DE60121733T2 - Zusamensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Angiogenese in pathologischen Schädigungen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Läsionen pathologischer Angiogenese, insbesondere von Tumoren. Aspekte der vorliegenden Erfindung verwenden ein Konjugat oder eine Fusion aus Interleukin-2 (IL-2) und einem Antikörper, der gegen Fibronektin ED-B gerichtet ist, insbesondere mit dem Antikörper L19 (wie nachfolgend beschrieben ist).
  • Tumore können nicht über eine bestimmte Masse hinaus wachsen, ohne neue Blutgefäße zu bilden (Angiogenese), und bei einer Reihe von Tumoren wurde über einen Zusammenhang zwischen der Dichte von Mikroblutgefäßen und der Invasivität von Tumoren berichtet (1). Moleküle, die gezielt gegen Marker der Angiogenese gerichtet sind, schaffen klinische Möglichkeiten zur Diagnose und Behandlung von Tumoren und anderen Erkrankungen, die durch vaskuläre Proliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. rheumatoide Arthritis, diabetische Retinopathie und altersbedingte Makuladegeneration (2–8).
  • Die ED-B-Domäne von Fibronektin, eine Sequenz aus 91 Aminosäuren, die bei Mäusen, Ratten und Menschen identisch ist, und durch alternatives Splicing in das Fibronektinmolekül eingesetzt wird, sammelt sich speziell um neovaskuläre Strukturen herum an und dient als Angriffspunkt für eine molekulare Intervention (9–11). Die Möglichkeit eines In-vivo-Angriffs neovaskulärer Struktur mit einem humanen rekombinanten Antikörper (L19) gegen die ED-B-Domäne wurde bei verschiedenen Tumormodellen nachgewiesen (12, 13).
  • Die Vorbehandlung tumortragender Mäuse mit einem IL-2-Anti-Fibronektin-Antikörperkonjugat ergab eine vermehrte Aufnahme des Antikrebswirkstoffs TNT (Epstein et al (1995), Cancer Research, Band 55, S. 2673–2680).
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf den Versuchen des Erfinders, einen Antikörper zu verwenden, der in Konjugation mit Molekülen, die biozide oder zytotoxische Wirkung auf die Zielzellen haben, insbesondere Interleukin-2 (IL-2), gegen die ED-B-Domäne von Fibronektin gerichtet ist, die bei der Angiogenese in pathologischen Läsionen wie Tumoren vorkommt.
  • Interleukin-2 (IL-2), ein Zytokin aus vier α-Helixbündeln, das von T-Helfer-1-Zellen produziert wird, spielt in den Aktivierungsphasen sowohl spezifischer als auch natürlicher Immunreaktionen (14) eine wesentliche Rolle. IL-2 unterstützt die Proliferation und die Differenzierung aktivierter T- und B-Lymphozyten und natürlicher Killerzellen (NK) und induziert die Aktivität der zytotoxischen T-Zellen (CTL) und die Antitumorzytotoxität von NK-Zellen/Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK). IL-2 wurde in immuntherapeutischen Ansätzen bei verschiedenen Tumoren beim Menschen (15) angewandt. Die Verabreichung von rekombinantem IL-2 (rIL2) allein oder in Kombination mit adoptiv übertragenen lymphoiden Zellen führte sowohl bei Tiermodellen und auch bei Patienten zur Regression etablierter Tumore. Dennoch ist seine therapeutische Wirkung in vivo begrenzt, da es schnell wieder abgebaut wird und weil es bei hohen Dosen stark toxisch ist, vor allem in Verbindung mit dem Vascular-Leak-Syndrom (16). Die Abgabe von IL-2 an die Stelle des Tumors mittels eines Antikörpers, der gegen einen Tumormarker auf der Zelloberfläche gerichtet ist, kann aktive lokale IL-2-Konzentrationen sowie die Verringerung der Toxizität im Zusammenhang mit systemischer Verabreichung (17) ermöglichen.
  • Die vorliegende Erfindung weicht auf neuartige und nicht offensichtliche Weise vom oben beschriebenen Stand der Technik ab, indem IL-2 mit einem Antikörper verbunden wird, der gegen Fibronektin ED-B gerichtet ist. Wie erwähnt, wurde nach bisherigem Stand der Technik versucht, IL-2 bei der Behandlung von Tumoren zu verwenden und mit einem Antikörper abzugeben, wobei der Antikörper auf den Tumormarker einer Zelloberfläche abzielt. Jedoch sind Tumorzellen hinsichtlich der Expression von Tumormarkern auf der Zelloberfläche stark heterogen und können während der Therapien herunter reguliert sein.
  • Die Gegenwart von IL-2, das auf einer Tumorzellenoberfläche gebunden ist, führt zur Aktivierung und/oder zum Abgreifen von Effektorzellen des Immunsystems, d. h. entweder der zytotoxischen CD8+-T-Zellen oder der natürlichen Killerzellen (NK), und zu einer wirksamen Antitumor-Immunreaktion. T- oder NK-Zellen empfangen ein Signal über (einen) Rezeptor(en) (zum Beispiel den T-Zellrezeptor auf T-Zellen), der speziell entsprechende Liganden an der Oberfläche der Tumorzelle erkennt, und ein zweites Signal über eine IL-2-Rezeptorenkette von IL-2, die sich ebenfalls an der Oberfläche der Tumorzelle befindet (Lode et al., 1999, PNAS USA, 96: 8591–8596 und die darin enthaltenen Bezugsverweise).
