RU2129018C1 - Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция - Google Patents

Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция Download PDF

Info

Publication number
RU2129018C1
RU2129018C1 RU94045281A RU94045281A RU2129018C1 RU 2129018 C1 RU2129018 C1 RU 2129018C1 RU 94045281 A RU94045281 A RU 94045281A RU 94045281 A RU94045281 A RU 94045281A RU 2129018 C1 RU2129018 C1 RU 2129018C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
mab
fragment
immunoconjugate
cells
Prior art date
Application number
RU94045281A
Other languages
English (en)
Other versions
RU94045281A (ru
Inventor
фон Хеген Илка
Хофманн Уве
Еггле Карлотта-Сильвия
Штриттматтер Вольфганг
Штадльмюллер Йорг
Матцку Зигфрид
Original Assignee
Мерк Патент Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мерк Патент Гмбх filed Critical Мерк Патент Гмбх
Publication of RU94045281A publication Critical patent/RU94045281A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2129018C1 publication Critical patent/RU2129018C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/028—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a herpesvirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к новым слитым белкам, и может быть использовано при лечении опухолевых заболеваний. Иммуноконьюгат представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент, соединенный с биологически активным лигандом. Антитело или его фрагмент направлены против опухолевой клетки, несущей антигенный эпитон рецептора эпидермального фактора роста. В качестве биологически активного лиганда использован цитокин. Для получения иммуноконьюгата используют слияние ДНК-последовательности, кодирующей антитело или его фрагмент, и ДНК-последовательности, кодирующей биологически активный лиганд. Полученную конструкцию вводят в вектор экспрессии. Вектор экспрессии культивируют в хозяйских клетках. Изобретение может быть использовано для лечения любых видов опухолей. 3 с. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.

