JP6171331B2 - Ｆｃ結合性タンパク質の精製方法および定量方法 - Google Patents
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本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質の精製方法および定量方法に関する。特に本発明は、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたＦｃ結合性タンパク質の精製方法、および試料中に含まれるＦｃ結合性タンパク質の定量方法に関する。
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８ｍｏｌ／Ｌ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
ヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）、および遺伝子配列はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。
ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのα鎖は図１に示す構造をとり、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目から１５番目までの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目から３１３番目までの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目から３７４番目までの領域）から構成される。
ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのα鎖は図１に示す構造をとり、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目から１５番目までの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目から３１３番目までの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目から３７４番目までの領域）から構成される。
前述した通りＦｃγＲＩの細胞外領域を構成するタンパク質（以下、Ｆｃ結合性タンパク質という）は、高度な親和性のもと、ヒト抗体に対する優れた識別機能を有している。この高度な親和性に基づいて、Ｆｃ結合性タンパク質は、診断試薬、抗体医薬品の研究用ツールまたはＩｇＧなどの抗体医薬品の製造工程で利用されるアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして活用する方法が報告されている（特許文献１）。また、近年になり見出されたＦｃ結合性タンパク質の予想外の免疫抑制的な生物学的特性により、自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。
Ｆｃ結合性タンパク質α鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（非特許文献４）はＡｌｌｅｎ等により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）または動物細胞を（非特許文献３）利用した発現が報告されている。さらにはバチルス属細菌（特許文献２）、酵母（特許文献３）、麹菌（特許文献４）など、多様な遺伝子発現系でのＦｃ結合性タンパク質の発現が報告されている。特に大腸菌を用いる系では高密度培養生産法が開発され（特許文献５）、疎水クロマトグラフィー（特許文献６）や陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製する方法が開発されるに至り、さらには、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを改変することにより、Ｆｃ結合性タンパク質の安定化、生産性の向上が報告される（特許文献７）など、Ｆｃ結合性タンパク質の産業利用への関心が高まっている。
一方でＦｃ結合性タンパク質は精製時のロスによる低回収率が問題となっており、産業利用において重大な欠点となっていた。前述した疎水クロマトグラフィーによる方法や陽イオン交換クロマトグラフィーによる方法では一回のクロマトグラフィーでは大腸菌細胞由来の不純物が残存し、これらを組合わせて複数回のカラム精製を行なう必要があった。そこで、大腸菌等から抽出したＦｃ結合性タンパク質の純度を効率的に向上させ、精製工程を円滑に進めるための精製法の確立が求められていた。
また、抽出液中または精製途中のＦｃ結合性タンパク質は、従来より酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）で定量しているが、ＥＬＩＳＡ法は操作が煩雑なことに加え、製造工程管理で要求される感度より過剰に高感度であるため、高倍率に希釈して測定しなければならず、測定誤差が大きいという問題があった。かかる問題の解決として液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法が考えられるが、Ｆｃ結合性タンパク質は通常の方法でＨＰＬＣを行なうと溶液中の夾雑物の影響によりＨＰＬＣカラムへの吸着阻害やＦｃＲの溶出位置付近に不純物が溶出されるなどの問題があり、これらの解決も求められていた。
Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
本発明の目的は、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてＦｃ結合性タンパク質を高純度に精製する方法、および試料中に含まれるＦｃ結合性タンパク質を簡便かつ高精度に定量する方法を提供することにある。
本願発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、少なくとも陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するＦｃ結合性タンパク質を含むアプライ液、またはＦｃ結合性タンパク質を定量する試料に一定濃度のアルギニンを含ませることにより、前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下の（Ａ）から（Ｇ）に記載の態様を包含する。
（Ａ）あらかじめ平衡化液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にＦｃ結合性タンパク質を含むアプライ液を添加してＦｃ結合性タンパク質を前記担体に吸着させる工程と前記担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出液を用いて溶出させる工程とを含むＦｃ結合性タンパク質の精製方法であって、少なくとも前記アプライ液が０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを含んでいる、前記精製方法。
