ES2916101T3 - Nuevas proteínas de unión a inmunoglobulina y su uso en la purificación por afinidad - Google Patents

Abstract

Una proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural que comprende uno o más dominios de unión a Ig no naturales, donde al menos un dominio de unión a Ig no natural comprende la secuencia de aminoácidos X1X2X3X4X5XeX7X8QQX11AFYEILHLPX21LTEX25QRX28AFIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46 EAX49KLX52X53X54QAPX58 (SEQ ID NO: 38), donde X1 es N, V, P o A; X2 es D o A; X3 es A, S o N; X4 es K o Q; X5 es H o F; X6 es D, S o A; X7 es E o K; X8 es D, E o A; X11 es S o N; X21 es N, S o D; X25 es D o E; X28 es N, S o A; X40 es V, T o Q; X42 es K o A; X43 es E o S; X44 es V, L o I; X46 es G o A; X49 es K o Q; X52 es N, S o D; X53 es D o E; X54 es S o A; y X58 es K o P; donde la constante de disociación KD de dicha proteína de unión a Ig no natural a IgG1 humana es 1 mM o menos, preferiblemente 100 nM o menos, y donde dicha proteína de unión a Ig no natural es estable en condiciones alcalinas.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas proteínas de unión a inmunoglobulina y su uso en la purificación por afinidad

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de unión no naturales que comprenden uno o más dominios de unión a inmunoglobulinas (Ig) no naturales. La invención se refiere además a composiciones tales como matrices de afinidad que comprenden las proteínas de unión a Ig no naturales de la invención. La invención también se refiere al uso de estas proteínas o composiciones de unión a Ig para la purificación por afinidad de inmunoglobulinas y a métodos de purificación por afinidad que utilizan las proteínas de unión a Ig de la invención.

Antecedentes de la invención

Muchas aplicaciones biotecnológicas y farmacéuticas requieren la eliminación de contaminantes de una muestra que contiene anticuerpos. Un procedimiento establecido para capturar y purificar anticuerpos es la cromatografía de afinidad utilizando la proteína A de la superficie celular bacteriana de Staphylococcus aureus como ligando selectivo para inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, la revisión de Huse et al., J. Biochem. Biografía. Métodos 51, 2002: 217-231). La Proteína A de tipo silvestre se une a la región Fc de las moléculas de IgG con alta afinidad y selectividad y es estable a altas temperaturas y en un amplio rango de valores de pH. Las variantes de la proteína A con propiedades mejoradas, tales como la estabilidad alcalina, están disponibles para purificar anticuerpos y varias matrices cromatográficas que comprenden ligandos de proteína A están disponibles comercialmente. Sin embargo, en particular, las matrices de cromatografía basadas en la proteína A de tipo silvestre muestran una pérdida de la capacidad de unión de las inmunoglobulinas después de la exposición a condiciones alcalinas. AU 2013 318928 se refiere a ligandos de proteína derivados de cualquiera de los dominios de proteína A de Staphylococcus aureus y la inmovilización de los dominios para abordar la capacidad de unión y la eficacia de unión a una molécula diana de matrices de separación por afinidad.

Problemas técnicos que subyacen a la presente invención

La mayoría de los procesos de producción a gran escala de anticuerpos o proteínas de fusión que contienen Fc utilizan la Proteína A para la purificación por afinidad.

Sin embargo, debido a las limitaciones de las aplicaciones de la Proteína A en la cromatografía de afinidad, existe la necesidad en la técnica anterior para proporcionar nuevas proteínas de unión a Ig con propiedades mejoradas que se unan específicamente a las inmunoglobulinas para facilitar la purificación por afinidad de las inmunoglobulinas. Por lo tanto, la especificidad de las proteínas de unión a Ig para inmunoglobulina con afinidades de 1 |iM, incluso de 100 nM o menos, es una característica funcional importante para una proteína de unión a Ig para la purificación eficiente de inmunoglobulinas.

Además, para aprovechar al máximo el valor de las matrices cromatográficas que comprenden proteínas de unión a Ig, es deseable utilizar las matrices de ligandos de afinidad varias veces. Entre los ciclos de cromatografía, se requiere un procedimiento de limpieza a fondo para la desinfección y eliminación de contaminantes residuales en la matriz. En este procedimiento, es práctica general aplicar soluciones alcalinas con altas concentraciones de NaOH a las matrices de ligando de afinidad. La Proteína A de tipo silvestre o los dominios de Proteína A de origen natural no resisten condiciones alcalinas tan duras durante un tiempo prolongado y pierden rápidamente la capacidad de unión a la inmunoglobulina. En consecuencia, existe la necesidad en este campo de obtener nuevas proteínas alcalinoestables capaces de unirse a las inmunoglobulinas.

La presente invención proporciona proteínas de unión a inmunoglobulinas artificiales que son particularmente adecuadas para la purificación por afinidad de inmunoglobulinas pero que superan las desventajas de la técnica anterior. En particular, una ventaja significativa de las proteínas de unión a Ig no naturales de la invención es su mayor estabilidad a pH alto en comparación con los dominios de Proteína A de origen natural.

La visión general anterior no describe necesariamente todos los problemas resueltos por la presente invención.

Breve descripción de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

Además, se describe aquí:

Un primer aspecto que se relaciona con una proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural que comprende uno o más dominios de unión a Ig no naturales, donde al menos un dominio de unión a Ig no natural comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

Según el primer aspecto, al menos un dominio de unión a Ig no natural comprende la secuencia de aminoácidos X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸QQX¹¹AFYX¹⁵X¹⁶LX¹⁸X¹⁹PX²¹LX²³X²⁴X²⁵QRX²⁸X²⁹FIQSLKDDPSX⁴⁰SX⁴²X⁴³X⁴⁴LX⁴⁶EAX⁴⁹KLX⁵²X⁵³X⁵⁴ QX⁵⁶PX⁵⁸ (SEQ ID NO: 1), donde

Xi es A, V, Q, N o P; preferiblemente N, V, P o A;

X² es D, A o Q; preferiblemente D o A;

X³ es A, S o N;

X⁴ es K, Q o N; preferiblemente K o Q;

X⁵ es H o F;

X6 es D, N, S o A; preferiblemente D, S o A,

X⁷ es E o K;

X8 es D, E o A;

X¹¹ es S o N;

X₁₅ es E, D o Q; preferiblemente E;

X₁₆ es V o I; preferiblemente I;

X₁₈ es H o N; preferiblemente H;

X₁₉ es L o M; preferiblemente L;

X₂₁ es N S o D;

X23 es T o N; preferiblemente T;

X₂₄ es E o A; preferiblemente E;

X25 es D o E;

X28 es N S o A;

X29 es G o A; preferiblemente A;

X₄₀ es V o Q o T;

X₄₂ es K, T o A; preferiblemente K o A;

es E, N o S; preferiblemente E o S;

X₄₄ es V, L o I;

es G o A;

X₄₉ es K o Q;

X52 es N S o D;

X53 es D o E;

es S o A;

X₅₆ es A o P; preferiblemente A; _y

es K o P;

y donde la constante de disociación K^d de dicha proteína de unión a Ig no natural a IgG1 humana es 1 |iM o menos, preferiblemente menos de 500 nM, más preferiblemente menos de 100 nM. En una primera realización, la invención se refiere a una proteína de unión que comprende uno o más dominios de unión a Ig no naturales, donde al menos un dominio de unión a Ig no naturales comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1 con la capacidad de unirse a la inmunoglobulina incluso después del tratamiento alcalino.

Un segundo aspecto, que se refiere a una composición que comprende la proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto, preferiblemente donde la composición es una matriz de separación por afinidad.

Un tercer aspecto, que se refiere a un uso de la proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto o de la composición del segundo aspecto para la purificación por afinidad de inmunoglobulinas.

Un cuarto aspecto, que se refiere a un método de purificación por afinidad de inmunoglobulinas que comprende los pasos de (a) proporcionar un líquido que contiene una inmunoglobulina; (b) proporcionar una matriz de separación por afinidad que comprende una proteína de unión a Ig no natural inmovilizada del primer aspecto; (c) poner en contacto dicho líquido y dicha matriz de separación por afinidad, en donde dicha inmunoglobulina se une a dicha proteína de unión a Ig inmovilizada; y (d) eluir dicha inmunoglobulina de dicha matriz, obteniendo así un eluato que contiene dicha inmunoglobulina; y (e) opcionalmente que comprende además uno o más pasos de lavado llevados a cabo entre los pasos (c) y (d).

Un quinto aspecto, que se refiere a un método de generación de una proteína de unión a Ig no natural según el primer aspecto, donde cada dominio de unión a Ig se puede obtener mediante un proceso de empalme de al menos dos dominios de unión a Ig de origen natural a partir de una proteína de unión a Ig de origen natural y, opcionalmente, la introducción de mutaciones adicionales.

Un sexto aspecto, que se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto.

Un séptimo aspecto, que se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico del sexto aspecto.

Un octavo aspecto, que se refiere a una célula huésped o un huésped no humano que comprende la proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto, una molécula de ácido nucleico del sexto aspecto o un vector del séptimo aspecto. Un noveno aspecto, que se refiere a un método para la producción de una proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto, que comprende el(los) paso(s): a. cultivar la célula huésped del octavo aspecto en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de unión con el fin de obtener dicha proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural; y B. aislar opcionalmente dicha proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural.

Las realizaciones de la invención se harán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1A. Ilustración del método de empalme para la generación de proteínas de unión a Ig.

Figura 1B. Secuencia genérica de proteínas de unión a IgG de la invención (SEQ ID NO: 1). Los números se refieren a la posición del aminoácido correspondiente en la proteína de unión; "X" se refiere a un aminoácido que se selecciona de los aminoácidos que se muestran debajo de la "X". Por ejemplo, "X" en la posición 2 se puede seleccionar entre A, D o Q. Figura 2. Secuencias de aminoácidos de proteínas de unión a Ig no naturales seleccionadas (SEQ ID NO: 9-30) Figura 3. Análisis de proteínas de unión a IgG expresadas en HMS174(DE3) mediante SDS-PAGE desnaturalizante. Se generaron fracciones solubles e insolubles y se aplicaron al SDS-Gel. Cultivo principal 7 h después de la inoculación (Figura 3A) y 24 h después de la inoculación (Figura 3B). Carril 1 - marcador de peso molecular, fracción soluble (carril 2) e insoluble (carril 3) de 148464 (SEQ ID NO: 15), fracción soluble (carril 4) e insoluble (carril 5) de 148463 (SEQ ID NO: 14), fracción soluble (carril 6) e insoluble (carril 7) de 148461 (SEQ ID NO: 12). La flecha gris apunta al tamaño aproximado de las proteínas expresadas.

Figura 4. Análisis de proteínas de unión a IgG purificadas mediante SDS-PAGE desnaturalizante. Expresión y purificación de 148461 (SEQ ID No : 12) (Figura 4A), y de 148471 (SEQ ID NO: 22) (Figura 4B). Carril 1 marcador de peso molecular, carril 2 fracción insoluble, carril 3 fracción soluble, carril 4 columna de flujo continuo StrepTactin, carriles 5-9 fracciones de elución HiLoad 16/600 Superdex 75 pg.