  • Im Unterschied dazu haben die Erfinder bei den Versuchen, die nachfolgend ausführlicher beschrieben sind, in Zellen von Säugetieren ein Antikörper-IL2-Fusionsprotein konstruiert und exprimiert, wobei der Antikörper (L19, dessen Sequenz in Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769–21776 beschrieben ist) gegen einen Bestandteil der extrazellulären Matrix gerichtet ist, der bei der Angiogenese in pathologischen Läsionen (insbesondere Fibronektin ED-B) vorhanden ist. In-vivo-Versuche zur Bioverteilung in Mäusen mit Tumoren zeigten, dass sich das Fusionsprotein um die sich neu bildenden Tumorblutgefäße ansammelte. Das Fusionsprotein wurde in therapeutischen Versuchen bei Tieren mit Tumoren getestet und es stellte sich überraschenderweise heraus, dass es einen Antitumoreffekt auslöst und dass es bei der Reduzierung des Tumorwachstums bedeutend aktiver ist als eine äquimolare Mischung aus L19 und IL-2.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt eine schematische Darstellung des scFv-L19-IL2-cDNA-Konstruktes. scFv-L19 und IL2-cDNA sind mit einem DNA-Linker (—) genetisch gekoppelt, der 15 Aminosäuren (SSSSG)3 kodiert, und in den pcDNA3-Säugetierexpressionsvektor unter Anwendung der Restriktionsschnittstellen HindIII und BamHI kloniert wurde. Das schraffierte Kästchen stellt die CMV-Promotersequenz dar, das ausgefüllte Kästchen die genomische Sequenz des Leaderpeptids als Sekretionssignal(— Intron innerhalb der genomischen Sequenz) und die weißen Kästchen das VH- oder VL-Segment der scFV-L19- und IL2-Sequenz. T7, BC666, BC679 und BC695 sind Primer, die zur PCR-Amplifikation verwendet werden, die im Abschnitt Material und Verfahren beschrieben sind.
  • 2 zeigt die biologische Aktivität des IL2-Anteils des Fusionsproteins (°) und von IL2 in einer Mischung aus äquimolaren Konzentrationen von L19 und IL2 (•), gemessen anhand der CTLL-Zellproliferation.
  • 3 zeigt die Ergebnisse einer Bioverteilungsanalyse, durchgeführt bei Mäusen mit einem subkutan implantierten murinen F9-Teratokarzinom, in das ionenbestrahltes scFv(L19)-TF intravenös injiziert wurde.
  • Der Bezugsverweis hierin zum bioziden oder zytotoxischen Molekül bezieht sich auf Interleukin 2. Die vorliegende Erfindung ist Gegenstand der Ansprüche.
  • Ein in der Erfindung verwendetes Konjugat umfasst vorzugsweise ein Fusionsprotein, welches das biozide oder zytotoxische Molekül und das spezifische Bindungselement umfasst, oder, wenn das spezifische Bindungselement aus zwei Ketten oder mehreren Ketten besteht, ein Fusionsprotein, welches das biozide oder zytotoxische Molekül und eine Polypeptidketten-Komponente des spezifischen Bindungselements umfasst.
  • Vorzugsweise besteht das spezifische Bindungselement aus einem Einzelketten-Polypeptid, z. B. einem Einzelketten-Antikörper-Molekül wie scFv. Folglich stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Fusionsprotein bereit, welches das biozide oder zytotoxische Molekül und ein für Fibronektin ED-B spezifisches Einzelketten-Fv-Antikörper-Molekül umfasst.
  • Wie weiter unten erklärt, ist das spezifische Bindungselement vorzugsweise ein Antikörper oder umfasst eine Antigen-Antikörper-Bindungsstelle. Praktischerweise kann das spezifische Bindungselement ein Einzelketten-Polypeptid sein, beispielsweise ein Einzelketten-Antikörper. Dies erlaubt die praktische Herstellung eines Fusionsproteins, das einen Einzelketten-Antikörper und das biozide oder zytotoxische Molekül, d. h. Interleukin-2, umfasst. In anderen Ausführungsformen wird die Antigen-Antikörper-Bindungsstelle mittels der Verbindung einer Antikörper-VH-Domäne und einer Antikörper-VL-Domäne in getrennten Polypeptiden bereitgestellt, zum Beispiel in einem vollständigen Antikörper oder in einem Antikörperfragment wie Fab oder Diabody. Handelt es sich bei dem spezifischen Bindungselement um ein Molekül mit zwei oder mehreren Ketten (z. B. jeweils Fab oder Gesamtantikörper), kann das biozide oder zytotoxische Molekül als ein Fusionspolypeptid mit einer oder mehreren Polypeptidketten in dem spezifischen Bindungselement konjugiert werden.
  • Eine Antigen-Antikörper-Bindungsstelle, die in einem spezifischen Bindungselement gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann die VH- und/oder VL-Domänen des Antikörpers L19 oder eines Antikörpers enthalten, der mit L19 um die Bindung mit ED-B konkurriert. Die Sequenzen der L19-VH- und L19-VL-Domänen sind in Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769–21776 beschrieben.
  • Andere nicht antikörperspezifische Bindungselemente, die mit IL-2 konjugiert werden können und entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet werden, enthalten Peptide, Aptamere und kleine organische Moleküle, die in der Lage sind, mit einem Bestandteil von ECM zusammenzuwirken, der mit pathologischen Läsionen im Zusammenhang steht.