Description

Изобретение относится к новым слитым белкам, которые включают в себя опухолеассоциированный и направленный против клетки-мишени элемент, предпочтительно моноклональное антитело или его фрагмент, распознающие молекулу, экспрессирующуюся преимущественно на опухолевых клетках человека, например, такую, как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR); и биологически активный лиганд, например, такой, как фактор роста и/или фактор дифференцировки. Полученный гибридный белок может быть использован для доставки биологически активного лиганда к специфическим клеткам-мишеням или тканям-мишеням. Новые иммуноконъюгаты могут быть использованы для лечения опухолевых заболеваний.
Для лечения раковых заболеваний было разработано множество различных терапевтических методов. В последние годы были проведены клинические испытания с использованием моноклональных антител, которые обладают способностью к специфическому или преимущественному распознаванию молекул клеточной поверхности, экспрессируемых на злокачественных клетках. Целью описанной методики является индукция антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплект опосредованной цитотоксичности (CDC) для удаления опухолевых клеток. Второй способ, разработанный за последнее время, заключается в цитокин-опосредованной активации иммунного ответа. Такая цитокин-индуцированная противоопухолевая активность может быть опосредована:
1) прямым цитотоксическим/цитостатическим воздействием цитотоксина на рост опухоли%
2) "опухоль-антиген" - неспецифическими механизмами, такими, как LAK-активность, или моноцит/макрофаг-опосредованная цитотоксичность;
3) "опухоль-антиген" - специфическими иммунными реакциями, опосредованными CD4 и CD8-положительными T-клетками. В этом случае системный иммунитет против опухолей наблюдался на моделях животных.
К сожалению, токсичность цитокинов таких, как ШД-2 или TNFα , не позволяет широко использовать их для системного введения (Rubin, Cancer Inverst., II, 460-172, 1990, Balkwill Nature 361: 206-207, 1993). Для обеспечения достаточной концентрации цитокинов в месте локализации опухоли их необходимо вводить в довольно высоких дозах, и эти дозы, как правило, превышают предельно допустимые дозы. Отсюда очевидно, что негативный эффект применения обусловлен, в основном, их системным введением; однако возможность использования цитокинов при лечении опухолей не вызывает сомнений. На моделях животных было проиллюстрировано, что присутствие in situ цитокина, обусловленное либо внутриопухолевой инъекцией, либо секрецией трансфецированных опухолевых клеток, может приводить к регрессии опухоли (Носок и др., PNAS, 90: 2774 - 2778, 1993; Colombo и др., Cancer Res. 52: 4853 - 4857, 1992; Mcbride и др., Cancer Res. 52: 3931 - 3937, 1992; Tepper и др., Science 287: 548 - 551, 1992; Mullen и др., Cancer Res. 52: 6020 - 6024, 1992; Blankenstein и др., J.Exp. Med. 173: 1047 - 1052, 1991; Gansdbacher и др. J.Exp Med. 172: 1217 - 1224, 1990). В этих системах цитокины не ослабляют опухолевую пролиферацию, но активируют и сильную антиопухолевую реакцию. Поэтому, физическая комбинация эффекторной молекулы и элемента, направленного против мишени, должна способствовать снижению периферического количества биологически активного лиганда и увеличению его количества внутри опухоли. Кроме того, эти молекулы могут быть также направлены на одиночные опухолевые клетки или микро-метастазы.
Указанный биологически активный лиганд, обеспечивающий антитело-направленную доставку конъюгата к клеткам-мишеням, должен индуцировать деструкцию клетки-мишени либо непосредственно, либо посредством создания условий, летальных для клетки-мишени. Таким биологически активным лигандом может быть цитокин, например, IL-1, LI-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFN, TNFα, или CSF. Было показано, что эти цитокины обладают либо непосредственным противоопухолевым действием, либо способностью активировать защитные механизмы хозяина (Mire-Sluis TIBTECH 11:74-77, 1993; Colombo и др., Cancer Res. 52: 4853-4857, 1992; Thomas $ Balkwill, Pharmac Ther. 52:307.
Например, IL-2 является, как предполагают, центральным медиатором иммунного ответа. Было показано, что IL-2 стимулирует пролиферацию T-клеток и NK-клеток (природных киллеров), а также индуцирует лимфокин-активированные клетки-киллеры (LAK). IL-2 индуцируют пролиферацию T-лимфоцитов, вызывающих инфильтрацию опухоли. Кроме того, IL-2 усиливают цитотоксичность T-клеток и моноцитов. IL-2 индуцируют каскад цитокинов, секретируемых T-клетками, NK-клетками и моноцитами, что способствует дополнительному потенцированию иммунной реакции.
TNFα находит широкое применение в опухолевой терапии, главным образом, благодаря своей непосредственной цитотоксичности в отношении некоторых опухолевых клеток, и способностью индуцировать геморрагический регресс опухоли. Помимо этого, TNFα способствует усилению иммунного ответа, поскольку он является костимулирующим фактором пролиферации T-клеток, и индуцирует экспрессию антигенов ГКС класса I и класса II, а также секрецию TNFα , IFN и IL-1 макрофагами. IL-4 был первоначально описан как фактор роста B-клеток. В последующих исследованиях было показано, что IL-4 стимулирует антиген-специфические цитотоксические T-клетки, и оказывает специфическое воздействие на T-клетки, подобные LAK-клеткам, а не на NK-клетки, подобные LAK-клеткам. IL-4 ингибирует рост клеток меланомы человека и усиливает экспрессию их ГКС класса I и класса II. Факт индуцирования макрофаг-опосредованного противоопухолевого действия IL-4 остается пока спорным.
IL-7 представляет собой фактор роста пре-B-клеток, а также периферических CD4- и CD8-положительных T-клеток. IL-7 непосредственно увеличивает цитотоксичность CЭ8-положительной субпопуляции T-клеток. помимо этого, IL-7 способствует продуцированию IL-1, IL-6 и TNFα периферическими моноцитами. in vitro, противоопухолевая активность моноцитов/макрофагов может быть стимулирована вышеуказанным фактором IL-7, и возможно опосредована цитокинами, такими, как TNFα .
Эпидермальный фактор роста (EGF) представляет собой полипептидный гормон, который является митогенным для эпидермальных и эпителиальных клеток. При взаимодействии EGF с чувствительными клетками, он связывается с мембранными рецепторами (EGFP). EGFP представляет собой трансмембранный гликопротеин (около 170 кДа), и является генным продуктом c-evb-B протоонкогена.
Было обнаружено, что мышиное моноклональное антитело MAb 425, продуцируемое против клеточной линии карциномы А 431 человека (АТСС CPI 1555), связывается с эпитопом полипептида на внешнем домене EGFP. Как было установлено, это антитело ингибирует связывание EGF, опосредует in vitro - цитотоксичность по отношению к опухолям, и подавляет опухолевый рост in vitro клеточных линий, происходящих от эпидермальной и колоректальной карциномы (Rodeck и др. , 1987, Cancer Res. 47, 3692). Гуманизированные и химерные варианты MAb 425 описаны в WO 92/15683.
В литературе были описаны иммуноконъюгаты "антитело-цитокин" в различных комбинациях, предназначенных для направленной доставки активных белков к тканям-мишеням. Il-2 был объединен со специфическим антителом против карциномы человека L6 (Fell и др., 1991, J. Immunol. 146: 2446 - 2452, EP-OS-0439095), или с антителом против ганглиозида CD2 (Gillies и др., 1992, PN AS 89: 1428-1432, WO 92/08495). Были также генерированы иммуноконъюгаты, состоящие из антиданзилового антитела и IGFI, и обеспечивающие направленную доставку гормонов к тканям-мишеням (Shin & Morrison 1990, PNAS 87: 5322-5326, WO 91/14438).
Таким образом, целью настоящего изобретения является продуцирование антител или их фрагментов, содержащих (I) эпитоп, направленный против EGFP - антигена на поверхности опухолевой клетки, и (2) биологически активной лиганд, обладающий высокой степенью способности индуцировать цитотоксичность, и тем самым, интенсифицировать противоопухолевый эффект in situ.
Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгатам, включающим в себя часть моноклонального антитела, или, по крайней мере, его сайт распознавания антигена, либо полное моноклональное антитело; и биологически активный лиганд. Конструкции, кодирующие указанные иммуноконъюгаты, получают с использованием техники рекомбинантных ДНК. Эти иммуноконъюгата содержат вариабельную область тяжелой цепи антитела и СР1-домен константой области (антитело-СР1-конъюгат), или CH1- и СР2-домены контактной области (антитело-CH2-конъюгат), или CH1-, CH2- или CH3-домены контактной области (антитело-CH3-конюъгат), связанные с биологически активным лигандом. Кроме того, могу быть генерированы иммуноконъгаты, которые содержат соответствующую легкую цепь, и которые направлены на антиген-несущие клетки и способны обеспечивать доставку активного лиганда к контрольному участку организма (фиг. 1 a-c).
С помощью имммуноконъюгатов настоящего изобретения могут быть обнаружены и подвергнуты успешному лечению такие опухоли, как меланома, глиома и карцинома.
В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является получение иммуноконъюгата, состоящего из (I) моноклонального антитела или его фрагмента, направленного против опухолевой клетки, несущей антигенную детерминанту (эпитоп) рецептора эпидермального фактора роста (EGFR); и (2) биологически активный лиганд, предпочтительно, цитокин, который сцеплен с указанным антителом или его фрагментом, и обладает цитотоксической способностью специфически лизировать опухолевую клетку in situ, или индуцировать опухолеспецифический иммунный ответ.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, цитокины выбирают из TNFα , IL-2, IL-4 и IL-7.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, антитело или его фрагмент происходит от мышиного, гумманизированного или химерного MAb 425.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, иммуноконъюнгатами является MAb 425-CH1-INF, MAb 425-CH2-INF и MAb 425-CH3-INF, MAb 425-CH1-IL2 и MAb 425-CH2-IL2, MAb 425-CH3-IL-7, MAb 425-CH2-IL-7 и MAb 425-CH3-IL-7.
Кроме того, целью настоящего изобретения является разработка способа получения иммуноконъюгата, определенного выше и в нижеприведенной формуле изобретения, который осуществляют с использованием организма-хозяина, и который заключается в том, что: получают гибридную конструкцию, содержащую ДНК-последовательность, кодирующую антитело или его фрагмент, и биологически активный лиганд; полученную конструкцию вставляют в экспрессирующий вектор, которым трансформируют указанный хозяйский организм; хозяйские клетки культивируют в питательном растворе; и гибридный белок экспрессируют.
А предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используется технология, в которой ДНК-последовательности, кодирующие антитело или его фрагмент, и биологически активный лиганд, сливают на одноцепочечной ДНК с использованием олигонуклеотида, комплеменатарного ДНК-последовательности нужной для слияния.
Кроме того, целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей по крайней мере один иммуноконъюгант, определенный выше и в формуле изобретения, и физиологически приемлемый носитель.
И наконец, еще одной целью настоящего изобретения является использование иммуноконъюгатов, определенных выше и в формуле изобретения, для изготовления противоопухолевого лекарственного средства.
Было обнаружено, что в случае использования иммуноконъюгатов "антитело-CH2" и "антилтело-CH3", например, таких, как МAb 425-CH2-TNFα и MAb 425-CH3-TNFα , наблюдается особенно высокая степень индукции клеточной цитотоксичности по сравнению с неконъюгированным TNFα . Этот факт, вероятно, обусловлен сочетанием связывающих свойств, индуцирования ACC (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности) константными областями моноклонального антитела, и активности цитокинов.
Преимущество конъюгатов "антитело-CH1" настоящего изобретения заключается в небольшом размере из молекулы, а также в их способности экспрессироваться в прокариотах. Малый размер молекулы облегчает проникновение конъюгата в ткани (опухоль).
Кроме того, иммуноконъюгаты настоящего изобретения обнаруживают хорошую способность к связыванию и пролиферации по сравнению с моноклональным антителом (предпочтительно MAb 425) как таковым или его фрагментами.
Материалы и методы.
Моноклональные антитела.
MAb 425 представляет собой мышиное моноклональное антитело IoG1, продуцируемое против клеточной линии карциномы А431 человека (АТСС CPL 1555). MAb 425 связывается с полипептидным эпитопом внешнего домена EGF-рецептора человека и конкурирует за связывание с EGF. Было обнаружено, что MAb 425 опосредует опухолевую цитотоксичность in vitro, и подавляет in vitro рост клеток эпидермальной и колоректальной карциномы (Rodeck и др., 1987, Cancer Res 47:3692). Гуманизированные и химерные варианты MAb 425 были описаны в WO 92/15683.
Цитокины.
Цитокинкодирующие кДНК поставлялись от фирмы British Biotechnology Limited (Herrmann Biermann GMBH, Ban Nauheim FRG:
чел. IL -2 BBG30, чел. IL-4 BBG15, чел. IL-7 BBG 43, чел. TNF BBG 18). В коммерчески доступных кДРК отсутствует сигнальная последовательность, необходимая для выделения белка. Цитокин-кодирующие кДНК могут быть генерированы из мРНК, выделенной из цитокин-продуцирующих клеток.
Векторы.
pUC19 является одним из серии родственных мультикопийных E.coli-плазмидных векторов клонирования и содержит части pBP322 и M13 mp19. pUC19 содержит индуцибельный lac-бактериальный промотор-оператор и расположенный за ним множественный клонирующий сайт (Yanisch-Perron и др., Gene 33: 103-109, 1985). Векторы pUC являются коммерчески доступными (например, New England Biolahs). Фазмидные векторы pBlue script KS/SK + и KS/SK - происходит от p C19. Эти векторы являются коммерчески доступными (Stratagene).
Эукариотический экспрессирующий вектор pHCM V (Gil Lies и др., 1983, Cell 33:717) содержит сайт инициации репликации обезьяньего вируса 40 (SV40) и область промотора и энхансера цитомегаловируса человека. Указанная область просмотра/энхансера расположена за сайтом мультиклонирования (mcs) для введения экспрессируемых генов. В этом векторе для генерирования гибридного белка с тяжелой цепью MAb 425 были объединены химерная форма вариабельной области тяжелой цепи m AB425 и области C γ Δ Sac 11, сцепленная с эффекторной молекулой в конце домена CH1, CH2 или CH3, соответственно. Гибридная цепь Ig может быть включена в иммуноконьюгат путем ее объединения с соответствующей легкой цепью, в результате чего образуется моновалентная область связывания с антигеном, которая может быть затем использована для продуцирования иммуноконьюгата, специфического для антигена-мишени (фиг. 1). Конструкция с тяжелой и легкой цепью могут быть введены в тот же самый или в разные векторы.
Вектор для экспрессии в прокариотах получают на основе вектора pSW1 (Ward и др., Nature 341:544-546, 1989), который происходит от вектора pUC19. pSW1 содержит последовательность, колирующую лидерный пептид бактериального peIB-гена от Erwinia carotovra (Lei и др., J. Bact 169: 4379 - 4383, 1987). Чужеродные ДНК могут быть введены с сохранением рамки считывания ниже лидерной последовательности peIB для регулирования экспрессии белка в периплазме.
Краткое описание чертежей и таблиц.
Таблица I. PCP-праймеры, используемые для генерирования MAb 425-цитокин-гибридных белков (зукариотическая экспрессия).
* Обратный праймер, гибридизирующийся с векторами (Stratagene) SR+/- и KS+/- (коммерческий продукт);
** Этот праймер гибридизируется с константной областью CgL, включая уникальный Sac 11-сайт;
*** Обратный праймер, гибридизирующийся с векторами, происходящими из М13 (коммерческий продукт).
Таблица II. PCR-праймеры, используемые для генерирования MAb 425-цитокин-гибридных белков (прокариотическая экспрессия)
Фиг. 1. Модель иммуноконьюгатов "антитело-цитокин"
C = цитокин; VH = вариабельная область тяжелой цепи; VL = вариабельная область легкой цепи; CH = константная область тяжелой цепи; CL = константная область легкой цепи. (а) конъюгат "антитело-CHI"; (b) конъюгат "антитело-CH2"; (c) конъюгат "антитело-CH3".
Фиг. 2. Связывание иммуноконъюгатов с EGF-рецептором (EGFR) в EGFR- специфическом ELISA - анализе.
Супернатанты кратковременно трансфицированных клеток CO S-7 анализировали на содержание иммуноконъюгата. Вертикальная ось:% оптической плотности при 490 нм; горизонтальная ось: разведение супернатанта (log.2).
MAb 425 CHI-TNFα (заштрихованные (cilled) кружочки), MAb 425 CH2-TNFα (заштрихованные квадраты), MAb 425 CH3-TNFα (заштрихованные треугольники), MAb 425-контроль (заштрихованные ромбы); MAb 425 FAb-контроль (перевернутый заштрихованный треугольник); MAb 425 F(ab')2 в своей первоначальной форме (очищенный белок) (заштрихованный шестиугольник).
Фиг. 3А. IL-2-активность иммуноконъюгата "MAb 425-CHI-IL-2", экспрессированного в клетках COS-7.
Клетки CTLL-2 использовали в качестве индикаторной клеточной линии, пролиферативная активность серийно разведенного COS-супернатанта, содержащего MAb 425-CHI-II-2, показана на левой панели (заштрихованные кружки). В качестве контроля использовали COS-супернатант, содержащий MAb 425 Fab-контроль (незаштрихованные кружки). Пролиферативный ответ клеток CTLL-2 на активацию рекомбинантным коммерческим IL-2-белком или без IL-2 (KO) показан на правой панели.
Фиг. 3B. IL-2-активность иммуноконъюгата "MAb 425-CHI-IL-2", экспрессированного в E.coli.
Клетки CTLL-2 использовали в качестве индикаторной клеточной линии. Пролиферативная активность серийно разведенного иммуноконъюгата MAb 425-CHI-IL-2, экспрессированного в E.coli, и аффинноочищенного на идиотипической колонке против MAb 425, показана на левой панели (заштрихованные треугольники). В качестве контроля использовали COS-супернатант, содержащий MAb 425-CHI-IL-2 (зачерненные (closed)кружки). Буфер для диализа - зачерненные квадраты. Для того, чтобы убедиться, что буфер не влияет на IL-2-активность, буфер для диализа титровали в присутствии постоянной концентрации IL-2 (I ед. /мл) (заштрихованные перевернутые треугольники). Пролиферативный ответ клеток CTLL.2 на активно коммерчески рекомбинантным белкам с IL-2 или при отсутствии IL-2 (КО) показан на правой панели.
Фиг. 3C. Индуцирование TIL-пролиферация с помощью иммуноконъюгата MAb 425-CHI-IL-2.
Лимфоциты, вызывающие инфильтрацию меланомы, культивировали в отсутствии (КО) или в присутствии серийно разведенных COS-супернатантов, содержащих иммуноконъюгат 425-CHI-IL-2 (левая панель). Пролиферативный ответ TII на активацию рекомбинантным коммерческим IL-2 показан на правой панели.
Фиг. 4. Индуцирование HPBL-пролиферации с помощью иммуноконъюгата MAb 425-IL-4
PHA - активированные HPBL культивировали в присутствии серийно разведенных COS - супернатантов, содержащих MAb 425-CH2-IL-4 (зачерненные кружочки), MAb 425-CH3-IL-4 (зачерненные треугольники) - гибридные белки. Супернатанты, содержащие MAb 425 (зачерненные квадраты), IL -4 (зачерненный ромб), и векторный контроль (зачерненный перечеркнутый треугольник), использовали в качестве контроля. Пролиферативный ответ HPBL на активацию рекомбинатным коммерческим IL-4 и при отсутствии фактора роста (КО) показан на правой панели.
Фиг. 5. Цитотоксичность иммуноконъюгата MAb 425-TNFL по отношению к клеткам EHI 164
Клеточную линию TNFL-чувствительной мышиной фибросаркомы WEHI 164 культивировали 48 часов в присутствии серийно разведенных COS-супернатантов (левая панель), содержащих 425-CHI-TNFα-иммуноконъюгат (заштрихованные квадраты) или 425-CH2-TNFα-иммуноконъюгат (заштрихованные треугольники), или MAb 425Fab-контроль (заштрихованные кружки). Ингибирование роста индикаторных клеток, индуцированного коммерчески рекомбинантным TNFα-человека, проиллюстрировано на правой панели.
Фиг. 6. Цитолиз опухолевых клеток лимфоцитами периферической крови, опосредованной MAb 425 - TNFL-иммуноконъюгатом
Неактивированные лимфоциты периферической крови (PBMC) использовали в качестве эффекторных клеток и культивировали вместе с аллогенными EGF-R-положительными 51Cr-меченными клетками-мишенями C8161 в отношении эффектор/мишень = 30:1. Процент специфического лизиса вычисляли после 18-часового совместного культивирования в отсутствие или в присутствии серийно разведенных COS-супернатантов, содержащих иммуноконъюгат MAb 425-CH3-TNFα (заштрихованные столбцы). Рекомбинатный TNFα (Genzym) был экспрессирован в E.coli как 36 кДа-димер (точечные столбцы).
Другие микроорганизмы, клеточные линии, плазмиды, промоторы маркеры резистентности, сайты инициации репликации, рестрикционные сайты или другие фрагменты векторов, которые упоминаются в настоящем описании, являются коммерчески доступными, либо они могут быть продуцированы стандартными методами. Если это не оговорено особо, то все указанные элементы могут быть использованы лишь в иллюстрированных целях, и в основном, не относятся к настоящему изобретению, причем, они могут быть заменены другими подходящими элементами и биологическими материалами, соответственно.
Способы, относящиеся к настоящему изобретению, подробно описаны ниже. Другие способы, которые являются стандартными и достаточно хорошо известными специалистам и которые упоминаются в настоящем описании, более подробно описываются в цитируемых работах, патентных заявках и в специальной литературе (см. , например, "Antibodies, A Laboratory Manual, Harlon, Lane, Cold Spring Harbor, 1988).
Экспрессия гибридных белков в эукариотических клетках.
Конструирование экспрессирующих векторов для эукариотической экспрессии Fab 425-цитокин-гибридного белка.
Слияние MAb 425 и цитокинов с использованием техники выпетливания.
Генерирование TNFα-конструкций.
Sac11/Xba1-фрагмент Sac11-cγ1- клона вставляли в вектор Bluescript SK+, содержащий цитокин-кодирующие последовательности, такие, как TNFα-кДНК.
TNFα-кДНК вводили между сайтами Smal и EcoRI. Эту конструкцию получали в виде одноцепочечной ДНК путем добавления соответствующего фага-хелпера. Домен CH2 или CH3 сливали с сохранением рамки считывания к 5'-концу TNFα-колирующей последовательности. Олигонуклеотиды
Figure 00000002

