KR20220057563A - Cd8 결합제 및 이의 용도 - Google Patents

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제임스 토마스 쾨르버
알레잔드라 베아트리체 우르피 우루티아
시몬-피터 윌리암스
크리스토퍼 윌리암슨 데이비스
쉬라반 쿠마르 스리라만
허만 싱 길
제임스 리차드 주니어 키퍼
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제넨테크, 인크.
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Abstract

인간 CD8에 특이적으로 결합하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다. 또한, 이러한 CD8 결합제를 인코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 이를 포함하는 숙주 세포, 및 이러한 CD8 결합제를 제조하는 방법이 제공된다. 또한, 검출가능한 표지에 접합된 VHH 도메인을 갖는 CD8 결합제가 제공된다. 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환이 있는 대상체에서 CD8+ T 세포를 검출하고, 질환 진행을 모니터링하고, 치료 진행을 모니터링하기 위해 이같은 CD8 결합제를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

CD8 결합제 및 이의 용도
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 9월 4일 출원된 미국 가특허출원 번호 62/895,865의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일로의 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일로의 하기 제출 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF) (파일명: 146392049240SEQLIST.txt, 기록된 날짜: 2020년 8월 19일, 크기: 14KB)
기술분야
본 출원은 항-CD8 VHH 도메인에 기반한 CD8 결합제 및 생체내 CD8+ T-세포를 영상화하기 위해 이러한 CD8 결합제를 사용하는 방법에 관한 것이다.
종양 조직에서 면역 세포의 수, 유형 및 공간 분포의 특성화는 암 진단, 예후, 요법 선택, 및 요법에 대한 반응에 관한 중요한 정보를 제공할 수 있다. 구체적으로는, CD8+ 세포독성 림프구는 다양한 암에서 진단 및 예후상의 중요성을 가지는 것으로 일관되게 보고되어 왔다. CD8+ 세포를 검출하는 현재의 방법들은 말초 혈액 또는 관심 조직으로부터의 세포의 단리를 수반한다. 이러한 샘플링 방법은 오류가 발생하기 쉽고 생체내 CD8+ 세포의 수, 국재화 및 이동을 반영하는 동적 정보를 제공하지 않는다. 생체내 면역 세포를 검출하는 하나의 예시적인 비 침습적 방법은 방사성 표지된 추적자를 사용하는 양전자 방출 단층촬영(PET)이다. 그러나, 이러한 추적자의 사용은 방사성 동위 원소 반감기와 세포 분열에 의해 제한되며, 이는 생체내에서 프로브 희석을 초래한다. 따라서, 생체내 CD8+ 세포의 양 및 시간적 분포의 변화를 모니터링하기 위한 방법 및 시약이 해당 분야에 여전히 필요하다.
본원에는 중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인 (VHH 도메인)을 포함하는 CD8 결합제가 제공되며, 여기서 CD8 결합제는 약 1 nM 이하의 KD로 인간 CD8에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 500 pM 이하, 약 250 pM 이하, 또는 약 100 pM 이하의 KD로 인간 CD8에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 132 pm, 또는 약 50 pM의 KD로 인간 CD8에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 0.002/s 이하, 또는 약 0.001/s 이하의 koff로 인간 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 0.0018/s, 또는 약 0.00085/s의 koff로 인간 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 1 nM 이하의 KD로 시노몰구스 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 500 pM 이하, 약 250 pM 이하, 또는 약 150 pM 이하의 KD로 시노몰구스 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 344 pM 또는 약 137 pM의 KD로 시노몰구스 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 0.004/s 이하, 또는 약 0.002/s 이하의 koff로 시노몰구스 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 0.0037/s, 또는 약 0.0019/s의 koff로 시노몰구스 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 적어도 약 30분, 예컨대 적어도 약 1시간, 2시간 이상과 같은 CD8-결합 반감기(예를 들어, 시험관내 결합 분석에서)를 갖는다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 1 nM 이하의 KD로 레서스 원숭이 CD8에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 마우스 또는 래트 CD8에 결합하지 않는다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 CD8+ T 세포의 활성화를 자극 또는 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 CD8+ T 세포 증식을 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 CD4+ T 세포에 결합하지 않는다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 라마 VHH와 같은 낙타류 VHH이다. 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 키메라이다. 일부 실시양태에서, VHH는 인간화된다. 일부 실시양태에서, VHH는 친화도 성숙된다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 및 Thr97을 포함하는 인간 CD8α 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 아미노산 넘버링은 서열식별번호(SEQ ID NO): 13에 따른다. 일부 실시양태에서, 인간 CD8α 에피토프의 아미노산 잔기는 CD8 결합제의 결정 구조 내의 VHH 도메인 또는 인간 CD8α에 결합된 VHH 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기로부터 약 4.5 Å 내에 있다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 (CDR) 1; 서열식별번호: 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열식별번호: 10-12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 L49A를 포함하고, 여기서 넘버링은 카바트(Kabat) 넘버링에 따른다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 단백질 A 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 V89T 치환, T110Q 치환, S112Q 치환 및 위치 114에서의 A의 첨가 (본원에서 이하 "A114 첨가"로 지칭된다)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 V89T 치환, T110Q 치환, S112Q 치환 및 A114 첨가를 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 CD8 결합제를 제공받는 대상체에서 기존의 항-VHH 항체에 결합하지 않는다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 본원에는 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) CD8 결합제를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 핵산을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포 또는 Expi293 세포와 같은 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대 대장균(E. coli) 세포이다.
추가로 본원에는 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) CD8 결합제를 만드는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 상기 작용제가 생산되는 조건 하에서 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 b) 상기 숙주 세포에 의해 생산된 CD8 결합제를 회수하는 단계.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 표지를 포함한다. 표지를 포함하는 CD8 결합제는 본원에서 "표지된 CD8 결합제"로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) CD8 결합제의 VHH 도메인에 킬레이팅 모이어티를 접합시켜 접합체를 제공하는 단계 및 상기 접합체를 18F를 포함하는 플루오린화알루미늄 복합체와 접촉시켜 표지된 CD8 결합제를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 킬레이팅 모이어티는 하기 화학식 (I)의 화합물인, 표지된 CD8 결합제를 제조하는 방법이 제공된다.
Figure pct00001
(I). 일부 실시양태에서, 상기 접합체는 메티오닌 및/또는 N-아세틸-트립토판과 같은 하나 이상의 항산화제 화합물의 존재 하에 플루오린화알루미늄 복합체와 접촉된다.
본원에는 표지에 접합된 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 항-CD8 VHH 도메인을 포함하는 표지된 CD8 결합제가 제공된다. 일부 실시양태에서, 표지는 형광 염료, 방사성핵종 또는 효소이다. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, 표지는 방사성핵종이다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종은 18F, 89Zr, 99mTc, 67Ga, 68Ga, 64Cu, 52Mn, 111In 또는 124I이다. 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 킬레이팅 모이어티를 통해 표지에 접합된다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅 모이어티는 리신 잔기를 통해 VHH 도메인에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 표지는 금속과 복합체를 형성하고, 여기서 복합체는 킬레이팅 모이어티에 의해 킬레이트화된다. 일부 실시양태에서, 표지는 18F이고, 금속은 알루미늄이다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅 모이어티는 화학식 (I)의 화합물이다.
본원에는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD8 VHH 도메인을 포함하며, 여기서 VHH 도메인은 킬레이팅 모이어티를 통해 방사성핵종(예를 들어, 18F)에 접합된 것인 표지된 CD8 결합제가 제공된다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅 모이어티는 화학식 (I)의 화합물이고, 방사성핵종은 알루미늄과 복합체를 형성한 18F이다. 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-CD8 VHH 도메인을 포함하며, 여기서 VHH 도메인은 킬레이팅 모이어티를 통해 방사성핵종(예를 들어, 18F)에 접합된 것인 표지된 CD8 결합제가 제공된다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅 모이어티는 화학식 (I)의 화합물이고, 방사성핵종은 알루미늄과 복합체를 형성한 18F이다. 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 본원에는 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) CD8 결합제 (표지된 CD8 결합제 포함) 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다.
추가로 본원에는 대상체에서의 질환 또는 상태의 치료 또는 진단을 위한 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) CD8 결합제 (표지된 CD8 결합제 포함)의 용도, 및 대상체에서의 질환 또는 상태의 치료 또는 진단을 위한 약제의 제조에서 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) CD8 결합제 (표지된 CD8 결합제 포함)의 용도가 제공된다.
추가로 본원에는 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) CD8 결합제 (표지된 CD8 결합제 포함) 및 하나 이상의 항산화제 화합물을 포함하는 제약학적 제형이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항산화제 화합물은 메티오닌 및/또는 N-아세틸 트립토판이다. 일부 실시양태에서, 제약학적 제형은 메티오닌 및 N-아세틸 트립토판을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약학적 제형은 히스티딘 및 슈크로스를 추가로 포함한다.
본원에는 대상체에서 CD8+ 세포를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계; 및 b) 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계, 여기서 결합의 검출은 CD8+ 세포의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것은 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것은 대상체에 대해 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8+ 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, CD8+ 세포는 CD8+ 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 검출은 투여 후 약 1일 이내에 (예를 들어, 약 6시간, 4시간, 2시간, 90분, 1시간, 30분 이내에) 실행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1회 이상, 예컨대 연간 약 1 내지 4회 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD8 결합제의 이전 투여 후 약 1일 후에 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1년 초과 동안 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 약 1 nM 내지 약 30 nM의 감도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 시노몰구스 원숭이 또는 레서스 원숭이이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는다.
본원에는 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신에 대한 암을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계 및; b) 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신에 반응할 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것은 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것은 대상체에 대해 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다: (c) 결합이 검출된 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신을 투여하는 단계. 일부 실시양태에서, 검출은 투여 후 약 1일 또는 그 미만 이내에 (예를 들어, 약 6시간, 4시간, 2시간, 90분, 1시간, 30분 또는 그 미만 이내에) 실행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1회 이상, 예컨대 연간 약 1 내지 4회 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD8 결합제의 이전 투여 후 적어도 1일 후에 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1년 초과 동안 반복된다.
또한 본원에는 암을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계, 및 b) 1차 시점 및 2차 시점에서 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것은 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것은 대상체에 대해 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다: (c) 2차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준이 1차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준보다 높은 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신을 투여하는 단계. 일부 실시양태에서, 검출은 투여 후 약 1일 또는 그 미만 이내에 (예를 들어, 약 6시간, 4시간, 2시간, 90분, 1시간, 30분 또는 그 미만 이내에) 실행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1회 이상, 예컨대 연간 약 1 내지 4회 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD8 결합제의 이전 투여 후 적어도 1일 후에 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 1년 초과 동안 모니터링된다.
본원에는 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신을 제공받았거나 이를 제공받고 있는 암을 가진 대상체에서 치료 진행을 모니터하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: i) 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 표지된 CD8 결합제를 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신과 함께 대상체에게 투여하는 단계, 및 ii) 1차 시점 및 2차 시점에서 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것은 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것은 대상체에 대해 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 CD8 결합제는 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신 이전에 투여되고, 여기서 1차 시점은 표지된 CD8 결합제의 투여 후 그리고 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신의 투여 전이며, 여기서 2차 시점은 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신의 투여 후이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신은 표지된 CD8 결합제 이전에 투여되고, 여기서 1차 시점은 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신의 투여 후 그리고 표지된 CD8 결합제의 투여 후이고, 여기서 2차 시점은 1차 시점 후이다. 일부 실시양태에서, 검출은 투여 후 약 1일 또는 그 미만 이내에 (예를 들어, 약 6시간, 4시간, 2시간, 90분, 1시간, 30분 또는 그 미만 이내에) 실행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1회 이상, 예컨대 연간 약 1 내지 4회 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD8 결합제의 이전 투여 후 적어도 1일 후에 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 1년 초과 동안 모니터링된다.
상기 예측 방법 또는 모니터링 방법 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, 면역요법제가 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 항-PDL1 항체, 항-PD1 항체, 항-TIGIT 항체, TIGIT 길항제, 항-CSF-1R 항체, 항-CSF-1R 길항제, 항-CEA 항체, 항-CEA 길항제, 항-CTLA4 항체, CTLA4 길항제, 항-OX40 항체, 또는 OX40 효현제이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 하나 이상의 치료제와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 타르세바(TARCEVA)® (에를로티닙), 젤보라프(ZELBORAF)® (베무라페닙), 가지바(GAZYVA)® (오비누투주맙), 아바스틴(AVASTIN)® (베바시주맙), 코텔릭(COTELLIC)® (코비메티닙), 젤보라프® (베무라페닙) 및 코텔릭® (코비메티닙), 알렉센사(ALECENSA)® (알렉티닙), 카드실라(KADCYLA)® (아도-트라스투주맙 엠탄신), 헤르셉틴(HERCEPTIN)® (트라스투주맙), 페르제타(PERJETA)® (페르투주맙), 폴라투주맙, IFN-알파, 항-CD40 작용제, 항-OX40 항체, OX40 효현제, 항-CSF-1R 항체, 항-CEA 항체, IDO 억제제 또는 항-TIGIT 항체이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IL2, 조작된 IL2, IL15, 또는 조작된 IL15이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 CD16에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 CD16A에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 수지상 세포 활성화제 또는 수지상 세포 성장 인자와 같은 수지상 세포 조정제이다.
상기 예측 방법 또는 모니터링 방법 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, 암 백신이 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 암 백신은 맞춤형 암 백신 (PCV)이다.
상기 예측 방법 또는 모니터링 방법 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 일부 실시양태에서, 세포 요법이 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 CAR-T이다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 신생항원-특이적 T 세포이다.
본원에는 면역요법제에 대한 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계 및; b) 표지된 CD8 결합제가 대상체의 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 결합하는 것을 검출하는 단계, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제에 반응할 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것은 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것은 대상체에 대해 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다: (c) 결합이 검출된 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제를 투여하는 단계. 일부 실시양태에서, 검출은 투여 후 약 1일 또는 그 미만 이내에 (예를 들어, 약 6시간, 4시간, 2시간, 90분, 1시간, 30분 또는 그 미만 이내에) 실행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1회 이상, 예컨대 연간 약 1 내지 4회 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD8 결합제의 이전 투여 후 적어도 1일 후에 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1년 초과 동안 반복된다.
또한 본원에는 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계, 및 b) 1차 시점 및 2차 시점에 대상체의 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계, 여기서 1차 시점 및 2차 시점으로부터의 CD8+ T 세포의 증가는 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환이 진행되었다는 표시이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것은 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것은 대상체에 대해 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다: (c) 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제를 투여하는 단계이고, 여기서 2차 시점에서의 질환 조직 내 CD8+ T 세포의 수준은 1차 시점에서의 질환 조직 내 CD8+ T 세포의 수준보다 낮다. 일부 실시양태에서, 검출은 투여 후 약 1일 또는 그 미만 이내에 (예를 들어, 약 6시간, 4시간, 2시간, 90분, 1시간, 30분 또는 그 미만 이내에) 실행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1회 이상, 예컨대 연간 약 1 내지 4회 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD8 결합제의 이전 투여 후 적어도 1일 후에 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1년 초과 동안 모니터링된다.
본원에는 면역요법제를 제공받았거나 이를 제공받고 있는 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환을 가진 대상체에서 치료 진행을 모니터하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: i) 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 표지된 CD8 결합제를 면역요법제와 함께 대상체에게 투여하는 단계, 및 ii) 1차 시점 및 2차 시점에서 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것은 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것은 대상체에 대해 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 CD8 결합제는 면역요법제 이전에 투여되고, 여기서 1차 시점은 표지된 CD8 결합제의 투여 후 그리고 면역요법제의 투여 전이며, 여기서 2차 시점은 면역요법제의 투여 후이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 표지된 CD8 결합제 이전에 투여되고, 여기서 1차 시점은 면역요법제의 투여 후 그리고 표지된 CD8 결합제의 투여 후이고, 여기서 2차 시점은 1차 시점 후이다. 일부 실시양태에서, 검출은 투여 후 약 1일 또는 그 미만 이내에 (예를 들어, 약 6시간, 4시간, 2시간, 90분, 1시간, 30분 또는 그 미만 이내에) 실행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 1회 이상, 예컨대 연간 약 1 내지 4회 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD8 결합제의 이전 투여 후 적어도 1일 후에 반복된다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 1년 초과 동안 모니터링된다.
본원에는 면역요법제를 이용한 치료에 대한 반응성과 관련된 장내 미생물 균주 식별 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: a) 면역요법제를 이용한 치료에 반응성인 대상체 및 면역요법제를 이용한 치료에 반응성이 아닌 대상체를 포함하는, 암을 갖는 대상체의 집단으로부터 장내 미생물총(microbiome) 샘플을 수득하는 단계; b) 치료에 반응성인 대상체의 장내 미생물총 샘플 및 치료에 반응성이 아닌 대상체의 장내 미생물총 샘플을 분석하는 단계; 및 c) 치료에 반응성인 대상체와 관련된 장내 미생물 균주를 식별하는 단계; 여기서 반응성은 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출함으로써 결정되고, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제에 반응성임을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 면역요법제에 대한 반응성과 관련된 장내 미생물 균주를 포함하는 미생물총-기반 약물을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 항-PD-1 항체이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 항-PD-L1 항체, 예컨대 아테졸리주맙이다.
추가로 본원에는 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 (또는 어느 하나에 적용되는) CD8 결합제, 예컨대 표지된 CD8 결합제를 포함하는 키트 및 제조 물품이 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트 또는 제조 물품은 상기 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 CD8 결합제의 용도에 대한 지시를 포함한다.
도 1은 라마 VHH wt2C8 (서열식별번호: 1), 인간화된 VHH hu2C8v130 (서열식별번호: 2), hu2C8v142 (서열식별번호: 3) 및 hu2C8v144 (서열식별번호: 4), 및 비-결합 대조군 2C8v145 (서열식별번호: 5)를 포함하는 예시적인 항-CD8 VHH 도메인의 아미노산 서열의 정렬을 제공한다.
도 2는 인간 CD8a (서열식별번호: 13), 시노몰구스 CD8a (서열식별번호: 14), 및 레서스 CD8a (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열의 정렬을 제공한다.
도 3은 OKT8-Fc와 비교하여 VHH-Fc 변이체의 CD8+ 세포-특이적 결합을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 4는 2C8 VHH에 결합된 건강한 지원자로부터의 전혈 세포 샘플의 염색의 예시적인 결과를 보여준다. OKT8은 양성 대조군으로서의 역할을 하는 항-CD8 IgG 이다. 3E8 VHH는 비-결합 음성 대조군이다.
