CN113348176A - 用于亲和纯化的免疫球蛋白结合蛋白 - Google Patents
用于亲和纯化的免疫球蛋白结合蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113348176A CN113348176A CN202080011113.5A CN202080011113A CN113348176A CN 113348176 A CN113348176 A CN 113348176A CN 202080011113 A CN202080011113 A CN 202080011113A CN 113348176 A CN113348176 A CN 113348176A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- binding
- protein
- ala
- leu
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 102000028557 immunoglobulin binding proteins Human genes 0.000 title description 4
- 108091009323 immunoglobulin binding proteins Proteins 0.000 title description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims abstract description 169
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims abstract 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 77
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 75
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 67
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 21
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 11
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 11
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 6
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 6
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 6
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 101150026046 iga gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 39
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 39
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 abstract description 15
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 150
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 48
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 44
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 41
- RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N Ala-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N 0.000 description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 27
- OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N Gln-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 25
- DLOHWQXXGMEZDW-CIUDSAMLSA-N Gln-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DLOHWQXXGMEZDW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 25
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 25
- AGTHXWTYCLLYMC-FHWLQOOXSA-N Phe-Tyr-Glu Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AGTHXWTYCLLYMC-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 23
- YJIUYQKQBBQYHZ-ACZMJKKPSA-N Gln-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YJIUYQKQBBQYHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 21
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 21
- CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CN=CN1 CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 19
- HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 19
- AMBLXEMWFARNNQ-DCAQKATOSA-N Pro-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AMBLXEMWFARNNQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 19
- LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N Thr-Glu-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 18
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 17
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 17
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 16
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 16
- RPZFUIQVAPZLRH-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N RPZFUIQVAPZLRH-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 15
- KXEGPPNPXOKKHK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KXEGPPNPXOKKHK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 14
- LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N Asp-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 14
- QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 14
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 14
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 14
- OGMQXTXGLDNBSS-FXQIFTODSA-N Glu-Ala-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O OGMQXTXGLDNBSS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 13
- TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 13
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 13
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- BLTRAARCJYVJKV-QEJZJMRPSA-N Ala-Lys-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O BLTRAARCJYVJKV-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 9
- NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 9
- RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- LPIKVBWNNVFHCQ-GUBZILKMSA-N Gln-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LPIKVBWNNVFHCQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- DBXXASNNDTXOLU-MXAVVETBSA-N Ile-Leu-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DBXXASNNDTXOLU-MXAVVETBSA-N 0.000 description 8
- AQGUSRZKDZYGGV-GMOBBJLQSA-N Pro-Ile-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O AQGUSRZKDZYGGV-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 7
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VCSBGUACOYUIGD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VCSBGUACOYUIGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 6
- RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HPBCTWSUJOGJSH-MNXVOIDGSA-N Leu-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HPBCTWSUJOGJSH-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 6
