JP2018523994A - 新規な免疫グロブリン結合タンパク質およびアフィニティ精製におけるそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図8
Description
抗体またはFc含有融合タンパク質の大規模製造プロセスの多くは、アフィニティ精製のためにプロテインAを使用する。
XlがA,V,Q,NまたはP、好ましくはN,V,PまたはAであり、
X2がD,AまたはQ、好ましくはDまたはAであり、
X3がA,SまたはNであり、
X4がK,QまたはN、好ましくはKまたはQであり、
X5がHまたはFであり、
X6がD,N,SまたはA、好ましくはD,SまたはAであり、
X7がEまたはKであり、
X8がD,EまたはAであり、
XllがSまたはNであり、
X15がE,DまたはQ、好ましくはEであり、
Xl6がVまたはI、好ましくはIであり、
Xl8がHまたはN、好ましくはHであり、
Xl9がLまたはM、好ましくはLであり、
X2lがN,SまたはDであり、
X23がTまたはN、好ましくはTであり、
X24がEまたはA、好ましくはEであり、
X25がDまたはEであり、
X28がN,SまたはAであり、
X29がGまたはA、好ましくはAであり、
X40がV,QまたはTであり、
X42がK,TまたはA、好ましくはKまたはAであり、
X43がE,NまたはS、好ましくはEまたはSであり、
X44がV,LまたはIであり、
X46がGまたはAであり、
X49がKまたはQであり、
X52がN,SまたはDであり、
X53がDまたはEであり、
X54がSまたはAであり、
X56がAまたはP、好ましくはAであり、
X58がKまたはPであり、
前記非天然Ig結合タンパク質のヒトIgG1に対する解離定数KDが1μM以下、好ましくは500nM以下、より好ましくは100nM以下である。第1実施形態では、本発明は、1またはそれ以上の非天然Ig結合ドメインを含む結合タンパク質に関し、少なくとも1つの非天然Ig結合ドメインが、アルカリ処理後も免疫グロブリンに結合する能力を有する配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載した特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、それらは変更可能であることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
以下、本発明をさらに説明する。以下の節では、本発明の様々な態様をより詳細に定義する。以下に定義される各態様は、明確に反対の表示がない限り、1または複数の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示される任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される1または複数の他の任意の特徴と組み合わせることができる。
XlがN,V,PまたはAであり、
X2がDまたはAであり、
X3がA,SまたはNであり、
X4がKまたはQであり、
X5がHまたはFであり、
X6がD,SまたはAであり、
X7がEまたはKであり、
X8がD,EまたはAであり、
XllがSまたはNであり、
X2lがN,SまたはDであり、
X25がDまたはEであり、
X28がN,SまたはAであり、
X40がV,TまたはQであり、
X42がKまたはAであり、
X43がEまたはSであり、
X44がV,LまたはIであり、
X46がGまたはAであり、
X49がKまたはQであり、
X52がN,SまたはDであり、
X53がDまたはEであり、
X54がSまたはAであり、
X58がKまたはPである。
XlX2X3X4X5X6X7X8QQXllAFYX15Xl6LXl8Xl9PX2lLX23X24X25QRX28X29FIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QX56PX58(配列番号2)を含み、または本質的にこのアミノ酸配列からなり、ここで、
XlがA,V,Q,NまたはPであり、X2がD,AまたはQであり、X3がAまたはNであり、X4がK,QまたはNであり、X5がHまたはFであり、X6がD,NまたはAであり、X7がEまたはKであり、X8がD,EまたはAであり、XllがSまたはNであり、X15がEまたはDであり、Xl6がVまたはIであり、Xl8がHまたはNであり、Xl9がLまたはMであり、X2lがN,SまたはDであり、X23がTまたはNであり、X24がEまたはAであり、X25がDまたはEであり、X28がN,SまたはAであり、X29がGまたはAであり、X40がVまたはQであり、X42がK,TまたはAであり、X43がEまたはNであり、X44がV,LまたはIであり、X46がGまたはAであり、X49がKまたはQであり、X52がNまたはDであり、X53がDまたはEであり、X54がSまたはAであり、X56がAまたはPであり、X58がKまたはPである。