являются гомологичными 3'-концу CH2-домена и CH3-домена, соответственно, и 5'-концу TNA α-кодирующей последовательности. Одноцепочечные ДНК-последовательности соединяли друг с другом посредством олигонуклеотида, а нежелательные последовательности, расположенные между ними, из конструкции удаляли. Олигонуклеотиды имели противоположную ориентацию, поскольку верхнюю цепь продуцировали как одноцепочечную ДНК.
К полученной ДНК достраивали вторую цепь с помощью секвеназы-полимеразы. Этот фермент не подвержен ошибкам, как ДНК-полимераза Amplitag, а поэтому была определена лишь ДНК-последовательность области соединения выделенных клонов. Клоны с правильной последовательностью были лигированы с последовательностями, необходимыми для генерирования полного 425-гибридного белка, и клонированы в вектор pHCMV для экспрессии в эукариотических клетках.
Генерирование IL-4-конструкций.
Для генерирования указанных конструкций, полный ΔSac11-cγ1-клон вставляли в Bluescript RS+ в качестве Kpnl/Sall -фрагмента. IL-4 клонировали как Hind 111/EcoRL -фрагмент в тот же самый вектор. Генерирование гибрида осуществляли так же, как и для TNF-конструкций, но с использованием следующих олигонуклеотидов:
Figure 00000003