- UDQBCBUXAQIZAK-GLLZPBPUSA-N Thr-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UDQBCBUXAQIZAK-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 6
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 5
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PIPTUBPKYFRLCP-NHCYSSNCSA-N Ala-Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PIPTUBPKYFRLCP-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 4
- RSMIHCFQDCVVBR-CIUDSAMLSA-N Asp-Gln-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RSMIHCFQDCVVBR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LPYPANUXJGFMGV-FXQIFTODSA-N Gln-Gln-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LPYPANUXJGFMGV-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- MNYNINSTBAKKFY-NAKRPEOUSA-N Glu-Asp-Gln-Gln Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MNYNINSTBAKKFY-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 4
- DAOSYIZXRCOKII-SRVKXCTJSA-N Lys-His-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DAOSYIZXRCOKII-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IMXAAEFAIBRCQF-SIUGBPQLSA-N Tyr-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N IMXAAEFAIBRCQF-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- LGFCAXJBAZESCF-ACZMJKKPSA-N Ala-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LGFCAXJBAZESCF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- UBKOVSLDWIHYSY-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UBKOVSLDWIHYSY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- VAWNQIGQPUOPQW-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VAWNQIGQPUOPQW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- NKVZTQVGUNLLQW-JBDRJPRFSA-N Ile-Ala-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N NKVZTQVGUNLLQW-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 3
- LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 3
- PRKWBYCXBBSLSK-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PRKWBYCXBBSLSK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N Ser-Gln-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- 238000003450 affinity purification method Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- -1 polystyrene Chemical compound 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- DXTYEWAQOXYRHZ-KKXDTOCCSA-N Ala-Phe-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N DXTYEWAQOXYRHZ-KKXDTOCCSA-N 0.000 description 2
- QQEWINYJRFBLNN-DLOVCJGASA-N Asn-Ala-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QQEWINYJRFBLNN-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- VYLVOMUVLMGCRF-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asp-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VYLVOMUVLMGCRF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LTXLIIZACMCQTO-GUBZILKMSA-N Gln-His-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LTXLIIZACMCQTO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- YBJWJQQBWRARLT-KBIXCLLPSA-N Ile-Gln-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YBJWJQQBWRARLT-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- HIIZIQUUHIXUJY-GUBZILKMSA-N Lys-Asp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HIIZIQUUHIXUJY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- DWPXHLIBFQLKLK-CYDGBPFRSA-N Pro-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 DWPXHLIBFQLKLK-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 2
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- 238000012004 kinetic exclusion assay Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 description 2
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical compound SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 1
- FHETWELNCBMRMG-HJGDQZAQSA-N Asn-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FHETWELNCBMRMG-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- VPPXTHJNTYDNFJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VPPXTHJNTYDNFJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FAUPLTGRUBTXNU-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FAUPLTGRUBTXNU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- SKOKHBGDXGTDDP-MELADBBJSA-N His-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N SKOKHBGDXGTDDP-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- REPPKAMYTOJTFC-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O REPPKAMYTOJTFC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- DDYIRGBOZVKRFR-AVGNSLFASA-N Phe-Asp-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N DDYIRGBOZVKRFR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000011157 data evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical class [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920001289 polyvinyl ether Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
- B01J20/28004—Sorbent size or size distribution, e.g. particle size
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
- B01J20/28016—Particle form
- B01J20/28019—Spherical, ellipsoidal or cylindrical
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
- B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
- B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
- B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
- B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