Figura 5. Análisis de la afinidad de unión de las proteínas de unión a IgG por ELISA. El ensayo se realizó con Cetuximab (círculos rellenos) y Adalimumab (círculos vacíos) como objetivo y SAB (triángulos rellenos) como fuera del objetivo. La unión de las proteínas de unión a IgG se analizó mediante StrepTag con Strep-Tactin-HRP. Figura 5A. Proteína de unión a Ig 148472 (SEQ ID NO: 23); El Kd para SEQ ID NO: 23 es 5,9 nM frente a Cetuximab y 5,1 nM frente a Adalimumab. Figura 5B. Proteína de unión a Ig 148461 (SEQ ID NO: 12). La Kd para SEQ ID NO: 12 es 7,8 nM frente a Cetuximab y 7,5 nM frente a Adalimumab. Los resultados de otras proteínas de unión a IgG de la invención en comparación con los dominios de Proteína A de origen natural se muestran en la Tabla 2 (véase el Ejemplo 5).

Figura 6. Análisis de la afinidad de unión de proteínas de unión a IgG por SPR (Biacore). Figura 6A. Análisis de la proteína de unión a Ig 148463 (SEQ ID NO: 14). Las concentraciones analizadas fueron 0 nM, 1,56 nM, 3,125 nM, 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM. La K^d para SEQ ⁱD NO: 14 es 1,3 nM, Figura 6B. Análisis de la proteína de unión a Ig 154256 (SEQ ID NO: 28). Las concentraciones analizadas fueron 0, 0,39 nM, 0,78 nM, 1,56 nM, 3,125 nM, 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM. La K^d para SEQ ID NO: 28 es 3,1 nM. En la Tabla 3 se muestran resultados adicionales (véase el Ejemplo 6). Figura 7. Inmovilización de proteínas de unión de IgG a la resina de acoplamiento SulfoLink. Se muestran los perfiles de la proteína de unión a Ig 148470 (SEQ ID NO: 21) (Figura 7A), y proteína de unión a Ig 148460 (SEQ ID NO: 11) (Figura 7B). El eje y muestra la absorción a 280 nm en mAU, el eje y se refiere al volumen de elución en ml.

Figura 8. Actividad de unión a Ig de las proteínas de unión a IgG inmovilizadas en resina Sulfolink después del tratamiento alcalino. La figura muestra la actividad restante de diferentes proteínas de unión a IgG 148462 (SEQ ID NO: 13, "13").

148463 (SEQ ID NO: 14; "14"). 1484672 (SEQ ID NO: 23, "23") en comparación con los dominios E, D, A, B, C y el dominio Z de la Proteína A de origen natural después de 80 min de tratamiento continuo con NaOH 0,5 M.

Figura 9. Unión de Ig de proteínas de unión de IgG inmovilizadas a la resina epoxi activada después del tratamiento alcalino. Proteínas de unión a Ig 154254 (SEQ ID NO: 26), 154255 (SEQ ID NO: 27), 154256 (SEQ ID NO: 28), y 154257 (SEQ ID NO: 30) se compararon con la proteína de unión a IgG 148463 (SEQ ID NO: 14). Se muestra la actividad restante después de seis horas de tratamiento continuo con NaOH 0,5 M.

Figura 10. Actividad de unión a Ig de proteínas de unión a IgG que consisten en 1, 2, 4 o 6 dominios de unión a IgG inmovilizados en resina activada con epoxi después del tratamiento alcalino. La actividad de unión a IgG del monómero 148463 (SEQ ID NO: 14), dimero 150570 (SEQ ID NO: 45), tetrámero 150663 (SEQ ID NO: 46), and hexámero 150772 (SEQ ID NO: 47) después del tratamiento continuo con NaOH 0,5 M (0 horas, columna gris claro; 2 horas, columna gris medio; 4 horas, columna gris medio oscuro; 6 horas, columna gris oscuro).

Descripción detallada de la invención

Antes de que la presente invención se describa en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos en este documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en el arte al que pertenece esta invención.

Preferiblemente, los términos utilizados en este documento se definen como se describe en "Un glosario multilingüe de términos biotecnológicos: (Recomendaciones IUPAC)", Leuenberger, HGW, Nagel, B. y Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH- 4010 Basilea, Suiza).

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un número entero o paso o grupo de números enteros o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o paso o grupo de números enteros o pasos.

Varios documentos (por ejemplo: patentes, solicitudes de patentes, publicaciones científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, presentaciones de secuencias de números de acceso de GenBank, etc.) se citan a lo largo del texto de esta memoria descriptiva. Nada de lo aquí contenido debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a ser anterior a dicha divulgación en virtud de una invención anterior.

Todas las secuencias a las que se hace referencia en el presente documento se describen en el listado de secuencias adjunto que, con todo su contenido y descripción, forma parte de esta memoria descriptiva.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se refieren a cualquier cadena molecular lineal de dos o más aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y no se refieren a una longitud específica del producto. Por lo tanto, "péptidos", "proteínas", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término utilizado para referirse a una cadena de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" puede utilizarse en lugar de, o de manera intercambiable con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones postraduccionales del polipéptido, que incluyen, entre otros, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, escisión proteolítica, modificación por aminoácidos no naturales y modificaciones similares que son bien conocidos en la técnica. Por tanto, las proteínas de unión a Ig que comprenden dos o más dominios proteicos también se incluyen en la definición del término "proteína" o "polipéptidos".

En el contexto de la presente invención, el término "proteína de unión a inmunoglobulina" se usa para describir proteínas que son capaces de unirse específicamente a la región Fc de una inmunoglobulina. Debido a esta unión específica a la región Fc, las "proteínas de unión a inmunoglobulinas" de la invención son capaces de unirse a inmunoglobulinas completas, a fragmentos de inmunoglobulina que comprenden la región Fc, a proteínas de fusión que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina, y a conjugados que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina. Si bien las "proteínas de unión a inmunoglobulina" de la presente invención exhiben una unión específica a la región Fc de una inmunoglobulina, no se excluye que las "proteínas de unión a inmunoglobulina" puedan unirse adicionalmente con afinidad reducida a otras regiones, como las regiones Fab de las inmunoglobulinas.

A lo largo de esta memoria descriptiva, el término "proteína de unión a inmunoglobulina" se abrevia a menudo como "proteína de unión a Ig" o "proteína de unión a Ig". Ocasionalmente, tanto la forma larga como la forma abreviada se usan al mismo tiempo, por ejemplo, en la expresión "proteína de unión a inmunoglobulina (Ig)".

En realizaciones preferidas de la presente invención, la "proteína de unión a inmunoglobulina" comprende uno o más dominios de unión a Ig no naturales. Como se usa en este documento, el término "dominio de unión a inmunoglobulina" (a menudo abreviado como: Dominio de unión a Ig) se refiere a un dominio de proteína que es capaz de unirse específicamente a la región Fc de una inmunoglobulina. Sin embargo, no se excluye que el "dominio de unión a inmunoglobulina" pueda unirse adicionalmente, con afinidad reducida, a otras regiones, como las regiones Fab de las inmunoglobulinas. Debido a la unión específica a la región Fc, los "dominios de unión a inmunoglobulina" de la invención son capaces de unirse a inmunoglobulinas enteras, a fragmentos de inmunoglobulina que comprenden la región Fc, a proteínas de fusión que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina y a conjugados que comprende una región Fc de una inmunoglobulina.

En realizaciones preferidas de la invención, los "dominios de unión a inmunoglobulina" son dominios no naturales que exhiben un máximo de 85 % de identidad de secuencia con los dominios de unión a Ig de origen natural, por ejemplo, el dominio C (SEQ ID NO: 7) o al dominio B (SEQ ID NO: 6) o al dominio E (SEQ ID NO: 3) o al dominio D (SEQ ID N^o : 4) o al dominio A (SEQ ID NO: 5) de la Proteína A de Staphylococcus aureus. Un dominio de unión a Ig no natural preferido de la invención tiene aminoácidos idénticos en las posiciones correspondientes a las posiciones Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, 131, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, P57 del dominio E, D, A, B, C y al dominio Z. La identidad de un dominio de unión a Ig de la invención a los dominios naturales E, D, A, B, C y al dominio Z es al menos aproximadamente el 50 % y como máximo el 85 %.

Como se usa en el presente documento, se considera que un primer compuesto (p. ej., una proteína de unión a Ig de la invención) se "une" a un segundo compuesto (p. ej., un antígeno, como una proteína diana, como una inmunoglobulina), si tiene una constante de disociación K^d a dicho segundo compuesto de 500 |iM o menos, preferiblemente 100 |iM o menos, preferiblemente 50 |iM o menos, preferiblemente 10 |iM o menos, preferiblemente 1 |iM o menos, preferiblemente 500 nM o menos, preferiblemente 100 nM o menos, más preferiblemente 50 nM o menos, incluso más preferiblemente 10 nM o menos. El término "unión" según la invención se refiere preferiblemente a una unión específica. "Unión específica" significa que una proteína de unión a Ig de la invención se une más fuerte a una inmunoglobulina para la que es específica en comparación con la unión a otra diana que no es inmunoglobulínica. Por ejemplo, la constante de disociación (Kd) para la diana (p. ej., inmunoglobulina) a la que se une específicamente la proteína de unión a Ig es más de 10 veces, preferiblemente más de 20 veces, más preferiblemente más de 50 veces, incluso más preferiblemente más de 100, 200, 500 o 1000 veces menor que la constante de disociación (Kd) para una diana a la que la proteína de unión no se une específicamente.

El término "constante de disociación" o "Kd" define la afinidad de unión específica. Como se usa aquí, el término "Kd" (normalmente medido en "mol/L", a veces abreviado como "M") se refiere a la constante de equilibrio de disociación de la interacción particular entre una primera proteína y una segunda proteína. En el contexto de la presente invención, el término K^d se usa particularmente para describir la afinidad de unión entre una proteína de unión a inmunoglobulina y una inmunoglobulina. Una afinidad alta corresponde a un valor bajo de KD. Por lo tanto, la expresión "un Kd de al menos, por ejemplo, 10-7 M" significa un valor de 10-7 M o menos (unión más fuerte). 1 x 10-7 M corresponde a 100 nM. Un valor de 10-5 M e inferior hasta 10-12 M puede considerarse como una afinidad de unión cuantificable. De acuerdo con la invención, la afinidad por la unión a la diana debe estar en el rango de 500 nM o menos, más preferiblemente por debajo de 100 nM, incluso más preferiblemente 10 nM o menos.

Los métodos para determinar las afinidades de unión, es decir, para determinar la constante de disociación KD, son conocidos por los expertos en la técnica y pueden seleccionarse, por ejemplo, entre los siguientes métodos conocidos en la técnica: Tecnología basada en resonancia de plasmón superficial (SPR por sus siglas en inglés), interferometría de biocapa (BLI por sus siglas en inglés), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA por sus siglas en inglés), citometría de flujo, técnicas de espectroscopia de fluorescencia, calorimetría de titulación isotérmica (ITC por sus siglas en inglés), ultracentrifugación analítica, radioinmunoensayo (RIA o IRMA por sus siglas en inglés) y quimioluminiscencia mejorada (ECL por sus siglas en inglés). Algunos de los métodos se describen en los Ejemplos a continuación.

