JP7355729B2 - C末端ヘリカル領域にシステインを有するfc結合タンパク質 - Google Patents
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Description
[本発明の根底にある技術的課題]
(a)免疫グロブリンを含んでいる液体を準備する工程;
(b)アフィニティー分離マトリックスにカップリングされた第1の様相の固定化されたFc結合タンパク質を含んでいる当該アフィニティー分離マトリックスを準備する工程;
(c)当該液体と当該アフィニティー分離マトリックスとを接触させて、当該免疫グロブリンが当該固定化されたFc結合タンパク質に結合する工程;および
(d)当該マトリックスから当該免疫グロブリンを溶出させ、それによって当該免疫グロブリンを含んでいる溶出液を得る工程。
本発明が以下に詳細に記載される前に、本発明は、本明細書に記載された特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、それらが変更可能であることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付された特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。他様に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
用語「固体支持体」または「固体マトリックス」は、固定相と互換的に使用される。
本発明がこれからさらに説明される。以下の節では、本発明の様々な様相がより詳細に定義される。以下に定義される各様相は、明確に反対の表示がない限り、1または複数の任意の他の様相と組み合わされることができる。特に、好ましいまたは有利であると示される任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される1または複数の他の任意の特徴と組み合わされることができる。
例として、たとえば位置46にCysを有する変異体の動的結合能力は、組換えタンパク質Aと比較して優れている(図5を参照せよ)。
いくつかの実施形態は、配列番号1~86、90~99から成る群から選ばれたアミノ酸を有する配列に関する。いくつかの実施形態は、配列番号1~86、90~99から成る群から選ばれたアミノ酸と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも84%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも89.5%、少なくとも91%、少なくとも93%、少なくとも94.5%、少なくとも96%、少なくとも98%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列に関し、但しそれらが、位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54の中に少なくとも1つのシステインを有することを条件とする。好ましいのは、位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54に、好ましくは位置43または/および46に、より好ましくは位置46に少なくとも1つのシステインを有する配列番号1~86、90~99から成る群から選ばれたアミノ酸と、少なくとも89.5%の同一性を有する配列を有する実施形態である。好ましいのは、ヘリックス3の中に1つまたは2つのシステインを有するFc結合タンパク質の実施形態である。
いくつかの実施形態では、Fc結合タンパク質は、配列番号7のアミノ酸配列の、またはそれと少なくとも89.5%の同一性を有する、位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の、1つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号7に少なくとも89.5%の同一性を有するアミノ酸配列はcs24(配列番号8)を含んでいるが、これに限定されない。位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54にCysを有するcs26の変異体の例は、たとえば配列番号26~39および90~99を含んでいるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Fc結合タンパク質は、配列番号8のアミノ酸配列の、またそれと少なくとも89.5%の同一性を有する、位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の、1つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号8に少なくとも89.5%の同一性を有するアミノ酸配列はcs26(配列番号7)を含んでいるが、これに限定されない。