  • Wie erwähnt, ist das spezifische Bindungselement vorzugsweise mit dem bioziden oder zytotoxischen Molekül mittels einer Peptidbindung konjugiert, das heißt, innerhalb eines Fusionspolypeptids, welches das Molekül und das spezifische Bindungselement oder einen Bestandteil der Polypeptidkette daraus umfasst. Siehe Taniguchi et al. (1983) Nature 302, 305–310; Maeda et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 115: 1040–1047; Devos et al ((1983) Nucl. Acids Res. 11: 4307–4323 zur Information über die IL-2-Sequenz, die zur Herstellung eines Fusion-Polypeptids, das IL-2 umfasst, hilfreich ist. Andere Mittel der Konjugation umfassen chemische Konjugation, speziell Vernetzung mit einem bifunktionellen Reagens (z. B. Anwendung des ADOUBLE-REAGENTSTM Cross-linking Reagents Selection Guide, Pierce).
  • Die behandelte Läsion kann des Weiteren ein Tumor sein, der ohne Einschränkung die Folgenden oder andere einschließt: Melanom, Neuroblastom, Kolorektalkarzinom, Nierenkarzinom, Lungenkarzinom, Lungenmetastasen, Brustkarzinom, fortgeschrittenes Astrozytom (Grad III, Grad IV), Meningiom, Angiom.
  • Die Läsionen können Okular sein, z. B. können sie aufgrund altersbedingter Makuladegeneration auftreten, die bei der Angiogenese in den choroidalen Gefäßen entsteht.
  • Spezifisches Bindungselement
  • Dieser Begriff beschreibt ein Element eines Paars von Molekülen, die für einander Bindungsspezifität aufweisen. Die Elemente eines spezifischen Bindungspaares können natürlich abgeleitet oder vollständig oder teilweise künstlich hergestellt werden. Ein Element des Molekülpaars hat einen Bereich auf seiner Oberfläche oder eine Aushöhlung, die spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation des anderen Elementes des Molekülpaares bindet und daher dazu komplementär ist. Folglich haben die Elemente des Paares die Eigenschaft, spezifisch aneinander zu binden.
  • Antikörper
  • Dieser Begriff beschreibt ein Immunglobulin, das entweder natürlich oder teilweise oder vollständig künstlich hergestellt ist. Der Begriff bezieht jedes Polypeptid oder Protein mit einer Bindungsdomäne mit ein, die zu einer Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne homolog oder im Wesentlichen homolog ist. Diese können aus natürlichen Quellen abgeleitet sein oder sie können teilweise oder vollständig künstlich hergestellt sein. Beispiele für Antikörper sind die Immunglobulin-Isotypen und deren isotypische Subklassen; Fragmente, die eine Antigenbindungsdomäne umfassen, wie Fab, scFv, Fv, dAb, Fd und Diabodies.
  • Es ist möglich, anhand monoklonaler und anderer Antikörper Techniken der DNA-Rekombinationstechnologie anzuwenden, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle herzustellen, welche die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Solche Techniken können das Einführen von DNA einschließen, die den variablen Immunglobulinbereich oder die hypervariablen Bereiche (CDR) eines Antikörpers gegen den konstanten Bereich oder konstante Bereiche plus Rahmenbereiche eines anderen Immunglobulins kodiert. Siehe, als Beispiel, EP-A-184187, GB 2188638 A oder EP-A-239400. Ein Hybridom oder eine andere Zelle, die einen Antikörper produziert, kann genetischer Mutation oder anderen Veränderungen unterworfen sein, die eventuell die Bindungsspezifität der produzierten Antikörper verändern können.
  • Da Antikörper auf vielfältige Weise verändert werden können, soll der Begriff „Antikörper" so ausgelegt werden, dass jedes spezifische Bindungselement mit einer Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität mit einbezogen wird. Folglich bezieht dieser Begriff Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Antikörperhomologe mit ein, einschließlich aller Polypeptide, die eine natürliche oder vollständig künstliche oder teilweise künstliche Immunglobulinbindungsdomäne umfassen. Chimäre Moleküle, umfassend eine Immunglobulinbindungsdomäne oder ein Äquivalent und fusioniert mit einem weiteren Polypeptid, sind daher ebenfalls eingeschlossen. Klonieren und Exprimieren chimärer Antikörper sind in EP-A-0120694 und EP-A-0125023 beschrieben.
  • Es hat sich erwiesen, dass Fragmente eines Gesamtantikörpers die Funktion bindender Antigene erfüllen können. Beispiele für Bindungsfragmente sind (i) das Fab-Fragment bestehend aus VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen; (ii) das Fd-Fragment bestehend aus den VH- und CH1-Domänen; (iii) das Fv-Fragment bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines Einzelantikörpers; (iv) das dAb-Fragment (Ward, E. S. et al., Nature 341, 544–546 (1989)), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) isolierte CDR-Bereiche; (vi) F(ab')2-Fragmente, ein bivalentes Fragment, das zwei miteinander verbundene Fab-Fragmente umfasst; (vii) Einzelketten-Fv-Moleküle (scFv), wobei eine VH-Domäne und eine VL-Domäne durch einen Peptidlinker miteinander verbunden sind, was den beiden Domänen erlaubt, gemeinsam eine Antigenbindungsstelle zu bilden (Bird et al, Science, 242, 423–426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879–5883, 1988); (viii) bispezifische Einzelketten-Fv-Dimere (PCT/US92/09965) und (ix) „Diabodies", multivalente oder multispezifische Fragmente, die durch Genfusion konstruiert werden (WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444–6448, 1993). Fv, scFv oder Diabody-Moleküle können durch Einbau von Disulfidbrücken, welche die VH- und VL-Domänen miteinander verbinden, stabilisiert werden (Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239–1245, 1996). Es können auch Minibodies hergestellt werden, die ein an die CH3-Domäne gekoppeltes scFv umfassen (S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055–3061, 1996).
