DE69931908T2

DE69931908T2 - Steigerung der antikörper-zytokin-fusionsproteinmediierten immunantwort durch mitverabreichung mit einem angiogeneseinhibitor

Info

Publication number: DE69931908T2
Application number: DE69931908T
Authority: DE
Inventors: D. Stephen Carlisle GILLIES
Original assignee: EMD Serono Research Center Inc
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 1999-04-15
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2019-04-16
Also published as: JP2002511432A; CA2328076A1; EP1071468B1; PL343462A1; WO1999052562A2; NO20005155L; RU2229305C2; ES2267263T3; HUP0101352A3; WO1999052562A3; US20040180035A1; AU758860B2; CN1305386A; NO20005155D0; ATE329622T1; HUP0101352A2; CN1318092C; CZ20003767A3; DE69931908D1; BR9909583A

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Immunkonjugate, insbesondere Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine, die für gezielte Immuntherapie und allgemeine Immunstimulation von Nutzen sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Angiogeneseinhibitoren, um eine Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein-vermittelte Immunantwort auf einen zuvor ausgewählten Zelltyp, zum Beispiel Zellen in einem festen Tumor, zu verstärken.
Stand der Technik
Antikörper wurden seit vielen Jahren zur Behandlung von humanen Erkrankungen verwendet, in erster Linie, um passive Immunität gegenüber viralen oder bakteriellen Infektionen zu verleihen. Vor kurzem wurden jedoch Antikörper und Antikörperkonjugate als Antitumormittel verwendet. Der Nachweis von Antitumorwirkung war bei den meisten Tumorarten schwierig, wenn die klinischen Voraussetzungen nicht solche einer minimalen Resterkrankung waren (Reithmuller et al, LANCET 94: 1177-1183), oder wenn der Tumor über den Kreislauf für Antikörper zugänglich ist, zum Beispiel, im Falle des B-Lymphoms (Maloney et al. (1994) BLOOD 84: 2457-2466). Feste Tumore sind für eine Antikörper-vermittelte therapeutische Intervention viel unempfindlicher als mikrometastatische Foki, die unter den Voraussetzungen einer minimalen Resterkrankung gefunden werden.
Frühere Untersuchungen zeigen, dass die Behandlung von Tumoren mit Antikörpern in vivo deutlich verstärkt werden kann, wenn immunstimulierende Cytokine mit einem Antikörpermolekül verschmolzen werden. Die Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine waren jedoch viel weniger wirksam bei der Zerstörung von größeren festen Tumoren, als sie bei diffusen metastatischen Foki waren (Xiang et al. (1997) CANCER RESEARCH 57: 4948-4955, und Lode et al. (1998) BLOOD 91: 1706-1715).
Daher besteht auf dem Fachgebiet noch immer Bedarf nach Zusammensetzungen und Verfahren, die solche Zusammensetzungen einsetzen, um Antikörper-Cytokin- Fusionsprotein-vermittelte Immunantworten auf zuvor ausgewählte Zelltypen, zum Beispiel in festen Tumoren vorkommende Zelltypen, zu verstärken.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung basiert, zum Teil, auf der Entdeckung, dass, wenn ein Immunkonjugat einem Säuger verabreicht wird, es möglich ist, eine stärkere Immunantwort auf einen zuvor ausgewählten Zelltyp zu erzeugen, wenn das Immunkonjugat zusammen mit einem Angiogeneseinhibitor verabreicht wird. Insbesondere wurde gefunden, dass solche Zusammensetzungen insbesondere bei der Vermittlung der Immunzerstörung des zuvor ausgewählten Zelltyps nützlich sind, so wie bei in festen Tumoren und in virus-infizierten Zellen gefundenen Zelltypen.
In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Induzierung einer zytoziden Immunantwort gegen einen zuvor ausgewählten Zelltyp in einem Säuger bereit. Die Zusammensetzung enthält in Kombination: (i) ein Immunkonjugat, enthaltend eine Antikörperbindungsstelle, die den zuvor ausgewählten Zelltyp binden kann, und ein Cytokin, das solch eine Immunantwort gegen den zuvor ausgewählten Zelltyp in dem Säuger induzieren kann, und (ii) einen Angiogeneseinhibitor in einer Menge, die für eine Verstärkung der Immunantwort, die durch das Immunkonjugat der Kombination induziert wird, bezogen auf die durch das Immunkonjugat allein stimulierte Immunantwort ausreicht.
Die Antikörperbindungsstelle des Immunkonjugats enthält vorzugsweise eine schwere Immunglobulinkette oder ein Antigen-bindendes Fragment davon. Die schwere Immunglobulinkette enthält vorzugsweise von aminoterminaler zu carboxyterminaler Richtung eine variable Regionsdomäne (V_H) des Immunglobulins, die ein zuvor ausgewähltes Antigen binden kann, eine konstante Domäne 1 (CH1) einer schweren Immunglobulinkette, eine konstante Domäne 2 (CH2) einer schweren Immunglobulinkette und kann gegebenenfalls weiterhin eine konstante Domäne 3 (CH3) einer schweren Immunglobulinkette umfassen. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist das Immunkonjugat ein Fusionsprotein, enthaltend eine schwere Immunglobulinkette oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, das über eine Polypeptidbindung mit dem Cytokin verschmolzen ist. Demzufolge enthält ein bevorzugtes Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus, (i) die Antikörperbindungsstelle, enthaltend eine variable Region des Immunglobulins, die ein Zelloberflächenantigen auf dem zuvor ausgewählten Zelltyp binden kann, eine Immunglobulin-CH1-Domäne, eine Immunglobulin-CH2-Domäne (gegebenenfalls eine CH3-Domäne), und (ii) das Cytokin. Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Fusionsproteine werden detailliert beschrieben bei Gillies et al. (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89: 1428-1432; Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160:6195-6203; and U.S. Patent Nr. 5 650 150.
Die konstanten Regionsdomänen des Immunglobulins (d. h., die CH-1, CH2-und/oder CH3-Domänen) können die konstanten Regionsdomänen sein, die normalerweise mit den variablen Regionsdomänen in natürlich auftretenden Antikörpern verknüpft sind. Alternativ können eine oder mehrere der konstanten Regionsdomänen des Immunglobulins von Antikörpern abgeleitet werden, die sich von dem als eine Quelle der variablen Regionsdomäne verwendeten Antikörper unterscheidet. In anderen Worten, die variablen und konstanten Regionsdomänen des Immunglobulins können von verschiedenen Antikörpern abstammen, zum Beispiel von Antikörpern, die von verschiedenen Spezies abstammen. Siehe, zum Beispiel, U.S. Patent Nr. 4 816 567. Weiterhin können die variablen Regionen des Immunglobulins Gerüstregion-(FR)-Sequenzen, die von einer Spezies abstammen, zum Beispiel, einem Menschen, und komplementätsbestimmende-Region-(CDR)-Sequenzen enthalten, die zwischen die FRs eingefügt sind und von einer zweiten, anderen Spezies, zum Beispiel, einer Maus abstammen. Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher chimären variablen Regionen des Immunglobulins werden, zum Beispiel, in den U.S. Patenten Nr. 5 225 539 und 5 585 089 beschrieben.
Die Antikörper-basierten Immunkonjugate enthalten weiterhin vorzugsweise eine leichte Kette des Immunglobulins, die vorzugsweise kovalent an die schwere Immunglobulinkette mittels, zum Beispiel, einer Disulfidbindung gebunden ist. Die variablen Regionen der verknüpften schweren und leichten Immunglobulinketten definieren zusammen eine einzelne und vollständige Bindungsstelle für die Bindung des zuvor ausgewählten Antigens. In anderen Ausführungsformen enthalten die Immunkonjugate zwei chimäre Ketten, die jede mindestens einen Teil einer mit einem Cytokin verschmolzenen schweren Immunglobulinkette enthält. Die beiden chimären Ketten sind vorzugsweise kovalent miteinander verknüpft, zum Beispiel, über eine oder mehrere interkettige Disulfidbindungen.
Die Erfindung stellt so Fusionsproteine bereit, in denen die Antigenbindungsspezifität und Aktivität eines Antikörpers mit der starken biologischen Aktivität eines Cytokins kombiniert ist. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein kann verwendet werden, um das Cytokin selektiv zu einer Zielzelle in vivo zu liefern, so dass das Cytokin eine lokalisierte biologische Wirkung in der Nachbarschaft der Zielzelle ausüben kann. In einer bevorzugten Ausführungsform bindet die Antikörperkomponente des Fusionsproteins spezifisch an Antigen auf einer Karzinomzelle und dadurch übt das Fusionsprotein eine lokalisierte Antikarzinomaktivität aus. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform bindet die Antikörperkomponente des Fusionsproteins spezifisch eine virusinfizierte Zelle wie eine HIV-infizierte Zelle, und dadurch übt das Fusionsprotein eine lokalisierte antivirale Aktivität aus.
Cytokine, die in erfindungsgemäße Immunkonjugate eingebaut werden können, umfassen, zum Beispiel, Tumornekrosefaktoren, Interleukine, koloniestimulierende Faktoren und Lymphokine. Bevorzugte Tumornekrosefaktoren umfassen, zum Beispiel, Gewebenekrosefaktor α(TNFα). Interleukine umfassen, zum Beispiel, Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-7 (IL-7), Interleukin-12 (IL-12), Interleukin-15 (IL-15) und Interleukin-18 (IL-18). Bevorzugte Interleukine sind IL-4, IL-7, IL-2 und IL-12. Koloniestimulierende Faktoren umfassen, zum Beispiel, Granulozyt-Makrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) und Makrophagenkoloniestimulierenden Faktor (M-CSF). Bevorzgute Lymphokine umfassen, zum Beispiel, Lymphotoxin (LT). Andere nützliche Cytokine umfassen Interferone, einschließlich IFN-α, IFN-β und IFN-γ, die alle immunologische Wirkungen wie auch antiangiogenetische Wirkungen haben, die unabhängig von ihren antiviralen Aktivitäten sind.
Bevorzugte Angiogeneseinhibitoren, die für die Ausführung der Erfindung von Nutzen sind, umfassen, zum Beispiel, Endostatin, Angiostatin, Peptide mit einer Bindungsaffinität für αvβ₃-Integrin und Antikörper oder Fragmente davon, die eine Bindungsaffinität für αvβ₃-Integrin haben.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von genannter Zusammensetzung zur Induzierung einer zytoziden Immunantwort auf einen zuvor ausgewählten Zelltyp in einem Säuger. Die Verwendung umfasst die Verabreichung an einen Säuger (i) eines Immunkonjugats, enthaltend eine Antikörperbindungsstelle, die den zuvor ausgewählten Zelltyp binden kann, und ein Cytokin, das solch eine Immunantwort auf den zuvor ausgewählten Zelltyp in dem Säuger induzieren kann, und (ii) einen Angiogeneseinhibitor in einer Menge, die für eine Verstärkung der Immunantwort, die durch das Immunkonjugat der Kombination induziert wird, bezogen auf die durch das Immunkonjugat allein stimulierte Immunantwort ausreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der zuvor ausgewählte Zelltyp eine Karzinomzelle sein, die zum Beispiel in einem festen Tumor vorkommt, mehr bevorzugt in einem größeren festen Tumor (d.h. größer als etwa 100 mm³). Alternativ kann der zuvor ausgewählte Zelltyp eine virus-infizierte Zelle sein, zum Beispiel, eine mit dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierte Zelle.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann der Angiogeneseinhibitor gleichzeitig mit dem Immunkonjugat verabreicht werden. Alternativ kann der Angiogeneseinhibitor vor der Verabreichung des Immunkonjugats verabreicht werden. Weiterhin wird erwogen, dass das Immunkonjugat zusammen mit einer Vielzahl an verschiedenen Angiogeneseinhibitoren verabreicht werden kann. Alternativ wird erwogen, dass der Angiogeneseinhibitor zusammen mit einer Vielzahl an verschiedenen Immunkonjugaten verabreicht werden kann.
