KR102064396B1 - 신규한 면역글로불린-결합 단백질 및 친화도 정제에서의 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 하나 이상의 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 도메인을 포함하는 비-천연 결합 단백질에 관한 것이며, 여기서 적어도 하나의 비-천연 Ig-결합 도메인은 아미노산 서열 X1 X2X3XiXsX5X7 XsQQX11AFYX1sX15LX1 sX19PX21 LX23X24X2sQRX28X2gf IQSLKDDPSXio SXi2Xi3Xi4LXi5EAXigKLXs2Xs3Xs4QXs5PX를 포함한다. 본 개시는 또한 본 발명의 비-천연 Ig-결합 단백질을 포함하는 조성물, 예컨대 친화도 매트릭스에 관한 것이다. 면역글로불린의 친화도 정제를 위한 이러한 Ig-결합 단백질 또는 조성물의 용도 및 친화도 정제 방법.

Description

신규한 면역글로불린-결합 단백질 및 친화도 정제에서의 이의 용도
본 발명은 하나 이상의 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 도메인을 포함하는 비-천연 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 비-천연 Ig-결합 단백질을 포함하는 조성물, 예컨대 친화도 매트릭스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역글로불린의 친화도 정제를 위한 이러한 Ig-결합 단백질 또는 조성물의 용도 및 본 발명의 Ig 결합 단백질을 이용하는 친화도 정제 방법에 관한 것이다.
여러 생물공학적 및 약학적 응용은 항체를 함유하는 샘플로부터 오염물질의 제거를 필요로 한다. 항체의 포획 및 정제를 위해 확립된 절차는 면역글로불린에 대한 선택적 리간드로서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 박테리아 세포 표면 단백질 A를 이용하는 친화도 크로마토그래피이다(예를 들어, 리뷰로 문헌[Huse et al, J. Biochem. Biophys. Methods 51, 2002: 217-231]을 참고한다). 야생형 단백질 A는 높은 친화도 및 선택성으로 IgG 분자의 Fc 영역에 결합하며, 고온 그리고 넓은 범위의 pH값에서 안정하다. 개선된 특성, 예컨대 알칼리 안정성을 갖는 단백질 A의 변이체가 항체 정제를 위해 이용 가능하며, 단백질 A 리간드를 포함하는 다양한 크로마토그래피 매트릭스가 상업적으로 이용 가능하다. 그러나, 특히 야생형 단백질 A 기반 크로마토그래피 매트릭스는 알칼리 조건에 대한 노출 후 면역글로불린에 대한 결합능의 손실을 나타낸다.
항체 또는 Fc-함유 융합 단백질에 대한 대부분의 대규모 제조 공정은 친화도 정제를 위해 단백질 A를 이용한다.
그러나, 친화도 크로마토그래피에서 단백질 A 적용의 한계로 인해, 면역글로불린의 친화도 정제를 촉진하기 위해 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 개선된 특성을 갖는 신규 Ig 결합 단백질을 제공하는 것에 대한 필요성이 선행 기술에 존재한다. 따라서, 1 μΜ, 심지어 100 nM 이하의 친화도를 갖는 면역글로불린에 대한 Ig 결합 단백질의 특이성이 면역글로불린의 효율적 정제를 위한 Ig 결합 단백질에 있어서 중요한 기능적 특징이다.
또한, Ig 결합 단백질을 포함하는 크로마토그래피 매트릭스의 가치를 최대한 활용하기 위해, 친화도 리간드 매트릭스를 다회 이용하는 것이 바람직하다. 크로마토그래피 사이클 간에, 매트릭스 상 잔여 오염물질의 살균 및 제거를 위해 철저한 세정 절차가 요구된다. 상기 절차에서는, 친화도 리간드 매트릭스에 고농도 NaOH를 포함하는 알칼리 용액을 적용하는 것이 일반 관례이다. 야생형 단백질 A 또는 천연 발생 단백질 A 도메인은 연장된 시간 동안 이러한 가혹한 알칼리 조건을 견디지 못하고, 면역글로불린에 대한 결합능을 빠르게 소실한다. 따라서, 면역글로불린에 결합할 수 있는 신규한 알칼리-안정한 단백질을 수득하는 것에 대한 필요성이 본 분야에 존재한다.
본 발명은 면역글로불린의 친화도 정제에 특히 매우 적합하지만, 선행 기술의 단점을 극복하는 인공 면역글로불린 결합 단백질을 제공한다. 특히, 본 발명의 비-천연 Ig 결합 단백질의 상당한 장점은 천연 발생 단백질 A 도메인에 비해 높은 pH에서 이의 증가된 안정성이다.
상기 개요가 반드시 본 발명에 의해 해결되는 모든 문제를 기재하는 것은 아니다.
제1 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 비-천연 Ig-결합 도메인을 포함하는 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질에 관한 것이며, 여기서 적어도 하나의 비-천연 Ig-결합 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1을 포함한다.
제1 양태의 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 비-천연 Ig-결합 도메인은 아미노산 서열
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYX15X16LX18X19PX21LX23X24X25QRX28X29FIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QX56PX58(SEQ ID NO: 1)을 포함하며, 식 중
X1은 A, V, Q, N, 또는 P; 바람직하게는 N, V, P, 또는 A이며;
X2는 D, A, 또는 Q; 바람직하게는 D 또는 A이고;
X3은 A, S, 또는 N이고;
X4는 K, Q, 또는 N; 바람직하게는 K 또는 Q이고;
X5는 H 또는 F이고;
X6은 D, N, S, 또는 A; 바람직하게는 D, S, 또는 A이고,
X7은 E 또는 K이고;
X8은 D, E 또는 A이고;
X11은 S 또는 N이고;
X15는 E, D, 또는 Q; 바람직하게는 E이고;
X16은 V 또는 I; 바람직하게는 I이고;
X18은 H 또는 N; 바람직하게는 H이고;
X19는 L 또는 M; 바람직하게는 L이고;
X21은 N, S, 또는 D이고;
X23은 T 또는 N; 바람직하게는 T이고;
X24는 E 또는 A; 바람직하게는 E이고;
X25는 D 또는 E이고;
X28은 N, S, 또는 A이고;
X29는 G 또는 A; 바람직하게는 A이고;
X40은 V 또는 Q 또는 T이고;
X42는 K, T, 또는 A; 바람직하게는 K 또는 A이고;
X43은 E, N, 또는 S; 바람직하게는 E 또는 S이고;
X44는 V, L, 또는 I이고;
X46은 G 또는 A이고;
X49는 K 또는 Q이고;
X52는 N, S, 또는 D이고;
X53은 D 또는 E이고;
X54는 S 또는 A이고;
X56은 A 또는 P; 바람직하게는 A이고;
X58은 K 또는 P이고;
여기서 인간 IgG1에 대한 상기 비-천연 Ig-결합 단백질의 해리 상수 KD는 1 μΜ 이하, 바람직하게는 500 nM 미만, 보다 바람직하게는 100 nM 미만이다. 제1 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 비-천연 Ig-결합 도메인을 포함하는 결합 단백질에 관한 것이며, 여기서 적어도 하나의 비-천연 Ig-결합 도메인은 알칼리 처리 후에도 면역글로불린에 대한 결합력을 가지는 SEQ ID NO: 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
제2 양태에서, 본 발명은 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 바람직하게는 조성물은 친화도 분리 매트릭스이다.
제3 양태에서, 본 발명은 면역글로불린의 친화도 정제를 위한 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질 또는 제2 양태의 조성물의 용도에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 (a) 면역글로불린을 함유하는 액체를 제공하는 단계; (b) 제1 양태의 고정화된 비-천연 Ig-결합 단백질을 포함하는 친화도 분리 매트릭스를 제공하는 단계; (c) 상기 액체 및 상기 친화도 분리 매트릭스를 접촉시키는 단계로서, 상기 면역글로불린은 상기 고정화된 Ig-결합 단백질에 결합하는 단계; 및 (d) 상기 매트릭스로부터 상기 면역글로불린을 용출함으로써 상기 면역글로불린을 함유하는 용출액을 수득하는 단계; 및 (e) 선택적으로 단계 (c) 및 (d) 간에 수행되는 1회 이상의 세척 단계를 추가로 포함하는 단계를 포함하는 면역글로불린의 친화도 정제 방법에 관한 것이다.
제5 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따른 비-천연, Ig-결합 단백질의 생성 방법에 관한 것이며, 여기서 각각의 Ig-결합 도메인은 천연 발생 Ig-결합 단백질로부터의 적어도 2개의 천연 발생 Ig-결합 도메인의 셔플링 공정에 의해 그리고 선택적으로 추가 돌연변이를 도입하여 수득 가능하다.
제6 양태에서, 본 발명은 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
제7 양태에서, 본 발명은 제6 양태의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
제8 양태에서, 본 발명은 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질, 제6 양태의 핵산 분자, 또는 제7 양태의 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 비-인간 숙주에 관한 것이다.
제9 양태에서, 본 발명은 a. 상기 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질을 수득하기 위해 결합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 제8 양태의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 b. 선택적으로 상기 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 요약이 반드시 본 발명의 모든 특징을 기재하는 것은 아니다. 다른 구현예는 뒤따르는 상세한 설명의 리뷰로부터 자명해질 것이다.
도 1a. Ig 결합 단백질의 생성을 위한 셔플링 방법의 예시.
도 1b. 본 발명의 IgG 결합 단백질의 일반 서열(SEQ ID NO: 1). 번호는 결합 단백질에서 대응하는 아미노산 위치를 나타내며; "X"는 "X" 아래에 나타낸 바와 같은 아미노산으로부터 선택되는 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, 위치 2에서의 "X"는 A, D, 또는 Q로부터 선택될 수 있다.
도 2. 선택된 비-천연 Ig-결합 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 9~30)
도 3. 변성 SDS-PAGE에 의해 HMS174(DE3)에서 발현되는 IgG 결합 단백질의 분석. 가용성 및 불용성 분획을 생성하여 SDS-겔로 적용하였다. 접종 7 h 후(도 3a) 및 접종 24 h 후(도 3b) 주 배양. 레인 1 - 분자량 마커, 148464(SEQ ID NO: 15)의 가용성(레인 2) 및 불용성(레인 3) 분획, 148463(SEQ ID NO: 14)의 가용성(레인 4) 및 불용성(레인 5) 분획, 148461(SEQ ID NO: 12)의 가용성(레인 6) 및 불용성(레인 7) 분획. 회색 화살표는 발현된 단백질의 근사 크기를 나타낸다.
도 4. 변성 SDS-PAGE에 의한 정제된 IgG 결합 단백질의 분석. 148461(SEQ ID NO: 12)(도 4a), 및 148471(SEQ ID NO: 22)(도 4b)의 발현 및 정제. 레인 1 분자량 마커, 레인 2 불용성 분획, 레인 3 가용성 분획, 레인 4 플로우-쓰루 StrepTactin 컬럼, 레인 5~9 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 용출 분획.
도 5. ELISA에 의한 IgG 결합 단백질의 결합 친화도 분석. 검정을 온-타겟으로 세툭시맵(검은 원) 및 아달리무맵(흰 원) 및 오프-타겟으로 BSA(검은 삼각형)를 이용하여 수행하였다. IgG 결합 단백질의 결합을 Strep-Tactin-HRP를 이용하여 StrepTag를 통해 분석하였다. 도 5a. Ig 결합 단백질 148472(SEQ ID NO: 23); SEQ ID NO: 23에 대한 KD는 세툭시맵 대비 5.9 nM이고 아달리무맵 대비 5.1 nM이다. 도 5b. Ig 결합 단백질 148461(SEQ ID NO: 12). SEQ ID NO: 12에 대한 KD는 세툭시맵 대비 7.8 nM이고 아달리무맵 대비 7.5 nM이다, 천연 발생 단백질 A 도메인 대비 본 발명의 추가적인 IgG 결합 단백질에 대한 결과를 표 2에 나타낸다(실시예 5 참고).
도 6. SPR(Biacore)에 의한 IgG 결합 단백질의 결합 친화도 분석. 도 6a. Ig 결합 단백질 148463(SEQ ID NO: 14)의 분석. 분석된 농도는 0 nM, 1.56 nM, 3.125 nM, 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM이었다. SEQ ID NO: 14에 대한 KD는 1.3 nM이다, 도 6b. Ig 결합 단백질 154256(SEQ ID NO: 28)의 분석. 분석된 농도는 0, 0.39 nM, 0.78 nM, 1.56 nM, 3.125 nM, 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM이었다. SEQ ID NO: 28에 대한 KD는 3.1 nM이다. 추가 결과를 표 3에 나타낸다(실시예 6 참고).
도 7. SulfoLink 커플링 수지에 대한 IgG 결합 단백질의 고정화. Ig 결합 단백질 148470(SEQ ID NO: 21)(도 7a), 및 Ig 결합 단백질 148460(SEQ ID NO: 11)(도 7b)의 프로필을 나타낸다. y-축은 280 nm에서의 흡광도를 mAU로 나타내며, y-축은 용출 부피를 ml로 나타낸다.