El término "de origen natural", como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural. Por ejemplo, los dominios de unión a Ig de origen natural se pueden aislar de la bacteria Staphylococcus aureus, por ejemplo, Proteína A dominio C (SEQ ID NO: 7) o Proteína A dominio B (SEQ ID NO: 6) o Proteína A dominio E (^s E^q ID NO: 3) o Proteína A dominio D (SEQ ID NO: 4) o Proteína A dominio A (SEQ ID NO: 5).

Por el contrario, el término "no natural", tal como se utiliza aquí, se refiere a un objeto que no se produce de forma natural, es decir, el término se refiere a un objeto que ha sido producido o modificado por el hombre. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que ha sido generada por el hombre, por ejemplo, en un laboratorio (p. ej., mediante ingeniería genética, mediante métodos de empalme o mediante reacciones químicas, etc.) o modificada intencionadamente, es "no natural". Los términos "no natural" y "artificial" se usan indistintamente en este documento. Por ejemplo, las proteínas de unión a Ig de la invención que comprenden al menos un dominio de unión a Ig son proteínas no naturales.

El término "anticuerpo" o "Ig" o "inmunoglobulina", como se usa aquí de manera intercambiable de acuerdo con la presente invención, comprende proteínas que tienen una estructura de cuatro cadenas polipeptídicas que consta de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (anticuerpos inmunoglobulina o IgG) con la capacidad para unirse específicamente a un antígeno. El término "cadena ligera de anticuerpo" designa la pequeña subunidad polipeptídica de una cadena de anticuerpo que se compone de dos dominios de inmunoglobulina en tándem, un dominio constante y un dominio variable que es importante para la unión al antígeno. El término "cadena pesada de anticuerpo" designa la subunidad polipeptídica grande de un anticuerpo que determina la clase o el isotipo de un anticuerpo. Además, también los fragmentos o derivados de los mismos, que todavía conservan la especificidad de unión, están comprendidos en el término "anticuerpo". Se entiende que los fragmentos de anticuerpos en este documento comprenden menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. El término "anticuerpo" también incluye realizaciones tales como anticuerpos quiméricos (dominio constante humano, dominio variable no humano), monocatenario y humanizado (anticuerpo humano con la excepción de las CDR no humanas). Los anticuerpos IgG de longitud completa que constan de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras son los más preferidos en esta invención. Las cadenas pesadas y ligeras están conectadas a través de interacciones no covalentes y enlaces disulfuro.

Como se usa en el presente documento, el término "enlazador" se refiere en su significado más amplio a una molécula que se une covalentemente al menos a otras dos moléculas. En realizaciones típicas de la presente invención, un "enlazador" debe entenderse como un resto que conecta un primer polipéptido con al menos un polipéptido adicional. El segundo polipéptido puede ser el mismo que el primer polipéptido o puede ser diferente. En estas realizaciones típicas se prefieren los conectores peptídicos. Esto significa que el conector peptídico es una secuencia de aminoácidos que conecta un primer polipéptido con un segundo polipéptido, por ejemplo, un primer dominio de unión a Ig con un segundo dominio de unión a Ig. El conector peptídico está conectado al primer polipéptido y al segundo polipéptido mediante un enlace peptídico, generando así una única cadena polipeptídica lineal. La longitud y composición de un enlazador puede variar entre al menos uno y hasta 30 aminoácidos. Más específicamente, un conector peptídico tiene una longitud de entre 1 y 30 aminoácidos; por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos. Se prefiere que la secuencia de aminoácidos del conector peptídico sea estable frente a proteasas y/o no forme una estructura secundaria. Son bien conocidos los enlazadores compuestos por pequeños aminoácidos como la glicina y la serina. Los enlazadores pueden ser ricos en glicina (p. ej., más del 50 % de los residuos en el enlazador pueden ser residuos de glicina). Se prefieren los enlazadores de glicina-serina de longitud variable que consisten únicamente en residuos de glicina y serina. En general, se pueden usar enlazadores de la estructura (SGGG)n o permutaciones de SGGG, por ejemplo (GGGS)n, donde n puede ser cualquier número entre 1 y 6, preferiblemente 1 ó 2 ó 3. También se prefieren los enlazadores que comprenden otros aminoácidos. Las realizaciones preferidas de la invención comprenden enlazadores que consisten en alanina, prolina y serina. Se prefiere que un conector peptídico consista en aproximadamente 40 % a 60 % de alanina, aproximadamente 20 % a 35 % de prolina y aproximadamente 10 % a 30 % de serina. Se prefiere que los aminoácidos alanina, prolina y serina se distribuyan uniformemente a lo largo de la secuencia de aminoácidos del enlazador de manera que no más de un máximo de 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos idénticos sean adyacentes, preferiblemente un máximo de 3 aminoácidos. Otros enlazadores para la fusión de proteínas son conocidos en la técnica y pueden usarse.

Ejemplos de enlazadores utilizables en la presente invención son los siguientes enlazadores: un enlazador que tiene al menos la secuencia de aminoácidos SG o cualquier otro enlazador, por ejemplo SGGGG [SEQ ID NO: 31], SGGGGSGGGG [SEQ ID NO: 32], GGGSGGGSGGGS [SEQ ID NO: 33], GGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 34], GGGGS [SEQ ID NO: 35], GGGS [SEQ ID NO: 36], SGGG [SEQ ID NO: 37], o (GGGS)n (es decir, n repeticiones de SEQ ID NO: 36, donde n está entre 1 y 5 (por ejemplo, n puede ser 1, 2, 3, 4 o 5)), (SGGG)n (es decir, n repeticiones de SEQ ID NO: 37, donde n está entre 1 y 5 (por ejemplo, n puede ser 1,2, 3, 4 o 5), o SAAPAPSAPASAAPAPAPAPAPSPAAPAAS [SEQ ID NO: 41], ASPSPAAPAPAP- SAASPAPAAPAPAASPAA [SEQ ID NO: 42], o ASPAPSAPSA [SEQ ID NO: 43]). Otros enlazadores para la fusión de dos dominios de unión a IgG o dos proteínas de unión de IgG también se conocen en la técnica y pueden usarse.

El término "fusionado" significa que los componentes están unidos por enlaces peptídicos, ya sea directamente o a través de conectores peptídicos. El término "proteína de fusión" se refiere a una proteína que comprende al menos una primera proteína unida genéticamente a al menos una segunda proteína. Una proteína de fusión se crea mediante la unión de dos o más genes que originalmente codificaban proteínas separadas. Por lo tanto, una proteína de fusión puede comprender un multímero de proteínas de unión idénticas o diferentes que se expresan como un único polipéptido lineal. Puede comprender dos, tres, cuatro o incluso más dominios de unión o proteínas de unión. En general, las proteínas de fusión se generan artificialmente mediante tecnología de ADN recombinante bien conocida por un experto en la materia. Las proteínas de unión a Ig de la invención pueden prepararse mediante cualquiera de las muchas técnicas convencionales y bien conocidas, tales como estrategias sintéticas orgánicas simples, técnicas de síntesis asistida por fase sólida o mediante sintetizadores automáticos disponibles en el mercado.

Preferiblemente, el término "multímero" como se usa en el presente documento se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos dos dominios de unión a IgG, preferiblemente 2 (dímero), 3 (trímero), 4 (tetrámero), 5 (pentámero), 6 (hexámero), 7 (heptámero) u 8 (octámero) dominios de unión a IgG, más preferentemente 4, 5 ó 6 dominios de unión a IgG. En una realización preferida, los dominios de unión a Ig en un multímero son idénticos. En otras realizaciones, los dominios de unión a Ig de un multímero pueden ser diferentes. Se insertan una o más secuencias conectoras entre los dominios del multímero.

El término "identidad de secuencia de aminoácidos" se refiere a una comparación cuantitativa de la identidad (o diferencias) de las secuencias de aminoácidos de dos o más proteínas. "Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia.

Para determinar la identidad de la secuencia, la secuencia de una proteína de consulta se alinea con la secuencia de una proteína de referencia. Los métodos para la alineación son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar el grado de identidad de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido arbitrario con respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia, se emplea preferentemente el programa de similitud SIM Local (Xiaoquin Huang y Webb Miller (1991), Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337-357), que está disponible gratuitamente (ver también: http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html). Para el análisis de alineación múltiple, se utiliza preferentemente ClustalW (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22(22): 4673-4680). Preferentemente, se utilizan los parámetros por defecto del programa de similitud SIM Local o de ClustalW, al calcular los porcentajes de identidad de secuencia.

En el contexto de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre una secuencia modificada y la secuencia de la que se deriva generalmente se calcula con respecto a la longitud total de la secuencia no modificada, si no se indica explícitamente lo contrario.

Cada aminoácido de la secuencia de consulta que difiere de la secuencia de aminoácidos de referencia en una posición determinada se cuenta como una diferencia. Una inserción o eliminación en la secuencia de consulta también se cuenta como una diferencia. Por ejemplo, una inserción de un conector entre dos dominios de unión se cuenta como una diferencia en comparación con la secuencia de referencia. La suma de las diferencias se relaciona luego con la longitud de la secuencia de referencia para producir un porcentaje de no identidad. El porcentaje cuantitativo de identidad se calcula como 100 menos el porcentaje de no identidad.

El término "aproximadamente", como se usa en este documento, abarca las cantidades enumeradas explícitamente, así como las desviaciones de las mismas de ± 10 %. Más preferiblemente, una desviación del 5 % está comprendida por el término "aproximadamente".

El término "reordenado" como se usa en el presente documento se refiere a un proceso de ensamblaje que da como resultado nuevas secuencias no naturales a partir de un conjunto de secuencias conocidas que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un conjunto de al menos dos secuencias para empalmar; (b) alineación de dichas secuencias; y (c) ensamblaje de nuevas secuencias a partir de las secuencias alineadas, en las que el aminoácido en cada posición de la nueva secuencia puede derivarse de la misma posición de cualquiera de las secuencias alineadas. Preferiblemente, dos o más aminoácidos consecutivos se derivan de una de las secuencias alineadas.

El término "cromatografía" se refiere a tecnologías de separación que emplean una fase móvil y una fase estacionaria para separar un tipo de moléculas (p. ej., inmunoglobulinas) de otras moléculas (p. ej., contaminantes) en la muestra. La fase móvil líquida contiene una mezcla de moléculas y las transporta a través de una fase estacionaria (como una matriz sólida). Debido a la interacción diferencial de las diferentes moléculas de la fase móvil con la fase estacionaria, las moléculas de la fase móvil pueden separarse.

El término "cromatografía de afinidad" se refiere a un modo específico de cromatografía donde un ligando acoplado a una fase estacionaria interactúa con una molécula (es decir, inmunoglobulina) en la fase móvil (la muestra), es decir, el ligando tiene una afinidad específica por la molécula a purificar. Como se entiende en el contexto de la invención, la cromatografía de afinidad implica la adición de una muestra que contiene una inmunoglobulina a una fase estacionaria que comprende un ligando de cromatografía, tal como una proteína de unión a Ig de la invención. Los términos "soporte sólido" o "matriz sólida" se usan indistintamente para la fase estacionaria.