位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54にCysを有するcs26の変異体の例は、たとえば配列番号26~39および90~99を含んでいるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Fc結合タンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列の、またそれと少なくとも89.5%の同一性を有する、位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の1つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号3に少なくとも89.5%の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号10(cs25)、配列番号11(cs47h3)、配列番号12(cs47h4)、配列番号13(cs74h1)および配列番号14(cs74h2)を含んでいるが、これらに限定されない。位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54にCysを有するcs14の変異体の例は、たとえば配列番号17~20、40~52、64、65、70、71および74~76を含んでいるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Fc結合タンパク質は、配列番号4のアミノ酸配列の、またそれと少なくとも89.5%の同一性を有する、位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の1つ以上のドメインを含んでいる。位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54にCysを有するcs27の変異体の例は、たとえば配列番号21~25を含んでいるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Fc結合タンパク質は、配列番号5のアミノ酸配列の、またそれと少なくとも89.5%の同一性を有する、位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の1つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号5に少なくとも89.5%の同一性を有するアミノ酸配列は配列番号9(cs17)を含んでいるが、これに限定されない。位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54にCysを有するcs20の変異体の例は、たとえば配列番号53~57を含んでいるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Fc結合タンパク質は、配列番号6のアミノ酸配列の、またそれと少なくとも89.5%の同一性を有する、位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の1つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号16に少なくとも89.5%の同一性を有するアミノ酸配列はcs28(位置4で異なる。)またはcs41(配列番号15)を含んでいるが、これに限定されない。位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54にCysを有するcs42の変異体の例は、たとえば配列番号58~63を含んでいるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Fc結合タンパク質は、配列番号16のアミノ酸配列の、またそれと少なくとも89.5%の同一性を有する、位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の1つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号16に少なくとも89.5%の同一性を有するアミノ酸配列はcs44(位置44で異なる。)、cs31(位置25および54で異なる。)またはcs45(位置25および26で異なる。)を含んでいるが、これに限定されない。位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54にCysを有するcs43の変異体の例は、たとえば配列番号66~69および72を含んでいるが、これらに限定されない。
驚いたことに、Fc結合ドメインのヘリックス3中のシステインは、図および実施例に示されるように、ヘリックス3中にシステインを有しないドメインと比較して、Fc結合ドメインのアルカリ安定性を増加させ、かつマトリックスへのFc結合タンパク質の部位特異的なカップリングを改善し、これは能力を改善する。
いくつかの実施形態では、当該Fc結合ドメインは位置42にロイシン(L)を含んでいる。位置42のアミノ酸はチロシン(Y)でないことが好ましい。
IX2AX4X5DX7X8QQX11AFYEILHLPNLTEX25QRNAFIQSLX35DDPSX40SLX43X44LX46X47AX49X50X51NX53X54QAPX58。