для слияния с CH2- и CH3-доменом, соответственно.
Клоны с правильной последовательностью объединяли с последовательностями, необходимыми для генерирования полного mab 425-гибридного белка, и клонировали в вектор pHCM для экспрессии в эукариотических клетках.
Получение гибрида "MAb 425-цитокины" с помощью PCP-технологии.
ДНК-полимераза Amplitag подвержена ошибкам, и во избежании возможных ошибок, были определены последовательности вышеуказанных фрагментов, амплифицированных с помощью PCR-технологии. Праймеры, использованные в этих экспериментах, систематизированы в табл. 1.
Генерирование CHI-гибридных белков.
Плазмида pUH5 содержат последовательности фрагмента FAb 425 тяжелой цепи для прокариотической экспрессии и N-концевой pelB-лидерной последовательности, происходящей из Erwinia carotovora (Lei и др., J/Bact 169: 4379-4383, 1987), и обеспечивающей секрецию белка. Hind 111/Not1-фрагмент субклонировали в вектор Bluescript KS+. Цитокины IL-4 и IL-7 были амплифицированы с помощью PCP-технологии и введены в рестрикционные 5' Ncol и 3' Bam H1-сайты, соответственно. IL-2 и TNFα уже содержали 5' Hcol и 3' BamH1-сайты рестрикции. Все цитокины были клонированы в качестве Ncol/Bam H1 - фрагментов позади CHI-домена. В этих конструкциях, последовательности цитокинов были введены без сохранения рамки считывания. Поэтому, между Sall- и Ncol- сайтами рестрикции был введен адаптор (5'TGGACAAGAAAG 3'). В полученных конструкциях тяжелая цепь и цитокин были экспрессированы как гибридный белок с одной дополнительной аминокислотой (AIa), введенной последовательностью адаптора. Dra 111/BamH1-фрагменты были клонированы в экспрессирующий вектор pHCM, содержащий полный кДНК-клон тяжелой цепи MAb 425. В этой конструкции, pelB-лидерная последовательность была замена на лидерную последовательность кДНК тяжелой цепи MAb 425.
Генерирование CH2- и CH3-гибридных белков.
Sac11-cγ1-ДНК была амплифицирована с помощью PCR-технологии в двух отдельных реакциях с использованием CH2-3'-концевых праймеров, которые перекрывались (с сохранением рамки считывания) с 5'-концом соответствующего цитокина, такого, как IL-2 и IL-7. IL-2 и IL-7-кДНК-клоны были также амплифицированы с помощью PCR. Для облегчения субклонирования в SK+-вектор, а затем в экспрессирующий вектор pHCMV, в IL-2-конструкцию (у 3'-конца) были введены уникальные Not1- и Sa11-сайты, а в IL-7-конструкцию был введен уникальный Xot1-сайт. Генерирование гибрида IL-2- и IL-7-PCP-продуктов с полной ΔSac11-cγ1-областью осуществляли путем PCR-рекомбинации. Полученный BamH1/Not1-фрагмент ΔSac11-cγ'-CH2-IL-2 субклонировали в SK+, содержащий вариабельную область тяжелой цепи MAb 425. Sac11/Xba1-фрагмент ΔSa11-CH-2-IL-7 субклонировали в вектор SK+, содержащий вариабельную область тяжелой цепи MAb 425 и Sac11-cγ1-область до Sa11-сайта. В результате этой процедуры были генерированы полные MAb425-CH2-IL-2- и IL-7-гибридные гены, соответственно. Аналогичным образом был генерирован полный MAb 425-CH3-IL-2-гибридный ген за тем лишь исключением, что ΔSa11-c γ1 был амплифицирован из уникального Sac11-сайта в качестве 5'-конца. Sac11/Pst/-фрагмент MAb 425-CH2-IL-2 в SK+, содержащем CH2-IL-2-гибрид, затем заменяли Sac11/Pst-фрагментом, содержащим CH3-IL-2-гибрид. После этого полные MAb 425-гибридные гены клонировали в вектор pHCMV для экспрессии в аукариотических клетках.
Экспрессия иммуноконъюгатов.
Введение векторных конструкций в хозяйские клетки для экспрессии моновалентного иммуноконъюгата, содержащего лишь CH1-домен, или дивалентных иммуноконъюгатов, содержащих CH2-и CH2- плюс CH3-домены, может быть осуществлено путем электропорации, методами с использованием DEAE-декстрана, кальцийфосфата, липофектина, или путем слияния протопластов. При этом, может быть использован любой тип клетки-хозяина, при условии, что рекомбинантные ДНК-последовательности, кодирующие иммуноконъюгат и соответствующую легкую цепь, правильно транскрибируются в мРНК в клетках этого типа. Такими клетками-хозяевами могут быть клетки мышиной миеломы, которые не продуцируют иммуноглобулин, например, Sp2/0-AG14 (ATCC CPL 1581), P3X63Ag8.653 (ATCC CPL 1580), или клетки хомячка, такие, как CHO-K1 (ATCC CCL 61), или CHO/dhF - (ATCC CPL 9096), или ВНК-21 (ATCC CCL 10). Для кратковременной экспрессии могут быть использованы COS-1 (ATCC CPL 1650) или COS-7 (ATCC CPL 1651).
Кратковременная экспрессия иммуноконъюгатов.
Экспрессирующий вектор pHCMV содержит сайт инициации репликации обезьяньего вируса 40 (SV 40). Клеточная линия COS-7 происходит от обезьяньей клеточной линии CV-1, которая была трансформирована вирусом SV40, не содержащим точки инициации репликации. Поэтому, для улучшения продуцирования иммуноконъюгатов, амплифицировали плазмиды, содержащие точку инициации репликации вируса SV40. Через 72 часа, супернатанты собирали и анализировали на связывание с EGF-рецептором и на концентрацию цитокина.
Постоянная экспрессия иммуноконъюгатов.
Векторы, содержащие рекомбинантные конструкции, и предназначенные для экспрессии иммуноконъюгатов, вводили в соответствующие клетки-хозяева. Конструкции, содержащие тяжелую и легкую цепи могут быть введены в тот же самый вектор или в разные векторы. В последнем случае оба вектора могут нести идентичные селективные маркеры, такие, как резистентность к неомицину, или dhFr, либо два различных селективных маркера для отбора на присутствие этих векторов. Отбор на dhFR-маркер может быть осуществлен лишь в dhFr-отрицательных клеточных линиях, таких, как CHO/dhFr. Клоны анализировали на экспрессию иммуноконъюгатов с помощью EGFP-специфического анализа ELISA. Отобранные клоны подвергали дополнительной очистке путем клонирования методом серийных разведений.
Конструирование векторов для экспрессии MAb 425-CH1-цитокин-гибридного белка в прокариотах.
ДНК-последовательности, кодирующие легкую цепь MAb 425 и Fd-фрагмент тяжелой цепи, вводили в сайт множественного клонирования вектора pSWl. Перед последовательностью, кодирующей зрелую легкую цепь, и последовательностью, кодирующей зрелую тяжелую цепь, находился лидерный пептид pelB-бактериального гена. Последовательность, кодирующая тяжелую цепь, содержала 3'Ncol-сайт. Цитокин-кодирующие кДНК были модифицированы посредством PCR для введения рестрикционных Ncol (5'-конец) и Not (3'-конец)-сайтов. Гены цитокина сливали с сохранением рамки считывания непосредственно с CH1-доменом тяжелой цепи. Праймеры, используемые в этих экспериментах. Систематизированы в таблице II.
Эти векторы способны к эффективной экспрессии функциональных FAb-цитоксин-гибридных белков в E.coli. Белок-гибрид, содержащий легкую и тяжелую цепь и цитокин, локализован на дицистронной мРНК, находящейся под контролем индуцибельного Iac-промотора (Skerra и Pluckthun Science 242: 1038 - 104, 1988). Поэтому, экспрессия FAb-гибридного белка может быть индуцирована в соответствии с требуемыми условиями культивирования. Трансляция обоих белков с дицистронной мРНК способствует синтезу равных количеств Fd-IL-2-гибридного белка и легкой цепи, повышая, тем самым, вероятность правильной сборки функциональных Fab-гибридных белков. Эти два полипептида выделяются в периплазму E. coli, где происходит укладка, образование дисульфидных связей и сборка функционального FAb 425 CH1-гибридного белка. При продолжительном культивировании бактерий, белки выделяются в культуральную среду.
Экспрессия MAb 425-CH1-IL-2-гибридного белка в E. coli и его очистка.
Штаммы E. coli, подходящие для экспрессии белка, трансформировали экспрессирующими плазмидами. Клетки культивировали до уровня оптической плотности ОП580 = 0,5, и индуцировали с использованием IPTG (1 мМ). Эти клетки культивировали в течение ночи, после чего супернатанты и клетки собирали. Супернатант наносили антиидиотипическую колонку против MAb 425. Эту колонку промывали забуференным фосфатом 0,5 м NaCl, и связанные белки элюировали 100 мМ глицина 0,5 М NaCl, pH 2,5. Элюат сразу нейтрализовали 2,5 М - Трисом, pH 8. Фракции, содержащие MAb 425-CH1-IL-2, объединяли, концентрировали и диализовали против PBS.
Связывающие свойства MAb 425-иммуноконъюгатов.
Способность MAb 425 к связыванию определяли с помощью EGF-рецептор-специфического ELISA-анализа. В общих чертах, эту процедуру проводили следующим образом: планшеты для микротитрования покрывали (4oC, в течение ночи) очищенным EGF-рецептором, и промывали для удаления несвязанного белка. Затем планшеты инкубировали с супернатантами, содержащими гибридный белок, или с супернатантами, содержащими неконъюгированные MAb, или Fab-фрагменты, или белки в очищенной форме. Планшеты промывали и инкубировали с козьими античеловечьими IgG и IgM (тяжелая и легкая цепь), конъюгированными с пероксидазой. Затем добавляли субстрат, и путем измерения при 450 нм (фиг. 2) определяли количество связанного EGFR-специфического белка. Концентрацию цитокина определяли с помощью коммерческого набора для ELISA, специфического для каждого цитокина, в соответствии с инструкциями изготовителей (данные не приводятся).
Пролиферация лейкоцитов.
Опухолеспецифические эффекторные клетки.
Одноядерные лейкоциты периферической крови и опухолеинфильтрующие лимфоциты (TIL), полученные от пациентов, страдающих меланомой, культивировали вместе с облученными (30Gy) аутологичными опухолевыми клетками в среде RPMI 1640 (1% пенициллин/стрептомицин, 1% глутамин, 20 мМ Hepes, 50 мМ β-меркаптоэтанола, 10% околоплодной сыворотки теленка, 20 ед./мл IL-2, 20 ед. /мл IL-4). Иммунореактивные клетки были слегка стимулированы аутологичными опухолевыми клетками.
Оценка пролиферации.
Цитокин-опосредованная пролиферация может быть определена с помощью:
(a) соответствующих индикаторных клеточных линий. В случае IL-2, может быть использована IL-2-зависимая мышиная клеточная линия CTLL-2 (ATCC TIB 241) (фиг. 3A) или другие IL-2 зависимые клеточные линии;
(b) in vitro - развивающихся опухолеинфильтрующих лимфоцитов (фиг. 3B);
(c) свежевыделенных одноядерных клеток, предварительно обработанных РНА-М (Sigma). В этом случае, эксперимент проводили с MAb 425-IL-4-гибридными белками (фиг. 4).
Свежевыделенные лейкоциты периферической крови человека, полученные от здоровых доноров или от пациентов с меланомой, либо TIL, полученные от пациентов с меланомой, культивировали in vitro (см. выше). Для оценки гибридных белков, лимфоциты культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах для микротитрования при плотности 1 • 105 клеток на лунку в конечном объеме 200 мкл. Затем клетки инкубировали с супернатантами, содержащими гибридный белок, или с супернатантами, содержащими неконъюгированные MAb, или с супернатантами, содержащими неконъюгированные цитокины, или белки в очищенной форме. Через 72 часа, клетки подвергали импульсному мечению с использованием 0,5 мкКи 3H-тимидина. Введение радиоактивной метки определяли после ночного инкубирования путем β-счета подложки в жидком сцинтилляторе. Результаты выражали как среднее число импульсов в минуту.
Определение цитотоксичности MAb 425-TNFα-иммуноконъюгатов
Определение TNFα-опосредованной цитотоксичности
Известно, что TNFα обладает прямой цитотоксичностью в отношении некоторых клеток, включая, ряд опухолевых клеток. Непосредственное цитотоксическое действие TNFα может быть определено с использованием мышиных фибробластов L929 (ATCC CCL 1)/ или EH1 164 (ATCC CPL 1751), или других TNFα-чувствительных клеточных линий, описанных в литературе (Flick & Gifford 1984, J. Immunol Meth 68 : 167). На фиг. 4 цитотоксическое действие MAb 425 CH1-TNFα и MAb 425 CH2-TNFα проиллюстрировано на клетках WEH1 164, используемых в качестве индикаторной клеточной линии.
Определение TNFα-индуцированной цитотоксичности.
В качестве клеток-мишеней для цитолиза, опосредованного аллогенными опухолеинфильтрующими лимфоцитами или свежевыделенными лимфоцитами периферической крови человека, полученными от пациентов с меланомой или от здоровых доноров, могут быть использованы EGF-рецептор-положительные клеточные линии, такие, как в высокой степени инвазивная и спонтанно метастатическая EGFR-положительная клеточная линия С8161 (Welch и др., 1991, Int. J. Cancer 47: 227, и работы, цитированные выше). Условия культивирования опухолевых клеток и TIL были описаны ранее (Shimizu и др., 1991, Cancer Res. 51: 6153).
In vitro - анализ на цитотоксичность осуществляли с использованием 51Cr-меченных опухолевых клеток-мишеней. Эти клетки-мишени подвергали мечению в течение 1 ч с использованием 51Cr (100 мкКИ / 107 клеток), а затем промывали в три стадии для удаления избыточного 51Cr. После этого клетки-мишени (2 • 103 клеток на лунку) инкубировали вместе с эффекторными клетками в 96-луночных планшетах для микротитрования в присутствии супернатантов, содержащих слитый белок, или супернатантов, содержащих неконъюгированные MAb, или супернатантов, содержащих неконъюгированные цитокины (контроль), или белков в очищенной форме. Супернатанты или очищенные белки серийно разводили в культуральной среде и анализировали в трех дубликатах. Планшеты инкубировали в течение 4 ч при 37oC в атмосфере 10% CO2. Затем клетки удаляли путем центрифугирования, а радиоактивность в супернатантах оценивали с помощью γ-счетчика. Процент специфического 51Cr-высвобождения вычисляли по следующей формуле:
Figure 00000004