도 8. 알칼리 처리 후 Sulfolink 수지에 고정화된 IgG 결합 단백질의 Ig 결합 활성. 도면은 80분 연속 0.5 M NaOH 처리 후 천연 발생 단백질 A 도메인 E, D, A, B, C 및 도메인 Z 대비 상이한 IgG 결합 단백질 148462(SEQ ID NO: 13, "13"). 148463(SEQ ID NO: 14; "14"). 1484672(SEQ ID NO: 23, "23")의 잔여 활성을 나타낸다.
도 9. 알칼리 처리 후 에폭시-활성화 수지에 고정화된 IgG 결합 단백질의 Ig 결합. Ig 결합 단백질 154254(SEQ ID NO: 26), 154255(SEQ ID NO: 27), 154256(SEQ ID NO: 28), 및 154257(SEQ ID NO: 30)을 IgG 결합 단백질 148463(SEQ ID NO: 14)과 비교하였다. 6시간 연속 0.5 M NaOH 처리 후 잔여 활성을 나타낸다.
도 10. 알칼리 처리 후 에폭시-활성화 수지에 고정화된 1, 2, 4, 또는 6개 IgG 결합 도메인으로 구성된 IgG 결합 단백질의 Ig 결합 활성. 연속 0.5 M NaOH 처리 후 단량체 148463(SEQ ID NO: 14), 이량체 150570(SEQ ID NO: 45), 사량체 150663(SEQ ID NO: 46), 및 육량체 150772(SEQ ID NO: 47)의 IgG 결합 활성을 나타낸다(0시간, 밝은 회색 컬럼; 2시간, 중간 회색 컬럼; 4시간, 진한 중간 회색 컬럼; 6시간, 진한 회색 컬럼).
정의
본 발명을 아래에서 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 본원에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약이 변할 수 있으므로 이에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한 본원에서 이용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하는 목적을 위한 것이며, 첨부되는 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 본원에서 이용되는 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (lUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kㆆlbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)]에 기재된 바와 같이 정의된다.
본 명세서 및 후술되는 청구범위에 걸쳐, 맥락 상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다(comprise)"라는 단어, 및 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급되는 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 시사하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 시사하지 않음이 이해될 것이다.
몇몇 문헌(예를 들어: 특허, 특허 출원, 과학 문헌, 제조업체의 사양, 지침, GenBank 접근 번호 서열 승인 등)이 본 명세서의 텍스트를 통해 인용된다. 본원의 어느 것도 본 발명이 선행 발명의 이유로 이러한 개시보다 선행하는 것으로 자격이 주어지지 않는다는 시인으로서 해석되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 일부 문헌은 "참조로 포함"되는 것을 특징으로 한다. 이러한 포함된 참고문헌의 정의 또는 교시 및 본 명세서에서 인용되는 정의 또는 교시 간 상충 시에는 본 명세서의 기재가 우선이 된다.
본원에서 언급되는 모든 서열은 그 전체 내용 및 개시와 함께, 본 명세서의 일부인 첨부되는 서열 목록에 개시된다.
"단백질" 및 "폴리펩타이드"라는 용어는 펩타이드 결합에 의해 연결되는 2개 이상의 아미노산의 임의의 선형 분자쇄를 나타내며, 특정 길이의 산물을 나타내는 것이 아니다. 따라서, "펩타이드", "단백질", "아미노산쇄" 또는 2개 이상의 아미노산쇄를 나타내기 위해 이용되는 임의의 다른 용어가 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되며, "폴리펩타이드"라는 용어는 임의의 이러한 용어 대신 또는 이와 상호 교환적으로 이용될 수 있다. "폴리펩타이드"라는 용어는 또한 비제한적으로 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아마이드화, 단백분해 절단, 비-천연 발생 아미노산에 의한 변형 및 당분야에 널리 공지된 유사한 변형을 포함하는, 폴리펩타이드의 번역-후 변형 산물을 나타내려는 것이다. 따라서, 2개 이상의 단백질 도메인을 포함하는 Ig 결합 단백질도 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"라는 용어의 정의 하에 속한다.
본 발명의 맥락에서, "면역글로불린-결합 단백질"이라는 용어는 면역글로불린의 Fc 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 설명하기 위해 이용된다. Fc 영역에 대한 상기 특이적 결합으로 인해, 본 발명의 "면역글로불린-결합 단백질"은 전체 면역글로불린, Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 단편, 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 콘주게이트에 결합할 수 있다. 본 발명의 "면역글로불린-결합 단백질"은 본원에서 면역글로불린의 Fc 영역에 대해 특이적 결합을 나타내지만, "면역글로불린-결합 단백질"이 면역글로불린의 다른 영역, 예컨대 Fab 영역에 대해 감소된 친화도로 추가 결합할 수 있음이 배제되는 것은 아니다.
본 명세서를 통해, "면역글로불린-결합 단백질"이라는 용어는 종종 "Ig 결합 단백질" 또는 "Ig-결합 단백질"로 약칭된다. 때때로, 긴 형태 및 약칭된 형태가 모두 동시에, 예컨대 "면역글로불린(Ig) 결합 단백질"이라는 표현에서 이용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, "면역글로불린-결합 단백질"은 하나 이상의 비-천연 Ig-결합 도메인을 포함한다. 본원에서 이용되는 "면역글로불린-결합 도메인"(종종 Ig-결합 도메인으로 약칭됨)이라는 용어는 면역글로불린의 Fc 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 도메인을 나타낸다. 그러나, "면역글로불린-결합 도메인"이 추가적으로 - 감소된 친화도를 가지고 - 다른 영역, 예컨대 면역글로불린의 Fab 영역에 결합할 수 있음이 배제되는 것은 아니다. Fc 영역에 대한 특이적 결합으로 인해, 본 발명의 "면역글로불린-결합 도메인"은 전체 면역글로불린, Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 단편, 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 콘주게이트에 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, "면역글로불린-결합 도메인"은 천연 발생 Ig-결합 도메인, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A의 도메인 C(SEQ ID NO: 7) 또는 도메인 B(SEQ ID NO: 6) 또는 도메인 E(SEQ ID NO: 3) 또는 도메인 D(SEQ ID NO: 4) 또는 도메인 A(SEQ ID NO: 5)와 최대 85% 서열 동일성을 나타내는 비-천연 도메인 이다. 본 발명의 바람직한 비-천연 Ig 결합 도메인은 도메인 E, D, A, B, C, 및 도메인 Z의 위치 Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, I31, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, P57에 대응하는 위치에서 동일한 아미노산을 갖는다. 천연 발생 도메인 E, D, A, B, C, 및 도메인 Z와 본 발명의 Ig-결합 도메인의 동일성은 적어도 약 50% 및 최대 85%이다.
본원에서 이용되는 제1 화합물(예컨대, 본 발명의 Ig 결합 단백질)은 제2 화합물(예컨대 항원, 예컨대 표적 단백질, 예컨대 면역글로불린)에 대해500 μΜ 이하, 바람직하게는 100 μΜ 이하, 바람직하게는 50 μΜ 이하, 바람직하게는 10 μΜ 이하, 바람직하게는 1 μΜ 이하, 바람직하게는 500 nM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하, 보다 바람직하게는 50 nM 이하, 더욱 바람직하게는 10 nM 이하의 해리 상수 KD를 갖는 경우, 상기 제2 화합물에 대해 "결합"하는 것으로 간주된다. 본 발명에 따른 "결합"이라는 용어는 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다. "특이적 결합"이란 본 발명의 Ig 결합 단백질이 다른 비-면역글로불린 표적에 대한 결합에 비해 특이적인 면역글로불린에 대해 더 강력하게 결합함을 의미한다. 예를 들어, Ig 결합 단백질이 특이적으로 결합하는 표적(예컨대 면역글로불린)에 대한 해리 상수(KD)는 결합 단백질이 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리 상수(KD)보다 10배 초과, 바람직하게는 20배 초과, 보다 바람직하게는 50배 초과, 더욱 바람직하게는 100배, 200배, 500배, 또는 1000배 초과가 더 낮다.
"해리 상수" 또는 "KD"라는 용어는 특이적 결합 친화도를 정의한다. 본원에서 이용되는 "KD"(보통 "mol/L"로 측정되며, 때때로 "M"으로 약칭됨)라는 용어는 제1 단백질 및 제2 단백질 간 특정한 상호작용의 해리 평형 상수를 나타내려는 것이다. 본 발명의 맥락에서, KD라는 용어는 특히 면역글로불린-결합 단백질 및 면역글로불린 간 결합 친화도를 설명하기 위해 이용된다. 고친화도는 낮은 값의 KD에 대응한다. 따라서, "적어도 예컨대 10-7 M의 KD"라는 표현은 10-7 M 이하의 값을 의미한다(더 단단히 결합함). 1 x 10-7 M은 100 nM에 대응한다. 10-5 M 내지 10-12 M까지의 값은 정량 가능한 결합 친화도로 간주될 수 있다. 본 발명에 따르면, 표적 결합을 위한 친화도는 500 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 nM 미만, 더욱 바람직하게는 10 nM 이하의 범위여야 한다.
결합 친화도의 결정 방법, 즉 해리 상수 KD의 결정 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 당분야에 공지된 다음 방법으로부터 선택될 수 있다: 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 기술, 바이오-레이어 간섭계(BLI), 효소-연관 면역흡착 검정(ELISA), 유세포 측정, 형광 분광측정 기법, 등온 적정 열량측정(ITC), 분석용 초원심분리, 방사선면역검정(RIA 또는 IRMA) 및 증강된 화학발광(ECL). 일부 방법은 아래의 실시예에 기재된다.
본원에서 이용되는 "천연 발생"이라는 용어는 대상체가 자연에서 확인될 수 있다는 사실을 나타낸다. 예를 들어, 자연에서의 원천으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 천연 발생이다. 예를 들어, 천연 발생 Ig-결합 도메인은 박테리움 스타필로코커스 아우레우스, 예를 들어 단백질 A 도메인 C(SEQ ID NO: 7) 또는 단백질 A 도메인 B(SEQ ID NO: 6) 또는 단백질 A 도메인 E(SEQ ID NO: 3) 또는 단백질 A 도메인 D(SEQ ID NO: 4) 또는 단백질 A 도메인 A(SEQ ID NO: 5) 로부터 단리될 수 있다.
이와 대조적으로, 본원에서 이용되는 "비-천연"이라는 용어는 천연 발생이 아닌 대상체를 나타낸다, 즉 본 용어는 인간에 의해 제조되거나 변형된 대상체를 나타낸다. 예를 들어, 실험실에서 인간에 의해 생성된(예컨대 유전 조작에 의해, 셔플링 방법에 의해, 또는 화학 반응에 의해 등) 또는 의도적으로 변형된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 "비-천연"이다. "비-천연" 및 "인공"이라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 이용된다. 예를 들어, 적어도 하나의 Ig 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 Ig-결합 단백질은 비-천연 단백질이다.
본 발명에 따라 본원에서 상호 교환적으로 이용되는 "항체" 또는 "Ig" 또는 "면역글로불린"이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 2개 중쇄 및 2개 경쇄(면역글로불린 또는 IgG 항체)로 구성되는 4-폴리펩타이드쇄 구조를 갖는 단백질을 포함한다. "항체 경쇄"라는 용어는 항원 결합을 위해 중요한 2개의 일렬 면역글로불린 도메인, 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인으로 이루어지는 항체 사슬의 작은 폴리펩타이드 서브유닛을 표시한다. "항체 중쇄"라는 용어는 항체의 클래스 또는 이소형을 결정하는 항체의 큰 폴리펩타이드 서브유닛을 표시한다. 또한, 여전히 결합 특이성을 보유하는 단편 또는 이의 유도체가 "항체"라는 용어에 포함된다. 항체 단편은 본원에서 온전한 또는 전체 항체 또는 항체 사슬보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 이해된다. "항체"라는 용어에는 또한 키메라(인간 불변 도메인, 비-인간 가변 도메인), 단일쇄 및 인간화(비-인간 CDR을 제외하면 인간 항체) 항체와 같은 구현예가 포함된다. 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성되는 전장 IgG 항체가 본 발명에서 가장 바람직하다. 중쇄 및 경쇄는 비-공유 상호작용 및 디설파이드 결합을 통해 연결된다.