Ebenso werden bevorzugte Dosierungs- und Verabreichungsregime für die Verabreichung der Immunkonjugate in Kombination mit den Angiogeneseinhibitoren bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der Abbildung
Die vorhergehenden und andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie die Erfindung selbst können aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen in Zusammenhang mit den beigefügten Abbildungen genauer verstanden werden, in denen:
1 eine schematische Darstellung eines beispielhaften Immunkonjugats ist, das für die Ausführung der Erfindung von Nutzen ist.
2A und 2B Diagramme sind, die die Expression von humanem EpCAM in transfizierten Maus-Lewis-Lungenkarziom-(LLC)-Zellen nach Analyse durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) darstellen. Gleiche Zahlen an transfizierten Zellen wurden entweder mit einem sekundären Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-markiertem antihumanen Fc-spezifischen Antikörper allein (Panel A) gefärbt, oder zuerst mit einem huKS-huIL2-Antikörper-Fusionsprotein gefolgt von einem FITC-markierten antihumanem Fc-spezifischen Antikörper gefärbt (Panel B);
3 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung eines Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein auf subkutane Tumore darstellt, das entweder allein oder in Kombination mit einem zweiten Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein, in dem das Cytokin antiangiogenetische Wirkung hat, verabreicht wird. Behandlung über 5 Tage wurde 13 Tage nach Implantation der LLC-Zellen begonnen. Die Mäuse wurden behandelt mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (offene Diamanten), 15 μg/day huKS-muγ2amuIL2-Fusionsprotein allein (geschlossene Quadrate), 10 μg/day eines huKS-muγ2amuIL12-Fusionsproteins (geschlossene Dreiecke) und einer Kombination aus 7,5 μg/day huKS-muγ2a-muIL2-Fusionsprotein und 5 μg/day huKS-muγ2a-muIL12-Fusionsprotein (Kreuze);
4 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung eines Antikörper-Cytokin-Fusionsproteins, das entweder allein oder in Kombination mit einem Endostatin-Fusionsprotein verabreicht wird, auf subkutane Tumore darstellt. Die Größe der subkutanen CT26/EpCAM-Tumore wurde in Mäusen überwacht, die behandelt wurden mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (geschlossene Diamanten), einem muFcmuEndoS-Fusionsprotein (geschlossene Quadrate), einem huKS-huγ4-huIL2-Fusionsprotein (geschlossener Diamant) und einer Kombination aus muFcmuEndoS-Fusionsprotein und dem huKS-huγ4-huIL2-Fusionsprotein (Kreuze); und,
5 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung eines Antikörper-Cytokin-Fusionsproteins, das entweder allein oder in Kombination mit Indometacin verabreicht wird, auf subkutane Tumore darstellt. Die Größe der subkutanen LLC-EpCAM-Tumore wurde in Mäusen überwacht, die behandelt wurden mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (geschlossene Diamanten), einem huKS-huγl-huIL2-Fusionsprotein (geschlossene Quadrate), Indometacin (geschlossene Winkel), und einer Kombination aus huKS-huγl-huIL2-Fusionsprotein und Indometacin (Kreuze).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es wurde nun gefunden, dass zytozide durch ein Immunkonjugat gegen einen zuvor ausgewählten Zelltyp ausgelöste Immunantworten durch Verabreichung des Immunkonjugats zusammen mit einem Angiogeneseinhibitor deutlich verstärkt werden können. Die Kombinationstherapie ist insbesondere bei der Vermittlung der Immunzerstörung eines kranken Gewebes, wie einem bestehenden Tumor oder virus-infizierten Zellen wirksam. Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren zur Herstellung und Verwendung von nützlichen Immunkonjugaten sowie von Assays, die für eine Untersuchung ihrer pharmakokinetischen Aktivitäten in vorklinischen invivo-Tiermodellen von Nutzen sind, wenn sie mit geeigneten Angiogeneseinhibitoren kombiniert werden.
So wie hier verwendet, wird der Begriff „zytozide Immunantwort" so verstanden, dass eine entweder in ihrer Art humorale oder zelluläre Immunantwort in einem Säuger gemeint ist, die durch das erfindungsgemäße Immunkonjugat stimuliert wird und die einen in dem Säuger zuvor ausgewählten Zelltyp tötet oder auf andere Weise dessen Lebensfähigkeit vermindert. Die Immunantwort kann eine oder mehrere Zelltypen umfassen, einschließlich T-Zellen, natürlichen Killerzellen (NK) und Makrophagen.
So wie hier verwendet, wird der Begriff „Immunkonjugat" so verstanden, dass ein Konjugat aus (i) einer Antikörperbindungsstelle mit einer Bindungsspezifität für und einer Fähigkeit zur Bindung eines Oberflächenantigens auf einer Krebszelle oder einer virus-infizierten Zelle und (ii) einem Cytokin, das eine zytozide Immunantwort gegen die Krebs- oder virus-infizierte Zelle induzieren oder stimulieren kann, gemeint ist. Demzufolge, ist das Immunkonjugat fähig, das Cytokin selektiv zu einer Zielzelle in vivo zu liefern, so dass das Cytokin eine lokalisierte Immunantwort gegen die Zielzelle vermitteln kann. Wenn zum Beispiel der Antikörperbestandteil des Immunkonjugats selektiv an ein Antigen auf einer Krebszelle, zum Beispiel einer Krebszelle in einem festen Tumor bindet, insbesondere einem großen festen Tumor größer als etwa 100 mm³, übt das Immunkonjugat eine lokalisierte Antikrebswirkung aus. Alternativ übt das Immunkonjugat, wenn der Antikörperbestandteil des Immunkonjugats selektiv an ein Antigen auf einer virus-infizierten Zelle, wie einer mit dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten Zelle bindet, eine antivirale Wirkung aus.
So wie hier verwendet, wird der Begriff „Antikörperbindungsstelle" so verstanden, dass mindestens ein Teil einer schweren Immunglobulinkette, zum Beispiel eine variable Region des Immunglobulins gemeint ist, die den zuvor ausgewählten Zelltyp binden kann. Die Antikörperbindungsstelle enthält also vorzugsweise mindestens einen Teil einer konstanten Region eines Immunglobulins, einschließlich, zum Beispiel, einer CH1-Domäne, einer CH2-Domäne und gegebenenfalls einer CH3-Domäne. Darüber hinaus kann die schwere Immunglobulinkette, entweder kovalent oder nichtkovalent, an eine leichte des Immunglobulins gebunden werden, die zum Beispiel eine variable Region einer leichten Kette des Immunglobulins und gegebenenfalls eine konstante Region einer leichten Kette enthält. Demzufolge wird erwogen, dass die Antikörperbindungsstelle einen intakten Antikörper oder ein Fragment davon enthalten kann, der den zuvor ausgewählten Zelltyp binden kann.
Mit Bezug auf das Immunkonjugat wird erwogen, dass das Antikörperfragment mit dem Cytokin durch einen Vielfalt von Fachleuten wohlbekannten Wegen verknüpft werden kann. Zum Beispiel ist die Antikörperbindungsstelle vorzugsweise über eine Peptidbindung an das Cytokin in einem Fusionsproteinkonstrukt gebunden. Alternativ kann die Antikörperbindungsstelle chemisch an das Cytokin über reaktive Gruppen gekoppelt werden, zum Beispiel, Sulfhydrylgruppen innerhalb von Aminosäureseitenketten, die in der Antikörperbindungsstelle und dem Cytokin vorliegen.
So wie hier verwendet, wird der Begriff „Cytokin" so verstanden, dass irgendein Protein oder Peptid, Analogon oder funktionelles Fragment davon gemein ist, das eine zytozide Immunantwort gegen einen zuvor ausgewählten Zelltyp, zum Beispiel, eine Krebszelle oder virus-infizierte Zelle, in einem Säuger induzieren oder stimulieren kann. Demzufolge wird erwogen, dass eine Vielfalt an Cytokinen in die erfindungsgemäßen Immunkonjugate eingebaut werden kann. Nützliche Cytokine umfassen, zum Beispiel, Tumornekrosefaktorern, Interleukine, Lymphokine, kolonie stimulierende Faktoren, Interferone einschließlich Speziesvarianten, trunkierte Analoga davon, die zytozide Immunantworten stimulieren oder induzieren können. Nützliche Tumornekrosefaktoren umfassen, zum Beispiel, TNF α. Nützliche Lymphokine umfassen, zum Beispiel, LT. Nützliche koloniestimulierende Faktoren umfassen, zum Beispiel, GM-CSF und M-CSF. Nützliche Interleukine umfassen, zum Beispiel, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15 und IL-18. Nützliche Interferone umfassen, zum Beispiel, IFN-α, IFN-β und IFN-γ.
Das ein bestimmtes interessierendes Cytokin kodierende Gen kann de novo kloniert werden, aus einer erhältlichen Quelle erhalten werden oder mittels Standard-DNA-Synthese aus einer bekannte Nucleotidsequenz synthetisiert werden. Zum Beispiel ist die DNA-Sequenz von LT bekannt (siehe, zum Beispiel, Nedwin et al. (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13:6361), wie auch die Sequenzen für IL-2 (siehe, zum Beispiel, Taniguchi et al. (1983) NATURE 302:305-318), GM-CSF (siehe, zum Beispiel, Gasson et al. (1984) SCIENCE 266:1339-1342), und TNF α (siehe, zum Beispiel, Nedwin et al. (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13:6361).
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Immunkonjugate rekombinante Fusionsproteine, die durch konventionelle rekombinante DNA-Methoden hergestellt werden, nämlich durch Bildung eines Nucleinsäurekonstrukts, das das chimäre Immunkonjugat kodiert, Die Konstruktion des rekombinanten Antikörper-Cytokin-Fusionsproteins wurde im Stand der Technik beschrieben. Siehe, zum Beispiel, Gillies et al. (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89: 1428-1432; Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160:6195-6203; und U.S. Patent Nr. 5 650 150. Vorzugsweise umfasst ein Genkonstrukt, das das erfindungsgemäße Immunkonjugat kodiert, in 5' nach 3'-Orientierung, ein DNA-Segment, das die variable Regionsdomäne der schweren Immunglobulinkette kodiert, ein DNA-Segment, das eine konstante Region einer schweren Immunglobulinkette kodiert, und eine DNA, die das Cytokin kodiert. Das fusionierte Gen wird zusammengesetzt in einem oder eingeführt in einen Expressionsvektor für die Transfektion in eine geeignete Aufnahmezelle, wo das fusionierte Gen exprimiert wird. Die Hybridpolypeptidkette wird vorzugsweise mit einer leichten Kette des Immunglobulins kombiniert, so dass die variable Region der schweren Immunglobulinkette (V_H) und die variable Region der leichten Immunglobinkette (V_L) kombinieren, um eine einzige und vollständige Stelle für die Bindung eines zuvor ausgewählten Antigens herzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die schweren und leichten Immunglobulinketten gekoppelt, zum Beispiel, mittels einer interkettigen Disulfidbindung. Weiterhin können die beiden schweren Immunglobulinketten, wobei entweder eine oder beide mit einem Cytokin verschmolzen sind, kovalent gekoppelt sein, zum Beispiel mittels einer oder mehreren interkettigen Disulfidbindungen.