この配列で、位置1でのアミノ酸はIから選ばれまたは欠失され、位置2(X2)でのアミノ酸はAまたはDから選ばれまたは欠失され、位置3でのアミノ酸はAから選ばれるまたは欠失され、位置4(X4)でのアミノ酸はKまたはQから選ばれまたは欠失され、位置5(X5)でのアミノ酸はHまたはFから選ばれ、位置7(X7)でのアミノ酸はKまたはEから選ばれ、位置8(X8)でのアミノ酸はD、AまたはEから選ばれ、位置11(X11)でのアミノ酸はA、S、IまたはEから選ばれ、位置25(X25)でのアミノ酸はDまたはEから選ばれ、位置35(X35)でのアミノ酸はRまたはIから選ばれ、位置40(X40)でのアミノ酸はQ、T、VまたはCから選ばれ、位置42(X42)でのアミノ酸はLまたはCから選ばれ、位置43(X43)でのアミノ酸はE、SまたはCから選ばれ、位置44(X44)でのアミノ酸はI、LまたはVから選ばれ、位置46(X46)でのアミノ酸はG、AまたはCから選ばれ、位置47(X47)でのアミノ酸はEまたはCから選ばれ、位置49(X49)でのアミノ酸はK、QまたはCから選ばれ、位置50(X50)でのアミノ酸はKまたはCであり、位置51(X51)でのアミノ酸はLまたはCであり、位置53(X53)でのアミノ酸はD、EまたはCから選ばれ、位置54(X54)でのアミノ酸はAまたはSまたはCから選ばれ、位置57でのアミノ酸はPから選ばれまたは欠失され、および位置58(X58)でのアミノ酸はPまたはKから選ばれまたは欠失される。本発明のFc結合タンパク質は以下の位置のうちの1つまたは2つにシステインを有する:40、42、43、46、47、49、50、51、53および54。本発明のFc結合ドメイン用に選ばれる例としては、たとえば配列番号17~73および90~99が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、実施例および図に示されるように、ヘリックス3中にシステインを有するFc結合タンパク質は、Fc結合タンパク質の驚くほど特に良好なアルカリ安定性を提供する。ヘリックス3中にシステインを有するFc結合タンパク質が、数時間のアルカリ処理の後でさえもIgに結合することができることは最も驚くべきことでありかつ予期し得ないことであった。Fc結合タンパク質のアルカリ安定性は、0.5MのNaOH中で少なくとも6時間のインキュベーション後のIg結合活性の損失量を比較することによって測定される(図3を参照せよ。)。たとえば、cs26 46Cの結合能力は、0.5MのNaOHを用いた長時間(たとえば、36時間)のインキュベーション後の野生型ドメインCよりも少なくとも20%高く保持されている(図4を参照せよ。)。
本発明の全てのFc結合タンパク質は、好ましくは500nM未満、または100未満nM、さらにより好ましくは10nM以下の解離定数KDで免疫グロブリンに結合する。Fc結合タンパク質またはドメインの結合親和力を測定する方法、すなわち解離定数KDを測定する方法は、当業者に知られており、たとえば当技術分野で知られた以下の方法から選ばれることができる:表面プラズモン共鳴(SPR)に基いた技術、バイオ層干渉計使用法(BLI)、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)、フローサイトメトリー、等温滴定熱量測定法(ITC)、分析的超遠心分離、放射免疫検定(RIAまたはIRMA)および増強化学発光(ECL)。これらの方法のいくつかは実施例にさらに記載される。
本発明の1つの実施形態では、Fc結合タンパク質は1、2、3、4、5、6、7または8つ、好ましくは2、3、4、5または6つの互いに連結されたFc結合ドメインを含んでいる、すなわちFc結合タンパク質は、たとえば単量体、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体であることができる。多量体は2、3、4つまたはさらにそれより多くの結合ドメインを含んでいてもよい。本発明の多量体は、一般に当業者に周知の組換えDNA技術によって人工的に生成された融合タンパク質である。
多量体は2つ以上のFc結合ドメインを含んでいてもよく、その場合に当該Fc結合ドメインは、好ましくは上記の配列を含んでおり、またはそれから本質的に成り、但しそれらがヘリックス3中に少なくとも1つのシステインを有することを条件とする。
たとえば、配列番号27または配列番号22が使用されて、本明細書の実施例1に記載されたホモ多量体融合構成物が生成される。たとえば配列番号32、配列番号35または配列番号25を参照せよ。
第1の様相のいくつかの実施形態では、1つ以上のFc結合ドメインは、互いに直接連結される。他の実施形態では、1つ以上のFc結合ドメインは、互いに1つ以上のリンカーによって連結される。これらの典型的な実施形態で好ましいのは、ペプチドリンカーである。これは、ペプチドリンカーが第1のFc結合ドメインを第2のFc結合ドメインに結合するアミノ酸配列であることを意味する。ペプチドリンカーは、第1のFc結合ドメインおよび第2のFc結合ドメインに、これらのドメインのC末端とN末端の間のペプチド結合によって結合され、それによって単一の線状のポリペプチド鎖を生成する。リンカーの長さおよび構成は、少なくとも1個と約30個までのアミノ酸の間で様々であってもよい。より具体的には、ペプチドリンカーは、1~30個のアミノ酸、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個のアミノ酸の長さを有する。