  • Antigenbindende Domäne
  • Dieser Begriff beschreibt den Anteil eines Antikörpers, der den Bereich umfasst, der spezifisch an einen Teil eines Antigens oder an ein vollständiges Antigen bindet und dazu komplementär ist. Wenn ein Antigen groß ist, kann ein Antikörper eventuell nur an einen bestimmten Anteil des Antigens binden, wobei dieser Anteil Epitop genannt wird. Eine Antigenbindungsdomäne kann durch eine oder mehrere variable Antikörperdomänen (z. B. ein sogenanntes Fd-Antikörper-Fragment bestehend aus einer VH-Domäne) bereitgestellt werden. Vorzugsweise umfasst eine antigenbindende Domäne einen variablen Antikörper-Bereich mit einer leichten Kette (VL) und einen variablen Antikörper-Bereich mit einer schweren Kette (VH).
  • Spezifisch
  • Dieser Begriff wird verwendet, um den Bezug zu der Situation herzustellen, bei der ein Element eines spezifischen Bindungspaares keine wesentliche Bindung an Moleküle aufweist, bei denen es sich nicht um seine(n) spezifischen Bindungspartner handelt. Der Begriff kann auch angewandt werden, wenn beispielsweise eine antigenbindende Domäne für ein bestimmtes Epitop, das in vielen Antigenen vorhanden ist, spezifisch ist. In diesem Fall kann das spezifische Bindungselement, das die antigenbindende Domäne trägt, an die verschiedenen Antigene mit dem Epitop binden.
  • Umfassen
  • Dieser Begriff wird im Allgemeinen im Sinne von einschließen verwendet, das heißt, um die Gegenwart eines oder mehrerer Merkmale oder Bestandteile zuzulassen.
  • Isoliert
  • Dieser Begriff bezieht sich auf den Zustand, bei dem spezifische Bindungselemente der Erfindung oder eine Nukleinsäure, die solche Bindungselemente kodiert, im Allgemeinen entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Elemente und die Nukleinsäure sind frei oder im Wesentlichen frei von Stoffen, mit denen sie in natürlicher Weise verbunden sind, beispielsweise andere Polypeptide oder Nukleinsäuren, mit denen sie in ihrem natürlichen Umfeld vorkommen, oder in der Umgebung, in der sie hergestellt werden (z. B. Zellkulturen), wenn eine solche Herstellung in vitro oder in vivo durch DNA-Rekombinationstechnologie erfolgt. Elemente und Nukleinsäure können mit Verdünnungsmitteln oder Adjuvanzien formuliert werden und dennoch zu praktischen Zwecken isoliert werden – zum Beispiel werden die Elemente für das Beschichten von Mikrotiterplatten, die in Immunassays zur Anwendung kommen, normalerweise mit Gelatine oder anderen Trägerstoffen gemischt oder sie werden beim Verwenden zur Diagnose oder Behandlung mit pharmazeutisch einwandfreien Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln gemischt. Spezifische Bindungselemente können glykosyliert sein, entweder natürlich oder durch Systeme aus heterologen eukaryotischen Zellen (z. B. CHO- oder NSO-Zellen (ECACC 85110503)) oder sie können nicht glykosyliert sein (zum Beispiel, wenn sie durch Expression in einer prokaryotischen Zelle gewonnen werden).
  • Wie erwähnt, muss in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eine Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne, die gegen Fibronektin ED-B gerichtet ist, angewandt werden, und eine solche bevorzugte Domäne umfasst die VH- und VL-Domänen des Antikörpers L19. In anderen Ausführungsformen können modifizierte Formen von einer oder von anderen dieser Domänen können angewandt werden, z. B. die L19-VH- oder die L19-VL-Domäne, in welcher 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuresubstitutionen in einer CDR erzeugt wurden, z. B. CDR3 und/oder FR, wobei die spezifischen Bindungselemente die Fähigkeit zur Bindung von Fibronektin ED-B behalten. Solche Aminosäuresubstitutionen sind im Allgemeinen „konservativ", zum Beispiel die Substitution eines hydrophoben Restes wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen oder die Substitution eines polaren Restes, wie Arginin durch Lysin, von Glutaminsäure durch Asparaginsäure oder von Glutamin durch Asparagin. An bestimmten Stellen sind nicht konservative Substitutionen erlaubt.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich weiter auf das Verwenden eines spezifischen Bindungselements, das mit dem Antikörper L19 um die Bindung an Fibronektin ED-B konkurriert. Die Konkurrenz zwischen Bindungselementen kann einfach in vivo geprüft werden, zum Beispiel durch das Anheften eines spezifischen Reportermoleküls an ein Bindungselement, das in Gegenwart eines anderen nicht identifizierten Bindungselements oder anderer nicht identifizierter Bindungselemente erkannt werden kann, um das Identifizieren spezifischer Bindungselemente, die an dasselbe Epitop oder ein überlappendes Epitop binden, zu ermöglichen.
  • Zusätzlich zu Antikörper-Sequenzen kann ein spezifisches Bindungselement, das entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet wird, andere Aminosäuren umfassen, wobei z. B. ein Peptid oder Polypeptid gebildet wird, beispielsweise eine Faltungsdomäne, oder um dem Molekül außer der Fähigkeit zur Antigenbindung andere funktionelle Eigenschaften zu verleihen. Spezifische Bindungselemente der Erfindung können einen nachweisbaren Marker tragen.
  • Spezifische Bindungselemente in einem Konjugat entsprechend der Erfindung können bei einem Verfahren zur Behandlung des Körpers von Menschen und Tieren verwendet werden, beispielsweise als ein Verfahren zur Behandlung (welches die vorbeugende Behandlung einschließen kann) einer Erkrankung oder einer Störung in einem menschlichen Patienten, die eine Verabreichung einer wirksamen Menge des Konjugats an den Patienten umfasst. Die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung behandelbaren Zustände sind an anderer Stelle hierin erläutert.
