CN107922483A - 新型免疫球蛋白结合蛋白及其在亲和纯化中的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及包含一个或多个非天然免疫球蛋白(Ig)结合结构域的非天然结合蛋白，其中至少一个非天然lg‑结合结构域包含氨基酸序列X1X2X3XiXsX5X7XsQQX11AFYX1sX15LX1sX19PX21LX23X24X2sQRX28X2gfIQSLKDDPSXioSXi2Xi3Xi4LXi5EAXigKLXs2Xs3Xs4QXs5PX。本公开还涉及组合物，诸如包含本发明的非天然Ig结合蛋白的亲和基质。这些Ig‑结合蛋白或组合物用于亲和纯化免疫球蛋白的用途，并且涉及亲和纯化的方法。

Description

新型免疫球蛋白结合蛋白及其在亲和纯化中的用途
技术领域
本发明涉及非天然结合蛋白，其包含一个或多个非天然免疫球蛋白(Ig)结合结构域。本发明还涉及组合物，例如包含本发明的非天然Ig结合蛋白亲和基质。本发明还涉及这些Ig结合蛋白或组合物用于免疫球蛋白的亲和纯化的用途，并且涉及使用本发明的Ig结合蛋白的亲和纯化方法。
背景技术
许多生物技术和药物应用需要从含有抗体的样品中去除污染物。用于捕获和纯化抗体的建立的过程是，使用来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌细胞表面蛋白A作为免疫球蛋白的选择性配体的亲和层析(参见例如Huse等的综述,J.Biochem.Biophys.Methods 51,2002:217-231)。野生型蛋白A以高亲和力及选择性结合IgG分子的Fc区，并且在高温和宽范围pH值下是稳定的。具有改善性质(如碱稳定性)的蛋白A的变体可用于纯化抗体，并且包含蛋白A配体的各种色谱基质可商购。然而，特别地，基于野生型蛋白A的色谱基质在暴露于碱性条件后显示出对免疫球蛋白的结合能力的损失。
本发明的技术问题
大部分用于抗体或含Fc的融合蛋白的大规模生产方法使用蛋白A进行亲和纯化。
然而，由于蛋白A在亲和层析中的应用受到限制，现有技术中需要提供具有特异性结合免疫球蛋白的改进性质的新Ig结合蛋白，以促进免疫球蛋白的亲和纯化。因此，Ig结合蛋白对亲和力为1μM(甚至100nM或更小)的免疫球蛋白的特异性是Ig结合蛋白用于有效纯化免疫球蛋白的重要功能特征。
此外，为了最大限度地利用包含Ig结合蛋白的色谱基质的价值，期望多次使用亲和配体基质。在色谱循环之间，需要彻底的清洁程序来消毒和去除基质上的残留污染物。在该程序中，通常的做法是将高浓度NaOH的碱性溶液施加到亲和配体基质上。野生型蛋白A或天然存在的蛋白A结构域不能长时间耐受这种苛刻的碱性条件，并迅速丧失对免疫球蛋白的结合能力。因此，在该领域中需要获得能够结合免疫球蛋白的新型碱性稳定蛋白质。
本发明提供了特别适合于免疫球蛋白的亲和纯化但克服了现有技术的缺点的人工免疫球蛋白结合蛋白。特别地，本发明的非天然Ig结合蛋白的显著优点是，与天然存在的蛋白A结构域相比，它们在高pH下的稳定性增加。
以上概述不一定描述本发明解决的所有问题。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种非天然的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白，其包含一个或多个非天然Ig-结合结构域，其中至少一个非天然Ig-结合结构域包含氨基酸序列SEQ IDNO:1。
在第一方面的实施方案中，至少一个非天然Ig-结合结构域包含氨基酸序列
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYX15X16LX18X19PX21LX23X24X25QRX28X29FIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QX56PX58(SEQ ID NO:1)，其中
X1是A、V、Q、N或P；优选N、V、P或A；
X2是D、A或Q；优选D或A；
X3是A、S或N；
X4是K、Q或N；优选K或Q；
X5是H或F；
X6是D、N、S或A；优选D、S或A,
X7是E或K；
X8是D、E或A；
X11是S或N；
Xl5是E、D或Q；优选E；
Xl6是V或I；优选I；
Xl8是H或N；优选H；
X19是L或M；优选L；
X21是N、S或D；
X23是T或N；优选T；
X24是E或A；优选E；
X25是D或E；
X28是N、S或A；
X29是G或A；优选A；
X40是V或Q或T；
X42是K、T或A；优选K或A；
X43是E、N或S；优选E或S；
X44是V、L或I；
X46是G或A；
X49是K或Q；
X52是N、S或D；
X53是D或E；
X54是S或A；
X56是A或P；优选A；并且
X58是K或P；
并且其中，所述非天然的Ig-结合蛋白与人IgG1的解离常数KD为1μM或更少，优选小于500nM，更优选小于100nM。在第一实施方案中，本发明涉及一种包含一个或多个非天然Ig-结合结构域的结合蛋白，其中至少一个非天然Ig-结合结构域包含SEQ ID NO:1中示出的氨基酸序列，其即使在碱性处理后也能够结合免疫球蛋白。
在第二方面，本发明涉及一种组合物，其包含第一方面的非天然的Ig-结合蛋白，优选其中该组合物是亲和分离基质。
在第三方面，本发明涉及第一方面的非天然Ig-结合蛋白或第二方面的组合物用于免疫球蛋白的亲和纯化的用途。
在第四方面，本发明涉及一种亲和纯化免疫球蛋白的方法，包含以下步骤：(a)提供含有免疫球蛋白的液体；(b)提供亲和分离基质，其包含固定化的第一方面的非天然Ig-结合蛋白；(c)使所述液体与所述亲和分离基质接触，其中所述免疫球蛋白结合所述固定化的Ig-结合蛋白；和(d)从所述基质洗脱所述免疫球蛋白，由此获得含有所述免疫球蛋白的洗出液；和(e)可选地进一步包含在步骤(c)和(d)之间进行一个或多个洗涤步骤。
在第五方面，本发明涉及一种生成根据第一方面所述的非天然的Ig-结合蛋白的方法，其中每个Ig结合结构域可以通过来自天然存在的Ig-结合蛋白的至少两种天然存在的Ig-结合结构域的改组方法(shuffling process，洗牌方法)和可选地引入更多的突变来获得。
在第六方面，本发明涉及一种核酸分子，其编码第一方面所述的非天然的Ig-结合蛋白。
在第七方面，本发明涉及一种载体，其包含第六方面所述的核酸分子。
在第八方面，本发明涉及一种宿主细胞或非人类宿主，其包含第一方面所述的非天然的Ig-结合蛋白、第六方面所述的核酸分子或第七方面所述的载体。
在第九方面，本发明涉及一种用于生产第一方面所述的非天然的Ig-结合蛋白的方法，包含以下步骤：a.在适合于表达所述结合蛋白的条件下培养第八方面所述的宿主细胞以获得所述非天然的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白；和b.可选地分离所述非天然的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白。
本发明内容部分不一定描述了本发明的全部特征。通过对随后的详细描述的回顾，其它实施方案将变得显而易见。
附图说明
图1A.用于生成Ig结合蛋白的改组方法的图示。
图1B.本发明的IgG结合蛋白的通用序列(generic sequence)(SEQ ID NO:1)。数字是指结合蛋白中相应的氨基酸位置；“X”是指选自“X”下方所示氨基酸的氨基酸。例如，位置2中的“X”可以选自A、D或Q。
图2.选定的非天然Ig-结合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:9-30)。
图3.通过变性SDS-PAGE分析在HMS174(DE3)中表达的IgG结合蛋白。产生了可溶性和不溶性级分(fraction)并将其施加到SDS-凝胶上。接种后7小时的主要培养物(图3A)和接种后24小时的主要培养物(图3B)。泳道1-分子量标记，148464(SEQ ID NO:15)的可溶性级分(泳道2)和不溶性级分(泳道3)，148463(SEQ ID NO:14)的可溶性级分(泳道4)和不溶性级分(泳道5)，148461(SEQ ID NO:12)的可溶性级分(泳道6)和不溶性级分(泳道7)。灰色箭头指向表达蛋白质的近似大小。
图4.通过变性SDS-PAGE分析纯化的IgG结合蛋白。148461(SEQ ID NO:12)(图4A)和148471(SEQ ID NO:22)(图4B)的表达与纯化。泳道1分子量标记，泳道2不溶性级分，泳道3可溶性级分，泳道4流动通过(flow-through)StrepTactin柱，泳道5-9HiLoad 16/600Superdex 75pg洗脱级分。
图5.通过ELISA分析IgG结合蛋白的结合亲和力。使用西妥昔单抗(Cetuximab)(实心圈)和阿达木单抗(Adalimumab)(空心圈)作为中靶(on-target)并使用BSA(实心三角形)作为脱靶(off-target)进行测定。通过StrepTag使用Strep-Tactin-HRP分析IgG结合蛋白的结合。图5A.Ig结合蛋白148472(SEQ ID NO:23)；SEQ ID NO:23相对于西妥昔单抗的KD为5.9nM且相对于阿达木单抗为5.1nM。图5B.Ig结合蛋白148461(SEQ ID NO:12)；SEQ ID NO:12相对于西妥昔单抗的KD为7.8nM且相对于阿达木单抗为7.5nM。本发明的进一步IgG结合蛋白相比于天然存在的蛋白A结构域的结果示于表2中(参见实施例5)。
图6.通过SPR(Biacore)分析IgG结合蛋白的结合亲和力。图6A.Ig结合蛋白148463(SEQ ID NO:14)的分析。分析的浓度为0nM、1.56nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM。SEQ ID NO:14的KD为1.3nM。图6B.Ig结合蛋白154256(SEQ ID NO:28)的分析。分析的浓度为0、0.39nM、0.78nM、1.56nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM。SEQ ID NO:28的KD为3.1nM。表3示出了其它结果(参见实施例6)。
图7.IgG结合蛋白固定到SulfoLink偶联树脂。示出的是Ig结合蛋白148470(SEQID NO:21)(图7A)和Ig结合蛋白148460(SEQ ID NO:11)(图7B)的曲线。y轴显示在280nm下的吸收，单位为mAU，y轴表示以ml计的洗脱体积。
图8.在碱性处理后固定在Sulfolink树脂上的IgG结合蛋白的Ig结合活性。该图显示了，与天然存在的蛋白A结构域E、D、A、B、C和结构域Z相比，和与在连续0.5M NaOH处理80min后的结构域Z相比，不同的IgG结合蛋白148462(SEQ ID NO:13,“13”)、148463(SEQ IDNO:14；”14”)、1484672(SEQ ID NO:23,“23”)的剩余活性。
图9.在碱性处理后固定在环氧活化树脂(epoxy-activated resin)上的IgG结合蛋白的Ig结合。将Ig结合蛋白154254(SEQ ID NO:26)、154255(SEQ ID NO:27)、154256(SEQID NO:28)和154257(SEQ ID NO:30)与IgG结合蛋白148463(SEQ ID NO:14)进行比较。示出了在连续0.5M NaOH处理6小时之后的剩余活性。
图10.由在碱性处理之后固定在环氧活化树脂上的1、2、4或6个IgG结合结构域组成的IgG结合蛋白的Ig结合活性。示出了在连续0.5M NaOH处理之后，单体148463(SEQ IDNO:14)、二聚体150570(SEQ ID NO:45)、四聚体150663(SEQ ID NO:46)和六聚体150772(SEQ ID NO:47)的IgG结合活性(0小时，浅灰色柱；2小时，中灰色柱；4小时，中深灰色柱；6小时，深灰色柱)。
具体实施方式
定义
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
优选地，本文使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和H.编(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,瑞士)中描述的定义。
在整个本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”和变型诸如“包含有(comprises)”和“包含了(comprising)”将被理解为暗示包含所叙述的整数或步骤或者整数组或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或者整数组或步骤的组。
在整个本说明书的文本中引用了多篇文献(例如：专利，专利申请，科学出版物，制造商的规格，使用说明，GenBank登录号序列提交(GenBank Accession Number sequencesubmission)等)。本文中的任何事物都不应被解释为承认本发明没有资格先于这类公开(由于现有发明的原因)。本文引用的一些文献表征为“通过引用并入”。倘若此种并入的参考文献的定义或教导与本说明书中叙述的定义或教导之间发生冲突，则本说明书的文本优先。
本文中提及的所有序列公开在所附的序列表中，其全部内容和公开内容是本说明书的一部分。
术语“蛋白质”和“多肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的任何线性分子链而不是指产物的具体长度。因此，“多肽”的定义包括“肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指示两个或更多个氨基酸的链的任何其它术语，并且可以使用术语“多肽”来代替或与这些术语中的任何一个互换使用。术语“多肽”也意指多肽的翻译后修饰的产物，所述翻译后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、蛋白水解切割、非天然存在的氨基酸的修饰和本领域公知的类似修饰。因此，包含两个或更多个蛋白质结构域的Ig结合蛋白也归入术语“蛋白质”或“多肽”的定义。
在本发明的上下文中，术语“免疫球蛋白-结合蛋白”用于描述能够特异性结合免疫球蛋白的Fc区的蛋白质。由于与Fc区的这种特异性结合，本发明的“免疫球蛋白-结合蛋白”能够结合完整的免疫球蛋白、结合包含Fc区的免疫球蛋白片段、结合包含免疫球蛋白Fc区的融合蛋白、以及结合包含免疫球蛋白Fc区的结合物(conjugate缀合物)。虽然本发明的“免疫球蛋白-结合蛋白”在本文中表现出与免疫球蛋白Fc区的特异性结合，不排除“免疫球蛋白-结合蛋白”可以额外地以降低的亲和力结合其它区(诸如免疫球蛋白的Fab区)。
在本说明书中，术语“免疫球蛋白-结合蛋白”通常缩写为“Ig结合蛋白”或“Ig-结合蛋白”。有时，长形式(long form)和缩写形式同时使用，例如在表述“免疫球蛋白(Ig)结合蛋白”中。
在本发明的优选实施方案中，“免疫球蛋白-结合蛋白”包含一个或多个非天然Ig-结合结构域。如本文所使用的，术语“免疫球蛋白-结合结构域”(经常缩写为：Ig-结合结构域)是指能够特异性结合免疫球蛋白的Fc区的蛋白质结构域。然而，不排除“免疫球蛋白-结合结构域”可以能够附加地以降低的亲和力结合其它区域，诸如免疫球蛋白的Fab区。由于与Fc区的特异性结合，本发明的“免疫球蛋白-结合结构域”能够结合整个免疫球蛋白、结合包含Fc区的免疫球蛋白片段、结合包含免疫球蛋白Fc区的融合蛋白和结合包含免疫球蛋白Fc区的结合物。
在本发明优选的实施方案中，“免疫球蛋白-结合结构域”是非天然的结构域，其与天然存在的Ig结合结构域(诸如金黄色葡萄球菌蛋白A的结构域C(SEQ ID NO:7)或结构域B(SEQ ID NO:6)或结构域E(SEQ ID NO:3)或结构域D(SEQ ID NO:4)或结构域A(SEQ ID NO:5))具有最多85％的序列一致性。本发明优选的非天然的Ig结合结构域在对应于结构域E、D、A、B、C的位置Q9、Q10、A12、F13、Y14、L17、P20、L22、Q26、R27、F30、I31、Q32、S33、L34、K35、D36、D37、P38、S39、S41、L45、E47、A48、K50、L51、Q55、P57的位置和对应于结构域Z的位置具有相同的氨基酸。本发明的Ig-结合结构域与天然存在的结构域E、D、A、B、C和与结构域Z的一致性为至少约50％且最大为85％。