（Ｂ） 前記平衡化液、前記アプライ液および前記溶出液が０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを含んでいる、（Ａ）に記載の精製方法。
（Ｃ） Ｆｃ結合性タンパク質を含むアプライ液が、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得られた形質転換体の抽出物を含む、（Ａ）または（Ｂ）に記載の精製方法。
（Ｄ）宿主が大腸菌である、（Ｃ）に記載の精製方法。
（Ｅ）Ｆｃ結合性タンパク質が、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
（Ａ）から（Ｄ）のいずれかに記載の精製方法。
（Ａ）から（Ｄ）のいずれかに記載の精製方法。
（Ｆ）高速液体クロマトグラフィーにより得られる溶出ピーク面積から試料中に含まれるＦｃ結合性タンパク質を定量する方法であって、前記試料が０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを含んでいる、前記方法。
（Ｇ）あらかじめ０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを含む平衡化液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用カラムに０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／ＬのアルギニンとＦｃ結合性タンパク質を含む試料を添加してＦｃ結合性タンパク質を前記担体に吸着させ、前記カラムに吸着したＦｃ結合性タンパク質を０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンと水溶性の塩を含む溶出液を用いて前記タンパク質を溶出させ、前記溶出液により溶出した液に含まれるＦｃ結合性タンパク質を検出器で検出することで得られたクロマトグラムから前記タンパク質の溶出ピーク面積を算出し、前記算出した溶出ピーク面積から試料中に含まれるＦｃ結合性タンパク質を定量する方法。
以下に、本発明について詳細に説明する。
本発明においてＦｃ結合性タンパク質とは、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域（図１ではＥＣ領域））を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもＦｃ結合性タンパク質（すなわち、ＦｃγＲＩの細胞外領域）の全領域でなくてもよく、Ｆｃ結合性タンパク質を構成するポリペプチドのうち、少なくとも抗体（ＩｇＧ）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。Ｆｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のヒトＦｃ結合性タンパク質があげられる。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のヒトＦｃ結合性タンパク質があげられる。
本発明の精製方法で、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加する、Ｆｃ結合性タンパク質を含むアプライ液を調製するには、ヒト細胞から直接抽出してもよいし、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主に導入して得られた形質転換体の抽出物を用いてもよいが、前記タンパク質を安定的にかつ大量に得られる点で後者が好ましい。
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、直接ヒト細胞から抽出して得てもよいが、前記ヒト細胞からの抽出物を核酸増幅することで得たり、既知のヌクレオチド配列を基に人工的に直接合成して得たほうが好ましい。前記ポリヌクレオチドを人工的に合成するには、前記ポリヌクレオチドの全長をＤＮＡ自動合成機などで直接合成してもよいが、化学合成した数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群をＰＣＲ法によりアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製する、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）やＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．、４７、４４１−４４５、２００６）を用いると、より効率的な合成が可能である。
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列情報から変換して得る場合、アミノ酸配列として変化しない範囲であれば任意のヌクレオチド配列が選択できるが、好ましくは発現させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮の上変換するのが好ましい。コドンの使用頻度は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）を用いることで解析することができる。
本発明においてＦｃ結合性タンパク質は、抗体結合活性を損なわない範囲で任意のオリゴペプチドを付加してもよい。前記任意のオリゴペプチドの例として、６残基程度のヒスチジンからなるＨｉｓタグ配列やｃ−ｍｙｃ抗原配列といった分析や精製を容易にするためのタグ配列、微生物での分泌発現を促すためのシグナルペプチドなどがあげられる。Ｆｃ結合性タンパク質に前記タグ配列を付加する場合は、Ｎ末端側またはＣ末端側に付加してもよいし、抗体結合活性を失わない範囲であればタンパク質内に挿入してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質に前記シグナルペプチドを付加する場合は、Ｎ末端側に付加すればよく、公知のシグナルペプチドの中から発現に用いる宿主に応じて適宜選択して用いればよい。なおＦｃ結合性タンパク質を発現させる宿主として大腸菌を用いる場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特開２０１１−０９７８９８号）。また宿主として枯草菌や麹菌を用いる場合は、プロテアーゼやアミラーゼのシグナルペプチドがあげられる。
本発明においてＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単にＦｃ結合性タンパク質のポリヌクレオチドとする）を用いて宿主を形質転換する際、Ｆｃ結合性タンパク質のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミドなど）の適切な位置にポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお、前記発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターが例示できる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターにポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーターといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。宿主が大腸菌である場合の前記プロモーターの例として、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、さらにはλファージのλＰＬプロモーター、λＰＲプロモーターがあげられる。