  • Entsprechend betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung, welche die Verabreichung eines bereitgestellten spezifischen Bindungselements, pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein solches spezifisches Bindungselement umfassen, und die Verwendung eines solchen spezifischen Bindungselements bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung umfassen, zum Beispiel bei einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die das Formulieren des spezifischen Bindungselements mit einem pharmazeutisch annehmbaren Arzneistoffträger umfasst.
  • Die bereitgestellten Zusammensetzungen können Individuen verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in „therapeutisch wirksamer Menge", und ist ausreichend, um dem Patienten zu nützen. Dieser Nutzen kann mindestens die Besserung mindestens eines Symptoms sein. Die tatsächlich verabreichte Menge und die Häufigkeit und der Zeitverlauf der Verabreichung hängen von der Art und Schwere der zu behandelnden Krankheit ab. Die Verschreibung einer Behandlung, z. B. Entscheidungen bezüglich Dosierung usw., liegt in der Verantwortung des Allgemeinarztes und anderer Ärzte. Angemessene Dosen von Antikörpern sind im Stand der Technik bestens bekannt; siehe Ledermann J. A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659–664; Bagshawe K. D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915–922.
  • Eine Zusammensetzung kann allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen verabreicht werden, entweder gleichzeitig oder nacheinander, was von den zu behandelnden Zuständen abhängt.
  • Spezifische Bindungselemente der vorliegenden Erfindung, einschließlich solchen, die eine Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne umfassen, können einem Patienten, der eine Behandlung benötigt, auf jedem geeigneten Weg verabreicht werden, üblicherweise durch Injektion in die Blutbahn und/oder direkt in die zu behandelnde Stelle, z. B. in den Tumor. Die genaue Dosis hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, von der Behandlungsart, der Größe und Lage des zu behandelnden Bereichs (z. B. Tumor), von der genauen Art des Antikörpers (z. B. Gesamtantikörper, scFv-Molekül) und von der Art eines nachweisbaren Markers oder anderer an den Antikörper gekoppelter Moleküle. Eine übliche Antikörperdosis liegt im Bereich von 10–50 mg. Das entspricht einer Dosis für eine einmalige Behandlung eines erwachsenen Patienten, die für Kinder und Säuglinge verhältnismäßig angepasst werden kann und die auch für andere Antikörperformate im Verhältnis zum molekularen Gewicht angepasst werden kann. Die Behandlungen können in täglichen, zweimal wöchentlichen, wöchentlichen oder monatlichen Zeitabständen wiederholt werden, je nach Ermessen des Arztes.
  • Spezifische Bindungselemente der vorliegenden Erfindung werden gewöhnlich in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, die mindestens einen Bestandteil zusätzlich zum spezifischen Bindungselement umfasst.
  • Demnach können pharmazeutische Zusammensetzungen zur Anwendung entsprechend der vorliegenden Erfindung außer dem Wirkstoff einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneistoffträger, Trägerstoff, Puffer, Stabilisator oder andere Stoffe umfassen, die einem Fachmann bestens bekannt sind. Derartige Stoffe sollten nicht toxisch sein und sollten keine Auswirkung auf die Wirksamkeit des Wirkstoffes haben. Die genaue Art des Trägerstoffes oder eines anderen Stoffes hängt von der Art der Verabreichung ab, die oral oder mittels Injektion, z. B. intravenös, sein kann.
  • Für die intravenöse Injektion oder die Injektion an der betroffenen Stelle hat der Wirkstoff die Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung, die pyrogenfrei ist und einen geeigneten pH-Wert, geeignete Isotonizität und geeignete Stabilität aufweist. Fachleute auf diesem Gebiet sind bestens in der Lage, geeignete Lösungen herzustellen, wobei zum Beispiel isotone Vehikel wie beispielsweise Injektion von Natriumchlorid, Ringer-Lösung oder Ringer-Laktat verwendet wird. Je nach Bedarf können Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidanzien und/oder andere Zusatzstoffe enthalten sein.
  • Je nach dem zu behandelnden Zustand kann eine Zusammensetzung allein oder gleichzeitig oder nacheinander in Kombination mit anderen Behandlungen verabreicht werden. Andere Behandlungen können die Verabreichung geeigneter Dosen an Schmerzmittel beinhalten, wie z. B. nicht steroidale entzündungshemmende Arzneimittel (z. B. Aspirin, Paracetamol, Ibuprofen oder Ketoprofen) oder Opiate wie Morphin oder Antiemetika.
  • Weitere Gesichtspunkte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind für Fachleute anhand der vorliegenden Beschreibung offensichtlich. Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung sind im Folgenden experimentellen Abschnitt dargestellt.
  • EXPERIMENTE
  • BEISPIEL 1
  • KONSTRUKTION UND IN-VIVO ANTI-Tumor-AKTIVITÄT EINER ANTIKÖRPER-IL2-FUSION
  • MATERIAL UND VERFAHREN
  • Konstruktion und Expression eines L19-IL2-Fusionsproteins
  • Die L19-IL2-cDNA wurde durch Fusion einer synthetischen Sequenz, die für humanes IL2 kodiert, an das 3'-Ende der Sequenz, die für scFv-L19 kodiert, konstruiert. Die schematische Darstellung des L19-IL2-cDNA-Konstrukts ist in 1 gezeigt. IL2-cDNA wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, wobei die Primer BC-666 und BC695 sowie IL2-cDNA, die durch Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) mit RNA von humanen Phytohämagglutinin(PHA)-aktivierten peripheren Blutlymphozyten als Ausgangsmaterial, wie von Meazza et al. 1996 (18) beschrieben wurde, hergestellt wurde, als Vorlage verwendet wurden.