1 zeigt eine schematische Darstellung eines beispielhaften Immunkonjugats 10. In dieser Ausführungsform sind die Cytokinmoleküle 2 und 4 über eine Peptidbindung an die Carboxyterminusn 6 und 8 der CH3-Regionen 10 und 12 der schweren Ketten 14 und 16 des Antikörpers gebunden. Die V_L-Regionen 26 und 28 sind gepaart mit den V_H-Regionen 18 und 20 in einer typischen IgG-Konfiguration dargestellt, um so zwei Antigenbindungsstellen 30 und 32 an den Aminoterminusn der Immunkonjugate 10 und zwei Cytokin-Rezeptorbindungsstellen 40 und 42 an den Carboxyterminusn des Immunkonjugats 10 zu liefern. Selbstverständlich müssen in einem breiteren Aspekt die Immunkonjugate nicht wie oben dargestellt gepaart sein oder es muss nur eine der beiden schweren Immunglobulinketten mit einem Cytokinmolekül verschmolzen sein.
Erfindungsgemäße Immunkonjugate können wegen zweier Aspekte ihrer Struktur als chimär betrachtet werden. Erstens ist das Immunkonjugat insofern chimär, als dass es eine schwere Immunglobulinkette mit einer Antigenbindungsspezifität umfasst, die mit einem gegebenen Cytokin verknüpft ist. Zweitens kann ein erfindungsgemäßes Immunkonjugat insofern chimär sein, als dass es eine variable Region (V) eines Immunglobulins und eine konstante Region (C) eines Immunglobulins umfasst, die beide von verschiedenen Antikörpern abstammen, so dass das resultierende Protein eine V/C-Chimäre ist. Zum Beispiel können die variablen und konstanten Regionen von natürlich auftretenden Antikörpermolekülen abstammen, die aus verschiedenen Spezies isolierbar sind. Siehe, zum Beispiel, U.S. Patent Nr. 4 816 567. Ebenso sind Konstrukte eingeschlossen, in welchen eine oder beide der variablen Regionen des Immunglobulins Gerüstregion-(FR)-Sequenzen und komplementätsbestimmende-Region-(CDR)-Sequenzen enthalten, die von verschiedenen Spezies abstammen. Solche Konstrukte werden, zum Beispiel, beschrieben in Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525, Verhoyen et al. (1988) SCIENCE 239: 1534-1535, und U.S. Patent Nr. 5 225 539 und 5 585 089. Weiterhin wird erwogen, dass die Sequenzen der variablen Regionen durch das Screening von Bibliotheken, zum Beispiel Phagendisplay-Bibliotheken, für Sequenzen von variablen Regionen, die an ein zuvor ausgewähltes Antigen mit einer gewünschten Affinität binden, abgeleitet können. Verfahren zur Herstellung und zum Screening von Phagendisplay-Bibliotheken werden, zum Beispiel, beschrieben in Huse et al. (1989) SCIENCE 246: 1275-1281 und Kang et al. (1991) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 88: 11120-11123.
Die konstanten Regionsdomänen der schweren Immunglobulinkette der Immunkonjugate können ausgewählt werden aus irgendeiner der fünf Immunglobulinklassen, die als IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε), IgG (Igγ) und IgM (Igμ) bezeichnet werden. Die konstanten Regionen der schweren Immunglobulinkette aus der IgG-Klasse sind jedoch bevorzugt. Weiterhin wird erwogen, dass die schweren Immunglobulinketten aus irgendeiner der IgG-Antikörper-Unterklassen, die im Fachgebiet mit IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 bezeichnet werden, abgeleitet werden können. Jede konstante Region der schweren Immunglobulinkette enthält bekanntermaßen vier oder fünf Domänen. Die Domänen werden der Reihe nach wie folgt benannt: CH1-Gelenk-CH2-CH3-(-CH4). CH4 kommt in IgM vor, das keine Gelenk-Region hat. Die DNA-Sequenzen der Schwere-Kette-Domänen haben eine Kreuzhomologie unter den Immunglobulinklassen, zum Beispiel, ist die CH2-Domäne von IgG homolog zur CH2-Domäne von IgA und IgD, und zur CH3-Domäne von IgM und IgE. Die leichten Immunglobulinketten können entweder eine konstante Kappa-(k-) oder Lambda-(λ)-Kette haben. Sequenzen und Sequenzanordnungen dieser Immunglobulinregionen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt (siehe, zum Beispiel, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" U.S.Department of Health and Human Services, third edition 1983, fourth edition 1987, Huck et al. (1986) Nuc. ACIDS RES. 14: 1779-1789).
In bevorzugten Ausführungsformen wird die variable Region von einem für eine zuvor ausgewählte Zelloberfläche spezifischen Antikörper abgeleitet (ein Antigen, das mit einer erkrankten Zelle wie einer Krebszelle oder virus-infizierten Zelle verbunden ist), und die konstante Region umfasst CH1- und CH2- (und gegebenenfalls CH3)-Domänen aus einem Antikörper, der der gleiche ist oder sich vom Antikörper, der die Quelle der variablen Region ist, unterscheidet. In der Ausführung dieser Erfindung ist der Antikörperteil des Immunkonjugats in dem beabsichtigten Empfänger vorzugsweise nichtimmunogen oder ist schwach immunogen. Demzufolge, wird der Antikörperteil, so viel wie möglich, vorzugsweise aus der gleichen Spezies wie der beabsichtigte Empfänger abgeleitet. Soll das Immunkonjugat, zum Beispiel, Menschen verabreicht werden, sind die konstanten Regionsdomänen vorzugsweise humanen Ursprungs. Siehe, zum Beispiel, U.S. Patent Nr. 4 816 567. Wenn weiterhin die variable Region des Immunglobulins aus einer anderen Spezies als dem beabsichtigten Empfänger stammt, zum Beispiel, wenn die Sequenzen der variablen Region murinen Ursprungs sind und der beabsichtigte Empfänger ein Mensch ist, dann enthält die variable Region vorzugsweise humane FR-Sequenzen mit zwischen den FR-Sequenzen geschalteten murinen CDR-Sequenzen, um eine chimäre variable Region herzustellen, die eine Bindungsspezifität für ein zuvor ausgewähltes Antigen hat, aber dabei doch die Immunreaktion des beabsichtigten Wirts minimiert. Der Entwurf und die Synthese von solchen chimären variablen Regionen werden beschrieben in Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525, Verhoyen et. al. (1988) SCIENCE 239: 1534-1535, und U.S. Patent Nr. 5 225 539 und 5 585 089. Das Klonieren und die Expression eines humanisierten Antikörper-Cytokin-Fusionsproteins, KS-1/4 anti-EpCAM-Antikörper-EL-12-Fusionsprotein, sowie seine Fähigkeit bestehende Kolonkarzinommetastasen zu beseitigen, wurde beschrieben in Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160: 6195-6203.
Das das Cytokin kodierende Gen wird, entweder direkt oder mittels eines Linkers, zum Beispiel mittels einer (Gl-Ser)₃-Linker kodierenden DNA im Rahmen an das 3'-Ende des Gen geknüpft, das die konstante Region des Immunglobulins (z. B. ein CH2- oder CH3-Exon) kodiert. In bestimmten Ausführungsformen kann der Linker eine Nucleotidsequenz enthalten, die eine proteolytische Spaltstelle kodiert. Diese Stelle kann, wenn sie zwischen der konstanten Region des Immunglobulins und dem Cytokin eingefügt ist, entworfen werden, um die proteolytische Freisetzung des Cytokins an der Zielstelle zu gewährleisten. Zum Beispiel ist es wohlbekannt, dass Plasmin und Trypsin hinter Lysin- und Argininresten an Stellen spalten, die für die Proteasen zugänglich sind. Viele andere stellenspezifische Endoproteasen und die Aminosäuresequenzen, die sie spalten, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Bevorzugte proteolytische Spaltstellen und proteolytische Enzyme, die mit solchen Spaltstellen reaktiv sind, werden in den U.S. Patenten Nr. 5 541 087 und 5 726 044 beschrieben.
Das Nucleinsäurekonstrukt kann gegebenenfalls den endogenen Promotor und Enhancer für das die variable Region kodierende Gen enthalten, um die Expression der chimären Immunglobulinkette zu regulieren. Zum Beispiel können die variable Region kodierende Gene als DNA-Fragmente erhalten werden, die das Signalpeptid, das VJ-Gen (funktionell umgeordnete variable Regionen (V) mit Verbindungssegmenten (J)) für die leichte Kette oder VDJ-Gen für die schwere Kette und den endogenen Promoter und Enhancer für diese Gene enthalten. Alternativ kann das die variable Region kodierende Gen auch getrennt von endogenen Regulierungselementen erhalten und in einem Expressionsvektor verwendet werden, der diese Elemente bereitstellt.
Gene für die variable Region können mittels Standard-DNA-Klonierungsverfahren aus Zellen erhalten werden, die die gewünschten Antikörper produzieren. Screening der genomischen Bibliothek nach einer spezifischen funktionell umgeordneten variablen Region kann unter Verwendung von geeigneten DNA-Sonden wie DNA-Segmenten durchgeführt werden, die die JR-Region-DNA-Sequenz und -Sequenzen stromabwärts enthalten. Identifizierung und Bestätigung von korrekten Klonen wird durch Sequenzierung der klonierten Gene und Vergleich der Sequenz zur entsprechenden Sequenz der ordnungsgemäß gespleißten Volllängen-mRNA erreicht werden.
Das Ziel-Antigen kann ein Zelloberflächenantigen einer Tumor- oder Krebszelle, einer virus-infizierten Zelle oder einer anderen erkrankten Zelle sein. Gene, die geeignete variable Regionen kodieren, können im Allgemeinen aus Immunglobulin produzierenden lymphoiden Zelllinien erhalten werden, zum Beispiel können Hybridom-Zelllinien, die für Tumor assoziierte Antigene oder virale Antigene spezifische Immunglobuline produzieren, durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte somatische Standard-Zellhybridisierungstechniken produziert werden (siehe, zum Beispiel, U.S. Pat. Nr. 4 196 265). Diese Immunglobulin produzierenden Zelllinien liefern die Quelle der Gene für die variable Region in funktionell umgeordneter Form. Die Gene für die variable Region sind typischerweise murinen Ursprungs, da dieses murine System sich für die Produktion einer breiten Vielfalt an Immunglobulinen mit gewünschter Spezifizität eignet. Weiterhin können Sequenzen der variablen Region durch das Screening von Bibliotheken, zum Beispiel, Phagendisplay-Bibliotheken, für Sequenzen der variablen Region, die an ein zuvor ausgewähltes Antigen mit einer gewünschten Affinität binden, abgeleitet werden. Verfahren zur Herstellung und zum Screening von Phagendisplay-Bibliotheken werden, zum Beispiel, beschrieben in Huse et al. (1989) SCIENCE 246: 1275-1281 und Kang et al. (1991) Proc NATL. ACAD. SCI. USA 88: 11120-11123.