Los términos "matriz de afinidad" o "matriz de separación de afinidad" o "matriz de cromatografía de afinidad", como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a una matriz, por ejemplo, una matriz cromatográfica, sobre la cual un ligando de afinidad (por ejemplo, una proteína de unión a Ig de la invención) está unido. El ligando (p. ej., proteína de unión a Ig) es capaz de unirse a una molécula de interés (p. ej., una inmunoglobulina o una proteína que contiene Fc) a través de una interacción de afinidad que se va a purificar o eliminar de una mezcla.

El término "purificación por afinidad" como se usa aquí se refiere a un método para purificar inmunoglobulinas o proteínas que contienen Fc de un líquido uniendo las inmunoglobulinas o proteínas que contienen Fc a una proteína de unión a Ig que está inmovilizada en una matriz. De este modo, se eliminan todos los demás componentes de la mezcla excepto las inmunoglobulinas o las proteínas que contienen Fc. En otro paso, las inmunoglobulinas unidas o las proteínas que contienen Fc se pueden eluir en forma purificada.

El término "alcalino estable" o "estabilidad alcalina" o "estable al cáustico" o "estabilidad al cáustico" se refiere a la capacidad de la proteína de unión a Ig de la invención para soportar condiciones alcalinas sin perder significativamente la capacidad de unirse a las inmunoglobulinas. El experto en este campo puede probar fácilmente la estabilidad alcalina incubando una proteína de unión a Ig con hidróxido de sodio, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos, y la posterior prueba de la actividad de unión a la inmunoglobulina mediante experimentos de rutina conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, por aproximaciones cromatográficas.

En algunas realizaciones, las proteínas de unión a Ig de la invención, así como las matrices que comprenden proteínas de unión a Ig de la invención, exhiben una estabilidad alcalina "aumentada" o "mejorada", lo que significa que las moléculas y matrices que incorporan dichas proteínas de unión a Ig son estables en condiciones alcalinas durante un período prolongado de tiempo en relación con los dominios de Proteína A de origen natural, es decir, no pierden la capacidad de unirse a las inmunoglobulinas ni pierden la capacidad de unirse a las inmunoglobulinas en menor medida que los dominios de Proteína A de origen natural.

Los términos "actividad de unión" o "capacidad de unión" o "capacidad de unión estática" como se usan de manera intercambiable en este documento, se refieren a la capacidad de una proteína de unión a Ig de la invención para unirse a inmunoglobulina. Por ejemplo, la actividad de unión se puede determinar antes y/o después del tratamiento alcalino. La actividad de unión se puede determinar para una proteína de unión de Ig o para una proteína de unión de Ig acoplada a una matriz, es decir, para una proteína de unión inmovilizada.

Los métodos generalmente conocidos y practicados en los campos de la biología molecular, la biología celular, la química de proteínas y las técnicas de anticuerpos se describen detalladamente en las publicaciones continuamente actualizadas "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (Sambrook et al., Cold Spring Harbor); Current Protocols in Molecular Biology (FM Ausubel et al. Eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Protein Science (JE Colligan et al. eds., Wiley & Sons); Protocolos Actuales en Biología Celular (JS Bonifacino et al., Wiley & Sons) y Protocolos Actuales en Inmunología (JE Colligan et al., Eds., Wiley & Sons). Las técnicas conocidas relacionadas con el cultivo celular y los medios se describen en "Large Scale Mammalian Cell Culture" (D. Hu et al., Curr. Opin. Biotecnología. 8:148-153, 1997); "Medios sin suero" (K. Kitano, Biotechnol. 17:73-106, 1991); y "Cultivo en Suspensión de Células de Mamíferos" (JR Birch et al. Tecnología de bioprocesos. 10: 251-270,1990).

En los siguientes pasajes se definen con más detalle diferentes aspectos de la invención. Cada aspecto definido a continuación puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.

Un primer aspecto está dirigido a una proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural que comprende uno o más dominios de unión a Ig no naturales, donde al menos un dominio de unión a Ig comprende o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸QQX¹¹AFYX¹⁵X¹⁶LX¹⁸X¹⁹PX²¹LX²³X²⁴X²⁵QRX²⁸X²⁹FIQSLKDDPSX⁴⁰SX⁴²X⁴³X⁴⁴LX⁴⁶EAX⁴⁹KLX⁵²X⁵³X⁵⁴ QX⁵⁶PX⁵⁸ (SEQ ID NO: 1), donde X¹ es A, V, Q, N o P; preferiblemente N, V, P o A; X² es D, A o Q; preferiblemente D o A; X³ es A, S o N; X⁴ es K, Q o N; preferiblemente K o Q; X⁵ es H o F; X6 es D, N, S o A; preferiblemente D, S o A: X⁷ es E o K; X8 es D, E o A; X¹¹ es S o N; X¹⁵ es E, D o Q; preferiblemente E; X¹⁶ es V o I; preferiblemente I; X¹⁸ es H o N; preferiblemente H; X¹⁹ es L o M; preferiblemente L; X²¹ es N, S o D; X²³ es T o N; preferiblemente T; X²⁴ es E o A; preferiblemente E; X²⁵ es D o E; X²⁸ es N, S o A; X²⁹ es G o A; preferiblemente A; X⁴⁰ es V o Q o T; X⁴² es K, T o A; preferiblemente K o A; X⁴³ es E, N o S; preferiblemente E o S; X⁴⁴ es V, L o I; X⁴⁶ es G o A; X⁴⁹ es K o Q; X⁵² es N, S o D; X⁵³ es D o E; X⁵⁴ es S o A; X⁵⁶ es A o P; preferiblemente A; y X⁵⁸ es K o P;

y donde la constante de disociación Kd de dicha proteína de unión a Ig no natural a IgG1 humana es 1 |iM o menos, preferiblemente 500 nM, más preferiblemente 100 nM o menos. Más detalladamente, SEQ ID NO: 1 y una realización preferida como se muestra en SEQ ID NO: 38 son secuencias genéricas resultantes de una alineación de SEQ ID NO: 9 a 30. Por lo tanto, cada dominio de unión a Ig no natural de la proteína de unión a Ig de la invención muestra una identidad de secuencia de aproximadamente 50 % a aproximadamente 85 % con un dominio de unión de Ig de origen natural, véase la Tabla 1 (véase el Ejemplo 1). Cada dominio de unión a Ig no natural de la proteína de unión a Ig de la invención tiene los mismos aminoácidos en posiciones que corresponden a las posiciones Q9, A12, F13, L17, Q26, R27, F30, 131, L34, P38, S41, L45, A48, L51, Q55 de un dominio de unión a Ig de origen natural, más preferiblemente con los mismos aminoácidos que corresponden a las posiciones Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, 131, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, P57 de un dominio de unión a Ig natural, por ejemplo, dominio C, dominio B, dominio A, dominio E y dominio D.

Al menos un dominio de unión a Ig no natural puede comprender o consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸QQX¹¹AFYEILHLPX²¹LTEX²⁵QRX²⁸AFIQSLKDDPSX⁴⁰SX⁴²X⁴³X⁴⁴LX⁴⁶EAX⁴⁹KLX⁵²X⁵³X⁵⁴QAPX⁵⁸ (SEQ ID NO: 38), donde

X¹ es N, V, P o A;

X² es D o A;

X3 es A, S o N;

X⁴ es K o Q;

X5 es H o F;

X6 es D, S o A;

X⁷ es E o K;

X8 es D, E o A;

X11 es S o N;

X21 es N S o D

X25 es D o E;

X28 es N S o A;

es V, T o Q;

X₄₂ es K o A;

es E o S;

X₄₄ es V, L o I;

es G o A;

X₄₉ es K o Q;

X52 es N S o D

X53 es D o E;

es S o A; y

es K o P.

SEQ ID NO: 38 es una secuencia de aminoácidos genérica resultante de una alineación de SEQ ID NO: 9-30 y es una selección preferida de SEQ ID NO: 1.

Al menos un dominio de unión a Ig no natural puede comprender o consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos

X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸QQX¹¹AFYX¹⁵X¹⁶LX¹⁸X¹⁹PX²¹LX²³X²⁴X²⁵QRX²⁸X²⁹FIQSLKDDPSX⁴⁰SX⁴²X⁴³X⁴⁴LX⁴⁶EAX⁴⁹KLX⁵²X⁵³X⁵⁴ QX⁵⁶PX⁵⁸ (SEQ ID NO: 2), donde

X¹ es A, V, Q, N o P; X² es D, A o Q; X³ es A o N; X⁴ es K, Q o N; X⁵ es H o F; X6 es D, N o A; X⁷ es E o K; Xa es D, E o A; X¹¹ es S o N; X¹⁵ es E o D; X¹⁶ es V o I; X¹⁸ es H o N; X¹⁹ es L o M; X²¹ es N, S o D; X²³ es T o N; X²⁴ es E o A; X²⁵ es D o E; X²⁸ es N, S o A; X²⁹ es G o A; X⁴⁰ es V o Q; X⁴² es K, T o A; X⁴³ es E o N; X⁴⁴ es V, L o I; X⁴⁶ es G o A; X⁴⁹ es K o Q; X⁵² es N o D; X⁵³ es D o E; X⁵⁴ es S o A; X⁵⁶ es A o P; y X⁵⁸ es K o P. Una proteína de unión a Ig según la invención puede comprender uno o más dominios de unión a Ig no naturales en los que al menos un dominio de unión a Ig comprende o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos X¹X²AX⁴X⁵DX⁷X⁸QQX¹¹AFYEILHLPNLTEX²⁵QRNAFIQSLKDDPSX⁴⁰SX⁴²X⁴³X⁴⁴LX⁴⁶EAX⁴⁹KLNX⁵³X⁵⁴QAPK (SEQ ID NO: 48), donde

X ^I es N o V;

X² es D o A;

X⁴ es K o Q;

X5 es H o F;

X⁷ es E o K;

X8 es D, E o A;

X ^{I I} es S o N;

X25 es D o E;

X⁴⁰ es V o Q;

X⁴² es K o A;

X⁴³ es E o S;

X⁴⁴ es V o I;

X⁴⁶ es G o A;

X⁴⁹ es K o Q;

X⁵³ es D o E; y

X⁵⁴ es S o A.

SEQ ID NO: 48 es una secuencia de aminoácidos genérica resultante de una alineación de SEQ ID NO: 24, 26, 27, 28 y 30 y es una selección preferida de SEQ ID NO: 38. Las proteínas de unión a Ig son estables incluso después de un tratamiento alcalino durante un período de tiempo prolongado (p. ej., al menos hasta 6 horas, NaOH 0,5 M), por ejemplo, las proteínas de unión a Ig de la invención tienen una mayor estabilidad alcalina que los dominios de Proteína A naturales.

Una proteína de unión a Ig según la invención puede comprender uno o más dominios de unión a Ig no naturales en los que al menos un dominio de unión a Ig comprende o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸QQX¹¹AFYEILHLPX²¹LTEDQRX²⁸AFIQSLKDDPSX⁴⁰SKX⁴³X⁴⁴LGEAKKLX⁵²DAQAPP (SEQ ID NO: 49), donde

X ^I es P, N o A;

X² es A o D;

X3 es A, S o N;

X⁴ es K o Q;

X5 es H o F;

X6 es D, S o A;

X7 es K o E;

X8 es D, E o A;

X ^{I I} es S o N;

X²¹ es N, S o D;

X²⁸ es S o A;

X⁴⁰ es V o T;

X⁴³ es E o S;

X⁴⁴ es I o L; y

X⁵² es N, S o D.