Терапевтическое использование иммуноконъюгатов.
Иммуноконъюгаты настоящего изобретения могут быть введен человеку для проведения терапии. Поэтому, целью настоящего изобретения является получение фармацевтических композиций, которые, в качестве активного ингредиента, содержат, по крайней мере, один слитый белок, определенный выше или в формуле изобретения, в сочетании с одним или несколькими фармацевтическими приемлемыми носителями, наполнителями или разбавителями.
Иммуноконъюгаты настоящего изобретения, в основном, вводят путем внутривенной инъекции или другими парентеральными способами. Дозы вводимых иммуноконъюгатов должны быть достаточными для получения желаемого эффекта подавления опухоли и лизиса опухолевых клеток. Диапазон вводимых доз зависит от возраста, состояния здоровья, пола и степени тяжести заболевания пациента, и может варьироваться от 0,1 до 200,0 мг/кг, а предпочтительно от 0,1 до 100,0 мг/кг на одну или несколько доз в день, которые могут быть введены в течение одного или нескольких дней.
Препараты для парентерального введения могут быть изготовлены в виде стерильных водных или безводных растворов, суспензий и эмульсий. Примерами безводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие, как оливковое масло, инъецируемые органические сложные эфиры, такие, как этилолеат, и другие растворители, которые обычно используются специалистами в этих целях. Иммуноконъюгаты настоящего изобретения могут быть введены в композиции, содержащие физиологически приемлемый носитель. Примерами таких носителей являются физиологический раствор, PBS, раствор Рингера, или лактатсодержащий раствор Рингера. В указанных фармацевтических препаратах могут также присутствовать консерванты, и другие добавки, такие, как антибиотики, антиоксиданты, и хелатообразующие агенты.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть использованы для лечения любых видов опухолей, включая меланомы, глиомы, и карциномы, а также опухоли крови и твердые опухоли.

Claims (13)

1. Иммуноконьюгат, содержащий моноклональное антитело или его фрагмент и биологически активный лиганд, соединенный с антителом или его фрагментом, причем антитело или его фрагмент направлены против опухолевой клетки, несущей антигенный эпитон рецептора эпидермального фактора роста, а в качестве биологически активного лиганда использован цитокин, обладающий способностью к специфическому in situ - лизису опухолевой клетки или к возбуждению опухолеспецифического иммунного ответа.
2. Иммуноконьюгат по п. 1, отличающийся тем, что цитокин выбран из группы, содержащей TNFα, JL-2, JL-4 и JL-7.
3. Иммуноконьюгат по п.1 или 2, отличающийся тем, что в качестве антитела использован Fab-фрагмент или F(ab')2-фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела, СН1-домен постоянной области и соответствующую легкую цепь.
4. Иммуноконьюгат по п.1 или 2, отличающийся тем, что использован фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела, СН1- и СН2-домены постоянной области и соответствующую легкую цепь.
5. Иммуноконьюгат по п.1 или 2, отличающийся тем, что использован фрагмент, включающий вариабельную область тяжелой цепи антитела, СН1-, СН2- и СН3-домены постоянной области и соответствующую легкую цепь.
6. Иммуноконьюгат по любому из пп.1 - 5, отличающийся тем, что антитело или его фрагмент происходят из мышиного гуманизированного или химерного МАв 425.
7. Иммуноконьюгат по п.6, отличающийся тем, что он выбран из группы, содержащей МАв 425-СН1-TNFα, МАв 425-СН2-TNFα,, МАв 425-СН3-TNFα, МАв 425-СН1-JL-2, МАв 425-СН2-JL-2 и МАв 425-СН3-JL-2.
8. Иммуноконьюгат по любому из пп.1 - 7, отличающийся тем, что его используют в качестве противоопухолевого препарата.
9. Способ получения иммуноконьюгата по любому из пп.1 - 7, включающий слияние ДНК-последовательности, кодирующей антитело или фрагмент антитела, с ДНК-последовательностью, кодирующей биологически активный лиганд, введение полученной конструкции в вектор экспрессии, введение вектора экспрессии в хозяйстве клетки и культивирование указанных клеток в питательной среде с экспрессией слитого белка, отличающийся тем, что используют антитело или фрагмент антитела, направленные на опухолевые клетки, содержащие детерминанту рецептора эпидермального фактора роста, а в качестве биологически активного лиганда используют цитокин, способный специфически лизировать опухолевые клетки in situ или индуцировать опухолеспецифический ответ.
10. Способ по п.8, отличающийся тем, что слияние ДНК-последовательностей, кодирующих антитело или его фрагмент и биологически активный лиганд, осуществляют на одноцепочечной ДНК-последовательности, необходимой для слияния.
11. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что осуществляют экспрессию иммуноконьюгатов по п.3 в E.coli, используемой в качестве хозяина.
12. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что осуществляют экспрессию иммуноконьюгатов по п.3 или 4 в эукартиотическом хозяине.
13. Фармацевтическая композиция, содержащая активный компонент и физиологически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного компонента использован иммуноконьюгат по любому из пп.1 - 7.
RU94045281A 1993-12-24 1994-12-23 Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция RU2129018C1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP93120865 1993-12-24
EP93120865.6 1993-12-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU94045281A RU94045281A (ru) 1996-11-10
RU2129018C1 true RU2129018C1 (ru) 1999-04-20

Family

ID=8213530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU94045281A RU2129018C1 (ru) 1993-12-24 1994-12-23 Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6979726B1 (ru)
EP (1) EP0659439B1 (ru)
JP (2) JPH07223968A (ru)
KR (1) KR950016781A (ru)
AT (1) ATE207366T1 (ru)
AU (1) AU688817B2 (ru)
CA (1) CA2138928C (ru)
CZ (1) CZ289099B6 (ru)
DE (1) DE69428764T2 (ru)
DK (1) DK0659439T3 (ru)
ES (1) ES2166368T3 (ru)
HU (1) HU219680B (ru)
NO (1) NO315903B1 (ru)
PL (1) PL178793B1 (ru)
PT (1) PT659439E (ru)
RU (1) RU2129018C1 (ru)
SK (1) SK283494B6 (ru)
UA (1) UA41888C2 (ru)
ZA (1) ZA9410282B (ru)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2196604C1 (ru) * 2001-12-21 2003-01-20 Северин Евгений Сергеевич Полипептид, являющийся аналогом рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста с 21-й по 31-ю аминокислоту, его конъюгат с доксорубицином и фармацевтическая композиция на его основе
RU2265027C2 (ru) * 2003-11-14 2005-11-27 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор") Опухоль-адресованный пептид
RU2279441C2 (ru) * 1999-12-23 2006-07-10 Займодженетикс, Инк. Выделенный растворимый il-20 рецептор (варианты)
RU2317999C2 (ru) * 2000-02-25 2008-02-27 Те Гавернмент Оф Те Юнайтед Стейтс, Эз Репризентед Бай Те Секретари Оф Те Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисез SCFV ПРОТИВ EGFRvIII С УЛУЧШЕННОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ И ВЫХОДОМ, ИММУНОТОКСИНЫ НА ИХ ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
RU2451521C2 (ru) * 2006-06-16 2012-05-27 Онкотерапи Сайенс, Инк. Sparc-производные антигенные пептиды отторжения опухоли и лекарственные средства, содержащие их
RU2663795C2 (ru) * 2013-06-26 2018-08-09 Шанхай Цзюньши Биосайенсиз Инк. Антитело к pd-1 и его применение
RU2701341C2 (ru) * 2014-04-03 2019-09-25 Селлектис Cd33-специфические химерные антигенные рецепторы для иммунотерапии рака
RU2746021C2 (ru) * 2015-02-18 2021-04-06 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Иммуноконъюгаты для специфической индукции цитотоксичности т-клеток против клеток-мишеней