本発明のいくつかの実施形態では、Fc結合タンパク質は固体担体にコンジュゲートされる。Fc結合ドメインのヘリックス3の中のシステインは、固体担体へのFc結合タンパク質の部位特異的な共有結合によるカップリングのための付加部位を含んでいる。位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54での少なくとも1つのシステインは、固相の反応基との、または固相とタンパク質、たとえばN-ヒドロキシスクシンイミド、ヨードアセトアミド、マレイミド、エポキシまたはアルケン基から選ばれたものとの間のリンカーとの特定の化学反応を可能にする。
別の様相では、本発明は、第1の様相のFc結合タンパク質を含んでいるアフィニティー分離マトリックスに関する。
第2の様相の好ましい実施形態では、アフィニティー分離マトリックスは固体担体である。アフィニティー分離マトリックスは、本発明の少なくとも1つのFc結合タンパク質を含んでいる。
アフィニティーマトリックスは免疫グロブリンの分離に有用であり、洗浄工程の際に適用されるような高度にアルカリ性の条件の後でさえもIg結合特性を保持するべきである。マトリックスのそのような洗浄は、マトリックスの長期間の繰り返し使用にとって不可欠である。
第3の様相では、本発明は、第1の様相のFc結合タンパク質または第2の様相のアフィニティーマトリックスの、免疫グロブリンまたはその変異体のアフィニティー精製への使用に関する。すなわち、本発明のFc結合タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーに使用される。いくつかの実施形態では、本発明のFc結合タンパク質は、本発明の第2の様相に記載された固体担体上に固定化される。
第4の様相では、本発明は、免疫グロブリンのアフィニティー精製の方法に関し、この方法は以下の工程を含む:(a)免疫グロブリンを含んでいる液体を準備する工程;(b)アフィニティー分離マトリックスにカップリングされた第1の様相の固定化されたFc結合タンパク質を含んでいる当該アフィニティー分離マトリックスを準備する工程;(c)当該液体と当該アフィニティー分離マトリックスとを接触させて、当該免疫グロブリンが当該固定化されたFc結合タンパク質に結合する工程;および(d)当該マトリックスから当該免疫グロブリンを溶出させ、それによって当該免疫グロブリンを含有する溶離液を得る工程。
本明細書に開示された使用および方法に適したアフィニティー分離マトリックスは、上に記載された実施形態によるおよび当業者に知られているマトリックスである。
第5の様相では、本発明は、上に開示された任意の実施形態のFc結合タンパク質をコードする核酸分子、好ましくは単離された核酸分子に関する。1つの実施形態では、本発明は核酸分子を含んでいるベクターに関する。ベクターとは、タンパク質をコードする情報を宿主細胞中に転移するために使用されることができる任意の分子または部分(たとえば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウィルス)を意味する。1つの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。
第7の様相では、本発明は、以下の工程を含む本発明のFc結合タンパク質を産生する方法に関する:(a)当該Fc結合タンパク質を得るために、この結合タンパク質の発現に適した条件の下で第6の様相の宿主細胞を培養する工程;および(b)任意的に当該Fc結合タンパク質を分離する工程。原核生物または真核生物の宿主の培養に適した条件は当業者に周知である。
本発明のさらなる実施形態では、Fc結合タンパク質の産生は無細胞の生体外の転写/翻訳によって実施される。
[実施例]
Fc結合タンパク質が、天然型のタンパク質Aのドメイン(E、B、D、A、C、Z)のシャッフリングプロセスによって初めに生成された。より詳細には、本明細書で理解されるシャッフリングプロセスとは、1組の同一でない既知のアミノ酸配列から出発して人工的なアミノ酸配列をもたらす組み立てプロセスである。シャッフリングプロセスは以下の工程から構成される:a)5つの天然型のタンパク質AのドメインE、B、D、AおよびCならびにタンパク質A変異体ドメインZの配列を準備する工程;およびb)当該配列のアラインメント;c)コンピューター内での統計的断片化によって、組み換えられた部分配列を同定する工程;そして次にd)様々な断片から新規な人工的な配列を組み立てて、モザイク産物、すなわち新規かつ人工的なアミノ酸配列を生成する工程。工程c)で生成された断片は任意の長さのもの、たとえば断片化された親配列がnの長さを有していた場合、断片は長さが1~n-1であった。
多量体Fc結合タンパク質を生成するために、2つまたは3つの同一のFc結合ドメインが遺伝子工学的に融合された。
特定の精製については、任意的に、strepタグ(WSHPQFEK;配列番号89)がFc結合タンパク質のC末端に付加された。