도 5는 2C8 VHH의 결정 구조의 도식을 보여준다. 좌측의 구조는 CD8α/8α 동종이량체 (에피토프가 백색으로 강조 표시된 흑색, 결정학적 대칭 연산자를 통해 재구성된 이량체)에 결합된 2C8 VHH (밝은 회색)를 보여준다. 우측 구조는 2C8 VHH의 중첩을 보여준다: CD8α/β 이종이량체를 갖는 MHC 분류 I 복합체의 공개된 구조 상에 CD8α/8α 복합체 (좌측 패널과 동일한 색상) (PDB ID: 3DMM, MHC I는 밝은 회색으로 제시되고, CD8β는 중간 회색으로 제시된다).
도 6은 96명의 건강한 공여자로부터의 혈액 샘플에서 기존의 항-VHH 항체에 대한 야생형 2C8 및 2C8.v144 VHH의 결합을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 7a는 2C8v130, Lys2 VHH (비-결합 대조군) 또는 PBS (비히클)의 존재 하에 CD8+ T 세포 증식을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 7b는 2C8v130, Lys2 VHH (비-결합 대조군) 또는 PBS (비히클)의 존재 하에 항-CD3 및 항-CD28을 통한 폴리클로날 T 세포 자극에 대한 CD8+ T 세포 프로테아제 방출 반응을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 7c는 SEB 자극 후 2C8v130, Lys2 VHH (비-결합 대조군) 또는 PBS (비히클)의 존재 하에 CD8+ T 세포 증식을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 7d는 CEF 펩티드 풀에 의한 자극 후 2C8v130, Lys2 VHH (비-결합 대조군) 또는 PBS (비히클)의 존재 하에 CD8+ T 세포 증식을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 7e는 LPS 자극 후 2C8v130, Lys2 VHH (비-결합 대조군) 또는 PBS (비히클)의 존재 하에 CD8+ T 세포 증식을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 8a는 10% FBS가 배양 배지로서 사용된, 2C8v130, Lys2 VHH (비-결합 대조군) 또는 PBS (비히클)의 존재 하에 CD8+ T 세포 증식을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 8b는 10% 자가 공여자 혈장이 배양 배지로서 사용된, 2C8v130, Lys2 VHH (비-결합 대조군) 또는 PBS (비히클)의 존재 하에 CD8+ T 세포 증식을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 8c는 10% FBS가 배양 배지로서 사용된, SEB 자극 후 2C8v130, Lys2 VHH (비-결합 대조군) 또는 PBS (비히클)의 존재 하에 CD8+ T 세포 증식을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 8d는 10% 자가 공여자 혈장이 배양 배지로서 사용된, SEB 자극 후의 2C8v130, Lys2 VHH (비-결합 대조군) 또는 PBS (비히클)의 존재 하에서의 CD8+ T 세포 증식을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 9는 키메라 HPBALL/Daudi 종양 이종이식편 마우스에서 18F-항-CD8 VHH에 의한 CD8 영상화 능력을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
도 10은 89Zr-OA mAb 대조군 또는 89Zr-huOKT8.v1-OA를 주사(0일) 후 5일차 (즉, 6일째) (좌측), 또는 18F-대조군 VHH 또는 18F-항-CD8 VHH를 주사한 후 90분 후 (우측)의 TALL1 종양 이종이식된 마우스의 PET MIP를 보여준다.
도 11은 18F-항-CD8 VHH (상부) 또는 18F-대조군 VHH (하부)의 주사 후 1시간째의 레서스 원숭이의 PET MIP 영상을 보여준다.
본원에는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제 (항-CD8 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)가 제공되며, 여기서 CD8 결합제는 인간 CD8에 높은 친화도로 특이적으로 결합하지만, CD8+ T 세포를 자극 또는 억제하거나 CD8+ T 세포 증식을 유도하지 않는다. CD8 결합제는 비-인간 영장류, 예컨대 레서스 및 시노몰구스 원숭이에서 CD8에 높은 친화도로 결합할 수 있다. 전통적인 4-쇄 항체를 기반으로 하는 CD8 결합제와 비교하여, 본원에 기재된 CD8 결합제는 더 높은 투과도 및 더 짧은 혈청 반감기를 갖는다. 따라서, 본원에 기재된 CD8 결합제는 투여 후 짧은 기간 내에 (예를 들어, 1일 내에, 예컨대 1시간 내에) CD8+ 세포 (예를 들어, CD8+ T 세포)의 존재, 국재화 및/또는 양을 검출하는데 적합하여, 다른 바이오마커와 조합하여 당일 판독, 반복 영상화 및 다중화 영상화를 가능하게 한다. 추가적으로, 본원에 기재된 CD8 결합제는 CD8에 대한 높은 감도, 넓은 동적 범위에 걸친 CD8 수준과의 선형 상관관계, 투과도와 같은 외부 인자에 대한 감소된 감도로 인한 높은 정밀도, 및 마우스 이종이식편 모델에서 높은 종양 대 혈액 비로 반영되는 바와 같은 높은 영상 품질을 보여준다.
본원에는 생체내에서 CD8+ T-세포를 검출하는 방법에서 CD8 결합제를 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 면역요법제를 이용한 치료에 대한 질환 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환)을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법에서 본원의 CD8 결합제를 사용하는 방법이 제공된다. 추가로, 면역요법제를 이용한 치료를 받고 있는 질환 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환)을 갖는 대상체에서 질환 진행 및/또는 치료 진행을 모니터링하기 위해 본원의 CD8 결합제를 사용하는 방법이 제공된다.
정의
본원에서 용어 "인간 CD8"은 인간에서 분화 8 분자의 클러스터에 대응하는 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 일부분을 지칭한다. 전장 인간 CD8은 T 세포 수용체에 대한 보조수용체로서 작용하는 막횡단 당단백질이다. 인간 CD8 단백질은 CD8α 및 CD8β 쇄를 포함하는 한 쌍의 CD8 쇄로 구성된 이량체이다. 용어 "인간 CD8"은 CD8α/CD8α 동종이량체, CD8α/CD8β 이종이량체, CD8α 쇄, CD8β 쇄, 또는 이의 일부분, 예컨대 세포외 도메인(들)을 포괄한다. " CD8a" 및 " CD8α"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, " CD8b" 및 " CD8β"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 인간 CD8α 쇄의 예시적인 서열이 도 2에 제시된다.
본원에서 용어 "CD8 결합제"는 임의의 CD8 결합 분자를 지칭한다. CD8 결합제는 인간 CD8, 시노몰구스 CD8, 및/또는 다른 비-인간 CD8 단백질 또는 펩티드에 결합하는 폴리펩티드, 단백질, 항체 (4-쇄 항체, 또는 중쇄 항체 포함), 항체 단편 (예를 들어, VHH), 또는 면역접합체일 수 있다. CD8 결합제는 또한 소분자 표지와 같은 표지, 예를 들어 방사성핵종을 포함할 수 있다. 표지를 포함하는 CD8 결합제는 또한 본원에서 "표지된 CD8 결합제"로 지칭된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 일가 항체 (예를 들어, 단일-아암 항체), 4-쇄 항체 (예컨대 IgG 항체), 중쇄 항체, 및 원하는 항원-결합 활성, 즉 CD8 (예컨대 인간 CD8, 시노몰구스 CD8, 및/또는 레서스 CD8)에 대한 결합을 나타내는 한 이의 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다. 용어 "4-쇄 항체"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.
"항체 단편"은 항체의 일부분, 바람직하게는 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 VHH, 단일-도메인 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]] 참조); 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. 용어 "불변 도메인"은 항원-결합 부위를 함유하는 가변 도메인인 면역글로불린의 다른 일부분에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 일부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 (총칭하여, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.
본원에서 용어 "Fc 영역" 또는 "단편 결정화가능 영역"은 고유-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 이의 카르복실-말단까지의 스트레치(stretch)로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 체계에 따른 잔기 447)은, 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산을 재조합에 의해 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기를 갖는 항체와 갖지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 항체에 사용하기에 적합한 고유-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예를 들어, 이성질체화, 아미드화)을 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 전형적으로 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 그의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않고 하이브리도마(hybridoma) 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 출원에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 충분히 항원-결합 특이성을 부여할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조하라.
"중쇄-단독 항체" 또는 "HCAb"로도 공지된 용어 "중쇄 항체"는 2개의 중쇄를 포함하지만, 4-쇄 항체에서 통상적으로 발견되는 2개의 경쇄가 결여된 기능성 항체를 지칭한다. 낙타류 동물(예컨대 낙타, 라마 또는 알파카)은 HCAb를 생산하는 것으로 공지되어 있다.
용어 "단일-도메인 항체" 또는 "sdAb"는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 단일 항원-결합 도메인을 지칭한다. sdAb 단독은 상응하는 CDR-함유 폴리펩티드와 쌍을 형성하지 않으면서 항원에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 단일-도메인 항체는 낙타류 HCAb로부터 조작되고, "VHH"(하기 정의된다)로 지칭된다. 낙타류 sdAb는 가장 작은 공지된 항원-결합 항체 단편 중 하나이다(예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8 (1993); Greenberg et al., Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013)] 참조).
용어 "VHH" 또는 "중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인"은 중쇄 항체의 단일, 중쇄 가변 도메인을 지칭한다. VHH 분자는 낙타과(Camelidae) 종, 예를 들어 낙타, 라마, 비쿠냐, 단봉낙타, 알파카 및 구아나코에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있다. 기본 VHH는 N-말단에서 C-말단까지 하기 구조를 갖는다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, 여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변인 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 및/또는 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고 및/또는 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 항체 단편은 6개의 HVR: VH에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 일반적으로, 중쇄 항체는 3개의 HVR (HVR1, HVR2, HVR3)을 포함한다.
다수의 HVR 서술(delineation)이 사용되고 있고, 본원에 포괄된다. 본원의 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 항체 단편에 대한 예시적인 HVR은 하기를 포함한다: (a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]); (b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]); (c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉부 (문헌[MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및 (d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)를 포함하는 (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
별도의 표시가 없는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
단일-도메인 항체 (예컨대 VHH)의 아미노산 잔기는 논문 [Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun. 23; 240 (1-2): 185-195]에서 낙타류로부터의 VHH 도메인에 적용된 바와 같이, 카바트 등(Kabat et al.)의 문헌["Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., Publication No. 91])에 의해 제공된 VH 도메인에 대한 일반적인 넘버링에 따라 넘버링될 수 있다. 이 넘버링에 따르면, VHH의 FR1은 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR1은 위치 31-35의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 FR2는 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR2는 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 FR3은 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR3은 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함한다. 이와 관련하여, VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 해당 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 각각의 CDR 내의 아미노산 잔기의 총수는 달라질 수 있고, 카바트 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총수에 대응하지 않을 수 있다는 것을 알 수 있다 (즉, 카바트 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 또는 실제 서열은 카바트 넘버링에 의해 허용되는 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다).
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종과 동일하거나 이로부터 유래된 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종과 동일하거나 이로부터 유래된 항체를 지칭한다.
"인간화" 항체는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 낙타류, 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 특정 측면에서, "인간화" 항체는 비-인간 (예를 들어, 낙타류) CDR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조하라.
"친화도-성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여, 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 이의 하나 이상의 CDR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 친화도-성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도-성숙 항체는 해당 분야에서 공지된 절차에 의해 생산된다. 예를 들어, CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은, 예를 들어 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
본원에서 식별된 폴리펩티드 및 항체 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성" 또는 "상동성"은 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하여 서열을 정렬한 후에 비교되는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 해당 분야의 기술 범위 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)에 의해 작성되었고, 소스 코드(source code)는 미국 저작권청 (Washington D.C., 20559)에 사용자 문서로 제출되어 있으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코(South San Francisco, California)의 제넨테크, 인크.를 통해 공개적으로 이용가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D에서의 사용을 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 가변적이지 않다.
본원에 사용된 바와 같은 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은, 예를 들어 표적에 대해 적어도 약 10-4 M, 대안적으로 적어도 약 10-5 M, 대안적으로 적어도 약 10-6 M, 대안적으로 적어도 약 10-7 M, 대안적으로 적어도 약 10-8 M, 대안적으로 적어도 약 10-9 M, 대안적으로 적어도 약 10-10 M, 대안적으로 적어도 약 10-11 M, 대안적으로 적어도 약 10-12 M 이상의 KD를 갖는 분자에 의해 나타내어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 지칭한다. KD는 해당 분야에 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 표면 플라스몬 공명 (SPR), 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석, 또는 방사성면역침강법 (RIA)에 의해 결정될 수 있다. 특이적 결합은, 예를 들어 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비-표지된 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비-표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우에 특이적 결합이 표시된다.
본원에 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하여 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 출원의 목적상, 유익한 또는 원하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 질환으로 인한 하나 이상의 증상을 경감시키는 것, 질환의 정도를 감쇠시키는 것, 질환을 안정화시키는 것 (예를 들어, 질환의 악화를 예방 또는 지연시키는 것), 질환의 확산 (예를 들어, 전이)을 예방 또는 지연시키는 것, 질환의 재발을 예방 또는 지연시키는 것, 질환의 진행을 지연 또는 둔화시키는 것, 질환 상태를 호전시키는 것, 질환의 (부분적 또는 전체적) 완화를 제공하는 것, 질환 치료에 필요한 하나 이상의 다른 약물의 용량을 감소시키는 것, 질환의 진행을 지연시키는 것, 삶의 질을 증가 또는 개선시키는 것, 체중 증가를 증가시키는 것, 및/또는 생존을 연장시키는 것. 또한 “치료”에는 암의 병리학적 결과 (예컨대, 예를 들어, 종양 부피)의 감소가 포괄된다. 본원에 제공된 방법은 치료의 이러한 측면들 중 어느 하나 이상을 고려한다.
본원에 개시된 바와 같은 CD8 결합제 또는 조성물의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 실행하기에, 예를 들어 생체내 CD8+ T-세포를 영상화하기에 충분한 양이다. "유효량"은 실험적으로 및 상기 언급된 목적(예컨대 생체내 CD8+ T-세포의 영상화)과 관련된 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 대상체 (예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 유효한, 예를 들어 면역요법제 (예컨대 본원의 다른 곳에 기재된 면역요법제), 세포 요법 또는 암 백신의 양을 지칭한다. 암의 경우, 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신의 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소; 종양 크기 또는 중량을 감소; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제 (예를 들어, 어느 정도 둔화, 바람직하게는 중단); 종양 전이를 억제 (예를 들어, 어느 정도 둔화, 바람직하게는 중단); 종양 성장을 어느 정도 억제; 및/또는 암과 관련된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신이 기존의 암 세포의 성장을 예방 및/또는 이를 사멸시킬 수 있다면, 이는 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효량은 성장 억제 양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료적 유효량은 환자의 생존을 연장시키는 양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료적 유효량은 환자의 무진행 생존을 개선시키는 양이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 레서스 및 시노몰구스 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 "반응성"은 대상체가 치료제 (예를 들어, 면역요법제)를 이용한 치료를 받고 있거나 받은 경우 유리한 반응의 발생을 지칭한다. 유리한 반응의 예는 치료제 (예를 들어, 면역요법제)를 이용한 치료 중 또는 치료 후에 대상체에서의 종양 성장의 억제인 반면, 불리한 반응의 예는 치료제 (예를 들어, 면역요법제)를 이용한 치료 중 또는 치료 후에 대상체에서의 종양의 성장 지속 또는 성장 가속화이다.
본원에 사용된 "질환 진행의 모니터링"은 질환 증상이 악화, 안정화 또는 개선되었는지 (즉, 중증도가 덜하게 되었는지) 여부를 결정하기 위해 대상체 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환으로 진단된 대상체)를 연속적인 시간 간격으로 평가하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 특정 경우에, 대상체에서 암의 진행을 모니터링하는 것은 종양의 중량 또는 크기 (예컨대 종양 퇴행 또는 종양 성장), 진행까지의 시간, 생존 기간, 무진행 생존 길이, 전체 반응률, 반응 기간, 삶의 질, 질환 마커의 발현 및/또는 활성 (예를 들어, 특정 유전자 및/또는 단백질의 발현), 또는 해당 분야에 공지된 다른 기준에서의 변화를 모니터링하는 것을 포함할 수 있다. 암 환자에서 질환 진행을 모니터링하기 위한 추가 접근법, 예를 들어 영상화 기술을 통한 치료에 대한 반응의 측정이 사용될 수 있으며, 이는 본원의 다른 부분에 더 상세히 기재되어 있다.
본원에 사용된 "치료 진행의 모니터링"은 치료의 결과로서 질환 증상이 악화, 안정화 또는 개선되었는지 (즉, 중증도가 덜하게 되었는지) 여부를 결정하기 위해 치료 (예를 들어, 면역요법제를 이용한 치료) 중 또는 치료 후에 연속적인 시간 간격으로 대상체 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환으로 진단된 대상체)를 평가하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 대상체 (예를 들어, 면역요법제를 이용한 치료를 받았거나 받고 있는 대상체)에서의 치료 진행은 질환 진행을 모니터링하는데 사용된 것과 동일한 기준을 사용하여 모니터링될 수 있다.
본원에 사용된 "제약학적으로 허용가능한" 또는 "약리학적으로 상용성인"은 생물학적으로 또는 그 외에도 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 예를 들어 상기 물질은 임의의 유의한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 또는 그것이 함유된 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 환자에게 투여되는 제약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 바람직하게는 필요한 독물학적 및 제조 시험의 표준을 충족시키며 및/또는, 미국 식품 의약품국에 의해 작성된 비활성 성분 가이드(Inactive Ingredient Guide) 상에 포함된다.
본원에 사용된 "와 함께"는 제2 작용제, 예를 들어 면역요법제, 또는 또 다른 진단 영상화제의 투여와 관련하여, 예를 들어 본원에 기재된 CD8 결합제의 투여 시기를 지칭한다. 예를 들어, 면역요법제와 함께 본원에 기재된 CD8 결합제의 투여는 CD8 결합제가 면역요법제가 투여되기 전에, 면역요법제가 투여된 후에, 면역요법제의 투여와 함께, 또는 면역요법제의 투여와 동시에 투여될 수 있음을 의미한다. 추가 작용제는 CD8 결합제 및 면역요법제가 투여되기 전 또는 후에 투여될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, CD8 결합제 및 면역요법제의 순차적 투여 사이에 다른 작용제가 투여될 수 있다.