X1X2AX4X5DX7X8QQX11AFYEILHLPNLTEX25QRNAFIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLNX53X54QAPK(配列番号48)を含み、または本質的にこのアミノ酸配列からなり、ここで、
XlがNまたはVであり、
X2がDまたはAであり、
X4がKまたはQであり、
X5がHまたはFであり、
X7がEまたはKであり、
X8がD,EまたはAであり、
XllがSまたはNであり、
X25がDまたはEであり、
X40がVまたはQであり、
X42がKまたはAであり、
X43がEまたはSであり、
X44がVまたはIであり、
X46がGまたはAであり、
X49がKまたはQであり、
X53がDまたはEであり、
X54がSまたはAである。
X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYEILHLPX21LTEDQRX28AFIQSLKDDPSX40SKX43X44LGEAKKLX52DAQAPP(配列番号49)を含み、または本質的にこのアミノ酸配列からなり、ここで、
XlがP,NまたはAであり、
X2がAまたはDであり、
X3がA,SまたはNであり、
X4がKまたはQであり、
X5がHまたはFであり、
X6がD,SまたはAであり、
X7がKまたはEであり、
X8がD,EまたはAであり、
XllがSまたはNであり、
X2lがN,SまたはDであり、
X28がSまたはAであり、
X40がVまたはTであり、
X43がEまたはSであり、
X44がIまたはLであり、
X52がN,SまたはDである。
以下の実施例は、本発明のさらなる説明のために提供されるものである。しかしながら、本発明はそれらに限定されるものではなく、以下の実施例は上記記載に基づく本発明の実行可能性を示すに過ぎない。本発明の完全な開示のために、本出願に引用される文献も参照される。それら文献は、引用により本出願に完全に組み込まれるものである。
本発明のIgG結合タンパク質を、天然に存在するプロテインAドメインおよびプロテインA誘導体(例えば、Zドメインまたは任意の天然に存在するドメインと少なくとも90%の同一性を有する他のドメイン)のシャッフリングプロセスによって最初に生成した。シャッフリングプロセスは、a)5つの天然に存在するプロテインAドメインE、B、D、AおよびCおよびプロテインA誘導体ドメインZの配列を提供するステップと、b)前記配列のアライメントを行うステップと、c)インシリコで統計的フラグメンテーションを行って、天然に存在するIg結合ドメインの位置Q9、Q10、A12、F13、Y14、L17、P20、L22、Q26、R27、F30、I31、Q32、S33、L34、K35、D36、D37、P38、S39、S41、L45、E47、A48、K50、L51、Q55、P57が維持されるという条件で組み換えが可能な配列を特定するステップと、d)様々なフラグメントの新しい人工的な配列を構築して、モザイク生成物、すなわち新規なアミノ酸配列を生成するステップとを備えるものであった。
「E、D、A、B、C、Z」は、天然に存在するプロテインAドメインおよびドメインZ(配列番号3−8)を指している。数字「9−30」は、本発明のIg結合タンパク質の例を示している。例えば、数字「9−24」は対応する配列番号9−24を示し、「25」は配列番号26を示し、「26」は配列番号27を示し、「27」は配列番号28を示し、「28」は配列番号30を示している。