- B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3268—Macromolecular compounds
- B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
- B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及包含一个或多个结构域的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白。本发明进一步涉及包含本发明的Ig结合蛋白的亲和基质。本发明还涉及这些Ig结合蛋白或亲和基质用于免疫球蛋白亲和纯化的用途，以及使用本发明的Ig结合蛋白进行亲和纯化的方法。
Description
技术领域
本发明涉及包含一个或多个结构域的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白。本发明进一步涉及包含本发明的Ig结合蛋白的亲和基质。本发明还涉及这些Ig结合蛋白或亲和基质用于免疫球蛋白亲和纯化的用途，以及使用本发明的Ig结合蛋白进行亲和纯化的方法。
背景技术
许多生物技术和药物应用需要从含有抗体的样品中去除污染物。捕获和纯化抗体的既定程序是亲和层析，使用来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌细胞表面蛋白A作为免疫球蛋白的选择性配体(参见例如，review by Huse et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 51,2002:217-231)。野生型蛋白A以高亲和力和选择性结合IgG分子的Fc区。具有改进特性如碱性稳定性的蛋白A的变体可用于纯化抗体，并且包含蛋白A配体的各种层析基质可商购获得。然而，目前可用的基于蛋白A的层析基质在暴露于碱性条件后会失去对免疫球蛋白的结合能力。
本发明的技术问题
大多数抗体或含Fc的融合蛋白的大规模生产过程使用蛋白A进行亲和纯化。然而，由于蛋白A在亲和层析中的应用的限制，本领域需要提供具有改进的特性的新Ig结合蛋白，其特异性结合免疫球蛋白以促进免疫球蛋白的亲和纯化。为了最大限度地利用包含Ig结合蛋白的层析基质的价值，需要多次使用亲和配体基质。在层析循环之间，需要进行彻底的清洁程序以消毒和去除基质上的残留污染物。在该程序中，一般的做法是将含有高浓度的NaOH的碱性溶液应用于亲和配体基质。野生型蛋白A结构域不能长时间承受这种苛刻的碱性条件，并很快失去对免疫球蛋白的结合能力。此外，对于亲和配体基质的重复使用，需要在苛刻的酸性条件下进行清洁步骤。
因此，在该领域中持续需要获得能够结合包含Fc序列的蛋白质并承受亲和层析中应用的苛刻清洁条件的新蛋白质。
本发明提供了特别适用于免疫球蛋白的亲和纯化的Ig结合蛋白。特别地，本发明的Ig结合蛋白具有若干优点。本发明的Ig结合蛋白的一个显著优点是它们在高pH值下的延长时间的改善的稳定性，而不会降低Ig结合能力连同高动态结合能力。
以上概述不一定描述本发明解决的所有问题。
发明内容
本发明的一个方面是提供适用于亲和纯化的Ig结合蛋白。
[1]这通过一种包含一个或多个Ig结合结构域的Ig结合蛋白实现，其中至少一个结构域包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:1(cs50)、SEQ ID NO:2(cs52)、SEQ IDNO:3(cs58)、SEQ ID NO:4(cs59)、SEQ ID NO:5(cs60)、SEQ ID NO:6(cs51)、SEQ ID NO:7(cs56)、SEQ ID NO:8(cs54)或SEQ ID NO:10(cs55)中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中的任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[2]根据[1]所述的Ig结合蛋白，其中所述结构域包含如SEQ ID NO:1(cs50)所示的氨基酸序列，或与其至少95％同一性的序列。
[3]根据[1]所述的Ig结合蛋白，其中所述结构域包含如SEQ ID NO:7(cs56)所示的氨基酸序列或与其至少95％同一性的序列，或其中所述结构域包含如SEQ ID NO:10(cs55)所示的氨基酸序列，或与其至少95％同一性的序列。
[4]根据[3]所述的Ig结合蛋白，其中所述结构域包含如SEQ ID NO:8(cs54)或SEQID NO:9(cs57)所示的氨基酸序列。
[5]根据[1]-[4]所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白包含2、3、4、5、6、7或8个彼此连接的结构域。
[6]根据[5]所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白质是同源多聚体或异源多聚体。
[7]根据[6]所述的Ig结合蛋白，其中一个或多个结构域彼此直接连接或通过一个或多个接头彼此连接。
[8]根据[1]-[7]中任一项所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白结合IgG1、IgG2、IgG4、IgM、IgA、Ig片段、Fc片段或Fab片段。
[9]根据[1]-[8]中任一项所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白质被固定在固体支持物上。
[10]一种亲和分离基质，包含与所述亲和分离基质偶联的根据[1]-[9]中任一项所述的Ig结合蛋白。
[11]根据[1]-[9]中任一项所述的Ig结合蛋白或根据[10]所述的亲和分离基质用于亲和纯化对所述Ig结合蛋白具有亲和力的任何蛋白质的用途。
[12]一种亲和纯化包含Ig序列的蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)提供含有包含Ig序列的蛋白质的液体；
(b)提供根据[10]所述的亲和分离基质；
(c)在允许根据[1]-[9]中任一项所述的至少一种Ig结合蛋白与包含Ig序列的蛋白质结合的条件下使所述亲和分离基质与所述液体接触；
(d)从所述亲和纯化基质中洗脱包含Ig序列的所述蛋白质。
[13]根据[12]所述的方法，其中在步骤(d)中，其中大于90％的包含所述Ig序列的蛋白质是从根据[1]-[9]中任一项所述的Ig结合蛋白洗脱的。
[14]根据[12]-[13]所述的方法，包括用碱性清洗液清洗所述亲和纯化基质的所述另外的步骤(e)。
[15]根据[14]所述的方法，其中所述Ig结合蛋白的Ig结合能力是在碱性条件下孵育之前的所述Ig结合能力的至少70％。
本发明的该概述不一定描述本发明的所有特征。通过阅读随后的详细描述，其他实施方式将变得显而易见。
附图说明
图1.新Ig结合蛋白的氨基酸序列。顶行中的数字是指Ig结合蛋白中相应的氨基酸位置。
图1A.SEQ ID NO:17的共有氨基酸序列和SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列。位置3、9、40、43和46中的可变氨基酸以灰色显示。
图1B.SEQ ID NO:18的共有氨基酸序列和SEQ ID NO:7-10的氨基酸序列。位置2、4、7、40、46和53中的可变氨基酸以灰色显示。
图2.固定在PraestoTM Pure85上。Ig结合蛋白在环氧树脂基质PraestoTM Pure85上的偶联效率。Y轴：蛋白质与环氧树脂基质的偶联量，以mg/ml为单位。
图3.本发明的Ig结合蛋白的动态结合能力。
图3A.与市售蛋白质树脂MabSelect SuRe相比，显示了Ig结合蛋白的动态结合能力(DBC；mg/ml)。图3B.与MabSelect SuRe相比，提高了Ig结合蛋白的动态结合能力(DBC；mg/ml)。
图4.本发明的Ig结合蛋白的苛性稳定性。图4A.与MabSelect SuRe相比，分析Ig结合蛋白的碱性稳定性。Y轴：在0.5M NaOH孵育24小时后剩余的IgG结合活性，以％计。
具体实施方式
在下面详细描述本发明之前，应理解本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。除非另外定义，否则在本文使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
优选地，本文使用的术语与“生物技术术语的多语言词汇表”中提供的定义一致：(lUPAC建议)",Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.and Kolbl,H.eds.(1995),HelveticaChimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland)。
贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”以及诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”的变体将被理解为暗示包括所陈述的成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组。如在本发明的描述和所附权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”可互换使用，并且意在包括复数形式并落入每个含义内，除非上下文另有明确的说明。此外，如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时缺少组合。
如本文所用，术语“约”包括明确列举的量以及与其的±10％的偏差。更优选地，术语“约”包括5％的偏差。
贯穿本说明书的全文引用了若干文件(例如：专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书等)。本文中的任何内容均不应解释为承认由于在先发明，本发明无权先于这样的公开。本文引用的一些文件特征为“通过引用并入”。如果此类并入的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导之间存在冲突，则以本说明书的正文为准。
本文中提及的所有序列都在所附序列表中公开，其全部内容和公开内容是本说明书的一部分。
在本发明的上下文中，术语“Ig结合蛋白”或“免疫球蛋白结合蛋白”用于描述能够特异性结合免疫球蛋白的蛋白质。如本文所理解的，“免疫球蛋白”或“Ig”可包括但不一定限于，哺乳动物IgG，诸如例如人IgG1、人IgG2、人IgG4、小鼠IgG、大鼠IgG、山羊IgG、牛IgG、豚鼠IgG、兔IgG；人IgM、人IgA；和包含Fc区的免疫球蛋白片段(也称为“Fc片段”或“Fc”)和/或包含Fab区的免疫球蛋白片段(也称为“Fab片段”或“Fab”)。Ig结合蛋白能够结合完整免疫球蛋白和包含Fc区的Ig片段和/或包含Fab区的Ig片段。如本文所理解的，定义“免疫球蛋白”包括包含免疫球蛋白的融合蛋白、包含Fc区的免疫球蛋白片段(Fc片段)、包含Fab区的免疫球蛋白片段(Fab片段)、包含含有Fc区的免疫球蛋白的片段的融合蛋白、包含含有Fab区的免疫球蛋白的片段的融合蛋白、包含Ig或包含Fc区的Ig片段的缀合物(Fc片段)，以及包含含有Fab区的Ig片段的缀合物(Fab片段)。
根据本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。“特异性结合”是指Ig结合蛋白或Ig结合结构域与其特异性的免疫球蛋白的结合比与另一种非免疫球蛋白靶标的结合更强。
术语“结合活性”是指本发明的Ig结合蛋白结合免疫球蛋白的能力。例如，可以在碱处理之前和/或之后确定结合活性。可以确定Ig结合蛋白或偶联至基质的Ig结合蛋白，即固定的结合蛋白的结合活性。术语“人工”是指非天然存在的物体，即该术语是指由人工生产或修改的物体。例如，由人类(诸如例如，在实验室中通过基因工程、通过改组方法或通过化学反应等)产生或有意修饰的多肽或多核苷酸序列是人工的。