용어 "검출"은 재료의 존재 또는 부재를 결정하는 것 또는 재료(예컨대 CD8)의 양을 정량하는 것을 포함하는 것으로 한다. 따라서, 상기 용어는 정성적 및 정량적 측정을 위한 본 출원의 물질, 조성물 및 방법의 사용을 지칭한다. 일반적으로, 검출에 사용되는 특정 기술은 본 출원의 방법의 실시에 중요하지 않다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따른 "검출"은 CD8 폴리펩티드의 존재 또는 부재 또는 CD8 폴리펩티드의 수준의 변화를 관찰하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "검출하는"은 야생형 CD8 수준 (예를 들어, mRNA 또는 폴리펩티드 수준)을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 검출은 대조군과 비교할 때 10% 내지 90%의 임의의 값, 또는 30% 내지 60%의 임의의 값, 또는 100% 초과의 변화 (증가 또는 감소)를 정량화하는 것을 포함할 수 있다. 검출은 2-배 내지 10-배(이를 포함), 또는 그 초과, 예를 들어 100-배의 임의의 값의 변화를 정량화하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 단어 "표지"는 항체 (예를 들어, VHH)에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
본원에서 "약" 해당 값 또는 매개변수에 대한 언급은 이 기술 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 해당 값 또는 매개변수에 대한 언급은 그 해당 값 또는 매개변수 그 자체에 관한 측면을 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 지칭하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본 출원의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태를 "포함하는", "구성되는" 및 "필수적으로 구성되는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태(“a,”“an”및 “the”)는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
"A 및/또는 B"와 같은 어구와 같이 본원에서 사용된 용어 "및/또는"은 A 및 B 모두; A 또는 B; A (단독); 및 B (단독)를 포함하는 것으로 한다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구와 같이 본원에 사용된 용어 "및/또는"은 각각의 하기 실시양태를 포괄하는 것으로 한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
명백하게 하기 위해, 별개의 실시양태와 관련하여 기재된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 실시양태와 조합되어 제공될 수 있는 것으로 이해된다. 반대로, 간결하게 하기 위해, 단일 실시양태와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 제공될 수 있다. CD8 결합제 및 이의 사용 방법에 관한 실시양태의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포괄되고, 각각의 및 모든 조합이 본원에 개별적으로 및 명백하게 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
CD8 결합제
a. 기능적 특성
본원에 제공된 CD8 결합제는 VHH 도메인 (예를 들어, 낙타류 또는 인간화 VHH)을 포함하고, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: (a) CD8 결합제는 인간 CD8에 약 1 nM 이하의 KD로 특이적으로 결합한다; (b) CD8 결합제는 약 0.002/s 이하 (예를 들어, 약 0.0018/s, 또는 약 0.00085/s)의 koff로 인간 CD8에 결합한다; (c) CD8 결합제는 시노몰구스 CD8에 약 1 nM 이하의 KD로 결합한다; (d) CD8 결합제는 시노몰구스 CD8에 약 0.004/s 이하 (예를 들어, 약 0.0037/s, 또는 약 0.0019/s)의 koff로 결합한다; (e) CD8 결합제는 CD8+ T 세포의 활성화를 억제 또는 자극하지 않는다; (f) CD8 결합제는 CD8+ T 세포 증식을 유도하지 않는다; (g) CD8 결합제는 CD4+ 세포에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 본원에 기재된 CD8 결합제의 하나 이상의 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 표지된 VHH 도메인 (즉, 검출가능한 표지에 접합된 VHH 도메인)은 본원에 기재된 CD8 결합제의 하나 이상의 특성을 갖는다.
본원에 기재된 CD8 결합제는 CD8에 높은 친화도 및 특이성으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 인간 CD8에 약 1 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.25 nM, 0.2 nM, 0.15 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 이하 (예를 들어, 10-9 M 이하, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M, 또는 10-10 M 내지 10-12 M) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 레서스 CD8에 약 1 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.25 nM, 0.2 nM, 0.15 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 이하 (예를 들어, 10-9 M 이하, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M, 또는 10-10 M 내지 10-12 M) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 시노몰구스 CD8에 1 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.25 nM, 0.2 nM, 0.15 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 이하 (예를 들어, 10-9 M 이하, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M, 또는 10-10 M 내지 10-12 M) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 (a) 인간 CD8에 약 1 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.25 nM, 0.2 nM, 0.15 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 이하 (예를 들어, 10-9 M 이하, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M, 또는 10-10 M 내지 10-12 M) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 KD로 결합하고; (b) 레서스 CD8에 약 1 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.25 nM, 0.2 nM, 0.15 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 이하 (예를 들어, 10-9 M 이하, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M, 또는 10-10 M 내지 10-12 M) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 KD로 결합하고, 및 (c) 시노몰구스 CD8에 약 1 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.25 nM, 0.2 nM, 0.15 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 이하 (예를 들어, 10-9 M 이하, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M, 또는 10-10 M 내지 10-12 M) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 인간 CD8에 약 150 pM 이하의 KD로 결합하고, CD8 결합제는 시노몰구스 원숭이 CD8에 약 350 pM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 인간 CD8에 약 132 pM의 KD로 결합하고, CD8 결합제는 시노몰구스 원숭이 CD8에 약 344 pM의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 인간 CD8에 약 50 pM 이하의 KD로 결합하고, CD8 결합제는 시노몰구스 원숭이 CD8에 약 150 pM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 인간 CD8에 약 50 pM의 KD로 결합하고, CD8 결합제는 시노몰구스 원숭이 CD8에 약 137pM 의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8은 CD8α이다. 일부 실시양태에서, CD8은 CD8α/CD8α 동종이량체이다. 일부 실시양태에서, CD8은 CD8α/CD8β 이종이량체이다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 인간 CD8에 약 0.01/s, 0.005/s, 0.004/s, 0.003/s, 0.002/s, 0.0015/s, 0.001/s, 0.0005/s, 0.0002/s, 0.0001/s 이하 (예를 들어, 10-2/s 이하, 예를 들어, 10-5/s 내지 10-2/s, 또는 10-4/s 내지 10-3/s) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 koff로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 레서스 CD8에 약 0.01/s, 0.005/s, 0.002/s, 0.001/s, 0.0005/s, 0.004/s, 0.003/s, 0.002/s, 0.0015/s, 0.001/s, 0.0005/s 이하 (예를 들어, 10-2/s 이하, 예를 들어, 10-5/s 내지 10-2/s, 또는 10-4/s 내지 10-3/s) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 koff로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 시노몰구스 CD8에 약 0.01/s, 0.005/s, 0.002/s, 0.001/s, 0.0005/s, 0.004/s, 0.003/s, 0.002/s, 0.0015/s, 0.001/s, 0.0005/s 이하 (예를 들어, 10-2/s 이하, 예를 들어, 10-5/s 내지 10-2/s, 또는 10-4/s 내지 10-3/s) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 koff로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 (a) 인간 CD8에 약 0.01/s, 0.005/s, 0.004/s, 0.003/s, 0.002/s, 0.0015/s, 0.001/s, 0.0005/s, 0.0002/s, 0.0001/s 이하 (예를 들어, 10-2/s 이하, 예를 들어, 10-5/s 내지 10-2/s, 또는 10-4/s 내지 10-3/s) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 koff로 결합하고; (b) 레서스 CD8에 약 0.01/s, 0.005/s, 0.002/s, 0.001/s, 0.0005/s, 0.004/s, 0.003/s, 0.002/s, 0.0015/s, 0.001/s, 0.0005/s 이하 (예를 들어, 10-2/s 이하, 예를 들어, 10-5/s 내지 10-2/s, 또는 10-4/s 내지 10-3/s) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 koff로 결합하고; (c) 시노몰구스 CD8에 약 0.01/s, 0.005/s, 0.002/s, 0.001/s, 0.0005/s, 0.004/s, 0.003/s, 0.002/s, 0.0015/s, 0.001/s, 0.0005/s 이하 (예를 들어, 10-2/s 이하, 예를 들어, 10-5/s 내지 10-2/s, 또는 10-4/s 내지 10-3/s) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 koff로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 0.002/s 이하의 koff로 인간 CD8에 결합하고, CD8 결합제는 약 0.004/s 이하의 koff로 시노몰구스 원숭이 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 0.0018/s의 koff로 인간 CD8에 결합하고, CD8 결합제는 약 0.0037/s의 koff로 시노몰구스 원숭이 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 0.001/s의 koff로 인간 CD8에 결합하고, CD8 결합제는 약 0.002/s의 koff로 시노몰구스 원숭이 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 약 0.00085/s의 koff로 인간 CD8에 결합하고, CD8 결합제는 약 0.0019/s의 koff로 시노몰구스 원숭이 CD8에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8은 CD8α이다. 일부 실시양태에서, CD8은 CD8α/CD8α 동종이량체이다. 일부 실시양태에서, CD8은 CD8α/CD8β 이종이량체이다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 인간 CD8에 약 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 이상 (예를 들어, 적어도 15분, 예를 들어 15분 내지 6시간, 또는 30분 내지 2시간) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 CD8-결합 반감기 (예를 들어, 시험관내 결합 분석에서)로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 레서스 CD8에 약 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 이상 (예를 들어, 적어도 15분, 예를 들어 15분 내지 6시간, 또는 30분 내지 2시간) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 CD8-결합 반감기로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 시노몰구스 CD8에 약 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 이상 (예를 들어, 적어도 15분, 예를 들어 15분 내지 6시간, 또는 30분 내지 2시간) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 CD8-결합 반감기로 결합한다.
인간 CD8, 레서스 CD8 및/또는 시노몰구스 CD8에 대한 본원에 제공된 CD8 결합제의 KD 및 koff는, 예를 들어 ELISA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석, 방사성면역침강법 (RIA), 및 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 해당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 CD8, 레서스 CD8 및/또는 시노몰구스 CD8에 대한 본원에 제공된 CD8 결합제의 KD 및/또는 koff는 SPR을 통해 결정된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제의 KD 및/또는 koff는 시약으로서 CD8α/ CD8β-Fc 융합 단백질을 사용하는 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, CD8α/ CD8β-Fc 융합 단백질은 단일-아암 인간 CD8α/인간 CD8β-Fc 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, CD8α/ CD8β-Fc 융합 단백질은 단일-아암 시노몰구스 CD8α/시노몰구스 CD8β-Fc 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단일-아암 CD8α/ CD8β-Fc 융합 단백질은 Fc의 하나의 폴리펩티드 쇄에 융합된, 인간 CD8α 및 인간 CD8β를 포함하는 단일-쇄 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일-아암 CD8α/ CD8β-Fc 융합 단백질은 Fc의 하나의 폴리펩티드 쇄에 융합된, 시노몰구스 CD8α 및 시노몰구스 CD8β를 포함하는 단일-쇄 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 CD8, 레서스 CD8 및/또는 시노몰구스 CD8에 대한 본원에 제공된 CD8 결합제의 KD는 FACS를 통해 결정된다. 예시적인 인간, 레서스, 및 시노몰구스 CD8α 아미노산 서열이 도 2에 제시된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 마우스 CD8에 결합(예를 들어, 특이적으로 결합)하지 않는다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 래트 CD8에 결합(예를 들어, 특이적으로 결합)하지 않는다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 예를 들어 SPR 및/또는 FACS를 통해 결정시, 마우스 CD8 또는 래트 CD8에 결합(예를 들어, 특이적으로 결합)하지 않는다.
본원에 기재된 CD8 결합제의 특성은 널리 공지된 방법, 예를 들어 하기 실시예에 사용된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD8+ T 세포 증식은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 및 본원에 제공된 CD8 결합제의 존재 하에 시험관내에서 평가된다. 일부 실시양태에서, CD8+ T 세포 증식은 PBMC, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 본원에 제공된 CD8 결합제의 존재 하에 시험관내에서 평가된다. 일부 실시양태에서, CD8+ T 세포 증식은 스타필로코쿠스 장독소 B (Staphylococcus enterotoxin B) (SEB), 및 본원에 제공된 CD8 결합제로 자극된 PBMC의 존재 하에 시험관내에서 평가된다. 일부 실시양태에서, CD8+ T 세포 증식은 CEF 펩티드 풀, 및 본원에 제공된 CD8 결합제로 자극된 PBMC의 존재 하에 시험관내에서 평가된다. 일부 실시양태에서, CD8+ T 세포 증식은 지질다당류 (lipopolysaccharide) (LPS), 및 본원에 제공된 CD8 결합제로 자극된 PBMC의 존재 하에 시험관내에서 평가된다. 일부 실시양태에서, 시험관내 분석은 배지로서 10% FBS를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 시험관내 분석은 배지로서 10% 자가 공여자 혈장을 사용하여 수행되며, 여기서 공여자 혈장 및 PBMC는 동일한 공여자로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 인간 CD4+ T 세포에 결합(예를 들어, 특이적으로 결합)하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 인간 CD3- 세포에 결합(예를 들어, 특이적으로 결합)하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 인간 CD4+ T 세포 또는 인간 CD3- 세포에 결합(예를 들어, 특이적으로 결합)하지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간 CD4+ T 세포 또는 인간 CD3- 세포에 대한 본원에 제공된 CD8 결합제에 의한 특이적 결합의 결여는 실시예에서 논의되는 바와 같이 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 통해 검출된다.
본원에는 상기 기재된 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는 예시적인 CD8 결합제 (항-CD8 항체 및 이의 항체 단편 포함)가 제공된다. 일부 실시양태에서, Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 및 Thr97을 포함하는 인간 CD8α 에피토프에 특이적으로 결합하는 VHH 도메인을 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 13에 따른 것인 CD8 결합제가 제공된다. 또한 Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 및 Thr97을 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 13에 따른 것인 인간 CD8α 에피토프가 제공된다. 일부 실시양태에서, 인간 CD8α 에피토프 내의 아미노산 잔기는 인간 CD8α에 결합된 VHH 도메인 또는 CD8 결합제의 결정 구조 내의 VHH 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기로부터 약 4.5 Å 이내에 있다. 본원에 기재된 CD8 결합제 (예를 들어, 항-CD8 VHH) 중 어느 하나와 동일한 인간 CD8α 에피토프에 경쟁적으로 결합하는 항-CD8 항체가 추가로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 인간 CD8에 특이적으로 결합하는 낙타류 VHH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 인간 CD8에 특이적으로 결합하는 인간화 VHH 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열에서 적어도 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, (a) 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 또는 서열식별번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열에 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열에 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
예시적인 CDR 서열이 하기 도 1 및 표 1에서 제시된다.
표 1
Figure pct00002
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 L49A를 포함하는 VHH 도메인을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. L49A 돌연변이의 예는 도 1에서 서열식별번호: 2-4에 제시된다. 일부 실시양태에서, L49A 돌연변이는 단백질 A 컬럼을 사용한 CD8 결합제의 정제를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, L49A 돌연변이는 CD8 결합제의 수율을 적어도 약 2배, 5배, 10배 이상 증가시킨다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 VHH 도메인의 면역원성을 감소시키는, 예를 들어 CD8 결합제를 제공받은 대상체에서 기존의 항-VHH 항체에 대한 CD8 결합제의 결합을 감소시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이를 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 V89T 치환, T110Q 치환, S112Q 치환 및 A114 첨가로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 VHH 도메인을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 V89T 치환, T110Q 치환, S112Q 치환 및 A114 첨가를 포함하고, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른다. 이러한 돌연변이의 예는 도 1에서 서열식별번호: 2-4에 제시된다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 돌연변이는 CD8 결합제의 면역원성을 적어도 약 2배, 10배, 100배, 1000배 이상 감소시킨다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함한다.
예시적인 VHH 서열이 도 1에 제시된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 신장에서 제거된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 신장계에 의해 제거(예컨대, 대부분 제거)된다.
일부 실시양태에서, 항-CD8 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 VHH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 항-CD8 중쇄 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 중쇄 항체는 Fc 영역, 예컨대 낙타류 또는 인간 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 중쇄 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD8 항체는 모든 이펙터 기능은 아니지만 일부를 보유하는 Fc 변이체를 포함하며, 이는 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 응용분야에 대한 바람직한 후보가 되게 한다.
일부 실시양태에서, 항-CD8 항체 단편, 예컨대 항-CD8 단일-도메인 항체 또는 항-CD8 VHH가 제공된다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 Fc 영역을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 하나 이상의 비단백질성 모이어티를 포함한다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리 에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조상 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 가변적일 수 있으며, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 성질 또는 기능, 상기 항체 유도체가 정의된 조건 하에 요법에 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항에 기반하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 작용제의 혈청 반감기를 증가시키는 비단백질성 모이어티를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 가용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하지 않는다.
b. 변이체 및 변형
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD8 결합제 (예를 들어, 항-CD8 항체)의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, CD8 결합제의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. CD8 결합제의 아미노산 서열 변이체는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 CD8 결합제의 아미노산 서열 내의 (예컨대, 하나 이상의 CDR 및/또는 프레임워크 서열 내의 또는 VHH 도메인 내의) 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은)원하는 특성을 보유한다면, 최종 구출물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
"CD8 결합제 변이체"는 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 원하는 특성을 보유하는 CD8 결합제가 본원에 기재된 CD8 결합제의 VHH와 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VHH를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 CD8 결합제 변이체는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 VHH 도메인에 첨가되거나 그로부터 결실된 작용제를 포함한다. 대개는, CD8 결합제 변이체는 본원에 기재된 CD8 결합제에 대해 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성 중 어느 하나를 가질 것이다. 선택적으로, 변이체 CD8 결합제는 본원에 제공된 CD8 결합제 서열과 비교하여 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 본원에 제공된 CD8 결합제 서열과 비교하여 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 중 어느 하나 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 CD8 결합제 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 표 2 에서 "보존적 치환"의 표제 하에 제시된다. 보다 실질적인 변화는 표 2 에서 "예시적 치환"의 표제 하에 및 아미노산 측쇄 분류와 관련하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
표 2
Figure pct00003
CD8 결합제 변이체의 생물학적 성질에서의 실질적 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 치환 영역에서 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지시키는 것에 대한 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 아미노산은 그의 측쇄의 성질의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):
(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기반한 하기 군으로 나뉠 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 분류 중 하나의 구성원을 또 다른 분류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VHH 서열은 기준 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 해당 서열을 포함하는 CD8 결합제는 CD8 (예를 들어, 인간 CD8, 레서스 CD8 및/또는 시노몰구스 CD8)에 대한 결합 능력을 함유한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4에 제시된 VHH 서열(해당 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체 (예를 들어, 라마 VHH 또는 인간화 VHH)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 제작된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 성질의 변형(예를 들어, 개선) (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)을 가지고 및/또는 모 항체의 특정 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게 설명하면, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 제작된 변이체 VHH는 결합 친화도에 대해 시험된다. 제2 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발(error-prone) PCR, 쇄 셔플링(shuffling) 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 이어서, 제2 라이브러리가 생성된다. 이어서, 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지정 접근법을 수반하며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 식별될 수 있다. 특히 CDR3은 종종 표적화된다
일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 CD8 결합제가 CD8에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VHH 서열의 일부 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 식별에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들어, Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu와 같은 하전된 잔기)이 식별되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받았는지 여부를 결정한다. 초기 치환에 대한 기능적 감도를 입증하는 아미노산 위치에 추가 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 이용하여 항체와 항원 사이의 접촉점을 식별한다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 성질을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우)에 대한 항체의 N- 또는 C-말단 융합을 포함한다.
c. 검출가능한 표지를 포함하는 면역접합체
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 검출가능한 표지에 접합된 본원에 기재된 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH) 중 어느 하나를 포함하는 면역접합체이다. 용어 "표지" 또는 "검출가능한 표지"는 세포, 조직, 기관 등 상의 표적 분자 (예컨대 CD8)의 위치 및/또는 양을 진단, 검출 또는 시각화/영상화하는데 유용한 원자, 분자 또는 화합물을 지칭한다. 본원의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 검출가능한 표지는 방사성 재료 (예를 들어, 방사성동위원소, 방사성핵종, 방사성 표지 또는 방사성추적자), 염료 (예를 들어, 인도시아닌 그린 (ICG)), 조영제, 형광 화합물 또는 분자, 생물발광 화합물 또는 분자, 효소 및 강화제 (예를 들어, 상자성 이온)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 일부 나노입자, 예를 들어 양자점 및 금속 나노입자가 검출제로서 사용하기에 적합할 수 있다.