部位特異的な突然変異生成については、Q5(商標)部位特異的突然変異生成キット(NEB;カタログ番号E0554S)が製造業者の取扱説明書に従って使用された。PCRが、各特定の置換のそれぞれをコードするオリゴヌクレオチドおよびテンプレートを含有するプラスミドを用いて実施された。産物がライゲーションされ、電気穿孔法によって大腸菌(E.Coli)XL2-ブルー細胞(Stratagene社)中に形質転換された。単一コロニーが単離され、DNAシークエンシングが挿入物含有クローンについて使用されて、正確な配列が検証された。
BL21(DE3)コンピテント細胞が、Fc結合タンパク質をコードする発現プラスミドを用いて形質転換された。細胞は選択的寒天プレート(カナマイシン)上に広げられ、37℃で一晩インキュベートされた。予備培養物は100mlの2×YT培地中で単一コロニーから接種を受けて、ラクトースおよび消泡剤を含んでいない150μg/mlのカナマイシンで補給された、バッフル付き1リットルのエルレンマイヤーフラスコ中の従来型の軌道シェーカーの中で160rpm、37℃で16時間培養された。OD600の計測値は6~12の範囲にあるはずである。主培養物は、150μg/mlのカナマイシンで補給された、1リットルの厚肉エルレンマイヤーフラスコ内の400mlのスーパーリッチ培地(変性H15培地2%のグルコース、5%の酵母エキス、0.89%のグリセリン、0.76%のラクトース、250mMのMOPS、202mMのTRIS、pH7.4、消泡剤SE15)中で、0.5の調整後の開始時OD600計測値を有する先の一晩培養物から接種を受けた。培養物は共鳴音響ミキサー(RAMbio)に転送され、20×g、37℃でインキュベートされた。通気はOxy-Pumpストッパーによって促進された。組み換えタンパク質の発現が、グルコースを代謝させ、引き続いてラクトースを細胞内に進入させることによって誘導された。所定の時点でOD600が測定され、5/OD600に調整されたサンプルが抜き出され、ペレット化され、-20℃で凍結された。細胞はおよそ24時間にわたり一晩増殖させられて、約45~60の最終OD600に達した。バイオマスを収集するために、細胞は20℃で10分間、16000×gで遠心分離された。ペレットは秤量(湿潤重量)され、pHが上清中で測定された。細胞はプロセッシングされるまで-20℃で貯蔵された。
発酵中に採取されたサンプルが、300μlの抽出緩衝液(0.2mg/mlのリゾチーム、0.5×のBugBuster、7.5mMのMgSO4、40UのBenzonaseで補給されたPBS)中に再懸濁され、700rpm、室温で15分間、サーモミキサー中の撹拌によって溶解された。可溶性タンパク質が遠心分離(16000×g、2分間、室温)によって不溶性タンパク質から分離された。上清(可溶性画分)が抜き出され。ペレット(不溶性画分)が同等量の尿素緩衝液(8Mの尿素、0.2MのTris、2 mMのEDTA、pH8.5)の中に再懸濁された。50μlが可溶性および不溶性画分の両方から採取され、12μlの5×サンプル緩衝液とともに5μlの0.5MのDTTが添加された。サンプルは95℃で5分間沸騰させられた。最後に、8μlのこれらのサンプルが、製造業者の推奨条件に従って稼働されるNuPage Novex 4~12%のBis-TrisSDSゲルにかけられ、クーマシィーで染色された。全てのFc結合タンパク質の高いレベルの発現が、選択された時間内の最適化された条件の下で見出された(データは示されていない。)。発現されたFc結合タンパク質はすべて、SDS-PAGEによって95%超まで可溶性であった。
Fc結合タンパク質が、C末端StrepタグII(WSHPQFEK)を用いて大腸菌(E.Coli)の可溶性画分中で発現された。細胞は2つの凍結/溶解サイクルによって溶解され、精製工程がStrep-Tactin(商標)樹脂を用いて製造業者(IBA社、独国、ゲッチンゲン)の取扱説明書に従って実施された。ジスルフィドの形成を回避するために、緩衝液には1mMのDTTが補給された。
酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)を使用して、IgG1またはIgG2またはIgG4へのFc結合タンパク質の親和性が測定された。IgG1またはIgG2またはIgG4含有抗体(たとえば、IgG1についてCetuximab、IgG2についてPanitumumabまたはIgG4についてNatalizumab)が、96ウェルNunc MaxiSorb ELISAプレート(2μg/ml)上に固定化された。4℃で16時間のインキュベーションの後、ウェルはPBST(PBS+0.1%のTween20)で3回洗われ、ウェルはPBS中3%のBSAでブロックされた(室温で2時間)。陰性対照物は、BSAでのみブロックされたウェルであった。ブロッキングの後、ウェルはPBSTで3回洗われ、Fc結合タンパク質とともに(PBST中で)室温で1時間インキュベートされた。インキュベーションの後、ウェルはPBSTで3回洗われ、引き続いて、Strep-Tactin-HRP(1:10000)(IBA社、独国、ゲッチンゲン)を用いて室温で1時間インキュベートされた。その後、ウェルはPBSTで3回およびPBSで3回洗われた。ホースラディシュ・ペルオキシダーゼの活性が、TMB-Plus基質を加えることにより視覚化された。30分後、反応は0.2MのH2SO4を加えることにより停止され、吸光度が450nmで測定された。たとえば、ELISAによって測定されて、ヒトIgG1についてのKDはIB14の場合、4.9nM;ドメインZの場合、3.4nM;ドメインBの場合、3.1nM;およびドメインCの場合、2.8nMである。
