地操作。

[实施例1-1]

作为蛋白质，使用制造例3中制造的蛋白质“R3-26 repCK+K3”，使其固定化量为5.0mg，除此以外，与参考例1-1同样地操作。

[实施例1-2]

作为蛋白质，使用制造例4中制造的蛋白质“R3-26 repCK+K5”，使其固定化量为5.0mg，除此以外，与参考例1-1同样地操作。

[结果]

将结果汇总于表2中。需要说明的是，表中的参考例的结果为参考例1-1与参考例1-2的结果的平均值。

与参考例相比，实施例1-1、实施例1-2中的固定化蛋白质的每单位量的DBC值更大。另一方面，与参考例相比，比较例1中的固定化蛋白质的每单位量的DBC值更小。

以上的结果表明，与担载体的表面通过化学键而结合的赖氨酸残基数目为1时，担载体上的目标物质的捕获效率未提高，但通过设定为3以上，担载体上的目标物质的捕获效率提高。

[表2]

表2

[参考例2]

将蛋白质向柱上的固定化量设为宽范围的量，除此以外，与参考例1-1同样地操作。

[实施例2]

将制造例4中制造的蛋白质“R3-26 repCK+K5”向柱上的固定化量设为宽范围的量，除此以外，与参考例1-1同样地操作。

[结果]

图1示出结果。图中的虚线为得到的标绘点(plot)的拟合直线。

由该结果可知，在宽泛的固定化量范围内，实施例2与参考例2相比目标物质的捕获效率更高。