본원의 실시양태에 따라 검출가능한 표지로서 사용될 수 있는 방사성 재료는 18F, 32P, 33P, 45Ti, 47Sc, 52Fe, 59Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 75Sc, 77As, 86Y, 89Sr, 89Zr, 90Y, 90Nb, 94Tc, 99Tc, 99mTc, 99Mo, 105Pd, 105Rh, 111Ag, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 154-158Gd, 161Tb, 166Dy, 169Er, 175Lu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211At, 211Pb, 212Bi , 212Pb , 213Bi, 223Ra, 및 225Ac를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 검출가능한 표지로서 사용될 수 있는 예시적인 상자성 이온 재료는 전이 및 란탄족 금속 (예를 들어, 6 내지 9, 21 내지 29, 42 내지 44, 또는 57 내지 71의 원자 번호를 갖는 금속)의 이온을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 금속은 Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 및 Lu의 이온을 포함한다.
검출가능한 표지가 방사성 금속 또는 상자성 이온일 때, 일부 실시양태에서, 표지는 이들 이온에 결합하기 위해 긴 꼬리에 부착된 하나 이상의 킬레이팅기를 갖는 긴 꼬리를 갖는 시약과 반응할 수 있다. 긴 꼬리는 폴리리신, 다당류, 또는 킬레이팅기(즉, 이온과 결합을 위한)가 결합될 수 있는 펜던트(pendant)기를 갖는 다른 유도체화 또는 유도체화가능한 쇄와 같은 중합체일 수 있다. 본원의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 킬레이팅기의 예는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), DOTA, NOIA, NOGADA, NETA, NODA, NOTA, 데페록사민 (DfO), DFO* (즉, DFO-별), DFO- 스쿠아라미드, 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카르바존, 폴리옥심 등의 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 킬레이트는 면역반응성의 최소 손실 및 최소 응집 및/또는 내부 가교로 분자에 대한 결합의 형성을 가능하게 하는 기에 의해 본원에 제공된 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH)에 연결될 수 있다. 동일한 킬레이트가 비-방사성 금속 (예를 들어, 망가니즈, 철 및 가돌리늄)과 복합체를 형성시, 본원에 기재된 CD8 결합제와 함께 사용될 때 자기 공명 영상화 (MRI)에 유용하다. 거대고리 킬레이트, 예컨대 NOIA, NOGADA, DOTA, NOD A, NOTA 및 TETA는, 예를 들어 갈륨, 이트륨 및 구리의 방사성핵종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 금속 및 방사성금속과 함께 사용된다. 방사성 아이오딘 처리(RAIT)를 위한 라듐-223과 같은 방사성핵종을 안정하게 결합시키는데 관심있는 다른 고리형 킬레이트, 예컨대 거대고리 폴리에테르가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅 모이어티는 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상화제, 예컨대 알루미늄-18F 복합체를 PET 분석에 사용하기 위해 본원에 제공된 CD8 결합제에 부착시키는데 사용될 수 있다. 알루미늄-18F 복합체는 제한된 착화제 (RESCA), 예컨대 하기 화학식 (I)의 화합물을 통해 VHH 도메인에 접합될 수 있다.
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(I)
예를 들어, US20180273441A1 및 문헌 [Cleeren F. et al. Nature Protocols 13, 2330-2347 (2018)]을 참조하라.
일부 실시양태에서, 18F와 같은 방사성핵종 표지에 접합된 본원에 기재된 항-CD8 VHH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 CD8 결합제가 제공된다. 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 킬레이팅 모이어티를 통해 표지에 접합된다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅 모이어티는 리신 잔기를 통해 VHH 도메인에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종 표지는 금속 복합체에 포함된다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종 표지는 금속과 복합체를 형성하고, 여기서 복합체는 킬레이팅 모이어티에 의해 킬레이트화된다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 18F 표지 및 알루미늄을 포함하는 복합체를 킬레이트화하는 킬레이팅 모이어티에 접합된 항-CD8 VHH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅 모이어티는 화학식 (I)의 화합물이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물을 통해 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체에 접합된 본원에 기재된 항-CD8 VHH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 CD8 결합제가 제공된다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물을 통해 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체에 접합된 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공되며, 여기서 VHH 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물을 통해 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체에 접합된 VHH 도메인을 포함하는 CD8 결합제가 제공되며, 여기서 VHH 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VHH 도메인은 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
본원의 방법 및 조성물의 실시양태에 따라 검출가능한 표지로서 사용될 수 있는 예시적인 조영제는 바륨, 디아트리조에이트, 에티오다이즈드 오일, 갈륨 시트레이트, 아이오카름산, 아이오세탐산, 아이오다미드, 아이오디파미드, 아이오독삼산, 아이오굴라미드, 아이오헥실, 아이오파미돌, 아이오판산, 아이오프로셈산, 아이오세팜산, 아이오세르산, 아이오술라미드 메글루민, 아이오세메트산, 아이오타술, 아이오테트르산, 아이오탈람산, 아이오트록스산, 아이옥사글산, 아이옥소트리조산, 아이포데이트, 메글루민, 메트리자미드, 메트리조에이트, 프로필아이오돈, 탈로우스 클로라이드, 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원의 방법 및 조성물에 따라 검출가능한 표지로서 사용될 수 있는 생물발광 및 형광 화합물 또는 분자 및 염료는, 예를 들어 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), OREGON GREEN™, 로다민, 텍사스 레드, IRDye800CW, ALEXA FLUOR® 647, 테트라로디민 이소티오시아네이트 (TRITC), Cy3, Cy5 등), 형광 마커 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), 피코에리트린 등), 종양-관련 프로테아제, 효소 (예를 들어, 루시페라제, 호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제 등), 나노입자, 비오틴, 디곡시제닌 또는 이의 조합에 의해 활성화되는 오토켄칭된 형광 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원의 방법 및 조성물에 따라 검출가능한 표지로서 사용될 수 있는 효소는, 예를 들어 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 산 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루코로니다제 또는 베타-락타마제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 효소는 검출가능한 신호를 생성하기 위해 발색원, 형광성 화합물 또는 발광성 화합물과 조합되어 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 나노입자, 즉 크기가 나노미터로 측정되는 미세한 입자에 접합된다. 예를 들어, 나노입자는 적어도 하나의 치수가 약 100 nm 미만인 입자이다. 나노입자는 가시광을 흡수하기보다는 가시광을 산란시키기에 충분히 작기 때문에 검출가능한 재료로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 금 나노입자는 유의한 가시 광선 소광 성질을 가지며, 용액에서 진한 적색 내지 흑색으로 보인다. 그 결과, 나노입자에 접합된 본원에 제공된 CD8 결합제는 대상체에서 T-세포의 생체내 영상화에 사용될 수 있다. 크기 범위의 작은 말단에서, 나노입자는 종종 클러스터로 지칭된다. 금속, 유전체, 및 반도체 나노입자, 뿐만 아니라 하이브리드 구조 (예를 들어 코어-쉘 나노입자)가 형성되었다. 나노스피어, 나노막대 및 나노컵은 성장한 형상들 중 단지 몇 개에 불과하다. 반도체 양자점 및 나노결정은 추가 유형의 나노입자의 예이다. 이러한 나노규모 입자는, 본원에 제공된 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH)에 접합된 경우, 본원에 기재된 바와 같은 T-세포의 생체내 검출을 위한 영상화제로서 사용될 수 있다.
항체 및 표지의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이팅제이다. WO94/11026을 참조하라. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물-함유 링커 (문헌[Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다. 본원의 면역접합체는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 미국 일리노이주 록포드의 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc)로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포- EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 가교 시약으로 제조된 이러한 접합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 데스페리옥사민 화합물인 링커를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Vugts et al. (2017) Eur J Nucl Med Mol Imaging. 44:286-295 and Rudd et al. (2016) Chem Commun. 52: 11859-12000] 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 N-숙시닐-데스페리옥사민 (DFO) 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 데스페리옥사민 화합물 (예를 들어, N-숙시닐-데스페리옥사민)을 통해 방사성핵종 (예를 들어, 89Zr, 124I, 또는 18F를 포함하나 이에 제한되지는 않는다)에 접합된 항-CD8 VHH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지는 부위-특이적 방식으로, 예를 들어 효소, 예를 들어 소르타제 또는 트랜스글루타미나제를 사용하여 항-CD8 VHH 도메인에 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CD8 결합제는 검출가능한 표지에 직접 커플링된 (즉, 링커 없이) 항-CD8 VHH 도메인을 포함한다.
CD8 결합제의 생산 방법
또한 본원에는 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH)를 생산하는 방법, 및 표지된 CD8 결합제를 생산하는 방법을 포함하는, 본원에 기재된 CD8 결합제를 생산하는 방법이 제공된다.
본원에 기재된 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH)는 예를 들어 미국 특허 번호 6,015,695에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH)를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항-CD8 VHH 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH 도메인을 인코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 여기서 핵산은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산을 포함하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, Expi293 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵, 예를 들어 대장균 세포이다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH)를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 제공된 바와 같이 상기 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 선택적으로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항-CD8 항체 및 킬레이팅 모이어티를 포함하는 접합체를 제공하기 위해 킬레이팅 모이어티를 본원에 기재된 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH) 중 어느 하나에 접합시키는 단계, 및 표지된 CD8 결합제를 제공하기 위해 접합체를 18F를 포함하는 플루오린화알루미늄 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표지된 CD8 결합제를 제조하는 방법이 추가로 제공되며, 여기서 킬레이팅 모이어티는 화학식 (I)의 화합물이다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅 모이어티는 항-CD8 항체의 리신 잔기에 접합된다. 일부 실시양태에서, 접합체는 하나 이상의 항산화제 화합물의 존재 하에 플루오린화알루미늄 복합체와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항산화제 화합물은 메티오닌 및/또는 N-아세틸-트립토판을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합체는 메티오닌 및 N-아세틸-트립토판의 존재 하에 플루오린화알루미늄 복합체와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 방법은 탈염 컬럼에 의해 접합체 및 플루오린화알루미늄을 포함하는 반응 혼합물로부터 표지된 CD8 결합제를 정제하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탈염 컬럼은 히스티딘, 메티오닌, N-아세틸 트립토판 및/또는 슈크로스를 포함하는 완충제로 평형화된다. 일부 실시양태에서, 탈염 컬럼은 히스티딘, 메티오닌, N-아세틸 트립토판 및 슈크로스를 포함하는 완충제로 평형화된다.
항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH)의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 벡터 내로 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우, 항체가 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523을 참조하라. (또한, 대장균에서의 항체 단편의 발현을 기재하는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조하라) 발현 후에, 항체는 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에도, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간형인 글리코실화 패턴을 갖는 항체가 생산되는 진균 및 효모 균주를 포함하는 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]를 참조하라.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 베큘로바이러스 균주(baculoviral strain)가 식별되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 기재)를 참조하라.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK);　마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1);　아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA);　개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562);　예를 들어, 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포 (문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 Y0, NS0 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주를 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조하라.
CD8 결합제를 사용한 CD8 + 세포의 검출, 국재화 및/또는 영상화 방법
본원에 기재된 CD8 결합제 (예를 들어, 항-CD8 항체, 또는 항-CD8 항체 및 검출가능한 표지를 포함하는 면역접합체) 중 어느 하나를 사용하여 CD8+ 세포를 검출, 국재화 및/또는 영상화하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 샘플에서 CD8의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD8 결합제를 시험관내 또는 생체외 샘플에 첨가하는 것을 포함한다. 예를 들어 웨스턴 블롯(Western blot), 면역조직화학 분석법, ELISA 검정 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 이러한 방법은 시험관내 또는 생체외 샘플에 CD8 결합제를 첨가한 후에 세척을 수행하는 단계를 선택적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8에 대한 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것은 항-CD8 VHH 도메인에 부착된 표지를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 항-CD8:CD8 복합체에 결합하는 본원의 검출가능한 표지를 포함하는 제2 작용제를 적용하는 단계를 포함하고, CD8에 대한 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것은 제2 작용제의 검출가능한 표지를 검출하는 것을 포함한다. 해당 분야의 통상의 기술자는 제2 작용제가 CD8에 대한 결합에 대해 CD8 결합제와 경쟁하지 않거나, 또는 CD8 결합제에 대한 결합에 있어서 CD8과 경쟁하지 않음을 용이하게 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 생체내에서 CD8의 존재를 검출, 국재화 또는 영상화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물, 예를 들어 래트, 마우스, 기니 피그, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 양, 당나귀, 돼지, 원숭이, 유인원 또는 다른 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 영장류는 레서스 원숭이 또는 시노몰구스 원숭이이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 대상체에게 경구로, 국소로 또는 국부로 투여된다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 주입 (예컨대 정맥내 주입)을 통해 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 주입은 복강내이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 주사, 예컨대 정맥내 주사 또는 피하 주사에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계 및 분석 (즉, CD8에 대한 CD8 결합제의 결합의 검출)을 위해 대상체로부터 샘플을 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, CD8+ 세포의 검출, 국재화 및/또는 영상화는, 예를 들어 본원의 다른 곳에 더 상세히 기재되어 있는 기술을 사용하여 생체내에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 생체내 CD8의 존재를 검출하는 것은 CD8 (예컨대 CD8+ 세포)을 기관 또는 조직에 대해 국재화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 기관 또는 조직, 예컨대 질환 조직에서 CD8+ 세포의 수를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖고, 생체내에서 CD8의 존재를 검출하는 것은 CD8+ 세포를 종양에 대해 국재화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8+ 세포는 CD8+ T 세포, 예를 들어 종양 침윤 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 암을 갖는 대상체에서 종양 내 CD8+ T 세포의 수를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 다중 연속 시점에 암을 갖는 대상체의 종양 내 CD8+ T 세포의 수를 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD8+ 세포는 CD8 결합제의 투여 후에 약 1일 이하 이내에, 예컨대 약 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 90분, 1시간, 30분 이하 (예를 들어, 약 30분 내지 약 6시간, 약 30분 내지 약 4시간, 또는 약 2시간 내지 4시간) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함) 내에 생체내 검출, 국재화 또는 영상화될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD8+ 세포는 선량측정 가이드라인을 초과하지 않으면서 연간 1회 이상, 예컨대 연간 1, 2, 3, 4, 5회 이상 동안 본원에 기재된 방법 중 어느 하나를 사용하여 생체내 검출, 국재화 또는 영상화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD8 결합제의 첫 번째 투여 후 약 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 1일 이하 후에 반복될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표지된 CD8 결합제는 다중화 영상화를 위해 하나 이상의 추가 영상화제와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 영상화제는 표지된 CD8 결합제의 투여로부터 단기간 내에, 예를 들어 첫 번째 영상화제로부터의 방사능이 감소되자마자, 예를 들어 약 48시간, 36시간, 24시간, 18시간, 12시간, 8시간, 6시간, 4시간, 2시간, 1시간 이하 중 어느 하나 내에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 장기-수명 영상화 시약과 달리, 본원에 기재된 표지된 CD8 결합제는 면역 반응의 추가의 특성화를 위해 CD8 영상화가 표준 관리 PET 영상화 (예를 들어, FDG-PET) 또는 신규 분자 영상화 (예를 들어, CD4, 그랜자임 B, PSMA)와 조합될 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표지된 CD8 결합제를 사용한 영상화로부터 약 48시간 이내에 또 다른 영상화 스캔 (예를 들어, FDG-PET, SPECT, 또는 섬광조영술 스캔과 같은 PET)을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 연장된 기간에 걸쳐, 예컨대 적어도 약 3개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 이상(이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함) 동안 생체내 CD8+ 세포를 검출, 국재화 또는 영상화하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 CD8 결합제의 낮은 면역원성은 생체내 영상화 및 CD8 검출을 위한 CD8 결합제의 반복되고 연장된 사용을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 생체내 CD8 검출을 위한 CD8의 약 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 15 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, 40 nM 또는 50 nM (예를 들어, 적어도 약 50 nM, 예를 들어 약 1 nM 내지 약 50 nM, 또는 약 1 nM 내지 약 30 nM) (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)의 감도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표지로부터의 신호와 생체내 CD8 수준 사이에 선형 상관관계를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 마우스 CD8+ 종양 (예를 들어, TALL-1) 이종이식편 모델에서 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 이상의 종양:혈액 비를 갖는다.