如本文使用的，如果第一化合物(例如本发明的Ig结合蛋白)与第二化合物(例如抗原，例如靶蛋白，如免疫球蛋白)的解离常数KD为500μΜ或更小，优选100μΜ或更小，优选50μΜ或更小，优选10μΜ或更小，优选1μΜ或更小，优选为500nM或更小，优选100nM或更小，更优选为50nM或更小，甚至更优选为10nM或更小，那么该第一化合物被认为“结合”所述第二化合物。根据本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。“特异性结合”是指与结合另一非免疫球蛋白靶相比，本发明的Ig结合蛋白更强地结合其特异的免疫球蛋白。例如，与Ig结合蛋白非特异性结合的靶的解离常数(KD)相比，该Ig结合蛋白特异性结合的靶(例如免疫球蛋白)的解离常数(KD)是超过10倍，优选超过20倍，更优选超过50倍，甚至更优选超过100倍、200倍、500倍或1000倍更低。
术语“解离常数”或“KD”定义了特异性结合亲和力。如本文使用的，术语“KD”(通常测量单位为“mol/L”，有时缩写为“M”)是指第一蛋白质和第二蛋白质之间的特定相互作用的解离平衡常数。在本发明的上下文中，术语KD特别用于描述免疫球蛋白-结合蛋白和免疫球蛋白之间的结合亲和力。高亲和力对应于低值的KD。因此，表述“至少为例如10-7M的KD”意味着值为10-7M或更低(结合更紧密)。1x 10-7M对应于100nM。10-5M和低至10-12M的值可被认为是可量化的结合亲和力。根据本发明，靶结合的亲和力应在500nM或更小的范围内，更优选低于100nM，甚至更优选10nM或更小。
用于确定结合亲和力(即确定解离常数KD)的方法是本领域普通技术人员已知的并且可以例如从本领域已知的以下方法中选择：基于表面等离子体共振(SPR)的技术、生物层干涉测量(BLI)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、荧光光谱技术、等温滴定量热法(ITC)、分析超速离心、放射免疫测定(RIA或IRMA)和增强化学发光(ECL)。下列实施例中描述了所述方法的一些。
本文所用的术语“天然存在”是指在自然界中可以发现物体(object)的事实。例如，存在于生物体中可以从天然来源中分离出来并且未经人为在实验室进行故意改造的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。例如，天然存在的Ig-结合结构域可以分离自细菌金黄色葡萄球菌，例如蛋白质A结构域C(SEQ ID NO:7)或蛋白质A结构域B(SEQ ID NO:6)或蛋白质A结构域E(SEQ ID NO:3)或蛋白质A结构域D(SEQ ID NO:4)或蛋白质A结构域A(SEQ ID NO:5)。
与此相反，如本文所使用的术语“非天然的”是指不是天然存在的物体，即该术语是指由人生产或修饰的物体。例如，由人类例如在实验室中(例如通过遗传工程、改组方法或化学反应等)产生的或有意修饰的多肽或多核苷酸序列是“非天然的”。术语“非天然的”和“人工的”在本文中可互换使用。例如，包含至少一个Ig结合结构域的本发明的Ig-结合蛋白是非天然的蛋白质。
根据本发明在本文中可互换使用的术语“抗体”或“Ig”或“免疫球蛋白”包含具有由两条重链和两条轻链组成的四-多肽链结构的蛋白质(免疫球蛋白或IgG抗体)，其具有特异性结合抗原的能力。术语“抗体轻链”指示抗体链的小多肽亚基，其由两个串联免疫球蛋白结构域、一个恒定结构域和一个对于抗原结合很重要的可变结构域组成。术语“抗体重链”表示抗体的大多肽亚基，其决定了抗体的类别或同种型。另外，仍然保留有结合特异性的其片段或衍生物也包含在术语“抗体”中。抗体片段在本文中理解为包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基。术语“抗体”还包括实施方案，诸如嵌合抗体(人类恒定结构域、非人类可变结构域)、单链抗体和人源化抗体(除了非人类CDR之外的人类抗体)。在本发明中最优选由两条重链和两条轻链组成的全长IgG抗体。重链和轻链通过非共价相互作用和二硫键连接。
如本文所使用的，术语“接头(linker)”在其最广泛的意义上指共价连接至少两个其它分子的分子。在本发明的典型实施方案中，“接头”应理解为连接第一多肽与至少一种其它多肽的部分。第二多肽可以与第一多肽相同或可以不同。在这些典型实施方案中优选的是肽接头。这意味着肽接头是将第一多肽与第二多肽连接的氨基酸序列，例如将第一Ig结合结构域与第二个Ig结合结构域连接。肽接头通过肽键连接到第一多肽和连接到第二多肽，从而产生单一的线性多肽链。接头的长度和组成可以在至少一个和至多30个氨基酸之间变化。更具体地，肽接头的长度在1和30个氨基酸之间；例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。优选的是，肽接头的氨基酸序列对蛋白酶是稳定的和/或不形成二级结构。众所周知的是由小氨基酸如甘氨酸和丝氨酸组成的接头。接头可以是富含甘氨酸的(例如，接头中多于50％的残基可以是甘氨酸残基)。优选的是仅由甘氨酸和丝氨酸残基组成的可变长度的甘氨酸-丝氨酸-接头。通常，可以使用结构(SGGG)n或SGGG的排列(permutation)例如(GGGS)n的接头，其中n可以是1和6之间的任何数，优选1或2或3。还优选包含其它氨基酸的接头。本发明的优选实施方案包括由丙氨酸、脯氨酸和丝氨酸组成的接头。优选的是，肽接头由约40％至60％的丙氨酸、约20％至35％的脯氨酸和约10％至30％的丝氨酸组成。优选的是，氨基酸丙氨酸、脯氨酸和丝氨酸均匀分布在整个接头氨基酸序列中，使得不超过最多2、3、4或5个相同的氨基酸残基邻近，优选最多3个氨基酸。用于融合蛋白质的其它接头是本领域已知的并且可以使用。
可以在本发明中使用的示例性接头为下列接头：具有至少氨基酸序列SG的接头或任何其它接头，例如SGGGG[SEQ ID NO:31]、SGGGGSGGGG[SEQ ID NO:32]、GGGSGGGSGGGS[SEQ ID NO:33]、GGGGSGGGGSGGGGS[SEQ ID NO:34]、GGGGS[SEQ ID NO:35]、GGGS[SEQ IDNO:36]、SGGG[SEQ ID NO:37]或(GGGS)n(即n个重复的SEQ ID NO:36，其中n在1和5之间(例如n可以为1、2、3、4或5))、(SGGG)n(即n个重复的SEQ ID NO:37，其中n在1和5之间(例如n可以是1、2、3、4或5)或SAAPAPSAPASAAPAPAPAPAPSPAAPAAS[SEQ ID NO:41]、ASPSPAAPAPAPSAASPAPAAPAPAASPAA[SEQ ID NO:42]或ASPAPSAPSA[SEQ ID NO:43])。用于融合两个IgG结合结构域或两个IgG结合蛋白的其它接头在本领域中也是已知的，并且可以使用。
术语“融合”是指组分通过肽键直接连接或通过肽接头连接。术语“融合蛋白”涉及包含至少第一蛋白的蛋白质，该第一蛋白质基因上接合至少第二蛋白。融合蛋白是通过连接两个或更多个最初编码单独蛋白质的基因来产生的。因此，融合蛋白可以包含相同或不同结合蛋白的多聚体，其被表达为单一的线性多肽。它可以包括两个、三个、四个或更多个结合结构域或结合蛋白。通常，融合蛋白是通过本领域技术人员熟知的重组DNA技术人工产生的。本发明的Ig结合蛋白可以通过许多常规和公知技术中的任何一种来制备，例如纯有机合成策略(plain organic synthetic strategy)、固相辅助合成技术或通过市售的自动合成仪。
优选地，如本文中使用的术语“多聚体”涉及包含至少两个IgG结合结构域的融合蛋白，优选2(二聚体)、3(三聚体)、4(四聚体)、5(五聚体)、6(六聚体)、7(七聚体)或8(八聚体)个IgG结合结构域，更优选4、5或6个IgG结合结构域。在优选的实施方案中，在多聚体中的Ig结合结构域是相同的。在其它实施方案中，多聚体的Ig结合结构域可以不同。在多聚体的结构域之间插入了一个或多个接头序列。
术语“氨基酸序列一致性”是指两个或更多个蛋白质的氨基酸序列的一致性(或差异)的定量比较。相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列一致性”被定义为，在比对序列并且引入间隙(gap)(如果需要)以获得最大的百分比序列一致性之后，与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的序列中的氨基酸残基的百分比。
为了确定序列一致性，将查询蛋白的序列与参考蛋白的序列进行比对。用于比对的方法是本领域中公知的。例如，为了确定任意多肽相对于参考氨基酸序列的氨基酸序列一致性的程度，优选采用SIM局部相似性程序(Xiaoquin Huang和Webb Miller(1991),Advances in Applied Mathematics,第12卷:337-357)，其可免费获得(还参见：http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html)。为了多重比对分析，优选使用ClustalW(Thompson et al.(1994)Nucleic Acids Res.,22(22):4673-4680)。优选地，在计算序列一致性百分比时，使用SIM局部相似性程序或ClustalW的默认参数。
在本发明的上下文中，如果没有另外明确说明，修饰序列与其衍生来源的序列之间的序列一致性程度，通常相对于未修饰序列的总长度来计算。
在给定位置与参考氨基酸序列不同的查询序列的每个氨基酸被计为一个差异。查询序列中的插入或缺失也被计为一个差异。例如，与参考序列相比，两个结合结构域之间插入接头被计为一个差异。然后，将差异的总和与参考序列的长度相关以产生非一致性百分比。将一致性的定量百分比计算为100减去非一致性百分比。
如本文中使用的“约”包括明确列出的量以及其±10％的偏差。更优选，术语“约”包括5％的偏差。
如本文中使用的术语“改组(shuffled，洗牌)”是指从一组已知序列开始产生新型非天然序列的组装过程，包括以下步骤：(a)提供要改组的至少两个序列的组；(b)对所述序列进行比对；和(c)从所比对的序列组装新序列，其中所述新序列的每个位置处的氨基酸可以衍生自任一比对序列的相同位置。优选地，从比对序列之一衍生两个或更多个连续氨基酸。
术语“层析法”是指分离技术，其采用流动相和固定相以将样品中的一种类型的分子(例如免疫球蛋白)与其它分子(例如污染物)分开。液体流动相包含分子的混合物并将它们传送跨过或通过固定相(例如固体基质)。由于流动相中不同分子与固定相的差异相互作用，可以分离流动相中的分子。
术语“亲和层析法”是指特异模式的色谱法，其中偶联到固定相的配体与流动相(样品)中的分子(即免疫球蛋白)相互作用，即配体对待纯化的分子具有特异性亲和力。如在本发明的上下文中所理解的，亲和层析涉及将含有免疫球蛋白的样品加入到包含色谱配体(诸如本发明的Ig结合蛋白)的固定相中。对于固定相，术语“固体载体”或“固体基质”可互换使用。
如在本文中可互换使用的术语“亲和基质”或“亲和分离基质”或“亲和层析基质”是指一种基质(例如层析基质)，其上附接亲和配体(例如本发明的Ig结合蛋白)。配体(例如Ig结合蛋白)能够通过亲和力相互作用结合待纯化的或从混合物中除去的感兴趣的分子(例如免疫球蛋白或含Fc的蛋白)。
如本文所用的术语“亲和纯化”，是指通过将免疫球蛋白或含Fc的蛋白结合到固定在基质上的Ig结合蛋白来从液体中纯化免疫球蛋白或含Fc蛋白的方法。由此，除去了除了免疫球蛋白或含Fc蛋白之外的混合物的所有其它组分。在另一步骤中，结合的免疫球蛋白或含Fc的蛋白可以纯化形式洗脱。
术语“碱性稳定的”或“碱性稳定性”或“苛性碱稳定的”或“苛性碱稳定性”，是指本发明的Ig结合蛋白耐受碱性条件而不显著地丧失其结合免疫球蛋白的能力的能力。通过用氢氧化钠孵育Ig结合蛋白(例如，如实施例中所述)，以及随后通过本领域技术人员已知的常规实验(例如通过色谱法)测试对免疫球蛋白的结合活性，本领域技术人员可以容易地测试碱性稳定性。
在一些实施方案中，本发明的Ig结合蛋白以及包含本发明的Ig结合蛋白的基质表现出“增加的”或“改善的”碱性稳定性，意味着相对于天然存在的蛋白A结构域，掺入所述Ig结合蛋白的分子和基质在碱性条件下在延长的时间内是稳定的，即不会丧失结合免疫球蛋白的能力或者结合免疫球蛋白的能力不会丧失到比天然存在的蛋白A结构域更低的程度。
本文可互换使用的术语“结合活性”或“结合能力”或“静态结合能力”是指本发明的Ig结合蛋白结合免疫球蛋白的能力。例如，可以在碱处理之前和/或之后确定结合活性。可以确定Ig结合蛋白或偶联到基质的Ig结合蛋白(即固定化的结合蛋白)的结合活性。
在不断更新的出版物“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,(Sambrooket al.,Cold Spring Harbor)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelet al.编,Wiley&Sons)；Current Protocols in Protein Science(J.E.Colligan et al.编,Wiley&Sons)；Current Protocols in Cell Biology(J.S.Bonifacino et al.,Wiley&Sons)和Current Protocols in Immunology(J.E.Colligan et al.编,Wiley&Sons)中充分描述了分子生物学、细胞生物学、蛋白质化学和抗体技术领域中一般已知和实践的方法。在“Large Scale Mammalian Cell Culture”(D.Hu et al.,Curr.Opin.Biotechnol.8:148-153,1997)；“Serum free Media”(K.Kitano,Biotechnol.17:73-106,1991)；和“Suspension Culture of Mammalian Cells”(J.R.Birch et al.BioprocessTechnol.10:251-270,1990)中描述了与细胞培养和培养基有关的已知技术。
本发明的实施方案
现在进一步描述本发明。在下面的段落中，会更详细地定义本发明的不同方面。除非有相反的明确指示，下面定义的每个方面可以与任何其他一个或多个方面组合。特别地，指示为优选的或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其它一个或多个特征组合。
在第一方面，本发明涉及非天然的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白，其包含一个或多个非天然Ig-结合结构域，其中所述至少一个Ig结合结构域包含以下氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成：
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYX15X16LX18X19PX21LX23X24X25QRX28X29FIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QX56PX58(SEQ ID NO:1)，其中X1是A、V、Q、N或P；优选N、V、P或A；X2是D、A或Q；优选D或A；X3是A、S或N；X4是K、Q或N；优选K或Q；X5是H或F；X6是D、N、S或A；优选D、S或A；X7是E或K；X8是D、E或A；X11是S或N；Xl5是E、D或Q；优选E；Xl6是V或I；优选I；Xl8是H或N；优选H；X19是L或M；优选L；X21是N、S或D；X23是T或N；优选T；X24是E或A；优选E；X25是D或E；X28是N、S或A；X29是G或A；优选A；X40是V或Q或T；X42是K、T或A；优选K或A；X43是E、N或S；优选E或S；X44是V、L或I；X46是G或A；X49是K或Q；X52是N、S或D；X53是D或E；X54是S或A；X56是A或P；优选A；并且X58是K或P；