SEQ ID NO: 49 es una secuencia de aminoácidos genérica resultante de una alineación de SEQ ID NO: 9 a 23 y es una selección preferida de SEQ ID NO: 38.

La proteína de unión a Ig no natural puede comprender uno o más dominios de unión a Ig, donde al menos un dominio de unión a Ig no natural comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

NAAQHAKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO: 9), NAAQHDKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 10), NAAQHSKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 11), NAAQHSKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 12), PAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 13), PAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 14), ADNKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 15), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO: 16), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 17), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPDLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 18), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 19), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO: 20), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLDDAQAPP (SEQ ID NO: 21), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLSDAQAPP (SEQ ID NO: 22), PAAKHDKDQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO: 23), NAAQHDKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 24), ADNKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO 25), NAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO: 26), NAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO 27), NAAKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEVLGEAQKLNDSQAPK (SEQ ID NO: 28),

(SEQ ID NO: 29), y VDAQHDEDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSAEILAEAKKLNESQAPK (SEQ ID NO: 30).

Particularmente preferidas son las proteínas de unión a Ig no naturales que comprenden uno o más dominios de unión a Ig, en las que al menos un dominio de unión a Ig no natural comprende o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, 14, 23, 26, 27, 28 y 30.

Como se muestra en los ejemplos siguientes, se encontró que las proteínas de la invención se unían a IgG. Más detalladamente, se encontró que los polipéptidos de unión a Ig que comprenden la secuencia genérica de SEQ ID NO: 1, más concretamente de las secuencias genéricas de SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 2, incluso más específicamente SEQ ID NO: 9-30, son capaces de unirse a IgG con altas afinidades que son comparables con las propiedades de unión del dominio de unión de Ig natural (ver Tabla 2, Ejemplo 5 y Tabla 3, Ejemplo 6). Fue más sorprendente e inesperado que las proteínas de unión a Ig que comprenden la secuencia genérica de s Eq ID NO: 1, más específicamente las secuencias genéricas de SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 2, incluso más específicamente SEQ ID NO: 9-30, son capaces de unirse a IgG incluso después de un tratamiento alcalino durante varias horas, por ejemplo, después de un tratamiento con NaOH 0. 5 M durante un máximo de 6 horas. Esta es una propiedad ventajosa en comparación con los dominios de la Proteína A o el dominio Z de origen natural (por ejemplo, véanse los datos comparativos en el Ejemplo 7 y en el Ejemplo 8 y en la Figura 8 y la Figura 9).

En una realización de la invención, la proteína de unión a Ig no natural comprende los dominios de unión a Ig no naturales 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, preferiblemente 4, 5 o 6, unidos entre sí, es decir, la proteína de unión a Ig no natural puede ser un monómero, dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, etc. Por ejemplo, SEQ ID NO: 14 se usó para generar las construcciones de fusión multiméricas descritas aquí en el Ejemplo 1. Las proteínas de unión a Ig obtenidas que comprenden más de un dominio de unión a Ig son estables y muestran propiedades de unión a Ig incluso después del tratamiento alcalino (por ejemplo, véase la Figura 10). En SEQ ID NO: 45 se proporcionan ejemplos seleccionados, pero no limitantes, de proteínas de unión a Ig multiméricas (dímero), SEQ ID NO: 46 (tetrámero), o SEQ ID NO: 47 (hexámero).

Los dominios de unión a Ig no naturales pueden estar directamente enlazados entre sí. Los dominios de unión a Ig no naturales pueden unirse entre sí a través de conectores peptídicos. Las secuencias de aminoácidos de todos los dominios de unión a Ig no naturales de la proteína de unión a Ig pueden ser idénticas (por ejemplo, SEQ ID NO: 45-47). Al menos un dominio de unión a Ig no natural puede tener una secuencia de aminoácidos diferente a la de los otros dominios de unión a Ig dentro de la proteína de unión a inmunoglobulina no natural.

La constante de disociación K^d de las proteínas o dominios de unión a Ig se puede determinar como se describe anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, véanse el Ejemplo 5 y el Ejemplo 6). Normalmente, la constante de disociación Kd se determina a 20 °C, 25 °C o 30 °C. Si no se indica específicamente lo contrario, los valores de Kd enumerados en este documento se determinan a 25 °C /- 3 °C mediante resonancia de plasmón superficial. La proteína de unión a Ig no natural puede tener una constante de disociación K^d a IgG1 humana en el rango entre 0,1 nM y 1000 nM, preferiblemente entre 0,1 nM y 500 nM, más preferiblemente entre 0,1 nM y 100 nM, más preferiblemente entre 0,5 nM y 100 nM, más preferentemente entre 1 nM y 10 nM.

La proteína de unión a Ig no natural puede tener una constante de disociación Kd a IgG² humana en el rango entre 0,1 nM y 1000 nM, preferiblemente entre 0,1 nM y 500 nM, más preferiblemente entre 0,1 nM y 100 nM, más preferiblemente entre 0,5 nM y 100 nM, más preferiblemente entre 1 nM y 10 nM

La proteína de unión a Ig no natural puede tener una constante de disociación Kd a IgG4 humana en el rango entre 0,1 nM y 1000 nM, preferiblemente entre 0,1 nM y 500 nM, más preferiblemente entre 0,1 nM y 100 nM, más preferiblemente entre 0,5 nM y 100 nM, más preferentemente entre 1 nM y 10 nM.

Un segundo aspecto se dirige a una composición que comprende la proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto.

La composición puede ser una matriz de separación por afinidad, que comprende la proteína de unión a Ig no natural según cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente acoplada a un soporte sólido. La matriz de separación por afinidad comprende una pluralidad de proteínas de unión a Ig de la invención acopladas a un soporte sólido.

Esta matriz que comprende la proteína de unión a Ig no natural de la invención es útil para la separación, por ejemplo, para la separación cromatográfica, de inmunoglobulinas y otras proteínas que contienen Fc, tales como derivados de inmunoglobulinas que comprenden la región Fc, proteínas de fusión que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina y conjugados que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina. Las matrices de soporte sólido para la cromatografía de afinidad son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, entre otros, agarosa y derivados estabilizados de agarosa (p. ej., rPROTEIN A Sepaharose Fast Flow o Mabselect®), vidrio de poro controlado (p. ej., resina ProSep® vA), monolito (p. ej., monolitos CIM®), sílice, óxido de circonio (p. ej., CM Zirconia o CPG®), óxido de titanio o polímeros sintéticos (p. ej., poliestireno, como resina Poros 50A o Poros MabCapture® A, éter polivinílico, alcohol polivinílico, acrilatos de polihidroxialquilo, polihidroxialquilo metacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilamidas, etc.) e hidrogeles de diversas composiciones. En determinadas realizaciones, el soporte comprende un polímero polihidroxilado, como un polisacárido.

Los ejemplos de polisacáridos adecuados para soportes incluyen, entre otros, dextrano, almidón, celulosa, pululano, agar, agarosa, etc., y variantes estabilizadas de estos.

Los formatos de soporte sólido pueden ser de cualquier tipo conocido adecuado. Dicho soporte sólido para acoplar la proteína de unión a Ig de la invención podría comprender, por ejemplo, pero sin limitarse a uno de los siguientes: columnas, capilares, partículas, membranas, filtros, monolitos, fibras, almohadillas, geles, portaobjetos, placas, casetes, o cualquier otro formato comúnmente utilizado en cromatografía y conocido por el experto en la materia. En una realización de la matriz, el vehículo se compone de partículas sustancialmente esféricas, también conocidas como perlas, por ejemplo, perlas de Sepharose o Agarosa. Los tamaños de partícula adecuados pueden estar en el rango de diámetro de 5-500 |im, tal como 10-100 |im, por ejemplo, 20-80 |im. En una realización alternativa, el vehículo es una membrana, por ejemplo, una membrana de hidrogel. En algunas realizaciones, la purificación por afinidad implica una membrana como matriz a la que se une covalentemente la proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto.

El soporte sólido también puede estar en forma de membrana en un cartucho. En una realización, la matriz sólida está en forma de perlas o partículas que pueden ser porosas o no porosas. Las matrices en forma de perlas o de partículas se pueden usar como un lecho empacado o en forma suspendida, incluidos los lechos expandidos. En el caso de monolitos, lecho empacado y lecho expandido, el procedimiento de separación suele seguir la cromatografía convencional con un gradiente de concentración o etapas de concentración en la fase móvil. En caso de suspensión pura, se utilizará el modo por lotes.

En algunas realizaciones, la purificación por afinidad implica una columna de cromatografía que contiene un soporte sólido al que se une covalentemente la proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto.

La proteína de unión a Ig de la invención se puede unir a un soporte sólido adecuado mediante técnicas de acoplamiento convencionales utilizando, por ejemplo, grupos amino, sulfhidroxi y/o carboxi presentes en la proteína de unión a Ig de la invención. El acoplamiento puede llevarse a cabo a través de un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre de la proteína de unión a Ig. Preferiblemente, los aminoácidos comprendidos en un conector peptídico N- o C-terminal comprenden dicho átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre. Las proteínas de unión a Ig pueden acoplarse al transportador directa o indirectamente a través de un elemento espaciador para proporcionar una distancia adecuada entre la superficie del transportador y la proteína de unión a Ig de la invención, lo que mejora la disponibilidad de la proteína de unión a Ig y facilita el acoplamiento químico de la Proteína de unión de Ig de la invención al soporte. Los métodos para la inmovilización de ligandos de proteínas en soportes sólidos son bien conocidos en este campo y los expertos en este campo los realizan fácilmente usando técnicas y equipos estándar.

En una realización, la proteína de unión a Ig no natural comprende un sitio de unión para la unión covalente a una fase sólida (matriz). Preferiblemente, el sitio de unión es específico para proporcionar una unión específica del sitio a la fase sólida. Los sitios de unión específicos comprenden aminoácidos naturales, como la cisteína o la lisina, o aminoácidos no naturales que permiten reacciones químicas específicas con un grupo reactivo de la fase sólida, por ejemplo, seleccionados entre grupos sulfhidrilo, maleimida, epoxi o alqueno, o un conector entre la fase sólida y la proteína. El extremo N puede marcarse preferentemente a pH ácido con reactivos amino reactivos. Las realizaciones preferidas de la invención comprenden una secuencia peptídica N- o C-terminal corta de 5 - 20 aminoácidos, preferiblemente 10 aminoácidos, con una cisteína terminal. Los aminoácidos para la secuencia del péptido C-terminal se seleccionan preferiblemente de prolina, alanina, serina, por ejemplo, AS^pA ^p SAPSAC (SEQ ID NO: 39).

Un tercer aspecto está dirigido al uso de la proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto o una composición del segundo aspecto para la purificación por afinidad de inmunoglobulinas, es decir, la proteína de unión a Ig de la invención se usa para cromatografía de afinidad. En algunas realizaciones, la proteína de unión a Ig de la invención se inmoviliza sobre un soporte sólido como se describe en el segundo aspecto de la invención. En una realización del tercer aspecto, la inmunoglobulina a purificar se selecciona del grupo que consiste en IgG1 humana, IgG2 humana, IgG4 humana, IgM humana, IgA humana, IgG1 de ratón, IgG2A de ratón, IgG2B de ratón, IgG3 de ratón, IgG1 de rata, IgG2C de rata, IgG1 de cabra, IgG2 de cabra, IgG2 bovina, IgG de cobaya, IgG de conejo, fragmentos de inmunoglobulina que comprenden la región Fc, proteínas de fusión que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina y conjugados que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina.