CD8의 생체내 검출을 위한 기술
일부 실시양태에서, CD8 (예컨대 CD8+ 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포)에 대한 CD8 결합제의 생체내 결합은 면역 PET (양전자 방출 단층촬영), SPECT (단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영), NMR (핵 자기 공명)로도 공지된 MRI (자기 공명 영상), 근적외선 (NIR), 또는 체렌코프(Cerenkov) 발광 영상 (CLI) 중 적어도 하나를 통해 검출된다. 일부 실시양태에서, CD8에 대한 CD8 결합제의 결합은 2개 이상의 형태의 영상화를 통해 검출된다. 일부 실시양태에서, CD8에 대한 CD8 결합제의 결합은 근적외선 (NIR) 및/또는 CLI를 통해 검출된다. 일부 실시양태에서, CD8에 대한 CD8 결합제의 결합은 면역 SPECT 및/또는 NIR 형광을 통해 검출된다. 일부 실시양태에서, CD8에 대한 CD8 결합제의 결합은 면역 SPECT 및 컴퓨터 단층촬영을 통해 검출된다.
면역-PET는 양전자-방출 방사성핵종, 예컨대 18F, 64CU, 68Ga, 76Br, 86Y, 89Zr 및 124I로 표지된 항체 (예컨대 본원에 제공된 항-CD8 항체) 또는 이의 단편의 일치 검출에 기반한다. 항-CD8 항체를 표지하기 위한 적합한 방사성핵종은 예를 들어 18F, 64Cu, 68Ga, 76Br, 86Y, 88Y, 89Zr, 99mTc, 111In, 177 Lu, 123I, 124I, 125I, 및 131I를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 방출된 양전자는 초기 양전자 에너지 및 주변의 밀도에 따라 수 밀리미터까지의 거리를 이동할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Guus et al. (2007) The Oncologist, 12: 1379-1389]의 표 2 참조). 운동 에너지를 상실한 후, 양전자는 전자와 조합되어, 각각 511 keV의 에너지를 갖는 두 개의 광자를 생성하는 소위 소멸 과정으로 이어진다. 두 광자는 반대 방향으로 동시에 방출된다. 환자에서 양전자-방출 방사성핵종-표지된 항-CD8 항체의 분포는 PET 카메라로 소멸 광자 쌍의 검출에 의해 모니터링될 수 있다. PET 카메라는 환자의 신체 주위에 배치된 검출기의 링으로 이루어진다. 두 개의 광자가 매우 짧은 시간 간격 (전형적으로 5-15 나노초) 내에 신체의 반대편에 검출기에 의해 기록되는 경우에, 두 개의 검출기 사이의 선을 따라 어딘가에서 소멸 사건이 발생한 것으로 가정된다. 모든 선의 교차를 계산함으로써, 방사선원 (방사성표지된 항체)의 위치를 결정할 수 있다. 정량화를 위해, PET는 적절한 수정이 수행될 때 신뢰할 수 있는 정보를 제공할 수 있다 (문헌 [Verel et al. (2005) J Nucl Med, 46 suppl 1:164S-171S] 참조). 면역 PET에 관한 추가 세부사항은, 예를 들어 문헌 [van Dongen et al. (2007) The Oncologist, 12(12): 1379-1389; Reddy et al. (2010) Semin Nucl Med. 40(3): 182-189; Boerman et al. (2011) J. Nucl Med. 52(8): 1171-1172; Santangelo et al. (2015) Nature Methods, 12: 427-432]에 제공된다.
면역SPECT 영상화는 감마-방출 방사성핵종으로 표지된 항체 (예컨대 본원에 제공된 항-CD8 항체) 또는 이의 단편을, 전형적으로 혈류 내로의 주사를 통해, 대상체에게 투여하는 것을 수반한다. 감마-방출 방사성핵종의 예는, 예를 들어, 67Ga,　99mTc,　111In,　123I, 131I, 153Sm, 또는　186Re를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다음으로, 감마 카메라는 여러 각도로부터 여러 개의 2-D 영상을 획득하는데 사용된다. 컴퓨터는 이어서 단층촬영 재구성 알고리즘을 다중 투영에 적용하여, 3-D 데이터 세트를 산출하는데 사용된다. 이어서, 이 데이터 세트는 다른 단층촬영 기술로부터 수득된 것과 유사하게, 신체의 임의의 선택된 축을 따라 얇은 슬라이스를 제시하도록 조작될 수 있다. SPECT 영상을 얻기 위해, 감마 카메라는 환자 주위에서 회전된다. 회전하는 동안, 전형적으로 3 내지 6도마다 정의된 지점에서 투영이 얻어진다. 대부분의 경우, 완전한 360-도 회전이 최적의 재구성을 수득하는데 사용된다. 각각의 투영을 수득하는데 걸리는 시간은 또한 가변적이지만, 15-20초가 전형적이다. 총 스캔 시간은 15-20분이다. 일부 경우에, SPECT 감마 스캐너는 영상을 공동 기록하여 통상적인 CT 스캐너와 함께 작동하도록 구축될 수 있다. 이는 SPECT 섬광조영술 상에서 볼 수 있지만 다른 해부학적 구조에 관하여 정확하게 위치시키기 어려운 종양 또는 조직의 위치를 찾을 수 있다. 면역SPECT에 관한 추가 세부사항은, 예를 들어, 문헌 [Laverman et al. (2015) J Nucl Med, 56(5): 778-783; Lutje et al. (2014) Cancer Res, 74(21): 6216-6223; Muselaers et al. (2013) Eur Urology 64(4): 1101-1106]; 및 기타에서 찾을 수 있다.
NMR(핵 자기 공명)로도 공지된 생체내 MRI (자기 공명 영상)의 원리는 대상체의 신체 (가장 일반적으로, 수소 원자에서 발견되는 것들)에 존재하는 원자 핵에 함유된 양성자 및 중성자의 자기 성질을 조작하는 것에 기반한다. 이러한 핵의 운동은 작은 자기 모멘트를 생성한다. 대상체의 신체가 MRI 스캐너의 자기장에 배치될 때, 이들 핵의 자기 모멘트는 자기장의 방향에 따라 정렬된다. 이어서, 고주파 (RF) 펄스가 스캐너에서 대상체의 신체에 적용되고, 이는 핵을 여기시켜 더 낮은 에너지 스핀 상태와 더 높은 에너지 스핀 상태 사이에 전이가 존재하도록 한다. 일단 RF 펄스가 주어지면, 핵은 그의 평형 상태 (이완으로 불리는 과정)로 되돌아 가서, 이의 흡수된 추가 에너지를 방출하고, RF 신호를 방출한다. 이 신호는 스캐너의 RF 코일에 의해 검출된 다음, 신체의 조직의 상세한 영상을 생성하는데 사용된다. MRI 조영제를 사용함으로써, 이 영상의 조영, 및 따라서 특정 신체 구조의 가시성이 개선될 수 있다. MRI를 통해 검출가능한 표지의 예는, 예를 들어 초상자성 산화철 (산화철 나노입자, 예컨대 Molday ION 로다민-B 카르복실 포함), 19F-계 프로브, 상자성 금속 (예를 들어, 가돌리늄, 망가니즈, 산화망가니즈, 디스프로슘), (U)SPIO, PARA(CEST), DIA(CEST), 및 PFC를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 생체내 MRI를 위해 표지된 항체를 사용하는 것 및/또는 MRI를 통해 검출가능한 표지에 관한 추가 정보는, 예를 들어 문헌 [Srivastava (2015) Dis Model Mech. 8(4): 323-336; Zhou et al. (2013) Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 5(1): 1-18; Sohn et al. (2015) Nanomedicine. 11(1): 127-135; Bates et al. (2014) PloS ONE 9(5): e97220; Zhu et al. (2015) Int. J. Mol. Sci. 16: 9573-9587; and Zhang et al. (2014) Int J. Medicine. 9: 33-41]에서 논의된다.
NIR 영상화는 <1 cm의 깊이에서 내인성 및/또는 외인성 조영제의 영상화를 제공하기 위해 살아있는 조직 내로의 근적외선 광의 심층 광자 침투를 이용한다. 이 분야 내에서, NIR 형광 영상화는 700 내지 900 nm의 형광을 방출하는 외인성 조영제로 표지된 항체의 검출에 초점을 맞춘다. 전형적인 형광 영상화 시스템은 다른 문헌[De Grand et al. (2003) Technol Cancer Res Treat, 2:553-62; Nakayama et al. (2002) Mol Imaging,1:365-77; Ntziachristos et al. (2003) Eur Radiol, 13:195-208; Tanaka et al. (2006) Ann Surg Oncol, 13:1671-81; Themelis et al. (2009) J Biomed Opt, 4:064012; 및 Troyan et al. (2009) Ann Surg Oncol, 16:2943-52]에 상세히 기재된 바 있다. 간략하게 설명하면, 이는 혼탁한 매질 내에서 형광단을 여기시키는 스펙트럼적으로 분해된 광원 (필터링된 광대역 공급원, 발광 다이오드 [LED], 또는 레이저 다이오드)으로 구성된다. 이어서, 이 형광단으로부터 방출된 광은 강력한 여기광을 걸러내기 위해 특별히 주의하면서 전하 결합 소자 (CCD) 카메라 상에 영상화된다. 적외선 염료의 예는 Tracy 652, Tracy 645, 로다민 염료, 시아닌 염료, Cy7, Cy7.5, ALEXA FLUOR®, CYDYE®, IRDYE®, DyLight, 및 ATTO를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 약 650 내지 약 950 nm의 근적외선 (NIR) 파장에서의 세포 및 조직 영상화는 이 영역에서의 생물학적 분자의 낮은 흡수 때문에 생체내 영상화에 유리하다. 생체내 NIR 영상화를 위한 표지된 항체의 사용 및 생체내 NIR 영상화를 위한 검출가능한 표지에 관한 추가 세부사항은 문헌 [Cillers et al. (2017) Mol Pharmaceuticals 14(5): 1623-1633; Hilderbrand et al. (2010) Curr Opin Chem Biol. 14(1): 71-79; Hong et al. (2017) Nat Biomed Eng. 1, 0010 DOI: 10.1038/s41551-016-0010; Pansare et al. (2012) Chem Mater. 24(5): 812-827; Hickson (2009) Urol Oncol Semin Orig Invest. 27: 295-297; Zhang et al. (2012) Curr Protoc Cytom. Chapter 12: Unit 12.7; Quek et al. (2012) Nanomaterials. 2: 92-112; Luker et al. (2008) J Nucl Med 49:1-4; 및 Liu et al. (2016) NPG Asia Materials. 8, e295]에 제공된다.
체렌코프 발광 영상화(CLI)는 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상화제 (예컨대 본원의 다른 곳에 기재된 것들)에 의해 방출된 광학 체렌코프 광자의 검출에 기반한 분자 광학 영상화 기술이다. 다른 CLI 영상화제는, 예를 들어 131I, 18F, 및 90Y를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대전된 입자가 유전체 매질 (즉, 전기장에 의해 분극화될 수 있는 매질)을 통해 그 매질에서의 광속보다 빠른 속도로 이동할 때 체렌코프 방사선이 생산된다. 전파되는 동안, 하전된 입자 (양으로 하전된 양전자 또는 음으로 하전된 전자)는 매질에서 원자의 양전하 및 음전하를 변위시킴으로써 국부 분극을 유도한다. 예를 들어, 문헌 [Grootendorst et al. (2016) Clin Transl Imaging. 4(5): 353-366]의 도 1을 참조하라. 입자의 속도가 광속을 초과하면, 분극은 입자의 트랙을 따라 비대칭이 되어, 입자로부터 더 먼 거리에서 쌍극자 전기장이 발생한다. 입자가 통과함에 따라, 원자의 전자는 그의 바닥 상태로 되돌아와서, 전달된 에너지를 광학 광자로서 방출한다. CLI 영상은 초고감도 광학 카메라, 예컨대 전자-증폭 전하-결합 장치 (EMCCD) 카메라를 사용하여 PET 추적자로부터 체렌코프 광을 검출함으로써 얻을 수 있다. CLI 영상은 반정량적으로 광자 라디안으로 분석될 수 있다. CLI 및 PET는 양전자-방출 방사성 의약품에 의해 생산된 광자를 측정하는 두 기술 모두로 인해 직접 상관관계가 있다; PET는 소멸 광자를 측정하고, CLI는 체렌코프 광자를 측정한다. 여러 연구는 시험관내, 생체외 및 생체내에서 상이한 방사성 의약품에 대해 CLI와 PET 사이의 강한 상관관계를 제시하였고, 따라서 살아있는 대상체의 분자 영상화에 대한 CLI의 실현 가능성을 입증한다. CLI에 관한 또는 CLI와 PET 사이의 상관관계를 상세히 설명하는 논문은, 예를 들어 문헌[Xu et al. (2012) J Nucl Med, 53(2):312-317; Liu et al. (2010) PLoS ONE. 5(3):e9470; Zhang et al. (2013) PLoS ONE. 8(4):e62007; Hu et al. (2015) Eur Radiol. 25(6):1814-1822; Robertson et al. (2011) J Nucl Med. 52(11):1764-1769; Timmermand et al. (2015) J Nucl Med. 56(3):444-449; Cao et al. (2014) Biomed Opt Express. 5(10):3660-3670 및 Thorek et al. (2014) J Nucl Med. 55(1):95-98]을 포함한다.
면역요법에 대한 암을 가진 대상체의 반응성을 예측하는 방법
또한 면역요법제를 이용한 치료에 대한 암을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표지된 CD8 결합제를 투여하는 단계 및 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제에 반응할 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 표지된 CD8 결합제를 투여하는 단계 및 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제를 이용한 치료를 필요로 함을 나타낸다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 검출가능한 표지 (예를 들어, 89Zr, 124I, 18F, 68Ga 등)로 표지되고, 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합은 PET 또는 PET/CT를 통해 검출된다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 18F 표지에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 화학식 (I)의 화합물을 통해 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합이 검출된 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신 (예를 들어, 맞춤형 암 백신 또는 "PCV")을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 면역요법제에 대한 대상체의 반응성의 반복된 예측을 위해 1회 초과로 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 연장된 기간, 예컨대 적어도 약 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 이상(이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)에 걸쳐 반복된다.
일부 실시양태에서, 면역요법제는 면역 체크포인트 억제제다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 치료적 항-CTLA-4 항체, 예컨대 이필리무맙 (예르보이(YERVOY)®)이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 치료적 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 치료적 항-PD-1 항체는 니볼루맙 (옵디보(OPDIVO)®)이다. 일부 실시양태에서, 치료 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙 (키트루다(KEYTRUDA)®)이다. 일부 실시양태에서, 치료 항-PD-1 항체는 피들리주맙이다.
일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 치료적 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 치료적 항-PD-L1 항체는 BMS-936559이다. 일부 실시양태에서, 치료적 항-PD-L1 항체는 아벨루맙 (반벤시오(BANVENCIO)®)이다. 일부 실시양태에서, 치료 항-PD-L1 항체는 두르발루맙 (임핀지(IMFINZI)®)이다. 일부 실시양태에서, 치료 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙 (테센트릭(TECENTRIQ)®)이다.
치료적 면역 체크포인트 억제제에 관한 추가적인 세부사항은, 예를 들어, 문헌[Byun et al. (2017) Nat Rev Endocrinol. 13: 195-207; La-Beck et al. (2015) Pharmacotherapy. 35(10): 963-976; Buchbinder et al. (2016) Am J Clin Oncol. 39(1): 98-106; Michot et al. (2016) Eur J Cancer. 54: 139-148, 및 Topalian et al. (2016) Nat Rev Cancer. 16: 275-287]에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 하나 이상의 추가 치료제 (예컨대 화학요법제)와 조합되어 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제 (예컨대 화학요법제)와 조합되어 투여되는 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-L1 항체 (예컨대 아테졸리주맙)이다. 화학요법제의 예는 에를로티닙 (타르세바®, 제넨테크/OSI 팜.(OSI Pharm.), 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®, 밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.)), 디설피람, 에피갈로카테킨 갈레이트, 살리노스포라미드 A, 카르필조밉, 17-AAG (겔다나마이신), 라디시콜, 젖산 탈수소효소 A (LDH-A), 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®, 아스트라제네카(AstraZeneca)), 수니팁 (수텐트(SUTENT)®, 화이자(Pfizer)/수젠(Sugen)), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®, 노바티스(Novartis)), 이마티닙 메실레이트 (글리벡(GLEEVEC)®, 노바티스), 피나수네이트 (바탈라닙(VATALANIB)®, 노바티스), 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)®, 사노피(Sanofi)), 5-FU (5-플루오로우라실), 류코보린, 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®, 와이어스(Wyeth)), 라파티닙 (타이커브(TYKERB)®, GSK572016, 글락소 스미스 클라인(Glaxo Smith Kline)), 로나파밉 (SCH 66336), 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR)®, 바이엘 랩스(Bayer Labs)), 게피티닙 (이레사(IRESSA)®, 아스트라제네카), AG1478, 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논);　캄프토테신 (토포테칸 및 이리노테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴;　CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 아드레노코르티코스테로이드 (프레드니손 및 프레드니솔론 포함);　시프로테론 아세테이트; 피나스테리드 및 두타스테리드를 비롯한 5α-환원효소;　보리노스타트, 로미뎁신, 파노비노스타트, 발프로산, 모세티노스타트 돌라스타틴; 알데스류킨, 탈크 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴;　사르코딕티인; 스폰지스타틴;　클로람부실, 클로마파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드;　카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴과 같은 니트로소우레아; 에네다인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 γ1I 및 칼리케아미신 ω1I (문헌[Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 1994, 33:183-186])와 같은 항생제; 다이네미신 A를 포함한 다이네미신; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소 단백질 에네다인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모미시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® (독소루비신), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신,이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 항-대사물; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-부신제; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피담놀;　니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트;　피라루비신; 로속산트론; 포도필린산;　2-에틸히드라지드; 프로카르바진;　PSK® 다당류 복합체 (JHS 네츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진(Eugene, Oreg.)); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온;　2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨;　피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 탁솔(TAXOL) (파클리탁셀; 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴(Princeton, N.J.)), 아브락스(ABRAXANE)® (무-크레모포르), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샤움버그(Schaumberg, Ill.)) 및 탁소테레(TAXOTERE)® (도세탁셀, 독세탁셀;　사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis)); 클로람부실;　겜자르(GEMZAR)® (젬시타빈);　6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴;　나벨빈(NAVELBINE)® (비노렐빈); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®); 이반드로네이트;　CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 및 상기 중 어느 하나의 제약학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체가 포함된다.