并且其中，所述非天然的Ig-结合蛋白与人类IgG1的解离常数KD为1μM或更少，优选500nM，更优选100nM或更小。更详细地，SEQ ID NO:1以及在SEQ ID NO:38中所示的优选实施方案是由SEQ ID NO:9至30的比对得到的通用序列。因此，本发明的Ig结合蛋白的每个非天然的Ig结合结构域表现出与天然存在的Ig结合结构域约50％至约85％的序列一致性，参见表1(参见实施例1)。本发明的Ig结合蛋白的每个非天然的Ig结合结构域，在对应于天然存在的Ig结合结构域的位置Q9、A12、F13、L17、Q26、R27、F30、I31、L34、P38、S41、L45、A48、L51、Q55的位置具有相同的氨基酸，更优选在对应于天然存在的Ig结合结构域(例如结构域C、结构域B、结构域A、结构域E和结构域D)的位置Q9、Q10、A12、F13、Y14、L17、P20、L22、Q26、R27、F30、I31、Q32、S33、L34、K35、D36、D37、P38、S39、S41、L45、E47、A48、K50、L51、Q55、P57处具有相同的氨基酸。
在第一方面的优选实施方案中，至少一个非天然Ig-结合结构域包含以下氨基酸序列或基本由其组成：
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYEILHLPX21LTEX25QRX28AFIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QAPX58(SEQ ID NO:38)，其中，
X1是N、V、P或A；
X2是D或A；
X3是A、S或N；
X4是K或Q；
X5是H或F；
X6是D、S或A；
X7是E或K；
X8是D、E或A；
X11是S或N；
X21是N、S或D；
X25是D或E；
X28是N、S或A；
X40是V、T或Q；
X42是K或A；
X43是E或S；
X44是V、L或I；
X46是G或A；
X49是K或Q；
X52是N、S或D；
X53是D或E；
X54是S或A；且
X58是K或P。
SEQ ID NO:38是由SEQ ID NO:9-30的比对产生的通用氨基酸序列，并且是SEQ IDNO:1的优选选择。
在第一方面的一个优选实施方案中，至少一个非天然Ig-结合结构域包含以下氨基酸序列或基本由以下氨基酸序列组成：
XlX2X3X4X5X6X7X8QQXllAFYX15Xl6LXl8Xl9PX2lLX23X24X25QRX28X29FIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QX56PX58(SEQ ID NO:2)，其中
X1是A、V、Q、N或P；X2是D、A或Q；X3是A或N；X4是K、Q或N；X5是H或F；X6是D、N或A；X7是E或K；X8是D、E或A；X11是S或N；X15是E或D；X16是V或I；X18是H或N；X19是L或M；X21是N、S或D；X23是T或N；X24是E或A；X25是D或E；X28是N、S或A；X29是G或A；X40是V或Q；X42是K、T或A；X43是E或N；X44是V、L或I；X46是G或A；X49是K或Q；X52是N或D；X53是D或E；X54是S或A；X56是A或P；且X58是K或P。
在第一方面的一个实施方案中，根据本发明所述的Ig结合蛋白包含一个或多个非天然Ig结合结构域，其中至少一个Ig结合结构域包含以下氨基酸序列或基本上由以下氨基酸序列组成：
X1X2AX4X5DX7X8QQX11AFYEILHLPNLTEX25QRNAFIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLNX53X54QAPK(SEQ ID NO:48)，其中
X1是N或V；
X2是D或A；
X4是K或Q；
X5是H或F；
X7是E或K；
X8是D、E或A；
X11是S或N；
X25是D或E；
X40是V或Q；
X42是K或A；
X43是E或S；
X44是V或I；
X46是G或A；
X49是K或Q；
X53是D或E；并且
X54是S或A。
SEQ ID NO:48是由SEQ ID NO:24,26,27,28和30的比对产生的通用氨基酸序列，并且是SEQ ID NO:38的优选选择。Ig结合蛋白即使在碱处理较长时间后也是稳定的(例如至少最高达6小时，0.5M NaOH)，例如，本发明的Ig结合蛋白具有比天然存在的蛋白A结构域更高的碱性稳定性。
在第一方面的另一实施方案中，根据本发明所述的Ig结合蛋白包含一个或多个非天然的Ig结合结构域，其中至少一个Ig结合结构域包含以下氨基酸序列或基本上由以下氨基酸序列组成：
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYEILHLPX21LTEDQRX28AFIQSLKDDPSX40SKX43X44LGEAKKLX52DAQAPP(SEQID NO:49)，其中
X1是P、N或A；
X2是A或D；
X3是A、S或N；
X4是K或Q；
X5是H或F；
X6是D、S或A；
X7是K或E；
X8是D、E或A；
X11是S或N；
X21是N、S或D；
X28是S或A；
X40是V或T；
X43是E或S；
X44是I或L；并且
X52是N、S或D。
SEQ ID NO:49是由SEQ ID NO:9至23的比对产生的通用氨基酸序列，并且是SEQID NO:38的优选选择。
在第一方面的实施方案中，非天然的Ig-结合蛋白包含一个或多个Ig-结合结构域，其中至少一个非天然Ig-结合结构域包含从由以下各项组成的组中选择的氨基酸序列或由其组成：
NAAQHAKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：9)，NAAQHDKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：10)，NAAQHSKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：11)，NAAQHSKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：12)，PAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：13)，PAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：14)，ADNKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：15)，ADSKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：16)，ADSKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：17)，ADSKFDEAQQSAFYEILHLPDLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：18)，ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：19)，ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：20)，ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLDDAQAPP(SEQ ID NO：21)，ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLSDAQAPP(SEQ ID NO：22)，PAAKHDKDQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：23)，NAAQHDKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO：24)，ADNKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO：25)，NAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：26)，NAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO：27)，NAAKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEVLGEAQKLNDSQAPK(SEQ ID NO：28)，QQAQHDEAQQSAFYQVLHLPNLTADQRNAFIQSLKDDPSQSAEVLGEAQKLNDSQAPK(SEQ ID NO：29)和
VDAQHDEDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSAEILAEAKKLNESQAPK(SEQ ID NO：30)。
特别优选的是包含一个或多个Ig-结合结构域的非天然的Ig-结合蛋白，其中至少一个非天然Ig-结合结构域包含由从由SEQ ID NO：13，14，23，26，27，28和30组成的组中选择的氨基酸序列或基本上由其组成。
如下文实施例中所示的，发现本发明的蛋白质与IgG结合。更详细地，发现包含SEQID NO：1的通用序列(更具体地是SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：2的通用序列，更具体地，SEQID NO：9-30)的Ig-结合多肽能够以与天然存在的Ig结合结构域的结合性质相当的高亲和力结合IgG(参见表2，实施例5和表3，实施例6)。更令人惊讶和意想不到的是，包含SEQ IDNO：1的通用序列(更具体地SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：2的通用序列，甚至更具体地SEQ IDNO：9-30)的Ig-结合蛋白即使在碱处理数小时后(例如用0.5M NaOH处理最长达6小时后)也能够结合IgG。与天然存在的蛋白A结构域或结构域Z相比，这是有利的性质(例如，参见实施例7和实施例8和图8和图9中的比较数据)。
在本发明的一个实施方案中，非天然的Ig-结合蛋白包含彼此连接的1、2、3、4、5、6、7或8(优选4、5或6)个非天然存在的Ig-结合结构域，即非天然Ig-结合蛋白可以是单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体等。例如，使用SEQ ID NO:14产生本文在实施例1中描述的多聚体融合构建体。所获得的包含多于一个Ig结合结构域的Ig结合蛋白是稳定的并且甚至在碱性处理之后仍然表现出Ig结合性质(例如，参见图10)。SEQ ID NO:45(二聚体)、SEQ ID NO:46(四聚体)或SEQ ID NO:47(六聚体)中提供了选定的但非限制性的多聚Ig结合蛋白的例子。
在第一方面的一些实施方案中，非天然Ig-结合结构域直接彼此连接。在第一方面的其它实施方案中，非天然Ig-结合结构域通过肽接头彼此连接。在第一方面的一些实施方案中，Ig结合蛋白的所有非天然Ig-结合结构域的氨基酸序列是相同的(例如SEQ ID NO:45-47)。在第一方面的其它实施方案中，至少一个非天然Ig-结合结构域具有与非天然的免疫球蛋白-结合蛋白内其它Ig-结合结构域不同的氨基酸序列。
如上所述并且在实施例中可以确定Ig结合蛋白或结构域的解离常数KD(例如，参见实施例5和实施例6)。典型地，在20℃、25℃或30℃下确定解离常数KD。如无具体的另外的指示，本文中叙述的KD值是在25℃+/-3℃下通过表面等离子体共振确定的。在第一方面的实施方案中，非天然的Ig-结合蛋白与人类IgG1的解离常数KD处于0.1nM至1000nM的范围内，优选0.1nM至500nM，更优选0.1nM至100nM，更优选0.5nM至100nM，更优选1nM至10nM。
在第一方面的实施方案中，非天然的Ig-结合蛋白与人类IgG2的解离常数KD处于0.1nM至1000nM的范围内，优选0.1nM至500nM，更优选0.1nM至100nM，更优选0.5nM至100nM，更优选1nM至10nM。
在第一方面的实施方案中，非天然的Ig-结合蛋白与人类IgG4的解离常数KD处于0.1nM至1000nM的范围内，优选0.1nM至500nM，更优选0.1nM至100nM，更优选0.5nM至100nM，更优选1nM至10nM。
在第二方面，本发明涉及包含第一方面所述的非天然的Ig-结合蛋白的组合物。
在第二方面的优选实施方案中，所述组合物是亲和分离基质，其包含与固体载体(solid support)偶联的根据任何上述实施方案所述的非天然的Ig-结合蛋白。所述亲和分离基质包含与固体载体偶联的多个本发明的Ig结合蛋白。
包含本发明的非天然Ig结合蛋白的这种基质用于分离(例如色谱分离)免疫球蛋白和其他含Fc的蛋白，诸如包含Fc区的免疫球蛋白衍生物、包含免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白、和包含免疫球蛋白的Fc区的结合物(conjugate)。用于亲和色谱法的固体载体基质是本领域中是已知的并且包括例如但不限于琼脂糖和稳定的琼脂糖衍生物(例如rPROTEIN ASepaharose Fast Flow或)、受控孔玻璃(例如 vA树脂)、整料(monolith)(例如整料)、二氧化硅、氧化锆(例如CM氧化锆或)、氧化钛、或合成聚合物(例如聚苯乙烯诸如Poros 50A或Poros A树脂、聚乙烯基醚、聚乙烯醇、聚丙烯酸羟烷基酯、聚甲基丙烯酸羟基烷基酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等)和各种组合物的水凝胶。在某些实施方案中，载体包含多羟基聚合物，例如多糖。
适用于载体的多糖的实例包括但不限于葡聚糖、淀粉、纤维素、支链淀粉(pullulan)、琼脂、琼脂糖等，以及它们的稳定变体。
固体载体形式(format)可以是任何合适的众所周知的种类。用于偶联本发明的Ig结合蛋白的此种固体载体可以包含例如但不限于以下各项中的一种：柱、毛细管、颗粒、膜、过滤器、整料(monolith)、纤维、衬垫、凝胶、载玻片、板、盒或色谱中通常使用和本领域技术人员已知的任何其它形式。在基质的一个实施方案中，载体由基本上为球形的颗粒(也称为珠粒)组成，例如琼脂糖凝胶(Sepharose)或琼胶糖(Agarose)珠粒。适合的颗粒大小可以处于5-500μm的直径范围内，诸如10-100μm，例如20-80μm。在替代实施方案中，载体是膜，例如水凝胶膜。在一些实施方案中，亲和纯化涉及作为基质(其上共价结合了第一方面的非天然Ig-结合蛋白)的膜。
固体载体也可以是卡座(cartridge)中的膜的形式。在一个实施方案中，固体基质是珠粒或颗粒形式，其可以是多孔的或非多孔的。珠粒或颗粒形式的基质可用作填充床或悬浮形式，包括膨胀床。在整料、填充床和膨胀床的情况下，分离过程通常遵循常规色谱法，在流动相中具有浓度梯度或浓度阶梯。在纯悬浮液的情况下，将使用分批式模式。
在一些实施方案中，亲和纯化涉及含有固体载体(其上共价地结合有第一方面的非天然Ig-结合蛋白)的色谱柱。
本发明的Ig结合蛋白可以通过常规的偶联技术，使用例如本发明的Ig结合蛋白中存在的氨基-、磺基羟基-和/或羧基附着于合适的固体载体上。偶联可以通过Ig结合蛋白的氮、氧或硫原子进行。优选地，包含在N-或C-末端肽接头中的氨基酸包含所述氮、氧或硫原子。Ig结合蛋白可以直接偶联到载体上或通过间隔物元件间接偶联到载体上，从而在载体表面和本发明的Ig结合蛋白之间提供适合的距离，这提高了Ig结合蛋白的可用性并促进本发明的Ig结合蛋白与载体的化学偶联。将蛋白质配体固定在固体载体上的方法在本领域中是公知的，并且本领域技术人员使用标准技术和设备可容易地进行。