Das DNA-Fragment, das das die funktionell aktive variable Region enthaltende Gen kodiert, ist an ein DNA-Fragment gebunden, das das die gewünschte konstante Region (oder einen Teil davon) kodierende Gen enthält. Konstante Regionen von Immunglobulinen (schwere und leichte Kette) können aus Antikörper produzierenden Zellen mittels Standard-Genklonierungstechniken erhalten werden. Es wurden Gene für die beiden Klassen von humanen leichten Ketten (κ und λ) und die fünf Klassen von humanen schweren Ketten (α, δ, ε, γ und μ) kloniert, und so sind konstante Regionen von humanem Ursprung leicht aus diesen Klonen erhältlich.
Das fusionierte Gen, das die schwere Kette vom Hybridimmunglobulin kodiert, wird in einem Expressionsvektor zusammengesetzt oder insertiert, um in eine Empfängerzelle inkorporiert zu werden. Die Einführung des Genkonstrukts in Plasmidvektoren kann mittels Standard-Genspleißungsverfahren ausgeführt werden. Die chimäre schwere Immunglobulinkette kann in der gleichen Zelle mit der entsprechenden leichten Kette des Immunglobulins koexprimiert werden, so dass ein vollständiges Immunglobulin gleichzeitig exprimiert und zusammengesetzt werden kann. Zu diesem Zweck können die Konstrukte für die schwere und leichte Kette in dem gleichen oder in getrennten Vektoren platziert werden.
Empfängerzelllinien sind im Allgemeinen Lymphoidzellen. Die bevorzugte Empfängerzelle ist ein Myelom (oder Hybridom). Myelome können durch transfizierte Gene kodierte Immunglobuline synthetisieren, zusammensetzen und sezernieren und sie können Protein glykosylieren. Besonders bevorzugte Empfänger- oder Wirtszellen umfassen Sp2/0-Myelom, die normalerweise keine endogenen Immunglobuline produzieren, und Myelom-NS/0-Zellen der Maus. Wenn die Zelle transfiziert ist, produziert sie nur Immunglobulin, das durch die transfizierten Genkonstrukte kodiert ist. Transfizierte Myelome können in Kulturen oder im Peritoneum von Mäusen gezüchtet werden, wo sezerniertes Immunkonjugat aus Ascites-Tumor-Flüssigkeit gewonnen werden kann. Andere Lymphoidzellen wie B-Lymphozyten können als Empfängerzellen verwendet werden.
Es gibt einige Verfahren zur Transfektion von Lymphoidzellen mit Vektoren, die die chimäre Immunglobulinkette kodierenden Nucleinsäurekonstrukte enthalten. Zum Beispiel können Vektoren in Lymphoidzellen durch Spheroblastenfusion eingeführt werden (siehe, zum Beispiel, Gillies et al. (1989) BIOTECHNOL. 7: 798-804). Andere nützliche Verfahren umfassen Elektroporation oder Calciumphosphatfällung (siehe, zum Beispiel, Sambrook et al. eds (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press).
Andere nützliche Verfahren zur Herstellung von Immunkonjugaten umfassen die Herstellung einer RNA-Sequenz, die das Konstrukt kodiert, und deren Translation in einem geeigneten in-vivo- oder in-vitro-Expressionssystem. Es wird erwogen, dass die rekombinanten DNA-Verfahren zur Synthese von Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine kodierenden Genen, zur Einführung der Gene in Wirtszellen, zur Expression der Gene im Wirt und zur Ernte des resultierenden Fusionsproteins auf dem Fach gebiet wohlbekannt und ausführlich dokumentiert sind. Spezifische Protokolle werden, zum Beispiel, in Sambrook et al. eds (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Press) beschrieben.
Selbstverständlich können die chemisch gekoppelten Immunkonjugate unter Verwendung einer Vielfalt von Fachleuten wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann der Antikörper oder ein Antikörperfragment chemisch an das Cytokin unter Verwendung von chemisch reaktiven Aminosäureseitenketten im Antikörper oder Antikörperfragment und dem Cytokin gekoppelt werden. Die Aminosäureseitenketten können kovalent verknüpft werden, zum Beispiel über Disulfidbindungen oder mittels homo- oder hetero-bifunktioneller Vernetzungsreagenzien, einschließlich, zum Beispiel, 3(2-Pyridyldithio)-proprionsäure-(Nsuccinimid)-ester, m-Maleinimidobenzoesäure-(N-hydroxysuccinat)-ester, m-Maleinimidobenzoesäure-(N-hydroxysulfosuccinimid)-ester und 1,4-Di-[3'(2'pyridylthio)-propionamido]butan, die alle von Pierce, Rockford, IL, kommerziell erhältlich sind.
Selbstverständlich bezieht sich der Begriff „Angiogeneseinhibitor", so wie hier verwendet, auf jegliches Molekül, das die Bildung von neuen Blutgefäßen in einem Säuger vermindert oder inhibiert. Bezogen auf die Krebstherapie vermindern oder inhibieren die Angiogeneseinhibitoren die Bildung von neuen Blutgefäßen in oder auf einem Tumor, vorzugsweise in oder auf einem festen Tumor. Es wird erwogen, dass nützliche Angiogeneseinhibitoren unter Verwendung einer Vielfalt von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Assays identifiziert werden können. Solche Assays umfassen, zum Beispiel, das BCE-(bovine capillary endothelian)-Proliferationsassay, das Hühner-Chorioallantois-Membran-(CAM)-Assay oder das korneale Maus-Assay. Das CAM-Assay ist jedoch bevorzugt (siehe, zum Beispiel, O'Reilly et al. (1994) CELL 79: 315-328 und O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277-285). Kurz gesagt werden Embryonen mit intakten Eigelben aus befruchteten drei Tage alten weißen Eiern entfernt und in eine Petrischale gegeben. Nach Inkubation bei 37 °C, 3 % CO₂ für drei Tage wird eine Methylcellulosescheibe mit dem putativen Angiogeneseinhibitor auf die Chorioallantois-Membran eines individuellen Embryos aufgebracht. Nach Inkubation für etwa 48 Stunden wurden die Chorioallantois-Membranen unter einem Mikroskop auf Beweise für Inhibitionszonen hin untersucht.
Es sind eine Vielzahl von Angiogeneseinhibitoren auf dem Fachgebiet wohlbekannt und ausführlich dokumentiert. Beispiele für Angiogeneseinhibitoren, die in der Ausführung der Erfindung nützlich sind, umfassen, zum Beispiel, Protein-/Peptidinhibitoren der Angiogenese wie: Angiostatin, ein proteolytisches Plasminogenfagment (O'Reilly et al. (1994) CELL 79: 315-328, und U.S. Patent Nr. 5 733 876, 5 837 682 und 5 885 795); Endostatin, einem proteolytischen Kollagen-XVIII-Fragment (O'Reilly et al. (1997) CELL 88:2 77-285 und U.S. Patent Nr. 5 854 205); Peptide, die die RGD-Tripeptidsequenz enthalten und das αvβ₃-Integrin binden können (Brooks et al. (1994) CELL 79: 1157-1164); und bestimmte Antikörper und Antigenbindungsfragmente davon und Peptide, die mit dem auf vaskulären Tumorepithelzellen gefundenem αvβ₃-Integrin wechselwirken (Brooks et al., supra). Endostatin und Angiostatin sind derzeit jedoch am meisten bevorzugt.
So wie hier verwendet, bindet ein Antikörperteil des Immunkonjugats selbstverständlich spezifisch ein zuvor ausgewähltes Antigen, ein Cytokin bindet spezifisch einen Rezeptor für das Cytokin oder ein Angiogeneseinhibitor bindet spezifisch einen Rezeptor für den Inhibitor, wenn die Bindungsaffinität für das Antigen oder den Rezeptor größer ist als 10⁵ M^-1, und mehr bevorzugt größer als 10⁷ M^-1. So wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe Angiostatin, Endostatin, TNF, IL, GM-CSF, M-CSF, LT und IFN nicht nur auf intakte Proteine sondern auch auf bioaktive Fragmente und/oder Analoga davon. Bioaktive Fragmente beziehen sich auf Teile des intakten Proteins, die mindestens 30 %, mehr bevorzugt mindestens 70 % und am meisten bevorzugt mindestens 90 % der biologischen Aktivität des intakten Proteins aufweisen. Analoga beziehen sich auf Spezies und allele Varianten des intakten Proteins, oder Aminosäureersetzungen, -insertionen oder -deletionen davon, die mindestens 30 %, mehr bevorzugt mindestens 70 % und am meisten bevorzugt mindestens 90 % der biologischen Aktivität des intakten Proteins aufweisen.
Angiogeneseinhibitoren können gemeinsam mit dem Immunkonjugat gleichzeitig verabreicht werden oder über verschiedene Verabreichungswege getrennt verabreicht werden. Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können über jeglichen Weg verabreicht werden, der mit den bestimmten Molekülen verträglich ist. So kann, wie geeignet, die Administration oral oder parenteral, einschließlich intravenöser und intraperitonealer Verabreichungswege erfolgen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können einem Tier mittels jeglichem geeignetem Mittel gegeben werden, direkt (z. B. lokal wie durch Injektion, Implantation oder topische Verabreichung auf einen Gewebeort) oder systemisch (z. B. parenteral oder oral). Wenn die Zusammensetzung parenteral gegeben werden soll, wie durch intravenöse, subkutane, ophthalmische, intraperitoneale, intramuskuläre, buccale, rektale, vaginale, intraorbitale, intrazerebrale, intrakranielle, intraspinale, intraventrikuläre, intrathekale, intrazisternale, intrakapsuläre, intranasale Verabreichung oder über Aerosol, enthält die Zusammensetzung vorzugsweise Teile einer wässrigen oder physiologisch verträglichen Flüssigsuspension oder Lösung. So ist der Träger oder das Vehikel physiologisch unbedenklich, so dass zusätzlich zur Gabe der gewünschten Zusammensetzung an den Patienten, diese keine ansonsten gegensätzliche Wirkung auf das Elektrolyt- und/oder Volumengleichgewicht des Patient hat. Das flüssige Medium für das Mittel kann so normale physiologische Kochsalzlösung enthalten (z. B., 9,85 %ige wässrige NaCl, 0,15M, pH 7-7,4).