术语“解离常数”或“KD”定义了特异性结合亲和力。如本文所用，术语“KD”(通常以“mol/L”测量，有时缩写为“M”)旨在是指第一种蛋白质和第二种蛋白质之间特定相互作用的解离平衡常数。在本发明的上下文中，术语KD特别用于描述Ig结合蛋白和免疫球蛋白之间的结合亲和力。如果本发明的Ig结合蛋白对免疫球蛋白的解离常数KD为至少1mM或更小，或优选100nM或更小，更优选50nM或更小，甚至更优选10nM或更小，则认为本发明的Ig结合蛋白与免疫球蛋白结合。
术语“蛋白质”和“多肽”是指通过肽键连接的两个或多个氨基酸的任何线性分子链，而不是指特定长度的产物。因此，“肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语或与这些术语中的任何术语互换使用。术语“多肽”也意指多肽翻译后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、蛋白水解切割、通过非天然存在的氨基酸修饰和本领域公知的类似的修饰。因此，包含两个或更多个蛋白质结构域的Ig结合蛋白也属于术语“蛋白质”或“多肽”的定义。
术语“碱性稳定的”或“碱性稳定性”或“苛性稳定的”或“苛性稳定性”(本文也缩写为“cs”)是指本发明的Ig结合蛋白承受碱性条件的能力而不显著丧失结合免疫球蛋白的能力。本领域技术人员可以通过将Ig结合蛋白与例如氢氧化钠溶液一起孵育，例如实施例中所述，容易地测试碱性稳定性，然后通过本领域技术人员已知的常规实验随后测试与免疫球蛋白的结合活性，例如，通过层析方法。
本发明的Ig结合蛋白以及包含本发明的Ig结合蛋白的基质表现出“增加的”或“改善的”碱性稳定性，这意味着掺入所述Ig结合蛋白的分子和基质相对于参考在碱性条件下稳定延长的时间段。
如本文所用，术语“变体”包括Ig结合蛋白或结构域的氨基酸序列，其通过至少一个氨基酸替换、缺失或插入与另一氨基酸序列不同。这些修饰可以通过基因工程或通过人工进行的化学合成或化学反应产生。
如本文所用，术语“缀合物”涉及包含化学连接至其他物质例如连接至第二蛋白质或非蛋白质部分的至少第一蛋白质或基本上由其组成的分子。
术语“修饰”或“氨基酸修饰”是指氨基酸在多肽序列中的特定位置被另一个氨基酸交换、缺失或插入。鉴于已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，熟练的科学家可以很容易地构建编码氨基酸变体的DNA。
术语“替换”或“氨基酸替换”是指多肽序列中特定位置的氨基酸被另一氨基酸交换。术语“缺失”或“氨基酸缺失”是指去除多肽序列中特定位置的氨基酸。
术语“插入”或“氨基酸插入”是指向多肽序列添加氨基酸。
在本说明书中，氨基酸残基位置编号被指定为对应于例如SEQ ID NO:1-10的那些。
术语“氨基酸序列同一性”是指两种或多种蛋白质的氨基酸序列的同一性(或差异)的定量比较。相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“相同百分比”或“同一性百分比”定义为(如果需要)在比对序列并引入缺口之后，序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，以获得最大的序列同一性百分比。
为了确定序列同一性，将查询蛋白质的序列与参考蛋白质的序列进行比对。比对方法是本领域公知的。序列比对的方法是本领域公知的。例如，为了确定任意多肽相对于参考氨基酸序列的氨基酸序列同一性的程度，优选使用SIM局部相似性程序。对于多重比对分析，优选使用本领域技术人员已知的ClustalW。
序列同一性的程度通常相对于未修饰序列的总长度计算。如本文所用，在两个多肽序列的上下文中，短语“相同百分比”或“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同一性百分比”是指在一些实施方式中具有至少89.5％，在一些实施方式中至少91％，在一些实施方式中至少92％，在一些实施方式中至少93％，在一些实施方式中至少94％，在一些实施方式中至少95％，在一些实施方式中至少96％，在一些实施方式中至少97％，在一些实施方式中至少98％，和在一些实施方式中100％的氨基酸残基同一性的两个或多个序列或子序列，当为最大对应进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查测量的。为清楚起见，例如具有至少89.5％同一性的序列包括同一性高于89.5％同一性的所有序列，例如具有至少89.6％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸同一性的实施方式。在一些实施方式中，同一性百分比存在于至少52个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少53个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少54个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少55个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少56个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少57个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少58个残基的区域。
术语“融合”是指组分通过肽键直接或通过肽接头连接。
术语“融合蛋白”涉及包含与至少第二蛋白质遗传连接的至少第一蛋白质的蛋白质。融合蛋白是通过连接两个或多个最初为不同蛋白质编码的基因而产生的。因此，融合蛋白可以包含相同或不同蛋白的多聚体，这些蛋白表达为单个线性多肽。
如本文所用，术语“接头”以其最广泛的含义指共价连接至少两个其他分子的分子。在本发明的典型实施方式中，“接头”应理解为将Ig结合结构域与至少一个另外的Ig结合结构域连接的部分，即，将两个蛋白质结构域彼此连接以产生多聚体的部分。在优选的实施方式中，“接头”是肽接头，即连接两个蛋白质结构域的部分是一个单一氨基酸或包含两个或更多个氨基酸的肽。
术语“层析法”是指使用流动相和固定相将样品中的一种类型的分子(例如免疫球蛋白)与其他分子(例如，污染物)分离的分离技术。液体流动相包含分子混合物，并将这些分子输送穿过或通过固定相(例如，固体基质)。由于流动相中不同分子与固定相的不同相互作用，可以分离流动相中的分子。
术语“亲和层析”是指一种特定的层析模式，其中与固定相偶联的配体与流动相(样品)中的分子(即，免疫球蛋白)相互作用，即配体对分子具有特异性结合亲和力被纯化。如在本发明的上下文中所理解的，亲和层析涉及将含有免疫球蛋白的样品添加到包含层析配体例如本发明的Ig结合蛋白的固定相。
术语“固体支持物”或“固体基质”对于固定相可互换使用。
如本文可互换使用的，术语“亲和基质”或“亲和分离基质”或“亲和层析基质”是指基质，例如层析基质，其上附着有亲和配体，例如本发明的Ig结合蛋白。配体(例如，Ig结合蛋白)能够特异性结合待纯化或从混合物中去除的感兴趣的分子(例如，如上定义的免疫球蛋白)。
如本文所用，术语“亲和纯化”是指通过将如上定义的免疫球蛋白与固定在基质上的Ig结合蛋白结合而从液体中纯化如上定义的免疫球蛋白的方法。因此，除去了混合物中除免疫球蛋白之外的所有其他组分。在进一步的步骤中，免疫球蛋白以纯化的形式被洗脱。
本发明的实施方式
现在将进一步描述本发明。在以下段落中更详细地定义了本发明的不同实施方式。除非明确指出相反的情况，否则下面定义的每个实施方式可以与任何其他实施方式组合。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与任何其他特征或指示为优选或有利的特征组合。
在一个实施方式中，Ig蛋白包含一个或多个结构域，其中至少一个结构域包含SEQID NO:1-10中的任一个的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1-7中的任一个的氨基酸序列，或与其具有至少89.5％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸或基本上由其组成或由其组成。在一些实施方式中，Ig蛋白包含一个或多个结构域，其中至少一个结构域包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸或基本上由其组成或由其组成。本发明的Ig结合结构域是58个氨基酸的三螺旋束，其中螺旋1来自氨基酸残基7-19、螺旋2来自氨基酸残基23-37，并且螺旋3来自氨基酸残基40-56。
本发明的Ig结合蛋白的惊人优点是在极端条件下的稳定性，例如在低pH或高pH(pH 13和更高)下，而不会失去Ig结合特性。如本文所述的Ig结合蛋白表现出延长时间段的碱稳定性而不损害Ig结合特性。此外，它们在低pH值下是稳定的，而不会显著丧失Ig结合特性。在0.5M NaOH中孵育至少24小时后，本发明的Ig结合蛋白的结合能力降低小于30％。对于使用具有高NaOH浓度的碱性溶液去除基质上的污染物的清洁程序的层析方法，该特征非常重要，使得例如，基质可以使用多次。除了高苛性稳定性外，Ig结合蛋白还显示出高偶联效率。此外，亲和层析的重要步骤是洗脱与本发明的Ig结合蛋白结合的蛋白质。该步骤通常在低pH值下进行。本发明的Ig结合蛋白在该处理后不会失去与Ig的结合特性。
优选的Ig结合蛋白。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1(cs50)、SEQ ID NO:2(cs52)、SEQ ID NO:3(cs58)、SEQ ID NO:4(cs59)、SEQ ID NO:5(cs60)、SEQ ID NO:6(cs51)、SEQ ID NO:7(cs56)、SEQ ID NO:8(cs54)、SEQ ID NO:9(cs57)或SEQ ID NO:10(cs55)中的任一个的氨基酸序列具有1或2个进一步的替换。一些实施方式涉及与SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。一些实施方式涉及与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一个的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含一个或多个Ig结合结构域，其中至少一个结构域包含SEQ ID NO:1-7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-7中的任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，其中Ig结合蛋白的Ig结合能力为碱性条件下孵育前的Ig结合能力的至少70％，例如，如通过在0.5M NaOH中孵育至少24小时后剩余的Ig结合能力测定的。
SEQ ID NO:17.一个实施方式涵盖包含一个或多个Ig结合结构域的Ig结合蛋白，所述Ig结合结构域包含以下各项或基本上由其组成或由其组成：SEQ I D NO:17％的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO:17的氨基酸序列示于图1A和此处：IDX3KFDEAX9QAAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSX40SLX43LLX46EAKKLNDAQAPP，其中3位(X3)的氨基酸选自A或S，9位(Xg)的氨基酸选自Q或A，40位(X40)的氨基酸选自T或V，43位(X43)的氨基酸选自S或A，并且46位(X46)的氨基酸选自G或A。
SEQ ID NO:17的氨基酸序列的选定实例是SEQ ID NO:1-6，如图1A中所示。在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的一个或多个结构域，或与其具有至少89.5％序列同一性的序列。例如，与SEQ ID NO:1具有至少89.5％同一性，优选至少95％同一性的氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:2(cs52；与SEQ ID NO:1具有98.3％同一性、SEQ ID NO:3(cs58；与SEQ ID NO:1具有98.3％同一性、SEQ ID NO:4(cs59；与SEQ IDNO:1具有98.3％同一性、SEQ ID NO:5(cs60；与SEQ ID NO:1具有96.6％同一性)和SEQ IDNO:6(cs51；与SEQ ID NO:1具有96.6％同一性)。SEQ ID NO:17的示例性氨基酸序列的氨基酸同一性参见表1。
