JP2021512085A - C末端螺旋領域にシステインを有するfc結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
以下に本発明を詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、及び試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態をただ説明することを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
本発明の実施形態
驚くべきことに、ヘリックス3の、特にFc結合ドメインの43、46、47、50、51、又は53位からなる群から選択されるアミノ酸位置のシステインは、図及び実施例に示されるように、43、46、47、50、51、又は53位にシステインを有しないドメインと比較して、Fc結合ドメインのアルカリ安定性を増加させ、Fc結合タンパク質のマトリックスへの部位特異的カップリングを改善し、これにより能力が改善される。
1位のアミノ酸がIから選択されるか又は欠失され、2位のアミノ酸(X2)が、A又はDから選択されるか又は欠失され、3位のアミノ酸がAから選択されるか又は欠失され、4位のアミノ酸(X4)が、K又はQから選択されるか又は欠失され、5位のアミノ酸(X5)が、H又はFから選択され、7位のアミノ酸(X7)が、K又はEから選択され、8位のアミノ酸(X8)が、D、A、又はEから選択され、11位のアミノ酸(X11)が、A、S、I、又はEから選択され、25位のアミノ酸(X25)が、D又はEから選択され、35位のアミノ酸(X35)が、R又はIから選択され、40位のアミノ酸(X40)が、Q、T、又はVから選択され、43位のアミノ酸(X43)が、E、S、又はCから選択され、44位のアミノ酸(X44)が、I、L、又はVから選択され、46位のアミノ酸(X46)が、G、A、又はCから選択され、47位のアミノ酸(X47)が、E又はCから選択され、49位のアミノ酸(X49)が、K又はQから選択され、50位のアミノ酸(X50)が、K又はCであり、51位のアミノ酸(X51)が、L又はCであり、53位のアミノ酸(X53)が、D、E、又はCから選択され、54位のアミノ酸(X54)が、A又はSから選択され、57位のアミノ酸が、Pから選択されるか又は欠失され、58位のアミノ酸(X58)が、P又はKから選択されるか又は欠失される、IX2AX4X5DX7X8QQX11AFYEILHLPNLTEX25QRNAFIQSLX35DDPSX40SLX43X44LX46X47AX49X50X51NX53X54QAPX58。本発明のFc結合タンパク質は、次の43、46、47、50、51、又は53位のうちの1つにシステインを有する。本発明のFc結合ドメインの選択された例としては、例えば、限定されないが、配列番号17〜73、90〜95が挙げられる。
次の実施例は、本発明の更なる説明のために提供される。しかしながら、本発明はこれらに限定されるものではなく、次の実施例は、上の説明に基づいて本発明の実用性を単に示すものである。
最初に、天然に存在するプロテインAドメイン(E、B、D、A、C、Z)のシャッフリングプロセスによって、Fc結合タンパク質を生成した。より詳細には、本明細書で理解されるシャッフリング処理は、1組の非同一の既知のアミノ酸配列から開始する人工アミノ酸配列をもたらすアセンブリプロセスである。シャッフリング処理を、次のステップ:a)5つの天然に存在するプロテインAドメインE、B、D、A、及びC、並びにプロテインAバリアントドメインZの配列の提供、b)当該配列のアラインメント、c)再度組み合わせられたサブ配列を同定するためのインシリコでの統計的断片化、次いでd)モザイク生成物、すなわち、新規の人工的なアミノ酸配列を生成するための、様々な断片の新たな人工配列へのアセンブリ、で構成した。ステップc)で生成した断片は、任意の長さのものであり、例えば、断片化した親配列が長さnを有する場合、断片は長さ1〜n−1であった。
部位特異的変異導入のために、Q5(登録商標))部位特異的変異導入キット(NEB、カタログ番号E0554S)を、製造元の取扱説明書に従って使用した。各特定の置換のそれぞれをコードするオリゴヌクレオチド及びテンプレートを含有するプラスミドを用いて、PCRを実行した。生成物をライゲーションし、電気穿孔法を介してE.coliXL2−青色細胞(Stratagene)に形質転換した。単一のコロニーを単離し、クローンを含有するインサートにDNAシーケンシングを使用して、正しい配列を確認した。
BL21(DE3)コンピテントセルを、Fc結合タンパク質をコードする発現プラスミドで形質転換した。細胞を選択的な寒天プレート(カナマイシン)上に広げ、37℃で一晩培養した。ラクトース及び消泡剤を含まない150μg/mLのカナマイシンを補充したバッフル付き1L三角フラスコ内で、100mLの2xYT培地に単一のコロニーからのプレ培養物を接種し、従来的なオービタルシェーカで、37℃、160rpmで16時間培養した。OD600読も出し値は、6〜12の範囲であるべきである。150μg/mLのカナマイシンを補充した1L三角フラスコ内の、400mLの高濃度培地(改変したH15培地(2%のグルコース、5%の酵母抽出物、0.89%のグリセロール、0,76%のラクトース、250mMのMOPS、202mMのTRIS、pH7.4、消泡剤SE15))中に、前述の一晩培養物からの主な培養物を0.5の開始OD600に調節して接種した。培養物を共振音響ミキサ(RAMbio)に移し、37℃、20×gで培養し、酸素ポンプストッパ(Oxy−Pump stopper)によって通気を促進した。組み換えタンパク質発現は、グルコースを代謝させ、続いてラクトースを細胞に入れることによって誘導した。所定の時点でOD600を測定し、5/OD600に調節した試料を回収し、ペレット化し、−20℃で凍結させた。細胞を一晩およそ24時間増殖させて、約45〜60の最終OD600に到達させた。バイオマスを収集するために、20℃、16000×gで10分間、細胞を遠心分離した。ペレットを秤量し(湿潤重量)、上清中でpHを測定した。処理前に細胞を−20℃で保存した。
発酵中に採取した試料を、300μLの抽出緩衝液(0.2mg/mLのリゾチーム、0.5×BugBuster、7.5mMのMgSO4、40Uのベンゾナーゼを補充したPBS)に再懸濁し、700rpm、室温で15分間、熱ミキサで撹拌することによって可溶化した。可溶性タンパク質を、遠心分離(16000×g、2分、室温)で不溶性タンパク質から分離した。上清(可溶性画分)を回収し、ペレット(不溶性画分)を当量の尿素緩衝液(8Mの尿素、0.2MのTris、2mMのEDTA、pH8.5)に再懸濁した。可溶性画分及び不溶性画分の両方から50μLを採取し、12μLの5x試料緩衝液、並びに5μLの0.5MのDTTを添加した。試料を95℃で5分間沸騰させた。最後に、8μLのこれらの試料をNuPage Novex4〜12%Bis−Tris SDSゲルに適用し、製造元の推奨に従って泳動し、クマシーで染色した。選択された期間内の最適化条件下で、全てのFc結合タンパク質の高レベルの発現が見出された(データは示さず)。SDS−PAGEによると、全ての発現したFc結合タンパク質は、95%超可溶性であった。
C末端StrepTagII(WSHPQFEK)を有するE.coliの可溶性画分に、Fc結合タンパク質を発現させた。細胞を2回の凍結/解凍サイクルによって溶解させ、製造元(IBA(Goettingen,Germany))の取扱説明書に従ってStrep−Tactin(登録商標)樹脂を用いて精製ステップを実施した。ジスルフィド形成を回避するために、緩衝液に1mMのDTTを補充した。
IgG1又はIgG2、又はIgG4に対する、Fc結合タンパク質の親和性を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して判定した。抗体(例えば、IgG1ではセツキシマブ、IgG2ではパニツムマブ、又はIgG4ではナタリズマブ)を含有するIgG1又はIgG2又はIgG4を、96ウェルNunc MaxiSorb ELISAプレート上に固定化した(2μg/mL)。4℃で16時間培養した後、ウェルをPBST(PBS+0.1%のTween20)で3回洗浄し、ウェルをPBS中3%のBSAで遮断した(室温で2時間)。陰性対照のウェルは、BSAのみで遮断した。遮断後、ウェルをPBSTで3回洗浄し、室温でFc結合タンパク質(PBST中)と共に1時間培養した。培養後、ウェルをPBSTで3回洗浄し、続いてStrep−Tactin−HRP(1:10000)(IBA(Goettingen,Germany))と共に室温で1時間培養した。その後、ウェルをPBSTで3回、PBSで3回洗浄した。TMB−Plus基質を添加することにより、西洋ワサビペルオキシダーゼの活性を可視化した。30分後、0.2MのH2SO4を添加することによって反応を停止させ、吸光度を450nmで測定した。例えば、ELISAを介して判定される際、ヒトIgG1のKDは、IB14では4.9nM、ドメインZでは3.4nM、ドメインBでは3.1nM、ドメインCでは2.8nMである。
1つのCM5センサチップ(GE Healthcare)をSPR泳動用緩衝液で平衡化した。EDCとNHSとの混合物を通過させることによって、表面に露出したカルボン酸基を活性化して反応性エステル基を得た。700〜1500RUオンリガンドをフローセル上に固定化し、オフリガンドを別のフローセル上に固定化した。リガンド固定化後のエタノールアミンの注入により、非共有結合Fc結合タンパク質を除去する。リガンド結合の際に、タンパク質分析物は、表面上に蓄積し、屈折率を増加させた。この屈折率の変化をリアルタイムで測定し、応答又はレゾナンスユニット(resonance unit、RU)対時間としてプロットした。分析物を、好適な流量(μL/分)で連続希釈してチップに適用した。各実行後、チップ表面を再生バッファ緩衝液で再生し、泳動用緩衝液で平衡化した。対照試料をマトリックスに適用した。再生及び再平衡化は、前述のように実施した。Biacore(登録商標)3000(GE Healthcare)を25℃で使用することにより、結合研究を実行し、製造元によって提供されるBIAevaluation3.0ソフトウェアを介して、Langmuirの1:1モデル(RI=0)を使用することによって、データ評価を行った。評価された解離定数(KD)は、ヒトIgG1−Fc、セツキシマブ(IgG1)、ナタリズマブ(IgG4)、又はパニツムマブ(IgG2)の異なる人工Fc結合タンパク質のオフターゲット及びKD値に対して標準化され、表1に示される。
精製したFc結合タンパク質を、エポキシ活性化マトリックス(セファロース6B、GE;カタログ番号17−0480−01)に、製造元の取扱説明書に従って(カップリング条件:pH9.0、一晩、エタノールアミンで5時間遮断)、カップリングした。セツキシマブをIgG試料として使用した(5mg、1mg/mLマトリックス)。セツキシマブを、固定化Fc結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。マトリックスを100mMグリシン緩衝液(pH2.5)で洗浄して、固定化IgG−結合タンパク質に結合したセツキシマブを溶出させた。Fc結合タンパク質の結合活性を判定するために、溶出したIgGの濃度を、BLI(基準としてのプロテインA Octet−sensors及びセツキシマブの定量化)によって測定した。
カラムを、室温(22℃+/−3℃)で0時間、6時間、18時間、24時間、36時間、又は72時間、0.5MのNaOHで培養した。0.5MのNaOHでの培養前及び培養後に、固定化タンパク質のIg結合活性を分析した。NaOH処理前の固定化タンパク質のIg結合活性を、100%と定義した。6時間連続の0.5MのNaOH処理後の、IB14バリアント(配列番号74〜77)の残留するIgG結合活性を、図3Aに示す。図3Bは、0時間、18時間、又は72時間連続の0.5MのNaOH処理後のcs14 46C、cs14 43C、cs14、及び市販のプロテインAの苛性安定性を示す。タンパク質を、30℃で2時間、エポキシセファロースに固定化した(4500nmol/ml)。動的結合能DBC10%を、5分の滞留時間で判定した。19,5mg/mlのCs14 46Cは、72時間連続の0.5のNaOH処理後の最高DBC10%を示し、これは市販のプロテインAで測定された値よりも20%超高い。図4は、6、24、及び36時間連続の0.5MのNaOH処理後の、cs26(配列番号7)及び野生型ドメインC(配列番号84)と比較した、cs26 46C(配列番号27)の残留する結合能を示す。cs26 A46C(単量体又は二量体)の結合能は、少なくとも36時間0.5MのNaOH培養後、>20%のままである(表2を参照されたい)。
精製したFc結合タンパク質を、アガロース系クロマトグラフィビーズ(Praesto(登録商標)Pure45、Purolite、カタログ番号PR01262−166)に、製造元の取扱説明書に従って(カップリング条件:pH9.5、3時間、35℃、4.1MのNaSO4、エタノールアミンで一晩遮断)カップリングした。ポリクローナルヒトIgG Gammanorm(登録商標)(Ocatpharm)(濃度2,2mg/ml)をIgG試料として使用した。ポリクローナルhIgG試料を、固定化Fc結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。マトリックスを100mMのクエン酸緩衝液(pH2.0)で洗浄し、固定化Fc結合タンパク質に結合したhIgGを溶出させた。cs26 46C(単量体及び二量体(配列番号27、32)の動的結合能を、6分の滞留時間で10%破過時の注入したhIgGの質量により、組み換え野生型プロテインAと比較して判定した。図5は、Cs26 46Cが、6分の滞留時間で、組み換えプロテインAよりも61.2%高いDBCを有することを示す。
精製したFc結合タンパク質(cs2646 C)を、製造元の取扱説明書に従って、アガロース系クロマトグラフィビーズ(Praesto(登録商標)Pure45又はPure5)にカップリングした。ポリクローナルヒトIgG Gammanorm(登録商標)及びモノクローナルIgG1抗体セツキシマブを、DBC10%まで充填してIgG試料として使用した(濃度2.2mg/ml)。ポリクローナルhIgG試料を、固定化Fc結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。2ステッププロセスでは、まず、マトリックスを100mMのクエン酸緩衝液(pH3.5)で、次いで、100mMのクエン酸緩衝液(pH2.0)で洗浄して、固定化Fc結合タンパク質に結合したhIgGを溶出させた。表3は、pH3.5で、結合したIgGのほぼ100%が、cs26 46Cをカップリングしたビーズから溶出されたことを示す。
Claims (14)
- 1つ以上のドメインを含む、Fc結合タンパク質であって、配列番号2に対応する43位のアミノ酸、46位のアミノ酸、47位のアミノ酸、50位のアミノ酸、51位のアミノ酸、又は53位のアミノ酸が、システインである、Fc結合タンパク質。
- 少なくとも1つのドメインが、配列番号2のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも89.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2に対応する43位のアミノ酸、46位のアミノ酸、47位のアミノ酸、50位のアミノ酸、51位のアミノ酸、又は53位のアミノ酸が、システインである、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 少なくとも1つのドメインが、配列番号3〜16のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも89.5%の同一性をそれぞれ有するアミノ酸配列を含み、配列番号3〜16に対応する43位のアミノ酸、46位のアミノ酸、47位のアミノ酸、50位のアミノ酸、51位のアミノ酸、又は53位のアミノ酸が、システインである、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 少なくとも1つのドメインが、配列番号7〜8のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも89.5%の同一性をそれぞれ有するアミノ酸配列を含み、配列番号7〜8に対応する43位のアミノ酸、46位のアミノ酸、47位のアミノ酸、50位のアミノ酸、51位のアミノ酸、又は53位のアミノ酸が、システインである、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 少なくとも1つのドメインが、配列番号17〜86、90〜95の群から選択されるアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも89.5%の同一性をそれぞれ有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 前記ドメインが、そのN末端の最初の4つのアミノ酸内に1、2、若しくは3つのアミノ酸の欠失、又はそのC末端の最初の2つのアミノ酸内に1若しくは2つのアミノ酸の欠失の少なくとも一つを有する、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 前記Fc結合タンパク質が、互いに連結した2、3、4、5、6、7、又は8つのドメインを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質。
- 前記Fc結合タンパク質が、ホモ多量体又はヘテロ多量体である、請求項7に記載のFc結合タンパク質。
- 1つ以上のドメインが、直接、又は1つ以上のリンカー、好ましくはペプチドリンカーで互いに連結している、請求項8に記載のFc結合タンパク質。
- 前記Fc結合タンパク質が、好ましくは43、46、47、50、51、又は53位の前記システインを介して、固体支持体にコンジュゲートされている、請求項1〜9のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質。
- 前記Fc結合タンパク質が、Fc領域を含むIgG1、IgG2、IgG4、IgM、IgA、Ig断片、IgのFc領域を含む融合タンパク質、及び前記IgのFc領域を含むコンジュゲートに結合する、請求項1〜10のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質を含む、親和性分離マトリックス。
- Fc配列を含む任意のタンパク質の親和性精製のための、請求項1〜11のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質又は請求項12に記載の親和性分離マトリックスの使用。
- Fc配列を含むタンパク質の親和性精製方法であって、前記親和性精製方法が、(a)Fc配列を含むタンパク質を含有する液体を提供することと、(b)親和性分離マトリックスにカップリングされた、請求項1〜11のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質の少なくとも1つを含む、親和性分離マトリックスを提供することと、(c)請求項1〜11のいずれか一項に記載のFc結合タンパク質の少なくとも1つが、Fc配列を含むタンパク質に結合することを可能にする条件下で、前記親和性分離マトリックスを前記液体と接触させることと、(d)前記親和性分離マトリックスからFc配列を含む前記タンパク質を溶出させることと、を含む、方法。
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