HMS174(DE3)コンピテント細胞を、IgG結合タンパク質をコードする発現プラスミドで形質転換した。細胞を選択的寒天プレート(カナマイシン)上に分散させ、37℃で一晩インキュベートした。前培養物を単一コロニーから100mlのスーパーリッチ培地(改変H15培地2%グルコース、5%酵母エキス、1%カザミノ酸、0.76%グリセロール、1%トルラ酵母RNA、250mMのMOPS、202mMのTRIS、10mg/LのRNase A、pH7.4、消泡剤SE15)に接種し、ラクトースおよび消泡剤を含まない150μg/mlのカナマイシンを添加したバッフル付き1リットル三角フラスコ中で、従来のオービタルシェーカーを用いて160rpm、37℃で16時間培養した。OD600リードアウトは6−12の範囲内とする必要がある。主培養物を、グリセロール、グルコース、ラクトース、消泡剤および150μg/mlのカナマイシンを補充した1Lの厚壁三角フラスコ中の400mlのスーパーリッチ培地中で、0.5の調整された開始OD600で前の一晩培養物から接種した。培養物を共鳴音響ミキサ(RAMbio)に移し、37℃で20×gでインキュベートした。Oxy−Pumpストッパによってエアレーションを促進した。グルコースを代謝させ、続いてラクトースを細胞に入れることにより、組み換えタンパク質発現を誘導した。予め設定された時点で、OD600を測定し、5/OD600に調整した試料を取り出し、ペレット化し、−20℃で凍結させた。細胞を約24時間一晩増殖させて、約45−60の最終的なOD600に達した。バイオマスを回収するために、細胞を16000×gで10分間、20℃で遠心分離した。ペレットを秤量し(湿重量)、上清中のpHを測定した。処理前に細胞を−20℃で保存した。
発酵中に採取した試料を300μl抽出緩衝液(0.2mg/mlのリゾチーム、0.5×のBugBuster、7.5mMのMgSC4、40UのBenzonaseを添加したPBS)に再懸濁し、サーモミキサで700rpm、室温で15分間攪拌して可溶化した。可溶性タンパク質を、遠心分離(16000×g、2分、室温)によって不溶性タンパク質から分離した。上清を回収し(可溶性画分)、ペレット(不溶性画分)を等量の尿素緩衝液(8M尿素、0.2Mトリス、2mMのEDTA、pH8.5)に再懸濁した。可溶性画分および不溶性画分の両方から50μlを採取し、12μl、5×の試料緩衝液および5μlの0.5MのDTTを添加した。試料を95℃で5分間沸騰させた。最後に、これらの試料8μlを、製造者の推奨に従って作動させたNuPage Novex 4−12% Bis−Tris SDSゲルに加え、クマシーで染色した。すべてのIgG結合タンパク質の高レベル発現は、選択された期間内に最適化された条件下で見出された(図3)。全ての発現されたIg結合性タンパク質は、SDS−PAGEによれば95%以上まで可溶性であった。
すべてのIgG結合タンパク質を、C末端StrepTagII(WSHPQFEK;配列番号44)を有するE.coliの可溶性画分中で発現させた。細胞を超音波処理によって溶解させ、最初の精製工程をStrep−Tactin−カラムで製造者の指示に従って行った。ジスルフィド形成を回避するために、緩衝液に1mMのDTTを補充した。溶出画分を、20mMのクエン酸pH6.0および150mMのNaClで平衡化したHiLoad 16/600 Superdex 75pg(GE Healthcare)に注入した。ピーク画分をプールし、SDS−PAGEにより分析した。
IgG1またはIgG2またはIgG4に対するIgG結合タンパク質の親和性を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて測定した。IgG1またはIgG2またはIgG4含有抗体(例えば、IgG1のためにセツキシマブ、IgG2のためにパニツムマブ、またはIgG4のためにナタリズマブ)を96ウェルNunc MaxiSorb ELISAプレート(2μg/ml)に固定化した。4℃で16時間インキュベートした後、ウェルをPBST(PBS +0.1% Tween20)で3回洗浄し、ウェルをPBS中の3%BSAでブロックした(室温で2時間)。ネガティブコントロールは、BSAのみでブロックされたウェルであった。ブロッキング後、ウェルをPBSTで3回洗浄し、室温でIgG結合タンパク質(PBST中)とともに1時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルをPBSTで3回洗浄し、続いてIBAのStrep−Tactin−HRP(1:10000)とともに室温で1時間インキュベートした。その後、ウェルをPBSTで3回、PBSで3回洗浄した。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼの活性を、TMB−Plus基質を添加することによって視覚化した。30分後、0.2MのH2SO4を添加することによって反応を停止させ、吸光度を450nmで測定した。結果を表2に示す。