  • Der Vorwärts-Primer BC666 (Sequenz: ctcgaattctcttcctcatcgggtagtagctcttccggctcatcgtccagcggcgcacctacttcaagttctaca) enthielt die Restriktionsenzym-Sequenz EcoRI, ein 45-bp-Segment, das einen Linker aus 15 Aminosäuren (Ser4-Gly)3 kodiert, und 21 Basen der Sequenz des reifen humanen IL2.
  • Der Rückwärts-Primer BC-695 (Sequenz: ctcggatccttatcaattcagatcctcttctgagatgagtttttgttcagtcagtgttgagatgatgct) enthielt die myc-Sequenz (13), zwei Stopp-Kodons und die Schnittstellensequenz des Restriktionsenzyms BamHI.
  • Das scFvL19, das an seinem 5'-Ende die genomische Sequenz des Leaderpeptids als Sekretionssignal enthält, wie von Li et al. 1997 (19) berichtet wurde, wurde unter Verwendung des T7-Primers im Vektor pcDNA3.1 (Invitrogen, Cronigen, Niederlande) und des Primers BC 679 (Sequenz: CTCGAATTCtttgatttccaccttggtccc), der 21 bp des 3'-Endes von L19 und die Restriktionsenzym-Schnittstellensequenz EcoRI enthielt, durch PCR amplifiziert. Das fusionierte Gen wurde sequenziert, in den Vektor pcDNA3.1, der den Zytomegalovirus (ZMV)-Promoter enthielt, eingeführt und in P3U1-Zellen in Gegenwart von G418 (750 μg/ml, Calbiochem, San Diego, CA) exprimiert. Klone von G418-resistenten Zellen wurden für die Sekretion des Fusionsproteins L19-IL2 durch einen ELISA unter Verwendung der rekombinanten ED-B-Domäne von humanem Fibronektin (FN) als Antigen getestet.
  • FN-rekombinante Fragmente, ELISA-Immunassay und Reinigung des L19-IL2-Fusionsproteins
  • Wie von Carnemolla et al. 1996 (20) beschrieben, wurden rekombinante FN-Fragmente, welche die Typ-III-Homologie-Wiederholungen (Homology Repeats) 7B89 und ED-B enthielten, hergestellt. Der ELISA-Immunassay wurde durchgeführt, wie von Carnemolla et al. 1996 (20) berichtet wurde. Das L19-IL2-Fusionsprotein wurde aus dem konditionierten Medium eines positiven Klons anhand des mit Sepharose konjugierten, rekombinanten Fragmentes 7B89 des humanen Fibronektins durch Affinitätschromatographie gereinigt, wie von Carnemolla et al. 1996 (20) berichtet wurde. Die Größe des Fusionsproteins wurde unter reduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE und im nativen Zustand mittels FPLC-Gelfiltration auf einer Gelfiltrationssäule Superdex S-200 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) analysiert.
  • IL2-Bioassay
  • Die IL2-Aktivität des L19-IL2-Fusionsproteins wurde anhand der Mauszelllinie CTLL festgelegt, die, wie von Meazza et al. 1996 (18) beschrieben, bekannterweise als Reaktion auf humanes IL2 proliferiert. Im CTLL-2-Proliferationsassay wurden serielle Verdünnungen des L19-IL2-Fusionsproteins und eine äquimolare Mischung aus L19 und rekombinantem humanem IL2 (Proleukin, Chiron) in Konzentrationen von 1000 bis 0,01 ng/ml verwendet.
  • Tiere und Zelllinien
  • Weibliche athymische Nacktmäuse (8 Wochen alte CD1-Nu/Nu-Mäuse, weiblich) wurden von Harlan Italy (Correzzana, Mailand, Italien) bezogen. F9, ein Karzinom aus Mausembryonen, Maus-T-Zellen (CTLL-2) und Mausmyelomzellen wurden von ATCC (American Type Culture Collection, Rockvill, MD, USA) erworben; N592, eine Zelllinien aus einem humanen kleinzelligen Bronchialkarzinom (SCLC) wurde freundlicherweise von Dr. J. D. Minna (National Cancer Institute and Naval Hospital, Bethesda, Maryland, USA) bereitgestellt; C51, eine Kolon-Adenokarzinom-Zelllinie aus BALB/c-Mäusen, wurde freundlicherweise von Dr. M. P. Colombo (21) bereitgestellt.
  • Bioverteilung des L19-IL2-Fusionsproteins
  • Gereinigtes L19-IL-2 wurde mit radioaktivem Jod125 unter Anwendung des Iodogenverfahrens (22) bestrahlt (Pierce, Rockford, IL, USA). Das immunreaktive radioaktiv markierte L19-IL-2 (mehr als 90%) wurde auf einer 7B89/Sepharose-Chromatographiesäule affinitätsgereinigt. Nacktmäuse mit subkutan implantiertem F9-Maus-Teratokarzinom (20, 23) erhielten eine intravenöse Injektion von etwa 10 μg (4 μCi) Protein in 100 μl Salzlösung. Für jeden Zeitpunkt wurden drei Tiere verwendet. Die Mäuse wurden 3, 6 und 24 Stunden nach der Injektion getötet. Die Organe wurden gewogen und die Radioaktivität wurde gemessen. Alle Organe und Tumore wurden für die histologischen Untersuchung und Mikroautoradiographie in Fixierungsmittel gelegt. Die Zielergebnisse repräsentativer Organe sind in Prozent der injizierten Dosis je Gramm Gewebe ausgedrückt (% ID/g).