화학요법제는 또한 (i) 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM)와 같은 항-호르몬제, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)®; 타목시펜 시트레이트 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 아이오독시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤(FARESTON)® (토레미핀 시트레이트); (ii) 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® (메게스트롤 아세테이트), 아로마신(AROMASIN)® (엑세메스탄; 화이자), 포르메스타니에, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® (보로졸), 페마라® (레트로졸; 노바티스), 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® (아나스트로졸; 아스트라제네카); (iii) 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 부세렐린, 트립테렐린, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 디에틸스틸베스트롤, 프레마린, 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산, 펜레티니드, 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); (iv) 단백질 키나아제 억제제; (v) 지질 키나아제 억제제; (vi) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대, 예를 들어 PKC-알파, Ralf 및 H-Ras; (vii) VEGF 발현 억제제와 같은 리보자임(예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)®) 및 HER2 발현 억제제; (viii) 유전자 요법 백신과 같은 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)®, 류벡틴(LEUVECTIN)®, 및 박시드(VAXID)®; 프로류킨(PROLEUKIN)®, rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)®와 같은 토포이소머라제 1 억제제; 아바릴렉스(ABARELIX)® rmRH; 및 (ix) 상기 중 어느 하나의 제약학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체가 포함된다.
화학요법제는 또한 알렘투주맙 (캄파트(Campath)), 베바시주맙 (아바스틴®, 제넨테크); 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)®, 임클론(Imclone)); 파니투무맙 (벡티빅스(VECTIBIX)®, 암젠(Amgen)), 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)®, 제넨테크/바이오젠 이덱(Biogen Idec)), 페르투주맙 (옴니타르그(OMNITARG)®, 2C4, 제넨테크), 트라스투주맙 (헤르셉틴®, 제넨테크), 토시투모맙 (벡사르 (Bexxar), 코릭시아 (Corixia)), 및 항체 약물 접합체, 겜투주맙 오조가미신 (밀로타르그(MYLOTARG)®, 와이어스)와 같은 항체를 포함한다. 본 출원의 화합물과 조합되는 작용제로서 치료 가능성을 갖는 추가 인간화 모노클로날 항체는 다음을 포함한다: 아폴리주맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 바피네우주맙, 비바투주맙 메르탄신, 칸투주맙 메르탄신, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 시드푸시투주맙, 시드투주맙, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에를리주맙, 펠비주맙, 폰톨리주맙, 겜투주맙 오조가미신, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 라베투주맙, 린투주맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 모토비주맙, 나탈리주맙, 니모투주맙, 놀로비주맙, 누마비주맙, 오크렐리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파스콜리주맙, 펙푸시투주맙, 펙투주맙, 펙셀리주맙, 랄리비주맙, 라니비주맙, 레슬리비주맙, 레슬리주맙, 레시비주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 시브로투주맙, 시플리주맙, 손투주맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 테피바주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투쿠시투주맙, 우마비주맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 비실리주맙, 및 인터류킨-12 p40 단백질을 인식하도록 유전적으로 변형된 재조합의 전적인 인간-서열, 전장 IgG1 λ 항체인 항-인터류킨-12 (ABT-874/J695, 와이어스 리서치 앤드 애보트 래보러토리즈 (Wyeth Research and Abbott Laboratories)).
화학요법제는 또한 "EGFR 억제제"를 포함하며, 이는 EGFR에 결합하거나 그 외에도 이와 직접 상호작용하여, 그 신호전달 활성을 방지 또는 감소시키는 화합물을 지칭하고, 이는 대안적으로 "EGFR 길항제"로 지칭된다. 이러한 작용제의 예는 EGFR에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다. EGFR에 결합하는 항체의 예는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 번호 4,943,533, 멘델손(Mendelsohn) 외 참조) 및 이의 변이체, 예컨대 키메라화 225 (C225 또는 세툭시맙; 에르부틱스(ERBUTIX)®) 및 재형성된 인간 225 (H225) (WO 96/40210, 임클론 시스템즈 인크. (Imclone Systems Inc.) 참조); IMC-11F8, 완전 인간, EGFR-표적화된 항체 (임클론); 유형 II 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 번호 5,212,290); 미국 특허 번호 5,891,996에 기재된 바와 같이 EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 ABX-EGF 또는 파니투무맙 (WO98/50433, 아브게닉스(Abgenix)/암젠 참조)와 같이 EGFR에 결합하는 인간 항체; EMD 55900 (문헌 [Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)]); EMD7200 (마투주맙), EGFR 결합에 대해 EGF 및 TGF-알파 둘 다와 경쟁하는, EGFR에 대해 지시된 인간화 EGFR 항체 (EMD/머크(Merck)); 인간 EGFR 항체, HuMax-EGFR (젠맵(GenMab)); E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 및 E7.6.3으로 공지되고 US 6,235,883에 기재되어 있는 완전 인간 항체; MDX-447 (메다렉스 인크(Medarex Inc)); 및 mAb 806 또는 인간화 mAb 806 (문헌[Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)]) 을 포함한다. 항-EGFR 항체는 세포독성제와 접합되어 면역접합체를 생성할 수 있다 (예를 들어, EP659439A2, 머크 특허 게엠베하(Merck Patent GmbH) 참조). EGFR 길항제에는 소분자, 예컨대 미국 특허 번호 5,616,582; 5,457,105; 5,475,001; 5,654,307; 5,679,683; 6,084,095; 6,265,410; 6,455,534; 6,521,620; 6,596,726; 6,713,484; 5,770,599; 6,140,332; 5,866,572; 6,399,602; 6,344,459; 6,602,863; 6,391,874; 6,344,455; 5,760,041; 6,002,008; 및 5,747,498; 뿐만 아니라 하기 PCT 공보: WO 98/14451, WO 98/50038, WO 99/09016, 및 WO 99/24037에 기재된 화합물이 포함된다. 특정 소분자 EGFR 길항제에는 OSI-774 (CP-358774, 에를로티닙, 타르세바® 제넨테크/OSI 파마슈티칼스 (OSI Pharmaceuticals)); PD 183805 (Cl 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디하이드로클로라이드, 화이자 인크. (Pfizer Inc.)); ZD1839, 게피티닙 (이레사®) 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린, 아스트라제네카); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, 제네카 (Zeneca)); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민, 베링거 잉겔하임 (Boehringer Ingelheim)); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로 [2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-히드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로 [2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드) (와이어스); AG1478 (화이자); AG1571 (SU 5271; 화이자); 이중 EGFR/HER2 티로신 키나아제 억제제, 예컨대 라파티닙 (타이커브®, GSK572016 또는 N-[3-클로로-4-[(3-플루오로페닐)메톡시]페닐]-6[5[[2메틸술포닐)에틸]아미노]메틸]-2-퓨라닐]-4-퀴나졸린아민)이 포함된다.
화학요법제는 또한 이전 단락에서 언급된 EGFR-표적화 약물; 타케다(Takeda)로부터 입수가능한 TAK165와 같은 소분자 HER2 티로신 키나아제 억제제;　ErbB2 수용체 티로신 키나아제 (화이자 및 OSI)의 경구 선택적 억제제인 CP-724,714; EGFR에 선호적으로 결합하지만 HER2 및 EGFR-과발현 세포 모두를 억제하는 EKB-569 (와이어스사에서 구입가능)와 같은 이중-HER 억제제; 경구 HER2 및 EGFR 티로신 키나아제 억제제인 라파티닙 (GSK572016; 글락소-스미스클라인사에서 구입가능);　PKI-166 (노바티스사에서 구입가능); 카네르티닙 (CI-1033; 파마시아 (Pharmacia))와 같은 pan-HER 억제제; 이시스 파마슈티칼스 (ISIS Pharmaceuticals)사에서 구입가능한 안티센스제 ISIS-5132와 같은 Raf-1 신호전달을 억제하는 Raf-1 억제제; 이마티닙 메실레이트 (글리벡®, 글락소 스미스클라인사에서 구입가능)와 같은 비-HER 표적화 TK 억제제; 수니티닙 (수텐트®, 화이자사에서 구입가능)과 같은 다중-표적화 티로신 키나아제 억제제;　바탈라닙 (PTK787/ZK222584, 노바티스/쉐링 아게 (Schering AG)사에서 구입가능)과 같은 VEGF 수용체 티로신 키나아제 억제제;　MAPK 세포외 조절 키나아제 I 억제제 CI-1040 (파마시아사에서 구입가능); PD 153035, 4-(3-클로로아닐리노) 퀴나졸린과 같은 퀴나졸린; 피리도피리미딘; 피리미도피리미딘; CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706과 같은 피롤로피리미딘; 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d] 피리미딘; 쿠르쿠민 (디페룰로일 메탄, 4,5-비스 (4-플루오로아닐리노)프탈이미드); 니트로티오펜 모이어티를 함유하는 티르포스틴;　PD-0183805 (워너-램버트);　안티센스 분자 (예를 들어, HER-인코딩 핵산에 결합하는 것); 퀴녹살린 (미국 특허 번호 5,804,396); 트리포스틴 (미국 특허 번호 5,804,396); ZD6474 (아스트라 제네카);　PTK-787 (노바티스/쉐링 아게);　CI-1033 (화이자)과 같은 pan-HER 억제제;　아피니탁 (ISIS 3521;　이시스/릴리 (Lilly)); 이마티닙 메실레이트 (글리벡®);　PKI 166 (노바티스);　GW2016 (글락소 스미스클라인);　CI-1033 (화이자);　EKB-569 (와이어스);　세막시닙 (화이자);　ZD6474 (아스트라제네카);　PTK-787 (노바티스/쉐링 아게);　INC-1C11 (임클론), 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨®); 또는 하기 특허 공보: 미국 특허 번호 5,804,396;　WO 1999/09016 (아메리칸 시아나미드(American Cyanamid));　WO 1998/43960 (아메리칸 시아나미드);　WO 1997/38983 (워너 램버트);　WO 1999/06378 (워너 램버트);　WO 1999/06396 (워너 램버트);　WO 1996/30347 (화이자, 인크);　WO 1996/33978 (제네카);　WO 1996/3397 (제네카) 및 WO 1996/33980 (제네카) 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 것을 포함하는 "티로신 키나아제 억제제"를 포함한다.
화학요법제는 또한 덱사메타손, 인터페론, 콜히친, 메토프린, 시클로스포린, 암포테리신, 메트로니다졸, 알렘투주맙, 알리트레티노인, 알로퓨리놀, 아미포스틴, 삼산화비소, 아스파라기나제, 생 BCG, 베바쿠지맙, 벡사로텐, 클라드리빈, 클로파라빈, 다르베포에틴 알파, 데닐루킨, 덱스라족산, 에포에틴 알파, 엘로티닙, 필그라스팀, 히스트렐린 아세테이트, 이브리투모맙, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 레날리도미드, 레바미솔, 메스나, 메톡살렌, 난드롤론, 넬라라빈, 노페투모맙, 오프렐베킨, 팔리퍼민, 파미드로네이트, 페가데마제, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, 페메트렉세드 이나트륨, 플리카마이신, 포르피머 나트륨, 퀴나크린, 라스부리카제, 사르그라모스팀, 테모졸로미드, VM-26, 6-TG, 토레미펜, 트레티노인, ATRA, 발루비신, 졸레드로네이트 및 졸레드론산, 및 이의 제약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
화학요법제는 또한 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 아세테이트, 코르티손 아세테이트, 틱소코르톨 피발레이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 트리암시놀론 알콜, 모메타손, 암시노나이드, 부데소나이드, 데소나이드, 플루오시노나이드, 플루오시놀론 아세토나드, 베타메타손, 베타메타손 인산나트륨, 덱사메타손, 덱사메타손 인산나트륨, 플루오코르톨론, 하이드로코르티손-17-부티레이트, 하이드로코르티손-17-발레레이트, 아클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 베타메타손 디프로피오네이트, 프레드니카르베이트, 클로베타손-17-부티레이트, 클로베타솔-17-프로피오네이트, 플루오코르톨론 카프로에이트, 플루오코르톨론 피발레이트 및 플루프레드니덴 아세테이트; 페닐알라닌-글루타민-글리신 (FEG) 및 그의 D-이성질체 형태 (feG) (이물란 바이오테라퓨틱스, 엘엘씨 (IMULAN BioTherapeutics, LLC))와 같은 면역 선택적 항-염증 펩티드 (ImSAID); 항-류마티스 약물 예컨대 아자티오프린, 시클로스포린 (시클로스포린 A), D-페니실라민, 금 염, 하이드록시클로로퀸, 레플루노미데미노시클린, 술파살라진, 에타네르셉트 (엔브렐(Enbrel)), 인플릭시맙 (레미케이드(Remicade)), 아달리무맙 (휴미라(Humira)), 세르톨리주맙 페골 (심지아(Cimzia)), 골리무맙 (심포니(Simponi))과 같은 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 차단제, 아나킨라 (키네레트(Kineret))와 같은 인터류킨 1 (IL-1) 차단제, 아바타셉트 (오렌시아(Orencia))와 같은 T 세포 공동자극 차단제, 토실리주맙 (악테메라(ACTEMERA)®)과 같은 인터류킨 6 (IL-6) 차단제;　레브리키주맙과 같은 인터류킨 13 (IL-13) 차단제;　론탈리주맙과 같은 인터페론 알파 (IFN) 차단제;　rhuMAb 베타7과 같은 베타 7 인테그린 차단제; 항- M1 프라임과 같은　IgE 경로 차단제; 항-림프독소 알파 (LTa)와 같은　분비된 동종삼량체 LTa3 및 막 결합 이종삼량체 LTa1/β2 차단제;　방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 티오플라틴, PS-341, 페닐부티레이트, ET-18- OCH3, 또는 파르네실 전달효소 억제제 (L-739749, L-744832)와 같은 기타 연구용 작용제; 퀘르세틴, 레스베라트롤, 피세아타놀, 에피갈로카테킨 갈레이트, 테아플라빈, 플라바놀, 프로시아니딘, 베툴린산 및 이의 유도체와 같은 폴리페놀; 클로로퀸과 같은　오토파지 억제제; 델타-9-테트라하이드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신); 포도필로톡신; 테가푸르 (우프토랄(UFTORAL)®); 벡사로텐 (타르그레틴(TARGRETIN)®); 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®) 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®)와 같은 비스포스포네이트; 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 테라토프(THERATOPE)® 백신과 같은 백신; 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오좀 억제제 (예를 들어 PS341);　CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; 오블리메르센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®)과 같은 Bcl-2 억제제; 픽산트론;　로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)TM)과 같은 파르네실전달효소 억제제; 및 상기 중 어느 하나의 제약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체;　뿐만 아니라 상기 중 둘 이상의 조합, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP; 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴TM)을 이용한 치료 요법에 대한 약어인 폴폭스(FOLFOX)를 포함한다.
화학요법제는 또한 진통, 해열 및 항-염증 효과를 갖는 비-스테로이드성 항-염증 약물을 포함한다. NSAID는 효소 시클로옥시게나제의 비-선택적 억제제를 포함한다. NSAID의 구체적 예는 아스피린, 이부프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루르비프로펜, 옥사프로진 및 나프록센과 같은 프로피온산 유도체, 인도메타신, 술린닥, 에토돌락, 디클로페낙과 같은 아세트산 유도체, 피록시캄, 멜록시캄, 테녹시캄, 드록시캄, 로르녹시캄 및 아이속시캄과 같은 에놀산 유도체, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 톨페남산과 같은 페남산 유도체, 및 셀레콕시브, 에토리콕시브, 루미라콕시브, 파레콕시브, 로페콕시브, 로페콕시브 및 발데콕시브와 같은 COX-2 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체 (예컨대 아테졸리주맙)는 하기 화학요법제 중 하나 이상과 조합되어 투여된다: 항-HER2 항체 (예를 들어, 트라스투주맙 (헤르셉틴®, 제넨테크) 또는 페르투주맙 (페르제타®, 제넨테크)), PD1 결합 길항제 (예를 들어, MDX-1106 (니볼루맙), MK-3475 (펨브롤리주맙, 람브롤리주맙), CT-011 (피딜리주맙) 또는 AMP-224), 및 PD-L2 결합 길항제.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체 (예컨대 아테졸리주맙)는 성장 억제제와 조합되어 투여된다. 본원에 사용된 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 예시적인 성장 억제제에는 예를 들어 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁세인 (도세탁셀 (탁소테레®, 롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer)) 및 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스큅)) 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1을 정지시키는 이러한 작용제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C와 같은 DNA 알킬화제는 또한 S-기 정지로 이어진다. 추가 정보는 무라카미(Murakami) 등의 문헌 [Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, 표제 "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995)], 예를 들어, p. 13에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역요법제는 수지상 세포 활성화제 또는 수지상 세포 성장 인자이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 백신 보강제이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 T-세포 자극제 또는 성장 인자이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 억제성 면역 세포, 시토카인 및/또는 효소를 중화시키거나 억제하는 작용제다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 항-TIGIT 항체, TIGIT 길항제, 항-CSF-1R 항체, 항-CSF-1R 길항제, 항-CEA 항체, 항-CEA 길항제, 항-CTLA4 항체, CTLA4 길항제, 항-OX40 항체, OX40 효현제, 하나 이상의 화학요법제와 조합된 임의의 항-PDL1 항체, 하나 이상의 화학요법제와 조합된 임의의 항-PD1 항체, 및 하나 이상의 화학요법제와 조합된 아테졸리주맙으로 구성된 군으로부터 선택된 면역요법제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD1 또는 항-PDL1 항체는 타르세바® (에를로티닙), 젤보라프® (베무라페닙), 가지바® (오비누투주맙), 아바스틴® (베바시주맙), 코텔릭® (코비메티닙), 젤보라프® (베무라페닙) 및 코텔릭® (코비메티닙), 알렉센사® (알렉티닙), 카드실라® (아도-트라스투주맙 엠탄신), 헤르셉틴® (트라스투주맙), 페르제타® (페르투주맙), 폴라투주맙, IFN-알파, 항-CD40 작용제, 항-OX40 항체 (예를 들어, OX40 효현제), 항-CSF-1R 항체, 항-CEA 항체, IDO 억제제, 또는 항-TIGIT 항체 중 하나 이상과 조합된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이고, 아테졸리주맙은 타르세바® (에를로티닙), 젤보라프® (베무라페닙), 가지바® (오비누투주맙), 아바스틴® (베바시주맙), 코텔릭® (코비메티닙), 젤보라프® (베무라페닙) 및 코텔릭® (코비메티닙), 알렉센사® (알렉티닙), 카드실라® (아도-트라스투주맙 엠탄신), 헤르셉틴® (트라스투주맙), 페르제타® (페르투주맙), 폴라투주맙, IFN-알파, 항-CD40 작용제, 항-OX40 항체 (예를 들어, OX40 효현제), 항-CSF-1R 항체, 항-CEA 항체, IDO 억제제, 항-CTLA4 항체, 또는 항-TIGIT 항체 중 하나 이상과 조합된다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IL2, 조작된 IL2, IL15, 또는 조작된 IL15이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 수지상 세포 조정제, 예컨대 수지상 세포 활성화제 또는 수지상 세포 성장 인자이다.
