JP6808995B2 - Fc結合性タンパク質の定量方法 - Google Patents
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[1] 陽イオン交換クロマトグラフィー用担体を充填したカラムに平衡化液を添加してカラムを平衡化させ、前記担体にヒトFc結合性タンパク質を含む試料を添加してFc結合性タンパク質を前記担体に吸着させ、前記担体に吸着した不純物を洗浄・除去し、前記担体に吸着したFc結合性タンパク質を、塩を含む溶出液により溶出させる方法であって、前記塩を含む溶出液の塩化ナトリウム濃度が0.1Mであり、その後塩化ナトリウム濃度を0.2Mまでのリニアグラジエントで溶出することを特徴とする定量方法。
[2] 前記Fc結合性タンパク質を含む試料が、Fc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得た形質転換体の抽出物であることを含む、[1]に記載の定量方法。
[3] 宿主が大腸菌であることを特徴とする、[2]に記載の定量方法。
[4] 前記Fc結合性タンパク質が、
(i)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
(ii)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
[1]から[3]のいずれかに記載の定量方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
(i)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
(ii)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸において特定位置におけるアミノ酸置換が生じたタンパク質、
があげられる。
前記定量方法はELISA法等、従来のFc結合性タンパク質の定量法と比較し簡便であること、また従来の定量法では定量することが困難であった特性の異なるFc結合性タンパク質の定量が高精度、高効率に可能となるため、Fc結合性タンパク質の工業的生産において生産管理や品質管理が容易となることが考えられる。
(1)以下の方法により、標準Fc結合性タンパク質を調製した。
(1−1)Fc結合性タンパク質を生産する組換え大腸菌(形質転換体)(特開2016−23152)を約60時間培養後、当該培養液より大腸菌菌体を得た。
(1−2)(1−1)で得られた菌体を40mM 塩化ナトリウム、1mM EDTA、2mM MgSO4、250U/L Benzonase(メルク社製)、0.05g/L リゾチーム(太陽化学社製)および0.5% Triton X−100(商品名)を含む20mM リン酸緩衝液(pH6.0)に懸濁し、撹拌することで菌体内からタンパク質を抽出した。
(1−3)(1−2)で得られた抽出液を遠心分離し、沈殿物を除去することで清澄な溶液を回収した。
(1−4)(1−3)で得られた清澄化液を、予め緩衝液A(20mM リン酸緩衝液(pH6.0))で平衡化したTOYOPEARL CM−650M(東ソー社製)を充填したカラムに通過させ、緩衝液Aで非吸着物質を洗浄した後、1M 塩化ナトリウムを含む緩衝液AでFc結合性タンパク質を溶出した。
(2)(1)に記載の方法で調製した標準Fc結合性タンパク質を下記に示すHPLCを用いた方法で測定し、標準Fc結合性タンパク質の検量線を作成した。
(2−1)HPLC用のポンプとしてDP−8020(東ソー社製)を、UV検出器としてUV−8020(東ソー社製)を、カラムとして生体高分子分離用の弱陽イオンカラムTSKgel CM−STAT(3.0mmI.D.×3.5cm)(東ソー製)を用いた。溶離液Aとして20mM リン酸緩衝液(pH6.0)を、溶離液Bとして溶離液Aに1.0M 塩化ナトリウムを添加したものを用いた。
(2−2)(1)に記載の方法で得られたFc結合性タンパク質を含む溶液を溶離液Aで希釈することで、Fc結合性タンパク質濃度0.03から0.12g/Lの溶液を調製した。尚、タンパク質濃度の測定は溶液の280nmの吸光度から算出しており、Fc結合性タンパク質のアミノ酸組成より1mg/mL水溶液の280nmにおける吸光度を1.78として算出している。
(2−3)予め溶離液Aを1mL/minで通液することでカラムを平衡化後、(2−2)の溶液80μLを導入し、溶離液Aを2分間通液した。その後、塩化ナトリウム濃度が0Mから0.5Mまでの直線濃度勾配を10分間で実施し、Fc結合性タンパク質を溶出した。溶出物は280nmの吸光度で検出し、UV検出器にてピーク面積を求めた。
(2−4)Fc結合性タンパク質の濃度に対する溶出ピーク面積をプロットし検量線を作成した。