본원에서 이용되는 "링커"라는 용어는 그 가장 광의의 의미에서 적어도 2개의 다른 분자를 공유 연결하는 분자를 나타낸다. 본 발명의 전형적인 구현예에서, "링커"는 제1 폴리펩타이드를 적어도 하나의 추가 폴리펩타이드와 연결하는 모이어티로 이해되어야 한다. 제2 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드와 동일할 수도 있고 또는 상이할 수도 있다. 이러한 전형적 구현예에서 펩타이드 링커가 바람직하다. 이는 펩타이드 링커가 제1 폴리펩타이드를 제2 폴리펩타이드와, 예를 들어 제1 Ig 결합 도메인을 제2 Ig 결합 도메인과 연결하는 아미노산 서열임을 의미한다. 펩타이드 링커는 제1 폴리펩타이드에 그리고 제2 폴리펩타이드에 펩타이드 결합에 의해 연결됨으로써 하나의, 선형 폴리펩타이드쇄를 생성한다. 링커의 길이 및 조성은 적어도 하나 내지 최대 30개 아미노산으로 변할 수 있다. 보다 구체적으로, 펩타이드 링커는 1 내지 30개 아미노산; 예컨대1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 아미노산의 길이를 갖는다. 펩타이드 링커의 아미노산 서열이 프로테아제에 대해 안정하고/하거나 이차 구조를 형성하지 않는 것이 바람직하다. 소형 아미노산, 예컨대 글리신 및 세린으로 이루어진 링커는 널리 공지되어 있다. 링커는 글리신이 풍부할 수 있다(예컨대, 링커 내 50% 초과 잔기가 글리신 잔기일 수 있다). 글리신 및 세린 잔기로만 구성되는 가변 길이의 글리신-세린-링커가 바람직하다. 일반적으로, 구조 (SGGG)n 또는 SGGG의 치환, 예컨대 (GGGS)n의 링커가 이용될 수 있고, 여기서 n은 1 내지 6, 바람직하게는 1 또는 2 또는 3의 임의의 수일 수 있다. 추가 아미노산을 포함하는 링커도 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예는 알라닌, 프롤린, 및 세린으로 구성되는 링커를 포함한다. 펩타이드 링커는 약 40% 내지 60% 알라닌, 약 20% 내지 35% 프롤린, 및 약 10% 내지 30% 세린으로 구성되는 것이 바람직하다. 아미노산 알라닌, 프롤린, 및 세린은 최대 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 동일한 아미노산 잔기, 바람직하게는 최대 3개의 아미노산이 인접하도록 링커 아미노산 서열을 통해 균일하게 분포되는 것이 바람직하다. 단백질의 융합을 위한 다른 링커가 당분야에 공지되어 있고 이용될 수 있다.
본 발명에서 이용 가능한 예시적인 링커는 다음 링커이다: 적어도 아미노산 서열 SG를 갖는 링커 또는 임의의 다른 링커, 예를 들어 SGGGG[SEQ ID NO: 31], SGGGGSGGGG[SEQ ID NO: 32], GGGSGGGSGGGS[SEQ ID NO: 33], GGGGSGGGGSGGGGS[SEQ ID NO: 34], GGGGS[SEQ ID NO: 35], GGGS[SEQ ID NO: 36], SGGG[SEQ ID NO: 37], 또는 (GGGS)n(즉, SEQ ID NO: 36의 n회 반복으로, 여기서 n은 1 내지 5이다(예컨대, n은 1, 2, 3, 4, 또는 5일 수 있다)), (SGGG)n(즉, SEQ ID NO: 37의 n회 반복으로, 여기서 n은 1 내지 5이다(예컨대, n은 1, 2, 3, 4, 또는 5일 수 있다), 또는 SAAPAPSAPASAAPAPAPAPAPSPAAPAAS[SEQ ID NO: 41], ASPSPAAPAPAPSAASPAPAAPAPAASPAA[SEQ ID NO: 42], 또는 ASPAPSAPSA[SEQ ID NO: 43]). 2개의 IgG 결합 도메인 또는 2개의 IgG 결합 단백질의 융합을 위한 다른 링커도 당분야에 공지되어 있고 이용될 수 있다.
"융합된"이라는 용어는 성분이 직접 또는 펩타이드 링커를 통해, 펩타이드 결합에 의해 연결됨을 의미한다. "융합 단백질"이라는 용어는 적어도 제2 단백질에 유전적으로 연결된 적어도 제1 단백질을 포함하는 단백질에 관한 것이다. 융합 단백질은 별개의 단백질에 대해 원래 코딩한 2개 이상의 유전자의 연결을 통해 생성된다. 따라서, 융합 단백질은 하나의, 선형 폴리펩타이드로 발현되는 동일하거나 상이한 결합 단백질의 다량체를 포함할 수 있다. 이는 2, 3, 4개 또는 훨씬 더 많은 결합 도메인 또는 결합 단백질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질은 당업자에게 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 인공적으로 생성된다. 본 발명의 Ig 결합 단백질은 임의의 여러 통상적이고 널리 공지된 기법, 예컨대 일반 유기 합성 전략, 고상-보조 합성 기법에 의해 또는 상업적으로 이용 가능한 자동화 합성장치에 의해 제조될 수 있다.
바람직하게는, 본원에서 이용되는 "다량체"라는 용어는 적어도 2개의 IgG 결합 도메인, 바람직하게는 2개(이량체), 3개(삼량체), 4개(사량체), 5개(오량체), 6개(육량체), 7개(칠량체), 또는 8개(팔량체) IgG 결합 도메인, 보다 바람직하게는 4, 5, 또는 6개 IgG 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 다량체 내의 Ig 결합 도메인은 동일하다. 다른 구현예에서, 다량체의 Ig 결합 도메인은 상이할 수 있다. 하나 이상의 링커 서열이 다량체의 도메인 사이에 삽입된다.
"아미노산 서열 동일성"이라는 용어는 2개 이상의 단백질의 아미노산 서열의 동일성(또는 차이)의 정량적 비교를 나타낸다. 기준 폴리펩타이드 서열에 관한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 기준 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.
서열 동일성을 결정하기 위해, 쿼리 단백질의 서열이 기준 단백질의 서열과 정렬된다. 정렬 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 기준 아미노산 서열 대비 임의의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 동일성 정도를 결정하기 위해, 자유롭게 이용 가능한(또한, http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html 참고) SIM Local 유사성 프로그램이 바람직하게 채택된다(Xiaoquin Huang and Webb Miller (1991), Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337-357). 다중 정렬 분석을 위해 ClustalW가 바람직하게 이용된다(Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680). 바람직하게는, 서열 동일성 백분율을 계산할 때, SIM Local 유사성 프로그램의 또는 ClustalW의 기본 파라미터가 이용된다.
본 발명의 맥락에서, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 변형된 서열 및 이것이 유도되는 서열 간 서열 동일성 정도는 일반적으로 변형되지 않은 서열의 전체 길이에 관해 계산된다.
주어진 위치에서 기준 아미노산 서열과 상이한 쿼리 서열의 각각의 아미노산이 하나의 차이로 카운팅된다. 쿼리 서열 내 삽입 또는 결실도 하나의 차이로 카운팅된다. 예를 들어, 2개의 결합 도메인 간 링커의 삽입은 기준 서열 대비 하나의 차이로서 카운팅된다. 이어서 차이의 합이 기준 서열의 길이와 관련되어 비-동일성 백분율을 산출한다. 정량적인 동일성 백분율은 100 마이너스 비동일성의 백분율로 계산된다.
본원에서 이용되는 "약"이라는 용어는 명시적으로 인용된 양뿐만 아니라 이로부터 ㅁ10%의 편차를 포괄한다. 보다 바람직하게는, 편차 5%가 "약"이라는 용어에 의해 포괄된다.
본원에서 이용되는 "셔플링된"이라는 용어는 다음 (a) 셔플링될 적어도 2개 서열의 세트를 제공하는 단계; (b) 상기 서열을 정렬하는 단계; 및 (c) 정렬된 서열로부터 새로운 서열을 어셈블리하는 단계로서, 여기서 새로운 서열의 각 위치에서의 아미노산은 임의의 정렬된 서열의 동일한 위치로부터 유래될 수 있는 단계를 포함하는 공지된 서열 세트에서 시작되는 신규한 비-천연 서열을 생성하는 어셈블리 공정을 나타낸다. 바람직하게는, 2개 이상의 연속 아미노산이 정렬된 서열 중 하나로부터 유래된다.
"크로마토그래피"라는 용어는 샘플 중 다른 분자(예컨대 오염물질)로부터 하나의 유형의 분자(예컨대, 면역글로불린)를 분리하기 위해 이동상 및 정지상을 채택하는 분리 기술을 나타낸다. 액체 이동상은 분자 혼합물을 함유하며 정지상(예컨대 고체 매트릭스)에 걸쳐 또는 이를 통해 이들을 수송한다. 이동상 내 상이한 분자와 정지상의 차별적 상호작용으로 인해, 이동상 내 분자가 분리될 수 있다.
"친화도 크로마토그래피"라는 용어는 정지상에 커플링된 리간드가 이동상(샘플) 내 분자(즉, 면역글로불린)와 상호작용하는, 즉 리간드가 정제될 분자에 대한 특이적 친화도를 갖는 특이적 방식의 크로마토그래피를 나타낸다. 본 발명의 맥락에서 이해되는 바와 같이, 친화도 크로마토그래피에는 크로마토그래피 리간드, 예컨대 본 발명의 Ig 결합 단백질을 포함하는 정지상에 대한 면역글로불린을 함유하는 샘플의 첨가가 관여된다. "고체 지지체" 또는 "고체 매트릭스"라는 용어는 정지상에 대해 상호 교환적으로 이용된다.
본원에서 상호 교환적으로 이용되는 "친화도 매트릭스" 또는 "친화도 분리 매트릭스" 또는 "친화도 크로마토그래피 매트릭스"라는 용어는 친화도 리간드(예컨대, 본 발명의 Ig 결합 단백질)가 부착되는 매트릭스, 예컨대 크로마토그래피 매트릭스를 나타낸다. 리간드(예컨대, Ig 결합 단백질)는 혼합물로부터 정제되거나 제거될 친화도 상호작용을 통해 관심 분자(예컨대, 면역글로불린 또는 Fc-함유 단백질)에 결합할 수 있다.
본원에서 이용되는 "친화도 정제"라는 용어는 매트릭스에 고정화되는 Ig 결합 단백질에 대한 면역글로불린 또는Fc-함유 단백질의 결합에 의한 액체로부터의 면역글로불린 또는Fc-함유 단백질의 정제 방법을 나타낸다. 이에 의해, 면역글로불린 또는Fc-함유 단백질 이외의 혼합물의 모든 다른 성분이 제거된다. 추가 단계에서, 결합된 면역글로불린 또는Fc-함유 단백질은 정제된 형태로 용출될 수 있다.
"알칼리 안정한" 또는 "알칼리 안정성" 또는 "부식제 안정한" 또는 "부식제 안정성"이라는 용어는 면역글로불린에 결합하는 능력을 유의미하게 소실하지 않고 알칼리 조건을 견디는 본 발명의 Ig 결합 단백질의 능력을 나타낸다. 당분야 숙련가는 Ig 결합 단백질을, 예컨대 실시예에 기재된 바와 같이 나트륨 하이드록사이드와 인큐베이션한 후, 예를 들어, 크로마토그래피 접근에 의해, 당분야 일부 숙련자에게 공지된 일상적 실험에 의해 면역글로불린에 대한 결합 활성을 평가하여 알칼리 안정성을 쉽게 시험할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 Ig 결합 단백질뿐만 아니라 본 발명의 Ig 결합 단백질을 포함하는 매트릭스는 "증가된" 또는 "개선된" 알칼리 안정성을 나타내며, 이는 상기 Ig 결합 단백질을 포함하는 분자 및 매트릭스가 천연 발생 단백질 A 도메인에 비해 연장된 시기 동안 알칼리 조건 하에 안정함을, 즉 면역글로불린에 결합하는 능력을 소실하지 않거나 면역글로불린에 결합하는 능력을 천연 발생 단백질 A 도메인에 비해 더 적은 정도로 소실함을 의미한다.
본원에서 상호 교환적으로 이용되는 "결합 활성" 또는 "결합능" 또는 "정적 결합능"이라는 용어는 면역글로불린에 결합하는 본 발명의 Ig 결합 단백질의 능력을 나타낸다. 예를 들어, 결합 활성은 알칼리 처리 이전 및/또는 이후 결정될 수 있다. 결합 활성은 Ig 결합 단백질에 대해, 또는 매트릭스에 커플링된 Ig 결합 단백질에 대해, 즉 고정화된 결합 단백질에 대해 결정될 수 있다.
분자 생물학, 세포 생물학, 단백질 화학 및 항체 기법 분야에 일반적으로 공지되고 실시되는 방법은 계속해서 업데이트되는 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (Sambrook et al., Cold Spring Harbor); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. Eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Protein Science (J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Cell Biology (J. S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) 및 Current Protocols in Immunology (J. E. Colligan et al., Eds., Wiley & Sons)]에 충분히 기재되어 있다. 세포 배양 및 배지에 관한 공지된 기법은 문헌["Large Scale Mammalian Cell Culture (D. Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:148-153, 1997); "Serum free Media" (K. Kitano, Biotechnol. 17:73-106, 1991); 및 "Suspension Culture of Mammalian Cells" (J.R. Birch et al. Bioprocess Technol. 10:251-270 (1990)]에 기재되어 있다.