表1.SEQ ID NO:1-6的氨基酸同一性
SEQ ID NO:18.一个实施方式涵盖包含一个或多个Ig结合结构域的Ig结合蛋白，所述Ig结合结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成。SEQ ID NO：18的氨基酸序列示于图1B和此处：
IX2AX4HDX7DQQAAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPSX40SLEILX46EAKKLNX53SQAPK，其中2(X2)位的氨基酸选自A或D，4位(X4)的氨基酸选自K或Q，7位(X7)的氨基酸选自K或E，40位(X40)的氨基酸选自Q或V，46位(X46)的氨基酸选自G或A，53位(X53)的氨基酸选自D或E。
SEQ ID NO：18的氨基酸序列的选定实例是SEQ ID NO：7-10，如图1B所示。在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的一个或多个结构域或具有至少92％同一性的氨基酸序列。例如，与SEQ ID NO：7具有至少89.5％同一性的氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO：8(cs54；与SEQ ID NO：7具有96.6％同一性)、SEQ ID NO：10(cs55；与SEQ ID NO：7具有94.8％同一性)和SEQ ID NO：9(cs57；与SEQ ID NO：7具有93.1％同一性)。例如，对于SEQ ID NO：18的氨基酸序列的氨基酸同一性，参见表2。
表2.SEQ ID NO：7-10的氨基酸同一性
| SEQ ID | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| SEQ ID | 变体 | cs56 | cs54 | cs57 | cs55 |
| 7 | cs56 | 100 | 96.6 | 93.1 | 94.8 |
| 8 | cs54 | 96.6 | 100 | 89.7 | 91.4 |
| 9 | cs57 | 93.1 | 89.7 | 100 | 98.3 |
| 10 | cs55 | 94.8 | 91.4 | 98.3 | 100 |
在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:1-8中所示的氨基酸序列的一个或多个结构域，或与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少92％同一性的序列。
在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:8(cs54)所示的氨基酸序列的一个或多个结构域，或与其至少92％同一性的序列。在其他实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:10(Cs55)所示的氨基酸序列的一个或多个结构域，或与其至少94％同一性的氨基酸序列，优选与其至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:1-10，优选SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ I D NO:10所示的氨基酸序列的一个或多个结构域，或与SEQ ID NO:1-10中的任一个，优选SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或10中的任一个具有至少95％同一性的序列。在其他实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:9(cs57)所示的氨基酸序列的一个或多个结构域，或与其至少95％同一性，优选至少98％同一性的氨基酸序列。
在其他实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:8、9、10所示的氨基酸序列的一个或多个结构域或与SEQ ID NO:8、9、10中的任一个至少89.5％同一性的序列，条件是对应于位置54的氨基酸是丝氨酸。
对免疫球蛋白的亲和力.本发明的所有Ig结合蛋白以优选低于500nM，或低于100nM，甚至更优选10nM或更小的解离常数KD结合免疫球蛋白。确定Ig结合蛋白或结构域的结合亲和力，即确定解离常数KD的方法是本领域普通技术人员已知的并且可以例如选自本领域已知的以下方法：基于表面等离子体共振(SPR)的技术、动力学排阻分析(KinExA测定)、生物层干涉测定(BLI)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、等温滴定量热(ITC)、分析超速离心、放射免疫测定(RIA)或IRMA)和增强化学发光(ECL)。一些方法在实施例中进一步描述。通常，解离常数KD在20℃、25℃或30℃下测定。如果没有另外特别指明，本文所述的KD值是在22℃+/-3℃下通过表面等离子体共振测定的。在一个实施方式中，Ig结合蛋白对人IgG 1的解离常数KD在0.1nM至100nM的范围内，优选为0.1nM至50nM(参见实施例6，表3)。
Ig结合蛋白的高碱性稳定性.如实施例和图中所示，本发明的Ig结合蛋白令人惊讶地提供了Ig结合蛋白的特别好的碱性稳定性。Ig结合蛋白的碱性稳定性通过比较Ig结合活性的损失来确定。在一些实施方式中，碱性液体包含0.1-1.0M的NaOH或KOH，优选0.25-0.5M的NaOH或KOH。由于本发明的Ig结合蛋白的高碱性稳定性，pH高于13的碱性液体可用于清洗具有本发明的固定化Ig结合蛋白的亲和基质。在一些实施方式中，通过比较在0.5MNaOH中孵育至少24小时后Ig结合活性的损失来确定Ig结合蛋白的碱性稳定性(参见图4和实施例)。
多聚体.在一个实施方式中，Ig结合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7或8个，优选2、3、4、5或6个彼此连接的Ig结合结构域，即Ig结合结构域蛋白质可以是例如单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体。多聚体可包含两个、三个、四个或甚至更多结合结构域。本发明的多聚体是人工产生的融合蛋白，通常通过技术人员公知的重组DNA技术产生。
在一些实施方式中，多聚体是同源多聚体，例如，Ig结合蛋白的所有Ig结合结构域的氨基酸序列是相同的。
多聚体可以包含两个或更多个Ig结合结构域，其中所述Ig结合结构域优选地包含如上所述的序列或基本上由其组成。二聚体的实例在SEQ ID NO:11(cs58二聚体)、SEQ IDNO:12(cs59二聚体)、SEQ ID NO:13(cs60二聚体)和SEQ ID NO:14(cs50二聚体)中提供。五聚体的实例在SEQ ID NO:15(cs50五聚体)和SEQ ID NO:16(cs59五聚体)中提供。
在一些实施方式中，多聚体是异源多聚体，例如，至少一个Ig结合结构域与Ig结合蛋白内的其他Ig结合结构域具有不同的氨基酸序列。
接头.在一个实施方式的一些实施方式中，一个或多个Ig结合结构域彼此直接连接。在其他实施方式中，一个或多个Ig结合结构域通过一个或多个接头彼此连接。在这些典型的实施方式中优选的是肽接头。这意味着肽接头是连接第一Ig结合结构域与第二Ig结合结构域的氨基酸序列。肽接头通过结构域的C-末端和N-末端之间的肽键连接到第一Ig结合结构域和第二Ig结合结构域，从而产生单个线性多肽链。接头的长度和组合物可以在至少一个和多达约30个氨基酸之间变化。更具体地，肽接头的长度在1至30个氨基酸之间；例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个氨基酸。优选的是肽接头的氨基酸序列对苛性条件和蛋白酶稳定。接头不应使Ig结合蛋白中的结构域的构象不稳定。众所周知的是包含或由小氨基酸如甘氨酸和丝氨酸组成的接头。接头可以是富含甘氨酸的(例如，接头中大于50％的残基可以是甘氨酸残基)。还优选的是包含其他氨基酸的接头。本发明的其他实施方式包括由丙氨酸、脯氨酸和丝氨酸组成的接头。用于蛋白质的融合的其他接头是本领域已知的并且可以使用。在一些实施方式中，Ig结合蛋白的多聚体包含连接Ig结合结构域的一个或多个接头，其中接头相同或不同。
亲和分离基质.在另一个实施方式中，本发明涉及亲和分离基质，其包含前述实施方式的Ig结合蛋白。
在优选的实施方式中，亲和分离基质是固体支持物。亲和分离基质包含至少一种如上所述的Ig结合蛋白。
亲和基质可用于分离免疫球蛋白，并且即使在清洁过程中应用的高度碱性条件下也应保留Ig结合特性。基质的这种清洁对于基质的长期重复使用是必不可少的。
用于亲和层析的固体支持物基质是本领域已知的并且包括例如但不限于，琼脂糖和琼脂糖的稳定衍生物(例如
Pure、
Jetted A50、
Sepharose 6B、
rPROTEIN ASepharose Fast Flow(琼脂糖快流速)等)、纤维素或纤维素衍生物、可控孔度玻璃(例如
vA树脂)、
整体柱(monolith)(例如
整体柱)、二氧化硅、氧化锆(例如CM Zirconia或
)、氧化钛或合成聚合物(例如，聚苯乙烯，例如Poros50A或Poros
A树脂、聚乙烯醚、聚乙烯醇、单分散聚丙烯酸酯树脂(例如UniMabTM，UniMabTM Pro)、丙烯酸聚羟基烷基酯、甲基丙烯酸聚羟基烷基酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等)和各种组合物的水凝胶。在某些实施方式中，载体包含多羟基聚合物，例如多糖。适用于支持物的多糖的实例包括但不限于琼脂、琼脂糖、葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰多糖等，以及这些的稳定变体。
固体支持物基质的形式可以是任何合适的众所周知的类型。用于偶联如本文所述的Ig结合蛋白的此类固体支持物基质可包括例如以下之一：柱、毛细管、颗粒、膜、过滤器、整体柱、纤维、垫、凝胶、载玻片、板、盒或层析中常用的且本领域技术人员已知的任何其他形式。
在一个实施方式中，基质由基本上球形的颗粒组成，也称为珠，例如琼脂糖凝胶或琼脂糖珠或单分散聚丙烯酸酯珠。合适的粒度可以在5-500μm，例如10-100μm，例如20-80μm，例如40-70μm的直径范围内。颗粒形式的基质可用作填充床或包括膨胀床的悬浮形式。
在替代实施方式中，固体支持物基质是膜，例如水凝胶膜。在一些实施方式中，亲和纯化涉及作为基质的膜，一个实施方式的Ig结合蛋白与其共价结合。固体支持物也可以是盒中的膜形式。
在一些实施方式中，亲和纯化涉及含有固体支持物基质的层析柱，一个实施方式的Ig结合蛋白与其共价结合。
固定到固体支持物上.在本发明的实施方式中，Ig结合蛋白与固体支持物缀合。在本发明的一些实施方式中，Ig结合蛋白可以在N-末端和/或C-末端包含另外的氨基酸残基。本发明的Ig结合蛋白可以通过常规偶联技术附着到合适的固体支持物基质上。将蛋白质配体固定到固体支持物的方法在本领域是众所周知的，并且本领域技术人员使用标准技术和设备容易地进行。在一些实施方式中，偶联可以是多点偶联，例如通过几种赖氨酸，或单点偶联，例如通过半胱氨酸。
在一些实施方式中，碱稳定的Ig结合蛋白包含用于共价连接至固相(基质)的连接位点。位点特异性连接位点包含天然氨基酸，例如半胱氨酸或赖氨酸，其能实现与固相的反应基团或固相与蛋白质之间的接头的特定化学反应。
在一些实施方式中，连接位点可以直接位于Ig结合蛋白的C-或N-末端。在一些实施方式中，单个半胱氨酸位于C末端以用于Ig结合蛋白的位点特异性固定。具有C-末端半胱氨酸的优点是Ig结合蛋白的偶联可以通过半胱氨酸硫醇与支持物上的亲电子基团的反应导致硫醚桥偶联来实现。这为偶联蛋白提供优异的流动性，其提供增加的结合能力。