  • In-vivo-Behandlung mit L19-IL2-Fusionsprotein
  • Die Behandlung mit dem gereinigten L19-IL2-Fusionsprotein wurde mit Gruppen von je sechs Mäusen durchgeführt, die jeweils 20 × 106 N592- oder 106 C51- oder 3 × 106 F9-Zellen subkutan injiziert erhielten. Vierundzwanzig Stunden nach der Injektion der N592-, F9- und C51-Zellen wurden 10–15 Tage lang täglich 12 μg des Fusionsproteins L19-IL2 in die Schwanzvene jedes Tieres injiziert. Gleiche Gruppen mit Tieren (sechs je Gruppe) erhielten über gleich viel Tage eine Mischung aus L19 (8 μg) und rekombinantem humanem IL2 (4 μg, entsprechend 72.000 IE; Proleukin, 18 × 106 IE, Chiron) und PBS-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung pH 7,4 per Injektion. Am Ende der Behandlung wurden die Tiere getötet, die Tumore gewogen und die Organe (Lunge, Leber, Herz, Nieren) und Tumore wurden für die histologische Untersuchung in Fixierungsmittel gelegt.
  • Auswertung der Mikroautoradiographie, Immunhistochemie und statistische Auswertung
  • Tumor- und Organ-Präparate wurden für die Mikroautoradiographie verarbeitet, um das Verteilungsmuster des 125I-L19-IL2-Fusionsproteins bestimmen zu können, wie von Tarli et al. 1999 (12) beschrieben wurde. Immunhistochemische Verfahren wurden wie von Castellani et al. 1994 (11) berichtet durchgeführt. Anhand des nicht parametrischen Mann-Whitney-Tests wurden die Unterschiede der Tumorgewichte zwischen den drei verschiedenen Tiergruppen (Mäuse, die mit dem L19-IL2-Fusionsprotein, mit einer Mischung aus L19 + IL2 und mit PBS behandelt wurden) bestimmt.
  • ERGEBNISSE
  • L19-IL2-Konstrukt und die Auswahl von Klonen, die das L19-IL2-Fusionsprotein exprimieren
  • G418-resistente Klone wurden, wie oben beschrieben, auf Antikörperspezifität der Überstände für die ED-B-Sequenz mittels ELISA getestet. Überstände von Klonen mit immunologischer Spezifität für die ED-B-Sequenz wurden auf biologische IL2-Aktivität getestet.
  • Das Fusionsprotein scFv L19 und das Fusionsprotein L19-IL2 wurden im SDS-PAGE aufgetrennt. L19-IL2 wird in einem einzigen Arbeitsgang affinitätschromatographisch gereinigt, Verunreinigungen unter 10% waren durch SDS-PAGE nachweisbar. Das Fusionsprotein zeigte eine scheinbare molekulare Masse von etwa 42 Kd, was der erwarteten Größe des Fusionsproteins entsprach. Die FPLC-Analyse des Fusionsproteins auf einer S200-Superdex-Chromatographiesäule (Pharmacia) zeigte, dass das Protein im nativen Zustand zu etwa 70% aus Dimeren und zu 30% aus Monomeren zusammengesetzt ist, wie zuvor bei scFv L19 beobachtet wurde. Es wurde sowohl die immunologische Aktivität des scFvL19-Bestandteils als auch die biologische Aktivität des IL-2-Bestandteils in dem aufgereinigten Protein getestet (3). Beide spezifischen Aktivitäten waren vergleichbar mit gereinigten aufgetrennten Molekülen.
  • Bioverteilung von radioaktiv bestrahltem L19-IL2-Fusionsprotein in tumortragenden Mäusen
  • Um zu untersuchen, ob eine effiziente Lokalisation des L19-IL2-Fusionsproteins in Tumorgefäßen stattfinden konnte, wie von Tarli et al. 1999 (12) für scFv L19 berichtet wurde, wurden in Mäusen mit dem F9-Teratokarzinom Versuche zur Bioverteilung durchgeführt.
  • Immunhistochemisch wurde gezeigt, dass das L19-IL2-Fusionsprotein Blutgefäße des Glioblastoms stark anfärbte. Mit radioaktivem Iod markiertes L19-IL2-Fusionsprotein wurde in die Schwanzvene von Mäusen mit subkutan implantierten F9-Tumoren injiziert und die Verteilung des L19-IL2-Fusionsproteins wurde zu verschiedenen Zeitpunkten erhalten: nach 3, 6 und 24 Stunden. Vierzehn Prozent der injizierten Dosis je Gramm Gewebe (% ID/g) waren 3 Stunden nach der Injektion im Tumor lokalisiert, wie in Tabelle 1 angegeben ist. Die Lokalisierung des L19-IL2-Fusionsproteins in der Neovaskulatur des Tumors wurde durch mikroradiographische Analyse bestätigt.
  • Ansammlung des radioaktiv markierten Fusionsproteins wurde in den Blutgefäßen von Mäusen mit F9-Tumor nachgewiesen. Es wurde keine Ansammlung des radioaktiv markierten Fusionsproteins in den Gefäßen der Leber oder anderer Organe der tumortragenden Mäuse festgestellt.