발명의 구현예
이제 본 발명을 추가 설명할 것이다. 아래 단락에서, 본 발명의 상이한 양태가 보다 상세히 정의된다. 명확히 반대로 나타내지 않는 한, 아래에서 정의된 각각의 양태는 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 시사되는 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 시사되는 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 비-천연 Ig-결합 도메인을 포함하는 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질에 대한 것이며, 여기서 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYX15X16LX18X19PX21LX23X24X25QRX28X29FIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QX56PX58(SEQ ID NO: 1)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되고, 식 중 X1은 A, V, Q, N, 또는 P; 바람직하게는 N, V, P, 또는 A이고; X2는 D, A, 또는 Q; 바람직하게는 D 또는 A이고; X3은 A, S, 또는 N이고; X4는 K, Q, 또는 N; 바람직하게는 K 또는 Q이고; X5는 H 또는 F이고; X6은 D, N, S, 또는 A; 바람직하게는 D, S, 또는 A이고: X7은 E 또는 K이고; X8은 D, E 또는 A이고; X11은 S 또는 N이고; X15는 E, D, 또는 Q; 바람직하게는 E이고; X16은 V 또는 I; 바람직하게는 I이고; X18은 H 또는 N; 바람직하게는 H이고; X19는 L 또는 M; 바람직하게는 L이고; X21은 N, S, 또는 D이고; X23은 T 또는 N; 바람직하게는 T이고; X24는 E 또는 A; 바람직하게는 E이고; X25는 D 또는 E이고; X28은 N, S, 또는 A이고; X29는 G 또는 A; 바람직하게는 A이고; X40은 V 또는 Q 또는 T이고; X42는 K, T, 또는 A; 바람직하게는 K 또는 A이고; X43은 E, N, 또는 S; 바람직하게는 E 또는 S이고; X44는 V, L, 또는 I이고; X46은 G 또는 A이고; X49는 K 또는 Q이고; X52는 N, S, 또는 D이고; X53은 D 또는 E이고; X54는 S 또는 A이고; X56은 A 또는 P; 바람직하게는 A이고; 및 X58은 K 또는 P이고;
여기서 인간 IgG1에 대한 상기 비-천연 Ig-결합 단백질의 해리 상수 KD는 1 μΜ 이하, 바람직하게는 500 nM, 보다 바람직하게는 100 nM 이하이다. 보다 상세하게는, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 38에 나타낸 바람직한 구현예는 SEQ ID NO: 9 내지 30의 정렬로 생성되는 일반 서열이다. 따라서, 본 발명의 Ig 결합 단백질의 각각의 비-천연 Ig 결합 도메인은 천연 발생 Ig 결합 도메인에 대해 약 50% 내지 약 85% 서열 동일성을 나타내며, 표 1을 참고한다(실시예 1 참고). 본 발명의 Ig 결합 단백질의 각각의 비-천연 Ig 결합 도메인은 천연 발생 Ig 결합 도메인의 위치 Q9, A12, F13, L17, Q26, R27, F30, I31, L34, P38, S41, L45, A48, L51, Q55에 대응하는 위치에서 동일한 아미노산을, 보다 바람직하게는 천연 발생 Ig 결합 도메인, 예를 들어 도메인 C, 도메인B, 도메인 A, 도메인 E, 및 도메인 D의 위치 Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, I31, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, P57에 대응하는 위치에서 동일한 아미노산을 갖는다.
제1 양태의 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 비-천연 Ig-결합 도메인은 아미노산 서열
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYEILHLPX21LTEX25QRX28AFIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QAPX58(SEQ ID NO: 38)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되며, 식 중
X1은 N, V, P, 또는 A이며;
X2는 D 또는 A이고;
X3은 A, S, 또는 N이고;
X4는 K 또는 Q이고;
X5는 H 또는 F이고;
X6은 D, S, 또는 A이고;
X7은 E 또는 K이고;
X8은 D, E 또는 A이고;
X11은 S 또는 N이고;
X21은 N, S, 또는 D이고;
X25는 D 또는 E이고;
X28은 N, S, 또는 A이고;
X40은 V, T, 또는 Q이고;
X42는 K 또는 A이고;
X43은 E 또는 S이고;
X44는 V, L, 또는 I이고;
X46은 G 또는 A이고;
X49는 K 또는 Q이고;
X52는 N, S, 또는 D이고;
X53은 D 또는 E이고;
X54는 S 또는 A이고;
X58은 K 또는 P이다.
SEQ ID NO: 38은 SEQ ID NO: 9 ~ 30의 정렬로 생성된 일반 아미노산 서열이고 SEQ ID NO: 1의 바람직한 선택이다.
제1 양태의 하나의 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 비-천연 Ig-결합 도메인은 아미노산 서열
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYX15X16LX18X19PX21LX23X24X25QRX28X29FIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QX56PX58(SEQ ID NO: 2)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되며, 식 중
X1은 A, V, Q, N, 또는 P이며; X2는 D, A, 또는 Q이고; X3은 A 또는 N이고; X4는 K, Q, 또는 N이고; X5는 H 또는 F이고; X6은 D, N, 또는 A이고; X7은 E 또는 K이고; X8은 D, E 또는 A이고; X11은 S 또는 N이고; X15는 E 또는 D이고; X16은 V 또는 I이고; X18은 H 또는 N이고; X19는 L 또는 M이고; X21은 N, S, 또는 D이고; X23은 T 또는 N이고; X24는 E 또는 A이고; X25는 D 또는 E이고; X28은 N, S, 또는 A이고; X29는 G 또는 A이고; X40은 V 또는 Q이고; X42는 K, T, 또는 A이고; X43은 E 또는 N이고; X44는 V, L, 또는 I이고; X46은 G 또는 A이고; X49는 K 또는 Q이고; X52는 N 또는 D이고; X53은 D 또는 E이고; X54는 S 또는 A이고; X56은 A 또는 P이고; 및 X58은 K 또는 P이다.
제1 양태의 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 Ig 결합 단백질은 하나 이상의 비-천연 Ig 결합 도메인을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은 아미노산 서열
X1X2AX4X5DX7X8QQX11AFYEILHLPNLTEX25QRNAFIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLNX53X54QAPK(SEQ ID NO: 48)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되며, 식 중
X1은 N 또는 V이고;
X2는 D 또는 A이고;
X4는 K 또는 Q이고;
X5는 H 또는 F이고;
X7은 E 또는 K이고;
X8은 D, E 또는 A이고;
X11은 S 또는 N이고;
X25는 D 또는 E이고;
X40은 V 또는 Q이고;
X42는 K 또는 A이고;
X43은 E 또는 S이고;
X44는 V 또는 I이고;
X46은 G 또는 A이고;
X49는 K 또는 Q이고;
X53은 D 또는 E이고;
X54는 S 또는 A이다.
SEQ ID NO: 48은 SEQ ID NO: 24, 26, 27, 28, 및 30의 정렬로 생성된 일반 아미노산 서열이고 SEQ ID NO: 38의 바람직한 선택이다. Ig 결합 단백질은 연장된 시기 동안 알칼리 처리(예컨대 적어도 최대 6시간, 0.5 M NaOH) 후에도 안정하다, 예를 들어, 본 발명의 Ig 결합 단백질은 천연 발생 단백질 A 도메인보다 높은 알칼리 안정성을 갖는다.
제1 양태의 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 Ig 결합 단백질은 하나 이상의 비-천연 Ig 결합 도메인을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 Ig 결합 도메인은 아미노산 서열
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYEILHLPX21LTEDQRX28AFIQSLKDDPSX40SKX43X44LGEAKKLX52DAQAPP(SEQ ID NO: 49)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되며, 식 중
X1은 P, N, 또는 A이며;
X2는 A 또는 D이고;
X3은 A, S, 또는 N이고;
X4는 K 또는 Q이고;
X5는 H 또는 F이고;
X6은 D, S, 또는 A이고;
X7은 K 또는 E이고;
X8은 D, E 또는 A이고;
X11은 S 또는 N이고;
X21은 N, S, 또는 D이고;
X28은 S 또는 A이고;
X40은 V 또는 T이고;
X43은 E 또는 S이고;
X44는 I 또는 L이고;
X52는 N, S, 또는 D이다.
SEQ ID NO: 49는 SEQ ID NO: 9 내지 23의 정렬로 생성된 일반 아미노산 서열이고 SEQ ID NO: 38의 바람직한 선택이다.
제1 양태의 하나의 구현예에서, 비-천연 Ig-결합 단백질은 하나 이상의 Ig-결합 도메인을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 비-천연 Ig-결합 도메인은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
NAAQHAKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 9),
NAAQHDKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 10),
NAAQHSKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 11),
NAAQHSKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 12),
PAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 13),
PAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 14),
ADNKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 15),
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 16),
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 17),
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPDLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 18),
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSVSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 19),
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 20),
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLDDAQAPP(SEQ ID NO: 21),
ADSKFDEAQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSLLGEAKKLSDAQAPP(SEQ ID NO: 22),
PAAKHDKDQQSAFYEILHLPSLTEDQRAAFIQSLKDDPSTSKSILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 23),
NAAQHDKEQQNAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO: 24),
ADNKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO: 25),
NAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 26),
NAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO: 27),
NAAKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEVLGEAQKLNDSQAPK(SEQ ID NO: 28),
QQAQHDEAQQSAFYQVLHLPNLTADQRNAFIQSLKDDPSQSAEVLGEAQKLNDSQAPK(SEQ ID NO: 29), 및
VDAQHDEDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSAEILAEAKKLNESQAPK(SEQ ID NO: 30).
하나 이상의 Ig-결합 도메인을 포함하는 비-천연 Ig-결합 단백질이 특히 바람직하며, 여기서 적어도 하나의 비-천연 Ig-결합 도메인은 SEQ ID NO: 13, 14, 23, 26, 27, 28, 및 30으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된다.
아래에서 본원의 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단백질은 IgG에 결합하는 것으로 나타났다. 보다 상세하게는, SEQ ID NO: 1의 일반 서열, 보다 구체적으로는 SEQ ID NO: 38, 또는 SEQ ID NO: 2의 일반 서열, 보다 구체적으로 SEQ ID NO: 9~30을 포함하는 Ig-결합 폴리펩타이드는 천연 발생 Ig 결합 도메인의 결합 특성과 필적하는 고친화도로 IgG에 결합할 수 있는 것으로 나타났다(표 2, 실시예 5, 및 표 3, 실시예 6 참고). 더욱 놀랍고 예상치 못하게도, SEQ ID NO: 1의 일반 서열, 보다 구체적으로는 SEQ ID NO: 38, 또는 SEQ ID NO: 2의 일반 서열, 보다 구체적으로 SEQ ID NO: 9~30을 포함하는 Ig-결합 단백질은 여러 시간 동안의 알칼리 처리 후에도, 예를 들어 최대 6시간 동안 0.5 M NaOH로의 처리 후에도 IgG에 결합할 수 있다. 이는 천연 발생 단백질 A 도메인 또는 도메인 Z에 비해 유리한 특성이다(예컨대, 실시예 7 및 실시예 8 그리고 도 8 및 도 9에서의 비교 데이터 참고).
본 발명의 하나의 구현예에서, 비-천연 Ig-결합 단백질은 서로 연결된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개, 바람직하게는 4, 5, 또는 6개의 비-천연-발생 Ig-결합 도메인을 포함한다, 즉 비-천연 Ig-결합 단백질은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 등일 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 14를 이용하여 실시예 1에서 본원에 기재된 다량체성 융합 구축물을 생성하였다. 하나를 초과하는 Ig 결합 도메인을 포함하는 수득된 Ig 결합 단백질은 안정하며, 알칼리 처리 후에도 Ig 결합 특성을 나타낸다(예를 들어, 도 10 참고). 다량체성 Ig 결합 단백질에 대해 선택된, 그러나 비제한적인 예가 SEQ ID NO: 45(이량체), SEQ ID NO: 46(사량체), 또는 SEQ ID NO: 47(육량체)에 제공된다.
제1 양태의 일부 구현예에서, 비-천연 Ig-결합 도메인은 서로 직접 연결된다. 제1 양태의 다른 구현예에서, 비-천연 Ig-결합 도메인은 펩타이드 링커를 통해 서로 연결된다. 제1 양태의 일부 구현예에서, Ig 결합 단백질의 모든 비-천연 Ig-결합 도메인의 아미노산 서열은 동일하다(예를 들어, SEQ ID NO: 45~47). 제1 양태의 다른 구현예에서, 적어도 하나의 비-천연 Ig-결합 도메인은 비-천연 면역글로불린-결합 단백질 내의 다른 Ig-결합 도메인과 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
Ig 결합 단백질 또는 도메인의 해리 상수 KD는 상기에서 그리고 실시예(예컨대 실시예 5 및 실시예 6 참고)에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 전형적으로, 해리 상수 KD는 20℃, 25℃ 또는 30℃에서 결정된다. 달리 구체적으로 나타내지 않으면, 본원에서 인용되는 KD값은 표면 플라즈몬 공명에 의해 25℃ +/- 3℃에서 결정된다. 제1 양태의 하나의 구현예에서, 비-천연 Ig-결합 단백질은 0.1 nM 내지 1000 nM, 바람직하게는 0.1 nM 내지 500 nM, 보다 바람직하게는 0.1 nM 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 0.5 nM 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 1 nM 내지 10 nM 범위의, 인간 IgG1에 대한 해리 상수 KD를 갖는다.