CM5センサチップ(GE Healthcare)をSPRランニング緩衝液で平衡化した。EDCおよびNHSの混合物を通過させることによって表面露出したカルボキシル基を活性化して、反応性エステル基を得た。700−1500RUのオンリガンドをフローセルに固定し、オフリガンドを別のフローセルに固定した。リガンド固定化後のエタノールアミンの注入は、非共有結合したIg結合タンパク質を除去する。リガンド結合の際に、タンパク質分析物が表面に蓄積され、屈折率が増加した。この屈折率の変化をリアルタイムで測定し、時間に対する応答または共鳴単位(RU)としてプロットした。適切な流速(μl/分)による連続希釈法で分析物をチップに加えた。各実験の後、チップ表面を再生緩衝液で再生し、ランニング緩衝液で平衡化した。対照サンプルをマトリックスに適用した。前述したように、再生および再平衡化を行った。結合の調査は、Biacore(登録商標)3000(GE Healthcare)の使用により実施し、データ評価は、Langmuir 1:1モデル(RI=0)を使用して、製造業者によって提供されたBIAevaluation 3.0ソフトウェアによって行った。評価した解離定数(KD)をオフターゲットに対して標準化した。結果を表3に示す。
IgG結合タンパク質を、製造元の説明書に従って、SulfoLink(登録商標)カップリング樹脂(Thermo;カタログ番号20402)にカップリングさせた。カラムの樹脂床容量は300μlであった。カラムをカップリング緩衝液(50mMのトリス、5mMのEDTA−Na、pH8.5)の4つの樹脂床容量で平衡化した。IgG結合タンパク質をカラムに添加した(1−2ml/mlのSulfoLinkカップリング樹脂)。IgG結合タンパク質を、C末端(ASPAPSAPSAC;配列番号39)でシステインを介してマトリックスに結合させた。カラムを15分間混合し、混合せずにさらに30分間インキュベートし、カップリング緩衝液で洗浄した。系の流量は0.5ml/分であった。300μlの50mMシステイン溶液をカラムに添加し、15分間混合し、混合せずにさらに30分間インキュベートし、1MのNaClで洗浄し、続いてPBSで洗浄した。
精製IgG結合タンパク質を、製造者の指示(カップリング条件:pH9.0で一晩、エタノールアミンで5時間ブロッキング)に従って、エポキシ活性化マトリックス(Sepharose 6B、GE;カタログ番号17−0480−01)にカップリングさせた。セツキシマブをIgGサンプル(5mg;1mg/mlマトリックス)として使用した。セツキシマブを、固定化IgG結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。マトリックスを100mMグリシン緩衝液(pH2.5)で洗浄して、固定化IgG結合タンパク質に結合したセツキシマブを溶出させた。Ig結合タンパク質の結合活性(静的結合能)を測定するために、溶出したIgGの濃度を280nmで分光学的に測定した。カラムを、室温(22℃±3℃)で0.5MのNaOHで6時間インキュベートした。固定化したタンパク質のIgG結合活性を、0.5MのNaOHで6時間インキュベートする前後で分析した。NaOH処理前の固定化タンパク質のIgG結合活性を100%と定義した。
配列番号1 非天然Ig結合ドメインの一般配列
配列番号2 非天然Ig結合ドメインの一般配列
配列番号3 黄色ブドウ球菌ドメインE(CID 148473)
配列番号4 黄色ブドウ球菌ドメインD(CID 148474)
配列番号5 黄色ブドウ球菌ドメインA(CID 148475)
配列番号6 黄色ブドウ球菌ドメインB(CID 148476)
配列番号7 黄色ブドウ球菌ドメインC(CID 148477)
配列番号8 プロテインAのドメインZ(CID 148478)
配列番号9 シャッフル配列IB9,CID 148458
配列番号10 シャッフル配列IB10,CID 148459
配列番号11 シャッフル配列IB11,CID 148460
配列番号12 シャッフル配列IB12,CID 148461
配列番号13 シャッフル配列IB13,CID 148462
配列番号14 シャッフル配列IB14,CID 148463
配列番号15 シャッフル配列IB15,CID 148464
配列番号16 シャッフル配列IB16,CID 148465
配列番号17 シャッフル配列IB17,CID 148466
配列番号18 シャッフル配列IB18,CID 148467
配列番号19 シャッフル配列IB19,CID 148468
配列番号20 シャッフル配列IB20,CID 148469