CM5センサーチップ(GE Healthcare社)がSPRランニング緩衝液で平衡化された。表面に露出したカルボキシル基がEDCとNHSとの混合物を通されることによって活性化されて、反応性エステル基が生成された。700~1500RUのオンリガンドがフローセル上に固定化され、オフリガンドは別のフローセル上に固定化された。リガンド固定化後のエタノールアミンの注入が、非共有結合で結合されたFc結合タンパク質を除去する。リガンドが結合した後、検査対象タンパク質は表面に蓄積され、屈折率を増加させる。屈折率のこの変化はリアルタイムで測定され、時間に対する応答または共鳴単位(RU)としてプロットされた。検査対象物は、適当な流量(μl/分)による連続希釈法でチップにかけられた。各実験の後、チップ表面は再生緩衝液で再生され、ランニング緩衝液で平衡化された。対照サンプルはマトリックスに適用された。再生および再平衡は、先に言及されたように実施された。結合の検討は、25℃でBiacore(商標)3000(GE Healthcare社)を使用することによって実施され、データ評価は、Langmuir 1:1モデル(RI=0)を使用して、製造業者によって提供されたBIAevaluation 3.0ソフトウェアによって行われた。評価された解離定数(KD)はオフターゲットに対して標準化され、ヒトIgG1-Fc、Cetuximab(IgG1)、Natalizumab(IgG4)またはPanitumomab(IgG2)についての異なる人工的Fc結合タンパク質のKD値が表1に示される。
精製されたFc結合タンパク質が、製造業者の取扱説明書(カップリング条件:pH9.0、一晩、エタノールアミンでの5時間のブロッキング)に従ってエポキシ活性化マトリックス(セファロ-ズ6B、GE社カタログ番号17-0480-01)にカップリングされた。CetuximabがIgGサンプル(5mg;1mg/mlのマトリックス)として使用された。Cetuximabは、固定化されたFc結合タンパク質を含んでいるマトリックスに飽和量で適用された。マトリックスは100mMのグリシン緩衝液、pH2.5で洗われ、固定化されたIgG結合タンパク質に結合されたCetuximabが溶出された。溶出されたIgGの濃度は、Fc結合タンパク質の結合活性を決定するために、BLIによって測定された(Cetuximabを標準として、タンパク質Aオクテットセンサーを用いた定量化)。
カラムは、室温(22℃±3℃)で0時間、6時間、18時間、24時間、36時間または72時間、0.5MのNaOHでインキュベートされた。固定化されたタンパク質のIg結合活性が、0.5MのNaOHでのインキュベーション前後で分析された。NaOH処理前の固定化されたタンパク質のIg結合活性が100%と定義された。
精製されたFc結合タンパク質が、製造業者の取扱説明書(カップリング条件:pH9.5、3時間、35℃、4.1MのNaSO4、エタノールアミンを用いた一晩のブロッキング)に従ってアガロースに基いたクロマトグラフィービーズ(Praesto(商標)Pure45、Purolite;カタログ番号PR01262-166)にカップリングされた。多クローン性のヒトIgG Gammanorm(商標)(Ocatpharm社)が、IgGサンプル(濃度2.2mg/ml)として使用された。多クローン性のヒトIgGサンプルは、固定化されたFc結合タンパク質を含んでいるマトリックスに飽和量で適用された。マトリックスは100mMのクエン酸塩緩衝液、pH2.0で洗われて、固定化されたFc結合タンパク質に結合されたヒトIgGが溶出された。動的結合能力が、cs26 46C(モノマーおよび二量体;配列番号27、32)について、組み換え野生型タンパク質Aと比較されて、6分間の滞留時間、10%破過で注入されたヒトIgGの質量によって測定された。図5は、cs26 46Cが組換えタンパク質Aよりも6分間の滞留時間で61.2%高いDBCを有することを示す。
精製されたFc結合タンパク質(cs26 46C)が、製造業者の取扱説明書に従ってアガロースに基いたクロマトグラフィービーズ(Praesto(商標)Pure45または85)にカップリングされた。多クローン性のヒトIgG Gammanorm(商標)および単クローン性IgG1抗体Cetuximabが、IgGサンプル(濃度2.2mg/ml)として使用され、DBC10%まで仕込まれた。多クローン性のヒトIgGサンプルは、固定化されたFc結合タンパク質を含んでいるマトリックスに飽和量で適用された。2段階の工程では、マトリックスは最初に100mMのクエン酸塩緩衝液、pH3.5で、次に100mMのクエン酸塩緩衝液、pH2.0で洗われて、固定化されたFc結合タンパク質に結合されたヒトIgGが溶出された。表3は、cs26 46CとカップリングされたビーズからpH3.5で、結合されたIgGのほとんど100%が溶出されたことを示す。