Bevorzugte Dosierungen des Immunkonjugats pro Verabreichung liegen in einem Bereich von 0,1 mg/m² – 100 mg/m², mehr bevorzugt 1 mg/m² – 20 mg/m² und am meisten bevorzugt 2 mg/m² – 6 mg/m². Bevorzugte Dosierungen des Angiogeneseinhibitors werden im Allgemeinen von der Art des verwendeten Angiogeneseinhibitors abhängen, jedoch können optimale Dosierungen unter Verwendung von Routineexperimenten bestimmt werden. Verabreichung des Immunkonjugats und/oder des Angiogeneseinhibitors können über periodische Bolusinjektionen oder über kontinuierliche intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung aus einem externen (zum Beispiel aus einem Infusionsbeutel) oder internen Vorrat (zum Beispiel aus einem bioabbaubaren Implantat) erfolgen. Weiterhin wird erwogen, dass das erfindungsgemäße Immunkonjugat dem beabsichtigten Empfänger auch zusammen mit einer Vielzahl an verschiedenen Angiogeneseinhibitoren verabreicht werden kann. Es ist jedoch zu erwägen, dass die optimale Kombination aus Immunkonjugaten und Angiogeneseinhibitoren, Arten der Verabreichung, Dosierungen mittels Routineexperimenten ermittelt werden kann, die gut innerhalb des Wissens des Fachgebiets liegen.
Eine Vielfalt an Verfahren kann zur Beurteilung der Effizienz der Kombinationstherapie unter Verwendung der Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine und Angiogeneseinhibitoren auf die Immunantworten verwendet werden. Zum Beispiel kann das in Beispiel 1 beschriebene Tiermodel oder ein anderes geeignetes Tiermodel von Fachleuten verwendet werden, um zu testen, welche Angiogeneseinhibitoren oder Kombinationen aus Angiogeneseinhibitoren bei der synergistischen Wirkung mit einem Immunkonjugat, zum Beispiel einem Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein (zum Beispiel einem Antikörper-IL2-Fusionsprotein), am effizientesten sind, um die Immunzerstörung von bestehenden Tumoren zu verstärken. Der Angiogeneseinhibitor oder die Kombination aus Angiogeneseinhibitoren kann vor oder gleichzeitig mit dem Verlauf der Immunkonjugattherapie verabreicht werden und die Wirkung auf den Tumor kann durch volumetrische Messungen bequem überwacht werden. Weiterhin kann ein Fachmann, wenn neue Angiogeneseinhibitoren identifiziert sind, die hier beschriebenen Verfahren verwenden, um das Potential dieser neuen Inhibitoren, die Antikrebswirkung der Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine zu verstärken, zu beurteilen.
Alternativ können auf eine Therapie folgend Tumore herausgeschnitten, geschnitten und über histologische Standardverfahren oder über spezifische immunhistologische Reagenzien gefärbt werden, um die Wirkung der Kombinationstherapie auf die Immunantwort zu beurteilen. Zum Beispiel kann einfache Färbung mit Hämatoxylin und Eosin Unterschiede in der lymphozytischen Infiltration in feste Tumore aufdecken, die ein Indikator für eine zelluläre Immunantwort ist. Weiterhin kann die Immunfärbung von Schnitten mit Antikörpern für spezifische Klassen von Immunzellen die Art der induzierten Antwort aufdecken. Zum Beispiel können Antikörper, die an CD45 (einem allgemeinen Leukozytenmarker), CD4 und CD8 (zur T-Zellensubklassenidentifizierung) und NK1.1 (ein Marker auf NK-Zellen) binden, verwendet werden, um die Art der Immunantwort zu beurteilen, die durch das erfindungsgemäße Immunkonjugat vermittelt wurde.
Alternativ kann die Art der von den Immunkonjugaten vermittelten Antwort auch durch herkömmliche Zellsubset-Verarmungsuntersuchungen beurteilt werden, die zum Beispiel, in Lode et al. (1998) BLOOD 91: 1706-1715 beschrieben werden. Beispiele für verarmende Antikörper umfassen solche, die mit T-Zellmarkern CD4 und CD8 reagieren, sowie solche, die die NK-Marker NK1.1 und Asialo-GM binden. Kurz gesagt werden diese Antikörper in den Säuger injiziert, bevor die Antikörper-Cytokin-Behandlung bei ziemlich hohen Dosen (zum Beispiel bei einer Dosis von etwa 0,5 mg/Maus) begonnen wird, und werden anschließend bis zum Ende des Experiments in wöchentlichen Intervallen gegeben. Diese Technik kann die Zelltypen identifizieren, die für ein Hervorrufen der beobachteten Immunantwort im Säuger notwendig sind.
In einem anderen Ansatz kann die zytotoxische Aktivität von Splenozyten, die aus mit der Kombinationstherapie behandelten Tieren isoliert wurden, mit denen von anderen Behandlungsgruppen verglichen werden. Splenozytkulturen werden durch mechanisches Hacken von gewonnenen, sterilen Milzen durch Standardtechniken hergestellt, die in den meisten immunologischen Laborhandbüchern zu finden sind. Siehe, zum Beispiel, Coligan et al. (eds) (1988) "Current Protocols in Immunology" John Wiley & Sons, Inc. Die resultierenden Zellen werden dann in einem geeigneten Kulturmedium (zum Beispiel DMEM von GIBCO), das Serum, Antibiotika und eine geringe Konzentration IL-2 (~10 U/mL) enthält, kultiviert. Um zum Beispiel die NK-Aktivität zu vergleichen, ist normalerweise eine Kultivierung von 3 Tagen optimal, während für den Vergleich der T-Zellzytotoxizitätsaktivität Kultivierung über 5 Tage normalerweise optimal ist. Die zytotoxische Aktivität kann durch radioaktiv markierende Tumorzielzellen (zum Beispiel LLC-Zellen) mit ⁵¹Cr für 30 min gemessen werden. Nach dem Entfernen von überschüssiger radioaktiver Markierung werden die markierten Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von kultivierten Milzzellen für 4 h kultiviert. Am Ende der Inkubation wird aus den Zellen freigesetztes ⁵¹Cr durch einen Gammazähler gemessen, was dann verwendet wird, um das Ausmaß der durch die Immunzellen induzierten Zelllyse zu quantifizieren. Auf diese Weise wird traditionelle zytotoxische T-Lymphozyten- (oder CTL-)Aktivität gemessen.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1. Tiermodel.
Es wurde ein murines Krebsmodel entwickelt, um die Wirkung der Kombination von Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein und Angiogeneseinhibitoren bei der Vermittlung von wirksamen Immunantworten auf Tumore zu untersuchen. Die in den folgenden Beispielen verwendeten Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine binden EpCAM, ein humanes Tumorantigen, das auf den meisten epithel abstammenden Tumoren gefunden wird, (siehe, Perez and Walker (1989) J. IMMUNOL. 142: 3662-3667). Um die Effizienz eines immunkompetenten Mausmodels zu testen, war es notwendig, das humane Antigen auf der Oberfläche einer Maustumorzelle zu exprimieren, die mit dem Mauswirt syngeneisch ist. Zu diesem Zweck wurden Lewis-Lungenkarzinomzellen (LLC), eine wohlbekannte Mauslungenkrebszelllinie, ausgewählt. Als Folge wurde das humane Tumorantigen, EpCAM, auf der Oberfläche der LLC-Zellen exprimiert.
LLC-Zellen wurden mit einem Expressionsplasmid transfiziert, das eine cDNA enthielt, die das humane EpCAM-Antigen (erkannt durch den KS-1/4-Antikörper, wie beschrieben in Vurki et al. (1984) CANCER RES. 44:681) kodierte, und wurden durch einen Cytomegalovirus-Frühen-Promoter (CMV) getrieben (Immunogen, Carlsbad, CA). Das KS-Antigen (KSA oder EpCAM) wurde mittels PCR aus cDNA kloniert, die aus den humanen Prostatakarzinomzellen, LnCAP, hergestellt wurde. Der Vorwärts-Primer hat die Oligonucleotidsequenz 5' TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC (SEQ ID Nr. 1), in der das ATG der Translationsstartcodon ist, und der reverse Primer hat die Oligonucleotidsequenz 5' CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT (SEQ ID Nr. 2), in der TTA der Anticodon für das Translationsende ist. Die EpCAM-cDNA wurde in einen retroviralen Vektor pLNCS (Clontech, Palo Alto, CA) kloniert und die Transfektion wurde gemäß bestehender Protokolle ausgeführt (Ausubel et al., (eds) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons). Kurz gesagt, wurde die Verpackungszelllinie P A317 (ATCC CRL 9078) mit pLNCX-EpCAM durch Calciumphosphat-Kofällung transfiziert und das konditionierte den Virus enthaltende Medium wurde zur Transfektion der LLC-Zellen verwendet. Zu den transfizierten Zellen wurde G418 (Sigma Chemical Co.) mit 1 mg/mL gegeben, um stabile Klone zu selektieren. Humanes EpCAM-Antigen exprimierende Klone (LLC-Ep) wurden mittels Immunfärbung und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) identifiziert.
Wie in 1 dargestellt, zeigen LLC-Ep-Klone, die zuerst mit einem hu-KS-IL2-Antikörperfusionsprotein (siehe Beispiel 2 unten) und dann mit einem Fluoresceinisothiocyanat-(FITC)-markierten antihumanem Fc-spezifischen Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) angefärbt wurden, ein annähernd gleichmäßiges Expressionsniveau von humanem EpCAM. Der Expressionsspiegel in diesen Klonen lag deutlich über dem Spiegel, der in Klonen beobachtet wurde, die allein mit dem FITC-markierten Fc-spezifischen Antikörper gefärbt wurden.
Um zu zeigen, dass die Expression eines humanen Zelloberflächenproteins nicht die Immunisierungskraft der LLC-Ep-Zellen erhöhte, wurde C57B1/6-Mäuse subkutan eine variierende Anzahl an Zellen injiziert. Bei allen Mäusen wurde nach Injektion mit 5 × 10⁵ Zellen die Entwicklung von schnell fortschreitenden Tumoren beobachtet, wobei in etwa die gleiche Wachstumskinetik wie in der Eltern-LLC-Zelllinie beobachtet wurde. Alle Tiere wurden moribund und wurden geopfert, um unnötiges Leiden zu vermeiden.
Beispiel 2. Herstellung von Antikörper-Cytokin- oder Antikörper-Angiogeneseinhibitor-Fusionsproteinen.
In den folgenden Beispielen werden eine Vielfalt an Antikörper-Cytokin-Fusionsproteinen diskutiert. Insbesondere beschreibt Beispiel 3 die Verwendung von humanisierten KS- murinen γ2α- murinen IL2 (huKS-muγ2α-muIL2) und humani sierten KS- murinen γ2α – murinen IL12 (huKS-muγ2α -muIL12) Fusionsproteinen. Beispiel 4 beschreibt die Verwendung des huKS-muγ2α-muIL2-Fusionsproteins zusammen mit murinen Fc- murinen Angiostatin- (muFc-muAngio) und murinen Fcmurinen Endostatin (muFc-muEndo) Fusionsproteinen. Beispiel 5 beschreibt die Verwendung von humanisierten KS- humanen γ4- humanen IL2 (huKS-huγ4-huIL2) und muFc-muEndo-Fusionsproteinen. Schließlich beschreibt Beispiel 6 die Verwendung von humanisiertem KS- humanem huγ1- humanem IL2 (huKS-huγ1-huIL2) Fusionsprotein mit Indometacin. Die Konstruktion dieser Fusionsproteine wird unten diskutiert.
huKS-huγ1-huIL2
Ein huKS-huγ1-huIL2-Fusionsprotein kodierendes Gen wurde hergestellt und exprimiert, im Wesentlichen wie in Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160:6195-6203 und U.S. Patent Nr. 5 650 150 beschrieben. Kurz gesagt, wurden humanisierte variable Regionen des Maus-KS-1/4-Antikörpers (Varki et al., (1984) CANCER RES. 44:681-687) unter Verwendung des bei Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525 beschriebenen Verfahrens modelliert, das die Insertion der CDRs von jeder variablen KS 1/4-Region in die Konsens-Leserahmensequenzen der humanen variablen Regionen mit dem höchsten Grad an Homologie umfassten. Molecular Modeling mit einer Silicon Diagrammics Indigo Workstation mit implementierter BioSym-Software bestätigte, dass die Formen der CDRs aufrechterhalten wurden. Die Proteinsequenzen wurden dann revers translatiert und durch die Ligation der überlappenden Oligonucleotide wurden Gene konstruiert.