配列番号21 シャッフル配列IB21,CID 148470
配列番号22 シャッフル配列IB22,CID 148471
配列番号23 シャッフル配列IB23,CID 148472
配列番号24 シャッフル配列IB24,CID 154253
配列番号25 シャッフル配列IB15b
配列番号26 シャッフル配列IB25,CID 154254
配列番号27 シャッフル配列IB26,CID 154255
配列番号28 シャッフル配列IB27,CID 154256
配列番号29 シャッフル配列IB29
配列番号30 シャッフル配列IB28,CID 154257
配列番号31 リンカー
配列番号32 リンカー
配列番号33 リンカー
配列番号34 リンカー
配列番号35 リンカー
配列番号36 リンカー
配列番号37 リンカー
配列番号38 例えばIB9−IB28についての非天然Ig結合ドメインの一般配列
配列番号39 C末端結合配列(APS10/C)
配列番号40 C末端結合配列(APS30/C)
配列番号41 APS30リンカー
配列番号42 APS30リンカー
配列番号43 APS10リンカー
配列番号44 Streptag
配列番号45 IB14二量体,CID 150570
配列番号46 IB14四量体,CID 150663
配列番号47 IB14六量体,CID 150772
配列番号48 例えばIB24−IB28についての一般配列
配列番号49 例えばIB9−IB23についての一般配列
配列番号50 C末端結合配列およびStrep−tagを有する配列番号14
配列番号51 C末端結合配列およびStrep−tagを有する配列番号28
Claims (15)
- 1またはそれ以上の非天然Ig結合ドメインを含む非天然免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質であって、少なくとも1の非天然Ig結合ドメインが、アミノ酸配列:XlX2X3X4X5X6X7X8QQXllAFYX15Xl6LXl8Xl9PX2lLX23X24X25QRX28X29FIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QX56PX58(配列番号1)を含み、
ここで、
XlがA,V,Q,NまたはPであり、
X2がD,AまたはQであり、
X3がA,SまたはNであり、
X4がK,QまたはNであり、
X5がHまたはFであり、
X6がD,N,SまたはAであり、
X7がEまたはKであり、
X8がD,EまたはAであり、
XllがSまたはNであり、
X15がE,DまたはQであり、
Xl6がVまたはIであり、
Xl8がHまたはNであり、
Xl9がLまたはMであり、
X2lがN,SまたはDであり、
X23がTまたはNであり、
X24がEまたはAであり、
X25がDまたはEであり、
X28がN,SまたはAであり、
X29がGまたはAであり、
X40がV,QまたはTであり、
X42がK,TまたはAであり、
X43がE,NまたはSであり、
X44がV,LまたはIであり、
X46がGまたはAであり、
X49がKまたはQであり、
X52がN,SまたはDであり、
X53がDまたはEであり、
X54がSまたはAであり、
X56がAまたはPであり、
X58がKまたはPであり、
前記非天然Ig結合タンパク質のヒトIgG1に対する解離定数KDが1μM以下、好ましくは100nM以下であることを特徴とする非天然Ig結合タンパク質。 - 請求項1に記載の非天然Ig結合タンパク質において、
少なくとも1の非天然Ig結合ドメインが、アミノ酸配列:X1X2X3X4X5X6X7X8QQX11AFYEILHLPX21LTEX25QRX28AFIQSLKDDPSX40SX42X43X44LX46EAX49KLX52X53X54QAPX58(配列番号38)を含み、ここで、
XlがN,V,PまたはAであり、
X2がDまたはAであり、
X3がA,SまたはNであり、
X4がKまたはQであり、
X5がHまたはFであり、
X6がD,SまたはAであり、
X7がEまたはKであり、
X8がD,EまたはAであり、
XllがSまたはNであり、
X2lがN,SまたはDであり、
X25がDまたはEであり、
X28がN,SまたはAであり、
X40がV,TまたはQであり、
X42がKまたはAであり、
X43がEまたはSであり、
X44がV,LまたはIであり、
X46がGまたはAであり、
X49がKまたはQであり、
X52がN,SまたはDであり、
X53がDまたはEであり、
X54がSまたはAであり、