前記方法により作製したＦｃ結合性タンパク質のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターで宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主とし大腸菌を選択する場合には、コンピテントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法などにより形質転換すればよい。
形質転換体を培養する方法については特に限定はなく、通常の液体培地やそれを寒天で固めた固体培地を用いればよい。固体培地の形状にも限定はなく、斜面培地であってもよいし平板培地であってもよい。培地の組成としては、形質転換体が増殖し、かつＦｃ結合性タンパク質を発現し得るものであればよい。炭素源としては、糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが用いられる。窒素源としては、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ペプトン、コーンスティープリカー、酵母エキスなどが用いられる。無機塩としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸塩、塩化ナトリウムなどが用いられる。金属イオンとしては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが用いられる。ビタミン類としては、酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンなどが用いられる。なお、固体培地を用いる場合には上記の組成の培地に寒天やジェランガムといった固形化剤を加熱溶解させた後に、培養に用いる試験管やシャーレに分注し、さらに目的の温度まで冷却して固形化することで得られる。
形質転換体の培養温度は１０℃から４０℃が好ましい。培養のｐＨは用いる宿主の性質に応じて設定され、大腸菌や枯草菌の場合にはｐＨは６から８が好ましく、酵母や麹菌ではより低いｐＨ４から７が好ましく用いられる。また、培養時間は任意に設定できるが、Ｆｃ結合性タンパク質が十分に生産される時間であることが好ましく、通常は数時間から２００時間の間に設定すればよい。なお宿主が麹菌の場合は、小麦麩麹等の固形培養法を行なうことも可能である。この場合は小麦麩等を湿潤状態で加熱滅菌したのち、Ｆｃ結合性タンパクを含むプラスミドにて形質転換した菌を植菌し、１０℃から４０℃で培養する。培養中は培養容器を静置しておけば良いが、より好ましくは１日に１回以上、任意のスピードで任意の時間、容器内の麹を撹拌する。これにより、完全に静置した場合より高い生産性が得られる。撹拌の方法は、雑菌の混入が防げる方法であれば特に限定はされない。
Ｆｃ結合性タンパク質のポリヌクレオチドを含むベクターに誘導性のプロモーターを含んでいる場合は、目的タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導すればよい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
得られた形質転換体培養液から抽出物を得るには、遠心分離操作により菌体を集めた後、一般的な細胞抽出方法により抽出物を得ればよい。抽出方法の例として、超音波破砕処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕による方法や、リゾチーム等の酵素処理や、界面活性剤による処理方法があげられる。なお前述した破砕処理後、ｐＨ２．５からｐＨ５．０の条件下で酸処理すると、破砕液に含まれる夾雑タンパク質が効率的に除去できるため、好ましい（特願２０１２−２４４４３５号）。
本発明の精製方法は、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液（例えば、前述した方法で得られた形質転換体の抽出物）（アプライ液）に０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを添加して、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行なうことを特徴としている。なおＦｃ結合性タンパク質を含む溶液が形質転換体の抽出物の場合、アルギニンを添加する前に脱塩操作を行なうと好ましい。脱塩は透析や希釈等、当業者にとって一般的な方法で行なえばよい。脱塩の目安として前記抽出液の電気伝導度が５０ｍＳ／ｃｍ以下、好ましくは２０ｍＳ／ｃｍ以下となるまで行なえばよい。前記抽出液のｐＨに特に限定はないが、ｐＨ３．５から８の間が好ましく、さらに好ましくはｐＨ５から７の間である。なお脱塩操作およびアルギニン添加操作において、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液に沈殿物が生じた場合、そのままアプライ液として陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加してもよいが、遠心分離やろ過などの当業者が通常行なう方法により清澄化してから添加したほうが好ましい。
本発明の精製方法で用いる、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体は、タンパク質精製に用いる陽イオン交換能を有した担体であれば特に限定はなく、一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−ＳＴＡＴ（いずれも東ソー製）といったスルホプロピル基を導入した担体、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０、ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−ＳＴＡＴ（いずれも東ソー製）といったカルボキシメチル基を導入した担体があげられる。なお前述した例のうち、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−ＳＴＡＴ、ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−ＳＴＡＴは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用カラムとして販売されており、Ｆｃ結合性タンパク質の精製量が少量の場合や、ＨＰＬＣによるＦｃ結合性タンパク質の定量をする場合に特に有用である。
本発明の精製方法を実施する際、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体を充填したカラムは、緩衝液（平衡化液）で平衡化しておくが、前記カラムに対して添加するアプライ液の容量が少ない場合は、前記平衡化液にあらかじめ０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを添加するとよい。緩衝液の種類はｐＨ３．５からｐＨ８で緩衝能を有する緩衝液であれば特に限定はなく、好ましくはｐＨ５からｐＨ７で緩衝能を有する緩衝液である。一例として、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸（以下トリス塩酸）緩衝液があげられる。