Claims (15)
- 1つ以上のドメインを含んでいる苛性安定性のFc結合タンパク質であって、少なくとも1つのドメインが、配列番号3~86、90~99のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列のそれぞれと少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれか1つを含んでおり、配列番号3に対応する位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54での少なくとも1つのアミノ酸がシステインである、Fc結合タンパク質。
- 1つ以上のドメインを含んでいる苛性安定性のFc結合タンパク質であって、少なくとも1つのドメインが、配列番号2のアミノ酸配列を含んでおり、配列番号2に対応する位置40、42、43、46、47、49、50、51、53または54での少なくとも1つのアミノ酸がシステインである、Fc結合タンパク質。
- 少なくとも1つのドメインが、配列番号3~16のアミノ酸配列、または配列番号3~16のそれぞれと少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、配列番号3~16に対応する位置40、42、43、46、47、50、51、53または54での少なくとも1つのアミノ酸がシステインである、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 少なくとも1つのドメインが、配列番号7~8のアミノ酸配列、または配列番号7~8のそれぞれと少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、配列番号7~8に対応する位置40、42、43、46、47、50、51、53または54での少なくとも1つのアミノ酸がシステインである、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 配列番号3に対応する位置43、46または47での少なくとも1つのアミノ酸がシステインである、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 少なくとも1つのドメインが、配列番号17~86、90~99の群から選ばれたアミノ酸配列、または前記配列番号17~86、90~99の群から選ばれたアミノ酸配列のそれぞれと少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 前記ドメインが、前記ドメインのN末端の最初の4つのアミノ酸のうちの1つ、2つまたは3つのアミノ酸の欠失および/または前記ドメインのC末端の最初の2つのアミノ酸のうちの1つまたは2つのアミノ酸の欠失を有する、請求項1に記載のFc結合タンパク質。
- 前期タンパク質が、互いに連結された2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つのドメインを含んでいる、請求項1~7のいずれか1項に記載のFc結合タンパク質。
- 前期タンパク質がホモ多量体またはヘテロ多量体である、請求項8に記載のFc結合タンパク質。
- 前期1つ以上のドメインが、互いに直接または1つ以上のリンカー、好ましくはペプチドリンカーで連結されている、請求項9に記載のFc結合タンパク質。
- 前記タンパク質が、固体担体に、好ましくは位置40、42、43、46、47、50、51、53または54でのシステインを介してコンジュゲートされる、請求項1~10のいずれか1項に記載のFc結合タンパク質。
- 前記タンパク質が、IgG1、IgG2、IgG4、IgM、IgA、Fc領域を含んでいるIg断片、IgのFc部位を含んでいる融合タンパク質、およびIgのFc部位を含んでいるコンジュゲートに結合する、請求項1~11のいずれか1項に記載のFc結合タンパク質。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載のFc結合タンパク質を含んでいる、アフィニティー分離マトリックス。
- Fc配列を含んでいる任意のタンパク質のアフィニティー精製のための、請求項1~12のいずれか1項に記載のFc結合タンパク質または請求項13に記載のアフィニティー分離マトリックスの使用。
- Fc配列を含んでいるタンパク質のアフィニティー精製の方法であって、以下の工程を含む方法:(a)Fc配列を含んでいるタンパク質を含有する液体を準備する工程;(b)アフィニティー分離マトリックスにカップリングされた請求項1~12のいずれか1項に記載の少なくとも1つのFc結合タンパク質を含んでいる前記アフィニティー分離マトリックスを準備する工程;(c)前記アフィニティー分離マトリックスと前記液体とを、前記請求項1~12のいずれか1項に記載の少なくとも1つのFc結合タンパク質がFc配列を含んでいるタンパク質に結合することを可能にする条件の下で接触させる工程;および(d)前記アフィニティー精製マトリックスから前記Fc配列を含んでいるタンパク質を溶出させる工程。
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