X58がKまたはPであることを特徴とする非天然Ig結合タンパク質。 - 請求項1乃至3の何れか一項に記載の非天然Ig結合タンパク質において、
前記非天然Ig結合タンパク質がアルカリ性条件下で安定であることを特徴とする非天然Ig結合タンパク質。 - 請求項1乃至4の何れか一項に記載の非天然Ig結合タンパク質において、
2,3,4,5,6,7または8の非天然Ig結合ドメインが互いに連結されていることを特徴とする非天然Ig結合タンパク質。 - 請求項1乃至5の何れか一項に記載の非天然Ig結合タンパク質において、
前記非天然Ig結合タンパク質が、固相への部位特異的共有結合のための特異的付着部位を含むことを特徴とする非天然Ig結合タンパク質。 - 請求項1乃至6の何れか一項に記載の非天然免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質を含む組成物であって、好ましくは当該組成物がアフィニティ分離マトリックスであることを特徴とする組成物。
- 免疫グロブリンのアフィニティ精製のための、請求項1乃至6の何れか一項に記載の非天然Ig結合タンパク質または請求項7に記載の組成物の使用。
- 免疫グロブリンのアフィニティ精製方法であって、
a.免疫グロブリンを含有する液体を提供するステップと、
b.請求項1乃至6の何れか一項に記載の固定化された非天然Ig結合タンパク質を含むアフィニティ分離マトリックスを提供するステップと、
c.前記液体と前記アフィニティ分離マトリックスとを接触させるステップであって、前記免疫グロブリンが固定化されたタンパク質に結合する、ステップと、
d.好ましくはpHの変化または塩濃度の変化により、前記免疫グロブリンをマトリックスから溶出し、それによって前記免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップとを含み、
e.任意選択的に、ステップ(c)とステップ(d)の間に実行される1またはそれ以上の洗浄ステップをさらに含むことを特徴とする方法。 - 請求項8に記載の方法において、
免疫グロブリンが、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG4、ヒトIgM、ヒトIgA、マウスIgG1、マウスIgG2A、マウスIgG2B、マウスIgG3、ラットIgG1、ラットIgG2C、ヤギIgG1、ヤギIgG2、ウシIgG2、モルモットIgG、ウサギIgG、Fc領域を含む免疫グロブリンフラグメント、免疫グロブリンのFc領域を含む融合タンパク質、および免疫グロブリンのFc領域を含むコンジュゲートからなる群から選択されることを特徴とする方法。 - 請求項1乃至6の何れか一項に記載の非天然免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質の生成方法であって、少なくとも1のIg結合ドメインが、天然に存在するIg結合タンパク質からの少なくとも2の天然に存在するIg結合ドメインのシャッフリングプロセスによって得ることができることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至6の何れか一項に記載の非天然免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質をコードする核酸分子。
- 請求項12に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項1乃至6の何れか一項に記載の非天然免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質、請求項12に記載の核酸、または請求項13に記載のベクターを含む宿主細胞または非ヒト宿主。
- 請求項1乃至6の何れか一項に記載の非天然免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質の産生方法であって、
a.前記非天然免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質を得るために、結合タンパク質の発現のための適切な条件下で、請求項14に記載の宿主細胞を培養するステップと、
b.任意選択的に、前記非天然免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質を単離するステップとを備えることを特徴とする方法。
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