(1)以下の方法により、Fc結合性タンパク質を含むタンパク質抽出液を調製した。
(1−1)Fc結合性タンパク質を生産する組換え大腸菌(形質転換体)を約60時間培養後、当該培養液100μLから遠心分離により菌体を回収した。
(1−2)回収した菌体に1mLのBugBuster溶液を加えて室温で20分間振とうすることでFc結合性タンパク質を抽出し、遠心分離により上清を回収した。尚、BugBuster溶液は市販抽出試薬(メルク社製)をトリス緩衝生理食塩水で10倍に希釈後、更にリゾチーム(太陽化学社製)を終濃度0.3mg/mLに、Benzonase(メルク社製)を終濃度250U/mLになるようそれぞれ添加して調製した。
(1−3)実施例2(1−2)で得られた抽出液を遠心分離し、沈殿物を除去することで溶液を回収した。
(2)HPLC法による定量を行った。
(2−1)実施例1(2−1)に従って分析準備を行い、予め溶離液Aを1mL/minで通液することでカラムを平衡化後、実施例2(1)の方法で得たFc結合性タンパク質を含む抽出液20μLを導入し、溶離液Aを2分間通液した。その後、塩化ナトリウム濃度が0.1Mの溶離液で夾雑不純物を洗浄し、続いて塩化ナトリウム濃度が0.1Mから0.2Mまでの直線濃度勾配を5分間で実施し、Fc結合性タンパク質を溶出した。溶出物は280nmの吸光度で検出し、UV検出器にてピーク面積を求めた。
(3)ELISA法による定量を行った。
(3−1)予めヒトIgG溶液(化血研製)を固定化し、1% 牛血清アルブミンでブロッキングした96穴プレート(Nunc社製)にトリス緩衝生理食塩水により適当な濃度に希釈した試料(実施例2(1)の方法で得たタンパク質抽出液)100μLを添加後、30℃で1時間保温した。また、実施例1(1)の方法で得た精製Fc結合性タンパク質を用いて希釈系列(濃度0.06から1mg/L)を作製し、併せて同プレートに100μL添加し保温した。
(3−2)TBST(0.05% Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水)でプレートを洗浄後、トリス緩衝生理食塩水で10,000倍に希釈した抗CD16抗体(R&D SYSTEMS社製、MAB2546)を100μL添加し、30℃で1時間保温した。
(3−3)TBSTでプレートを洗浄後、トリス緩衝生理食塩水で10,000倍に希釈したMouse IgG−heavy and light chain cross−adsorbed抗体(BETHYL社製、A90−216P)を100μL添加し、30℃で1時間保温した。
(3−4)TBSTでプレートを洗浄後、TMB Microwell Peroxidase Substrate System(KPL社製)を50μL添加し、室温で3分間放置することで発色後、1M リン酸を50μL加えることで反応を停止した。
(3−5)マイクロプレートリーダー(テカン社製 インフィニット200)を用いて450nmの吸光度を測定し、精製Fc結合性タンパク質の希釈系列を用いて作成した検量線より試料中のFc結合性タンパク質濃度を求めた。
(1)実施例2(1)の方法で得たタンパク質抽出液200μLに実施例1(1)の方法で得た精製Fc結合性タンパク質溶液(0.2から0.8mg/mLに調整)200μLをそれぞれ混合し、測定試料とした。
Claims (3)
- 陽イオン交換クロマトグラフィー用担体を充填したカラムにアルギニンを含まない平衡化液を添加してカラムを平衡化させ、前記担体にヒトFc結合性タンパク質を含む試料を添加してFc結合性タンパク質を前記担体に吸着させ、前記担体に吸着した不純物を、アルギニンを含まず0.1M濃度の塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液を用いて洗浄・除去し、前記担体に吸着したFc結合性タンパク質を、アルギニンを含まず塩を含む溶出液により溶出させる方法であって、
前記溶出が、0.1M濃度の塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液により溶出を開始し0.2M濃度の塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液で溶出を終了するリニアグラジエントで溶出することを特徴とし、
前記Fc結合性タンパク質が、ヒトFcγRIIIaである、
方法。 - 前記Fc結合性タンパク質を含む試料が、Fc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得た形質転換体の抽出物であることを含む、請求項1に記載の定量方法。
- 宿主が大腸菌であることを特徴とする、請求項2に記載の定量方法。
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