제1 양태의 하나의 구현예에서, 비-천연 Ig-결합 단백질은 0.1 nM 내지 1000 nM, 바람직하게는 0.1 nM 내지 500 nM, 보다 바람직하게는 0.1 nM 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 0.5 nM 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 1 nM 내지 10 nM 범위의 인간 IgG2에 대한 해리 상수 KD를 갖는다.
제1 양태의 하나의 구현예에서, 비-천연 Ig-결합 단백질은 0.1 nM 내지 1000 nM, 바람직하게는 0.1 nM 내지 500 nM, 보다 바람직하게는 0.1 nM 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 0.5 nM 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 1 nM 내지 10 nM 범위의 인간 IgG4에 대한 해리 상수 KD를 갖는다.
제2 양태에서, 본 발명은 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질을 포함하는 조성물에 대한 것이다.
제2 양태의 바람직한 구현예에서, 조성물은 친화도 분리 매트릭스이며, 이는 고체 지지체에 커플링된 상술된 임의의 구현예에 따른 비-천연 Ig-결합 단백질을 포함한다. 친화도 분리 매트릭스는 고체 지지체에 커플링된 본 발명의 복수의 Ig 결합 단백질을 포함한다.
본 발명의 비-천연 Ig 결합 단백질을 포함하는 상기 매트릭스는 면역글로불린 및 다른 Fc-함유 단백질, 예컨대 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 유도체, 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 콘주게이트의 분리에, 예를 들어 크로마토그래피 분리에 유용하다. 친화도 크로마토그래피를 위한 고체 지지체 매트릭스는 당분야에 공지되어 있으며 예를 들어 비제한적으로 아가로스 및 아가로스의 안정화된 유도체(예컨대 rPROTEIN A Sepaharose Fast Flow 또는 Mabselect®), 제어된 포어 글래스(예컨대 ProSep® vA 수지), 모노리쓰(예컨대 CIM® 모노리쓰), 실리카, 지르코늄 옥사이드(예컨대 CM Zirconia 또는 CPG®), 티타늄 옥사이드, 또는 합성 중합체(예컨대 폴리스티렌, 예컨대 Poros 50A 또는 Poros MabCapture® A 수지, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 알코올, 폴리하이드록시알킬 아크릴레이트, 폴리하이드록시알킬 메타크릴레이트, 폴리아크릴아마이드, 폴리메타크릴아마이드 등) 및 다양한 조성의 하이드로겔이 포함된다. 소정 구현예에서, 지지체는 폴리하이드록시 중합체, 예컨대 다당류를 포함한다.
지지체에 적합한 다당류의 예에는 비제한적으로 덱스트란, 전분, 셀룰로스, 풀루란, 한천, 아가로스 등, 및 이의 안정화된 변이체가 포함된다.
고체 지지체 포맷은 임의의 적합한 널리 공지된 종류일 수 있다. 본 발명의 Ig 결합 단백질의 커플링을 위한 이러한 고체 지지체는 예를 들어 컬럼, 모세관, 입자, 멤브레인, 필터, 모노리쓰, 섬유, 패드, 겔, 슬라이드, 플레이트, 카세트, 또는 크로마토그래피에서 일반적으로 이용되고 당분야 일부 숙련가에게 공지된 임의의 다른 포맷 중 하나를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 매트릭스의 하나의 구현예에서, 담체는 비드, 예를 들어 세파로스 또는 아가로스 비드로도 알려져 있는, 실질적으로 구형인 입자로 이루어진다. 적합한 입자 크기는 5~500 ㎛, 예컨대 10~100 ㎛, 예컨대 20~80 ㎛의 지름 범위일 수 있다. 대안적인 구현예에서, 담체는 멤브레인, 예를 들어 하이드로겔 멤브레인이다. 일부 구현예에서, 친화도 정제에는 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질이 공유 결합되는 매트릭스로서 멤브레인이 관여된다.
고체 지지체는 또한 카트리지 내 멤브레인의 형태일 수 있다. 하나의 구현예에서, 고체 매트릭스는 다공성이거나 비-다공성일 수 있는 비드화된 또는 입자 형태이다. 비드화된 또는 입자 형태의 매트릭스는 패킹된 층으로서 또는 팽창된 층을 포함하는 현탁된 형태로 이용될 수 있다. 모노리쓰, 패킹된 층 및 팽창된 층의 경우, 분리 절차는 일반적으로 이동상에서 농도 구배 또는 농축 단계를 포함하는 통상적 크로마토그래피를 따른다. 순수 현탁액의 경우, 배치식 방식이 이용될 것이다.
일부 구현예에서, 친화도 정제에는 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질이 공유 결합되는 고체 지지체를 함유하는 크로마토그래피 컬럼이 관여된다.
본 발명의 Ig 결합 단백질은, 예컨대 본 발명의 Ig 결합 단백질에 존재하는 아미노-, 설프하이드록시-, 및/또는 카복시-기를 이용하는 통상적 커플링 기법을 통해 적합한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 커플링은 Ig 결합 단백질의 질소, 산소, 또는 황 원자를 통해 수행될 수 있다. 바람직하게는, N- 또는 C-말단 펩타이드 링커에 포함되는 아미노산은 상기 질소, 산소 또는 황 원자를 포함한다. Ig 결합 단백질은 직접적으로 또는 스페이서 요소를 통해 간접적으로 담체에 커플링되어 Ig 결합 단백질의 이용 가능성을 개선하고 지지체에 대한 본 발명의 Ig 결합 단백질의 화학적 커플링을 촉진하는 담체 표면 및 본 발명의 Ig 결합 단백질 간에 적절한 거리를 제공할 수 있다. 고체 지지체에 대한 단백질 리간드의 고정화 방법은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 표준 기법 및 설비를 이용하여 당분야 숙련가에 의해 쉽게 수행된다.
하나의 구현예에서, 비-천연 Ig-결합 단백질은 고상(매트릭스)에 대한 공유 부착을 위한 부착 부위를 포함한다. 바람직하게는, 부착 부위는 고상에 대한 부위-특이적 부착을 제공하는 데 특이적이다. 특이적 부착 부위는, 예를 들어 설프하이드릴, 말레이미드, 에폭시, 또는 알켄기로부터 선택되는 고상의 반응기와의 특이적 화학 반응을 구현하는 천연 아미노산, 예컨대 시스테인 또는 라이신, 또는 비-천연 아미노산, 또는 고상 및 단백질 간 링커를 포함한다. N-말단은 아미노-반응성 시약으로 바람직하게는 산성 pH에서 표지될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예는 말단 시스테인을 포함하는, 5~20개 아미노산, 바람직하게는 10개 아미노산의 짧은 N- 또는 C-말단 펩타이드 서열을 포함한다. C-말단 펩타이드 서열에 대한 아미노산은 바람직하게는 프롤린, 알라닌, 세린으로부터 선택된다, 예를 들어 ASPAPSAPSAC(SEQ ID NO: 39)이다.
제3 양태에서, 본 발명은 면역글로불린의 친화도 정제를 위한 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질 또는 제2 양태의 조성물의 용도에 대한 것이다, 즉 본 발명의 Ig-결합 단백질은 친화도 크로마토그래피를 위해 이용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 Ig-결합 단백질은 본 발명의 제2 양태에 기재된 바와 같이 고체 지지체 상에 고정화된다. 제3 양태의 하나의 구현예에서, 정제될 면역글로불린은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG4, 인간 IgM, 인간 IgA, 마우스 IgG1, 마우스 IgG2A, 마우스 IgG2B, 마우스 IgG3, 래트 IgG1, 래트 IgG2C, 염소 IgG1, 염소 IgG2, 소 IgG2, 기니아픽 IgG, 토끼 IgG, Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 단편, 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 콘주게이트로 구성되는 군으로부터 선택된다.
제4 양태에서, 본 발명은 (a) 면역글로불린을 함유하는 액체를 제공하는 단계; (b) 제1 양태의 고정화된 비-천연 Ig-결합 단백질을 포함하는 친화도 분리 매트릭스를 제공하는 단계; (c) 상기 액체 및 상기 친화도 분리 매트릭스를 접촉시키는 단계로서, 상기 면역글로불린은 상기 고정화된 비-천연 Ig-결합 단백질에 결합하는 단계; 및 (d) 상기 매트릭스로부터 상기 면역글로불린을 용출함으로써 상기 면역글로불린을 함유하는 용출액을 수득하는 단계; 및 (e) 선택적으로 단계 (c) 및 (d) 간에 수행되는 1회 이상의 세척 단계를 추가로 포함하는 단계를 포함하는 면역글로불린의 친화도 정제 방법에 대한 것이다. 친화도 분리 매트릭스는 상술된 구현예에 따르며 당분야의 일부 숙련가에게 공지된 바와 같다.
제4 양태의 일부 구현예에서, 단계 (d)에서 매트릭스로부터의 면역글로불린의 단리는 pH 변화 또는 염 농도 변화를 통해 실시된다. 제4 양태의 일부 구현예에서, 방법은 (f) 상기 용출액을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
제4 양태의 하나의 구현예에서, 면역글로불린은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG4, 인간 IgM, 인간 IgA, 마우스 IgG1, 마우스 IgG2A, 마우스 IgG2B, 마우스 IgG3, 래트 IgG1, 래트 IgG2C, 염소 IgG1, 염소 IgG2, 소 IgG2, 기니아픽 IgG, 토끼 IgG, Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 단편, 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 콘주게이트로 구성되는 군으로부터 선택된다.
제5 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따른 적어도 하나의 Ig-결합 도메인을 포함하는 비-천연 Ig-결합 단백질의 생성 방법에 대한 것이며, 여기서 Ig-결합 도메인의 아미노산 서열은 천연 발생 단백질 A로부터 적어도 2개의 천연 발생 단백질 A 도메인의 아미노산 서열의 셔플링 공정에 의해 수득된다. 보다 상세하게는, 본원에서 이해되는 바와 같은 셔플링 공정은 다음 (a) 셔플링될 서열 세트, 예를 들어 5개의 천연 발생 단백질 A 도메인 E, D, A, B, 및 C 및 단백질 A 유도체(예컨대, Z 도메인 또는 임의의 천연 발생 도메인과 적어도 90% 동일성을 갖는 다른 도메인)의 서열을 제공하는 단계; (b) 상기 서열을 정렬하는 단계; (c) 컴퓨터내 통계적 단편화 단계, 이어서 (d) 다양한 단편으로부터 새로운 서열을 컴퓨터내 어셈블리하여 상대적 순서를 유지하는 모자이크 산물을 제조하는 단계를 포함하여 동일하지 않은 공지된 아미노산 서열 세트로부터 시작해서 신규한 인공 아미노산 서열을 생성하는 어셈블리 공정이다. 단계 c)에서 생성된 단편은 임의의 길이일 수 있다, 예컨대 단편화된 모체 서열이 n의 길이를 가지는 경우, 단편은 1 내지 n-1의 길이일 수 있다. 따라서, 재어셈블리된 단백질은 이들 하위서열이 단계 (b)에서 정렬된 단백질 A로부터의 하나 이상의 개별 IgG-결합 도메인에서 대응하는 위치에 존재하도록 하나 이상의 아미노산의 하위서열을 포함하는 일련의 단편으로 제조된다. 다시 말하면, 어셈블리된 모자이크 서열의 모든 아미노산 위치에서, 대응하는 위치에 동일한 아미노산을 포함하는 단백질 A로부터의 정렬된 IgG-결합 도메인 중 적어도 하나의 단백질이 존재한다. 그러나, 재어셈블리된 단백질의 전반적 아미노산 서열은 이것이 단백질 A로부터의 임의의 IgG-결합 도메인의 전반적 아미노산 서열과 동일하지 않다는 점에서 인공이다. 새로운 서열의 각 위치에서의 아미노산은 임의의 정렬된 서열의 동일한 위치에 대응한다. 모자이크 산물에서 아미노산의 상대 위치는 시작 서열에 대해 유지된다. 신규한, 인공 IgG-결합 단백질의 생성을 위한 일반 셔플링 방법이 도 1a에 도시된다.
상기 최초 셔플링된 단백질이 제조되면, 단백질은 선택적으로 아미노산 서열의 부위-특이적 무작위화에 의해 추가 변형되어, 요망되는 경우 셔플링된 단백질의 결합 특성을 추가 변형할 수 있다. 예로서, 추가 변형은 개별 아미노산 잔기의 부위-포화 돌연변이화에 의해 도입되어 복수의 변형된 셔플링된 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 이어서 이러한 IgG-결합 단백질이 스크리닝되어 관심의 대상이 될 수 있는 임의의 결합 특성을 가지는 그러한 변형된 셔플링된 폴리펩타이드를 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 IgG 결합 단백질의 생성에는 1 또는 2개의 기본 단계가 관여된다: 관련된 서열이 정렬되고 셔플링되어 셔플링된 폴리펩타이드를 제조하는 제1 단계, 및 요망되는 경우, 셔플링된 단백질의 결합 활성을 추가 변형하는 제2 단계.