在一个实施方案中，非天然的Ig-结合蛋白包含用于共价连接到固相(基质)的附着位点。优选地，附着位点特异性地提供与固相的位点特异性连接。特异性附着位点包含天然氨基酸，诸如半胱氨酸或赖氨酸或非天然的氨基酸，这使得能够与固相的反应性基团进行特定的化学反应，所述反应性基团例如选自巯基、马来酰亚胺、环氧基或烯烃基团或固相与蛋白质之间的接头。可以使用氨基反应性试剂在酸性pH下优先标记N末端。本发明的优选实施方案包括5-20个氨基酸的短的N-或C-末端肽序列，优选的10个氨基酸，具有末端半胱氨酸。C-末端肽序列的氨基酸优选选自脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸，例如ASPAPSAPSAC(SEQ IDNO:39)。
在第三方面，本发明涉及第一方面的非天然Ig-结合蛋白或第二方面的组合物用于亲和纯化免疫球蛋白的用途，即本发明的Ig-结合蛋白被用于亲和色谱法。在一些实施方案中，本发明的Ig-结合蛋白被固定化在如本发明第二方面所述的固体载体上。在第三方面的一个实施方案中，待纯化的免疫球蛋白选自由人类lgG1、人类lgG2、人类lgG4、人类IgM、人类IgA、小鼠IgG1、小鼠IgG2A、小鼠IgG2B、小鼠IgG3、大鼠IgG1、大鼠IgG2C、山羊IgG1、山羊IgG2、牛IgG2、豚鼠IgG、兔IgG、包含Fc区的免疫球蛋白片段、包含免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白、和包含免疫球蛋白的Fc区的结合物组成的组。
在第四方面，本发明涉及亲和纯化免疫球蛋白的方法，包含以下步骤：(a)提供含有免疫球蛋白的液体；(b)提供亲和分离基质，其包含固定化的第一方面的非天然Ig-结合蛋白；(c)使所述液体与所述亲和分离基质接触，其中所述免疫球蛋白结合所述固定化的非天然Ig-结合蛋白；和(d)从所述基质洗脱所述免疫球蛋白，由此获得含有所述免疫球蛋白的洗出液；和(e)可选地进一步包含在步骤(c)和(d)之间进行的一个或多个洗涤步骤。亲和分离基质是根据上述实施方案所描述的并且是本领域技术人员已知的。
在第四方面的一些实施方案中，在步骤(d)中从基质中分离免疫球蛋白通过pH的变化或盐浓度的变化来实现。在第四方面的一些实施方案中，所述方法包含进一步的步骤(f)回收所述洗出液。
在第四方面的一个实施方案中，所述免疫球蛋白选自由人类IgG1、人类IgG2、人类IgG4、人类IgM、人类IgA、小鼠IgG1、小鼠IgG2A、小鼠IgG2B、小鼠IgG3、大鼠IgG1、大鼠IgG2C、山羊IgG1、山羊IgG2、牛IgG2、豚鼠IgG、兔IgG、包含Fc区的免疫球蛋白片段、包含免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白、和包含免疫球蛋白的Fc区的结合物组成的组。
在第五方面，本发明涉及产生包含根据本发明所述的至少一个Ig-结合结构域的非天然Ig-结合蛋白的方法，其中Ig-结合结构域的氨基酸序列是通过来自天然存在的蛋白A的至少两个天然存在的蛋白A结构域的氨基酸序列的改组方法获得的。更详细地，本文所理解的改组方法是从一组不相同的已知氨基酸序列起始产生新的人工氨基酸序列的组装方法，包含下列步骤：(a)提供要被改组的一组序列，例如五个天然存在的蛋白A结构域E、D、A、B和C以及蛋白A衍生物(例如Z结构域或与任何天然存在的结构域具有至少90％一致性的其它结构域)的序列；(b)比对所述序列；(c)在计算机中统计碎片；然后(d)从各种片段计算机组装新序列，以产生维持相对顺序的镶嵌产物(mosaic product)。步骤c)中产生的片段可以为任何长度，例如如果片段化的母体序列具有长度n，那么片段的长度可以为1至n-1。因此，重组装的蛋白质由一系列包含一个或多个氨基酸的亚序列的片段组成，使得这些子序列存在于来自步骤(b)中已比对的蛋白A的一个或多个单独的IgG结合结构域中的相应位置处。换言之，在组装的镶嵌序列的每个氨基酸位置，具有来自在相应位置包含相同氨基酸的蛋白A的对比IgG-结合结构域中的至少一个蛋白质。然而，重组装蛋白质的总体氨基酸序列是人工的，因为它与来自蛋白A的任何IgG-结合结构域的总体氨基酸序列不相同。新序列的每个位置处的氨基酸对应于任何比对序列的相同位置。相对于起始序列维持了镶嵌产物中氨基酸的相对位置。图1A中描绘了用于产生新型人工IgG结合蛋白的一般改组方法。
在生产了这种初始改组蛋白之后，如果需要，该蛋白质可以可选地通过氨基酸序列的位点特异性随机化而进一步修饰以进一步改变改组蛋白质的结合性质。举例来说，可以通过单个氨基酸残基的位点饱和诱变来引入进一步的修饰，以产生多个修饰的改组多肽。然后可以筛选这些IgG-结合蛋白以鉴定具有任何可能感兴趣的结合特性的那些修饰的改组多肽。
因此，本发明的IgG结合蛋白的产生涉及一个或两个基本步骤：第一步中，对比并且改组相关序列以产生改组多肽，并且如果需要，第二步进一步修改该改组蛋白的结合活性。
本发明的Ig结合蛋白包含一个或多个非天然Ig-结合结构域，其中每个非天然Ig结合结构域在与位置Q9、A12、F13、L17、Q26、R27、F30、I31、L34、P38、S41、L45、A48、L51、Q55相对应的位置具有与天然存在的蛋白A结构域A、B、C、D或E或结构域Z相同的氨基酸，更优选地，在对应于天然存在的Ig结合结构域的位置Q9、Q10、A12、F13、Y14、L17、P20、L22、Q26、R27、F30、I31、Q32、S33、L34、K35、D36、D37、P38、S39、S41、L45、E47、A48、K50、L51、Q55、P57处具有相同的氨基酸。
本发明的Ig结合蛋白与天然存在的蛋白A结构域A、B、C、D或E或结构域Z的序列一致性至多约85％(详见表1)。
在第六方面，本发明涉及一种核酸分子，优选分离的核酸分子，其编码第一方面的非天然Ig-结合蛋白。
本发明还涵盖由本发明第六方面的核酸分子编码的多肽。
在第七方面，本发明涉及一种载体，其包含第六方面的核酸分子。
载体是指可以用来将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
在第七方面的一个实施方案中，所述载体是表达载体。
在第八方面，本发明涉及一种宿主细胞(优选分离的宿主细胞)或非人类宿主，其包含第一方面的非天然Ig-结合蛋白、第六方面的核酸分子或第七方面的载体。
例如，可以在适合的宿主中表达编码本发明的Ig-结合蛋白的一个或多个核酸分子并且可以分离出所产生的结合蛋白。
宿主细胞是已使用核酸序列转化或能够使用核酸序列转化并由此表达感兴趣的基因的细胞。
合适的宿主细胞包括原核生物或真核生物。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可用于表达重组蛋白。根据本发明，宿主可以是用本发明的蛋白质转染的和/或表达本发明的蛋白质的转基因非人类动物。在优选的实施方案中，转基因动物是非人类哺乳动物。
在第九方面，本发明涉及一种用于生产第一方面的非天然Ig-结合蛋白的方法，包含以下步骤：(a)在适合于表达结合蛋白的条件下培养第七方面的宿主细胞，从而获得所述非天然的Ig-结合蛋白；和(b)可选地分离所述非天然的Ig-结合蛋白。
本发明还涵盖由第九方面的方法生产的非天然的Ig-结合蛋白。用于培养原核或真核宿主的合适条件是本领域技术人员所熟知的。本发明的Ig结合分子可以通过许多常规和公知技术中的任何一种制备，例如纯有机合成策略(plain organic syntheticstrategy)、固相辅助合成技术或通过市售的自动合成仪。另一方面，它们也可以通过常规重组技术单独或与常规合成技术组合来制备。根据本发明的结合物可以通过结合本领域技术人员已知的化合物获得，例如通过化学方法，例如基于赖氨酸或半胱氨酸的化学，或通过常规重组技术。本文所用的术语“结合物(conjugate)”涉及一种分子，其包含化学地附接到其它物质(诸如附接到第二蛋白或非蛋白质部分)的至少第一蛋白，或基本上由其组成。
本发明的一个实施方案涉及用于制备如上详述的根据本发明所述的Ig-结合蛋白的方法，所述方法包含下列步骤：(a)制备编码如上定义的结合蛋白的核酸；(b)将所述核酸导入到表达载体中；(c)将所述表达载体导入到宿主细胞中；(d)培养所述宿主细胞；(e)使所述宿主细胞经受培养条件，在这种条件下表达Ig-结合蛋白；由此(e)生产如上所述的结合蛋白；可选地(f)分离步骤(e)中生产的蛋白质；和(g)可选地将所述蛋白质结合到如上所述的固体基质上。
在本发明的进一步实施方案中，通过无细胞体外转录/翻译进行非天然的Ig结合蛋白的生产。
实施例
提供以下实施例用于进一步说明本发明。然而，本发明不限于此，并且以下实施例仅基于上述描述显示本发明的实用性。为了本发明的完整公开，还参考通过引用完全并入本申请的在本申请中引用的文献。
实施例1.通过改组方法产生本发明的IgG结合蛋白
首先，通过天然存在的蛋白A结构域和蛋白A衍生物(例如Z结构域或与任何天然存在的结构域具有至少90％一致性的其它结构域)的改组方法产生本发明的Ig结合蛋白。改组方法包含下列步骤：a)提供五个天然存在的蛋白A结构域E、B、D、A和C以及蛋白A衍生物结构域Z的序列；b)比对所述序列；c)在计算机中统计片段化，以识别可重组的子序列，前提条件是保持天然存在的Ig结合结构域的位置Q9、Q10、A12、F13、Y14、L17、P20、L22、Q26、R27、F30、I31、Q32、S33、L34、K35、D36、D37、P38、S39、S41、L45、E47、A48、K50、L51、Q55、P57，然后d)组装各种片段的新的人工序列，以生产镶嵌产物，即新的氨基酸序列。
相对于起始序列，保持了镶嵌产物中氨基酸的相对位置。在“改组的(shuffled)”序列与所有天然存在的蛋白A结构域之间，至少位置Q9、Q10、A12、F13、Y14、L17、P20、L22、Q26、R27、F30、I31、Q32、S33、L34、K35、D36、D37、P38、S39、S41、L45、E47、A48、K50、L51、Q55、P57是相同的。重组装的“改组的”蛋白的全体氨基酸序列是人工的，因为其与天然存在的蛋白A结构域或结构域Z的任一种的全体氨基酸序列的一致性不超过85％。例如，表1中示出了Ig结合蛋白相比于天然存在的蛋白A结构域或结构域Z的一致性。
表1.IgG结合蛋白与天然存在的蛋白A结构域的一致性
“E、D、A、B、C、Z”是指天然存在的蛋白A结构域和结构域Z(SEQ ID NO：3-8)。数字“9-30”是指本发明的Ig结合蛋白的例子。例如，数字“9-24”是指相应的SEQ ID NO：9-24，“25”是指SEQ ID NO：26，“26”是指SEQ ID NO：27，“27”是指SEQ ID NO：28且“28”是指SEQID NO：30。
E D A B C Z
9 69％ 64％ 66％ 72％ 81％ 74％
10 71％ 64％ 66％ 72％ 81％ 74％
11 69％ 64％ 66％ 72％ 81％ 74％
12 67％ 67％ 62％ 69％ 78％ 71％
13 67％ 67％ 62％ 69％ 78％ 71％
14 66％ 69％ 62％ 71％ 79％ 72％
15 62％ 69％ 67％ 76％ 84％ 76％
16 62％ 67％ 66％ 74％ 83％ 74％
17 62％ 67％ 67％ 76％ 79％ 76％
18 60％ 66％ 66％ 74％ 78％ 74％
19 60％ 66％ 66％ 74％ 78％ 74％
20 60％ 66％ 66％ 74％ 76％ 74％
21 59％ 64％ 64％ 72％ 74％ 72％
22 60％ 64％ 64％ 72％ 74％ 72％
23 64％ 67％ 60％ 69％ 74％ 71％
24 72％ 69％ 71％ 78％ 86％ 79％
25 69％ 71％ 67％ 76％ 84％ 78％
26 69％ 71％ 69％ 76％ 84％ 78％
27 76％ 74％ 67％ 72％ 79％ 74％
28 71％ 74％ 76％ 76％ 78％ 79％
合成用于“改组的”IgG结合蛋白和天然存在的蛋白A结构域及衍生物(例如结构域C、结构域B、结构域A、结构域D、结构域E、结构域Z)的基因并且使用本领域技术人员已知的标准方法克隆到大肠杆菌表达载体中。使用DNA测序来验证插入片段的正确序列。
为了产生包含多于一个结合结构域的Ig结合蛋白，通过氨基酸接头(SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42)基因融合2、4或6个相同的IgG结合结构域(SEQ ID NO：14)。SEQ ID NO：45-47中示出了融合蛋白的氨基酸序列。
为了特异性膜附着和纯化，向Ig结合蛋白的C-末端添加具有C-末端Cys(ASPAPSAPSAC；SEQ ID NO:39)的短肽接头和strep-标签(WSHPQFEK；SEQ ID NO:44)(例如参见SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51)。
实施例2.IgG结合蛋白的表达
用编码IgG结合蛋白的表达质粒转化HMS174(DE3)感受态细胞。将细胞散布到选择性琼脂平板(卡那霉素)上并且在37℃下温育过夜。将来自单个集落的预培养物接种到100ml过富(superrich)培养基中(修改的H15培养基，2％葡萄糖、5％酵母抽提物、1％酪蛋白氨基酸(Casamino acid)、0.76％甘油、1％Torula酿母RNA、250mM MOPS、202mM TRIS、10mg/L核糖核酸酶A,pH7.4,消泡剂SE15)，并且在不含乳糖和消泡剂的补充有150μg/ml卡那霉素的带挡板(baffled)的1L锥形烧瓶(Erlenmeyer flask)中，在37℃下，在常规轨道振动器中以160rpm培养16小时。OD600读数应在6-12的范围内。在1L厚壁锥形烧瓶(补充有甘油、葡萄糖、乳糖、消泡剂和150μg/ml卡那霉素)中，将来自调整起始-OD600为0.5的先前过夜培养物的主培养物接种到400ml过富培养基中。将培养物转移到共振声学混合器(RAMbio)并且在37℃下以20x g培育。通过Oxy-Pump塞子(stopper)促进通气。通过代谢葡萄糖随后允许乳糖进入细胞诱导重组蛋白表达。在预定的时间点测量OD600，抽出调节至5/OD600的样品，丸粒化并且在-20℃下冷冻。将细胞生长过夜约24小时以达到约45-60的最终OD600。为了收集生物质，在16000x g在20℃下将细胞离心10分钟。称量丸粒(湿重)并且测量上清液的pH。在加工之前将细胞存储在-20℃下。
实施例3：IgG结合蛋白的表达和溶解度的SDS-PAGE分析
将发酵过程中取出的样品重新悬浮于300μl提取缓冲液中(补充有0.2mg/ml溶菌酶、0.5x BugBuster、7.5mM MgSO4、40U苯甲酸酶的PBS)并且在室温热混合器中在700rpm转速搅拌15分钟以溶解。通过离心将可溶性蛋白质与不溶性蛋白质分离(16000x g,2min,rt)。取出上清液(可溶性级分)并且将丸粒(不溶性级分)再悬浮于等量(equivalentamont)的尿素缓冲液(8M尿素、0.2M Tris、2mM EDTA,pH 8.5)中。从可溶性和不溶性级分中取出50μl并且添加12μl 5x样品缓冲液以及5μl 0.5M DTT。
在95℃下将样品煮沸5分钟。最后，将8μl的这些样品施加到NuPageNovex 4-12％Bis-Tris SDS凝胶上，其根据制造商的建议运行并用考马斯染色。在所选择的时间段内在优化条件下发现所有IgG结合蛋白的高水平表达(图3)。根据SDS-PAGE，所有表达的Ig结合蛋白是可溶的，超过95％。
实施例4：IgG结合蛋白的纯化
所有的IgG结合蛋白在大肠杆菌的可溶性级分中表达(具有C-末端StrepTagII)(WSHPQFEK；SEQ ID NO:44)。通过超声处理裂解细胞，并且根据制造商的说明书，用Strep-Tactin-柱进行第一纯化步骤。为了避免二硫化物形成，缓冲液中补充有1mM DTT。将洗脱级分注射到用20mM柠檬酸盐pH 6.0和150mM NaCl平衡的HiLoad 16/600Superdex 75pg(GEHealthcare)中。集中峰级分并且通过SDS-PAGE分析。
实施例5.IgG结合蛋白以高亲和力结合IgG(通过ELISA确定)