在其他实施方式中，N-末端或C-末端与连接位点之间可能存在接头。在本发明的一些实施方式中，Ig结合蛋白可包含3-20个氨基酸，优选4-10个氨基酸的N-末端或C-末端氨基酸序列，具有末端半胱氨酸。末端连接位点的氨基酸可选自脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，在C末端有单个半胱氨酸用于偶联。
在本发明的一些实施方式中，Ig结合蛋白还可以在N-末端和/或C-末端包含另外的氨基酸残基，诸如例如在N-末端的前导序列和/或在N-末端或C-末端有或没有标签的偶联序列。
Ig结合蛋白的用途.在一个实施方式中，本发明涉及一个实施方式的Ig结合蛋白或一个实施方式的亲和基质用于免疫球蛋白或其变体的亲和纯化的用途，即本发明的Ig结合蛋白用于亲和层析。在一些实施方式中，如本发明的一个实施方式中所述，将本发明的Ig结合蛋白固定在固体支持物上。
免疫球蛋白的亲和纯化方法.在一个实施方式中，本发明涉及一种亲和纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供含有Ig的液体，例如IgG1、IgG2、IgG4、IgM、IgA、Ig片段、Fc片段或Fab片段(包括融合蛋白和缀合物，如上定义的)；
(b)提供一种亲和分离基质，该基质包含固定在所述亲和分离基质上的如上所述的固定化Ig结合蛋白；
(c)在允许如上所述的至少一种Ig结合蛋白与Ig结合的条件下，使所述液体与所述亲和分离基质接触；和
(d)从所述基质中洗脱所述Ig，从而获得含有所述Ig的洗脱液。
在一些实施方式中，亲和纯化方法可以进一步包括在步骤(c)和(d)之间在足以从亲和分离基质中去除一些或所有与其非特异性结合的分子的条件下进行的一个或多个洗涤步骤。非特异性结合是指不涉及至少一种Ig结合蛋白和Ig之间的相互作用的任何结合。
适合于所公开的用途和方法的亲和分离基质是根据上述实施方式并且如本领域技术人员已知的那些基质。
在一些实施方式中，步骤(d)中免疫球蛋白从Ig结合蛋白的洗脱是通过pH变化和/或盐浓度变化实现的。通常，进行亲和纯化方法的合适条件是本领域技术人员公知的。在一些实施方式中，包含公开的Ig结合蛋白的公开的用途或亲和纯化方法在大于或等于3.5(例如，约3.8、约4.0或约4.5)的pH下可提供至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的含有Ig的蛋白质的洗脱。由于本发明的Ig结合蛋白的高稳定性，大于或等于pH 3.5的溶液可用于Ig蛋白的洗脱(参见实施例6)。
在一些实施方式中，添加用于有效清洁亲和基质的其他步骤(f)，优选通过使用例如具有13-14的pH的碱性液体。在某些实施方式中，清洁液体包含0.1-1.0M的NaOH或KOH，优选0.25-0.5M的NaOH或KOH。由于本发明的Ig结合蛋白的高碱性稳定性，这种强碱性溶液可用于清洁目的。
在一些实施方式中，Ig结合蛋白的Ig结合能力是在碱性条件下孵育之前的Ig结合能力的至少70％、至少约80％、至少约90％或100％，例如，通过在0.5M的NaOH中孵育至少24小时后剩余的Ig结合能力确定的(参见图4和实施例)。
在一些实施方式中，亲和基质可以重复使用至少10次、至少20次、至少30次、至少40次、至少50次、至少60次、至少70次、至少80次、至少90次或至少100次，由于步骤(a)至(e)的重复，可选地(a)至(f)可重复至少10次、至少20次、至少30次、至少40次、至少50次、至少60次、至少70次、至少80次、至少90次或至少100次。
核酸分子.在一个实施方式中，本发明涉及编码如上公开的Ig结合蛋白的核酸分子，优选分离的核酸分子。在一个实施方式中，本发明涉及包含核酸分子的载体。载体是指可用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。在一个实施方式中，载体是表达载体。
在一个实施方式中，本发明涉及一种表达系统，其包含如上公开的核酸或载体，例如原核宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，或真核宿主，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或哺乳动物细胞，如CHO细胞。
Ig结合蛋白的生产方法。在一个实施方式中，本发明涉及一种生产本发明的Ig结合蛋白的方法，包括以下步骤(多个)：(a)在合适的条件下培养一个实施方式的宿主细胞以用于表达结合蛋白以获得所述Ig结合蛋白；和(b)可选地分离所述Ig结合蛋白。培养原核或真核宿主的合适条件是本领域技术人员公知的。
本发明的Ig结合分子可以通过许多常规和众所周知的技术中的任一种来制备，例如普通有机合成策略、固相辅助合成技术或通过市售的自动合成仪。另一方面，它们也可以通过单独的常规重组技术或与常规合成技术结合来制备。
本发明的一个实施方式涉及一种用于制备如上文详述的根据本发明的Ig结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备编码如上定义的Ig结合蛋白的核酸；(b)将所述核酸导入表达载体；(c)将所述表达载体引入宿主细胞中；(d)培养宿主细胞；(e)将宿主细胞置于表达Ig结合蛋白的培养条件下，从而(e)产生如上所述的Ig结合蛋白；可选地(f)分离步骤(e)中产生的蛋白质；和(g)可选地将蛋白质缀合至如上所述的固体基质。
在本发明的另一个实施方式中，Ig结合蛋白的产生通过无细胞体外转录/翻译进行。
实施例
提供以下实施例以进一步说明本发明。然而，本发明并不限于此，以下实施例仅基于以上描述说明本发明的实用性。
实施例1：本发明的Ig结合蛋白的产生
人工Ig结合配体最初通过天然存在的蛋白A结构域和蛋白A结构域变体(例如，Z结构域)的改组过程产生。更详细地，本文理解的改组过程是导致从一组不同的已知氨基酸序列开始的人工氨基酸序列的组装过程。改组过程包括以下步骤：a)提供五个天然存在的蛋白A结构域E、B、D、A和C以及蛋白A变体结构域Z的序列；b)所述序列的比对；c)在硅上(insilico)统计片段化以鉴定重组的子序列，然后d)组装各种片段的新人工序列以产生镶嵌产物，即新的氨基酸序列。步骤c)中生成的片段具有任意长度，例如如果片段化的亲本序列的长度为n，则片段的长度为1至n-1。
镶嵌产物中氨基酸的相对位置相对于起始氨基酸序列保持不变。人工改组的Ig结合蛋白的总氨基酸序列是人工的，因为它与任何天然存在的蛋白A结构域或结构域Z的总氨基酸序列具有不大于85％的同一性。在产生最初的人工Ig结合蛋白后，通过氨基酸序列的位点特异性随机化进一步修饰蛋白质以进一步修饰功能特性。通过单个氨基酸残基的位点饱和诱变引入进一步的修饰。例如，碱性稳定的Ig结合蛋白cs26的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)通过这种方法产生。
变体cs50、cs52、cs58、cs59、cs60、cs51、cs56、cs54、cs55和cs57由合成基因片段(Twist Bioscience/Thermo Fisher Scientific)产生。基因片段对应于纯化的PCR产物，并被克隆到pET28a载体的衍生物中。通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌XL2-蓝色细胞(Stratagene)中。通过PCR筛选单个菌落以鉴定包含正确大小插入物的构建体。DNA测序用于验证正确的序列。本发明的所有变体与例如天然存在的蛋白A结构域C、蛋白A结构域B或结构域Z具有小于80％的同一性。
实施例2：Ig结合蛋白的表达
BL21(DE3)感受态细胞用编码Ig结合蛋白的表达质粒转化。将细胞铺在选择性琼脂平板(卡那霉素)上并在37℃下孵育过夜。将预培养物从单菌落接种到补充有50μg/ml卡那霉素的50ml 2xYT培养基中，并在500mL的锥形瓶中的常规定轨振荡器中以200rpm在37℃下培养17小时。OD600读数应在4-6的范围内。在1L的厚壁锥形瓶中，在补充有50μg/ml的卡那霉素和微量元素(参见Studier 2005)的300ml超富培养基(由2％葡萄糖、5％酵母提取物、0.89％甘油、0.76％乳糖、250mM MOPS、202mM TRIS、10mM MgSO4、pH 7.4、消泡剂Se15组成的改良的H15培养基)中，使用0.3的调整的起始OD600，从先前的过夜培养物中接种主要培养物。将培养物转移到共振声混合器(RAMbio)中，并在37℃下以20x g孵育。通过Oxy-Pump塞子促进曝气。通过代谢葡萄糖并随后允许乳糖进入细胞来诱导重组蛋白表达。细胞过夜生长约18小时后以达到约30-45的最终OD600。在收获之前，测量OD600，取出调整到0.6/OD600的样品，制粒并在-20℃下冷冻。为了收集生物质细胞，在20℃下以12000x g离心15分钟。称重颗粒(湿重)。处理前将细胞储存在-20℃下。
实施例3：Ig结合蛋白的表达和溶解度的SDS-PAGE分析
将样品重悬于90pi的提取缓冲液(补充有0.2mg/ml的溶菌酶、0.5xBugBuster、6mMMgSO4、6mM MgCl2、15U/mL的核酸酶的PBS)并通过在热混合器中以850rpm搅拌溶解，室温下搅拌15分钟，随后在-80℃下孵育15分钟。解冻后，通过离心(16000x g，2分钟，室温)将可溶性蛋白质与不溶性蛋白质分离。取出上清液(可溶性部分)并将沉淀(不溶性部分)重新悬浮在等量的尿素缓冲液(8M尿素、0.2M Tris、20mM EDTA，pH 7.0)中。从可溶性和不溶性部分中取出35μL，并添加10μL的5x样品缓冲液以及5μL的0.5M的DTT。样品在95℃下煮沸5分钟。最后，将5μL的这些样品应用于NuPage Novex 4-12％Bis-Tris SDS凝胶，将其根据制造商的建议进行并用考马斯法(Coomassie)染色。在选定的时间段内在优化条件下发现所有Ig结合蛋白的高水平表达(数据未显示)。根据SDS-PAGE，所有表达的Ig结合蛋白溶解至大于95％。
实施例4：Ig结合蛋白的纯化
Ig结合蛋白在大肠杆菌(E.coli)的可溶性部分中表达。将细胞重新悬浮在细胞破碎缓冲液中并通过超声细胞破碎系统(Sonopuls HD 2200,Bandelin)裂解。使用pH 3.0的柠檬酸缓冲液(20mM的柠檬酸，1mM EDTA，pH 3.0)使用AKTAvant系统(Ge Healthcare)根据制造商的说明使用IEC Sepharose SP-HP(GE Healthcare)进行纯化步骤。通过将氯化钠浓度增加到1M以10个柱体积的线性梯度洗脱纯蛋白质部分。
实施例5：(如由表面等离子共振实验确定的)Ig结合蛋白以高亲和力与IgG结合
用SPR运行缓冲液平衡CM5传感器芯片(GE Healthcare)。由使EDC和NHS的混合物通过以产生反应性酯基团来活化表面暴露的羧基。将700-1500RU的on-配体(on-ligand)固定在流动池上，off-配体(off-ligand)固定在另一个流动池上。配体固定后注射乙醇胺可去除非共价结合的Ig结合蛋白。配体结合后，蛋白质分析物在表面上积累，从而增加折射率。折射率的这种变化是实时测量的，并绘制为响应或共振单位(RU)与时间的关系图。将分析物以合适的流速(μl/min)以连续稀释的形式施加到芯片上。每次运行后，芯片表面用再生缓冲液再生并用运行缓冲液平衡。将对照样品施加到基质上。如前所述进行再生和再平衡。通过使用
3000(GE Healthcare)在25℃下进行结合研究；数据评估通过制造商提供的BIAevaluation 3.0软件，通过使用Langmuir 1:1模型(RI＝0)操作。评估的解离常数(KD)相对于脱靶进行标准化，并且西妥昔单抗(IgG1)的不同人工Ig结合蛋白的KD值显示在表3A中，并且西妥昔单抗(IgG1)、那他珠单抗(IgG4)和帕尼单抗(lgG2)的KD值显示在表3B中。
表3：Ig结合蛋白以高亲和力与IgG结合
表3A.IgG1的Ig结合蛋白的KD值
表3B.IgG1(西妥昔单抗)、IgG4(那他珠单抗)和IgG2(帕尼单抗)的Ig结合蛋白的KD值
实施例6：Ig结合蛋白偶联至基于琼脂糖的层析珠PraestoTM Pure85-偶联效率，DBC10％，洗脱