일부 실시양태에서, 세포 요법은 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T) 요법이다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 조작된 T-세포 수용체 T 세포 (TCR-T) 요법이다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 신생항원-특이적 T 세포 요법이다.
암을 갖는 대상체에서 진행을 모니터링하는 방법
본원에는 암을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계 및 1차 시점 및 2차 시점에 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체 내에서 질환이 진행된 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 면역요법제)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하고, 면역요법제를 투여하기 전에 표지된 CD8 결합제가 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 결합하는 것을 검출하는 단계, (b) 면역요법제를 투여하는 단계, (c) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하고, 면역요법제를 투여한 후의 시점에 표지된 CD8 결합제가 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 결합하는 것을 검출하는 단계, 및 (d) 면역요법제 투여 전 및 투여 후에 종양 조직 내 CD8+ T 세포를 표지하는 것에서의 차이를 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역요법제는 면역 체크포인트 억제제다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항- PD1항체 (예컨대, 본원에 기재된 항- PD1 항체, 그러나 이에 제한되지는 않음)이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-L1 항체 (예컨대, 본원에 기재된 항-PD-L1 항체, 그러나 이에 제한되지는 않음)이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체 (예컨대, 아테졸리주맙)는 제2 치료제 (예컨대, 본원의 다른 곳에 기재된 면역요법제 및/또는 화학요법제, 그러나 이에 제한되지는 않음)와 조합되어 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 면역요법제다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 항-PD-L1 항체 또는 항 PD1 항체이며, 이는 항-TIGIT 항체, TIGIT 길항제, 항-CSF-1R 항체, 항-CSF-1R 길항제, 항-CEA 항체, 항-CEA 길항제, 항-OX40 항체, 0X40 효현제, 항-CTLA4 항체, CTLA4 길항제, 타르세바® (에를로티닙), 젤보라프® (베무라페닙), 가지바® (오비누투주맙), 아바스틴® (베바시주맙), 코텔릭® (코비메티닙), 젤보라프® (베무라페닙) 및 코텔릭® (코비메티닙), 알렉센사® (알렉티닙), 카드실라® (아도-트라스투주맙 엠탄신), 헤르셉틴® (트라스투주맙), 페르제타® (페르투주맙), 폴라투주맙, IFN-알파, 항-CD40 작용제, 또는 IDO 억제제 중 하나 이상과 추가로 조합된다.
일부 실시양태에서, 면역요법제는 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IL2, 조작된 IL2, IL15, 또는 조작된 IL15이다.
일부 실시양태에서, 면역요법제는 수지상 세포 조정제이다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 수지상 세포 활성화제 또는 수지상 세포 성장 인자이다.
일부 실시양태에서, 면역요법제의 효과는 2차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준을 검출하고, 이를 1차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준과 비교함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 질환 진행은 2차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준이 1차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준보다 더 높은 경우에 검출된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준은 3차, 4차 또는 5차 후속 시점에 검출된다. 일부 실시양태에서, 시점은 적어도 1일, 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월, 12개월, 1.5년, 2년, 2.5년, 3년 또는 3년 초과로 떨어져 있다. 일부 실시양태에서, 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준은 환자에게 면역요법제의 투여 후에 검출된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직에 대한 면역요법제의 하나 이상의 투여 양생법의 효과는 1차 시점 및 2차 시점에 CD8 결합제에 의해 측정된 바와 같은 환자의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준을 비교함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 대상체에게의 면역요법제의 투여 후 종양 조직에 대한 CD8+ T 세포의 수준 (또는 국재화)은 면역요법제의 투여 전 1차 시점 및 투여 후 2차 시점에서 CD8 결합제에 의해 측정된 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준을 비교함으로써 결정된다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 검출가능한 표지 (예를 들어, 89Zr,　124I,　18F,　68Ga 등)로 표지되고, 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합은 PET 또는 PET/CT를 통해 검출된다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 18F 표지에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 화학식 (I)의 화합물을 통해 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 대상체에서 암의 진행의 반복 모니터링을 위해 1회 초과로 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연장된 기간, 예컨대 적어도 약 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 이상 (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)에 걸쳐 모니터링된다.
암을 갖는 대상체에서 치료 진행을 모니터링하는 방법
본원에는 면역요법제 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 면역요법제)를 사용하여 이전에 치료를 받았거나 또는 현재 치료 받고 있는 암을 갖는 대상체에서 치료 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 면역요법제와 함께 투여하는 단계 및 1차 시점 및 2차 시점에 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 CD8 결합제는 면역요법제 전에 투여되고, 1차 시점은 표지된 CD8 결합제의 투여 후 및 면역요법제의 투여 전이고, 2차 시점은 면역요법제의 투여 후이다. 일부 실시양태에서, 1차 시점과 비교하여 2차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 보다 낮은 수준은 긍정적인 치료 진행 (예를 들어, 유익한 또는 원하는 임상 결과)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 1차 시점과 비교하여 2차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 보다 높은 수준은 치료 진행의 결여 (예를 들어, 유익하거나 원하는 임상 결과의 결여)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 표지된 CD8 결합제 전에 투여되고, 1차 시점은 면역요법제의 투여 후 및 표지된 CD8 결합제의 투여 후이고, 2차 시점은 1차 시점 후이다. 일부 실시양태에서, 1차 시점과 비교하여 2차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 보다 낮은 수준은 긍정적인 치료 진행 (예를 들어, 유익한 또는 원하는 임상 결과)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 1차 시점과 비교하여 2차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 보다 높은 수준은 치료 진행의 결여 (예를 들어, 유익하거나 원하는 임상 결과의 결여)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 예를 들어 종양 CD8+ 세포의 손실에 의해, 소진에 의해, 및/또는 치료 효력의 손실에 의해, 치료 실패의 메커니즘을 설명하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준은 3차, 4차 또는 5차 후속 시점에 검출된다. 일부 실시양태에서, 시점은 적어도 약 1일, 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월, 12개월, 1.5년, 2년, 2.5년, 3년 또는 3년 초과로 떨어져 있다.
일부 실시양태에서, 면역요법제는 면역 체크포인트 억제제다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은) 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체 (예컨대, 아테졸리주맙)는 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은) 제2 치료제와 조합되어 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 검출가능한 표지 (예를 들어, 89Zr, 124I, 18F, 68Ga 등)로 표지되고, 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합은 PET 또는 PET/CT를 통해 검출된다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 18F 표지에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 화학식 (I)의 화합물을 통해 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 대상체에서 치료 진행의 반복 모니터링을 위해 1회 초과로 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연장된 기간, 예컨대 적어도 약 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 이상(이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)에 걸쳐 모니터링된다.
암 백신을 이용한 치료에 대한 암을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법 및 암 백신을 투여받은 암을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법
본원에는 암 백신을 이용한 치료에 대한 암을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 암 백신은 맞춤형 암 백신 ("PCV")이다. 예시적인 PCV는, 예를 들어 문헌 [Ott et al. (2017) Nature 547, 217-221 및 Sahin et al. (2017) Nature 547, 222-226]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 표지된 CD8 결합제를 투여하는 단계 및 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 암 백신에 반응할 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 표지된 CD8 결합제를 투여하는 단계 및 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 암 백신을 이용한 치료를 필요로 함을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 암 백신은 본원에 기재된 하나 이상의 면역요법제 및/또는 화학요법제와 조합되어 투여된다.
또한 본원에는 암을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 본원에 기재된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계 및 1차 시점 및 2차 시점에 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 암 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 백신은 맞춤형 암 백신 ("PCV")이다.
본원에는 이전에 암 백신을 이용한 치료를 받았거나 또는 현재 받고 있는 암을 갖는 대상체에서 치료 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 암 백신은 맞춤형 암 백신 ("PCV")이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하고, 암 백신 (예를 들어, PCV)을 투여하기 전에 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계, (b) 암 백신 (예를 들어, PCV)을 투여하는 단계, (c) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하고, 암 백신 (예를 들어, PCV)을 투여한 후의 시점에 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계, 및 (d) 암 백신 (예를 들어, PCV)의 투여 전 및 투여 후에 종양 조직 내 CD8+ T 세포를 표지하는 것에서의 차이를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 예를 들어 종양 CD8+ 세포의 손실에 의해, 소진에 의해, 및/또는 치료 효력의 손실에 의해, 치료 실패의 메커니즘을 설명하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 검출가능한 표지 (예를 들어, 89Zr,　124I,　18F,　68Ga 등)로 표지되고, 종양 조직에서 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합은 PET 또는 PET/CT를 통해 검출된다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 18F 표지에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 화학식 (I)의 화합물을 통해 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 대상체에서 반복된 예측 또는 모니터링을 위해 1회 초과로 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 반복되거나 또는 대상체는 연장된 기간, 예컨대 적어도 약 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 이상 (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)에 걸쳐 모니터링된다.
세포 요법을 이용한 치료에 대한 암을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법 및 세포 요법을 투여받은 암을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법
본원에는 세포 요법을 이용한 치료에 대한 암을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 CAR-T 또는 신생항원-특이적 T 세포 요법이다. 예시적인 세포 요법은, 예를 들어 문헌 [June et al. (2018) Science 359, 1361-1365 및 Guedan et al. (2019) Annu. Rev. Immunol. 37:145-171]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 표지된 CD8 결합제를 투여하는 단계 및 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 세포 요법에 반응할 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 표지된 CD8 결합제를 투여하는 단계 및 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 세포 요법을 이용한 치료를 필요로 함을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 본원에 기재된 하나 이상의 면역요법제 및/또는 화학요법제와 조합되어 투여된다.
또한 본원에는 암을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 본원에 기재된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계 및 1차 시점 및 2차 시점에 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 세포 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
세포 요법을 이용한 치료를 이전에 받았거나 또는 현재 치료 받고 있는 암을 갖는 대상체에서 치료 진행을 모니터링하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 CAR-T 또는 신생항원-특이적 T 세포 요법이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하고, 세포 요법을 투여하기 전에 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계, (b) 세포 요법을 투여하는 단계, (c) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하고, 세포 요법의 투여 후의 시점에 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계, 및 (d) 세포 요법의 투여 전 및 투여 후에 종양 조직 내 CD8+ T 세포를 표지하는 것에서의 차이를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 예를 들어 종양 CD8+ 세포의 손실에 의해, 소진에 의해, 및/또는 치료 효력의 손실에 의해 치료 실패의 메커니즘을 설명하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 검출가능한 표지 (예를 들어, 89Zr, 124I, 18F, 68Ga 등)로 표지되고, 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합은 PET 또는 PET/CT를 통해 검출된다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 18F 표지에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 화학식 (I)의 화합물을 통해 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 대상체에서 반복된 예측 또는 모니터링을 위해 1회 초과로 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 반복되거나 또는 대상체는 연장된 기간, 예컨대 적어도 약 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 이상 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)에 걸쳐 모니터링된다.
자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 및 이식편-대-숙주 질환을 위한 방법
본원에 기재된 CD8 결합제는 그의 높은 감도 및 낮은 면역원성 때문에, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하고 및/또는, 면역요법에 대한 반응성을 예측하고 및/또는, 치료 진행을 모니터링하는데 적합하다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 면역억제제다.
본원에는 자가면역 질환 또는 상태 (예를 들어, 자가면역 관절염, 대장염, 복강 질환), 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체에서 치료 진행 및 질환 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다. 이러한 질환은 모두 손상 염증 과정의 일부로서 CD8+ T 세포를 수반한다. 문헌 [Petrelli & Femke, CD8 + T cells in human autoimmune arthritis: the usual suspects; Nature Reviews Thumatology 12:421-428 (2016)]을 참조하라. 이러한 방법은 개입 치료와 함께 또는 개입 치료 없이 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계 및 1차 시점 및 2차 시점에 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 시점 및 2차 시점으로부터의 CD8+ T 세포의 증가는 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환이 진행되었다는 표시이다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 치료하기 위한 개입 요법이 표지된 CD8 결합제 전에 투여되고, 1차 시점은 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 치료하기 위한 개입 요법의 투여 후이고, 표지된 CD8 결합제의 투여 후이고, 2차 시점은 1차 시점 후이다. 일부 실시양태에서, 1차 시점과 비교하여 2차 시점에서의 조직 내 CD8+ T 세포의 보다 낮은 수준은 긍정적인 치료 진행 (예를 들어, 유익한 또는 원하는 임상 결과)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 1차 시점과 비교하여 2차 시점에서의 질환 조직 내 CD8+ T 세포의 보다 높은 수준은 치료 진행의 결여 (예를 들어, 유익하거나 원하는 임상 결과의 결여)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 조직 내 CD8+ T 세포의 수준은 3차, 4차 또는 5차 후속 시점에 검출된다. 일부 실시양태에서, 1차 시점과 비교하여 후속 시점(들)에서의 조직 내 CD8+ T 세포의 보다 낮은 수준은 치료 진행의 결여 (예를 들어, 유익한 또는 원하는 임상 결과의 결여)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 1차 시점과 비교하여 후속 시점(들)에서 질환 조직 내 CD8+ T 세포의 보다 높은 수준은 치료 진행의 결여 (예를 들어, 유익하거나 원하는 임상 결과의 결여)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료 실패의 메커니즘을 설명하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 시점은 적어도 약 1일, 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월, 12개월, 1.5년, 2년, 2.5년, 3년 또는 3년 초과로 떨어져 있다.
또한 본원에는 면역요법제 (예를 들어, 면역억제제)에 대한 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 표지된 CD8 결합제를 투여하는 단계 및 대상체의 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제에 반응할 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 표지된 CD8 결합제를 투여하는 단계 및 대상체의 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제를 이용한 치료를 필요로 함을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 결합이 검출된 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
면역요법제 (예를 들어, 면역억제제)를 제공받았거나 또는 이를 제공받고 있는 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체에서 치료 진행을 모니터링하는 방법이 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하고, 면역요법제를 투여하기 전에 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계, (b) 면역요법제를 투여하는 단계, (c) 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하고, 면역요법제를 투여한 후의 시점에 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계, 및 (d) 면역요법제 투여 전 및 투여 후에 종양 조직 내 CD8+ T 세포를 표지하는 것에서의 차이를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역요법제의 투여 전의 시점과 비교하여 면역요법제의 투여 후의 시점에서의 질환 조직 내 CD8+ T 세포의 보다 낮은 수준은 긍정적인 치료 진행 (예를 들어, 유익하거나 원하는 임상 결과)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 면역요법제의 투여 전의 시점과 비교하여 면역요법제의 투여 후의 시점에서의 질환 조직 내의 CD8+ T 세포의 보다 높은 수준은 치료 진행의 결여 (예를 들어, 유익하거나 원하는 임상 결과의 결여)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 조직 내 CD8+ T 세포의 수준은 1, 2, 3, 4개 이상의 후속 시점에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료 실패의 메커니즘을 설명하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 시점은 적어도 약 1일, 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월, 12개월, 1.5년, 2년, 2.5년, 3년 또는 3년 초과로 떨어져 있다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 검출가능한 표지 (예를 들어, 89Zr,　124I,　18F,　68Ga 등)로 표지되고, 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합은 PET 또는 PET/CT를 통해 검출된다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 18F 표지에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 화학식 (I)의 화합물을 통해 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 이식 거부, 예컨대 신장, 간, 심장 또는 심장/폐 이식 거부에 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 자가면역 질환 또는 상태, 예컨대 간염, 루푸스 (예를 들어 SLE), 혈관염, 및 다발성 경화증을 포함한 탈수초를 동반한 신경염에 사용된다.
일부 실시양태에서, 면역요법제는 면역억제제다. 적합한 면역억제제는 프레드니손, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸, 이브루티넙, 룩솔리티닙, 및 생물제제, 예컨대 TNF-알파 항체, 예를 들어 아달리무맙, 에타네르셉트, 골리무맙 및 인플릭시맙을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 대상체에서 반복된 예측 또는 모니터링을 위해 1회 초과로 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 반복되거나 또는 대상체는 연장된 기간, 예컨대 적어도 약 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 이상 (이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위 포함)에 걸쳐 모니터링된다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환에 수반되는 림프성 조직 및 기관의 연속 평가를 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8 결합제로부터 검출된 수준(들) 또는 신호(들)는 다른 영상화 기술 (예를 들어, MRI)과 상관관계가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 CD8 결합제로부터 검출된 수준(들) 또는 신호(들)는 혈액 및/또는 조직 바이오마커 (예를 들어, 조직 생검 바이오마커)와 상관관계가 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제는, 예를 들어 또 다른 영상화 스캔, 예컨대 PET, SPECT 또는 섬광조영술 스캔으로 다중화 영상화를 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제를 사용하여 수득된 영상화 데이터는 다른 방사선학적 방법, 예컨대 MRI, CT, 초음파 또는 X선으로부터의 데이터와 상관관계가 있다.
제약학적 조성물
또한 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH)와 같은 CD8 결합제, 또는 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH)와 같은 CD8 결합제를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 (제약학적 제형 포함)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 CD8에 결합하는 하나 이상의 CD8 결합제, 또는 CD8에 결합하는 하나 이상의 CD8 결합제를 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 해당 분야에 널리 공지된 적합한 담체, 예컨대 완충제를 포함한 제약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD8 결합제 (예를 들어, 표지된 CD8 결합제) 중 어느 하나 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 표지된 CD8 결합제 중 어느 하나 및 메티오닌 및/또는 N-아세틸 트립토판과 같은 하나 이상의 항산화제 화합물을 포함하는 제약학적 제형이 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약학적 제형은 히스티딘, 메티오닌, N-아세틸 트립토판 및/또는 슈크로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약학적 제형은 히스티딘, 메티오닌, N-아세틸 트립토판 및 슈크로스를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 CD8 결합제의 제약학적 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의의 제약학적으로 허용가능한 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 제약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산과 같은 완충제; 아스코르브산, N-아세틸트립토판 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량의 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제. 본원의 예시적인 제약학적으로 허용가능한 담체는 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP)과 같은 간질성(interstitial) 약물 분산제, 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 이를 사용하는 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료될 특정한 징조 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환)에 대해 필요에 따라 하나 초과의 활성 성분 (예를 들어, 면역요법제), 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 스타틴을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합물 내에 적합하게 존재한다.