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)确定IgG结合蛋白对IgG1或lgG2或lgG4的亲和力。将含有IgG1或lgG2或lgG4的抗体(例如西妥昔单抗用于IgG1、帕尼单抗用于lgG2或那他珠单抗用于lgG4)固定化在96孔Nunc MaxiSorb ELISA板上(2μg/ml)。在4℃下温育16小时后，使用PBST(PBS+0.1％吐温20)将孔洗涤三次，并且使用3％处于PBS中的BSA封闭孔(在室温下2小时)。阴性对照是仅用BSA封闭的孔。封闭之后，使用PBST将孔洗涤三次并且在室温下用IgG结合蛋白(在PBST中)培育1小时。培育之后，使用PBST将孔洗涤三次，随后在室温下使用来自IBA的Strep-Tactin-HRP(1:10000)培育1小时。然后，将孔用PBST洗涤三次，用PBS洗涤三次。通过加入TMB-Plus底物可视化辣根过氧化物酶的活性。30分钟后，通过加入0.2MH2SO4终止反应并且在450nm下测量吸光度。表2示出了结果。
表2：IgG结合蛋白的结合分析(与西妥昔单抗的结合分析；CID＝克隆识别号码)
实施例6.IgG结合蛋白以高亲和力结合IgG(用表面等离子体共振实验确定的)
用SPR运行缓冲液平衡CM5传感器芯片(GE Healthcare)。经由通过EDC和NHS的混合物来活化表面暴露的羧基以产生反应性酯基团。将700-1500 RU中靶配体(on-ligand)固定化在流动池上，脱靶配体(off-lignd)固定化在另一流动池上。在配体固定后，注射乙醇胺除去非共价结合的Ig结合蛋白。在配体结合后，蛋白质分析物在表面上积累，增加了折射率。实时地测量折射率的这种变化并且绘制响应或谐振单位(RU)-时间曲线。将分析物以适当的流速(μl/min)以连续稀释液施加到芯片上。在每次运行之后，用再生缓冲液再生芯片表面，并用运行缓冲液平衡。将对照样品施加到基质上。
如前所述进行再生和再平衡。使用3000(GE Healthcare)进行结合研究；通过由制造商提供的BIAevaluation 3.0软件通过使用朗缪尔1:1模型(RI＝0)进行数据评估。相对于脱靶(off-target)将评估的解离常数(KD)进行标准化。结果示于表3中。
表3：IgG结合蛋白的结合分析(使用hlgG1-Fc的结合分析；CID＝克隆识别号码)
IgG结合蛋白 CID KD IgG1-Fc(nM)
结构域Z(SEQ ID NO:8) 148478 2.35
SEQ ID NO:13 148462 1.2
SEQ ID NO:14 148463 1.3
SEQ ID NO:24 154253 1.4
SEQ ID NO:26 154254 4.6
SEQ ID NO:27 154255 5.3
SEQ ID NO:28 154256 3
SEQ ID NO:30 154257 7.6
SEQ ID NO:45(二聚体) 150570 0.38
SEQ ID NO:46(四聚体) 150663 0.09
SEQ ID NO:47(六聚体) 150772 0.16
实施例7：IgG结合蛋白与SulfoLink偶联树脂结合以及固化定的IgG结合蛋白的碱性稳定性
根据制造商的说明书将IgG结合蛋白偶联到偶联树脂(Thermo；Cat.No.20402)。柱的树脂床体积为300μl。用四个树脂床体积的偶联缓冲液(50mM Tris,5mM EDTA-Na,pH 8.5)平衡柱体。将IgG结合蛋白加入到柱中((1-2ml/ml SulfoLink偶联树脂)。IgG结合蛋白通过C-末端的半胱氨酸偶联到基质上(ASPAPSAPSAC；SEQ ID NO:39)。将柱混合15分钟，在不混合的条件下再温育30分钟，并用偶联缓冲液洗涤。系统流速为0.5ml/min。将300μl 50mM半胱氨酸溶液加入柱中，混合15分钟，在不混合的条件下再温育30分钟，并且1M NaCl洗涤，随后用PBS洗涤。
在280nm下测量全部级分的吸光度。所有的IgG结合蛋白均可以共价地偶联到基质；图6示例性地示出了IgG结合蛋白148470(图6A)和148460(图6B)与SulfoLink偶联树脂基质的结合。
以饱和量(5mg；1mg/ml树脂)向具有共价偶联的IgG结合蛋白的Sulfolink树脂柱中加入西妥昔单抗。使用100mM甘氨酸缓冲液,pH 2.5洗涤基质，以洗脱结合到固定化IgG结合蛋白上的西妥昔单抗。光谱测量洗脱的IgG的浓度以确定Ig结合蛋白的结合活性(静态结合能力)。在280nm的吸光度下分析洗脱级分。在室温下用0.5M NaOH温育20、40或80分钟之前和之后，分析固定化蛋白质的IgG结合活性。将NaOH处理之前的固定化蛋白质的IgG结合活性定义为100％。将蛋白质的IgG结合活性与天然存在的结构域C、B、A、D、E或结构域Z的活性进行比较。
图8示出了IgG结合蛋白148462(在图中称为“13”)、148463(在图中称为“14”)、148472(在图中称为“23”)以及天然存在的蛋白A结构域E、D、A、B、C和结构域Z的IgG结合活性。示出了在用0.5M NaOH温育80分钟之后的IgG结合活性。在碱性处理后，本发明的IgG结合蛋白显示出了对西妥昔单抗的高结合活性。
实施例8.偶联到环氧活化基质的IgG结合蛋白的苛性稳定性
根据制造商的说明，将纯化的IgG结合蛋白偶联到环氧活化的基质(Sepharose6B,GE；Cat.No.17-0480-01)(偶联条件：pH 9.0过夜，用乙醇胺封闭5小时)。将西妥昔单抗用作IgG样品(5mg；1mg/ml基质)。将西妥昔单抗以饱和量施用于包含固定化IgG结合蛋白的基质。使用100mM甘氨酸缓冲液,pH 2.5洗涤基质以洗脱结合到固定化IgG-结合蛋白的西妥昔单抗。在280nm下光谱测量洗脱的IgG的浓度，从而确定Ig结合蛋白的结合活性(静态结合能力)。在室温(22℃+/-3℃)用0.5M NaOH将柱温育6小时。在使用0.5M NaOH温育6h之前和之后，分析固定化蛋白质的IgG结合活性。将NaOH处理前的固定化蛋白的IgG结合活性定义为100％。图9显示，例如IgG结合蛋白154254(在图中称为“SEQ ID 26”)、154255(在图中称为“SEQ ID 27”)、154256(在图中称为“SEQ ID 28”)和154257(在图中称为“SEQ ID 30”)的活性高于IgG结合蛋白148463(“SEQ ID 14”)的活性，并因此高于任何天然存在的蛋白A结构域的活性。在使用0.5M NaOH温育6小时后，所有固定化的IgG结合蛋白显示出其原始IgG结合活性的至少35％至最高达50％。图10显示，在碱性处理0、2、4、6小时之后，由2、4或6个固定化至环氧活化树脂的IgG结合结构域组成的多聚IgG结合蛋白的Ig结合活性(能力)，可以与由一个IgG结合结构域组成的单体IgG结合蛋白的结合活性(能力)相当。
序列表自由文本信息(sequence listing free text information)
SEQ ID NO:1 非天然Ig-结合结构域的通用序列
SEQ ID NO:2 非天然Ig-结合结构域的通用序列
SEQ ID NO:3 金黄色葡萄球菌结构域E(CID 148473)
SEQ ID NO:4 金黄色葡萄球菌结构域D(CID 148474)
SEQ ID NO:5 金黄色葡萄球菌结构域A(CID 148475)
SEQ ID NO:6 金黄色葡萄球菌结构域B(CID 148476)
SEQ ID NO:7 金黄色葡萄球菌结构域C(CID 148477)
SEQ ID NO:8 蛋白A的结构域Z(CID 148478)
SEQ ID NO:9 改组序列IB9,CID 148458
SEQ ID NO:10 改组序列IB10,CID 148459
SEQ ID NO:11 改组序列IB11,CID 148460
SEQ ID NO:12 改组序列IB12,CID 148461
SEQ ID NO:13 改组序列IB13,CID 148462
SEQ ID NO:14 改组序列IB14,CID 148463
SEQ ID NO:15 改组序列IB15,CID 148464
SEQ ID NO:16 改组序列IB16,CID 148465
SEQ ID NO:17 改组序列IB17,CID 148466
SEQ ID NO:18 改组序列IB18,CID 148467
SEQ ID NO:19 改组序列IB19,CID 148468
SEQ ID NO:20 改组序列IB20,CID 148469
SEQ ID NO:21 改组序列IB21,CID 148470
SEQ ID NO:22 改组序列IB22,CID 148471
SEQ ID NO:23 改组序列IB23,CID 148472
SEQ ID NO:24 改组序列IB24,CID 154253
SEQ ID NO:25 改组序列IB15b
SEQ ID NO:26 改组序列IB25,CID 154254
SEQ ID NO:27 改组序列IB26,CID 154255
SEQ ID NO:28 改组序列IB27,CID 154256
SEQ ID NO:29 改组序列IB29
SEQ ID NO:30 改组序列IB28,CID 154257
SEQ ID NO:31 接头
SEQ ID NO:32 接头
SEQ ID NO:33 接头
SEQ ID NO:34 接头
SEQ ID NO:35 接头
SEQ ID NO:36 接头
SEQ ID NO:37 接头
SEQ ID NO:38 非天然的Ig结合结构域的通用序列(例如用于IB9-IB28)
SEQ ID NO:39 c-末端偶联序列(APS10/C)
SEQ ID NO:40 c-末端偶联序列(APS30/C)
SEQ ID NO:41 APS30接头
SEQ ID NO:42 APS30接头
SEQ ID NO:43 APS10接头
SEQ ID NO:44 Strep标签
SEQ ID NO:45 IB14二聚体,CID 150570
SEQ ID NO:46 IB14四聚体,CID 150663
SEQ ID NO:47 IB14六聚体,CID 150772
SEQ ID NO:48 用于例如IB24-IB28的通用序列
SEQ ID NO:49 用于例如IB9-IB23的通用序列
SEQ ID NO:50 具有c-末端偶联序列和strep-标签的SEQ ID NO:14
SEQ ID NO:51 具有c-末端偶联序列和strep-标签的SEQ ID NO:28。
序列表
<110> 希尔蛋白质有限公司(Scil Proteins GmbH)
<120> 新型免疫球蛋白结合蛋白（Novel Immunoglobulin-Binding Proteins）
<130> SP29 WO
<150> EP15177056.7
<151> 2015-07-16
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 非天然Ig-结合结构域的通用序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> 可以被P, V, Q, 或 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> 可以被 A 或 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> 可以被 N 或 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> 可以被 Q 或 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> 可以被 F替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> 可以被N, S, 或A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> 可以被 K替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> 可以被 A 或 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> 可以被 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> 可以被 D 或 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> 可以被 I替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (18)..(18)
<223> 可以被 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (19)..(19)
<223> 可以被 M替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (21)..(21)
<223> 可以被S 或D替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (23)..(23)
<223> 可以被 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (24)..(24)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (25)..(25)
<223> 可以被 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> 可以被S 或 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (29)..(29)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (40)..(40)
<223> 可以被 Q 或T替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> 可以被 T 或 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (43)..(43)
<223> 可以被 N 或S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> 可以被L 或I替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (46)..(46)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (49)..(49)
<223> 可以被 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (52)..(52)
<223> 可以被D 或S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (53)..(53)
<223> 可以被 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (54)..(54)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (56)..(56)
<223> 可以被 P替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (58)..(58)
<223> 可以被 P替代
<400> 1
Ala Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Val