Un cuarto aspecto se refiere a un método de purificación por afinidad de inmunoglobulinas que comprende los pasos de (a) proporcionar un líquido que contiene una inmunoglobulina; (b) proporcionar una matriz de separación por afinidad que comprende una proteína de unión a Ig no natural inmovilizada del primer aspecto; (c) poner en contacto dicho líquido y dicha matriz de separación por afinidad, en donde dicha inmunoglobulina se une a dicha proteína de unión a Ig no natural inmovilizada; y (d) eluir dicha inmunoglobulina de dicha matriz, obteniendo así un eluato que contiene dicha inmunoglobulina; y (e) opcionalmente que comprende además uno o más pasos de lavado llevados a cabo entre los pasos (c) y (d). Las matrices de separación por afinidad están de acuerdo con las realizaciones descritas anteriormente y como las conocen los expertos en la técnica.

El aislamiento de la inmunoglobulina de la matriz en el paso (d) puede efectuarse mediante un cambio en el pH o un cambio en la concentración de sal. En algunas realizaciones del cuarto aspecto, el método comprende el paso adicional (f) recuperar dicho eluato.

La inmunoglobulina puede seleccionarse del grupo que consiste en IgG1 humana, IgG2 humana, IgG4 humana, IgM humana, IgA humana, IgG1 de ratón, IgG2A de ratón, IgG2B de ratón, IgG3 de ratón, IgG1 de rata, IgG2C de rata, IgG1 de cabra, IgG2 de cabra, IgG2 de bovino. IgG2, IgG de cobaya, IgG de conejo, fragmentos de inmunoglobulina que comprenden la región Fc, proteínas de fusión que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina y conjugados que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina.

Un quinto aspecto se refiere a un método de generación de una proteína de unión a Ig no natural que comprende al menos un dominio de unión a Ig según el primer aspecto, donde la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión a Ig se obtiene mediante un proceso de empalme de secuencias de aminoácidos de al menos dos dominios de Proteína A de origen natural a partir de Proteína A de origen natural. Más detalladamente, el proceso de empalme tal como se entiende aquí es un proceso de ensamblaje que da como resultado secuencias de aminoácidos nuevas y artificiales a partir de un conjunto de secuencias de aminoácidos conocidas no idénticas, que comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un conjunto de secuencias que se mezclarán, por ejemplo, secuencias de cinco dominios E, D, A, B y C de proteína A naturales y derivados de proteína A (p. ej., dominio Z u otros dominios con al menos un 90 % de identidad con cualquier dominio de origen natural); (b) alineación de dichas secuencias; (c) fragmentación estadística en silico, y luego (d) en silico ensamblaje de nuevas secuencias a partir de varios fragmentos para producir un producto de mosaico manteniendo el orden relativo. Los fragmentos generados en el paso c) pueden tener cualquier longitud, por ejemplo, si la secuencia original fragmentada tiene una longitud de n, los fragmentos pueden tener una longitud de 1 a n-1. Por lo tanto, la proteína reensamblada se compone de una serie de fragmentos que comprenden subsecuencias de uno o más aminoácidos, de modo que estas subsecuencias están presentes en las posiciones correspondientes en uno o más de los dominios de unión a IgG individuales de la proteína A que se han alineado en el paso (b). En otras palabras, en cada posición de aminoácido de la secuencia de mosaico ensamblada, hay al menos una proteína entre los dominios de unión a IgG alineados de la proteína A que comprende el mismo aminoácido en la posición correspondiente. Sin embargo, la secuencia general de aminoácidos de la proteína reensamblada es artificial porque no es idéntica a la secuencia general de aminoácidos de ninguno de los dominios de unión a IgG de la proteína A. El aminoácido en cada posición de la nueva secuencia corresponde a la misma posición de cualquiera de las secuencias alineadas. Las posiciones relativas de los aminoácidos en los productos del mosaico se mantienen con respecto a las secuencias iniciales. El proceso general de empalme para la generación de nuevas proteínas de unión a IgG artificiales se muestra en la Figura 1A.

Después de que se produce esta proteína mezclada inicial, la proteína se puede modificar adicionalmente opcionalmente mediante la aleatorización específica del sitio de la secuencia de aminoácidos para modificar aún más las propiedades de unión de la proteína mezclada, si se desea. A modo de ejemplo, las modificaciones adicionales pueden introducirse mediante mutagénesis de saturación de sitio de residuos de aminoácidos individuales para producir una pluralidad de polipéptidos transpuestos modificados. A continuación, estas proteínas de unión a IgG pueden examinarse para identificar aquellos polipéptidos empalmes modificados que tengan cualquier propiedad de unión que pueda ser de interés.

Por lo tanto, la generación de proteínas de unión a IgG de la invención implica uno o dos pasos básicos: un primer paso donde las secuencias relacionadas se alinean y mezclan para producir un polipéptido mezclado y, si se desea, un segundo paso para modificar aún más la actividad de unión de la proteína mezclada.

La proteína de unión a Ig de la invención comprende uno o más dominios de unión a Ig no naturales, donde cada dominio de unión a Ig no natural tiene aminoácidos idénticos a los dominios A, B, C, D o E de la proteína A natural o el dominio Z en posiciones que corresponden a las posiciones Q9, A12, F13, L17, Q26, R27, F30, 131, L34, P38, S41, L45, A48, L51, Q55, más preferentemente con los mismos aminoácidos que corresponden a las posiciones Q9, Q10 , A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, 131, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55 , P57 de un dominio de unión a Ig de origen natural.

La identidad de secuencia de las proteínas de unión a Ig de la invención con los dominios A, B, C, D o E o el dominio Z de la proteína A de origen natural es como máximo de aproximadamente el 85 % (véase la Tabla 1 para obtener más detalles).

Un sexto aspecto se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica una proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto.

La presente invención también abarca polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico del sexto aspecto de la invención.

Un séptimo aspecto se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico del sexto aspecto.

Un vector significa cualquier molécula o entidad (p. ej., ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) que puede usarse para transferir información de codificación de proteínas a una célula huésped.

El vector puede ser un vector de expresión.

Un octavo aspecto está dirigido a una célula huésped, que puede ser una célula huésped aislada o un huésped no humano que comprende la proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto, una molécula de ácido nucleico del sexto aspecto o un vector del séptimo aspecto.

Por ejemplo, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de unión a Ig de la invención pueden expresarse en un huésped adecuado y la proteína de unión producida puede aislarse.

Una célula huésped es una célula que se ha transformado, o es capaz de transformarse, con una secuencia de ácido nucleico y, por lo tanto, expresa un gen de interés.

Las células huésped adecuadas incluyen procariotas o eucariotas. También se pueden emplear varios sistemas de cultivo de células de insectos o mamíferos para expresar proteínas recombinantes. De acuerdo con la presente invención, el huésped puede ser un animal no humano transgénico transfectado y/o que expresa las proteínas de la presente invención. En una realización preferida, el animal transgénico es un mamífero no humano.

Un noveno aspecto se dirige a un método para la producción de una proteína de unión a Ig no natural del primer aspecto, que comprende el(los) paso(s): (a) cultivar la célula huésped del séptimo aspecto en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de unión para obtener dicha proteína de unión a Ig no natural; y (b) opcionalmente aislar dicha proteína de unión a Ig no natural.

También se describe aquí una proteína de unión a Ig no natural producida por el método del noveno aspecto. Las condiciones adecuadas para cultivar un huésped procariótico o eucariótico son bien conocidas por el experto en la materia. Las moléculas de unión a Ig de la invención pueden prepararse mediante cualquiera de las muchas técnicas convencionales y bien conocidas, tales como estrategias de síntesis orgánica simple, técnicas de síntesis asistida por fase sólida o mediante sintetizadores automáticos disponibles en el mercado. Por otra parte, también pueden prepararse mediante técnicas recombinantes convencionales solas o en combinación con técnicas sintéticas convencionales. Los conjugados de acuerdo con la presente invención se pueden obtener combinando compuestos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante métodos químicos, por ejemplo, química basada en lisina o cisteína, o mediante técnicas recombinantes convencionales. El término "conjugado", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que comprende o consiste esencialmente en al menos una primera proteína unida químicamente a otras sustancias, como una segunda proteína o un resto no proteináceo.

En el presente documento se describe adicionalmente un método para la preparación de una proteína de unión a Ig según la invención como se detalla anteriormente, comprendiendo dicho método los siguientes pasos: (a) preparar un ácido nucleico que codifica una proteína de unión como se define anteriormente; (b) introducir dicho ácido nucleico en un vector de expresión; (c) introducir dicho vector de expresión en una célula huésped; (d) cultivar la célula huésped; (e) someter la célula huésped a condiciones de cultivo en las que se expresa una proteína de unión a Ig, por lo que (e) producir una proteína de unión como se ha descrito anteriormente; opcionalmente (f) aislar la proteína producida en el paso (e); y (g) opcionalmente conjugar la proteína con matrices sólidas como se describe anteriormente.

La producción de la proteína de unión a Ig no natural puede realizarse mediante in vitro transcripción/traducción.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar más la invención. La invención, sin embargo, no se limita a ello, y los siguientes Ejemplos simplemente muestran la viabilidad de la invención sobre la base de la descripción anterior.

Ejemplo 1: Generación de proteínas de unión a IgG de la invención mediante un proceso de empalme

Las proteínas de unión a IgG de la invención se generaron inicialmente mediante un proceso de empalme de dominios de proteína A naturales y derivados de proteína A (por ejemplo, dominio Z u otros dominios con al menos un 90 % de identidad con cualquier dominio natural). El proceso de empalme comprendía los siguientes pasos: a) proporcionar secuencias de cinco dominios E, B, D, A y C de la proteína A de origen natural, y el dominio Z derivado de la proteína A; b) alineación de dichas secuencias; c) fragmentación estadística en silico para identificar subsecuencias que se pueden recombinar con la condición de que las posiciones Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, 131, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, P57 de un dominio de unión a Ig natural se mantienen y luego d) ensamblaje de nuevas secuencias artificiales de los diversos fragmentos para producir un producto de mosaico, es decir, una nueva secuencia de aminoácidos.

Las posiciones relativas de los aminoácidos en los productos del mosaico se mantuvieron con respecto a las secuencias iniciales. Al menos las posiciones Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, 131, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, P57 son idénticos entre las secuencias "empalmadas" y todos los dominios de Proteína A de origen natural. La secuencia de aminoácidos general de la proteína "empalmadas" reensamblada es artificial en el sentido de que no tiene más del 85 % de identidad con la secuencia de aminoácidos general de cualquiera de los dominios de la Proteína A o el dominio Z que se producen de forma natural. Por ejemplo, en la Tabla 1 se muestran las identidades de las proteínas de unión a Ig en comparación con los dominios de la Proteína A o el dominio Z de origen natural.