本発明の精製方法では、あらかじめ前述した平衡化液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用担体を充填したカラムに、０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを添加したＦｃ結合性タンパク質を含む溶液（アプライ液）を添加することで、Ｆｃ結合性タンパク質を前記担体に選択的に吸着させた後、平衡化液を添加して前記担体に吸着しない夾雑物を洗浄する。その後、塩化ナトリウム等の水溶性の塩を含む緩衝液（溶出液）を添加し、前記担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出させることで、Ｆｃ結合性タンパク質を高純度に精製することができる。なお平衡化液の場合と同様、前記カラムに対して添加するアプライ液の容量が少ない場合は、前記溶出液に０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを添加するとよい。溶出液の塩濃度は、溶出液（緩衝液）のｐＨおよび前記担体の性質により、適宜決定すればよい。またＦｃ結合性タンパク質を溶出させる際、高濃度の塩を含む溶出液（緩衝液）で一段階に溶出してもよく、任意の段数で塩濃度を段階的に上昇させてもよく（ステップグラジエント）、直線的濃度勾配で塩濃度を上昇させてもよい（リニアグラジエント）が、リニアグラジエントで溶出させると好ましい。例えば、緩衝液が０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを添加した２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）であり、水溶性の塩として塩化ナトリウムを用いる場合、塩化ナトリウム濃度０ｍｏｌ／Ｌから１ｍｏｌ／Ｌまでのリニアグラジエントで溶出させればよい。
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／ＬのアルギニンとＦｃ結合性タンパク質を含むアプライ液を添加してＦｃ結合性タンパク質を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出液を用いて溶出させる工程により得られた、０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／ＬのアルギニンとＦｃ結合性タンパク質を含む溶液は、ＨＰＬＣにより得られる溶出ピーク面積から前記タンパク質を定量することができる。具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体を充填したカラムの出口側にオンライン検出器を設けて、溶出液を経時的にモニターやサンプリングをし、得られた溶出液のクロマトグラムのピーク面積から、溶出したＦｃ結合性タンパク質を定量すればよい。前記検出器としてはＦｃ結合性タンパク質を検出できるものであれば限定はなく、例えば示差屈折率計、電気伝導度計、蛍光検出器、紫外検出器、可視検出器があげられるが、タンパク質の紫外線吸収を利用して測定する紫外検出器を用いた検出が簡便であり好ましい。紫外検出器を用いて検出する場合、その波長はカルボニル基の吸収に基づく２１０から２３０ｎｍ、または芳香族アミノ酸の吸収に基づく２６０から２９０ｎｍの波長が用いればよい。前者の波長域には高感度で分析できる利点があり、後者の波長域には夾雑物の影響を受けにくいという利点がある。またポストカラム反応でニンヒドリンやフェニルイソチオシアネート等でＦｃ結合性タンパク質を修飾後、可視検出器、紫外検出器、蛍光検出器等を用いて検出してもよい。
Ｆｃ結合性タンパク質を定量する際は、あらかじめＥＬＩＳＡ法や紫外検出器を用いた方法等で定量した既知濃度のＦｃ結合性タンパク質溶液を用いて検量線を作成し、未知濃度のＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を、前記作成した検量線に基づき定量すればよい。
本発明は、あらかじめ平衡化液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にＦｃ結合性タンパク質を含むアプライ液を添加してＦｃ結合性タンパク質を前記担体に吸着させる工程と前記担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出液を用いて溶出させる工程とを含むＦｃ結合性タンパク質の精製方法において、少なくとも前記アプライ液が０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを含んでいることを特徴としている。本発明により、Ｆｃ結合性タンパク質を高純度に精製することができる。また本発明の精製方法は一定濃度のアルギニンを添加するのみの簡便な方法であるため、Ｆｃ結合性タンパク質の工業的生産に有用である。
またＦｃ結合性タンパク質を含む試料に、０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを含ませることにより、高速液体クロマトグラフィーにより得られる溶出ピーク面積から前記試料に含まれるＦｃ結合性タンパク質を定量することができる。前記定量方法は、ＥＬＩＳＡ法等従来のＦｃ結合性タンパク質の定量法と比較し簡便であるため、Ｆｃ結合性タンパク質の工業的生産において、生産管理や品質管理が容易となる点で好ましい。
以下、実施例および比較例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 標準Ｆｃ結合性タンパク質の調製
（１）以下の方法により、標準Ｆｃ結合性タンパク質を調製した。
（１−１）特許文献５（特開２０１２−０３４５９１号公報）に記載の方法によりＦｃ結合性タンパク質を生産する組換え大腸菌（形質転換体）を約７０時間培養後、当該培養液より大腸菌菌体を得た。
（１−２）（１−１）で得られた菌体を抽出液（６５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、６ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４、２５０Ｕ／Ｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）、０．０５ｇ／Ｌ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）、０．５％ 臭化セチルトリメチルアンモニウム塩（ＣＴＡＢ）および５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に懸濁し、撹拌することで菌体内からタンパク質を抽出した。
（１−３）タンパク質抽出液のｐＨが３．５になるよう、撹拌しながら酢酸を滴下することで酸処理を行ない、生じた沈殿物を遠心分離で除去することで清澄な溶液を回収した。