본 발명의 Ig 결합 단백질은 하나 이상의 비-천연 Ig-결합 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 비-천연 Ig 결합 도메인은 위치 Q9, A12, F13, L17, Q26, R27, F30, I31, L34, P38, S41, L45, A48, L51, Q55에 대응하는 위치에서 천연 발생 단백질 A 도메인 A, B, C, D, 또는 E 또는 도메인 Z와 동일한 아미노산, 보다 바람직하게는 천연 발생 Ig 결합 도메인의 위치 Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, I31, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, P57에 대응하는 동일한 아미노산을 갖는다.
천연 발생 단백질 A 도메인 A, B, C, D, 또는 E 또는 도메인 Z에 대한 본 발명의 Ig 결합 단백질의 서열 동일성은 최대 약 85%이다(추가 상세사항에 대해서는 표 1 참고).
제6 양태에서, 본 발명은 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, 바람직하게는 단리된 핵산 분자에 대한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 제6 양태의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 포괄한다.
제7 양태에서, 본 발명은 제6 양태의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 대한 것이다.
벡터는 숙주 세포 내로 단백질 코딩 정보를 전달하기 위해 이용될 수 있는 임의의 분자 또는 대상체(예컨대 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.
제7 양태의 하나의 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다.
제8 양태에서, 본 발명은 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질, 제6 양태의 핵산 분자, 또는 제7 양태의 벡터를 포함하는 숙주 세포, 바람직하게는 단리된 숙주 세포, 또는 비-인간 숙주에 대한 것이다.
예를 들어, 본 발명의 Ig-결합 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는 적합한 숙주에서 발현될 수 있고, 제조된 결합 단백질은 단리될 수 있다.
숙주 세포는 핵산 서열로 형질전환된, 또는 형질전환될 수 있고, 이에 의해 관심 유전자를 발현하는 세포이다.
적합한 숙주 세포에는 원핵생물 또는 진핵생물이 포함된다. 다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템이 또한 재조합 단백질을 발현하기 위해 채택될 수 있다. 본 발명에 따르면, 숙주는 본 발명의 단백질로 형질감염되고/되거나 이를 발현하는 트랜스제닉 비-인간 동물일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 비-인간 포유류이다.
제9 양태에서, 본 발명은 (a) 상기 비-천연 Ig-결합 단백질을 수득하기 위해 결합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 제7 양태의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 선택적으로 상기 비-천연 Ig-결합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 제1 양태의 비-천연 Ig-결합 단백질의 제조 방법에 대한 것이다.
본 발명은 또한 제9 양태의 방법에 의해 제조되는 비-천연 Ig-결합 단백질을 포괄한다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주의 배양에 적합한 조건은 당분야 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 Ig-결합 분자는 임의의 여러 통상적이고 널리 공지된 기법, 예컨대 기본 유기 합성 전략, 고상-보조 합성 기법에 의해 또는 상업적으로 이용 가능한 자동화 합성장치에 의해 제조될 수 있다. 반면, 이들은 또한 단독으로 또는 통상적 합성 기법과 조합되어 통상적 재조합 기법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 콘주게이트는 당분야 숙련가에게 공지된 화합물의 조합에 의해, 예를 들어 화학적 방법, 예컨대 라이신 또는 시스테인-기반 화학에 의해, 또는 통상적 재조합 기법에 의해 수득될 수 있다. 본원에서 이용되는 "콘주게이트"라는 용어는 다른 성분, 예컨대 제2 단백질 또는 비-단백질성 모이어티에 대해 화학적으로 부착된 적어도 제1 단백질을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 분자에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 구현예는 상술된 바와 같은 본 발명에 따른 Ig-결합 단백질의 제조 방법에 대한 것이며, 상기 방법은 다음 (a) 상기 정의된 바와 같은 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제조하는 단계; (b) 발현 벡터 내로 상기 핵산을 도입하는 단계; (c) 숙주 세포 내로 상기 발현 벡터를 도입하는 단계; (d) 숙주 세포를 배양하는 단계; (e) 숙주 세포에 Ig-결합 단백질이 발현되는 배양 조건을 가하는 단계, 이에 의해 (e) 상술된 바와 같은 결합 단백질을 제조하는 단계; (f) 선택적으로 단계 (e)에서 제조된 단백질을 단리하는 단계; 및 (g) 선택적으로 상술된 고체 매트릭스에 단백질을 콘주게이션하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 구현예에서, 비-천연 Ig 결합 단백질의 제조는 무-세포 시험관내 전사/번역에 의해 수행된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 추가 예시를 위해 제공된다. 그러나 본 발명은 이에 제한되지 않으며, 다음 실시예는 단지 상기 설명에 기반하여 본 발명의 실시 가능성을 나타낸다. 본 발명의 완전 개시를 위해, 출원 내에 참조로 전체 포함되는 출원에서 인용된 문헌도 참조된다.
실시예 1. 셔플링 공정에 의한 본 발명의 IgG 결합 단백질의 생성
본 발명의 IgG 결합 단백질을 처음에 천연 발생 단백질 A 도메인 및 단백질 A 유도체(예컨대, Z 도메인 또는 임의의 천연 발생 도메인과 적어도 90% 동일성을 갖는 다른 도메인)의 셔플링 공정에 의해 생성하였다. 셔플링 공정은 다음 a) 5개의 천연 발생 단백질 A 도메인 E, B, D, A, 및 C, 및 단백질 A 유도체 도메인 Z의 서열을 제공하는 단계; b) 상기 서열을 정렬하는 단계; c) 컴퓨터 내 통계적 단편화로 천연 발생 Ig 결합 도메인의 위치 Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, I31, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, P57이 유지되는 한, 재조합될 수 있는 하위서열을 확인하는 단계, 이어서 d) 다양한 단편의 새로운, 인공 서열을 어셈블리하여 모자이크 산물, 즉 신규한 아미노산 서열을 제조하는 단계로 이루어졌다.
모자이크 산물에서 아미노산의 상대 위치는 시작 서열에 대해 유지되었다. 적어도 위치 Q9, Q10, A12, F13, Y14, L17, P20, L22, Q26, R27, F30, I31, Q32, S33, L34, K35, D36, D37, P38, S39, S41, L45, E47, A48, K50, L51, Q55, P57은 "셔플링된" 서열 및 모든 천연 발생 단백질 A 도메인 간에 동일하다. 재어셈블리된 "셔플링된" 단백질의 전반적 아미노산 서열은 이것이 임의의 천연 발생 단백질 A 도메인 또는 도메인 Z의 전반적 아미노산 서열과 85% 이하로 동일하다는 점에서 인공이다. 예를 들어, 천연 발생 단백질 A 도메인 또는 도메인 Z 대비 Ig 결합 단백질의 동일성을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure 112018014539544-pct00001
"E, D, A, B, C, Z"는 천연 발생 단백질 A 도메인 및 도메인 Z(SEQ ID NO: 3~8)를 나타낸다. 번호 "9~30"은 본 발명의 Ig 결합 단백질에 대한 예를 나타낸다. 예를 들어, 번호 "9~24"는 대응하는 SEQ ID NO: 9~24를 나타내며, "25"는 SEQ ID NO: 26을 나타내고, "26"은 SEQ ID NO: 27을 나타내고, "27"은 SEQ ID NO: 28을 나타내고, "28"은 SEQ ID NO: 30을 나타낸다.
"셔플링된" IgG 결합 단백질뿐만 아니라 천연 발생 단백질 A 도메인 및 유도체(예컨대 도메인 C, 도메인 B, 도메인 A, 도메인 D, 도메인 E, 도메인 Z)에 대한 유전자를 당분야 숙련가에게 공지된 표준 방법을 이용하여 합성하고 대장균 발현 벡터 내로 클로닝하였다. DNA 서열분석을 이용하여 삽입된 단편의 정확한 서열을 확인하였다.
하나를 초과하는 결합 도메인을 포함하는 Ig 결합 단백질을 생성하기 위해, 2, 4, 또는 6개의 동일한 IgG 결합 도메인(SEQ ID NO: 14)을 아미노산 링커(SEQ ID NO: 41 및 SEQ ID NO: 42)를 통해 유전적으로 융합시켰다. 융합 단백질의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 45~47에 나타낸다.
특이적인 멤브레인 부착 및 정제를 위해, C-말단 Cys(ASPAPSAPSAC; SEQ ID NO: 39) 및 strep-tag(WSHPQFEK; SEQ ID NO: 44)를 갖는 짧은 펩타이드 링커를 Ig 결합 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 50 및 SEQ ID NO: 51참고)의 C-말단에 추가하였다.
실시예 2. IgG 결합 단백질의 발현
HMS174(DE3) 적격 세포를 IgG 결합 단백질을 인코딩하는 발현 플라스미드로 형질전환하였다. 세포를 선택적 한천 플레이트(카나마이신) 상에 전개하고 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 사전배양을 100 ml 수퍼리치(superrich) 배지(변형된 H15 배지 2% 글루코스, 5% 효모 추출물, 1% 카사미노산, 0.76% 글리세롤, 1% Torula 효모 RNA, 250 mM MOPS, 202 mM 트리스, 10 mg/L RNase A, pH 7.4, 소포제 SE15) 중 단일 콜로니로부터 접종하여 락토스 및 소포제를 함유하지 않는 150 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 배플 함유 1 L 에를렌마이어 플라스크 중 통상적 궤도 진탕장치에서 160 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. OD600 판독은 6~12 범위에 있어야 한다. 주 배양을 글리세롤, 글루코스, 락토스, 소포제 및 150 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 1 L 두꺼운 벽의 에를렌마이어 플라스크 중 400 ml 수퍼리치 배지에서 0.5의 조정된 시작-OD600로 이전 하룻밤 배양으로부터 접종하였다. 배양을 공명 음향 혼합장치(RAMbio)로 옮기고 20 x g로 37℃에서 인큐베이션하였다. Oxy-Pump 스토퍼로 통기를 촉진하였다. 글루코스를 대사시킨 후 락토스가 세포로 들어가도록 함으로써 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 소정 시점에 OD600을 측정하고, 5/OD600로 조정된 샘플을 인출하여 펠렛화하고 -20℃에서 냉동하였다. 세포를 대략 24시간 동안 하룻밤 성장시켜 약 45~60의 최종 OD600에 도달하였다. 바이오매스를 수집하기 위해, 세포를 20℃에서 10분 동안 16000 x g로 원심분리하였다. 펠렛을 칭량하고(습식 중량) 상청액 중 pH를 측정하였다. 세포를 가공 전까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 3: IgG 결합 단백질의 발현 및 가용성의 SDS-PAGE 분석
발효 동안 취한 샘플을 300 ㎕ 추출 완충액(0.2 mg/ml 라이소자임, 0.5x BugBuster, 7.5 mM MgSO4, 40 U 벤조나제가 보충된 PBS) 중 재현탁하고 15분 동안 700 rpm, rt에서 열혼합장치 내 진탕에 의해 가용화하였다. 가용성 단백질을 원심분리(16000 x g, 2분, rt)에 의해 불용성 단백질로부터 분리하였다. 상청액을 인출하고(가용성 분획) 펠렛(불용성 분획)을 동량의 요소 완충액(8 M 요소, 0.2 M 트리스, 2 mM EDTA, pH 8.5) 중에 재현탁하였다. 가용성 및 불용성 분획 모두로부터, 50 ㎕를 취해서 12 ㎕ 5x 샘플 완충액뿐만 아니라 5 ㎕ 0.5 M DTT를 첨가하였다.
샘플을 5분 동안 95℃에서 끓였다. 마지막으로, 8㎕의 이들 샘플을 NuPage Novex 4~12% 비스-트리스 SDS 겔에 적용하여, 제조업체의 권장사항에 따라 수행하고 쿠마시(Coomassie)로 염색하였다. 선택된 시기 내에 최적화된 조건 하에서 모든 IgG 결합 단백질의 높은 발현 수준이 확인되었다(도 3). 모든 발현된 Ig 결합 단백질은 SDS-PAGE에 따르면 95% 초과가 가용성이었다.