Families Citing this family (180)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) * 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
RU2219942C2 (ru) * 1996-02-24 2003-12-27 Берингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Лекарственный состав с иммуномодуляторным действием, содержащий пептиды и вспомогательные средства
WO1998011241A1 (en) * 1996-09-16 1998-03-19 Merck Patent Gmbh Oligocistronic expression system for the production of heteromeric proteins
RU2270029C2 (ru) 1999-06-25 2006-02-20 Джинентех, Инк. ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ ОБЛАДАЕТ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ ErbB2 И БЛОКИРОВАТЬ АКТИВАЦИЮ ЛИГАНДОМ РЕЦЕПТОРА ErbB (ВАРИАНТЫ) И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАКА, СОДЕРЖАЩАЯ ЭТО АНТИТЕЛО
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
EP2263691B1 (en) 2002-07-15 2012-08-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer with the recombinant humanized monoclonal anti-erbb2 antibody 2C4 (rhuMAb 2C4)
CN107213469A (zh) 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
DK1699822T3 (da) 2003-12-30 2008-08-04 Merck Patent Gmbh IL-7-fusionsproteiner med antistofdele, fremstilling deraf og anvendelse deraf
US8017321B2 (en) 2004-01-23 2011-09-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Gefitinib sensitivity-related gene expression and products and methods related thereto
WO2005099756A2 (en) 2004-04-08 2005-10-27 Agus David B ErbB ANTAGONISTS FOR PAIN THERAPY
ES2553264T3 (es) 2004-05-27 2015-12-07 The Regents Of The University Of Colorado Métodos para la predicción del resultado clínico para inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico para pacientes de cáncer
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
UA94899C2 (ru) 2005-01-21 2011-06-25 Дженентек, Инк. Фиксированное дозирование антител к her
DK1850874T3 (da) 2005-02-23 2013-11-11 Genentech Inc Forlængelse af tid til sygdomsprogression eller overlevelse for ovariecancer ved anvendelse af pertuzumab
AR053272A1 (es) 2005-05-11 2007-04-25 Hoffmann La Roche Determinacion de responsivos a la quimioterapia
ES2384055T3 (es) 2005-12-30 2012-06-28 Merck Patent Gmbh Variantes de la interleucina-12p40 con estabilidad mejorada
CA2635623C (en) 2005-12-30 2015-02-17 Michael Super Anti-cd19 antibodies with reduced immunogenicity
WO2008033782A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of lung cancer using pdgfra, kit or kdr gene as genetic marker
BRPI0808418A2 (pt) 2007-03-02 2014-07-22 Genentech, Inc Predição de resposta a um inibidor de her
ES2583377T3 (es) 2007-06-08 2016-09-20 Genentech, Inc. Marcadores de expresión génica de la resistencia tumoral al tratamiento con inhibidor de HER2
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
NZ594665A (en) 2009-03-20 2013-08-30 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
MX2012006406A (es) 2009-12-04 2012-07-25 Genentech Inc Anticuerpos multiespecificos, analogos de anticuerpo, composiciones y metodos.
US8461328B2 (en) 2010-01-12 2013-06-11 Genentech, Inc. Tricyclic heterocyclic compounds, compositions and methods of use thereof
MX2012008958A (es) 2010-02-18 2012-08-23 Genentech Inc Antagonista de neurogulina y usos de los mismos para el tratamiento contra el cancer.
US8617557B2 (en) 2010-03-12 2013-12-31 The Regents Of The University Of California Antibody fusion with IL-12 proteins with disrupted heparin-binding activity
US20130096104A1 (en) 2010-03-17 2013-04-18 Genentech, Inc. Imidazopyridine compounds, compositions and methods of use
CN103038643A (zh) 2010-04-16 2013-04-10 基因泰克公司 作为pi3k/akt激酶途径抑制剂效能的预测性生物标记的foxo3a
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
CA2808236A1 (en) 2010-08-31 2012-03-08 Genentech, Inc. Biomarkers and methods of treatment
RU2013114352A (ru) 2010-09-15 2014-10-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Азабензотиазолы, композиции и способы применения
AR083495A1 (es) 2010-10-22 2013-02-27 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos estables y solubles
AU2011320318B9 (en) 2010-10-29 2015-11-19 Immunogen, Inc. Non-antagonistic EGFR-binding molecules and immunoconjugates thereof
US8790649B2 (en) 2010-10-29 2014-07-29 Immunogen, Inc. EGFR-binding molecules and immunoconjugates thereof
EP2637692A4 (en) 2010-11-12 2014-09-10 Scott & White Healthcare ANTIBODIES TO THE ENDOTHELIAL TUMOR MARKER 8
CA2817785A1 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Toby Blench Pyrazolopyridines and pyrazolopyridines and their use as tyk2 inhibitors
WO2012085176A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Tricyclic pyrazinone compounds, compositions and methods of use thereof as janus kinase inhibitors
WO2013007768A1 (en) 2011-07-13 2013-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Tricyclic heterocyclic compounds, compositions and methods of use thereof as jak inhibitors
WO2013007765A1 (en) 2011-07-13 2013-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Fused tricyclic compounds for use as inhibitors of janus kinases
WO2013024011A1 (en) 2011-08-12 2013-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Indazole compounds, compositions and methods of use
KR20140057326A (ko) 2011-08-17 2014-05-12 제넨테크, 인크. 뉴레귤린 항체 및 그의 용도
MX2014002949A (es) 2011-09-20 2014-04-30 Hoffmann La Roche Compuesto de imidazopiridina, composiciones y metodos de uso.
KR20140105765A (ko) 2011-11-21 2014-09-02 이뮤노젠 아이엔씨 EGfr 항체 세포독성제 접합체에 의한 EGfr 치료에 내성을 나타내는 종양의 치료 방법
RU2019103083A (ru) 2011-11-30 2019-03-22 Дженентек, Инк. МУТАЦИИ ErbB3 ПРИ РАКЕ
WO2013148315A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
EP2958592A1 (en) 2013-02-22 2015-12-30 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of treating cancer and preventing drug resistance
RU2015137610A (ru) 2013-03-06 2017-04-10 Дженентек, Инк. Способы лечения и профилактики лекарственной резистентности злокачественных опухолей
EP2970307B1 (en) 2013-03-13 2020-03-11 Genentech, Inc. Pyrazolo compounds and uses thereof
HK1220916A1 (zh) 2013-03-14 2017-05-19 基因泰克公司 治疗癌症和预防癌症药物抗性的方法
BR112015022576A2 (pt) 2013-03-14 2017-10-24 Genentech Inc produto farmacêutico e seu uso, kit e método para tratar uma disfunção hiperproliferativa
KR102305226B1 (ko) * 2013-03-15 2021-09-29 아비에 도이치란트 게엠베하 운트 콤파니 카게 항-egfr 항체 약물 접합체 제형
CN105339001A (zh) 2013-03-15 2016-02-17 基因泰克公司 治疗癌症和预防癌症耐药性的方法
US9505767B2 (en) 2013-09-05 2016-11-29 Genentech, Inc. Pyrazolo[1,5-A]pyrimidin-7(4H)-onehistone demethylase inhibitors
TW201605857A (zh) 2013-10-03 2016-02-16 赫孚孟拉羅股份公司 Ｃｄｋ８之醫療性抑制劑及其用途
CN105744954B (zh) 2013-10-18 2021-03-05 豪夫迈·罗氏有限公司 抗rspo2和/或抗rspo3抗体及其用途
NZ760065A (en) 2013-12-17 2022-12-23 Genentech Inc Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
CA2934028A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
BR112016021383A2 (pt) 2014-03-24 2017-10-03 Genentech Inc Método para identificar um paciente com câncer que é susceptível ou menos susceptível a responder ao tratamento com um antagonista de cmet, método para identificar um paciente apresentando câncer previamente tratado, método para determinar a expressão do biomarcador hgf, antagonista anti-c-met e seu uso, kit de diagnóstico e seu método de preparo
HRP20192285T1 (hr) 2014-03-31 2020-03-06 F. Hoffmann - La Roche Ag Anti-ox40 protutijela i postupci uporabe
RU2016142476A (ru) 2014-03-31 2018-05-07 Дженентек, Инк. Комбинированная терапия, включающая антиангиогенезные агенты и агонисты, связывающие ох40
JP6814730B2 (ja) 2014-09-05 2021-01-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 治療用化合物およびその使用
CN107073125A (zh) 2014-09-19 2017-08-18 基因泰克公司 Cbp/ep300和bet抑制剂用于治疗癌症的用途
CN107912040B (zh) 2014-10-10 2021-04-06 基因泰克公司 作为组蛋白脱甲基酶抑制剂的吡咯烷酰胺化合物
CN107109484B (zh) 2014-11-03 2021-12-14 豪夫迈·罗氏有限公司 用于ox40激动剂治疗的功效预测和评估的方法和生物标志物
AU2015343337A1 (en) 2014-11-03 2017-06-15 Genentech, Inc. Assays for detecting T cell immune subsets and methods of use thereof
KR20170072343A (ko) 2014-11-06 2017-06-26 제넨테크, 인크. Ox40 결합 효능제 및 tigit 억제제를 포함하는 병용 요법
MA40940A (fr) 2014-11-10 2017-09-19 Constellation Pharmaceuticals Inc Pyrrolopyridines substituées utilisées en tant qu'inhibiteurs de bromodomaines
WO2016077375A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Genentech, Inc. Bromodomain inhibitors and uses thereof
MA40943A (fr) 2014-11-10 2017-09-19 Constellation Pharmaceuticals Inc Pyrrolopyridines substituées utilisées en tant qu'inhibiteurs de bromodomaines
MX2017006320A (es) 2014-11-17 2017-08-10 Genentech Inc Terapia combinada que comprende agonistas de unión de ox40 y antagonistas de unión del eje de pd-1.
CN107531690B (zh) 2014-11-27 2020-11-06 基因泰克公司 用作CBP和/或EP300抑制剂的4,5,6,7-四氢-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-胺化合物
ES2764299T3 (es) 2014-12-09 2020-06-02 Inst Nat Sante Rech Med Anticuerpos monoclonales humanos contra AXL
MX2017006864A (es) 2014-12-23 2017-08-28 Genentech Inc Composiciones y métodos para tratar y diagnosticar cánceres resistentes a la quimioterapia.
EP3240908A2 (en) 2014-12-30 2017-11-08 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and compositions for prognosis and treatment of cancers
JP6889661B2 (ja) 2015-01-09 2021-06-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド ４，５−ジヒドロイミダゾール誘導体およびヒストンジメチラーゼ（ｋｄｍ２ｂ）インヒビターとしてのその使用
CN107406414B (zh) 2015-01-09 2022-04-19 基因泰克公司 作为用于治疗癌症的组蛋白脱甲基酶kdm2b的抑制剂的(哌啶-3-基)(萘-2-基)甲酮衍生物
EP3242874B1 (en) 2015-01-09 2018-10-31 Genentech, Inc. Pyridazinone derivatives and their use in the treatment of cancer
ES3057334T3 (en) 2015-01-12 2026-02-27 Childrens Medical Center Pro-inflammatory and adjuvant functions of toll-like receptor 4 antagonists
CN107531692B (zh) 2015-01-29 2020-12-25 基因泰克公司 治疗化合物及其用途
CN107438593B (zh) 2015-01-30 2020-10-30 基因泰克公司 治疗化合物及其用途
MA41598A (fr) 2015-02-25 2018-01-02 Constellation Pharmaceuticals Inc Composés thérapeutiques de pyridazine et leurs utilisations
WO2016135041A1 (en) 2015-02-26 2016-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis
MX2017012805A (es) 2015-04-07 2018-04-11 Genentech Inc Complejo de unión a antígenos con actividad agonista y métodos de uso.
EP3294770B2 (en) 2015-05-12 2024-03-20 F. Hoffmann-La Roche AG Therapeutic and diagnostic methods for cancer
KR20250151554A (ko) 2015-05-29 2025-10-21 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
US20170000885A1 (en) 2015-06-08 2017-01-05 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies and pd-1 axis binding antagonists
EP3303399A1 (en) 2015-06-08 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies
IL256080B2 (en) 2015-06-17 2025-06-01 Genentech Inc Methods of treating locally advanced or metastatic breast cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
WO2017033019A1 (en) 2015-08-26 2017-03-02 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Oncológicas Carlos Iii (Cnio) Condensed tricyclic compounds as protein kinase inhibitors
KR20250021613A (ko) 2015-09-25 2025-02-13 제넨테크, 인크. 항-tigit 항체 및 이의 이용 방법
DK3389662T3 (da) 2015-12-16 2022-02-28 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af tricykliske PI3K-inhibitorforbindelser og fremgangsmåder til anvendelse af disse til behandling af cancer
AR107303A1 (es) 2016-01-08 2018-04-18 Hoffmann La Roche Métodos de tratamiento de cánceres positivos para ace utilizando antagonistas de unión a eje pd-1 y anticuerpos biespecíficos anti-ace / anti-cd3, uso, composición, kit
KR102500659B1 (ko) 2016-02-29 2023-02-16 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
EP3443004A1 (en) 2016-04-14 2019-02-20 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-rspo3 antibodies and methods of use
CA3019921A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
CN109072311A (zh) 2016-04-15 2018-12-21 豪夫迈·罗氏有限公司 用于癌症的诊断和治疗方法
EP3443120A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods for monitoring and treating cancer
US20190151346A1 (en) 2016-05-10 2019-05-23 INSERM (Institute National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations therapies for the treatment of cancer
CN109476663B (zh) 2016-05-24 2021-11-09 基因泰克公司 用于治疗癌症的吡唑并吡啶衍生物
JP7160688B2 (ja) 2016-05-24 2022-10-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｃｂｐ／ｅｐ３００の複素環式インヒビターおよびがんの処置におけるそれらの使用
CN109312407A (zh) 2016-06-08 2019-02-05 豪夫迈·罗氏有限公司 用于癌症的诊断和治疗方法
EP3494139B1 (en) 2016-08-05 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent and multiepitopic anitibodies having agonistic activity and methods of use
CN109476748B (zh) 2016-08-08 2023-05-23 豪夫迈·罗氏有限公司 用于癌症的治疗和诊断方法
IL265759B2 (en) 2016-10-06 2025-10-01 Genentech Inc Therapeutic and diagnostic methods for cancer
JP2019535250A (ja) 2016-10-29 2019-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｍｉｃ抗体及び使用方法
PL3589754T3 (pl) 2017-03-01 2023-10-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby diagnostyczne i terapeutyczne w chorobach nowotworowych
CN110582293B (zh) * 2017-03-31 2025-04-04 小利兰·斯坦福大学托管委员会 合成因子组合物及使用方法
JP2020516638A (ja) 2017-04-13 2020-06-11 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんを処置する方法における使用のための、インターロイキン２イムノコンジュゲート、ｃｄ４０アゴニスト、および任意選択のｐｄ−１軸結合アンタゴニスト
CN111492245A (zh) 2017-07-21 2020-08-04 基因泰克公司 癌症的治疗和诊断方法
CN111295394B (zh) 2017-08-11 2024-06-11 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd8抗体及其用途
KR102811888B1 (ko) 2017-09-08 2025-05-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 진단 및 치료 방법
WO2019084395A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 University Of Virginia Patent Foundation COMPOUNDS AND METHODS FOR REGULATING, LIMITING OR INHIBITING AVIL EXPRESSION
WO2019090263A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
EP3740756A4 (en) 2018-01-15 2021-10-27 Epiaxis Therapeutics Pty Ltd MEANS AND METHOD OF PREDICTING RESPONSE TO THERAPY
MX2020008882A (es) 2018-02-26 2021-01-08 Genentech Inc Dosificación para tratamiento con anticuerpos antagonistas anti-tigit y anti-pd-l1.
US20210363590A1 (en) 2018-05-21 2021-11-25 Nanostring Technologies, Inc. Molecular gene signatures and methods of using same
AU2019288728A1 (en) 2018-06-23 2021-01-14 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
BR112021000673A2 (pt) 2018-07-18 2021-04-20 Genentech, Inc. métodos para tratar um indivíduo com câncer de pulmão, kits, anticorpo anti-pd-l1 e composições
TW202024023A (zh) 2018-09-03 2020-07-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療性化合物及其使用方法
CN112955747A (zh) 2018-09-19 2021-06-11 豪夫迈·罗氏有限公司 膀胱癌的治疗和诊断方法
MX2021003213A (es) 2018-09-21 2021-05-12 Genentech Inc Metodos de diagnostico para cancer de mama triple negativo.
US12404540B2 (en) 2018-10-17 2025-09-02 The University Of Queensland Epigenetic biomarker and uses therefor
EP3867646A1 (en) 2018-10-18 2021-08-25 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer
US12344646B2 (en) 2018-12-13 2025-07-01 Bang DING Antibody-TNF α fusion protein and its preparation and applications
EP3921443A1 (en) 2019-02-08 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic and therapeutic methods for cancer
BR112021016923A2 (pt) 2019-02-27 2021-11-03 Genentech Inc Métodos para tratar um paciente com câncer hematológico, métodos para tratar um paciente com mm recidivante ou refratário, métodos para tratar um paciente tendo um lnh recidivante ou refratário e kits
WO2020172712A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Epiaxis Therapeutics Pty Ltd Methods and agents for assessing t-cell function and predicting response to therapy
WO2020223233A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for colorectal cancer
TWI879768B (zh) 2019-05-03 2025-04-11 美商建南德克公司 用抗pd-l1抗體治療癌症之方法
CN112300279A (zh) 2019-07-26 2021-02-02 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 针对抗cd73抗体和变体的方法和组合物
KR20220057563A (ko) 2019-09-04 2022-05-09 제넨테크, 인크. Cd8 결합제 및 이의 용도
TW202126690A (zh) 2019-09-27 2021-07-16 美商建南德克公司 用抗ｔｉｇｉｔ和抗ｐｄ－ｌ１拮抗劑抗體給藥治療
JP2023511472A (ja) 2019-10-29 2023-03-20 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんの治療のための二官能性化合物
CN115066613A (zh) 2019-11-06 2022-09-16 基因泰克公司 用于治疗血液癌症的诊断和治疗方法
EP4058435A1 (en) 2019-11-13 2022-09-21 Genentech, Inc. Therapeutic compounds and methods of use
PE20221511A1 (es) 2019-12-13 2022-10-04 Genentech Inc Anticuerpos anti-ly6g6d y metodos de uso
AU2020408562A1 (en) 2019-12-20 2022-06-23 Erasca, Inc. Tricyclic pyridones and pyrimidones
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2021177980A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Genentech, Inc. Combination therapy for cancer comprising pd-1 axis binding antagonist and il6 antagonist
EP4127724A1 (en) 2020-04-03 2023-02-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
JP2023523450A (ja) 2020-04-28 2023-06-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 非小細胞肺がん免疫療法のための方法及び組成物
EP3915576A1 (en) 2020-05-28 2021-12-01 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Chimeric antigen receptors specific for p95her2 and uses thereof
CA3181820A1 (en) 2020-06-16 2021-12-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
IL298946A (en) 2020-06-18 2023-02-01 Genentech Inc Treatment with anti-tigit antibodies and pd-1 axis binding antagonists
JP7741831B2 (ja) 2020-06-30 2025-09-18 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 術前補助療法及び根治手術後の固形がんを患っている患者の再発及び／又は死亡のリスクを予測するための方法
CN115997123A (zh) 2020-06-30 2023-04-21 国家医疗保健研究所 用于预测实体癌患者在术前辅助治疗后复发和/或死亡风险的方法
EP3939999A1 (en) 2020-07-14 2022-01-19 Fundación del Sector Público Estatal Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas Carlos III (F.S.P. CNIO) Interleukin 11 receptor alpha subunit (il11ra) neutralizing antibodies and uses thereof
US11787775B2 (en) 2020-07-24 2023-10-17 Genentech, Inc. Therapeutic compounds and methods of use
JP2023536602A (ja) 2020-08-03 2023-08-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド リンパ腫のための診断及び治療方法
US12540188B2 (en) 2020-08-05 2026-02-03 Synthekine, Inc. IL10Rα/IL2Rγ synthetic cytokines
EP4196612A1 (en) 2020-08-12 2023-06-21 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
IL301547A (en) 2020-10-05 2023-05-01 Genentech Inc Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2022133345A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Erasca, Inc. Tricyclic pyridones and pyrimidones
PE20231505A1 (es) 2021-02-12 2023-09-26 Hoffmann La Roche Derivados de tetrahidroazepina biciclicos para el tratamiento del cancer
EP4347603A1 (en) 2021-05-25 2024-04-10 Erasca, Inc. Sulfur-containing heteroaromatic tricyclic kras inhibitors
WO2022266206A1 (en) 2021-06-16 2022-12-22 Erasca, Inc. Kras inhibitor conjugates
WO2023018699A1 (en) 2021-08-10 2023-02-16 Erasca, Inc. Selective kras inhibitors
US12275745B2 (en) 2021-11-24 2025-04-15 Genentech, Inc. Therapeutic compounds and methods of use
JP2024541508A (ja) 2021-11-24 2024-11-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 治療用インダゾール化合物およびがんの治療における使用方法
EP4253418A1 (en) 2022-03-29 2023-10-04 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Immune cells expressing chimeric antigen receptors and bispecific antibodies and uses thereof
KR20240169042A (ko) 2022-04-01 2024-12-02 제넨테크, 인크. 항-fcrh5/항-cd3 이중특이성 항체로 치료하기 위한 투약법
AU2022458320A1 (en) 2022-05-11 2024-11-28 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
IL317449A (en) 2022-06-07 2025-02-01 Genentech Inc Method for determining the efficacy of a lung cancer treatment comprising an anti-PD-L1 antagonist and an anti-TIGIT antibody-antagonist
EP4554978A1 (en) 2022-07-13 2025-05-21 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
IL318252A (en) 2022-07-19 2025-03-01 Genentech Inc Dosage for treatment with bispecific anti-FCRH5/anti-CD3 antibodies
JP2025526683A (ja) 2022-08-11 2025-08-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二環式テトラヒドロチアゼピン誘導体
CR20250043A (es) 2022-08-11 2025-03-25 Hoffmann La Roche Derivados bicíclicos de tetrahidrotiazepina
CN119677732A (zh) 2022-08-11 2025-03-21 豪夫迈·罗氏有限公司 双环四氢氮杂䓬衍生物
PE20251399A1 (es) 2022-08-11 2025-05-22 Hoffmann La Roche Derivados de tetrahidrotiazepina biciclicos
JP2025538859A (ja) 2022-10-21 2025-12-02 公益財団法人川崎市産業振興財団 非吸着性またはスーパーステルス小胞
TW202426505A (zh) 2022-10-25 2024-07-01 美商建南德克公司 癌症之治療及診斷方法
EP4406973A1 (en) 2023-01-27 2024-07-31 Fundació Privada Institut de Recerca de la SIDA-Caixa Antibodies and uses thereof for the treatment of infections caused by enveloped viruses
TW202434206A (zh) 2023-02-17 2024-09-01 美商伊瑞斯卡公司 Ｋｒａｓ抑制劑
TW202448949A (zh) 2023-05-05 2024-12-16 美商建南德克公司 用抗ｆｃｒｈ５／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
WO2024254455A1 (en) 2023-06-08 2024-12-12 Genentech, Inc. Macrophage signatures for diagnostic and therapeutic methods for lymphoma
WO2025024257A1 (en) 2023-07-21 2025-01-30 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
WO2026030464A1 (en) 2024-07-30 2026-02-05 Genentech, Inc. Dosage regimen for reducing cytokine release syndrome (crs) with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies in multiple myeloma therapy
WO2026030476A1 (en) 2024-07-30 2026-02-05 Genentech, Inc. Precision medicine for optimal dosage of combined therapies systems and methods of use thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0428188A2 (en) * 1986-06-30 1991-05-22 Oncogen Novel immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy
EP0439095A2 (en) * 1990-01-22 1991-07-31 Bristol-Myers Squibb Company Therapeutic antibody based fusion proteins
WO1992008495A1 (en) * 1990-11-09 1992-05-29 Abbott Biotech, Inc. Cytokine immunoconjugates