Die resultierenden variablen Regionen wurden in einen Expressionsvektor insertiert, der die konstanten Regionen der humanen leichten κ-Kette und der humanen schweren Cγ1-Kette enthielt, im Wesentlichen wie in Gillies et al. (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:1428-1432 beschrieben, außer dass die Metallothioneinpromotoren und die Enhancer für die schwere Immunglobulinkette durch den CMV-Promotor/Enhancer für die Expression von beiden Ketten ausgetauscht wurde. Fusionen der reifen Sequenzen von IL-2 an das Carboxyterminus der humanen schweren Ketten wurden wie in Gillies et al. (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI.
USA 89:1428-1432 beschrieben hergestellt, außer dass die 3'-untranslatierten Regionen des IL-2-Gens aus der SV40-Poly(A)-Region abgeleitet wurden.
Das IL-2-Fusionsprotein wurde durch Transfektion des resultierenden Plasmids in NS/0-Myelomzelllinie mit einem Selektionsmedium, das 0,1 μM Methotrexat enthielt, exprimiert. Kurz gesagt, um stabil transfizierte Klone zu erhalten, wurde die Plasmid-DNA in die Maus-Myelom-NS/0-Zellen mittels Elektroporation eingeführt. Die NS/0-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, gezüchtet. Es wurden etwa 5 × 10⁶ Zellen einmal mit PBS gewaschen und in 0,5 mL PBS resuspendiert. Zehn μg linearisierte Plasmid-DNA wurde dann mit den Zellen in einer Gene-Pulser-Küvette (0,4 cm Elektrodenlücke, BioRad) auf Eis für 10 min inkubiert. Elektroporation wurde unter Verwendung eines Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) mit Einstellungen bei 0,25 V und 500 μF ausgeführt. Die Zellen durften sich 10 min auf Eis erholen, dann wurden sie im Wachstumsmedium resuspendiert und auf zwei 96-Loch-Platten ausplattiert. Stabil transfizierte Klone wurden durch Wachstum in Gegenwart von 100 nM Methotrexat (MTX) selektiert, das zwei Tage nach der Transfektion eingeführt wurde. Die Zellen wurden alle 3 Tage drei weitere Male gefüttert und die MTX-resistenten Klone erschienen nach 2 bis 3 Wochen.
Exprimierende Klone wurden durch Fc- oder Cytokin-ELISA unter Verwendung der geeigneten Antikörper identifiziert (siehe, zum Beispiel, Gillies et al. (1989) BIO-TECHNOL. 7: 798-804). Die resultierenden Fusionsproteine wurden durch Bindung und Elution von Protein-A-Sepharose (Pharmacia) gereinigt, gemäß den Angaben des Herstellers.
huKS-huγ4-huIL2
Ein das huKS.huγ4.huIL2-Fusionsprotein kodierendes Gen wurde konstruiert und exprimiert, im Wesentlichen wie in U.S.S.N. 09/256,156, eingereicht am 14.02.1999, beschrieben, das gegenüber U.S.S.N. 60/075,887, eingereicht am 25.02.1998 Priorität in Anspruch nimmt.
Kurz gesagt, wurde eine Ig-Version des huKS-huγl-huIL2-Fusionsproteins, wie oben beschrieben, durch Entfernen des Cγ1-Genfragments für die konstante Region des Immunglobulins aus dem huKS-huγl-huIL2-Expressionsvektor und dessen Austausch mit der entsprechenden Sequenz aus dem humanen Cγ4-Gen hergestellt. Sequenzen und Sequenzanordnungen der humanen konstanten Regionen der schweren Ketten Cγ1, Cγ2, Cγ3 und Cγ4 sind in Huck et al. (1986) Nuc. ACIDS RES. 14: 1779-1789 beschrieben.
Der Austausch der Cγ1- und Cγ4-Fragmente wurde durch Verdauung der originalen Cγ1-enthaltenden Plasmid-DNA mit Hind III und Xho I und Reinigen eines großen 7,8 kb Fragments durch Agarosegelelektrophorese erreicht. Eine zweite das Cγ4-Gen enthaltende Plasmid-DNA wurde mit Hind III und Nsi I verdaut und ein 1,75 kb Fragment wurde gereinigt. Ein drittes, die humane IL-2-cDNA und SV40-poly-A-Stelle enthaltendes Plasmid, das an des Carboxylterminus des humanen Cγ1-Gens fusioniert wurde, wurde mit Xho I und Nsi I verdaut und das kleine 470 bp Fragment wurde gereinigt. Alle drei Fragmente wurden in in etwa gleichen molaren Mengen zusammen verbunden und das Ligationsprodukt wurde verwendet, um kompetente E. coli zu transformieren. Das Ligationsprodukt wurde verwendet, um kompetente E. coli zu transformieren und es wurden Kolonien durch Wachstum auf ampicillinhaltigen Platten selektiert. Korrekt zusammengesetzte rekombinante Plasmide wurden durch Restriktionsanalysen der Plasmid-DNA-Präparate aus isolierten Transformanden identifiziert und Verdauung mit Fsp I wurde verwendet, um zwischen den Cγ1- (kein Fsp I) und Cγ4-Geninserten (eine Stelle) zu unterscheiden.
Der endgültige Vektor, der den Ersatz für die Cγ4-IL2-schwere-Kette enthält, wurde in NS/0-Maus-Myelomzellen mittels Elektroporation (0,25V und 500 μF) eingeführt und Transfektanten wurden durch Wachstum in einem Methotrexat (0,1 μM) enthaltenden Medium selektiert. Zellklone, die hohe Spiegel an huKS-huγ4-huIL2-Fusionsprotein exprimieren, wurden identifiziert, vermehrt und das Fusionsprotein aus den Zellüberständen unter Verwendung von A-Sepharose-Chromatographie gereinigt. Die Reinheit und Vollständigkeit des Cγ4-Fusionsproteins wurde mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmt. IL-2-Aktivität wurde in einem T- Zellproliferationsassay (Gillis et al. (1978) J. IMMUNOL. 120:2027-2032) gemessen und war identisch zu dem des γ1-Konstrukts.
huKS-muγ2a-muIL2
Ein das huKS-muγ2a-muIL2-Fusionsprotein kodierendes Gen wurde durch Austausch von konstanten Regionen von humanen Antikörpern und humanem IL-2 des huKS-huγ1-huIL2-Fusionsproteins, wie oben beschrieben, mit den entsprechenden murinen Sequenzen konstruiert. Insbesondere wurde die humane Cγ1-IL2-DNA mit einem murinen Cγ2a-cDNA-Fragment ersetzt, das an eine murines IL-2 kodierende DNA fusioniert war. Kurz gesagt, wurde die VH-Region des huKS in einem Rahmen mit der murinen γ2a-cDNA verbunden, indem eine Überlappungs-PCR unter Verwendung von überlappenden Oligonucleotidprimern durchgeführt wurde:
(Sense) 5' CC GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC (SEQ ID Nr. 3);
(Antisense) 5' GG GGC TGT TGT TTT GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA CG (SEQ ID Nr. 4);
(Sense) 5' C TTA AGC CAG ATC CAG TTG GTG CAG (SEQ ID Nr. 5); und
(Antisense) 5' CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C (SEQ ID Nr, 6).
Die Oligonucleotide von SEQ ID Nr. 3 und 4 wurden entworfen, um die Verbindung der V_H-Domäne von huKS und der konstanten Region von muriner γ2a-cDNA (kursiv) zu hybridisieren. In einer ersten PCR-Runde gab es zwei getrennte Reaktionen. In einer Reaktion wurde die VH der huKS-DNA als Templat mit den Oligonucleotiden der SEQ ID Nr. 4 und 5 verwendet. Der Primer von SEQ ID Nr. 5 führte eine Aflll-(CTTAAG)-Restriktionsstelle stromaufwärts der Sequenz ein, die das reife Aminoterminus der huKS VH (fett) kodiert. In einer anderen Reaktion wurde murine γ2a -cDNA als Templat mit den Oligonucleotiden der SEQ ID Nr. 3 und 6 verwendet. Der Primer von SEQ ID Nr. 6 hybridisierte an die cDNA, die die Region um das C-Ende von γ2a kodiert, und führte eine Xmal-(CCCGGG)-Restriktionsstelle für die nachfolgenden Ligation mit der muIL2-cDNA ein. PCR-Produkte aus den beiden Reaktionen wurden vermischt und einer zweiten PCR-Runde unter Verwendung der Oligonucleotide aus den SEQ ID Nr.: 5 und 6 unterzogen. Das resultierende PCR-Produkt wurde kloniert und nach Sequenzverifikation, wurde das Aflll-Xmal-Fragment, das die V_H von huKS und die murine konstante Region γ2a kodiert, für die Ligation an die DNA verwendet, die das Signalpeptid an der Aflll-Stelle und die muIL2-cDNA an der Xmal-Stelle kodiert.
Die murine IL2-cDNA wurde aus mRNA von murinen peripheren mononuclearen Blutzellen unter Verwendung der in SEQ ID Nr. 7 und 8 dargelegten Oligonucleotide kloniert, nämlich:
(Sense) 5' GGC CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AGC TCC (SEQ ID Nr. 7); und
(Antisense) 5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (SEQ ID Nr. 8).
Der Primer von SEQ ID Nr. 7 adaptierte das muIL2 (Sequenz kursiv), die an muγ2a an der Xmal-Restriktionsstelle (CCCGGG) geknüpft werden soll. Der Primer von SEQ ID Nr. 8 führte eine Xhol-Restriktionsstelle (CTCGAG) direkt hinter das Translationsstoppcodon ein (Antisense in Fett).
Ebenso wurde die variable leichte Domäne (V_L) von huKS mit der muk-cDNA-Sequenz durch Überlappungs-PCR verknüpft. Die verwendeten überlappenden Oligonucleotide umfassten
(Sense) 5' G GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT G (SEQ ID Nr. 9);
(Antisense) 5' GC AGC ATC AGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC (SEQ ID Nr. 10);
(Sense) 5' C TTA AGC GAG ATC GTG (CTG ACC CAG (SEQ ID Nr. 11); und
(Antisense) 5' CTC GAG CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC (SEQ ID Nr. 12).
Die Oligonucleotide wurden entworfen, um die Verbindung der V_L-Domäne von huKS und der konstanten Region von muriner κ-cDNA (kursiv) zu hybridisieren. In einer ersten PCR-Runde gab es zwei getrennte Reaktionen. In einer Reaktion wurde die V_L von huKS-DNA als Templat mit den in SEQ ID Nr. 10 und 11 dargelegten Oligonucleotiden verwendet, die eine AfIII-(CTTAAG)-Restriktionsstelle stromaufwärts der Sequenz einführt, die das reife Aminoterminus von huKS V_L kodiert (kursiv). In einer anderen Reaktion wurde murine κ-cDNA als Templat mit den in SEQ ID Nr. 9 und 12 dargelegten Oligonucleotiden verwendet, die eine Xhol-Restriktionsstelle nach dem Translationsstoppcodon einführte (Antisense, kursiv).