실시예 4: IgG 결합 단백질의 정제
모든 IgG 결합 단백질을 C-말단 StrepTagII(WSHPQFEK; SEQ ID NO: 44)를 갖는 대장균의 가용성 분획에서 발현시켰다. 세포를 초음파분쇄에 의해 용해시키고 첫 번째 정제 단계를 제조업체의 지침에 따라 Strep-Tactin-컬럼으로 수행하였다. 디설파이드 형성을 배제하기 위해, 완충액에 1 mM DTT를 보충하였다. 용출된 분획을 20 mM 시트레이트 pH 6.0 및 150 mM NaCl로 평형화된 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg(GE Healthcare)에 주입하였다. 피크 분획을 풀링하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
실시예 5. IgG 결합 단백질이 고친화도로 IgG에 결합함(ELISA에 의해 결정됨)
IgG1 또는 IgG2 또는 IgG4에 대한 IgG 결합 단백질의 친화도를 효소 연관 면역흡착 검정(ELISA)을 이용하여 결정하였다. IgG1 또는 IgG2 또는 IgG4 함유 항체(예컨대 IgG1에 대해 세툭시맵, IgG2에 대해 파니투무맵, 또는 IgG4에 대해 나탈리주맵)를 96웰 Nunc MaxiSorb ELISA 플레이트(2 ㎍/ml) 상에 고정화하였다. 4℃에서 16 h 동안 인큐베이션 후, 웰을 PBST(PBS + 0.1% Tween 20)로 3회 세척하고 웰을 PBS 중 3% BSA로 차단하였다(실온에서 2 h). 음성 대조군은 BSA로만 차단된 웰이었다. 차단 후, 웰을 PBST로 3회 세척하고 실온에서 (PBST 중) IgG 결합 단백질과 1 h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 웰을 PBST로 3회 세척한 후 실온에서 1 h 동안 IBA로부터 Strep-Tactin-HRP(1:10000)와 인큐베이션하였다. 이후 웰을 PBST로 3회 그리고 PBS로 3회 세척하였다. TMB-Plus 기질의 첨가에 의해 홀스래디쉬 퍼옥시다제의 활성을 가시화하였다. 30분 후 0.2 M H2SO4의 첨가에 의해 반응을 중지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure 112018014539544-pct00002
실시예 6. IgG 결합 단백질이 고친화도로 IgG에 결합함(표면 플라즈몬 공명 실험으로 결정됨)
CM5 센서 칩(GE Healthcare)을 SPR 수행 완충액으로 평형화하였다. 표면-노출된 카복실기를 EDC 및 NHS의 혼합물을 통과시켜 활성화하여 반응성 에스테르기를 산출하였다. 700~1500 RU 온-리간드를 플로우 셀 상에 고정화하고, 오프-리간드를 다른 플로우 셀 상에 고정화하였다. 리간드 고정화 후 에탄올아민의 주입으로 공유 결합되지 않은 Ig 결합 단백질을 제거한다. 리간드 결합 시, 단백질 분석물질이 표면 상에 축적되어 굴절률을 증가시켰다. 이러한 굴절률 변화를 실시간으로 측정하여 시간 대비 반응 또는 공명 단위(RU)로 도식화하였다. 분석물질을 적합한 유속(㎕/분)으로 연속 희석하여 칩에 적용하였다. 각 수행 후, 칩 표면을 재생 완충액으로 재생하고 수행 완충액으로 평형화하였다. 대조군 샘플을 매트릭스에 적용하였다.
재생 및 재-평형화를 이전에 언급된 바와 같이 수행하였다. Biacore®3000(GE Healthcare)을 이용하여 결합 연구를 수행하였다; 데이터 평가는 Langmuir 1:1 모델(RI=0)을 이용하여, 제조업체에 의해 제공되는 BIAevaluation 3.0 소프트웨어를 통해 수행하였다. 평가된 해리 상수(KD)를 오프-타겟에 대해 표준화하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure 112018014539544-pct00003
실시예 7. SulfoLink 커플링 수지에 대한 IgG 결합 단백질의 결합 및 고정화된 IgG 결합 단백질의 알칼리 안정성
IgG 결합 단백질을 제조업체의 지침에 따라 SulfoLink® 커플링 수지(Thermo; Cat. No. 20402)에 커플링하였다. 컬럼의 수지층 부피는 300 ㎕였다. 컬럼을 4배 수지층 부피의 커플링 완충액(50 mM 트리스, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5)으로 평형화하였다. IgG 결합 단백질을 컬럼(1~2 ml/SulfoLink 커플링 수지ml)에 첨가하였다. IgG 결합 단백질을 C-말단(ASPAPSAPSAC; SEQ ID NO: 39)에서 시스테인을 통해 매트릭스에 커플링하였다. 컬럼을 15분 동안 혼합하고, 혼합하지 않고 다시 30분 인큐베이션하고 커플링 완충액으로 세척하였다. 시스템 유속은 0.5 ml/분이었다. 50 mM 시스테인 용액 300 ㎕를 컬럼에 첨가하고, 15분 동안 혼합하고, 혼합하지 않고 다시 30분 인큐베이션하고 1 M NaCl로의 세척에 이어 PBS로 세척하였다.
280 nm에서의 흡광도를 모든 분획에 대해 측정하였다. 모든 IgG 결합 단백질을 매트릭스로 공유 커플링할 수 있었다; 도 6은 예시적으로 IgG 결합 단백질 148470(도 6a) 및 148460(도 6b)의 SulfoLink 커플링 수지 매트릭스에 대한 커플링을 나타낸다.
세툭시맵을 공유 커플링된 IgG 결합 단백질을 포함하는 Sulfolink 수지 컬럼에 포화량(5 mg; 1 mg/수지ml)으로 적용하였다. 매트릭스를 100 mM 글리신 완충액, pH 2.5로 세척하여 고정화된 IgG 결합 단백질에 결합된 세툭시맵을 용출하였다. IgG 결합 단백질의 결합 활성(정적 결합능)을 결정하기 위해 용출된 IgG의 농도를 분광학적으로 측정하였다. 용출 분획을 280 nm에서의 흡광도에서 분석하였다. 고정화된 단백질의 IgG 결합 활성을 실온에서 20, 40, 또는 80분 동안 0.5 M NaOH와의 인큐베이션 전에 및 후에 분석하였다. NaOH 처리 전 고정화된 단백질의 IgG 결합 활성을 100%로 정의하였다. 단백질의 IgG 결합 활성을 천연 발생 도메인 C, B, A, D, E, 또는 도메인 Z의 활성과 비교하였다.
도 8은 IgG 결합 단백질 148462(도면에서 "13"으로 나타냄), 148463(도면에서 "14"로 나타냄), 148472(도면에서 "23"으로 나타냄) 및 천연 발생 단백질 A 도메인 E, D, A, B, C, 및 도메인 Z의 IgG 결합 활성을 나타낸다. IgG 결합 활성을 80분 동안 0.5 M NaOH와의 인큐베이션 후에 나타낸다. 본 발명의 IgG 결합 단백질은 알칼리 처리 후 세툭시맵에 대해 높은 결합 활성을 나타낸다.
실시예 8. 에폭시-활성화된 매트릭스에 커플링된 IgG 결합 단백질의 부식 안정성
정제된 IgG 결합 단백질을 제조업체의 지침(커플링 조건: pH 9.0 하룻밤 동안, 에탄올아민으로 5 h 동안 차단)에 따라 에폭시-활성화된 매트릭스(세파로스 6B, GE; Cat. No. 17-0480-01)에 커플링하였다. 세툭시맵을 IgG 샘플로 이용하였다(5 mg; 1 mg/매트릭스ml). 세툭시맵을 고정화된 IgG 결합 단백질을 포함하는 매트릭스에 포화량으로 적용하였다. 매트릭스를 100 mM 글리신 완충액, pH 2.5로 세척하여 고정화된 IgG 결합 단백질에 결합된 세툭시맵을 용출하였다. IgG 결합 단백질의 결합 활성(정적 결합능)을 결정하기 위해 용출된 IgG의 농도를 280 ㎚에서 분광학적으로 측정하였다. 컬럼을 실온(22℃ +/- 3℃)에서 6 h 동안 0.5 M NaOH와 인큐베이션하였다. 고정화된 단백질의 IgG 결합 활성을 6 h 동안 0.5 M NaOH와의 인큐베이션 전에 및 후에 분석하였다. NaOH 처리 전에 고정화된 단백질의 IgG 결합 활성을 100%로 정의하였다. 도 9는, 예를 들어 IgG 결합 단백질 154254(도면에서 "SEQ ID 26"으로 나타냄), 154255(도면에서 "SEQ ID 27"로 나타냄), 154256(도면에서 "SEQ ID 28"로 나타냄), 및 154257(도면에서 "SEQ ID 30"으로 나타냄)의 활성이 IgG 결합 단백질 148463("SEQ ID 14")의 활성에 비해 더 높았고, 이에 따라 임의의 천연 발생 단백질 A 도메인보다 높음을 나타낸다. 모든 고정화된 IgG 결합 단백질은 0.5 M NaOH로 6 h 동안 인큐베이션 후 이의 원래 IgG 결합 활성의 적어도 35% 내지 최대 50%를 나타내었다. 도 10은 0, 2, 4, 6시간 동안 알칼리 처리 후 에폭시-활성화된 수지에 고정화된 2, 4, 또는 6개의 IgG 결합 도메인으로 구성된 다량체성 IgG 결합 단백질의 Ig 결합 활성 (능력)이 하나의 IgG 결합 도메인으로 구성된 단량체성 IgG 결합 단백질의 결합 활성 (능력)과 필적함을 나타낸다.
서열 목록 프리 텍스트 정보
SEQ ID NO: 1 비-천연 Ig-결합 도메인의 일반 서열
SEQ ID NO: 2 비-천연 Ig-결합 도메인의 일반 서열
SEQ ID NO: 3 스타필로코커스 아우레우스 도메인 E(CID 148473)
SEQ ID NO: 4 스타필로코커스 아우레우스 도메인 D(CID 148474)
SEQ ID NO: 5 스타필로코커스 아우레우스 도메인 A(CID 148475)
SEQ ID NO: 6 스타필로코커스 아우레우스 도메인 B(CID 148476)
SEQ ID NO: 7 스타필로코커스 아우레우스 도메인 C(CID 148477)
SEQ ID NO: 8 단백질 A의 도메인 Z(CID 148478)
SEQ ID NO: 9 셔플 서열 IB9, CID 148458
SEQ ID NO: 10 셔플 서열 IB10, CID 148459
SEQ ID NO: 11 셔플 서열 IB11, CID 148460
SEQ ID NO: 12 셔플 서열 IB12, CID 148461
SEQ ID NO: 13 셔플 서열 IB13, CID 148462
SEQ ID NO: 14 셔플 서열 IB14, CID 148463
SEQ ID NO: 15 셔플 서열 IB15, CID 148464
SEQ ID NO: 16 셔플 서열 IB16, CID 148465
SEQ ID NO: 17 셔플 서열 IB17, CID 148466
SEQ ID NO: 18 셔플 서열 IB18, CID 148467
SEQ ID NO: 19 셔플 서열 IB19, CID 148468
SEQ ID NO: 20 셔플 서열 IB20, CID 148469
SEQ ID NO: 21 셔플 서열 IB21, CID 148470
SEQ ID NO: 22 셔플 서열 IB22, CID 148471
SEQ ID NO: 23 셔플 서열 IB23, CID 148472
SEQ ID NO: 24 셔플 서열 IB24, CID 154253
SEQ ID NO: 25 셔플 서열 IB15b
SEQ ID NO: 26 셔플 서열 IB25, CID 154254
SEQ ID NO: 27 셔플 서열 IB26, CID 154255
SEQ ID NO: 28 셔플 서열 IB27, CID 154256
SEQ ID NO: 29 셔플 서열 IB29
SEQ ID NO: 30 셔플 서열 IB28, CID 154257
SEQ ID NO: 31 링커
SEQ ID NO: 32 링커
SEQ ID NO: 33 링커
SEQ ID NO: 34 링커
SEQ ID NO: 35 링커
SEQ ID NO: 36 링커
SEQ ID NO: 37 링커
SEQ ID NO: 38 비-천연 Ig 결합 도메인에 대한, 예를 들어 IB9~IB28에 대한 일반 서열
SEQ ID NO: 39 c-말단 커플링 서열(APS10/C)
SEQ ID NO: 40 c-말단 커플링 서열(APS30/C)
SEQ ID NO: 41 APS30 링커
SEQ ID NO: 42 APS30 링커
SEQ ID NO: 43 APS10 링커
SEQ ID NO: 44 Streptag
SEQ ID NO: 45 IB14 이량체, CID 150570
SEQ ID NO: 46 IB14 사량체, CID 150663
SEQ ID NO: 47 IB14 육량체, CID 150772
SEQ ID NO: 48 예컨대 IB24~IB28에 대한 일반 서열
SEQ ID NO: 49 예컨대 IB9~IB23에 대한 일반 서열
SEQ ID NO: 50 c-말단 커플링 서열 및 strep-tag를 갖는 SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 51 c-말단 커플링 서열 및 strep-tag를 갖는 SEQ ID NO: 28
SEQUENCE LISTING <110> Scil Proteins GmbH <120> Novel Immunoglobulin-Binding Proteins <130> SP29 WO <150> EP15177056.7 <151> 2015-07-16 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic sequence of non-natural Ig-binding domain <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> may be replaced by P, V, Q, or N <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> may be replaced by A or Q <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> may be replaced by N or S <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> may be replaced by Q or N <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> may be replaced by F <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> may be replaced by N, S, or A <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> may be replaced by K <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> may be replaced by A or E <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> may be replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> may be replaced by D or Q <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> may be replaced by I <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> may be replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> may be replaced by M <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> may be replaced by S or D <220> <221> VARIANT <222> (23)..(23) <223> may be replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> may be replaced by A <220> <221> VARIANT <222> (25)..(25) <223> may be replaced by E <220> <221> VARIANT <222> (28)..(28) <223> may be replaced by S or A <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> may be replaced by A <220> <221> VARIANT <222> (40)..(40) <223> may be replaced by Q or T <220> <221> VARIANT <222> (42)..(42) <223> may be replaced by T or A <220> <221> VARIANT <222> (43)..(43) <223> may be replaced by N or S <220> <221> VARIANT <222> (44)..(44) <223> may be replaced by L or I <220> <221> VARIANT <222> (46)..(46) <223> may be replaced by A <220> <221> VARIANT <222> (49)..(49) <223> may be replaced by Q <220> <221> VARIANT <222> (52)..(52) <223> may be 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<220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> may be replaced by N or A or S <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> may be replaced by K <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> may be replaced by E or A <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> may be replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> may be replaced by Q <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> may be replaced by Q <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> may be replaced by I <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> may be replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> may be replaced by M <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> may be replaced by S or D <220> <221> VARIANT <222> (23)..(23) <223> may be replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> may be replaced by A <220> <221> VARIANT <222> (25)..(25) <223> may be replaced by E <220> <221> VARIANT <222> (28)..(28) <223> may be replaced by S or A <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> may be replaced by A <220> <221> VARIANT <222> (40)..(40) <223> may be replaced by Q or T <220> <221> VARIANT <222> (42)..(42) <223> may be replaced by T or A <220> <221> VARIANT <222> (43)..(43) <223> may be replaced by N or S <220> <221> VARIANT <222> (44)..(44) <223> may be replaced by L or I <220> <221> VARIANT <222> (46)..(46) <223> may be replaced by A <220> <221> VARIANT <222> (49)..(49) <223> may be replaced by Q <220> <221> VARIANT <222> (52)..(52) <223> may be replaced by D or S <220> <221> VARIANT <222> (53)..(53) <223> may be replaced by E <220> <221> VARIANT <222> (54)..(54) <223> may be replaced by A <220> <221> VARIANT <222> (56)..(56) <223> may be replaced by P <220> <221> VARIANT <222> (58)..(58) <223> may be replaced by P <400> 2 Ala Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Val 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 65 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus domain E (CID 148473) <400> 3 Thr Pro Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn 20 25 30 Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val 35 40 45 Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp 50 55 60 Ala 65 <210> 4 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus D (CID 148474) <400> 4 Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 5 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus A (CID 148475) <400> 5 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 6 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus B (CID 148476) <400> 6 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 7 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus C (CID 148477) <400> 7 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 8 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> domain Z of protein A (CID 148478) <400> 8 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 9 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB9, CID 148458 <400> 9 Asn Ala Ala Gln His Ala Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 10 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB10, CID 148459 <400> 10 Asn Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 11 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB11, CID 148460 <400> 11 Asn Ala Ala Gln His Ser 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<211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB14, CID 148463 <400> 14 Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 15 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB15, CID 148464 <400> 15 Ala Asp Asn Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 16 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB16, CID 148465 <400> 16 Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 17 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB17, CID 148466 <400> 17 Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 18 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB18, CID 148467 <400> 18 Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asp Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 19 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB19, CID 148468 <400> 19 Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 20 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB20, CID 148469 <400> 20 Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Thr Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 21 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB21, CID 148470 <400> 21 Ala Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Thr Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asp Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 22 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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 25 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB15b <400> 25 Ala Asp Asn Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 26 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB25 (CID 154254) <400> 26 Asn Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 27 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB26 (CID 154255) <400> 27 Asn Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 28 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB27 (CID 154256) <400> 28 Asn Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 29 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB29 <400> 29 Gln Gln Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Gln Val 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Ala Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 30 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shuffle sequence IB28 (CID 154257) <400> 30 Val Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 31 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 32 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 33 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 34 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 35 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 36 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 37 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 38 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic sequence of non-natural Ig-binding domain (e.g. for IB9-IB28) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> may be replaced by N, P, or V <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> may be replaced by A <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> may be replaced by N or S <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> may be replaced by Q <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> may be replaced by F <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> may be replaced by S or A <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> may be replaced by K <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> may be replaced by A or E <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> may be replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> may be replaced by S or D <220> <221> VARIANT <222> (25)..