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5470571A (en) * 1988-01-27 1995-11-28 The Wistar Institute Method of treating human EGF receptor-expressing gliomas using radiolabeled EGF receptor-specific MAB 425
ZA902949B (en) * 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
AU639726B2 (en) * 1989-09-08 1993-08-05 Duke University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
KR100240308B1 (ko) * 1991-03-06 2000-01-15 플레믹 크리스티안 인간화된단클론성항체및혼성단클론성항체
WO1993000917A1 (en) * 1991-07-05 1993-01-21 Seragen, Inc. Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis
ATE188874T1 (de) * 1992-08-18 2000-02-15 Centro Inmunologia Molecular Monoklonale antikörper gegen den epidermalen wachstumsfaktorrezeptor, zellen und verfahren zur ihrer herstellung und sie erhaltende zusammensetzungen
DK139193D0 (da) 1993-09-24 1993-12-13 Hartmann As Brdr Rektangulaer aegbakke
MX9504802A (es) * 1994-03-17 1997-05-31 Merck Patent Gmbh Anticuerpos anti-egfr y fvs de cadena simple anti-egfr.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0428188A2 (en) * 1986-06-30 1991-05-22 Oncogen Novel immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy
EP0439095A2 (en) * 1990-01-22 1991-07-31 Bristol-Myers Squibb Company Therapeutic antibody based fusion proteins
WO1992008495A1 (en) * 1990-11-09 1992-05-29 Abbott Biotech, Inc. Cytokine immunoconjugates