（１−４）（１−３）で回収した溶液をミリポア社製限外ろ過膜（分画分子量５０００）により約５倍濃縮し、さらに緩衝液Ａ（１ｍｏｌ／Ｌ 尿素、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡおよび１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を添加しつつ限外ろ過を行なうこと（加水ろ過法）で緩衝液置換を行なった。
（１−５）緩衝液置換したＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を、あらかじめ緩衝液Ｂ（１ｍｏｌ／Ｌ 尿素と１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー社製）を充填したカラムに通過させ、緩衝液Ｂで非吸着物を洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む緩衝液ＢでＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（１−６）溶出したＦｃ結合性タンパク質に硫酸アンモニウムを終濃度１５％（ｗ／ｖ）となるよう添加後、予め緩衝液Ｃ（１５％（ｗ／ｖ）硫安、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ（東ソー社製）に通過させ、緩衝液Ｃで非吸着物を洗浄後、緩衝液Ｄ（１ｍｏｌ／Ｌ 尿素、２０％（ｗ／ｖ） グリセロール、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８））でＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（１−７）（１−６）の溶出液に純水を添加して伝導度を２０ｍＳ／ｃｍ以下とした後、あらかじめ緩衝液Ｅ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー社製）を充填したカラムに通過させ、緩衝液Ｅで非吸着物を洗浄後、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０ｍｏｌ／Ｌから１ｍｏｌ／Ｌまで）で精製Ｆｃ結合性タンパク質を溶出した。
（１）以下の方法により、標準Ｆｃ結合性タンパク質を調製した。
（１−１）特許文献５（特開２０１２−０３４５９１号公報）に記載の方法によりＦｃ結合性タンパク質を生産する組換え大腸菌（形質転換体）を約７０時間培養後、当該培養液より大腸菌菌体を得た。
（１−２）（１−１）で得られた菌体を抽出液（６５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、６ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４、２５０Ｕ／Ｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）、０．０５ｇ／Ｌ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）、０．５％ 臭化セチルトリメチルアンモニウム塩（ＣＴＡＢ）および５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に懸濁し、撹拌することで菌体内からタンパク質を抽出した。
（１−３）タンパク質抽出液のｐＨが３．５になるよう、撹拌しながら酢酸を滴下することで酸処理を行ない、生じた沈殿物を遠心分離で除去することで清澄な溶液を回収した。
（１−４）（１−３）で回収した溶液をミリポア社製限外ろ過膜（分画分子量５０００）により約５倍濃縮し、さらに緩衝液Ａ（１ｍｏｌ／Ｌ 尿素、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡおよび１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を添加しつつ限外ろ過を行なうこと（加水ろ過法）で緩衝液置換を行なった。
（１−５）緩衝液置換したＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を、あらかじめ緩衝液Ｂ（１ｍｏｌ／Ｌ 尿素と１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー社製）を充填したカラムに通過させ、緩衝液Ｂで非吸着物を洗浄した後、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む緩衝液ＢでＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（１−６）溶出したＦｃ結合性タンパク質に硫酸アンモニウムを終濃度１５％（ｗ／ｖ）となるよう添加後、予め緩衝液Ｃ（１５％（ｗ／ｖ）硫安、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ（東ソー社製）に通過させ、緩衝液Ｃで非吸着物を洗浄後、緩衝液Ｄ（１ｍｏｌ／Ｌ 尿素、２０％（ｗ／ｖ） グリセロール、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８））でＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（１−７）（１−６）の溶出液に純水を添加して伝導度を２０ｍＳ／ｃｍ以下とした後、あらかじめ緩衝液Ｅ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー社製）を充填したカラムに通過させ、緩衝液Ｅで非吸着物を洗浄後、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０ｍｏｌ／Ｌから１ｍｏｌ／Ｌまで）で精製Ｆｃ結合性タンパク質を溶出した。
精製Ｆｃ結合性タンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを、ゲルろ過クロマトグラフィー（カラム；ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ（東ソー社製）、溶離液；０．２ｍｏｌ／Ｌ アルギニンおよび０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０））で単一ピークを、それぞれ確認した。
（２）（１）で調製した標準Ｆｃ結合性タンパク質を下記に示すＨＰＬＣを用いた方法で測定し、標準Ｆｃ結合性タンパク質の検量線を作成した。
（２−１）ＨＰＬＣ用のポンプとしてＣＣＰＭ−ＩＩ（東ソー社製）を、ＵＶ検出器としてＵＶ−９０２０（東ソー社製）を、カラムとして東ソー社製タンパク質分析用カラムＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−ＳＴＡＴ（３．５ｍｍ×３．０ｃｍ）を用いた。溶離液Ａとして０．１５ｍｏｌ／Ｌ Ｌ−アルギニン塩酸塩を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を、溶離液Ｂとして溶離液Ａに１．０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを添加したものを用いた。