(25) <223> may be replaced by E <220> <221> VARIANT <222> (28)..(28) <223> may be replaced by A or S <220> <221> VARIANT <222> (40)..(40) <223> may be replaced by T or Q <220> <221> VARIANT <222> (42)..(42) <223> may be replaced by A <220> <221> VARIANT <222> (43)..(43) <223> may be replaced by S <220> <221> VARIANT <222> (44)..(44) <223> may be replaced by I or V <220> <221> VARIANT <222> (46)..(46) <223> may be replaced by A <220> <221> VARIANT <222> (49)..(49) <223> may be replaced by Q <220> <221> VARIANT <222> (52)..(52) <223> may be replaced by S or D <220> <221> VARIANT <222> (53)..(53) <223> may be replaced by E <220> <221> VARIANT <222> (54)..(54) <223> may be replaced by S <220> <221> VARIANT <222> (58)..(58) <223> may be replaced by P <400> 38 Ala Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Leu Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal coupling sequence (APS10/C) <400> 39 Ala Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ser Ala Cys 1 5 10 <210> 40 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> coupling sequence c-terminal (APS30/C) <400> 40 Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ala Ala Ser 1 5 10 15 Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Cys <210> 41 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> APS30 linker <400> 41 Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser 20 25 30 <210> 42 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> APS30 linker <400> 42 Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ala Ala Ser 1 5 10 15 Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala 20 25 30 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> APS10 linker <400> 43 Ala Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ser Ala 1 5 10 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptag <400> 44 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 45 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IB14 dimer (CID150570) <400> 45 Met Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala 50 55 60 Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 65 70 75 80 Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys 85 90 95 Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 100 105 110 Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 115 120 125 Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 130 135 140 Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser 145 150 155 160 Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 165 170 175 Ala Ala Ala Cys Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 180 185 <210> 46 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IB14 tetramer (CID150663) <400> 46 Met Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala 50 55 60 Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 65 70 75 80 Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys 85 90 95 Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 100 105 110 Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 115 120 125 Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 130 135 140 Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser 145 150 155 160 Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 165 170 175 Ala Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu 180 185 190 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile 195 200 205 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu 210 215 220 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala 225 230 235 240 Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 245 250 255 Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys 260 265 270 Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 275 280 285 Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 290 295 300 Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 305 310 315 320 Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser 325 330 335 Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 340 345 350 Ala Ala Ala Cys Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 355 360 365 <210> 47 <211> 541 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IB14 hexamer (CID 150772) <400> 47 Met Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala 50 55 60 Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 65 70 75 80 Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys 85 90 95 Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 100 105 110 Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 115 120 125 Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 130 135 140 Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser 145 150 155 160 Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 165 170 175 Ala Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu 180 185 190 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile 195 200 205 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu 210 215 220 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala 225 230 235 240 Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 245 250 255 Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys 260 265 270 Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 275 280 285 Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 290 295 300 Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 305 310 315 320 Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser 325 330 335 Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 340 345 350 Ala Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu 355 360 365 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile 370 375 380 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu 385 390 395 400 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ser Ala Ala Pro Ala 405 410 415 Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 420 425 430 Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Lys His Asp Lys 435 440 445 Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 450 455 460 Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 465 470 475 480 Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 485 490 495 Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser 500 505 510 Ala Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala 515 520 525 Ala Ala Ala Cys Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 530 535 540 <210> 48 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic sequence for e.g. IB24-IB28 <220> <221> variant <222> (1)..(1) <223> may be replaced by V <220> <221> variant <222> (2)..(2) <223> may be replaced by D <220> <221> variant <222> (4)..(4) <223> may be replaced by Q <220> <221> variant <222> (5)..(5) <223> may be replaced by F <220> <221> variant <222> (7)..(7) <223> may be replaced by K <220> <221> variant <222> (8)..(8) <223> may be replaced by D or E <220> <221> variant <222> (11)..(11) <223> may be replaced by N <220> <221> variant <222> (25)..(25) <223> may be replaced by D <220> <221> variant <222> (40)..(40) <223> may be replaced by Q <220> <221> variant <222> (42)..(42) <223> may be replaced by A <220> <221> variant <222> (43)..(43) <223> may be replaced by S <220> <221> variant <222> (44)..(44) <223> may be replaced by I <220> <221> variant <222> (46)..(46) <223> may be replaced by A <220> <221> variant <222> (49)..(49) <223> may be replaced by K <220> <221> variant <222> (53)..(53) <223> may be replaced by E <220> <221> variant <222> (54)..(54) <223> may be replaced by A <400> 48 Asn Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 49 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic sequence for e.g. IB9-IB23 <220> <221> variant <222> (1)..(1) <223> may be replaced by N or A <220> <221> variant <222> (2)..(2) <223> may be replaced by D <220> <221> variant <222> (3)..(3) <223> may be replaced by N or S <220> <221> variant <222> (4)..(4) <223> may be replaced by Q <220> <221> variant <222> (5)..(5) <223> may be replaced by H <220> <221> variant <222> (6)..(6) <223> may be replaced by S or A <220> <221> variant <222> (7)..(7) <223> may be replaced by E <220> <221> variant <222> (8)..(8) <223> may be replaced by A or E <220> <221> variant <222> (11)..(11) <223> may be replaced by N <220> <221> variant <222> (21)..(21) <223> may be replaced by S or D <220> <221> variant <222> (28)..(28) <223> may be replaced by A <220> <221> variant <222> (40)..(40) <223> may be replaced by T <220> <221> variant <222> (43)..(43) <223> may be replaced by S <220> <221> variant <222> (44)..(44) <223> may be replaced by L <220> <221> variant <222> (52)..(52) <223> may be replaced by D or S <400> 49 Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55

Claims (17)

  1. 하나 이상의 비-천연 Ig-결합 도메인을 포함하는 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질로서, 적어도 하나의 비-천연 Ig-결합 도메인이 하기 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 비-천연 Ig-결합 단백질:
    PAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 13),
    PAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRSAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 14),
    NAAKHDKDQQSAFYEILHLPNLTEDQRNAFIQSLKDDPSVSKEILGEAKKLNDAQAPP(SEQ ID NO: 26),
    NAAQHDKDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO: 27),
    NAAKFDEAQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSVSKEVLGEAQKLNDSQAPK(SEQ ID NO: 28),
    VDAQHDEDQQSAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSAEILAEAKKLNESQAPK(SEQ ID NO: 30).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 비-천연 Ig-결합 단백질이 알칼리 조건 하에 안정한 비-천연 Ig-결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 비-천연 Ig-결합 도메인이 서로 연결되는 비-천연 Ig-결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 비-천연 Ig-결합 단백질이 고상으로의 부위-특이적 공유 부착을 위한 특이적 부착 부위를 포함하는 비-천연 Ig-결합 단백질.
  7. 제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의되는 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질을 포함하는 조성물.
  8. 삭제
  9. 다음 단계를 포함하는 면역글로불린의 친화도 정제 방법:
    a. 면역글로불린을 함유하는 액체를 제공하는 단계;
    b. 제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 고정화된 비-천연 Ig-결합 단백질을 포함하는 친화도 분리 매트릭스를 제공하는 단계;
    c. 상기 액체 및 상기 친화도 분리 매트릭스를 접촉시키는 단계로서, 상기 면역글로불린이 상기 고정화된 단백질에 결합하는 단계; 및
    d. 상기 매트릭스로부터 상기 면역글로불린을 용출함으로써, 상기 면역글로불린을 함유하는 용출액을 수득하는 단계.
  10. 제9항에 있어서,
    면역글로불린이 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG4, 인간 IgM, 인간 IgA, 마우스 IgG1, 마우스 IgG2A, 마우스 IgG2B, 마우스 IgG3, 래트 IgG1, 래트 IgG2C, 염소 IgG1, 염소 IgG2, 소 IgG2, 기니아픽 IgG, 토끼 IgG, Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 단편, 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 콘주게이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질의 생성 방법으로서, 적어도 하나의 Ig-결합 도메인이 천연 발생 Ig-결합 단백질로부터 적어도 2개의 천연 발생 Ig-결합 도메인의 셔플링 방법에 의해 수득 가능한 방법.
  12. 제1항에서 정의되는 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자.
  13. 제12항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  14. 제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의되는 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질, 제12항에서 정의되는 핵산, 또는 제13항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. 다음 단계를 포함하는, 제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질의 제조 방법:
    a. 상기 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질을 수득하기 위해 결합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 제13항의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계.
  16. 제15항에 있어서, 상기 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질을 단리하는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.
  17. 제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의되는 비-천연 면역글로불린(Ig) 결합 단백질, 제12항에서 정의되는 핵산, 또는 제13항의 벡터를 포함하는 비-인간 숙주.
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