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 非天然Ig-结合结构域的通用序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> 可以被V, Q, N, 或 P替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> 可以被 A 或 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> 可以被N 或 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> 可以被 Q 或 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> 可以被 F替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> 可以被N 或 A 或 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> 可以被 K替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> 可以被 E 或 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> 可以被 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> 可以被 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> 可以被 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> 可以被 I替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (18)..(18)
<223> 可以被 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (19)..(19)
<223> 可以被 M替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (21)..(21)
<223> 可以被 S 或 D替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (23)..(23)
<223> 可以被 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (24)..(24)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (25)..(25)
<223> 可以被 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> 可以被 S 或 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (29)..(29)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (40)..(40)
<223> 可以被 Q 或 T替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> 可以被 T 或 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (43)..(43)
<223> 可以被 N 或 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> 可以被 L 或 I替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (46)..(46)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (49)..(49)
<223> 可以被 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (52)..(52)
<223> 可以被 D 或 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (53)..(53)
<223> 可以被 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (54)..(54)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (56)..(56)
<223> 可以被 P替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (58)..(58)
<223> 可以被 P替代
<400> 2
Ala Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Val
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 3
<211> 65
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌结构域E (CID 148473)（Staphylococcus aureus domain E(CID 148473)）
<400> 3
Thr Pro Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala
1 5 10 15
Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn
20 25 30
Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val
35 40 45
Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp
50 55 60
Ala
65
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌D (CID 148474)（Staphylococcus aureus D (CID 148474)）
<400> 4
Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌 A (CID 148475)（Staphylococcus aureus A (CID 148475)）
<400> 5
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 6
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌B (CID 148476)（Staphylococcus aureus B (CID 148476)）
<400> 6
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 7
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌 C (CID 148477)（Staphylococcus aureus C (CID 148477)）
<400> 7
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 8
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 蛋白A的结构域Z (CID 148478)（domain Z of protein A (CID 148478)）
<400> 8
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 9
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB9, CID 148458（shuffle sequence IB9, CID 148458）
<400> 9
Asn Ala Ala Gln His Ala Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 10
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB10, CID 148459（shuffle sequence IB10, CID 148459）
<400> 10
Asn Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 11
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB11, CID 148460（shuffle sequence IB11, CID 148460）
<400> 11
Asn Ala Ala Gln His Ser Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB12, CID 148461（shuffle sequence IB12, CID 148461）
<400> 12
Asn Ala Ala Gln His Ser Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 13
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB13, CID 148462（shuffle sequence IB13, CID 148462）
<400> 13
Pro Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 14
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB14, CID 148463（shuffle sequence IB14, CID 148463）
<400> 14
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 15
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB15, CID 148464（shuffle sequence IB15, CID 148464）
<400> 15
Ala Asp Asn Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 16
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列 IB16, CID 148465（shuffle sequence IB16, CID 148465）
<400> 16
Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 17
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB17, CID 148466（shuffle sequence IB17, CID 148466）
<400> 17
Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 18
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB18, CID 148467（shuffle sequence IB18, CID 148467）
<400> 18
Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asp Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 19
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB19, CID 148468（shuffle sequence IB19, CID 148468）
<400> 19
Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 20
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列 IB20, CID 148469（shuffle sequence IB20, CID 148469）
<400> 20
Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Thr Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 21
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB21, CID 148470（shuffle sequence IB21, CID 148470）
<400> 21
Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Thr Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asp Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 22
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB22, CID 148471（shuffle sequence IB22, CID 148471）
<400> 22
Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Thr Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Ser Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 23
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB23, CID 148472（shuffle sequence IB23, CID 148472）
<400> 23
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Thr Ser Lys Ser Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 24
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB24 (CID 154253)（shuffle sequence IB24 (CID 154253)）
<400> 24
Asn Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 25
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列 IB15b（shuffle sequence IB15b）
<400> 25
Ala Asp Asn Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 26
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB25 (CID 154254)（shuffle sequence IB25 (CID 154254)）
<400> 26
Asn Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 27
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB26 (CID 154255)（shuffle sequence IB26 (CID 154255)）
<400> 27
Asn Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 28