PCR-Produkte aus den beiden Reaktionen wurden vermischt und einer zweiten PCR-Runde unter Verwendung der in den SEQ ID Nr. 11 und 12 dargelegten Oligonucleotide unterzogen. Das resultierende PCR-Produkt wurde kloniert und nach Sequenzverifikation, wurde das Aflll-Xhol-Fragment, das die V_L von huKS und die murine konstante Region x kodiert, an die DNA ligiert, die das Signalpeptid an der Aflll-Stelle kodiert.
Sowohl die murinen schwere und leichte Kettensequenzen wurden verwendet, um die humanen Sequenzen in pdHL7 zu ersetzen. Der resultierende Antikörperexpressionsvektor, der ein dhfr-selektierbares Markergen enthielt, wurde in murine NS/0-MyelomZellen elektroporiert (0,25V, 500 μF) und Klone wurden durch Kultivieren in 0,1 μM Methotrexat enthaltendem Medium selektiert. Transfizierte, Methotrexat resistente Klone wurden auf die Sekretion von Antikörperdeterminanten durch Standard-ELISA-Verfahren getestet. Die Fusionsproteine wurden über Protein-A-Sepharose-Chromatographie gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt.
huKS-muγa-muIL12
Ein das huKS-muγ2a-muIL12-Fusionsprotein kodierendes Gen wurde hergestellt und exprimiert, im Wesentlichen wie in U.S.S.N. 08/986,997, eingereicht am 8.12.1997, und Gillies et al.(1998) J. Immunol. 160:6195-6203 beschrieben. Kurz gesagt, wurde dies erreicht, indem die murine p35-IL-12-Untereinheit-cDNA an die wie vorher beschrieben hergestellte huKS-muγ2a-schwere-Kette kodierend Region fusioniert wurde. Der resultierende Vektor wurde dann in eine NS/0-Myelom-Zelllinie transfiziert, die mit einer p40-IL-12-Untereinheit vortransfiziert wurde und diese exprimieren kann. In anderen Worten, eine Zelllinie wurde mit p40 allein transfiziert und es wurde eine stabile hochexprimierende Zelle selektiert, die dann als Empfänger für die Transfektion durch das p35 enthaltenden Fusionspeptid verwendet wurde (d.h. sequentielle Transfektion).
Die murinen p35- und p40-IL-12-Untereinheiten wurde durch PCR von aus Milzzellen hergestellter mRNA isoliert, die mit Concanavalin A (5 μg/mL in Kulturmedium für 3 Tage) aktiviert wurden. Die zur Isolierung der p35 kodierenden Nucleinsäuresequenz verwendeten PCR-Primer, die auch die p35-cDNA als ein Xmal-Xhol-Restriktionsfragment anpassten, umfassten:
5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (SEQ ID Nr. 13); und
5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (SEQ ID Nr 14).
Der zur Isolierung der p40 kodierenden Nucleinsäuresequenz verwendete PCR-Primer umfasste:
5' TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (SEQ ID Nr. 15); und
5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEQ ID Nr. 6).
Es wurde ein Plasmidvektor (pdHL7-huKS-muγ2a-p35) wie beschrieben (Gillies et al. J. IMMUNOL. METHODS 125:191) konstruiert, der ein dhfr-selektrierbares Markergen, eine Transkriptionseinheit, die eine humanisierte leichte Kette des KS-Antikörpers kodiert, und eine Transkriptionseinheit, die eine an die p35-Untereineit von Maus-IL-12 fusionierte murine schwere Kette kodiert, enthielt. Die Fusion wurde erreicht, in dem das Xmal an das Xhol-Fragment der angepassten p35-Untereinheit-cDNA zu einer einzigartigen Xmal-Stelle am Ende des CH3-Exons des vorher hergestellten murinen γ2a-Gens ligiert wird. Sowohl die H- wie auch die L-Kettentranskriptionseinheiten umfassen einen Cytomegalovirus-(CMV)-Promoter (anstelle des Metallothionein-Promoters in der Originalliteratur) am 5'-Ende und eine Polyadenylierungsstelle am 3'-Ende.
Ein ähnlicher Vektor (pNC-p40) wurde für die Expression der freien p40-Untereinheit konstruiert, die ein selektierbares Markergen (Neomycinresistenzgen) umfasste, aber immer noch den CMV-Promoter für Transkription verwendete. Die kodierende Region umfasste in diesem Fall die natürliche Signalsequenz der p40-Untereinheit für die ordnungsgemäße Überführung in das endoplasmatische Retikulum und Zusammenbau mit dem Fusionsprotein. Plasmid-pNC-p40 wurde in Zellen elektroporiert, und die Zellen wurde ausplattiert und in G418-haltigem Medium selektiert. In diesem Fall wurden die Kulturüberstände aus den wirkstoffresistenten Klonen mittels ELISA auf die Produktion der p40-Untereinheiten getestet.
Der pdHL7-huKS-muγ2a-p35-Expressionsvektor wurde in die NS/0-Zelllinie elektroporiert, die bereits murines p40 exprimiert, wie bei Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160: 6195-6203 beschrieben. Transfizierte, Methotrexat resistente Klone wurden auf die Sekretion von Antikörperdeterminanten und Maus-IL-12 durch Standard-ELISA-Verfahren getestet. Das resultierende Protein wurde durch Bindung an und Elution aus einer Protein-A-Sepharose-Säule gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt.
muFc-muEndo
Ein das muFc-muEndo-Fusionsprotein kodierendes Gen wurde hergestellt und exprimiert, im Wesentlichen wie in U.S.S.N. 60/097,883, eingereicht am 25.08.1998, beschrieben.
Kurz gesagt wurde murines Endostatin und murines Fc als ein muFc-muEndostatin-Fusionsprotein exprimiert. PCR wurde verwendet, um das Endostatingen für die Expression in den pdCs-muFc(D4K)-Vektor zu adaptieren (Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:495-500), der eine Enterokinase-Erkennungsstelle Asp4-Lys enthält (LaVallie et al. (1993) J. BIOL. CHEM. 268: 23311-23317). Der Vorwärts-Primer war 5'-C CCC AAG CTT CAT ACT CAT CAG GAC TTT C (SEQ ID Nr. 17), in der auf die AAGCTT (HindIII-Stelle) eine Sequenz (fett) folgte, die das N-Ende des Endostatins kodiert. Der reverse Primer war 5'-CCC CTC GAG CTA TTT GGA GAA AGA GGT C (SEQ ID Nr. 18), der so entworfen war, das er ein Translationsstoppcodon (Anticodon, CTA) direkt nach dem C-Ende des Endostatins setzte, und diesem folgte eine Xhol-Stelle (CTCGAG).
Das PCR-Produkt wurde kloniert und sequenziert und das das Endostatin kodierende Hindlll Xho-Fragement wurde in den pdCs-muFc(D₄K)-Vektor ligiert. Stabile NS/0-Klone, die muFc(D4K)-muEndo exprimierten, wurden unter Verwendung einer antimuFc-ELISA selektiert und untersucht. Das resultierende Fusionsprotein wurde exprimiert und über Protein-A-Sepharose-Chromatographie gereinigt.
muFc-muAngio
Ein das muFc-muAngio-Fusionsprotein kodierendes Gen wurde hergestellt und exprimiert, im Wesentlichen wie in U.S.S.N. 60/097,883, eingereicht am 25.08.1998, beschrieben.
Kurz gesagt wurde murines Angiostatin und murines Fc als ein muFc-muAngiostatin-Fusionsprotein exprimiert. PCR wurde verwendet, um die Angiostatinsequenz NA, freundlicherweise vom Labor von Dr. Judah Folkman, Childrens Hospital, Boston, MA zur Verfügung gestellt, für die Expression im pdCs-Fc(D4K)-Vektor anzupassen (Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:495-500). Der Vorwärts-Primer war 5'-C CCC AAG CTT GTG TAT CTG TCA GAA TGT AAG CCC TCC TGT CTC TGA GCA (SEQ ID Nr. 19), in der auf die AAGCTT (HindIII-Stelle) eine Sequenz (fett) folgte, die das N-Ende des Angiostatins kodiert. Der reverse Primer war 5'-CCC CTC GAG CTA CCC TCC TGT CTC TGA GCA (SEQ ID Nr. 20), der so entworfen war, das er ein Translationsstoppcodon (Anticodon, CTA) direkt nach dem C-Ende des Angiostatins setzte, und diesem folgte eine Xhol-Stelle (CTCGAG).
Das PCR-Produkt wurde kloniert und sequenziert und das das Angiostatin kodierende Hindlll-Xhol-Fragment wurde in den pdCs-muFc(D₄K)-Vektor ligiert. Stabile NS/0-Klone, die muFc(D4K)-muAngio exprimierten, wurden unter Verwendung einer anti-muFc-ELISA selektiert und untersucht. Das resultierende Fusionsprotein wurde exprimiert und über Protein-A-Sepharose-Chromatographie gereinigt.
Beipiel 3. Kombinationstherapie unter Verwendung von KS-IL2- und KS-ILl2-Fusionsproteinen für die Behandlung von LLC-Ep-Tumoren.
Weiblichen C57B1/6-Mäuse wurden subkutan im mittleren Teil des Rückens LLC-Ep-Zellen (5 × 10⁵ pro Maus) injiziert, die in Zellkultur gezogen wurden. Nach etwa zwei Wochen wurden Tiere mit tastbaren Tumoren im Bereich von 150 – 400 mm³ in vier Gruppen unterteil, mit einer gleichen Verteilung der Tumorgrößen zwischen den Gruppen. Die Tiere wurden wie folgt behandelt: in Gruppe 1 erhielten die Tiere nur PBS (Kontrollgruppe); in Gruppe 2 erhielten die Tieren nur das huKS-muγ2amuIL2-Fusionsprotein; in Gruppe 3 erhielten die Tiere nur das huKS-muγ2amuIL 12-Fusionsprotein; und in Gruppe 4 erhielten die Tiere sowohl das huKSmuγ2a-muIL2- wie auch das huKS-muγ2a-muIL 12-Fusionsprotein. Die Tumorgröße wurde durch volumetrische Messungen überwacht, bis die Tiere in der Kontrollgruppe moribund wurden und euthanasiert wurden. Die Tumorvolumina wurden mit Schieblehren gemessen und als V = 4 n/3 (0,5L x 0,5W x 0,5H) berechnet, wobei L die Länge, W die Weite und H die Höhe des Tumors ist.
Die Ergebnisse sind in 3 zusammengefasst. Mit PBS behandelte Mäuse werden durch offene Diamanten dargestellt, mit 15 μg/Tag huKS-muγ2a-muIL2-Fusionsprotein behandelte Mäuse werden durch geschlossene Quadrate dargestellt, mit 10 μg/Tag eines huKS-muγ2a-muIL 12-Fusionsprotein behandelten Mäuse werden durch geschlossene Dreiecke dargestellt, und mit einer Kombination aus 7,5 μg/Tag des huKS-muγ2a-muIL2-Fusionsproteins und 5 μg/Tag des huKS-muγ2amuIL12-Fusionsproteins behandelte Mäuse werden durch Kreuze dargestellt.