  • Behandlung von tumortragenden Mäusen mit dem L19-IL2-Fusionsprotein
  • Die Wirksamkeit des L19-IL2-Fusionsproteins zur Unterdrückung des Tumorwachstums, wurde in drei verschiedenen experimentellen Tumormodellen getestet: F9-Teratokarzinom der Maus; Mausadenokarzinom, C51 und humanes kleinzelliges Bronchialkarzinom, N592. Zur Tumorinduktion wurden Zellen des jeweiligen Tumortyps (spezifisch 20 × 106 für N592, 106 für C51 und 3 × 106 für F9) subkutan in die Tiere injiziert. Vierundzwanzig Stunden später erhielten die Tiere 10–15 Tage lang täglich intravenöse Injektionen mit entweder PBS (6 Tiere), einer Mischung aus L19 und IL2 (6 Tiere) oder des L19-IL2-Fusionsproteins (6 Tiere). Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Injektion wurden die Tiere getötet, die Tumormasse wurde entfernt und die Tumore gewogen.
  • Die in Tabelle 2 zusammengefassten Ergebnisse zeigen eine signifikante Verringerung des Tumorwachstums in der Gruppe der Tiere, die mit dem L19-IL2-Fusionsprotein behandelt wurden, sowohl in Bezug auf die Tiere, die mit einer äquimolaren Mischung aus L19- und IL2-Proteinen injiziert wurden als auch auf die dritte Gruppe, die mit PBS behandelt wurde.
  • Die F9-Teratokarzinome wurden nach einer 11-tägigen intravenösen Behandlung aus Nacktmäusen entfernt. In der mit dem L19-IL2-Fusionsprotein behandelten Gruppe wuchs die Tumormasse nur bei drei von sechs Mäusen. Um die statistische Signifikanz der Unterschiede der Tumorgewichte zwischen den drei Tiergruppen zu bestimmen, wurde der nicht parametrische Mann-Whitney-Test angewandt. Die Unterschiede der Tumorgewichte zwischen der Behandlung mit dem Fusionsprotein (L19-IL2), der Behandlung mit PBS oder einer Mischung (L19 + IL2) waren statistisch signifikant (siehe Tabelle 3).
  • BEZUGSVERWEISE
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  • Figure 00230001
  • Tabelle 2. Auswirkung des L19-IL2-Fusionsproteins auf das Tumorwachstum
    Figure 00240001
  • Die berichteten Werte stellen das durchschnittliche Tumorgewicht (g) ± Standardabweichung dar; für jeden Versuch wurden Gruppen mit sechs Mäusen verwendet.
    • 1 Tumormasse wuchs nur in 4 von 6 Mäusen.
    • 2 Tumormasse wuchs nur in 3 von 6 Mäusen.
    • * Unterschiede bei den Tumorgewichten zwischen der Behandlung mit Fusionsprotein (L19-IL2) und PBS oder der Mischung (L19 + IL2) waren bei den Kontrollgruppen statistisch signifikant (P < 0,01)
  • Tabelle 3: Statistischer Vergleich (p-Werte) zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen in drei Tumorarten
    Figure 00250001
  • TABELLE 4 PRIMER-SEQUENZEN 2) flagfoNotPicz2
    Figure 00260001
  • 3) XbaIL19fo
    Figure 00260002
  • 4) IfnXbaba
    Figure 00260003
  • 5) Ifnflagfo1
    Figure 00260004
  • 6) IFNBamba
    Figure 00260005
  • 7) IFNEcoba
    Figure 00260006
  • 8) IFNEcofo
    Figure 00260007
  • 9) SeqPicback
    Figure 00260008
  • 10) SeqPicfor
    Figure 00260009

Claims (13)

  1. Konjugat (i) eines spezifischen Bindungselementes, das für Fibronektin ED-B spezifisch ist, und (ii) Interleukin-2 (IL-2) für die Verwendung in einem therapeutischen Verfahren der Behandlung des Körpers von Menschen oder Tieren.
  2. Konjugat nach Anspruch 1 für die Verwendung in einem Verfahren der Behandlung eines Tumors.
  3. Konjugat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Bindungselement eine oder mehrere VH- und/oder VL-Domänen von Antikörper L19 umfasst und/oder mit Antikörper L19 um die Bindung an Fibronektin ED-B konkurriert, wobei die Aminosäuresequenzen der VH- und VL-Domänen von Antikörper L19 in Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769–21776 beschrieben sind.
  4. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das spezifische Bindungselement eine Einzelkette ist.
  5. Konjugat nach Anspruch 4, welches ein Fusionsprotein (a) des spezifischen Bindungselementes und (b) Interleukin-2 umfasst.
  6. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das spezifische Bindungselement aus mehreren Ketten besteht.
  7. Konjugat nach Anspruch 6, das (a) ein Fusionsprotein einer ersten Kette des spezifischen Bindungselementes und Interleukin-2 und (b) eine zweite Kette des spezifischen Bindungselementes umfasst.
  8. Verwendung eines Konjugates (i) eines spezifischen Bindungselementes, das für Fibronektin ED-B spezifisch ist, und (ii) Interleukin-2 (IL-2) bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung eines Tumors.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Bindungselement eine oder mehrere VH- und/oder VL-Domänen von Antikörper L19 umfasst und/oder mit Antikörper L19 um die Bindung an Fibronektin ED-B konkurriert, wobei die Aminosäuresequenzen der VH- und VL-Domänen von Antikörper L19 in Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769–21776 beschrieben sind.
  10. Verwendung nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei das spezifische Bindungselement eine Einzelkette ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, welche ein Fusionsprotein (a) des spezifischen Bindungselementes und (b) Interleukin-2 umfasst.
  12. Verwendung nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei das spezifische Bindungselement aus mehreren Ketten besteht.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, die (a) ein Fusionsprotein einer ersten Kette des spezifischen Bindungselementes und Interleukin-2 und (b) eine zweite Kette des spezifischen Bindungselementes umfasst.
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