（２−２）（１−７）で得られたＦｃ結合性タンパク質を含む溶出液を溶離液Ａで希釈することで、Ｆｃ結合性タンパク質濃度０．１から０．０１ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。なおタンパク質濃度の測定は溶液の２８０ｎｍの吸光度から算出しており、Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸組成より１ｍｇ／ｍＬ水溶液の２８０ｎｍの吸光度を１．２として算出している。
（２−３）あらかじめ溶離液Ａを１ｍＬ／ｍｉｎで通液することでカラムを平衡化後、（２−２）の溶液２０μＬを導入し、ＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／Ｌから１ｍｏｌ／Ｌまでの直線濃度勾配を１０分間で実施し、Ｆｃ結合性タンパク質を溶出した。溶出物は２２０ｎｍの吸光度で検出し、ＵＶ検出器にてピーク面積を求めた。
（２−４）導入したＦｃ結合性タンパク質に対する溶出ピーク面積をプロットすることで検量線を作成した。
（２−１）ＨＰＬＣ用のポンプとしてＣＣＰＭ−ＩＩ（東ソー社製）を、ＵＶ検出器としてＵＶ−９０２０（東ソー社製）を、カラムとして東ソー社製タンパク質分析用カラムＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−ＳＴＡＴ（３．５ｍｍ×３．０ｃｍ）を用いた。溶離液Ａとして０．１５ｍｏｌ／Ｌ Ｌ−アルギニン塩酸塩を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を、溶離液Ｂとして溶離液Ａに１．０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを添加したものを用いた。
（２−２）（１−７）で得られたＦｃ結合性タンパク質を含む溶出液を溶離液Ａで希釈することで、Ｆｃ結合性タンパク質濃度０．１から０．０１ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。なおタンパク質濃度の測定は溶液の２８０ｎｍの吸光度から算出しており、Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸組成より１ｍｇ／ｍＬ水溶液の２８０ｎｍの吸光度を１．２として算出している。
（２−３）あらかじめ溶離液Ａを１ｍＬ／ｍｉｎで通液することでカラムを平衡化後、（２−２）の溶液２０μＬを導入し、ＮａＣｌ濃度が０ｍｏｌ／Ｌから１ｍｏｌ／Ｌまでの直線濃度勾配を１０分間で実施し、Ｆｃ結合性タンパク質を溶出した。溶出物は２２０ｎｍの吸光度で検出し、ＵＶ検出器にてピーク面積を求めた。
（２−４）導入したＦｃ結合性タンパク質に対する溶出ピーク面積をプロットすることで検量線を作成した。
典型的な精製Ｆｃ結合性タンパク質のクロマトグラムを図２に、検量線を図３に、それぞれ示す。
実施例２
Ｆｃ結合性タンパク質を生産する大腸菌形質転換体の抽出物（タンパク質抽出液）に含まれるＦｃ結合性タンパク質を、以下に示すＨＰＬＣ法とＥＬＩＳＡ法で定量した。
（１）ＨＰＬＣ法による定量
実施例１（１−２）で得られたタンパク質抽出液（Ｆｃ結合性タンパク質を０．４３ｍｇ／ｍＬ含む）１００μＬに、１ｍｏｌ／Ｌ アルギニン塩酸塩水溶液１５０μＬを添加し、さらに２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて１ｍＬとしたものを測定試料とした（希釈倍率１０倍、アルギニン濃度０．１５ｍｏｌ／Ｌ）他は、（２−１）から（２−３）と同様の操作を行なった。
Ｆｃ結合性タンパク質を生産する大腸菌形質転換体の抽出物（タンパク質抽出液）に含まれるＦｃ結合性タンパク質を、以下に示すＨＰＬＣ法とＥＬＩＳＡ法で定量した。
（１）ＨＰＬＣ法による定量
実施例１（１−２）で得られたタンパク質抽出液（Ｆｃ結合性タンパク質を０．４３ｍｇ／ｍＬ含む）１００μＬに、１ｍｏｌ／Ｌ アルギニン塩酸塩水溶液１５０μＬを添加し、さらに２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて１ｍＬとしたものを測定試料とした（希釈倍率１０倍、アルギニン濃度０．１５ｍｏｌ／Ｌ）他は、（２−１）から（２−３）と同様の操作を行なった。
得られたＦｃ結合性タンパク質の溶出ピークの面積、希釈倍率および（２−４）で作成した検量線より試料中のＦｃ結合性タンパク質濃度を計算したところ、０．４８ｍｇ／ｍＬと計算された。試料のクロマトグラムを図４に示す。
（２）ＥＬＩＳＡ法による定量
（２−１）あらかじめヒトＩｇＧ溶液（化血研製）を固定化し、１％牛血清アルブミンでブロッキングした９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）にＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）により適当な濃度に希釈した試料（（１−２）で得られたタンパク質抽出液）１００μＬを添加後、３０℃で１時間保温した。なお、未使用ウェルには、（１−６）で得られた、精製Ｆｃ結合性タンパク質の希釈系列（濃度：０．０１から０．０９ｍｇ／Ｌ）１００μＬを添加し、同様に保温した。
（２−２）ＴＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）でプレートを洗浄後、ＴＢＳで1万倍に希釈した抗ＣＤ６４抗体（Ｒ＆Ｄシステム製、ＭＡＢ１２５７１）を１００μＬ添加し、３０℃で１時間保温した。
（２−３）ＴＢＳＴでプレートを洗浄後、ＴＢＳで１万倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧ抗体（コスモバイオ社製）を１００μＬ添加し、３０℃で１時間保温した。
（２−４）ＴＢＳＴでプレートを洗浄後、ＴＭＢ ２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を５０μｌ添加し、室温で４分間放置することで発色後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸５０μＬを加えることで反応を停止した。
（２−５）タイタープレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ社製、ＭＵＬＴＩＳＣＡＮ ＡＳＣＥＮＴ）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、精製Ｆｃ結合性タンパク質の希釈系列を用いて作成した検量線より試料中のＦｃ結合性タンパク質濃度を求めた。
（２−１）あらかじめヒトＩｇＧ溶液（化血研製）を固定化し、１％牛血清アルブミンでブロッキングした９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）にＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）により適当な濃度に希釈した試料（（１−２）で得られたタンパク質抽出液）１００μＬを添加後、３０℃で１時間保温した。なお、未使用ウェルには、（１−６）で得られた、精製Ｆｃ結合性タンパク質の希釈系列（濃度：０．０１から０．０９ｍｇ／Ｌ）１００μＬを添加し、同様に保温した。