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB27 (CID 154256)（shuffle sequence IB27 (CID 154256)）
<400> 28
Asn Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 29
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB29（shuffle sequence IB29）
<400> 29
Gln Gln Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Gln Val
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Ala Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 30
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 改组序列IB28 (CID 154257)（shuffle sequence IB28 (CID 154257)）
<400> 30
Val Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 接头
<400> 31
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 接头
<400> 32
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 接头
<400> 33
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 接头
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 接头
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 接头
<400> 36
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 接头
<400> 37
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 38
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 非天然Ig-结合结构域的通用序列 (例如，对于
IB9-IB28)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> 可以被 N, P, 或 V替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> 可以被 N 或 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> 可以被 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> 可以被 F替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> 可以被 S 或 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> 可以被 K替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> 可以被 A 或 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> 可以被 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (21)..(21)
<223> 可以被 S 或 D替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (25)..(25)
<223> 可以被 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> 可以被 A 或 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (40)..(40)
<223> 可以被 T 或 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (43)..(43)
<223> 可以被 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> 可以被 I 或 V替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (46)..(46)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (49)..(49)
<223> 可以被 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (52)..(52)
<223> 可以被 S 或 D替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (53)..(53)
<223> 可以被 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (54)..(54)
<223> 可以被 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (58)..(58)
<223> 可以被 P替代
<400> 38
Ala Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> C-末端偶联序列(APS10/C)（C-terminal coupling sequence (APS10/C)）
<400> 39
Ala Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ser Ala Cys
1 5 10
<210> 40
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> C-末端偶联序列(APS30/C)（coupling sequence c-terminal (APS30/C)）
<400> 40
Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Cys
<210> 41
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> APS30 接头
<400> 41
Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser
20 25 30
<210> 42
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> APS30 接头
<400> 42
Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala
20 25 30
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> APS10 接头
<400> 43
Ala Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ser Ala
1 5 10
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> Strep标签（Streptag）
<400> 44
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 45
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> IB14 二聚体 (CID150570)（IB14 dimer (CID150570)）
<400> 45
Met Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile
20 25 30
Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu
35 40 45
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys
85 90 95
Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
100 105 110
Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
115 120 125
Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
130 135 140
Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser
145 150 155 160
Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Cys Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
180 185
<210> 46
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> IB14 四聚体 (CID150663)（IB14 tetramer (CID150663)）
<400> 46
Met Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile
20 25 30
Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu
35 40 45
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys
85 90 95
Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
100 105 110
Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
115 120 125
Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
130 135 140
Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser
145 150 155 160
Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
165 170 175
Ala Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu
180 185 190
Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile
195 200 205
Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu
210 215 220
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
245 250 255
Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys
260 265 270
Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
275 280 285
Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
290 295 300
Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
305 310 315 320
Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser
325 330 335
Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
340 345 350
Ala Ala Ala Cys Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
355 360 365
<210> 47
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> IB14 六聚体 (CID 150772)（IB14 hexamer (CID 150772)）
<400> 47
Met Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile
20 25 30
Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu
35 40 45
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys
85 90 95
Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
100 105 110
Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
115 120 125
Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
130 135 140
Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser
145 150 155 160
Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
165 170 175
Ala Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu
180 185 190
Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile
195 200 205
Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu
210 215 220
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
245 250 255
Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys
260 265 270
Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
275 280 285
Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
290 295 300
Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
305 310 315 320
Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser
325 330 335
Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
340 345 350
Ala Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu
355 360 365
Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile
370 375 380
Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu
385 390 395 400
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala
405 410 415
Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
420 425 430
Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys
435 440 445
Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
450 455 460
Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
465 470 475 480
Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
485 490 495
Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser
500 505 510
Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
515 520 525
Ala Ala Ala Cys Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
530 535 540
<210> 48
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 用于例如IB24-IB28的通用序列（Generic sequence for e.g. IB24-IB28）
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> 可以被 V替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> 可以被 D替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> 可以被 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> 可以被 F替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> 可以被 K替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> 可以被 D 或 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> 可以被 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (25)..(25)
<223> 可以被 D替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (40)..(40)
<223> 可以被 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (43)..(43)
<223> 可以被 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> 可以被 I替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (46)..(46)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (49)..(49)
<223> 可以被 K替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (53)..(53)
<223> 可以被 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (54)..(54)
<223> 可以被 A替代
<400> 48
Asn Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 49
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> VARIANT
<223> 用于例如IB9-IB23的通用序列（Generic sequence for e.g. IB9-IB23）
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> 可以被 N 或 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> 可以被 D替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> 可以被 N 或 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> 可以被 Q替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> 可以被 H替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> 可以被 S 或 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> 可以被 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> 可以被 A 或 E替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> 可以被 N替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (21)..(21)
<223> 可以被 S 或 D替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> 可以被 A替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (40)..(40)
<223> 可以被 T替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (43)..(43)
<223> 可以被 S替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> 可以被 L替代
<220>
<221> VARIANT
<222> (52)..(52)
<223> 可以被 D 或 S替代
<400> 49
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55

Claims (15)

1.一种非天然免疫球蛋白(Ig)结合蛋白，包含一个或多个非天然Ig结合结构域，其中至少一个非天然Ig结合结构域包含氨基酸序列
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYX15X16LX18X19PX21LX23X24X25QRX28X29FIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QX56PX58(SED ID NO：1)，
其中
X1是A、V、Q、N或P；
X2是D、A或Q；
X3是A、S或N；
X4是K、Q或N；
X5是H或F；
X6是D、N、S或A；
X7是E或K；
X8是D、E或A；
X11是S或N；
X15是E、D或Q；
X16是V或I；
X18是H或N；
X19是L或M；
X21是N、S或D；
X23是T或N；
X24是E或A；
X25是D或E；
X28是N、S或A；
X29是G或A；
X40是V或Q或T；
X42是K、T或A；
X43是E、N或S；
X44是V、L或I；
X46是G或A；
X49是K或Q；
X52是N、S或D；
X53是D或E；
X54是S或A；
X56是A或P；并且
X58是K或P；并且其中，所述非天然Ig结合蛋白与人类IgG1的解离常数KD为1μM或更小，优选100nM或更小。
2.根据权利要求1所述的非天然Ig结合蛋白，其中至少一个非天然Ig结合结构域包含氨基酸序列
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYEILHLPX21LTEX25QRX28AFIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X5 3X54QAPX58(SED ID NO：38)，
其中
X1是N、V、P或A；
X2是D或A；
X3是A、S或N；
X4是K或Q；
X5是H或F；
X6是D、S或A；
X7是E或K；
X8是D、E或A；
X11是S或N；
X21是N、S或D；
X25是D或E；
X28是N、S或A；
X40是V、T或Q；
X42是K或A；
X43是E或S；
X44是V、L或I；
X46是G或A；
X49是K或Q；
X52是N、S或D；
X53是D或E；
X54是S或A；且
X58是K或P。
3.根据权利要求1或2所述的非天然Ig结合蛋白，其中至少一个非天然Ig结合结构域包含选自由以下序列组成的组中的氨基酸序列：
NAAQHAKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID No：9)，
NAAQHDKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：10)，
NAAQHSKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：11)，
NAAQHSKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：12)，
PAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：13)，
PAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：14)，
ADNKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：15)，
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：16)，
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：17)，
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPDLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：18)，
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：19)，
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：20)，
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLDDAQAPP(SEQ ID NO：21)，
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLSDAQAPP(SEQ ID NO：22)，
PAAKHDKDQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：23)，
NAAQHDKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO：24)，
ADNKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO：25)，
NAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO：26)，
NAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO：27)，
NAAKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEVLGEAQKLNDSQAPK(SEQ ID NO：28)，
QQAQHDEAQQSAFYQVLHLPNLTADQRNAFIQSLKDDPSQSAEVLGEAQKLNDSQAPK(SEQ ID NO：29)，和
VDAQHDEDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSAEILAEAKKLNESQAPK(SEQ ID NO：30)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的非天然Ig结合蛋白，其中所述非天然Ig结合蛋白在碱性条件下是稳定的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的非天然Ig结合蛋白，其中2、3、4、5、6、7或8个非天然Ig结合结构域彼此连接。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的非天然Ig结合蛋白，其中所述非天然Ig结合蛋白包含用于位点特异性共价附着至固相的特异性附着位点。
7.一种包含权利要求1至6中任一项中限定的非天然免疫球蛋白(Ig)结合蛋白的组合物，优选地其中所述组合物是亲和分离基质。
8.权利要求1至6中任一项所述的非天然Ig结合蛋白或权利要求7所述的组合物用于亲和纯化免疫球蛋白的用途。
9.一种亲和纯化免疫球蛋白的方法，包含以下步骤：
a.提供含有免疫球蛋白的液体；
b.提供包含固定化的权利要求1至6中任一项所述的非天然Ig结合蛋白的亲和分离基质；
c.使所述液体与所述亲和分离基质接触，其中所述免疫球蛋白结合固定化的所述蛋白；和
d.从所述基质洗脱所述免疫球蛋白，优选通过改变pH或改变盐浓度，由此获得含有所述免疫球蛋白的洗出液；和
e.可选地进一步包含在步骤(c)和(d)之间进行的一个或多个洗涤步骤。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫球蛋白选自由以下各项组成的组：人类IgG1、人类IgG2、人类IgG4、人类IgM、人类IgA、小鼠IgG1、小鼠IgG2A、小鼠IgG2B、小鼠IgG3、大鼠IgG1、大鼠IgG2C、山羊IgG1、山羊IgG2、牛IgG2、豚鼠IgG、兔IgG、包含Fc区的免疫球蛋白片段、包含免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白和包含免疫球蛋白的Fc区的结合物。
11.一种产生权利要求1至6中任一项所述的非天然免疫球蛋白(Ig)结合蛋白的方法，其中至少一个Ig结合结构域通过来自天然存在的Ig结合蛋白的至少两个天然存在的Ig结合结构域的改组方法可获得。
12.一种编码权利要求1至6中任一项限定的非天然免疫球蛋白(Ig)结合蛋白的核酸分子。
13.一种包含权利要求12所述的核酸分子的载体。
14.一种宿主细胞或非人类宿主，包含权利要求1至6中任一项限定的非天然免疫球蛋白(Ig)结合蛋白、权利要求12中限定的核酸分子或权利要求13所述的载体。
15.一种用于生产权利要求1至6中任一项所述的非天然免疫球蛋白(Ig)结合蛋白的方法，包含以下步骤：
a.在适合于表达所述结合蛋白的条件下培养权利要求14所述的宿主细胞，以便获得所述非天然免疫球蛋白(Ig)结合蛋白；和
b.可选地分离所述非天然免疫球蛋白(Ig)结合蛋白。
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