Wie in 3 dargestellt, verzögerte oder verminderte das huKS-muγ2a-muIL2-Fusionsprotein (15 μg über 5 aufeinanderfolgende Tage) das Wachstum der LLC-Ep-Tumore nicht (geschlossene Quadrate). Bei Mäusen, die mit dem huKS-muγ2amuIL 12-Fusionsprotein allein mit 10 μg pro Dosis über fünf aufeinanderfolgende Tage behandelt wurden, wurde nur eine geringfügige Antitumorwirkung beobachtet (geschlossene Dreiecke). Wurden die beiden Fusionsproteine jedoch kombiniert unter Verwendung der Hälfte der jeweils ursprünglichen Mengen (7,5 μg huKSmuγ2a-muIL2 bzw. 5 μg huKS-muγ2a-muIL12), wurde eine auffallende Wachstumsverzögerung (Kreuze) beobachtet, was einen synergistischen Effekt zwischen den beiden Fusionsproteinen andeutet.
Beispiel 4. Thrapie unter Verwendung eines Antikorper-Cytokin-Fusionsproteins und einer Kombination aus Angiostatin und Endostatin.
Weiblichen C57B1/6-Mäuse wurden subkutan im mittleren Teil des Rückens LLC-Ep-Zellen (5 × 10⁵ pro Maus) injiziert, die in Zellkultur gezogen wurden. Nach etwa zwei Wochen wurden Tiere mit tastbaren Tumoren im Bereich von 150-400 mm³ in vier Gruppen unterteilt und wie folgt behandelt: (1) Tiere, die nur PBS erhielten; (2) Tiere die eine Mischung aus muFc-Angio und muFc-Endo erhielten; (3)Tiere, die huKS-muγ2a-muIL2-Fusionsprotein erhielten; und (4) Tiere, die sowohl das huKSmuγ2a-muIL2-Fusionsprotein wie auch die Mischung aus muFc-Angio und muFc-Endo erhielten. Die Tiere wurden mit ihren jeweiligen Behandlungen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen injiziert.
MuFc-Angio und muFc-Endo werden den tumortragenden Mäusen in einer Dosis von 5 mg/kg verabreicht. Tiere, die das huKS-muγ2a-muIL2-Fusionsprotein erhielten, wurden mit täglichen Dosen von 10 μg huKS-muγ2a-muIL2 über insgesamt 5 Tage behandelt. Das Tumorwachstum wurde mittels volumetrischer Messungen. überwacht.
Es wird erwogen, dass die Behandlung mit der Mischung aus muFc-Angio und muFc-Endo allein die LLC-Tumore über eine Behandlungsdauer von zwei Wochen wirksam schrumpfen lassen wird. Es ist jedoch zu erwägen, dass diese Behandlung über einen kurzen Zeitraum hinweg, zum Beispiel fünf Tage, nicht so wirksam sein wird. Es ist auch zu bedenken, dass die mit dem muKS-muIL2-Fusionsprotein allein behandelten Tiere eine minimale Antitumoraktivität zeigen werden. Es ist jedoch zu bedenken, dass die Gruppe, die sowohl das huKS-muγ2a-muIL2-Fusionsprotein wie auch die Mischung aus muFc-Angio und muFc-Endo erhält, sowohl verglichen mit der muFc-Angio- und muFc-Endo-Gruppe wie auch der huKS-muγ2a-muIL2-Fusionsproteingruppe ein deutlich vermindertes Tumorwachstum zeigen wird.
Beispiel 5 Kombinationstherapie mit Antikorper-Cytokin-Fusionsprotein und Endostatin.
Maus-CT26-Karzinomzellen, die humanes EpCAM exprimieren, wurden subkutan in die geschorenen Rücken von BALB/c-Mäusen injiziert (2 × 10⁶ Zellen pro Injektion). Wenn die Tumore eine Größe von 100-200 mm³ erreichten (etwa 7 bis 14 Tage), wurden die Mäuse willkürlich in vier Gruppen, 4 Mäuse pro Gruppe eingeteilt. Gruppe 1 erhielt täglich intravenöse Injektionen von 0,2 mL PBS. Gruppe 2 erhielt täglich intravenöse Injektionen von muFc-muEndostatin (320 μg/Maus) in PBS. Gruppe 3 erhielt täglich intravenöse Injektionen von huKS-huγ4-huIL2-Fusionsprotein (10 μg/Maus) in PBS über nur 5 Tage. Gruppe 4 erhielt täglich intravenöse Injektionen einer Kombination aus huKS-huγ4-huIL2 (10 μg/Maus) und muFc-muEndo (320 μg/Maus) in PBS über 5 Tage und anschließend tägliche Injektionen von muFc-muEndo (320 μg/Maus) in PBS. Tumorvolumina wurde wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen.
Die Ergebnisse sind in 4 zusammengefasst. Mit PBS behandelte Mäuse werden durch geschlossene Diamanten dargestellt, mit muFc-muEndo-Fusionsprotein behandelte Mäuse werden durch geschlossene Quadrate dargestellt, mit einem huKS-huγ4-huIL2-Fusionsprotein behandelte Mäuse werden durch geschlossene Diamanten dargestellt, und mit einer Kombination aus muFc-muEndo-Fusionsprotein und huKS-huγ4-huIL2-Fusionsprotein behandelte Mäuse werden durch Kreuze dargestellt.
4 zeigt, dass die Kombination von Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein und dem antiangiogenetischen Protein muFc-muEndo jedem Wirkstoff allein überlegen war. Nach Behandlung für 19 Tage, betrug das T/C-Verhältnis (mittlere Tumorgrößen in der Behandlungsgruppe/mittlere Tumorgrößen in der Kontrollgruppe) für die Kombinationstherapie aus huKS-huγ4-huIL2 und muFc-muEndo 0,25, was eine deutliche Verbesserung gegenüber dem T/C von 0,31 für huKS-huγ4-huIL2 und 0,42 für muFc-muEndo ist.
Beispiel 6 Kombinationstherapie mit Antikorper-Cytokin-Fusionsprotein und Indometacin
Weiblichen C57B1/6-Mäuse wurden subkutan im mittleren Teil des Rückens LLC-Ep-Zellen (2 × 10⁶ pro Maus) injiziert, die in Zellkultur gezogen wurden. Wenn die Tumore 600-1200 mm³ erreichten, wurden die Mäuse geopfert. Die über dem Tumor liegende Haut wurde mit Betadin und Ethanol gereinigt, die Tumore herausgeschnitten und nekrotisches Gewebe verworfen. Eine Suspension aus Tumorzellen in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung wurde hergestellt, indem ein lebensfähiger Tumor durch ein Sieb und dann durch eine Reihe von immer kleiner werdenden hypodermischen Nadeln mit 22- bis 30-Gauge passiert wurde. Die Zellen wurden auf eine Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen/ml eingestellt und auf Eis gesetzt. C57BL/6-Mäusen wurden dann 0,1 mL der frisch suspendierten Zellen (1 × 10⁶ Zellen/Maus) in die proximale Mittellinie der subkutanen Dorsa injiziert.
Wenn die Tumore eine Größe von 100-200 mm³ erreichten (etwa 7 bis 14 Tage), wurden die Mäuse willkürlich in vier Gruppen, 5 Mäuse pro Gruppe eingeteilt. Gruppe 1 erhielt intravenöse Injektionen von 0,2 mL PBS täglich: Gruppe 2 erhielt 5 tägliche intravenöse Injektionen von huKS-huγl-huIL2 (25 μg/Maus) in PBS. Gruppe 3 erhielt während der Behandlungsdauer Indometacin oral im Trinkwasser (20 μg/mL, oder etwa 60-70 μg Indometacinkonsum täglich pro Maus). Gruppe 4 erhielt 5 tägliche intravenöse Injektionen von huKS-huγl-huIL2 (25 μg/Maus), und Indometacin oral im Trinkwasser (20 μg/mL) über die Behandlungsdauer hinweg. Tumorvolumina wurde wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen.
Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Mit PBS behandelte Mäuse werden durch geschlossene Diamanten dargestellt, mit huKS-huγ1-huIL2-Fusionsprotein behandelte Mäuse werden durch geschlossene Quadrate dargestellt, mit einem Indometacin behandelte Mäuse werden durch geschlossene Dreiecke dargestellt, und mit einer Kombination aus huKS-huγl-huIL2-Fusionsprotein und Indometacin behandelte Mäuse werden durch Kreuze dargestellt.
5 zeigt, dass die Kombination von Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein und der antiangiogenetischen chemischen Verbindung Indometacin jedem Wirkstoff allein überlegen war. Nach Behandlung für 22 Tage betrug das T/C-Verhältnis für die Kombinationstherapie aus huKS-huγ4-huIL2 und Indometacin 0,40, was eine deutliche Verbesserung gegenüber dem T/C von 0,61 für huKS-huγ4-huIL2 und 0,60 für Indometacin darstellt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung, enthaltend in Kombination: (i) ein Fusionsprotein aus (a) einem Immunglobulinmolekül, das von aminoterminaler zu carboxyterminaler Richtung eine variable Domäne einer schweren Immunglobulinkette (VH), die das Antigen binden kann, eine konstante Domäne 1 einer schweren Immunglobulinkette (CH1) und eine konstante Domäne 2 einer schweren Immunglobulinkette (CH2) umfasst, und (b) einem Cytokin, das an den Carboxyterminus der Immunglobulindomäne fusioniert ist, die eine Immunantwort gegen das Antigen in dem Säuger induzieren kann, wobei das Fusionsprotein eine Immunantwort gegen ein Antigen eines zuvor ausgewählten Zelltyps in einem Säuger induziert, und (ii) einen Angiogeneseinhibitor, der aus der Gruppe bestehend aus (a) Endostatin (b) Angiostatin (c) einem Peptid mit Bindungsaffinität zu avβ3-Integrin und (d) einem Antikörper mit Bindungsaffinität zu avβ3-Integrin, ausgewählt ist, in einer Menge, in der der Angiogeneseinhibitor die durch das Fusionsprotein induzierte Immunantwort verglichen mit nur dem Fusionsprotein verstärkt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Immunglobulindomäne ferner eine konstante Domäne 3 einer schweren Immunglobulinkette (CH3) zwischen der CH2-Domäne und dem Cytokin enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Immunglobulinmolekül ferner eine leichte Immunglobulinkette (VL) enthält, die sich mit der VH-Domäne unter Bildung einer einzelnen und vollständigen Stelle zum Binden des Antigens vereinigt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Cytokin des Fusionsproteins aus der Gruppe bestehend aus Tumornekrosefaktor, einem Interleukin, einem koloniestimulierenden Faktor und einem Lymphokin ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Interleukin aus der Gruppe IL-2, IL-4, IL-7 und IL-12 ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der zuvor ausgewählte Zelltyp eine Krebszelle ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels, das in einem Säuger die zytozide Immunantwort gegen einen zuvor ausgewählten Zelltyp verstärkt.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei sich das Arzneimittel zur Behandlung von Krebs eignet.