（２−２）ＴＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）でプレートを洗浄後、ＴＢＳで1万倍に希釈した抗ＣＤ６４抗体（Ｒ＆Ｄシステム製、ＭＡＢ１２５７１）を１００μＬ添加し、３０℃で１時間保温した。
（２−３）ＴＢＳＴでプレートを洗浄後、ＴＢＳで１万倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧ抗体（コスモバイオ社製）を１００μＬ添加し、３０℃で１時間保温した。
（２−４）ＴＢＳＴでプレートを洗浄後、ＴＭＢ ２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を５０μｌ添加し、室温で４分間放置することで発色後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸５０μＬを加えることで反応を停止した。
（２−５）タイタープレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ社製、ＭＵＬＴＩＳＣＡＮ ＡＳＣＥＮＴ）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、精製Ｆｃ結合性タンパク質の希釈系列を用いて作成した検量線より試料中のＦｃ結合性タンパク質濃度を求めた。
結果、Ｆｃ結合性タンパク質濃度は０．４３ｍｇ／ｍＬと計算され、ＨＰＬＣ法で求めた濃度とほぼ同じ値となった。
比較例１
測定試料として、実施例１（１−２）で得られたタンパク質抽出液（Ｆｃ結合性タンパク質を０．４３ｍｇ／ｍＬ含む）にアルギニンを添加せずに希釈した試料を用い、かつ溶離液Ａおよび溶離液Ｂへのアルギニンの添加を実施しない他は、実施例２（１）と同様な方法でＨＰＬＣ法による定量を試みた。しかしながらクロマトグラムを確認したところ、Ｆｃ結合性タンパク質が溶出されるべき、保持時間１０分付近には、痕跡程度のピークしか検出されず（図５（ｂ））、当該ピークから計算したＦｃ結合タンパク質の濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬとなり、ＥＬＩＳＡ法で測定（実施例２（２））した濃度より著しく低い値となった。この理由として、アルギニンを添加しなかったことにより、試料中の夾雑物によるＦｃ結合性タンパク質のＨＰＬＣカラムへの結合阻害や、前記カラムからのＦｃ結合性タンパク質の溶出阻害が推測される。
測定試料として、実施例１（１−２）で得られたタンパク質抽出液（Ｆｃ結合性タンパク質を０．４３ｍｇ／ｍＬ含む）にアルギニンを添加せずに希釈した試料を用い、かつ溶離液Ａおよび溶離液Ｂへのアルギニンの添加を実施しない他は、実施例２（１）と同様な方法でＨＰＬＣ法による定量を試みた。しかしながらクロマトグラムを確認したところ、Ｆｃ結合性タンパク質が溶出されるべき、保持時間１０分付近には、痕跡程度のピークしか検出されず（図５（ｂ））、当該ピークから計算したＦｃ結合タンパク質の濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬとなり、ＥＬＩＳＡ法で測定（実施例２（２））した濃度より著しく低い値となった。この理由として、アルギニンを添加しなかったことにより、試料中の夾雑物によるＦｃ結合性タンパク質のＨＰＬＣカラムへの結合阻害や、前記カラムからのＦｃ結合性タンパク質の溶出阻害が推測される。
実施例３ 添加回収試験
実施例１（１−２）で得られたタンパク質抽出液１００μＬ（Ｆｃ結合性タンパク質濃度：０．４３ｍｇ／ｍＬ）に、実施例１（１−７）で得られたＦｃ結合性タンパク質０．０３から０．５ｍｇ（濃度換算で０．０３４ｍｇ／ｍＬから０．５３ｍｇ／ｍＬ）と１ｍｏｌ／Ｌ アルギニン塩酸水溶液０．１５ｍＬとを混合し、さらに２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で１ｍＬとした溶液（アルギニン濃度：０．１５ｍｏｌ／Ｌ、Ｆｃ結合性タンパク質濃度：０．０７７から０．５７ｍｇ／ｍＬ）を測定試料とした他は、実施例２（１）と同様な方法でＨＰＬＣ法による定量を行なった。
実施例１（１−２）で得られたタンパク質抽出液１００μＬ（Ｆｃ結合性タンパク質濃度：０．４３ｍｇ／ｍＬ）に、実施例１（１−７）で得られたＦｃ結合性タンパク質０．０３から０．５ｍｇ（濃度換算で０．０３４ｍｇ／ｍＬから０．５３ｍｇ／ｍＬ）と１ｍｏｌ／Ｌ アルギニン塩酸水溶液０．１５ｍＬとを混合し、さらに２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で１ｍＬとした溶液（アルギニン濃度：０．１５ｍｏｌ／Ｌ、Ｆｃ結合性タンパク質濃度：０．０７７から０．５７ｍｇ／ｍＬ）を測定試料とした他は、実施例２（１）と同様な方法でＨＰＬＣ法による定量を行なった。
本例で測定した各試料のクロマトグラムを図６に示す。また本例で測定した各試料中に添加したＦｃ結合性タンパク質濃度に対する、Ｆｃ結合性タンパク質（溶出時間１０分付近のピーク）の溶出ピーク面積をプロットしたところ、原点を通る傾き０．９１の直線が得られた（図７の黒丸）。つまり本例で添加したＦｃ結合性タンパク質のうち、９１％が回収されることが判明した。
比較例２
測定試料として、実施例１（１−２）で得られたタンパク質抽出液（Ｆｃ結合性タンパク質を０．４３ｍｇ／ｍＬ含む）に、実施例１（１−７）で得られたＦｃ結合性タンパク質０．５ｍｇ（濃度換算で０．５４ｍｇ／ｍＬ）を添加し、アルギニンを添加せずに希釈した試料を用い、かつ溶離液Ａおよび溶離液Ｂへのアルギニンの添加を実施しない他は、実施例２（１）と同様な方法でＨＰＬＣ法による定量を試みた。
測定試料として、実施例１（１−２）で得られたタンパク質抽出液（Ｆｃ結合性タンパク質を０．４３ｍｇ／ｍＬ含む）に、実施例１（１−７）で得られたＦｃ結合性タンパク質０．５ｍｇ（濃度換算で０．５４ｍｇ／ｍＬ）を添加し、アルギニンを添加せずに希釈した試料を用い、かつ溶離液Ａおよび溶離液Ｂへのアルギニンの添加を実施しない他は、実施例２（１）と同様な方法でＨＰＬＣ法による定量を試みた。
本例で測定した試料のクロマトグラムを図５（ｃ）に示す。Ｆｃ結合性タンパク質が溶出されるべき、保持時間１０分付近には、痕跡程度のピークしか検出されず、当該ピークから計算したＦｃ結合タンパク質の濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬであった。この理由として、アルギニンを添加しなかったことにより、試料中の夾雑物によるＦｃ結合性タンパク質のＨＰＬＣカラムへの結合阻害や、前記カラムからのＦｃ結合性タンパク質の溶出阻害が推測される。
比較例３
測定試料を調製する際添加する１ｍｏｌ／Ｌ アルギニン塩酸水溶液の量を０．１ｍＬ（アルギニン濃度：０．１ｍｏｌ／Ｌ）とし、溶離液Ａおよび溶離液Ｂへのアルギニンの添加量を０．１ｍｏｌ／Ｌとした他は、実施例３と同様な試験を行なった。
測定試料を調製する際添加する１ｍｏｌ／Ｌ アルギニン塩酸水溶液の量を０．１ｍＬ（アルギニン濃度：０．１ｍｏｌ／Ｌ）とし、溶離液Ａおよび溶離液Ｂへのアルギニンの添加量を０．１ｍｏｌ／Ｌとした他は、実施例３と同様な試験を行なった。
本例で測定した各試料中に添加したＦｃ結合性タンパク質濃度に対する、Ｆｃ結合性タンパク質（溶出時間１０分付近のピーク）の溶出ピーク面積をプロットしたところ、原点を通る傾き０．５５の直線が得られた（図７の白丸）。つまり本例で添加したＦｃ結合性タンパク質の回収率は５５％となり、アルギニンを０．１５ｍｏｌ／Ｌ添加したとき（実施例３）と比較し回収率が低下した。