Tabla 1. Identidades de proteínas de unión de IgG a dominios de Proteína A naturales. "E, D, A, B, C, Z" se refiere a los dominios de Proteína A de origen natural y al dominio Z (SEQ ID NO: 3-8). Los números "9-30" se refieren a ejemplos de proteínas de unión a Ig de la invención. Por ejemplo, los números "9-24" se refieren a las SEQ ID NO correspondientes: 9-24, "25" se refieren a las SEQ ID NO: 26, "26" se refieren a las SEQ ID NO: 27, "27" se refieren a las SEQ ID NO: 28, y "28" se refieren a las SEQ ID NO: 30.

Los genes para las proteínas de unión a IgG "mezcladas", así como los dominios y derivados de la Proteína A de origen natural (p. ej., dominio C, dominio B, dominio A, dominio D, dominio E, dominio Z) se sintetizaron y clonaron en un vector de expresión E. coli utilizando métodos estándar conocidos por un experto en la materia. Se utilizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia correcta de los fragmentos insertados.

Para generar proteínas de unión a Ig que comprenden más de un dominio de unión, 2, 4 o 6 dominios de unión a IgG idénticos (SEQ ID NO: 14) se fusionaron genéticamente a través de conectores de aminoácidos (SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42). Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión se muestran en SEQ ID NO: 45-47.

Para la unión y purificación específicas de la membrana, un conector peptídico corto con Cys C-terminal (ASPAPSAPSAC; SEQ ID NO: 39) y una etiqueta Streptag (WSHPQFEK; SEQ ID NO: 44) se añadieron al extremo C de las proteínas de unión a Ig (por ejemplo, véase SEQ ID ^{n O :} 50 y SEQ ID NO: 51).

Ejemplo 2: Expresión de proteínas de unión a IgG

Se transformaron células competentes HMS174 (DE3) con cualquiera de los plásmidos de expresión que codificaban proteínas de unión a IgG. Las células se extendieron sobre placas de agar selectivo (kanamicina) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se inocularon precultivos de una sola colonia en 100 ml de medio súper rico (medio H15 modificado, 2 % de glucosa, 5 % de extracto de levadura, 1 % de ácidos casamino, 0,76 % de glicerol, 1 % de ARN de levadura Torula, 250 mM MOPS, 202 mM TRIS, 10 mg/ L RNase A, pH 7,4, Antifoam SE15) y se cultivó durante 16 horas a 37 °C a 160 rpm en un agitador orbital convencional en matraces Erlenmeyer de 1 L con deflectores suplementados con 150 |ig/ml de kanamicina sin lactosa y antiespumante. La lectura de DO⁶⁰⁰ debe estar en el rango de 6-12. El cultivo principal se inoculó a partir del cultivo anterior durante la noche con una DO⁶⁰⁰ inicial ajustada de 0,5 en 400 ml de medio súper rico en matraces Erlenmeyer de paredes gruesas de 1 L que se complementó con glicerol, glucosa, lactosa, agente antiespumante y 150 |ig/ml de kanamicina. Los cultivos se transfirieron a un mezclador acústico resonante (RAMbio) y se incubaron a 37 °C con 20 x g. La aireación fue facilitada por los tapones Oxy-Pump. La expresión de la proteína recombinante se indujo metabolizando la glucosa y, posteriormente, permitiendo que la lactosa entrara en las células. Se midió la DO⁶⁰⁰ en puntos de tiempo predefinidos, las muestras ajustadas a ⁵ /DO⁶⁰⁰ se retiraron, sedimentaron y congelaron a -20 °C. Las células se cultivaron durante la noche durante aproximadamente 24 horas para alcanzar una DO⁶⁰⁰ final de aproximadamente 45-60. Para recolectar la biomasa, las células se centrifugaron a 16000 x g durante 10 min a 20 °C. Se pesaron los sedimentos (peso húmedo) y se midió el pH en el sobrenadante. Las células se almacenaron a -20 °C antes del procesamiento.

Ejemplo 3 : Análisis de expresión SDS-PAGE y solubilidad de proteínas de unión a IgG

Las muestras tomadas durante la fermentación se resuspendieron en 300 |il de tampón de extracción (PBS suplementado con 0,2 mg/ml de lisozima, 0,5x BugBuster, 7,5 mM MgSO4, 40 U de benzonasa) y se solubilizaron mediante agitación en un termomezclador a 700 rpm, ta durante 15 min. Las proteínas solubles se separaron de las proteínas insolubles mediante centrifugación (16000 x g, 2 min, ta). Se retiró el sobrenadante (fracción soluble) y el sedimento (fracción insoluble) se resuspendió en una cantidad equivalente de tampón de urea (urea 8 M, Tris 0,2 M, EDTA 2 mM, pH 8,5). De la fracción soluble e insoluble se tomaron 50 |il y se añadieron 12 |il de tampón de muestra 5x, así como 5 |il de DTT 0,5 M. Las muestras se hirvieron a 95 °C durante 5 min. Finalmente, 8 ml de esas muestras se aplicaron a geles NuPage Novex 4-12 % Bis-Tris SDS que se procesaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y se tiñeron con Coomassie. Se encontró un alto nivel de expresión de todas las proteínas de unión a IgG en condiciones optimizadas dentro del período de tiempo elegido (Figura 3). Todas las proteínas de unión a Ig expresadas eran solubles en más del 95 % según SDS-PAGE.

Ejemplo 4 : Purificación de proteínas de unión a IgG

Todas las proteínas de unión a IgG se expresaron en la fracción soluble de E. coli con un StrepTagll C-terminal (WSH-PQFEK; SEQ ID NO: 44). Las células se lisaron mediante sonicación y el primer paso de purificación se realizó con columnas de Strep-Tactin de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para evitar la formación de disulfuro, los tampones se complementaron con DTT 1 mM. Las fracciones eluidas se inyectaron en un HiLoad 16/600 Superdex 75 pg (GE Healthcare) equilibrado con citrato 20 mM pH 6,0 y NaCl 150 mM. Las fracciones de los picos se agruparon y analizaron mediante SDS-PAGE.

Ejemplo 5: Las proteínas de unión a IgG se unen a IgG con altas afinidades (según lo determinado por ELISA)

Las afinidades de las proteínas de unión de IgG hacia IgG¹ o IgG² o IgG4 se determinaron utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Se inmovilizaron anticuerpos que contenían IgG¹, IgG² o IgG4 (p. ej., cetuximab para IgG¹, panitumumab para IgG² o natalizumab para IgG4) en una placa ELISA Nunc MaxiSorb de 96 pocillos (2 |ig/ml). Después de 16 h de incubación a 4 °C, los pocillos se lavaron tres veces con PBST (PBS 0,1 % Tween 20) y los pocillos se bloquearon con SAB al 3 % en PBS (2 h a temperatura ambiente). Los controles negativos fueron pozos bloqueados solo con SAB. Después del bloqueo, los pocillos se lavaron tres veces con PBST y se incubaron durante 1 h con la proteína de unión a IgG (en PBST) a temperatura ambiente. Después de la incubación, los pocillos se lavaron tres veces con PBST y posteriormente se incubaron con Strep-Tactin-HRP (1:10000) de IBA durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, los pocillos se lavaron tres veces con PBST y tres veces con PBS. La actividad de la peroxidasa de rábano picante se visualizó añadiendo sustrato TMB-Plus. Después de 30 min se detuvo la reacción añadiendo H²SO⁴ 0,2 M y se midió la absorbancia a 450 nm. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Análisis de unión de proteínas de unión a IgG (análisis de unión con Cetuximab; CID = número de identificación del clon.

Ejemplo 6 : Las proteínas de unión de IgG se unen a IgG con altas afinidades (según lo determinado con experimentos de resonancia de plasmones de superficie)

Se equilibró un chip sensor CM5 (GE Healthcare) con tampón de ejecución SPR. Los grupos carboxílicos expuestos en la superficie se activaron pasando una mezcla de EDC y NHS para producir grupos éster reactivos. 700-1500 RU en ligando se inmovilizó en una celda de flujo, el ligando se inmovilizó en otra celda de flujo. La inyección de etanolamina después de la inmovilización del ligando elimina la proteína de unión a Ig no unida covalentemente. Tras la unión del ligando, el analito proteico se acumuló en la superficie aumentando el índice de refracción Este cambio en el índice de refracción se midió en tiempo real y se graficó como unidades de respuesta o resonancia (UR) frente al tiempo. Los analitos se aplicaron al chip en diluciones en serie con un caudal adecuado (|il/min). Después de cada ejecución, la superficie del chip se regeneró con tampón de regeneración y se equilibró con tampón de ejecución. Las muestras de control se aplicaron a la matriz. La regeneración y el reequilibrio se realizaron como se mencionó anteriormente. Los estudios de unión se llevaron a cabo mediante el uso de Biacore® 3000 (GE Healthcare); la evaluación de los datos se realizó a través del software BIAe Evaluation 3.0, proporcionado por el fabricante, mediante el uso del modelo Langmuir 1:1 (Rl=0). Las constantes de disociación evaluadas ^{( K} d⁾ se estandarizaron contra el objetivo. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: Análisis de unión de proteínas de unión a IgG (análisis de unión con hlgG1-Fc; CID = número de identificación de^la clona .

Ejemplo 7 : Unión de proteínas de unión de IgG a una resina de acoplamiento SulfoLink y estabilidad alcalina de proteínas de unión de IgG inmovilizadas

Las proteínas de unión a IgG se acoplaron a la resina de acoplamiento SulfoLink® (Thermo; Cat. No. 20402) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El volumen del lecho de resina de la columna fue de 300 |il. La columna se equilibró con cuatro volúmenes de lecho de resina de tampón de acoplamiento (Tris 50 mM, EDTA-Na 5 mM, pH 8,5). La proteína de unión a IgG se añadió a la columna (1-2 ml/ml de resina de acoplamiento SulfoLink). Las proteínas de unión a IgG se acoplaron a la matriz a través de la cisteína en el extremo C (ASPAPSAPSAC; SEQ ID NO: 39). La columna se mezcló durante 15 minutos, se incubó otros 30 minutos sin mezclar y se lavó con tampón de acoplamiento. El flujo del sistema fue de 0,5 ml/min. Se añadieron a la columna 300 |il de solución de cisteína 50 mM, se mezcló durante 15 minutos, se incubó otros 30 minutos sin mezclar y se lavó con NaCI 1 M seguido de lavado con PBS.

Se midió la absorbancia a 280 nm para todas las fracciones. Todas las proteínas de unión a IgG podrían acoplarse covalentemente a la matriz; La Figura 6 muestra a modo de ejemplo el acoplamiento de las proteínas de unión a IgG 148470 (Figura 6A) y 148460 (Figura 6B) a la matriz de resina de acoplamiento SulfoLink.

Se aplicó cetuximab en cantidades saturadas (5 mg; 1 mg/ml de resina) a la columna de resina Sulfolink con proteína de unión a IgG acoplada covalentemente. La matriz se lavó con tampón de glicina 100 mM, pH 2,5 para eluir Cetuximab que se unió a la proteína de unión a IgG inmovilizada. La concentración de IgG eluida se midió espectroscópicamente para determinar la actividad de unión (capacidad de unión estática) de las proteínas de unión de Ig. Las fracciones de elución se analizaron a una absorbancia de 280 nm. La actividad de unión a IgG de las proteínas inmovilizadas se analizó antes y después de la incubación con NaOH 0,5 M durante 20, 40 u 80 minutos a temperatura ambiente. La actividad de unión a IgG de las proteínas inmovilizadas antes del tratamiento con NaOH se definió como 100 %. La actividad de unión a IgG de las proteínas se comparó con la actividad de los dominios naturales C, B, A, D, E o el dominio Z.