根据制造商的说明将纯化的Ig结合蛋白与基于琼脂糖的层析珠(PraestoTMPure85,Purolite；Cat.No.PR01265-164)偶联(偶联条件：pH9.5，3小时，35℃，4.1M NaSO4，用乙醇胺封闭过夜)。耦合效率参见图2。偶联树脂和商业MabSelect树脂(Cat.No.29049104,GE-Healthcare)填充到超紧凑型5/50柱(Gotec GmbH)。多克隆人IgG
(Ocatpharm)用作IgG样品(cone.2,2mg/ml)。将饱和量的多克隆hIgG样品施加到包含固定化Ig结合蛋白的基质上。动态结合容量(DBC,mg/ml)参见图3。使用与Praesto 85环氧树脂偶联的20mg/ml cs59(二聚体)或cs60(二聚体)(偶联条件：pH 9.5，3小时，35℃，350mg/ml树脂Na2SO4)获得可比较的结果。
用50mM的乙酸缓冲液(pH 3.5)然后用0.1M磷酸洗涤基质以洗脱与固定的Ig结合蛋白结合的hIgG。对于所有测试的Ig结合蛋白，大于97％的抗体被洗脱(100％，cs55、cs56、cs57；99.5％的cs54；98.3％的cs52、97.4％的cs51和97.3％的cs50)。或者，用100mM的乙酸缓冲液(pH 3.7)然后用0.1M磷酸洗涤基质以洗脱与固定的Ig结合蛋白结合的hIgG。大于98％的抗体从具有固定化cs60(二聚体)的基质中洗脱。
实施例7：偶联到环氧活化基质上的Ig结合蛋白的碱性稳定性
在室温(22℃+/-3℃)下，将柱用0.5M NaOH孵育0小时和24小时。在用0.5M NaOH孵育之前和之后分析固定蛋白的Ig结合活性。结果示于图4中。此外，在0.5M NaOH中48小时后，分析一些Ig结合蛋白的苛性稳定性。即使在强碱性溶液中孵育2天后，cs50的剩余结合能力仍为79％，cs52为75.2％，并且cs56为61.4％。与MabSelect Sure相比，结合容量提高了至少38.9％(cs56)、70.1％(cs52)和78.7％(cs50)。
将具有固定化20mg/ml的cs59(二聚体)或cs60(二聚体)的Praesto85环氧树脂与0.5M NaOH一起在室温(22℃+/-3℃)下孵育24小时和50小时。即使在强碱性溶液中大于2天后，cs59(二聚体)和cs60(二聚体)仍分别显示95.3％和98.6％的针对Ig的剩余结合能力。与SEQ ID NO:19的苛性稳定蛋白(针对Ig的88％的剩余结合能力)相比，在碱处理50小时后的cs59和cs60的剩余IgG结合能力得到改善。
序列表
<110> 纳维格蛋白质有限公司（Navigo Proteins GmbH）
<120> 用于亲和纯化的免疫球蛋白结合蛋白
<130> NP41 EP2
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs50
<400> 1
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs52
<400> 2
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs58
<400> 3
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs59
<400> 4
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs60
<400> 5
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 6
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs51
<400> 6
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 7
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs56
<400> 7
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 8
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs54
<400> 8
Ile Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 9
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs57
<400> 9
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 10
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs55
<400> 10
Ile Ala Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs58 二聚体
<400> 11
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Pro
115
<210> 12
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs59 二聚体
<400> 12
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Pro
115
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs60 二聚体
<400> 13
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Pro
115
<210> 14
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs50 二聚体
<400> 14
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Pro Cys
115
<210> 15
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs50 五聚体
<400> 15
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp
165 170 175
Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala
225 230 235 240
Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val
260 265 270
Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala
275 280 285
Pro Pro
290
<210> 16
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs59 五聚体
<400> 16
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp
50 55 60
Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
165 170
<210> 17
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列 1
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> 可以由S替换
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> 可以由A替换
<220>
<221> 变体
<222> (40)..(40)
<223> 可以由T替换
<220>
<221> 变体
<222> (43)..(43)
<223> 可以由A替换
<220>
<221> 变体
<222> (46)..(46)
<223> 可以由G替换
<400> 17
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 18
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列 2
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 可以由A替换
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> 可以由Q替换
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> 可以由k替换
<220>
<221> 变体
<222> (40)..(40)
<223> 可以由V替换
<220>
<221> 变体
<222> (46)..(46)
<223> 可以由A替换
<220>
<221> 变体
<222> (53)..(53)
<223> 可以由D替换
<400> 18
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 19
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 参考 2
<400> 19
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
Claims (15)
1.一种包含一个或多个Ig结合结构域的Ig结合蛋白，其中至少一个结构域包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的Ig结合蛋白，其中所述结构域包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与其至少95％同一性的序列。
3.根据权利要求1所述的Ig结合蛋白，其中所述结构域包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与其至少95％同一性的序列，或其中所述结构域包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或与其至少95％同一性的序列。
4.根据权利要求3所述的Ig结合蛋白，其中所述结构域包含如SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白包含2、3、4、5、6、7或8个彼此连接的结构域。
6.根据权利要求5所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白质是同源多聚体或异源多聚体。
7.根据权利要求6所述的Ig结合蛋白，其中一个或多个结构域彼此直接连接或通过一个或多个接头彼此连接。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白结合IgG1、IgG2、IgG4、IgM、IgA、Ig片段、Fc片段或Fab片段。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白固定在固体支持物上。
10.一种亲和分离基质，包含与所述亲和分离基质偶联的根据权利要求1至9中任一项所述的Ig结合蛋白。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的Ig结合蛋白或根据权利要求10所述的亲和分离基质用于亲和纯化对所述Ig结合蛋白具有亲和力的任何蛋白质的用途。
12.一种亲和纯化包含Ig序列的蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)提供含有包含Ig序列的蛋白质的液体；
(b)提供根据权利要求10所述的亲和分离基质；
(c)在允许权利要求1至9中任一项所述的至少一种Ig结合蛋白与包含Ig序列的蛋白质结合的条件下使所述亲和分离基质与所述液体接触；和
(d)从所述亲和纯化基质中洗脱包含Ig序列的所述蛋白质。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤(d)中，大于90％的包含所述Ig序列的蛋白质是从根据权利要求1至9中任一项所述的Ig结合蛋白洗脱的。