比較例４
測定試料を調製する際添加する１ｍｏｌ／Ｌ アルギニン塩酸水溶液の量を０．２ｍＬ（アルギニン濃度：０．２ｍｏｌ／Ｌ）とし、溶離液Ａおよび溶離液Ｂへのアルギニンの添加量を０．２ｍｏｌ／Ｌとした他は、実施例３と同様な試験を行なった。しかしながらクロマトグラムを確認したところ、Ｆｃ結合性タンパク質が溶出されるべき、保持時間１０分付近には、ピークが検出されなかった。
測定試料を調製する際添加する１ｍｏｌ／Ｌ アルギニン塩酸水溶液の量を０．２ｍＬ（アルギニン濃度：０．２ｍｏｌ／Ｌ）とし、溶離液Ａおよび溶離液Ｂへのアルギニンの添加量を０．２ｍｏｌ／Ｌとした他は、実施例３と同様な試験を行なった。しかしながらクロマトグラムを確認したところ、Ｆｃ結合性タンパク質が溶出されるべき、保持時間１０分付近には、ピークが検出されなかった。
以上をまとめると、本発明におけるアルギニン添加量は、少なくとも０．１ｍｏｌ／Ｌより多く、かつ０．２ｍｏｌ／Ｌより少ない条件、つまり０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌの範囲がよいことがわかる。
実施例４
（１）特許文献５に記載の方法により、Ｆｃ結合性タンパク質を生産する大腸菌の形質転換体を約７０時間培養し、当該培養液１００μＬから遠心分離により菌体を回収した。
（２）回収した菌体に１ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液を加えて室温で２０分振とうすることでＦｃ結合性タンパク質を抽出し、遠心分離により上清を回収した。なおＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液は、市販抽出試薬（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、メルク社製）１０倍濃度品をＴＢＳで１０倍に希釈後、さらにリゾチーム（鶏卵由来、太陽化学製）を終濃度０．３ｍｇ／ｍＬに、ベンゾナーゼ（メルク社製）を終濃度２５０Ｕ／ｍＬに、それぞれなるよう添加して調製した。
（３）回収した上清中のＦｃ結合性タンパク質を実施例１（４）と同様にＥＬＩＳＡ法で定量した。Ｆｃ結合性タンパク質濃度は０．４０ｍｇ／ｍＬと求められた。
（４）一方、上清を溶離液Ａで２倍に希釈した後、実施例２（１）と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質をＨＰＬＣ法により定量した。Ｆｃ結合性タンパク質（溶出時間１０分付近のピーク）の溶出ピーク面積から算出したＦｃ結合性タンパク質濃度は０．４１ｍｇ／ｍＬとなった。すなわちアルギニンを０．１５ｍｏｌ／Ｌ添加することで、市販抽出試薬を用いて抽出しても、ＨＰＬＣ法によるＦｃ結合性タンパク質の定量が可能であることがわかる。
（１）特許文献５に記載の方法により、Ｆｃ結合性タンパク質を生産する大腸菌の形質転換体を約７０時間培養し、当該培養液１００μＬから遠心分離により菌体を回収した。
（２）回収した菌体に１ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液を加えて室温で２０分振とうすることでＦｃ結合性タンパク質を抽出し、遠心分離により上清を回収した。なおＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液は、市販抽出試薬（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、メルク社製）１０倍濃度品をＴＢＳで１０倍に希釈後、さらにリゾチーム（鶏卵由来、太陽化学製）を終濃度０．３ｍｇ／ｍＬに、ベンゾナーゼ（メルク社製）を終濃度２５０Ｕ／ｍＬに、それぞれなるよう添加して調製した。
（３）回収した上清中のＦｃ結合性タンパク質を実施例１（４）と同様にＥＬＩＳＡ法で定量した。Ｆｃ結合性タンパク質濃度は０．４０ｍｇ／ｍＬと求められた。
（４）一方、上清を溶離液Ａで２倍に希釈した後、実施例２（１）と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質をＨＰＬＣ法により定量した。Ｆｃ結合性タンパク質（溶出時間１０分付近のピーク）の溶出ピーク面積から算出したＦｃ結合性タンパク質濃度は０．４１ｍｇ／ｍＬとなった。すなわちアルギニンを０．１５ｍｏｌ／Ｌ添加することで、市販抽出試薬を用いて抽出しても、ＨＰＬＣ法によるＦｃ結合性タンパク質の定量が可能であることがわかる。
Claims (3)
- あらかじめ平衡化液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にＦｃ結合性タンパク質を含むアプライ液を添加して、Ｆｃ結合性タンパク質を前記担体に吸着させる工程と、
前記担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、
Ｆｃ結合性タンパク質の精製方法であって、
少なくとも前記アプライ液が０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを含んでおり、
前記アプライ液が、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得られた形質転換体の抽出物を含み、前記宿主が大腸菌であり、前記Ｆｃ結合性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質である、前記精製方法。 - 前記平衡化液、前記アプライ液および前記溶出液が０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを含んでいる、請求項１に記載の精製方法。
- あらかじめ０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを含む平衡化液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用カラムに０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／ＬのアルギニンとＦｃ結合性タンパク質を含む試料を添加して、Ｆｃ結合性タンパク質を前記担体に吸着させ、
前記カラムに吸着したＦｃ結合性タンパク質を０．１２ｍｏｌ／Ｌから０．１８ｍｏｌ／Ｌのアルギニンと水溶性の塩を含む溶出液を用いて前記タンパク質を溶出させ、
前記溶出液により溶出した液に含まれるＦｃ結合性タンパク質を検出器で検出することで得られたクロマトグラムから、前記タンパク質の溶出ピーク面積を算出し、
前記算出した溶出ピーク面積から、試料中に含まれるＦｃ結合性タンパク質を定量する方法であって、
前記試料がＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得られた形質転換体の抽出物を含み、前記宿主が大腸菌であり、前記Ｆｃ結合性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質である、前記方法。
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