Figura 8 muestra la actividad de unión a IgG de las proteínas de unión a IgG 148462 (denominada "13" en la figura), 148463 (denominada "14" en la figura), 148472 (denominada "23" en la figura) y de forma natural que se producen en los dominios E, D, A, B, C de la Proteína A y del dominio Z. La actividad de unión a IgG se muestra después de la incubación con NaOH 0,5 M durante 80 min. Las proteínas de unión a IgG de la invención muestran una alta actividad de unión a Cetuximab después del tratamiento alcalino.

Ejemplo 8 : Estabilidad cáustica de las proteínas de unión a IgG acopladas a una matriz activada con epoxi

Las proteínas de unión a IgG purificadas se acoplaron a una matriz activada con epoxi (Sepharose 6B, GE; Cat. No. 17­ 0480-01) según las instrucciones del fabricante (condiciones de acoplamiento: pH 9,0 durante la noche, bloqueo durante 5 h con etanolamina). Se utilizó cetuximab como muestra de IgG (5 mg; matriz de 1 mg/ml). Se aplicó cetuximab en cantidades saturadas a la matriz que comprende proteína de unión a IgG inmovilizada. La matriz se lavó con tampón de glicina 100 mM, pH 2,5 para eluir el cetuximab que estaba unido a la proteína de unión a IgG inmovilizada. La concentración de IgG eluida se midió espectroscópicamente a 280 nm para determinar la actividad de unión (capacidad de unión estática) de las proteínas de unión de Ig. Las columnas se incubaron con NaOH 0,5 M durante 6 h a temperatura ambiente (22 °C /- 3 °C). La actividad de unión a IgG de las proteínas inmovilizadas se analizó antes y después de la incubación con NaOH 0,5 M durante 6 h. La actividad de unión a IgG de las proteínas inmovilizadas antes del tratamiento con NaOH se definió como 100 %. La Figura 9 muestra que la actividad de, por ejemplo, las proteínas de unión a IgG 154254 (denominada "SEQ ID 26" en la figura), 154255 (denominada "SEQ ID 27" en la figura), 154256 (denominada "SEQ ID 28" en la figura) y 154257 (denominada "SEQ ID 30" en la figura) fue mayor en comparación con la actividad de la proteína de unión a IgG 148463 ("SEQ ID 14") y, por lo tanto, mayor que cualquier dominio de Proteína A natural. Todas las proteínas de unión a IgG inmovilizadas mostraron al menos un 35 % hasta un 50 % de su actividad de unión a IgG original después de la incubación durante 6 h en NaOH 0,5 M. La Figura 10 muestra que la actividad de unión a Ig (capacidad) de las proteínas de unión a IgG multiméricas que consisten en 2, 4 o 6 dominios de unión a IgG inmovilizados en resina activada con epoxi después de un tratamiento alcalino durante 0, 2, 4, 6 horas es comparable a la actividad de unión (capacidad) de la proteína de unión a IgG monomérica que consta de un dominio de unión a IgG.

Listado de secuencias información de texto libre

SEQ ID NO: 1 secuencia genérica de dominio de unión a Ig no natural

SEQ ID NO: 2 secuencia genérica de dominio de unión a Ig no natural

SEQ ID NO: 3 Staphylococcus aureus dominio E (CID 148473)

SEQ ID NO: 4 Staphylococcus aureus dominio D (CID 148474)

SEQ ID NO: 5 Staphylococcus aureus dominio A (CID 148475)

SEQ ID NO: 6 Staphylococcus aureus dominio B (CID 148476)

SEQ ID NO: 7 Staphylococcus aureus dominio C (CID 148477)

SEQ ID NO: 8 dominio Z de proteína A (CID 148478)

SEQ ID NO: 9 secuencia de empalme iB9, CID 148458

SEQ ID NO: 10 secuencia de empalme IB10, CID 148459

SEQ ID NO: 11 secuencia de empalme IB11, CID 148460

SEQ ID NO: 12 secuencia de empalme IB12, CID 148461

SEQ ID NO: 13 secuencia de empalme IB13, CID 148462

SEQ ID NO: 14 secuencia de empalme IB14, CID 148463

SEQ ID NO: 15 secuencia de empalme IB15, CID 148464

SEQ ID NO: 16 secuencia de empalme IB16, CID 148465

SEQ ID NO: 17 secuencia de empalme IB17, CID 148466

SEQ ID NO: 18 secuencia de empalme IB18, CID 148467

SEQ ID NO: 19 secuencia de empalme IB19, CID 148468

SEQ ID NO: 20 secuencia de empalme IB20, CID 148469

SEQ ID NO: 21 secuencia de empalme IB21, CID 148470

SEQ ID NO: 22 secuencia de empalme IB22, CID 148471

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural que comprende uno o más dominios de unión a Ig no naturales, donde al menos un dominio de unión a Ig no natural comprende la secuencia de aminoácidos

X-iX2X3X4X5XeX7X8QQX11AFYEILHLPX21LTEX25QRX28AFIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46 EAX⁴⁹KLX⁵²X⁵³X⁵⁴QAPX⁵⁸ (SEQ ID NO: 38), donde

X ^I es N, V, P o A;

X² es D o A;

X3 es A, S o N;

X⁴ es K o Q;

X5 es H o F;

X6 es D, S o A;

X7 es E o K;

X8 es D, E o A;

X ^{I I} es S o N;

X²¹ es N, S o D;

X²⁵ es D o E;

X²⁸ es N, S o A;

X⁴⁰ es V, T o Q;

X⁴² es K o A;

X⁴³ es E o S;

X⁴⁴ es V, L o I;

X⁴⁶ es G o A;

X⁴⁹ es K o Q;

X⁵² es N, S o D;

X53 es D o E;

X⁵⁴ es S o A; y

X58 es K o P;

donde la constante de disociación K^d de dicha proteína de unión a Ig no natural a IgG1 humana es 1 |iM o menos, preferiblemente 100 nM o menos, y donde dicha proteína de unión a Ig no natural es estable en condiciones alcalinas.

2. La proteína de unión a Ig no natural según la reivindicación 1, donde dicha proteína de unión a Ig no natural comprende la secuencia de aminoácidos X¹X²AX⁴X⁵DX⁷X⁸QQX¹¹AFYEILHLPNLTEX²⁵QRNAFIQSLKDDPSX⁴⁰SX⁴²X⁴³X⁴⁴LX⁴⁶EA X⁴⁹KLNX⁵³X⁵⁴QAPK (SEQ ID NO: 48), donde

X ^I es N o V;

X² es D o A;

X⁴ es K o Q;

X5 es H o F;

X7 es E o K;

X8 es D, E o A;

X ^{I I} es S o N;

X²⁵ es D o E;

X⁴⁰ es V o Q;

X⁴³ es E o S;

X⁴² es K o A;

X⁴⁴ es V o I;

X⁴⁶ es G o A;

X⁴⁹ es K o Q;

X53 es D o E; y

X⁵⁴ es S o A.

3. La proteína de unión a Ig no natural según la reivindicación 1, donde dicha proteína de unión a Ig no natural comprende la secuencia de aminoácidos X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸QQX¹¹AFYEILHLPX²¹LTEDQRX²⁸AFIQSLKDDPSX⁴⁰SKX⁴³X⁴⁴LGEAK KLX⁵²DAQAPP (SEQ ID NO: 49), donde

X¹ es P, N o A;

X² es A o D;

X3 es A, S o N;

X⁴ es K o Q;

X5 es H o F;

X6 es D, S o A;

X⁷ es K o E;

X8 es D, E o A;

X¹¹ es S o N;

X²¹ es N, S o D;

X²⁸ es S o A;

X⁴⁰ es V o T;

X⁴³ es E o S;

X⁴⁴ es I o L; y

X⁵² es N, S o D.

4. La proteína de unión a Ig no natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde al menos un dominio de unión a Ig no natural comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

NAAQHAKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO: 9), NAAQHDKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 10), NAAQHSKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 11), NAAQHSKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 12), PAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 13), PAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 14), ADNKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 15), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO: 16), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 17), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPDLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 18), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO 19), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO: 20), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLDDAQAPP (SEQ ID NO: 21), ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLSDAQAPP (SEQ ID NO: 22), PAAKHDKDQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO: 23), NAAQHDKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 24), ADNKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO 25), NAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP (SEQ ID NO: 26), NAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO 27), NAAKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEVLGEAQKLNDSQAPK (SEQ ID NO: 28), QQAQHDEAQQSAFYQVLHLPNLTADQRNAFIQSLKDDPSQSAEVLGEAQKLNDSQAP (SEQ ID NO: 29), y VDAQHDEDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSAEILAEAKKLNESQAPK (SEQ ID NO: 30).

5. La proteína de unión a Ig no natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde los dominios de unión a Ig no natural 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 están enlazados entre sí.

6. La proteína de unión a Ig no natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha proteína de unión a Ig no natural comprende un sitio de unión específico para la unión covalente específica del sitio a una fase sólida.

7. Una composición que comprende la proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, preferiblemente donde la composición es una matriz de separación por afinidad.

8. Uso de la proteína de unión a Ig no natural de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de la composición de la reivindicación 7 para la purificación por afinidad de inmunoglobulinas.

9. Un método de purificación por afinidad de inmunoglobulinas que comprende los pasos de

a. proporcionar un líquido que contiene una inmunoglobulina;

b. proporcionar una matriz de separación por afinidad que comprende una proteína de unión a Ig no natural inmovilizada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

c. poner en contacto dicho líquido y dicha matriz de separación por afinidad, donde dicha inmunoglobulina se une a dicha proteína inmovilizada; y

d. eluir dicha inmunoglobulina de dicha matriz, preferiblemente mediante un cambio en el pH o un cambio en la concentración de sal, obteniendo así un eluato que contiene dicha inmunoglobulina; y

e. opcionalmente comprende además uno o más pasos de lavado llevados a cabo entre los pasos (c) y (d).

10. El método según la reivindicación 9, donde la inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en fragmentos de inmunoglobulina IgG1 humana, IgG2 humana, IgG4 humana, IgM humana, IgA humana, IgG1 de ratón, IgG2A de ratón, IgG2B de ratón, IgG3 de ratón, IgG1 de rata, IgG2C de rata, IgG1 de cabra, IgG2 de cabra, IgG2 bovina, IgG de cobaya, IgG de conejo, que comprenden la región Fc, proteínas de fusión que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina y conjugados que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina.

11. Un método de generación de una proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde al menos un dominio de unión a Ig se puede obtener mediante un proceso de empalme de al menos dos dominios de unión a Ig de origen natural a partir de una proteína de unión a Ig de origen natural.

12. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

13. Una célula huésped o un huésped no humano que comprende la proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un ácido nucleico como se define en la reivindicación 12.

14. Un método para la producción de una proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende el(los) paso(s):

a. cultivar la célula huésped de la reivindicación 13 en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de unión con el fin de obtener dicha proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural; y

b. opcionalmente aislar dicha proteína de unión a inmunoglobulina (Ig) no natural.