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2279441C2 (ru) * 1999-12-23 2006-07-10 Займодженетикс, Инк. Выделенный растворимый il-20 рецептор (варианты)
RU2317999C2 (ru) * 2000-02-25 2008-02-27 Те Гавернмент Оф Те Юнайтед Стейтс, Эз Репризентед Бай Те Секретари Оф Те Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисез SCFV ПРОТИВ EGFRvIII С УЛУЧШЕННОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ И ВЫХОДОМ, ИММУНОТОКСИНЫ НА ИХ ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
RU2196604C1 (ru) * 2001-12-21 2003-01-20 Северин Евгений Сергеевич Полипептид, являющийся аналогом рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста с 21-й по 31-ю аминокислоту, его конъюгат с доксорубицином и фармацевтическая композиция на его основе
RU2265027C2 (ru) * 2003-11-14 2005-11-27 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор") Опухоль-адресованный пептид
RU2451521C2 (ru) * 2006-06-16 2012-05-27 Онкотерапи Сайенс, Инк. Sparc-производные антигенные пептиды отторжения опухоли и лекарственные средства, содержащие их
RU2663795C2 (ru) * 2013-06-26 2018-08-09 Шанхай Цзюньши Биосайенсиз Инк. Антитело к pd-1 и его применение
RU2701341C2 (ru) * 2014-04-03 2019-09-25 Селлектис Cd33-специфические химерные антигенные рецепторы для иммунотерапии рака
RU2746021C2 (ru) * 2015-02-18 2021-04-06 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Иммуноконъюгаты для специфической индукции цитотоксичности т-клеток против клеток-мишеней

Also Published As

Publication number Publication date
CZ330694A3 (en) 1995-10-18
EP0659439A2 (en) 1995-06-28
CZ289099B6 (cs) 2001-11-14
HU9403784D0 (en) 1995-02-28
ES2166368T3 (es) 2002-04-16
UA41888C2 (ru) 2001-10-15
JP2006298936A (ja) 2006-11-02
DK0659439T3 (da) 2002-01-14
HU219680B (hu) 2001-06-28
EP0659439A3 (en) 1996-12-04
HUT70471A (en) 1995-10-30
KR950016781A (ko) 1995-07-20
SK156294A3 (en) 1995-07-11
AU688817B2 (en) 1998-03-19
EP0659439B1 (en) 2001-10-24
ZA9410282B (en) 1995-08-29
PL306474A1 (en) 1995-06-26
US6979726B1 (en) 2005-12-27
DE69428764T2 (de) 2002-06-20
PL178793B1 (pl) 2000-06-30
NO944980L (no) 1995-06-26
CA2138928C (en) 2009-02-17
NO315903B1 (no) 2003-11-10
DE69428764D1 (de) 2001-11-29
RU94045281A (ru) 1996-11-10
CA2138928A1 (en) 1995-06-25
AU8159394A (en) 1995-06-29
NO944980D0 (no) 1994-12-22
ATE207366T1 (de) 2001-11-15
JPH07223968A (ja) 1995-08-22
SK283494B6 (sk) 2003-08-05
PT659439E (pt) 2002-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2129018C1 (ru) Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция
AU702184B2 (en) Immunoconjugates II
RU2263118C2 (ru) Комплексы антител с несколькими цитокинами
EP0574395B1 (en) Cytokine immunoconjugates
JP6925431B2 (ja) Ｉｌ２及びｔｎｆ突然変異体のイムノコンジュゲート
JP2002511432A (ja) 新脈管形成インヒビターの同時投与による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介性免疫応答の増強
HK1038881A1 (zh) 通过共同给予前列腺素抑制剂增强抗体-细胞因子融合蛋白介导的免疫应答
EP3660039A1 (en) Il2 immunoconjugates
EP1731531B1 (en) Multiple cytokine-antibody complexes
US20250333507A1 (en) Fusion protein of anti-tigit antibody and il2 or variant thereof, and application thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20101224