14.根据权利要求12至13中任一项所述的方法，包括用碱性清洗液清洗所述亲和纯化基质的另外的步骤(e)。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述Ig结合蛋白的Ig结合能力是在碱性条件下孵育之前的所述Ig结合能力的至少70％。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP19154972 | 2019-02-01 | ||
| EP19154972.4 | 2019-02-01 | ||
| EP19193552 | 2019-08-26 | ||
| EP19193552.7 | 2019-08-26 | ||
| PCT/EP2020/052438 WO2020157281A1 (en) | 2019-02-01 | 2020-01-31 | Immunoglobulin binding proteins for affinity purification |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113348176A true CN113348176A (zh) | 2021-09-03 |
Family
ID=69190814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202080011113.5A Pending CN113348176A (zh) | 2019-02-01 | 2020-01-31 | 用于亲和纯化的免疫球蛋白结合蛋白 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220112236A1 (zh) |
| EP (1) | EP3917942A1 (zh) |
| JP (1) | JP2022519808A (zh) |
| KR (1) | KR20210122788A (zh) |
| CN (1) | CN113348176A (zh) |
| AU (1) | AU2020213921B2 (zh) |
| BR (1) | BR112021013026A2 (zh) |
| CA (1) | CA3123498A1 (zh) |
| IL (1) | IL284936A (zh) |
| SG (1) | SG11202106848UA (zh) |
| WO (1) | WO2020157281A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA202104360B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3452097A1 (en) | 2016-05-04 | 2019-03-13 | Navigo Proteins GmbH | Targeted compounds for the site-specific coupling of chemical moieties comprising a peptide linker |
| EP4001301A1 (en) * | 2020-11-13 | 2022-05-25 | Navigo Proteins Gmbh | Binding protein for complement factor h (cfh) |
| GB202113626D0 (en) | 2021-09-24 | 2021-11-10 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | FC binding polypeptides |
| GB202203478D0 (en) | 2022-03-14 | 2022-04-27 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | Vh3 binding polypeptides |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1642976A (zh) * | 2002-03-25 | 2005-07-20 | 阿默森生物科学有限公司 | 一种突变的免疫球蛋白－结合蛋白 |
| CN107429244A (zh) * | 2015-03-26 | 2017-12-01 | Jsr株式会社 | 免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体 |
| WO2018029158A1 (en) * | 2016-08-11 | 2018-02-15 | Repligen Corporation | Alkaline stable fc—binding proteins for affinity chromatography |
| CN107922483A (zh) * | 2015-07-16 | 2018-04-17 | 纳维格蛋白质有限公司 | 新型免疫球蛋白结合蛋白及其在亲和纯化中的用途 |
| CN111132994A (zh) * | 2017-08-07 | 2020-05-08 | 瑞普利金公司 | 在c末端螺旋区中具有半胱氨酸的fc结合蛋白 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG195555A1 (en) * | 2008-12-24 | 2013-12-30 | Emd Millipore Corp | Caustic stable chromatography ligands |
| US11566082B2 (en) * | 2014-11-17 | 2023-01-31 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
| EP4249097A3 (en) * | 2018-02-01 | 2024-01-10 | Repligen Corporation | Fc binding proteins with cysteine in the c-terminal helical region |
-
2020
- 2020-01-31 WO PCT/EP2020/052438 patent/WO2020157281A1/en unknown
- 2020-01-31 KR KR1020217024464A patent/KR20210122788A/ko unknown
- 2020-01-31 CA CA3123498A patent/CA3123498A1/en active Pending
- 2020-01-31 JP JP2021541284A patent/JP2022519808A/ja active Pending
- 2020-01-31 EP EP20701816.9A patent/EP3917942A1/en active Pending
- 2020-01-31 SG SG11202106848UA patent/SG11202106848UA/en unknown
- 2020-01-31 BR BR112021013026-8A patent/BR112021013026A2/pt unknown
- 2020-01-31 US US17/430,238 patent/US20220112236A1/en active Pending
- 2020-01-31 CN CN202080011113.5A patent/CN113348176A/zh active Pending
- 2020-01-31 AU AU2020213921A patent/AU2020213921B2/en active Active
-
2021
- 2021-06-24 ZA ZA2021/04360A patent/ZA202104360B/en unknown
- 2021-07-19 IL IL284936A patent/IL284936A/en unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1642976A (zh) * | 2002-03-25 | 2005-07-20 | 阿默森生物科学有限公司 | 一种突变的免疫球蛋白－结合蛋白 |
| CN107429244A (zh) * | 2015-03-26 | 2017-12-01 | Jsr株式会社 | 免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体 |
| CN107922483A (zh) * | 2015-07-16 | 2018-04-17 | 纳维格蛋白质有限公司 | 新型免疫球蛋白结合蛋白及其在亲和纯化中的用途 |
| US20180305463A1 (en) * | 2015-07-16 | 2018-10-25 | Navigo Proteins Gmbh | Novel immunoglobulin-binding proteins and their use in affinity purification |
| WO2018029158A1 (en) * | 2016-08-11 | 2018-02-15 | Repligen Corporation | Alkaline stable fc—binding proteins for affinity chromatography |
| CN111132994A (zh) * | 2017-08-07 | 2020-05-08 | 瑞普利金公司 | 在c末端螺旋区中具有半胱氨酸的fc结合蛋白 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20220112236A1 (en) | 2022-04-14 |
| BR112021013026A2 (pt) | 2021-10-13 |
| AU2020213921B2 (en) | 2022-06-16 |
| WO2020157281A1 (en) | 2020-08-06 |
| CA3123498A1 (en) | 2020-08-06 |
| SG11202106848UA (en) | 2021-08-30 |
| JP2022519808A (ja) | 2022-03-25 |
| KR20210122788A (ko) | 2021-10-12 |
| AU2020213921A1 (en) | 2021-07-15 |
| ZA202104360B (en) | 2023-01-25 |
| IL284936A (en) | 2021-09-30 |
| EP3917942A1 (en) | 2021-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109476712B (zh) | 新型对碱稳定的免疫球蛋白结合蛋白 | |
| JP6856938B2 (ja) | 新規な免疫グロブリン結合タンパク質およびアフィニティ精製におけるそれらの使用 | |
| US11548929B2 (en) | Fc binding proteins with cysteine in the c-terminal helical region | |
| US20240091671A1 (en) | Fc binding proteins with cysteine in the c-terminal helical region | |
| AU2020213921B2 (en) | Immunoglobulin binding proteins for affinity purification | |
| CN115812075A (zh) | 用于亲和纯化的免疫球蛋白结合蛋白 | |
| EP3546476A1 (en) | Fc binding proteins with cysteine in the c-terminal helical region |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |