KR20200116963A - C-말단 나선형 영역 내에 시스테인을 갖는 Fc 결합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 C-말단 나선형 영역 내에 시스테인을 갖는 하나 이상의 도메인을 포함하는 Fc 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 Fc 결합 단백질을 포함하는 친화성 매트릭스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역글로불린의 친화성 정제를 위한 이들 Fc 결합 단백질 또는 친화성 매트릭스의 용도, 및 본 발명의 Fc 결합 단백질을 사용하는 친화성 정제 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 C-말단 나선형 영역 내에 시스테인을 갖는 하나 이상의 도메인을 포함하는 Fc 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 Fc 결합 단백질을 포함하는 친화성 매트릭스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역글로불린의 친화성 정제를 위한 이들 Fc 결합 단백질 또는 친화성 매트릭스의 용도, 및 본 발명의 Fc 결합 단백질을 사용하는 친화성 정제 방법에 관한 것이다.
많은 생물공학적 및 약제학적 응용은 항체를 함유하는 샘플로부터 오염물을 제거하는 것을 필요로 한다. 항체를 포획하고 정제하기 위한 것으로 확립된 절차는 면역글로불린에 대한 선택적 리간드로서 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래되는 세균 세포 표면 단백질 A를 사용하는 친화성 크로마토그래피이다(예를 들어, 문헌[review by Huse et al., J. Biochem. Biophys. Methods 51, 2002: 217-231] 참조). 야생형 단백질 A는 높은 친화도 및 선택성으로 IgG 분자의 Fc 영역에 결합하고, 고온에서 그리고 넓은 범위의 pH 값에서 안정하다. 알칼리 안정성과 같은 개선된 특성을 갖는 단백질 A의 변이체가 항체를 정제하는 데 이용가능하며, 단백질 A 리간드를 포함하는 다양한 크로마토그래피 매트릭스가 구매가능하다. 그러나, 특히 야생형 단백질 A 기반 크로마토그래피 매트릭스는 알칼리성 조건에 대한 노출 후에 면역글로불린에 대한 결합 능력(binding capacity)의 손실을 나타낸다.
본 발명의 근저에 있는 기술적 문제
항체 또는 Fc-함유 융합 단백질에 대한 대부분의 대규모 생산 공정은 친화성 정제를 위하여 단백질 A를 사용한다. 그러나, 친화성 크로마토그래피에서의 단백질 A 응용에 대한 제한으로 인해, 면역글로불린의 친화성 정제를 용이하게 하기 위하여 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 개선된 특성을 갖는 신규한 Fc 결합 단백질을 제공할 필요성이 당업계에 존재한다. Fc 결합 단백질을 포함하는 크로마토그래피 매트릭스의 가치를 최대한으로 이용하기 위하여, 친화성 리간드 매트릭스를 다수회 사용하는 것이 바람직하다. 크로마토그래피 사이클간에, 매트릭스 상의 잔류 오염물의 위생처리(sanitization) 및 제거를 위해 확실한 세정 절차가 필요하다. 이 절차에서는, 높은 농도의 NaOH를 함유하는 알칼리성 용액을 친화성 리간드 매트릭스에 적용하는 것이 일반적인 관행이다. 야생형 단백질 A 도메인은 장기간 동안 그러한 가혹한 알칼리성 조건을 견딜 수 없고, 면역글로불린에 대한 결합 능력을 빠르게 상실한다. 따라서, Fc 서열을 포함하는 단백질에 결합할 수 있는 신규한 단백질을 얻을 필요성이 이 분야에 계속 존재한다.
본 발명은, 면역글로불린의 친화성 정제에 특히 매우 적합하지만 종래 기술의 불리한 점을 극복하는 Fc 결합 단백질을 제공한다. 특히, 본 발명의 Fc 결합 단백질의 상당한 이점은 높은 동적 결합 능력과 조합하여 Fc 결합 능력을 감소시키지 않고서 장기간 동안 높은 pH에서의 그들의 개선된 안정성이다. 또한, 신규한 Fc 결합 단백질은 3.5 이상의 pH에서, 매트릭스에 고정화된 Fc 결합 단백질로부터 결합된 Fc 단백질의 95% 초과의 용리를 가능하게 한다.
상기 개요는 본 발명에 의해 해결되는 모든 문제를 반드시 기술하는 것은 아니다.
본 발명의 제1 태양은 친화성 정제에 적합한 Fc 결합 단백질을 제공하는 것이다. 이것은, 적어도 서열 번호 2에 상응하는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53의 아미노산이 시스테인인, 하나 이상의 Fc 결합 도메인을 포함하는 Fc 결합 단백질에 의해 달성된다. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 하나 이상의 Fc 결합 도메인을 포함하며, 적어도 하나의 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지거나, 또는 적어도 서열 번호 2에 상응하는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53의 아미노산이 시스테인인, 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 도메인은 서열 번호 3 내지 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지거나, 또는 적어도 서열 번호 3 내지 16에 상응하는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53의 아미노산이 시스테인인, 상기 아미노산 서열들과 각각 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 도메인은 서열 번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지거나, 또는 적어도 서열 번호 7 또는 8에 상응하는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53의 아미노산이 시스테인인, 상기 아미노산 서열들과 각각 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 도메인은 서열 번호 17 내지 77, 서열 번호 90 내지 95의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다.
제2 태양에서, 본 발명은 제1 태양의 Fc 결합 단백질을 포함하는 친화성 분리 매트릭스에 관한 것이다.
제3 태양에서, 본 발명은 면역글로불린 또는 면역글로불린의 Fc 부분을 포함하는 단백질의 친화성 정제를 위한 제1 태양의 Fc 결합 단백질 또는 제2 태양의 친화성 분리 매트릭스의 용도에 관한 것이다.
제4 태양에서, 본 발명은 면역글로불린 또는 면역글로불린의 Fc 부분을 포함하는 단백질의 친화성 정제 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 면역글로불린을 함유하는 액체를 제공하는 단계; (b) 친화성 분리 매트릭스를 제공하는 단계로서, 상기 친화성 분리 매트릭스는 상기 친화성 분리 매트릭스에 결합된 제1 태양의 고정화된 Fc 결합 단백질을 포함하는, 상기 단계; (c) 상기 액체와 상기 친화성 분리 매트릭스를 접촉시키는 단계로서, 상기 면역글로불린은 상기 고정화된 Fc 결합 단백질에 결합하는, 상기 단계; 및 (d) 상기 매트릭스로부터 상기 면역글로불린을 용리시켜 상기 면역글로불린을 함유하는 용리액을 얻는 단계를 포함한다. 본 발명의 이러한 요약은 반드시 본 발명의 모든 특징을 기술하는 것은 아니다. 다른 실시 형태가 하기의 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
도 1. C-말단 나선형 영역 내에 시스테인을 갖는 Fc 결합 도메인의 아미노산 서열. 상단 행의 숫자는 Fc 결합 도메인에서의 상응하는 아미노산 위치를 지칭한다. 도 1a. 서열 번호 2의 Fc 결합 도메인. 도 1b. 나선 3 내에 Cys를 갖는 Fc 결합 도메인에 대한 예
도 2. 나선 3 내에 시스테인을 갖는 Fc 결합 도메인의 고정화. 도 2a. 에폭시 매트릭스 상에서의 위치 43, 46, 47, 50, 또는 58에 시스테인을 갖는 IB14 단백질의 결합 효율. Y-축: 단백질의 결합량 [mmol/ml]. 도 2b. 에폭시-활성화된 세파로스 6B 매트릭스에 대한 cs14 43C 및 cs14 46C의 결합 Y-축: n(수지 1 ml당 단백질) [mmol]
도 3. C-말단 영역 3 내에 시스테인을 갖는 Fc 결합 단백질의 가성 안정성(caustic stability). 도 3a. 위치 43, 46, 47, 50, 또는 58에 시스테인을 갖는 IB14의 알칼리 안정성의 분석. Y-축: Fc 결합 단백질 IB14 및 Cys 변이체의 잔존 IgG 결합 활성 (%). 회색 컬럼: 0.5 M NaOH의 6시간 연속 처리 후의 IgG 결합 활성. 검정색 컬럼: NaOH가 없는 상태에서의 IgG 결합 활성. 도 3b. 위치 43 또는 46에 시스테인을 갖는 cs14의 가성 안정성 및 DBC 10%. Y-축: DBC 10%(mg/ml). 검정색: DBC 10%(mg/ml), 0시간 NaOH, 연회색: DBC 10%(mg/ml), 18시간 NaOH, 암회색: DBC 10%(mg/ml), 72시간 NaOH. Cys 변이체들을 C-말단에 시스테인을 갖는 cs14 및 단백질 A와 대비하였다.
도 4. cs26 46C에 대한 0.5 M NaOH의 6, 24, 및 36시간의 연속 처리 후의 잔존 결합 능력(단위: %)이 위치 46에 Cys를 갖지 않는 cs26과 대비하여 그리고 야생형 단백질 A 도메인 C와 대비하여 나타나 있다. X-축은 0.5 M NaOH의 인큐베이션 시간(단위: hr)을 나타낸다.
도 5. cs26 46C(단량체 및 이량체)에 대한 동적 결합 능력(DBC; mg/ml)이 위치 46에 Cys를 갖지 않는 cs26과 대비하여 그리고 재조합 야생형 단백질 A와 대비하여 나타나 있다.
도 2. 나선 3 내에 시스테인을 갖는 Fc 결합 도메인의 고정화. 도 2a. 에폭시 매트릭스 상에서의 위치 43, 46, 47, 50, 또는 58에 시스테인을 갖는 IB14 단백질의 결합 효율. Y-축: 단백질의 결합량 [mmol/ml]. 도 2b. 에폭시-활성화된 세파로스 6B 매트릭스에 대한 cs14 43C 및 cs14 46C의 결합 Y-축: n(수지 1 ml당 단백질) [mmol]
도 3. C-말단 영역 3 내에 시스테인을 갖는 Fc 결합 단백질의 가성 안정성(caustic stability). 도 3a. 위치 43, 46, 47, 50, 또는 58에 시스테인을 갖는 IB14의 알칼리 안정성의 분석. Y-축: Fc 결합 단백질 IB14 및 Cys 변이체의 잔존 IgG 결합 활성 (%). 회색 컬럼: 0.5 M NaOH의 6시간 연속 처리 후의 IgG 결합 활성. 검정색 컬럼: NaOH가 없는 상태에서의 IgG 결합 활성. 도 3b. 위치 43 또는 46에 시스테인을 갖는 cs14의 가성 안정성 및 DBC 10%. Y-축: DBC 10%(mg/ml). 검정색: DBC 10%(mg/ml), 0시간 NaOH, 연회색: DBC 10%(mg/ml), 18시간 NaOH, 암회색: DBC 10%(mg/ml), 72시간 NaOH. Cys 변이체들을 C-말단에 시스테인을 갖는 cs14 및 단백질 A와 대비하였다.
도 4. cs26 46C에 대한 0.5 M NaOH의 6, 24, 및 36시간의 연속 처리 후의 잔존 결합 능력(단위: %)이 위치 46에 Cys를 갖지 않는 cs26과 대비하여 그리고 야생형 단백질 A 도메인 C와 대비하여 나타나 있다. X-축은 0.5 M NaOH의 인큐베이션 시간(단위: hr)을 나타낸다.
도 5. cs26 46C(단량체 및 이량체)에 대한 동적 결합 능력(DBC; mg/ml)이 위치 46에 Cys를 갖지 않는 cs26과 대비하여 그리고 재조합 야생형 단백질 A와 대비하여 나타나 있다.
정의
본 발명을 하기에 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않음이 이해되어야 하는데, 그 이유는, 이들은 변동될 수 있기 때문이다. 또한, 본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태를 설명하기 위한 것이며, 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범주를 제한하고자 하지 않음이 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 본 명세서에 사용된 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, 
(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)]에 제공된 정의와 일치한다.
본 명세서 및 후술되는 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 변형 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 어떠한 다른 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제하지는 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 상호교환 가능하게 사용되며, 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수 형태를 역시 포함하고 각각의 의미 내에 속하는 것으로 의도된다. 또한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "및/또는"은 열거된 항목들 중 하나 이상의 임의의 그리고 모든 가능한 조합뿐만 아니라, 대안적인("또는")으로 해석될 때의 조합의 결여를 지칭하며 이를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 명시적으로 언급된 양뿐만 아니라 그로부터 ±10%의 편차를 포함한다. 더 바람직하게는, 편차 5%가 용어 "약"에 의해 포함된다.
몇몇 문헌(예를 들어, 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조자의 사양 등)이 본 명세서의 본문 전체에 걸쳐 인용된다. 여기서의 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 개시보다 선행되지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에 인용된 문헌들 중 일부는 "참고로 포함된" 것으로 특징지어진다. 그러한 포함된 참고문헌의 정의 또는 교시와 본 명세서에 인용된 정의 또는 교시 사이에 충돌이 있는 경우에는, 본 명세서의 본문이 우선한다.
본 명세서에 언급되어 있는 모든 서열은 첨부된 서열 목록에 개시되어 있으며, 그의 전체 내용 및 개시내용은 본 명세서의 일부이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "Fc 결합 단백질" 또는 "면역글로불린-결합 단백질" 또는 "Ig 결합 단백질"은 면역글로불린의 Fc 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 기술하는 데 사용된다. 본 명세서에서 이해되는 바와 같이, "면역글로불린"은 포유류 IgG, 예컨대 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG4, 마우스 IgG, 래트 IgG, 염소 IgG, 소 IgG, 기니 피그 IgG, 토끼 IgG; 인간 IgM, 인간 IgA; 및 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 단편을 포함할 수 있지만 이로 반드시 한정되지는 않는다. Fc 영역에 대한 특이적 결합으로 인해, 본 발명의 "Fc 결합 단백질" 또는 "Ig 결합 단백질"은 전체 면역글로불린에, 그리고 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 단편, 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 접합체에 결합할 수 있다. 본 명세서에서의 본 발명의 Fc 결합 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 특이적 결합을 나타내지만, Fc 결합 단백질이 감소된 친화도로 다른 영역, 예컨대 면역글로불린의 Fab 영역에 추가로 결합할 수 있음이 배제되지 않는다.
본 발명에 따른 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다. "특이적 결합"은 Fc 결합 단백질 또는 Fc 결합 도메인이 다른 비-면역글로불린 표적에 대한 결합과 대비하여 그것에 특이적인 면역글로불린에 더 강하게 결합함을 의미한다.
용어 "결합 활성"은 본 발명의 Fc 결합 단백질이 면역글로불린에 결합하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 결합 활성은 알칼리 처리 전 및/또는 후에 결정될 수 있다. 결합 활성은 Fc 결합 단백질에 대해 또는 매트릭스에 결합된 Fc 결합 단백질에 대해, 즉 고정화된 결합 단백질에 대해 결정될 수 있다.용어 "인공"은 천연 발생이 아닌 물체를 지칭하며, 즉 이 용어는 사람에 의해 생성되었거나 변형된 물체를 지칭한다. 예를 들어, 사람에 의해 (예를 들어, 실험실에서, 유전자적 조작에 의해, 셔플링(shuffling) 방법에 의해, 또는 화학 반응에 의해 등등으로) 생성되었거나 또는 의도적으로 변형된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 인공이다.
용어 "해리 상수" 또는 "KD"는 특이적 결합 친화도를 정의한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"(통상 "mol/L"로 측정되며, 때때로 "M"으로 약칭됨)는 제1 단백질과 제2 단백질 사이의 특정 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명과 관련하여, 용어 KD는 특히 Fc 결합 단백질과 면역글로불린 사이의 결합 친화도를 기술하는 데 사용된다. 본 발명의 Fc 결합 단백질은, 면역글로불린에 대한 그의 해리 상수 KD가 적어도 1 μM 또는 그 미만, 또는 바람직하게는 100 nM 또는 그 미만, 더 바람직하게는 50 nM 또는 그 미만, 더욱 더 바람직하게는 10 nM 또는 그 미만인 경우, 면역글로불린에 결합하는 것으로 간주된다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산의 임의의 선형 분자 사슬을 지칭하며, 그 생성물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, "펩티드", "단백질", "아미노산 사슬", 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬을 지칭하는 데 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에 또는 그와 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 폴리펩티드의 번역후 변형의 생성물을 지칭하는 것으로 의도되며, 이러한 번역후 변형에는, 제한 없이, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 단백질 분해적 절단, 천연 비발생 아미노산에 의한 변형, 및 당업계에 잘 알려진 유사한 변형이 포함된다. 따라서, 2개 이상의 단백질 도메인을 포함하는 Fc 결합 단백질이 또한 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"의 정의에 속한다.
용어 "알칼리에 안정한" 또는 "알칼리 안정성" 또는 "가성(caustic)에 안정한" 또는 "가성 안정성"(본 명세서에서 "cs"로도 약기됨)은 면역글로불린에 결합하는 능력을 크게 상실하지 않고서 알칼리 조건을 견디는 본 발명의 Fc 결합 단백질의 능력을 지칭한다. 당업자는, 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이, Fc 결합 단백질을 수산화나트륨 용액과 인큐베이션하고, 후속으로 당업자에게 알려진 일상적인 실험에 의해, 예를 들어 크로마토그래피 접근법에 의해 면역글로불린에 대한 결합 활성을 시험함으로써 알칼리 안정성을 용이하게 시험할 수 있다.
본 발명의 Fc 결합 단백질뿐만 아니라 본 발명의 Fc 결합 단백질을 포함하는 매트릭스는 "증가된" 또는 "개선된" 알칼리 안정성을 나타내는데, 이는, 상기 Fc 결합 단백질을 도입시킨 분자 및 매트릭스가 참조 단백질에 비하여 장기간 동안 알칼리성 조건 하에서 안정하다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "모(parental) 단백질" 또는 "모 도메인"에서의 용어 "모"는 상기 모 단백질 또는 도메인의 변이체를 생성하도록 후속으로 변형되는 Fc 결합 단백질을 지칭한다. 상기 모 단백질 또는 도메인은 인공 도메인(예를 들어, 제한 없이, 서열 번호 78 내지 83), 천연 발생 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A 도메인(예를 들어, 도메인 C의 경우 서열 번호 84, 도메인 B의 경우 서열 번호 85), 또는 천연 발생 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A 도메인의 변이체 또는 조작된 버전(예를 들어, 도메인 Z의 경우 서열 번호 86)일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 다른 아미노산 서열과 상이한 Fc 결합 단백질 또는 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. 이들 변형은 사람에 의해 수행되는 유전자적 조작에 의해 또는 화학 합성 또는 화학 반응에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 27(cs26 A46C)은 서열 번호 7(cs26)의 변이체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "접합체"는 제1 단백질이 다른 물질, 예컨대 제2 단백질 또는 비단백질성 모이어티에 화학적으로 부착된 것을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 분자에 관한 것이다.
용어 "변형" 또는 "아미노산 변형"은 모 폴리펩티드 서열 내의 특정 위치에 있는 아미노산의 다른 아미노산에 의한 교환, 결실, 또는 삽입을 지칭한다. 기지의 유전자 코드와, 재조합 및 합성 DNA 기법이 주어지면, 숙련된 과학자는 아미노산 변이체를 인코딩하는 DNA를 용이하게 작제할 수 있다.
용어 "치환" 또는 "아미노산 치환"은 모 폴리펩티드 서열 내의 특정 위치에 있는 아미노산의 다른 아미노산에 의한 교환을 지칭한다. 예를 들어, 치환 G46C는 위치 46에 있는 글리신이 시스테인으로 대체된 Fc 결합 단백질을 지칭한다. 앞선 예의 경우, 46C는 위치 46에 있는 시스테인을 지칭한다. 본 발명의 목적상, 다수의 치환은 전형적으로 슬래시에 의해 분리된다. 예를 들어, A1I/S11A/K35R/A46C는 치환 A1I, S11A, K35R, 및 A46C의 조합을 포함하는 변이체를 지칭한다.
용어 "결실" 또는 "아미노산 결실"은 모 폴리펩티드 서열 내의 특정 위치에 있는 아미노산의 제거를 지칭한다.
용어 "삽입" 또는 "아미노산 삽입"은 모 폴리펩티드 서열에 대한 아미노산의 부가를 지칭한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 도 1의 아미노산 잔기 위치 넘버링 규약이 사용되며, 위치 번호는, 예를 들어 서열 번호 1 내지 16에서의 것들에 상응하는 것으로 지정된다.
용어 "아미노산 서열 동일성"은 2개 이상의 단백질의 아미노산 서열의 동일성(또는 차이)의 정량적 비교를 지칭한다. 참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일한" 또는 "퍼센트 동일성"은, 서열을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후에, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
서열 동일성을 결정하기 위하여, 질의 단백질의 서열은 참조 단백질의 서열에 정렬된다. 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열에 대한 임의의 폴리펩티드의 아미노산 서열 동일성의 정도를 결정하기 위하여, 바람직하게는 SIM 로컬 유사성 프로그램(Local similarity program)이 사용되며(문헌[Xiaoquin Huang and Webb Miller (1991), Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337-357]), 이는 자유롭게 입수가능하다(또한, http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html 참조). 다중 정렬 분석의 경우, 바람직하게는 ClustalW가 사용된다(문헌[Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680]). 바람직하게는, 서열 동일성 백분율을 계산할 때, SIM 로컬 유사성 프로그램 또는 ClustalW의 디폴트 파라미터가 사용된다.
본 발명과 관련하여, 달리 명시적으로 언급되지 않는다면, 서열 동일성의 정도는 일반적으로 비변형된 서열의 총 길이에 대해 계산된다.
주어진 위치에서 참조 아미노산 서열과 상이한 질의 서열의 각각의 아미노산이 하나의 차이로서 계수된다. 이어서, 차이의 합을 참조 서열의 길이와 관련시켜 비동일성의 백분율을 산출한다. 동일성의 정량적 백분율은 100에서 비동일성의 백분율을 뺀 값으로 계산된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 2개의 폴리펩티드 서열과 관련하여 어구 "퍼센트 동일한" 또는 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 최대 일치도(maximum correspondence)를 위해 비교되고 정렬되는 경우, 하기 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하여 또는 시각적 검사에 의해 측정될 때, 일부 실시 형태에서 적어도 약 80%, 일부 실시 형태에서 적어도 82%, 일부 실시 형태에서 적어도 84%, 일부 실시 형태에서 적어도 86%, 일부 실시 형태에서 적어도 87%, 일부 실시 형태에서 적어도 89.5%, 일부 실시 형태에서 적어도 91%, 일부 실시 형태에서 적어도 93%, 일부 실시 형태에서 적어도 94%, 일부 실시 형태에서 적어도 96%, 일부 실시 형태에서 적어도 98%, 그리고 일부 실시 형태에서 100%의 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 명확성을 이유로, 예를 들어, 적어도 89.5%의 동일성을 갖는 서열은 89.5% 초과의 동일성을 갖는 모든 서열, 예를 들어 적어도 91%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 100%의 아미노산 동일성을 갖는 실시 형태를 포함한다.
퍼센트 동일성은 일부 실시 형태에서 적어도 50개의 잔기, 적어도 52개의 잔기의 영역에 걸쳐, 일부 실시 형태에서 적어도 53개의 잔기의 영역에 걸쳐, 일부 실시 형태에서 적어도 54개의 잔기의 영역에 걸쳐, 일부 실시 형태에서 적어도 55개의 잔기의 영역에 걸쳐, 일부 실시 형태에서 적어도 56개의 잔기의 영역에 걸쳐, 일부 실시 형태에서 적어도 57개의 잔기의 영역에 걸쳐, 그리고 일부 실시 형태에서 적어도 58개의 잔기의 영역에 걸쳐 존재한다.
용어 "융합된"은 성분들이 직접 또는 펩티드 링커를 통해 펩티드 결합에 의해 연결된 것을 의미한다.
용어 "융합 단백질"은 적어도 제1 단백질이 적어도 제2 단백질에 유전자적으로 결합된 것을 포함하는 단백질에 관한 것이다. 융합 단백질은 본래 별개의 단백질들에 대해 코딩된 2개 이상의 유전자의 결합을 통해 생성된다. 따라서, 융합 단백질은 단일 선형 폴리펩티드로서 발현되는 동일하거나 상이한 단백질들의 다량체(multimer)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "링커"는 그의 가장 광의의 의미에서 적어도 2개의 다른 분자를 공유적으로 결합시키는 분자를 지칭한다. 본 발명의 전형적인 실시 형태에서, "링커"는 Fc 결합 도메인을 적어도 하나의 추가의 Fc 결합 도메인과 연결시키는 모이어티, 즉 2개의 단백질 도메인을 서로 연결시켜 다량체를 생성하는 모이어티로 이해되어야 한다. 바람직한 실시 형태에서, "링커"는 펩티드 링커인데, 즉, 2개의 단백질 도메인을 연결하는 모이어티는 하나의 단일 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
용어 "크로마토그래피"는 이동상 및 고정상을 사용하여 샘플 내의 하나의 유형의 분자(예를 들어, 면역글로불린)를 다른 분자(예를 들어, 오염물)로부터 분리하는 분리 기술을 지칭한다. 액체 이동상은 분자들의 혼합물을 함유하고, 이들을 고정상(예컨대, 고체 매트릭스)을 가로질러 또는 이를 통해 수송한다. 이동상 내의 상이한 분자들과 고정상의 차별적 상호작용으로 인해, 이동상 내의 분자들이 분리될 수 있다.
용어 "친화성 크로마토그래피"는 고정상에 결합된 리간드가 이동상(샘플) 내의 분자(즉, 면역글로불린)와 상호작용하는 특정 방식의 크로마토그래피를 지칭하며, 즉, 리간드는 정제하고자 하는 분자에 대해 특이적 결합 친화도를 갖는다. 본 발명과 관련하여 이해되는 바와 같이, 친화성 크로마토그래피는 면역글로불린을 함유하는 샘플을 크로마토그래피 리간드, 예컨대 본 발명의 Fc 결합 단백질을 포함하는 고정상에 첨가하는 것을 포함한다.
용어 "고체 지지체" 또는 "고체 매트릭스"는 고정상에 대해 상호교환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 상호 교환가능하게 사용되는 바와 같이, 용어 "친화성 매트릭스" 또는 "친화성 분리 매트릭스" 또는 "친화성 크로마토그래피 매트릭스"는 친화성 리간드, 예를 들어 본 발명의 Fc 결합 단백질이 상부에 부착된 매트릭스, 예를 들어 크로마토그래피 매트릭스를 지칭한다. 리간드(예를 들어, Fc 결합 단백질)는 정제하고자 하거나 혼합물로부터 제거하고자 하는 관심 분자(예를 들어, 상기에 정의된 바와 같은 면역글로불린)에 대한 특이적 결합이 가능하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "친화성 정제"는 상기에 정의된 바와 같은 면역글로불린을 매트릭스에 고정화된 Fc 결합 단백질에 결합시킴으로써 액체로부터 상기에 정의된 바와 같은 면역글로불린을 정제하는 방법을 지칭한다. 이로써, 면역글로불린을 제외한 혼합물의 다른 모든 성분들이 제거된다. 추가의 단계에서, 결합된 면역글로불린은 정제된 형태로 용리된다.
본 발명의 실시 형태
본 발명을 이제 추가로 설명할 것이다. 하기 부분에서는, 본 발명의 상이한 태양이 더 상세히 정의된다. 하기에 정의된 각각의 태양은, 명백히 반대로 지시되지 않는 한, 임의의 다른 태양 또는 태양들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 나타낸 임의의 특징은, 바람직하거나 유리한 것으로 나타낸 임의의 다른 특징 또는 특징들과 함께 조합될 수 있다.
제1 태양에서, 본 발명은 Fc 결합 단백질에 관한 것으로, 서열 번호 2에 상응하는 위치 43의 아미노산, 위치 46의 아미노산, 위치 47의 아미노산, 위치 50의 아미노산, 위치 51의 아미노산, 또는 위치 53의 아미노산이 시스테인이다. 제1 태양에서, Fc 단백질은 하나 이상의 도메인을 포함하며, 적어도 하나의 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지거나, 또는 서열 번호 2에 상응하는 위치 43의 아미노산, 위치 46의 아미노산, 위치 47의 아미노산, 위치 50의 아미노산, 위치 51의 아미노산, 또는 위치 53의 아미노산이 시스테인인, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 84%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 89.5%, 적어도 91%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다.
위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에서 시스테인을 갖는 Fc 결합 단백질의 놀라운 이점은, 이들이 Fc-결합 특성을 손상시키지 않고서 장기간 동안 알칼리 안정성을 부여하고, 매트릭스에 대한 부위 지향 결합 효율을 가져서 높은 결합 능력을 제공한다는 것이다. 본 발명의 Fc 결합 도메인은 아미노산 잔기 7 내지 19로부터의 나선 1, 아미노산 잔기 23 내지 37로부터의 나선 2, 및 아미노산 잔기 40 내지 55로부터의 나선 3을 갖는 58개 아미노산의 3-나선 번들이다. 아미노산 위치 43, 46, 47, 50 및 51은 Fc-결합 단백질의 나선 3의 일부인 반면, Fc 결합은 나선 1 및 나선 2에 의해 매개된다. 본 발명의 Fc 결합 단백질은 적어도 6시간 내지 최대 적어도 72시간 동안 0.5 M NaOH 중에서 인큐베이션한 후 결합 능력의 20% 미만의 감소를 갖는다. 이러한 특징은, 예를 들어 매트릭스가 수회 사용될 수 있도록, 높은 NaOH 농도를 갖는 알칼리성 용액을 사용하여 매트릭스 상의 오염물을 제거하는 세정 절차에 의한 크로마토그래피 접근법에 있어서 중요하다. 또한, 높은 가성 안정성을 갖는 것에 더하여, 나선 3에서 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 Cys를 갖는 Fc 결합 단백질은 높은 결합 효율을 나타낸다. 예를 들자면, 예를 들어 위치 46에 Cys를 갖는 변이체의 동적 결합 능력은 재조합 단백질 A와 대비하여 우월하다(도 5 참조).
나선 3 내에 시스테인을 갖는 바람직한 Fc 결합 단백질. 일부 실시 형태는 서열 번호 1 내지 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는 서열에 관한 것이다. 일부 실시 형태는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 시스테인을 갖는다는 조건 하의 서열 번호 1 내지 86, 서열 번호 90 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 84%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 89.5%, 적어도 91%, 적어도 93%, 적어도 94.5%, 적어도 96%, 적어도 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 관한 것이다. 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에, 바람직하게는 위치 43 또는 46에, 더 바람직하게는 위치 46에 시스테인을 갖는 서열 번호 1 내지 86, 서열 번호 90 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 서열을 갖는 실시 형태가 바람직하다.
서열 번호 1 내지 86, 서열 번호 90 내지 95의 아미노산 서열은 추가의 변형, 예컨대 삽입, 결실, 또는 추가의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 추가의 치환을 갖는다. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 도메인은 그의 N-말단의 처음 4개의 아미노산 중 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산의 결실 및/또는 C-말단에서의 1개 또는 2개의 아미노산의 결실을 갖는다. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 도메인은 N-말단에서, 예를 들어 위치 1, 2, 및 4에, 또는 위치 1, 2, 및 3에 결실을 갖는다. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 도메인은 C-말단에서, 예를 들어 위치 57 및/또는 58(예를 들어, 서열 번호 33 또는 34에 제시된 바와 같지만, 이로 한정되지 않음)에 결실을 갖는다. 일부 실시 형태는 상기 언급된 서열 번호들(예를 들어, 서열 번호 1 내지 86, 서열 번호 90 내지 95이지만 이로 한정되지 않음) 중 임의의 것의 아미노산 서열과 적어도 89.5% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 관한 것이다. 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 Cys를 갖는 Fc 결합 도메인에 대한 예에는, 예를 들어 도 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
서열 번호 7(cs26) 및 변이체. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 7과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열은 cs24(서열 번호 8)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 Cys를 갖는 cs26의 변이체에 대한 예에는, 예를 들어 서열 번호 26 내지 39, 서열 번호 90 내지 95를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
서열 번호 8(cs24) 및 변이체. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 서열 번호 8의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 8과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열은 cs26(서열 번호 7)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 Cys를 갖는 cs24의 변이체에 대한 예에는, 예를 들어 서열 번호 26 내지 39, 서열 번호 90 내지 95를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
서열 번호 3(cs14) 및 변이체. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 서열 번호 3의 아미노산 서열, 또는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에서 시스테인으로 변형시키기에 적합한, 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 서열 동일성을 갖는 서열의 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 3과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열은 서열 번호 10(cs25), 서열 번호 11(cs47h3), 서열 번호 12(cs47h4), 서열 번호 13(cs74h1), 및 서열 번호 14(cs74h2)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 Cys를 갖는 cs14의 변이체에 대한 예에는, 예를 들어 서열 번호 17 내지 20, 40 내지 52, 64, 65, 70, 71, 74 내지 76을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
서열 번호 4(cs27) 및 변이체. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 서열 번호 4의 아미노산 서열, 또는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에서 시스테인으로 변형시키기에 적합한, 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 하나 이상의 도메인을 포함한다. 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 Cys를 갖는 cs27의 변이체에 대한 예에는, 예를 들어 서열 번호 21 내지 25를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
서열 번호 5(cs20) 및 변이체. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 서열 번호 5의 아미노산 서열, 또는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에서 시스테인으로 변형시키기에 적합한, 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 5와 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열은 서열 번호 9(cs17)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 Cys를 갖는 cs20의 변이체에 대한 예에는, 예를 들어 서열 번호 53 내지 57을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
서열 번호 6(cs42) 및 변이체. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에서 시스테인으로 변형시키기에 적합한, 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 16과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열은 cs28(위치 4에서 상이함) 또는 cs41(서열 번호 15)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 Cys를 갖는 cs42의 변이체에 대한 예에는, 예를 들어 서열 번호 58 내지 63을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
서열 번호 16(cs43) 및 변이체. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 서열 번호 16의 아미노산 서열, 또는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에서 시스테인으로 변형시키기에 적합한, 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 16과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열은 cs44(위치 44에서 상이함), cs31(위치 25 및 54에서 상이함), 또는 cs45(위치 25 및 26에서 상이함)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 Cys를 갖는 cs43의 변이체에 대한 예에는, 예를 들어 서열 번호 66 내지 69, 72를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
Fc 결합 단백질의 서열; 바람직한 아미노산 위치.
놀랍게도, 나선 3에서, 특히 Fc 결합 도메인의 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에 있는 시스테인이 도면에 그리고 실시예에 나타나 있는 바와 같이 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 시스테인을 갖지 않는 도메인과 대비하여 Fc 결합 도메인의 알칼리 안정성을 증가시키고, 매트릭스에 대한 Fc 결합 단백질의 부위-특이적 결합을 개선하며, 이는 능력을 개선한다.
일부 실시 형태에서, 상기 Fc 결합 도메인은 위치 1에 있는 아이소류신을 포함한다. Fc 결합 도메인의 위치 1의 아미노산은 트레오닌(T)이 아닌 것이 바람직하다. 위치 1의 아미노산은 아이소류신(I) 또는 알라닌(A)인 것이 바람직하다. 대안적으로, 위치 1이 결실될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 결합 도메인은 위치 11에 있는 알라닌(A), 글루탐산(E), 또는 아이소류신(I)을 포함한다. 위치 11의 아미노산은 아스파라긴(N) 또는 라이신(K)이 아닌 것이 바람직하다. 위치 11의 아미노산은 알라닌(A), 아이소류신(I), 글루탐산(E), 히스티딘(H), 또는 프롤린(P)이 바람직하며, 더 바람직하게는 A, I 또는 E이며, 가장 바람직하게는 A이다. 대안적으로, 위치 11의 아미노산은 세린(S)이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 결합 도메인은 위치 35에 있는 아르기닌(R) 또는 아이소류신(I)을 포함한다. 위치 35의 아미노산은 프롤린(P), 아스파라긴(N), 글리신(G), 트립토판(W), 알라닌(A), 글루타민(Q), 또는 메티오닌(M)이 아닌 것이 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 결합 도메인은 위치 42에 있는 류신(L)을 포함한다. 위치 42의 아미노산은 티로신(Y)이 아닌 것이 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 43C, 46C, 47C, 50C, 51C, 또는 53C에 더하여, Fc 결합 도메인은 1I, 11A, 11S, 35R, 및 42L로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 위치들 중 2개, 3개 또는 4개를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 위치 1I, 3A, 6D, 9Q, 10Q, 12A, 13F, 14Y, 15E, 16I, 17L, 18H, 19L, 20P, 21N, 22L, 23T, 24E, 26Q, 27R, 28N, 29A, 30F, 31I, 32Q, 33S, 34L, 36D, 37D, 38P, 39S, 41S, 42L, 45L, 48A, 52N, 55Q, 56A, 57P의 적어도 90%는 본 발명의 Fc 결합 도메인에서 동일하다. 위치 2는 A 또는 D이고, 위치 4는 K 또는 Q이고, 위치 5는 H 또는 F이고, 위치 7은 K 또는 E이고, 위치 8은 D, A 또는 E이고, 위치 11은 A, S, I, 또는 E이고, 위치 25는 D 또는 E이고, 위치 35는 R 또는 I이고, 위치 40은 V, T 또는 Q이고, 위치 43은 E, S 또는 C이고, 위치 44는 I, V 또는 L이고, 위치 46은 C, A 또는 G이고, 위치 47은 E 또는 C이고, 위치 49는 K 또는 Q이고, 위치 50은 K 또는 C이고, 위치 51은 L 또는 C이고, 위치 53은 D 또는 E 또는 C이고, 위치 54는 A 또는 S이고, 위치 58은 P 또는 K인 것이 바람직하다.
본 발명의 Fc 결합 단백질은, 서열 번호 2의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 하나 이상의 Fc 결합 도메인을 포함한다. 서열 번호 2의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열이다:
IX2AX4X5DX7X8QQX11AFYEILHLPNLTEX25QRNAFIQSLX35DDPSX40SLX43X44LX46X47AX49 X50 X51NX53X54QAPX58
여기서, 위치 1에 있는 아미노산은 I로부터 선택되거나, 또는 결실되고, 위치 2에 있는 아미노산(X2)은 A 또는 D로부터 선택되거나, 또는 결실되고, 위치 3에 있는 아미노산은 A로부터 선택되거나, 또는 결실되고, 위치 4에 있는 아미노산(X4)은 K 또는 Q로부터 선택되거나, 또는 결실되고, 위치 5에 있는 아미노산(X5)은 H 또는 F로부터 선택되고, 위치 7에 있는 아미노산(X7)은 K 또는 E로부터 선택되고, 위치 8에 있는 아미노산(X8)은 D, A, 또는 E로부터 선택되고, 위치 11에 있는 아미노산(X11)은 A, S, I, 또는 E로부터 선택되고, 위치 25에 있는 아미노산(X25)은 D 또는 E로부터 선택되고, 위치 35에 있는 아미노산(X35)은 R 또는 I로부터 선택되고, 위치 40에 있는 아미노산(X40)은 Q, T, 또는 V로부터 선택되고, 위치 43에 있는 아미노산(X43)은 E, S, 또는 C로부터 선택되고, 위치 44에 있는 아미노산(X44)은 I, L, 또는 V로부터 선택되고, 위치 46에 있는 아미노산(X46)은 G, A 또는 C로부터 선택되고, 위치 47에 있는 아미노산(X47)은 E 또는 C로부터 선택되고, 위치 49에 있는 아미노산(X49)은 K 또는 Q로부터 선택되고, 위치 50에 있는 아미노산(X50)은 K 또는 C이고, 위치 51에 있는 아미노산(X51)은 L 또는 C이고, 위치 53에 있는 아미노산(X53)은 D, E 또는 C로부터 선택되고, 위치 54에 있는 아미노산(X54)은 A 또는 S로부터 선택되고, 위치 57에 있는 아미노산은 P로부터 선택되거나, 또는 결실되고, 위치 58에 있는 아미노산(X58)은 P 또는 K로부터 선택되거나, 또는 결실된다. 본 발명의 Fc 결합 단백질은 하기 위치들 중 하나에 시스테인을 갖는다: 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53. 본 발명의 Fc 결합 도메인에 대해 선택된 예에는, 예를 들어 서열 번호 17 내지 73, 서열 번호 90 내지 95가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
Fc 결합 단백질의 C-말단 영역 내의 시스테인의 결과로서 얻은 높은 알칼리 안정성. 일부 실시 형태에서, 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 시스테인을 갖는 Fc 결합 단백질은 놀랍게도 실시예에 그리고 도면에 나타나 있는 바와 같이 Fc 결합 단백질의 특히 우수한 알칼리 안정성을 제공한다. 나선 3 내에 시스테인을 갖는 Fc 결합 단백질은 수 시간 동안 알칼리 처리 후에도 Ig에 결합할 수 있다는 것은 가장 놀랍고 예상치 못한 일이었다. Fc 결합 단백질의 알칼리 안정성은 0.5 M NaOH 중에서 적어도 6시간 인큐베이션한 후에 Ig 결합 활성의 손실을 비교함으로써 결정된다(도 3 참조). 예를 들어, cs26 46C의 결합 능력은 0.5 M NaOH와 함께 장기간(예를 들어, 36시간) 인큐베이션한 후에 야생형 도메인 C보다 적어도 20% 더 높게 유지된다(도 4 참조).
면역글로불린에 대한 친화성. 본 발명의 모든 Fc 결합 단백질은 바람직하게는 500 nM 미만, 또는 100 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 10 nM 이하의 해리 상수 KD로 면역글로불린에 결합한다. Fc 결합 단백질 또는 도메인의 결합 친화도를 결정하기 위한, 즉 해리 상수 KD를 결정하기 위한 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 당업계에 알려진 하기의 방법으로부터 선택될 수 있다: 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 기술, 바이오층 간섭법(BLI), 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 유세포측정, 등온 적정 열량측정법(ITC), 분석용 초원심분리, 방사면역검정(RIA 또는 IRMA) 및 향상된 화학발광(ECL). 일부 방법은 실시예에 추가로 설명되어 있다. 전형적으로, 해리 상수 KD는 20℃, 25℃, 또는 30℃에서 결정된다. 달리 구체적으로 지시되지 않는다면, 본 명세서에 인용된 KD 값은 22℃ +/- 3℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다. 제1 태양의 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 인간 IgG1에 대한 해리 상수 KD가 0.1 nM 내지 100 nM, 바람직하게는 0.1 nM 내지 50 nM 범위이다.
다량체. 본 발명의 일 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 서로 연결된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 Fc 결합 도메인을 포함하며, 즉, Fc 결합 단백질은, 예를 들어 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 또는 육량체일 수 있다. 다량체는 2개, 3개, 4개, 또는 심지어 더 많은 결합 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 다량체는, 일반적으로 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 의해, 인공적으로 생성된 융합 단백질이다.
일부 실시 형태에서, 다량체는 동종다량체(homo-multimer)이며, 예를 들어 Fc 결합 단백질의 모든 Fc 결합 도메인들의 아미노산 서열들은 동일하다.
다량체는 2개 이상의 Fc 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 Fc 결합 도메인들은 바람직하게는, 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 시스테인을 갖는다는 가정 하의 전술된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다.
예를 들어, 서열 번호 27 또는 서열 번호 22를 사용하여 본 명세서에서 실시예 1에 기재된 동종다량체 융합 작제물을 생성하였으며, 예를 들어 서열 번호 32, 서열 번호 35, 또는 서열 번호 25를 참조한다.
일부 실시 형태에서, 다량체는 이종다량체(hetero-multimer)이며, 예를 들어 적어도 하나의 알칼리 안정한 Fc 결합 도메인은 면역글로불린-결합 단백질 내의 다른 하나의 Fc 결합 도메인과는 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
링커. 제1 태양의 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 Fc 결합 도메인은 서로 직접 연결된다. 다른 실시 형태에서, 하나 이상의 Fc 결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 서로 연결된다. 이들 전형적인 실시 형태에서, 펩티드 링커가 바람직하다. 이는 펩티드 링커가 제1 Fc 결합 도메인을 제2 Fc 결합 도메인과 연결시키는 아미노산 서열임을 의미한다. 펩티드 링커는 제1 Fc 결합 도메인 및 제2 Fc 결합 도메인의 C-말단과 N-말단 사이의 펩티드 결합에 의해 이들 도메인에 연결되어, 단일의 선형 폴리펩티드 사슬을 생성한다. 링커의 길이 및 조성은 적어도 1개의 아미노산과 최대 약 30개의 아미노산 사이에서 변동될 수 있다. 더 구체적으로는, 펩티드 링커는 1 내지 30개의 아미노산의 길이를 가지며; 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개의 아미노산을 포함한다. 펩티드 링커의 아미노산 서열은 가성 조건 및 프로테아제에 대해 안정한 것이 바람직하다. 링커는 Fc 결합 단백질 내의 도메인들의 입체구조를 불안정화시키지 않아야 한다. 글리신 및 세린과 같은 작은 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 링커가 잘 알려져 있다. 링커는 글리신-풍부일 수 있다(예를 들어, 링커 내의 잔기의 50% 초과가 글리신 잔기일 수 있다). 추가의 아미노산을 포함하는 링커가 또한 바람직하다. 본 발명의 다른 실시 형태는 알라닌, 프롤린, 및 세린으로 이루어진 링커를 포함한다. 단백질들의 융합을 위한 다른 링커가 당업계에 알려져 있으며 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질들의 다량체는 Fc 결합 도메인들을 연결하는 하나 이상의 링커를 포함하며, 링커는 동일하거나 상이하다.
고체 지지체에 대한 접합. 본 발명의 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 고체 지지체에 접합된다. Fc 결합 도메인의 나선 3에서의 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53에 있는 시스테인은 고체 지지체에 대한 Fc 결합 단백질의 부위-특이적 공유 결합을 위한 부착 부위를 포함한다. 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53의 시스테인은 고체상(solid phase)의 반응성 기 또는 고체상과 단백질 사이의 링커, 예를 들어 N-하이드록시석신이미드, 요오도아세트아미드, 말레이미드, 에폭시, 또는 알켄 기로부터 선택되는 링커와의 특이적 화학 반응을 가능하게 한다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, Fc 결합 단백질은 또한 N- 및/또는 C-종결 말단에 추가의 아미노산 잔기, 예를 들어 N- 및/또는 C-종결 말단에 태그를 갖거나 갖지 않는 추가의 서열을 포함할 수 있다.
친화성 분리 매트릭스. 다른 태양에서, 본 발명은 제1 태양의 Fc 결합 단백질을 포함하는 친화성 분리 매트릭스에 관한 것이다.
제2 태양의 바람직한 실시 형태에서, 친화성 분리 매트릭스는 고체 지지체이다. 친화성 분리 매트릭스는 본 발명의 적어도 하나의 Fc 결합 단백질을 포함한다.
친화성 매트릭스는 면역글로불린의 분리에 유용하며, 세정 공정 동안 적용되는 바와 같은 고도로 알칼리성인 조건 후에도 Ig 결합 특성을 유지해야 한다. 매트릭스의 그러한 세정은 매트릭스의 장기간 반복된 사용에 필수적이다.
친화성 크로마토그래피용 고체 지지 매트릭스는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 아가로스 및 아가로스의 안정화된 유도체(예를 들어, 세파로스(Sepharose) 6B, Praesto™Pure; CaptivA®, rPROTEIN A 세파로스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow), Mabselect®, PrismA®, 및 기타), 셀룰로스 또는 셀룰로스의 유도체, 제어된 기공 유리(예를 들어, ProSep® vA 수지), 모놀리스(monolith)(예를 들어, CIM® 모놀리스), 실리카, 산화지르코늄(예를 들어, CM 지르코니아 또는 CPG®), 산화티타늄, 또는 합성 중합체(예를 들어, 폴리스티렌, 예컨대 Poros 50A 또는 Poros MabCapture® A 수지, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 알코올, 폴리하이드록시알킬 아크릴레이트, 폴리하이드록시알킬 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 등) 및 다양한 조성의 하이드로겔을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 소정 실시 형태에서, 지지체는 폴리하이드록시 중합체, 예컨대 다당류를 포함한다. 지지체에 적합한 다당류의 예에는 한천, 아가로스, 덱스트란, 전분, 셀룰로스, 풀루란 등, 및 이들의 안정화된 변형체가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
고체 지지 매트릭스에 대한 포맷은 임의의 적합한 잘 알려진 종류의 것일 수 있다. 본 발명의 Fc 결합 단백질을 결합하기 위한 그러한 고체 지지 매트릭스는, 예를 들어 하기 중 하나를 포함할 수 있다: 컬럼, 모세관, 입자, 막, 필터, 모놀리스, 섬유, 패드, 겔, 슬라이드, 플레이트, 카세트, 또는 크로마토그래피에 일반적으로 사용되고 당업자에게 알려진 임의의 다른 포맷을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 매트릭스는 비드(bead)로도 알려진 실질적으로 구형인 입자, 예를 들어 세파로스 또는 아가로스 비드로 구성된다. 적합한 입자 크기는 5 내지 500 μm, 예컨대 10 내지 100 μm, 예컨대 20 내지 80 μm, 예컨대 40 내지 70 μm의 직경 범위일 수 있다. 입자 형태의 매트릭스는 패킹된 층(packed bed)으로서 사용되거나 팽창된 층을 포함한 부유된 형태로 사용될 수 있다.
대안적인 실시 형태에서, 고체 지지 매트릭스는 막, 예를 들어 하이드로겔 막이다. 일부 실시 형태에서, 친화성 정제는 제1 태양의 Fc 결합 단백질이 공유 결합된, 매트릭스로서의 막을 수반한다. 고체 지지체는 또한 카트리지 내의 막 형태일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 친화성 정제는 제1 태양의 Fc 결합 단백질이 공유 결합된 고체 지지 매트릭스를 수용하는 크로마토그래피 컬럼을 수반한다.
본 발명의 Fc 결합 단백질은 통상적인 결합 기법을 통해 적합한 고체 지지 매트릭스에 부착될 수 있다. 고체 지지체에 대한 단백질 리간드의 고정화 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 표준 기법 및 장비를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 수행된다.
Fc 결합 단백질의 용도. 제3 태양에서, 본 발명은 면역글로불린 또는 이의 변이체의 친화성 정제를 위한 제1 태양의 Fc 결합 단백질 또는 제2 태양의 친화성 매트릭스의 용도에 관한 것으로, 즉, 본 발명의 Fc 결합 단백질은 친화성 크로마토그래피용으로 사용된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 Fc 결합 단백질은 본 발명의 제2 태양에 기재된 바와 같이 고체 지지체 상에 고정화된다.
면역글로불린의 친화성 정제 방법. 제4 태양에서, 본 발명은 면역글로불린의 친화성 정제 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 면역글로불린을 함유하는 액체를 제공하는 단계; (b) 친화성 분리 매트릭스를 제공하는 단계로서, 상기 친화성 분리 매트릭스는 상기 친화성 분리 매트릭스에 결합된 제1 태양의 고정화된 Fc 결합 단백질을 포함하는, 상기 단계; (c) 상기 액체를 상기 친화성 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계로서, 상기 면역글로불린은 상기 고정화된 Fc 결합 단백질에 결합하는, 상기 단계; 및 (d) 상기 매트릭스로부터 상기 면역글로불린을 용리시켜 상기 면역글로불린을 함유하는 용리액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 친화성 정제 방법은 친화성 분리 매트릭스에 비특이적으로 결합된 일부 또는 모든 분자를 그로부터 제거하기에 충분한 조건 하에서 단계 (c)와 단계 (d) 사이에 수행되는 1회 이상의 세척 단계를 추가로 포함할 수 있다. '비특이적으로 결합된'이란, 개시된 본 발명의 적어도 하나의 결합 도메인과 면역글로불린 사이의 상호작용을 수반하지 않는 임의의 결합을 의미한다.
개시된 용도 및 방법에 적합한 친화성 분리 매트릭스는 전술된 실시 형태에 따른 그리고 당업자에게 알려진 바와 같은 매트릭스이다.
제4 태양의 일부 실시 형태에서, 단계 (d)에서의 매트릭스로부터의 면역글로불린의 용리는 pH 변화 및/또는 염 농도의 변화를 통해 달성된다. 임의의 적합한 용액이 사용될 수 있으며, 예를 들어 pH 5 이하의 용액(예를 들어, 실시예 9에서의 표 3 참조)에 의해, 또는 pH 11 이상의 용액에 의해 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 친화성 매트릭스의 효율적인 세정 및 위생처리를 위한 추가의 단계 (f)가 추가되며, 이는, 바람직하게는, 예를 들어 pH 13 내지 14의 알칼리성 액체를 사용함으로써 행해진다. 소정 실시 형태에서, 세정 액체는 0.1 내지 1.0 M NaOH 또는 KOH, 바람직하게는 0.25 내지 0.5 M NaOH 또는 KOH를 포함한다. 본 발명의 Fc 결합 단백질의 높은 알칼리 안정성으로 인해, 그러한 강한 알칼리성 용액이 세정 목적으로 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 친화성 매트릭스는 단계 (a) 내지 단계 (e)의 반복으로 인해 적어도 10회, 적어도 20회, 적어도 30회, 적어도 40회, 적어도 50회, 적어도 60회, 적어도 70회, 적어도 80회, 적어도 90회, 또는 적어도 100회 재사용될 수 있으며, 선택적으로 (a) 내지 (f)는 적어도 10회, 적어도 20회, 적어도 30회, 적어도 40회, 적어도 50회, 적어도 60회, 적어도 70회, 적어도 80회, 적어도 90회, 또는 적어도 100회 반복될 수 있다.
일반적으로, 친화성 정제 방법을 수행하기에 적합한 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 실시 형태에서, 개시된 Fc 결합 도메인을 포함하는 친화성 정제의 개시된 용도 또는 방법은 pH 3.5 이상(예를 들어, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 또는 약 6.5)에서 Fc 함유 단백질의 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 용리를 제공할 수 있다.
핵산 분자. 제5 태양에서, 본 발명은 상기에 개시된 임의의 실시 형태의 Fc 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, 바람직하게는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 단백질 코딩 정보를 숙주 세포 내로 전달하는 데 사용될 수 있는 임의의 분자 또는 실체(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다. 일 실시 형태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
제6 태양에서, 본 발명은 상기에 개시된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 포함하는 발현 시스템, 예를 들어 원핵 숙주 세포, 예를 들어 E. 콜라이(E. coli), 또는 진핵 숙주, 예를 들어 효모 사카로미세스 세레비시아이(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포에 관한 것이다.
Fc 결합 단백질의 생성 방법. 제7 태양에서, 본 발명은 하기 단계(들)를 포함하는 본 발명의 Fc 결합 단백질의 생성 방법에 관한 것이다: (a) 상기 Fc 결합 단백질을 얻기 위하여 결합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 제6 태양의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 선택적으로, 상기 Fc 결합 단백질을 단리하는 단계. 원핵 또는 진핵 숙주를 배양하기에 적합한 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 Fc 결합 분자는 간단한 유기 합성 전략, 고체상-보조 합성 기법 또는 구매가능한 자동화 합성기에 의한 것과 같은 통상적인 그리고 잘 알려진 많은 기법들 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 한편, 이들은 또한 단독으로의 통상적인 재조합 기법에 의해 또는 통상적인 재조합 기법을 통상적인 합성 기법과 조합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태는 상기에 상세히 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 Fc 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 상기에 정의된 바와 같은 Fc 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 준비하는 단계; (b) 상기 핵산을 발현 벡터 내로 도입하는 단계; (c) 상기 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; (d) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; (e) 상기 숙주 세포를 Fc 결합 단백질이 발현되는 배양 조건에 노출시키는 단계, 그럼으로써 (e) 전술된 바와 같은 Fc 결합 단백질을 생성하는 단계; 선택적으로, (f) 단계 (e)에서 생성된 단백질을 단리하는 단계; 및 (g) 선택적으로, 전술된 바와 같은 고체 매트릭스에 상기 단백질을 접합시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시 형태에서, Fc 결합 단백질의 생성은 무세포 시험관내(in vitro) 전사/번역에 의해 수행된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 추가의 예시를 위해 제공된다. 그러나, 본 발명은 이로 한정되지 않으며, 하기 실시예는 단지 상기 설명에 기초하여 본 발명의 실행가능성을 보여줄 뿐이다.
실시예 1. Fc에 결합하는 인공 모자이크 단백질의 생성
Fc 결합 단백질은 초기에 천연 발생 단백질 A 도메인들(E, B, D, A, C, Z)의 셔플링 공정에 의해 생성되었다. 더 상세히 기술하면, 본 명세서에서 이해되는 바와 같이 셔플링 공정은 동일하지 않은 기지의 아미노산 서열들의 세트로부터 시작하여 인공 아미노산 서열을 생성하는 조립 공정이다. 셔플링 공정은 하기 단계들을 포함하였다: a) 5개의 천연 발생 단백질 A 도메인 E, B, D, A 및 C, 및 단백질 A 변이체 도메인 Z의 서열을 제공하는 단계; b) 상기 서열들을 정렬하는 단계; c) 컴퓨터 모의실험(in silico)으로 통계학적 단편화를 수행하여 재조합된 서열들을 확인하는 단계; 및 이어서, d) 다양한 단편들의 새로운 인공 서열들을 조립하여 모자이크 생성물, 즉 신규한 인공 아미노산 서열을 생성하는 단계. 단계 c)에서 생성된 단편들은 임의의 길이를 가졌는데, 예를 들어 단편화된 모 서열(parent sequence)이 n의 길이를 가졌다면, 단편들은 길이 1 내지 n-1을 가졌다.
모자이크 생성물에서의 아미노산들의 상대 위치는 출발 아미노산 서열에 대해 유지되었다. 위치 Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, I31, Q32, S33, L34, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, A56, P57의 적어도 90%가, 예를 들어 IB14, IB27, IB24, IB26, IB28, IB20(서열 번호 78 내지 83)의 인공 아미노산 서열과 천연 발생 단백질 A 도메인 또는 단백질 A 도메인 변이체 사이에 동일하다. 예를 들어 Fc 결합 단백질 IB14, IB26, 및 IB27의 전체 아미노산 서열은 천연 발생 단백질 A 도메인 또는 도메인 Z 중 임의의 것의 전체 아미노산 서열과 85% 이하로 동일하다는 점에서 인공적이다. 초기 인공 Fc 결합 단백질을 생성한 후, 일부 경우에, 이 단백질을 아미노산 서열의 부위-특이적 무작위화에 의해 추가로 변형시켜 생화학적 특성을 추가로 변형시켰다. 추가의 변형은 개별 아미노산 잔기의 부위-포화 돌연변이유발에 의해 도입하였다.
인공 Fc 결합 단백질을 위한 유전자를 합성하고, 당업자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 E. 콜라이 발현 벡터 내로 클로닝하였다. DNA 서열분석을 사용하여, 삽입된 단편의 정확한 서열을 확증하였다.
다량체 Fc 결합 단백질을 생성하기 위하여, 2개 또는 3개의 동일한 Fc 결합 도메인을 유전자적으로 융합시켰다.
특이적 정제를 위하여, 선택적으로 스트렙-태그(strep-tag)(WSHPQFEK; 서열 번호 89)를 Fc 결합 단백질의 C-말단에 부가하였다.
실시예 2. 변이체를 생성하기 위한 돌연변이유발
부위-지정 돌연변이유발을 위하여, Q5® 부위-지정 돌연변이유발 키트(NEB; 카탈로그 번호 E0554S)를 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 각각의 특이적 치환을 개별적으로 코딩하는 올리고뉴클레오티드들 및 주형을 함유하는 플라스미드를 사용하여 PCR을 수행하였다. 생성물을 라이게이션하고, 전기천공을 통해 E. 콜라이 XL2-블루 세포(Stratagene) 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 단리하고, 클론을 함유하는 삽입물에 대해 DNA 서열분석을 사용하여 정확한 서열을 검증하였다.
GeneArt™ Strings™ 합성(Thermo Fisher Scientific)에 의해 몇몇 점 돌연변이들의 조합을 생성하였다. Strings DNA 단편은 정제된 PCR 생성물에 상응하였으며, 이것을 pET28a 벡터의 유도체 내로 클로닝하였다. 라이게이션 생성물을 전기천공을 통해 E. 콜라이 XL2-블루 세포 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 PCR에 의해 스크리닝하여 올바른 크기의 삽입물을 함유하는 작제물을 확인하였다. DNA 서열분석을 사용하여 정확한 서열을 확증하였다. 점 돌연변이를 갖는 일부 변이체가, 예를 들어 도 1에 나타나 있다.
실시예 3. Fc 결합 단백질의 발현
BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 Fc 결합 단백질을 인코딩하는 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. 세포를 선택적 한천 플레이트(카나마이신) 상에 펼치고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 단일 콜로니로부터 전배양물(preculture)을 100 ml 2xYT 배지에 접종하고, 락토스 및 소포제 없이 150 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 배플부착형(baffled) 1 L 삼각 플라스크 내에서 통상적인 회전 진탕기에서 160 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. OD600 판독치는 6 내지 12의 범위이어야 한다. 0.5의 조정된 출발-OD600을 갖는 이전의 하룻밤 배양물로부터 주 배양물을 150 ㎍/ml의 카나마이신이 보충된 1 L 후벽 삼각 플라스크 내의 400 ml 초풍부(superrich) 배지(변형된 H15 배지 2% 글루코스, 5% 효모 추출물, 0.89% 글리세롤, 0,76% 락토스, 250 mM MOPS, 202 mM TRIS(pH 7.4), 소포제 SE15)에 접종하였다. 배양물을 공진 음향 혼합기(RAMbio)에 옮기고, 37℃에서 20 x g로 인큐베이션하였다. 옥시-펌프 마개(Oxy-Pump stopper)에 의해 에어레이션(aeration)을 촉진시켰다. 글루코스를 대사시키고, 후속으로 락토스가 세포에 진입될 수 있게 함으로써 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 미리 규정된 시점에서 OD600을 측정하였으며, 5/OD600으로 조정된 샘플을 취출하고, 펠릿화하고, -20℃에서 냉동시켰다. 세포를 대략 24시간 동안 하룻밤 성장시켜 약 45 내지 60의 최종 OD600에 도달하게 하였다. 수집하기 위하여, 바이오매스 세포를 20℃에서 10분 동안 16000 x g로 원심분리하였다. 펠릿을 칭량하고(습윤 중량), pH를 상층액에서 측정하였다. 처리 전에, 세포를 -20℃에서 저장하였다.
실시예 4: Fc 결합 단백질의 발현 및 용해도의 SDS-PAGE 분석
발효 동안 취해진 샘플을 300 μl 추출 완충액(0.2 mg/ml 라이소자임, 0.5x BugBuster, 7.5 mM MgSO4, 40 U 벤조나제(Benzonase)가 보충된 PBS) 중에 재현탁시키고, 700 rpm으로 실온에서 15분 동안 서모믹서(thermomixer) 내에서 교반에 의해 가용화하였다. 가용성 단백질을 원심분리(16000 x g, 2분, 실온)에 의해 불용성 단백질로부터 분리하였다. 상층액을 취출하고(가용성 분획), 펠릿(불용성 분획)을 당량의 우레아 완충액(8 M 우레아, 0.2 M Tris, 2 mM EDTA, pH 8.5) 중에 재현탁시켰다. 가용성 분획 및 불용성 분획 둘 모두로부터 50 μl를 취하고, 12 μl의 5x 샘플 완충액뿐만 아니라 5 μl의 0.5 M DTT를 첨가하였다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 비등시켰다. 마지막으로, 8 μl의 이들 샘플을 NuPage Novex 4 내지 12% 비스-트리스 SDS 겔에 적용하고 - 이는 제조자의 권장사항에 따라 전개됨 -, 쿠마시(Coomassie)로 염색하였다. 모든 Fc 결합 단백질의 고수준 발현이 선택된 기간 내에서 최적화된 조건 하에서 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). 모든 발현된 Fc 결합 단백질은 SDS-PAGE에 따라 95% 초과로 가용성이었다.
실시예 5: Fc 결합 단백질의 정제
Fc 결합 단백질을 C-말단 StrepTagII(WSHPQFEK)를 함유하는 E. 콜라이의 가용성 분획 중에서 발현시켰다. 세포를 2회의 냉동/해동 사이클에 의해 용해시키고, 제조자의 설명서(독일 괴팅겐 소재의 IBA)에 따라 Strep-Tactin®-수지를 사용하여 정제 단계를 수행하였다. 이황화물 형성을 피하기 위하여, 완충액에 1 mM DTT를 보충하였다.
대안적으로, Fc 결합 단백질을 C-말단 StrepTagII를 함유하는 E. 콜라이의 가용성 분획 중에서 발현시켰다. 세포를 세포 파괴 완충액 중에 재현탁시키고, 2회 사이클 동안 1 kbar에서 일정 세포 파괴 시스템(constant cell disruption system)(Unit F8B, Holly Farm Business Park)에 의해 용해시켰다. 제조자의 설명서에 따라 Strep-Tactin-수지(독일 괴팅겐 소재의 IBA) 및 
시스템(Ge Healthcare)을 사용하는 추가의 겔 여과(Superdex 75 16/60; GE Healthcare)에 의해 정제 단계를 수행하였다. 이황화물 형성을 피하기 위하여, 1 mM DTT 및 시트르산염-완충액(20 mM Citrat, 150 mM NaCl, pH 6,0)이 보충된 Strep-Tactin-정제용 완충액을 겔 여과용 전개 완충액으로서 사용하였다.
실시예 6. Fc 결합 단백질은 (ELISA에 의해 결정되는 바와 같이) 높은 친화도로 IgG에 결합한다
IgG1 또는 IgG2 또는 IgG4에 대한 Fc 결합 단백질의 친화도를 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 결정하였다. IgG1 또는 IgG2 또는 IgG4 함유 항체(예를 들어, IgG1에 대한 세툭시맙, IgG2에 대한 파니투무맙, 또는 IgG4에 대한 나탈리주맙)를 96웰 Nunc MaxiSorb ELISA 플레이트(2 ㎍/ml) 상에 고정화하였다. 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBST(PBS + 0.1% Tween 20)로 3회 세척하고, 웰을 PBS 중 3% BSA(실온에서 2시간)로 블로킹하였다. 음성 대조군은 단지 BSA로만 블로킹된 웰이었다. 블로킹 후, 웰을 PBST로 3회 세척하고, 실온에서 (PBST 중) Fc 결합 단백질과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 웰을 PBST로 3회 세척하고, 후속으로 실온에서 1시간 동안 Strep-Tactin-HRP(1:10000)(독일 괴팅겐 소재의 IBA)와 함께 인큐베이션하였다. 이후에, 웰을 PBST로 3회, 그리고 PBS로 3회 세척하였다. TMB-Plus 기질을 첨가함으로써 서양고추냉이 퍼옥시다제의 활성을 시각화하였다. 30분 후에, 0.2 M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 예를 들어, ELISA를 통해 결정될 때, 인간 IgG1에 대한 KD는, IB14에 대해서는 4.9 nM이고; 도메인 Z에 대해서는 3.4 nM이고; 도메인 B에 대해서는 3.1 nM이고; 도메인 C에 대해서는 2.8 nM이었다.
실시예 7. Fc 결합 단백질은 (표면 플라즈몬 공명 실험에 의해 결정되는 바와 같이) 높은 친화도로 IgG에 결합한다
CM5 센서 칩(GE Healthcare)을 SPR 전개 완충액으로 평형화하였다. 표면-노출된 카르복실 기를 EDC 및 NHS의 혼합물을 통과시킴으로써 활성화하여 반응성 에스테르 기를 생성하였다. 700 내지 1500 RU의 온(on)-리간드를 유동 세포 상에 고정화하고, 오프(off)-리간드를 다른 유동 세포 상에 고정화하였다. 리간드 고정화 후에 에탄올아민을 주입함으로써 비공유적으로 결합된 Fc 결합 단백질을 제거한다. 리간드 결합 시에, 단백질 분석물이 표면 상에 축적되어 굴절률을 증가시켰다. 굴절률의 이러한 변화를 실시간으로 측정하고 반응 단위 또는 공명 단위(RU) vs. 시간으로 도표로 나타내었다. 분석물을 적합한 유량(μl/min)으로 연속 희석물로 칩에 적용하였다. 매 실행 후마다, 칩 표면을 재생 완충액으로 재생시키고, 전개 완충액으로 평형화시켰다. 대조 샘플을 매트릭스에 적용하였다. 재생 및 재평형화를 앞서 언급된 바와 같이 수행하였다. 25℃에서 Biacore® 3000(GE Healthcare)의 사용에 의해 결합 연구를 수행하였으며; 랭뮤어(Langmuir) 1:1 모델(RI=0)의 사용에 의해 제조자에 의해 제공된 BIAevaluation 3.0 소프트웨어를 통해 데이터 평가를 실시하였다. 평가된 해리 상수(KD)를 탈표적(off-target)에 대해 표준화하였으며, 인간 IgG1-Fc, 세툭시맙(IgG1), 나탈리주맙(IgG4), 또는 파니투모맙(IgG2)에 대한 상이한 인공 Fc 결합 단백질들의 KD 값이 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
실시예 8. 에폭시-활성화된 매트릭스(세파로스 6B)에 결합된 Fc 결합 단백질
정제된 Fc 결합 단백질을 제조자의 설명서에 따라 에폭시-활성화 매트릭스(세파로스 6B, GE; 카탈로그 번호 17-0480-01)에 결합시켰다(결합 조건: pH 9.0 하룻밤, 에탄올아민으로 5시간 동안 블로킹). 세툭시맙을 IgG 샘플(5 mg; 1 mg/ml 매트릭스)로서 사용하였다. 세툭시맙을 고정화된 Fc 결합 단백질을 포함하는 매트릭스에 포화량으로 적용하였다. 매트릭스를 100 mM 글리신 완충액(pH 2.5)으로 세척하여, 고정화된 IgG-결합 단백질에 결합된 세툭시맙을 용리하였다. Fc 결합 단백질의 결합 활성을 결정하기 위하여 BLI(단백질 A 옥텟(Octet)-센서 및 표준물로서의 세툭시맙에 의한 정량화)에 의해 용리된 IgG의 농도를 측정하였다.
도 2a는 IB14(서열 번호 78) 및 위치 43, 46, 47, 50, 또는 58에 시스테인을 갖는 IB14 변이체들(각각 서열 번호 74 내지 77)의 결합 효율을 나타낸다. 위치 43, 46, 47, 50, 또는 58에 Cys를 갖는 모든 IB14 변이체의 결합 효율은 IB14에 대한 것보다 더 높았다. 도 2b는 에폭시 활성화된 세파로스 6B 기질에 대한 cs14 46C(서열 번호 18) 또는 cs14 43C(서열 번호 17)의 결합을, C-말단에 Cys를 갖는 cs14와 대비하여 그리고 구매가능한 단백질 A와 대비하여 나타낸다. 결합 조건은 450 μM, 4500 nmol/ml, pH 9, 30℃에서 2시간 또는 18시간, 1 mM TCEP, 1 M (NH4)2SO4였다. 순 결합률(net coupling rate)에 있어서의 단지 미소한 변화만이 2시간과 18시간 사이에서 관찰되었다. 결합률은 nmol(도메인)/ml로 나타나 있다.
실시예 9. 에폭시-활성화된 매트릭스에 결합된 Fc 결합 단백질의 알칼리 안정성
컬럼을 실온(22℃ +/-3℃)에서 0시간, 6시간, 18시간, 24시간, 36시간, 또는 72시간 동안 0.5 M NaOH와 함께 인큐베이션하였다. 고정화된 단백질의 Ig 결합 활성을 0.5 M NaOH와의 인큐베이션 전과 후에 분석하였다. NaOH 처리 전의 고정화된 단백질의 Ig 결합 활성은 100%로 정의되었다. 6시간 동안 0.5 M NaOH의 연속 처리 후에 잔존하는 IgG 결합 활성이 IB14 변이체들(서열 번호 74 내지 77)에 대해 도 3a에 나타나 있다. 도 3b는 cs14 46C, cs14 43C, cs14에 대해 그리고 구매가능한 단백질 A에 대해 0시간, 18시간, 또는 72시간 동안 0.5 M NaOH의 연속 처리 후의 가성 안정성을 나타낸다. 단백질을 30℃에서 2시간 동안 에폭시 세파로스에 고정화하였다(4500 nmol/ml). 동적 결합 능력 DBC 10%를 5분의 체류 시간에서 결정하였다. Cs14 46C가 19,5 mg/ml에 대해 0.5 NaOH의 72시간의 연속 처리 후 최고 DBC10%를 나타내는데, 이는 구매가능한 단백질 A에 대해 측정된 값보다 20% 초과로 더 크다. 도 4는 cs26 46C(서열 번호 27)에 대한 6, 24 및 36시간 동안의 0.5 M NaOH의 연속 처리 후의 잔존 결합 능력을 cs26(서열 번호 7) 및 야생형 도메인 C(서열 번호 84)와 대비하여 나타낸다. cs26 A46C(단량체 또는 이량체)의 결합 능력은 적어도 36시간의 0.5 M NaOH 인큐베이션 후에 20%를 초과하여 남아 있다(표 2 참조).
[표 2]
실시예 10. 아가로스-기반 크로마토그래피 비드 Praesto™ Pure45에 결합된 Fc 결합 단백질
정제된 Fc 결합 단백질을 제조자의 설명서에 따라 아가로스-기반 크로마토그래피 비드(Praesto™ Pure45, Purolite; 카탈로그 번호 PR01262-166)에 결합하였다(결합 조건: pH 9.5, 3시간, 35℃, 4.1 M NaSO4, 에탄올아민으로 하룻밤 블로킹). 다중클론 인간 IgG Gammanorm®(Ocatpharm)을 IgG 샘플로서 사용하였다(농도 2,2 mg/ml). 다중클론 hIgG 샘플을 고정화된 Fc 결합 단백질을 포함하는 매트릭스에 포화량으로 적용하였다. 매트릭스를 100 mM 시트르산 완충액(pH 2.0)으로 세척하여, 고정화된 Fc 결합 단백질에 결합된 hIgG를 용리하였다. 6분 체류 시간에서 10% 파과(breakthrough)에서 주입된 hIgG의 질량을 기준으로 재조합 야생형 단백질 A와 대비하여 cs26 46C(단량체 및 이량체; 서열 번호 27, 32)에 대해 동적 결합 능력을 결정하였다. 도 5는 cs26 46C가 6분 체류 시간에서 재조합 단백질 A보다 61.2% 더 높은 DBC를 가짐을 나타낸다.
실시예 11. 아가로스-기반 크로마토그래피 비드 Praesto™ Pure45 및/또는 Pure85에 결합된 Fc 결합 단백질로부터의 IgG의 용리
정제된 Fc 결합 단백질(cs26 46C)을 제조자의 설명서에 따라 아가로스-기반 크로마토그래피 비드(Praesto™ Pure45 또는 Pure 5)에 결합시켰다. 다중클론 인간 IgG Gammanorm® 및 단일클론 IgG1 항체 세툭시맙을 IgG 샘플로서 사용하고(농도 2.2 mg/ml), DBC10%에 이르기까지 로딩하였다. 다중클론 hIgG 샘플을 고정화된 Fc 결합 단백질을 포함하는 매트릭스에 포화량으로 적용하였다. 2-단계 공정으로, 매트릭스를 먼저 100 mM 시트르산염 완충액(pH 3.5)으로 세척하고, 이어서 100 mM 시트르산염 완충액(pH 2.0)으로 세척하여, 고정화된 Fc 결합 단백질에 결합된 hIgG를 용리하였다. 표 3은 결합된 IgG의 거의 100%가 pH 3.5에서 cs26 46C와 결합된 비드로부터 용리되었음을 보여준다.
[표 3]
SEQUENCE LISTING
<110> Navigo Proteins GmbH
<120> Fc binding proteins with Cysteine in helix 3
<130> SP33 EP1
<160> 95
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> consensus sequence 1
<220>
<221> variant
<222> (1)..(1)
<223> may be replaced by A, N, Q, V, or deleted
<220>
<221> variant
<222> (2)..(2)
<223> may be replaced by D or Q, or deleted
<220>
<221> variant
<222> (3)..(3)
<223> may be replaced by N, or deleted
<220>
<221> variant
<222> (4)..(4)
<223> may be replaced by Q or N, or deleted
<220>
<221> variant
<222> (5)..(5)
<223> may be replaced by F, or deleted
<220>
<221> variant
<222> (6)..(6)
<223> may be replaced by N, or deleted
<220>
<221> variant
<222> (7)..(7)
<223> may be replaced by E
<220>
<221> variant
<222> (8)..(8)
<223> may be replaced by A or E
<220>
<221> variant
<222> (11)..(11)
<223> may be replaced by S, N, I ,or E
<220>
<221> variant
<222> (15)..(15)
<223> may be replaced by Q
<220>
<221> variant
<222> (16)..(16)
<223> may be replaced by V
<220>
<221> variant
<222> (18)..(18)
<223> may be replaced by N
<220>
<221> variant
<222> (19)..(19)
<223> may be replaced by M
<220>
<221> variant
<222> (23)..(23)
<223> may be replaced by N
<220>
<221> variant
<222> (24)..(24)
<223> may be replaced by A
<220>
<221> variant
<222> (25)..(25)
<223> may be replaced by E
<220>
<221> variant
<222> (29)..(29)
<223> may be replaced by G
<220>
<221> variant
<222> (35)..(35)
<223> may be replaced by K or I
<220>
<221> variant
<222> (40)..(40)
<223> may be replaced by Q or T
<220>
<221> variant
<222> (42)..(42)
<223> may be replaced by A, K, or T
<220>
<221> variant
<222> (43)..(43)
<223> may be replaced by S, N, or C
<220>
<221> variant
<222> (44)..(44)
<223> may be replaced by L or V
<220>
<221> variant
<222> (46)..(46)
<223> may be replaced by C or A
<220>
<221> variant
<222> (47)..(47)
<223> may be replaced by C
<220>
<221> variant
<222> (49)..(49)
<223> may be replaced by Q
<220>
<221> variant
<222> (50)..(50)
<223> may be replaced by C
<220>
<221> variant
<222> (51)..(51)
<223> may be replaced by C
<220>
<221> variant
<222> (53)..(53)
<223> may be replaced by E or C
<220>
<221> variant
<222> (54)..(54)
<223> may be replaced by S, or deleted
<220>
<221> variant
<222> (57)..(57)
<223> may be deleted
<220>
<221> variant
<222> (58)..(58)
<223> may be replaced by K, or deleted
<400> 1
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
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Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
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<212> PRT
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<400> 81
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50 55
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<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 82
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1 5 10 15
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20 25 30
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 83
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 84
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> domain B
<400> 85
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1 5 10 15
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<220>
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Claims (14)
- 하나 이상의 도메인을 포함하는 Fc 결합 단백질로서,
서열 번호 2에 상응하는 위치 43의 아미노산, 위치 46의 아미노산, 위치 47의 아미노산, 위치 50의 아미노산, 위치 51의 아미노산, 또는 위치 53의 아미노산이 시스테인인, Fc 결합 단백질. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 2에 상응하는 위치 43의 아미노산, 위치 46의 아미노산, 위치 47의 아미노산, 위치 50의 아미노산, 위치 51의 아미노산, 또는 위치 53의 아미노산이 시스테인인, 상기 아미노산 서열과 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, Fc 결합 단백질.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 도메인은 서열 번호 3 내지 16의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 3 내지 16에 상응하는 위치 43의 아미노산, 위치 46의 아미노산, 위치 47의 아미노산, 위치 50의 아미노산, 위치 51의 아미노산, 또는 위치 53의 아미노산이 시스테인인, 상기 아미노산 서열들과 각각 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, Fc 결합 단백질.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 도메인은 서열 번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 7 또는 8에 상응하는 위치 43의 아미노산, 위치 46의 아미노산, 위치 47의 아미노산, 위치 50의 아미노산, 위치 51의 아미노산, 또는 위치 53의 아미노산이 시스테인인, 상기 아미노산 서열들과 각각 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, Fc 결합 단백질.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 도메인은 서열 번호 17 내지 86, 서열 번호 90 내지 95의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열들과 각각 적어도 89.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, Fc 결합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 도메인은 그의 N-말단의 처음 4개의 아미노산 중 1개, 2개 또는 3개의 아미노산의 결실 및/또는 그의 C-말단의 처음 2개 아미노산 중 1개 또는 2개 아미노산의 결실을 갖는, Fc 결합 단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 서로 연결된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 도메인을 포함하는, Fc 결합 단백질.
- 제7항에 있어서, 상기 단백질은 동종다량체(homo-multimer) 또는 이종다량체(hetero-multimer)인, Fc 결합 단백질.
- 제8항에 있어서, 하나 이상의 도메인이 서로 직접 연결되거나 또는 하나 이상의 링커, 바람직하게는 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는, Fc 결합 단백질.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은, 바람직하게는 위치 43, 46, 47, 50, 51, 또는 53의 시스테인을 통해 고체 지지체에 접합되는, Fc 결합 단백질.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 IgG1, IgG2, IgG4, IgM, IgA, Fc 영역을 포함하는 Ig 단편, Ig의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 Ig의 Fc 영역을 포함하는 접합체에 결합하는, Fc 결합 단백질.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 Fc 결합 단백질을 포함하는 친화성 분리 매트릭스.
- Fc 서열을 포함하는 임의의 단백질의 친화성 정제를 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 Fc 결합 단백질 또는 제12항의 친화성 분리 매트릭스의 용도.
- Fc 서열을 포함하는 단백질의 친화성 정제 방법으로서,
(a) Fc 서열을 포함하는 단백질을 함유하는 액체를 제공하는 단계; (b) 친화성 분리 매트릭스를 제공하는 단계로서, 상기 친화성 분리 매트릭스는 상기 친화성 분리 매트릭스에 결합된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 Fc 결합 단백질을 포함하는, 상기 단계; (c) Fc 서열을 포함하는 단백질에 대한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 Fc 결합 단백질의 결합을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 친화성 분리 매트릭스를 상기 액체와 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 친화성 정제 매트릭스로부터 Fc 서열을 포함하는 상기 단백질을 용리하는 단계를 포함하는, 방법.
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