활성 성분은, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼(microemulsion), 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼(macroemulsion)에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된다. 무균은, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
제조 물품 및 키트
일부 실시양태에서, 면역요법제에 대한 질환 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환)을 갖는 대상체의 반응성을 예측하고 및/또는, 질환 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환)을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하고 및/또는, 질환 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환)을 갖는 대상체에서 치료 진행을 모니터링하는데 유용한 물질을 함유하는 제조 물품 또는 키트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 제조 물품 또는 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 CD8 결합제 또는 조성물을 함유하는 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제조 물품 또는 키트는 본원에 기재된 하나 (또는 그 초과)의 CD8 결합제 또는 조성물을 인코딩하는 핵산(들)을 함유하는 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 CD8 결합제 (예를 들어, 항-CD8 항체)를 생산하는 세포주의 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트 또는 제조 물품은 항-CD8 VHH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트 또는 제조 물품은 표지된 CD8 결합제, 예를 들어 검출가능한 표지를 포함하는 면역접합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 항-CD8 항체 (예를 들어, 항-CD8 VHH) 및 표지된 CD8 결합제 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트 또는 제조 물품은 표지된 CD8 결합제를 제조하기 위한 시약, 예컨대 화학식 (I)의 킬레이팅제 및 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 표지된 CD8 결합제는 18F 표지에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, CD8 결합제는 화학식 (I)의 화합물을 통해 [18F]-플루오린화알루미늄 복합체에 접합된 항-CD8 VHH이다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD8 VHH는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 양성 대조군, 예를 들어 CD8 (또는 이의 단편) 또는 CD8+ 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 음성 대조군, 예를 들어 CD8이 실질적으로 없는 표면 또는 용액을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제조 물품 또는 키트는 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 또는 암을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 작용제는 본원에 기재된 CD8 결합제이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 면역요법제에 대한 암을 갖는 대상체의 반응성을 예측하기 위해, 암을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하기 위해, 및/또는 암을 갖는 대상체에서 치료 진행을 모니터링하기 위해 사용된다는 것을 나타낸다.
또한, 제조 물품 또는 키트는 (a) 본원에 기재된 CD8 결합제를 포함하는 조성물이 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 본원에 기재된 바와 같은 면역요법제다.
본원에 제공된 제조 물품 또는 키트는 조성물(들)이 면역요법제에 대한 질환 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환)을 갖는 대상체의 반응성을 예측하기 위해, 질환 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환)을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하기 위해, 및/또는 질환 (예를 들어, 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환)을 갖는 대상체에서 치료 진행을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 추가적으로, 제조 물품은 제약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충 염수, 링거액(Ringer's solution) 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예컨대 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
예시적인 실시양태
본 출원은 하기 실시양태를 제공한다:
1. 중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인 (VHH 도메인)을 포함하며, 인간 CD8에 약 1 nM 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 CD8 결합제.
2. 실시양태 1에 있어서, 인간 CD8에 약 0.002/s 이하의 koff로 결합하는 CD8 결합제.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, KD 및/또는 koff가 시약으로서 단일-아암 인간 CD8α/인간 CD8β-Fc 융합 단백질 (예를 들어, Fc의 하나의 폴리펩티드 쇄에 융합된, 인간 CD8α 및 인간 CD8β를 포함하는 단일-쇄 폴리펩티드)을 사용하는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정되는 것인 CD8 결합제.
4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 CD8에 약 1 nM 이하의 KD로 결합하는 CD8 결합제.
5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 CD8에 약 0.004/s 이하의 koff로 결합하는 CD8 결합제.
6. 실시양태 4 또는 5에 있어서, KD 및/또는 koff가 시약으로서 단일-아암 시노몰구스 CD8α/시노몰구스 CD8β-Fc 융합 단백질 (예를 들어, Fc의 하나의 폴리펩티드 쇄에 융합된, 시노몰구스 CD8α 및 시노몰구스 CD8β를 포함하는 단일-쇄 폴리펩티드)을 사용하는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정되는 것인 CD8 결합제.
7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, CD8 결합제가 CD8+ T 세포의 활성화를 자극하거나 억제하지 않는 CD8 결합제.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, CD8 결합제가 CD8+ T 세포 증식을 유도하지 않는 CD8 결합제.
9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, CD8 결합제가 CD4+ T 세포에 결합하지 않는 CD8 결합제.
10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, VHH 도메인이 라마 VHH인 CD8 결합제.
11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, VHH 도메인이 인간화된 것인 CD8 결합제.
12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, VHH 도메인이 Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 및 Thr97을 포함하는 인간 CD8α 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 13에 따른 것인 CD8 결합제.
13. 실시양태 12에 있어서, VHH 도메인이 서열식별번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 (CDR) 1; 서열식별번호: 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열식별번호: 10-12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 CD8 결합제.
14. 실시양태 13에 있어서, VHH 도메인이 다음을 포함하는 것인 CD8 결합제:
(1) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
(2) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
(3) 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
(4) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
15. 실시양태 13에 있어서, VHH 도메인이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 CD8 결합제.
16. 실시양태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, VHH 도메인이 L49A를 포함하고, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른 것인 CD8 결합제.
17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, VHH 도메인이 V89T 치환, T110Q 치환, S112Q 치환 및 A114 첨가로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른 것인 CD8 결합제.
18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, VHH 도메인이 서열식별번호: 1-4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CD8 결합제.
19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 작용제가 Fc 영역을 포함하지 않는 것인 CD8 결합제.
20. 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나의 CD8 결합제를 인코딩하는 단리된 핵산.
21. 실시양태 20의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
22. 실시양태 20의 핵산 또는 실시양태 21의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
23. 실시양태 22에 있어서, 숙주 세포가 진핵 세포인, 숙주 세포.
24. 실시양태 23에 있어서, 숙주세포가 포유동물 세포인, 숙주 세포.
25. 실시양태 24에 있어서, 숙주 세포가 Expi293 세포인, 숙주 세포.
26. 실시양태 22에 있어서, 숙주 세포가 원핵 세포인, 숙주 세포.
27. 다음 단계를 포함하는, CD8 결합제를 제조하는 방법:
a) 작용제가 생산되는 조건 하에 실시양태 22 내지 26 중 어느 하나의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 숙주 세포에 의해 생산된 CD8 결합제를 회수하는 단계.
28. 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, VHH 도메인이 표지에 접합된 것인 CD8 결합제.
29. 실시양태 28에 있어서, 표지가 형광 염료, 방사성핵종 또는 효소인 CD8 결합제.
30. 실시양태 29에 있어서, 표지가 방사성핵종인 CD8 결합제.
31. 실시양태 30에 있어서, 방사성핵종이 18F, 89Zr, 99mTc, 67Ga, 68Ga, 64Cu, 52Mn, 111In 또는 124I인 CD8 결합제.
32. 실시양태 28 내지 31 중 어느 하나에 있어서, VHH 도메인이 킬레이팅 모이어티를 통해 표지에 접합되는 것인 CD8 결합제.
33. 실시양태 32에 있어서, 킬레이팅 모이어티가 리신 잔기를 통해 VHH 도메인에 공유 결합된 것인 CD8 결합제.
34. 실시양태 32 또는 33에 있어서, 표지가 금속과 복합체를 형성하며, 여기서 복합체는 킬레이팅 모이어티에 의해 킬레이트화되는 것인 CD8 결합제.
35. 실시양태 34에 있어서, 표지가 18F이고, 금속이 알루미늄인 CD8 결합제.
36. 실시양태 35에 있어서, 킬레이팅 모이어티가 하기 화학식 (I)의 화합물인 CD8 결합제.
Figure pct00005
(I)
37. 다음 단계를 포함하는, 대상체에서 CD8+ 세포를 검출하는 방법:
a) 실시양태 28 내지 36 중 어느 하나의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계; 및
b) 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하며, 여기서 결합의 검출은 CD8+ 세포의 존재를 나타내는 것인 단계.
38. 실시양태 37에 있어서, 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것이 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것을 포함하는 것인 방법.
39. 실시양태 38에 있어서, 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것이 대상체에서 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영 /컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
40. 실시양태 37 내지 39 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD8+ 세포가 CD8+ T 세포인 방법.
41. 실시양태 37 내지 40 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD8+ 세포가 CD8+ 종양 세포인 방법.
42. 실시양태 37 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 검출이 투여 후 약 1일 또는 그 미만 이내에 실행되는 것인 방법.
43. 실시양태 37 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 1회 이상 반복되는 것인 방법.
44. 실시양태 43에 있어서, 상기 방법이 CD8 결합제의 이전 투여 후 약 1일 후에 반복되는 것인 방법.
45. 실시양태 43 또는 44에 있어서, 상기 방법이 연간 1 내지 4회 반복되는 것인 방법.
46. 실시양태 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 1년 초과 동안 반복되는 방법.
47. 실시양태 37 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 약 1 nM 내지 약 30 nM의 감도를 갖는 것인 방법.
48. 실시양태 37 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간 또는 비-인간 영장류인 방법.
49. 실시양태 48에 있어서, 비-인간 영장류가 시노몰구스 원숭이 또는 레서스 원숭이인 방법.
50. 실시양태 48에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
51. 실시양태 37 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 암을 갖는 것인 방법.
52. 실시양태 37 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 자가면역 질환, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 것인 방법.
53. 다음 단계를 포함하는, 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신에 대한 암을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법:
a) 실시양태 28 내지 36 중 어느 하나의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계; 및
b) 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 것인 단계.
54. 실시양태 53에 있어서, 다음 단계를 추가로 포함하는, 방법:
(c) 결합이 검출되었던 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신을 투여하는 단계.
55. 다음 단계를 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법:
a) 실시양태 28 내지 36 중 어느 하나의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계, 및
b) 1차 시점 및 2차 시점에서 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계.
56. 실시양태 55에 있어서, 다음 단계를 추가로 포함하는, 방법:
(c) 2차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준이 1차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준보다 높은 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신을 투여하는 단계.
57. 다음 단계를 포함하는, 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신을 제공받았거나 이를 제공받고 있는 암을 가진 대상체에서 치료 진행을 모니터링하는 방법:
i) 실시양태 28 내지 36 중 어느 하나의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신과 함께 투여하는 단계, 및
ii) 1차 시점 및 2차 시점에서 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계.
58. 실시양태 57에 있어서, 표지된 CD8 결합제가 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신 전에 투여되며, 여기서 1차 시점은 표지된 CD8 결합제의 투여 후 및 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신의 투여 전이고, 여기서 2차 시점은 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신의 투여 후인 방법.
59. 실시양태 57에 있어서, 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신이 표지된 CD8 결합제 전에 투여되며, 여기서 1차 시점은 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신의 투여 후 및 표지된 CD8 결합제의 투여 후이고, 여기서 2차 시점은 1차 시점 후인 방법.
60. 실시양태 53 내지 54 및 56 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 면역요법제가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
61. 실시양태 60에 있어서, 면역요법제가 항-PDL1 항체, 항-PD1 항체, 항-TIGIT 항체, TIGIT 길항제, 항-CSF-1R 항체, 항-CSF-1R 길항제, 항-CEA 항체, 항-CEA 길항제, 항-CTLA4 항체, CTLA4길항제, 항-OX40 항체, 또는 OX40 효현제인 방법.
62. 실시양태 61에 있어서, 면역요법제가 항-PD-L1 항체인 방법.
63. 실시양태 62에 있어서, 항-PD-L1 항체가 아테졸리주맙인 방법.
64. 실시양태 62 또는 63에 있어서, 항-PD-L1 항체가 하나 이상의 치료제와 조합되어 투여되는 것인 방법.
65. 실시양태 64에 있어서, 하나 이상의 치료제가 타르세바® (에를로티닙), 젤보라프® (베무라페닙), 가지바® (오비누투주맙), 아바스틴® (베바시주맙), 코텔릭® (코비메티닙), 젤보라프® (베무라페닙) 및 코텔릭® (코비메티닙), 알렉센사® (알렉티닙), 카드실라® (아도-트라스투주맙 엠탄신), 헤르셉틴® (트라스투주맙), 페르제타® (페르투주맙), 폴라투주맙, INF-알파, 항-CD40 작용제, 항-OX40 항체, OX40 효현제, 항-CSF-1R 항체, 항-CEA 항체, IDO 억제제 또는 항-TIGIT 항체인 방법.
66. 실시양태 60에 있어서, 면역요법제가 시토카인인 방법.
67. 실시양태 66에 있어서, 시토카인이 IL2, 조작된 IL2, IL15, 또는 조작된 IL15인 방법.
68. 실시양태 60에 있어서, 면역요법제가 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자인 방법.
69. 실시양태 60에 있어서, 면역요법제가 CD16에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자인 방법.
70. 실시양태 68 또는 69에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 방법.
71. 실시양태 69 또는 70에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자가 CD16A에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
72. 실시양태 60에 있어서, 면역요법제가 수지상 세포 조정제인 방법.
73. 실시양태 72에 있어서, 면역요법제가 수지상 세포 활성화제 또는 수지상 세포 성장 인자인 방법.
74. 실시양태 53 내지 54, 및 56 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 암 백신이 대상체에게 투여되는 것인 방법.
75. 실시양태 74에 있어서, 암 백신이 맞춤형 암 백신 (PCV)인 방법.
76. 실시양태 53 내지 54, 및 56 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 세포 요법이 대상체에게 투여되는 것인 방법.
77. 실시양태 76에 있어서, 세포 요법이 CAR-T 또는 신생항원-특이적 T 세포인 방법.
78. 다음 단계를 포함하는, 면역요법제에 대한 자가면역 질환, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법:
a) 실시양태 28 내지 36 중 어느 하나의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계; 및
b) 표지된 CD8 결합제가 대상체의 질환 조직 내의 CD8+ T 세포에 결합하는 것을 검출하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 것인 단계.
79. 실시양태 78에 있어서, 다음 단계를 추가로 포함하는, 방법:
(c) 결합이 검출되었던 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제를 투여하는 단계.
80. 다음 단계를 포함하는, 자가면역 질환, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법:
a) 실시양태 28 내지 36 중 어느 하나의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계, 및
b) 1차 시점 및 2차 시점에서 대상체의 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하며, 여기서 1차 시점 및 2차 시점으로부터의 CD8+ T 세포의 증가는 자가면역 질환, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환이 진행되었다는 표시인 것인 단계.
81. 실시양태 80에 있어서, 다음 단계를 추가로 포함하는, 방법:
(c) 2차 시점에서의 질환 조직 내 CD8+ T 세포의 수준이 1차 시점에서의 질환 조직 내 CD8+ T 세포의 수준보다 낮은 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제를 투여하는 단계.
82. 다음 단계를 포함하는, 면역요법제를 제공받았거나 이를 제공받고 있는 자가면역 질환, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체에서 치료 진행을 모니터링하는 방법:
i) 실시양태 28 내지 36 중 어느 하나의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 면역요법제와 함께 투여하는 단계, 및
ii) 1차 시점 및 2차 시점에서 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계.
83. 실시양태 82에 있어서, 표지된 CD8 결합제가 면역요법제 전에 투여되며, 여기서 1차 시점은 표지된 CD8 결합제의 투여 후 및 면역요법제의 투여 전이고, 여기서 2차 시점은 면역요법제의 투여 후인 방법.
84. 실시양태 82에 있어서, 면역요법제가 표지된 CD8 결합제 전에 투여되며, 여기서 1차 시점은 면역요법제의 투여 후 및 표지된 CD8 결합제의 투여 후이고, 여기서 2차 시점은 1차 시점 후인 방법.
85. 실시양태 53 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것이 대상체에서 CD8+ T 세포를 영상화하는 것을 포함하는 것인 방법.
86. 실시양태 85에 있어서, 대상체에서 CD8+ T 세포를 영상화하는 것이 대상체에 대해 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
87. 실시양태 53 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 표지된 CD8 결합제를 사용한 영상화로부터 약 48시간 이내에 또 다른 영상화 스캔 (예를 들어, PET, SPECT 또는 섬광조영술 스캔)을 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
88. 실시양태 55 내지 77 및 80 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 적어도 1년 동안 모니터링되는 것인 방법.
89. 다음 단계를 포함하는, 면역요법제를 이용한 치료에 대한 반응성과 관련된 장내 미생물 균주를 식별하는 방법:
a) 면역요법제를 이용한 치료에 반응성인 대상체 및 면역요법제를 이용한 치료에 반응성이 아닌 대상체를 포함하는, 암을 갖는 대상체의 집단으로부터 장내 미생물총 샘플을 수득하는 단계;
b) 치료에 반응성인 대상체의 장내 미생물총 샘플 및 치료에 반응성이 아닌 대상체의 장내 미생물총 샘플을 분석하는 단계; 및
c) 치료에 반응성인 대상체와 관련된 장내 미생물 균주를 식별하고, 여기서 반응성은 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 실시양태 28 내지 36 중 어느 하나의 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출함으로써 결정되고, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제에 반응성임을 나타내는 것인 단계.
90. 실시양태 89에 있어서, 면역요법제에 대한 반응성과 관련된 장내 미생물 균주를 포함하는 미생물총-기반 약물을 제조하는 것을 추가로 포함하는 방법.
91. 실시양태 89 또는 90에 있어서, 면역요법제가 항-PD-1 항체인 방법.
92. 실시양태 89 또는 90에 있어서, 면역요법제가 항-PD-L1 항체인 방법.
93. 실시양태 92에 있어서, 항-PD-L1 항체가 아테졸리주맙인 방법.
94. 실시양태 28 내지 36 중 어느 하나의 표지된 CD8 결합제를 포함하는 키트.
95. 킬레이팅 모이어티를 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나의 CD8 결합제의 VHH 도메인에 접합시켜 접합체를 제공하는 단계, 및 상기 접합체를 18F를 포함하는 플루오린화알루미늄 복합체와 접촉시켜 표지된 CD8 결합제를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 킬레이팅 모이어티는 하기 화학식 (I)의 화합물인, 표지된 CD8 결합제를 제조하는 방법.
Figure pct00006
(I)
96. 실시양태 95에 있어서, 접합체를 하나 이상의 항산화제 화합물의 존재 하에 플루오린화알루미늄 복합체와 접촉시키는 것인 방법.
97. 실시양태 96에 있어서, 하나 이상의 항산화제 화합물이 메티오닌 및/또는 N-아세틸-트립토판을 포함하는 것인 방법.
98. 실시양태 1 내지 19 및 28 내지 36 중 어느 하나의 CD8 결합제, 및 하나 이상의 항산화제 화합물을 포함하는 제약학적 제형.
99. 실시양태 98에 있어서, 하나 이상의 항산화제 화합물이 메티오닌 및/또는 N-아세틸 트립토판인 제약학적 제형.
100. 실시양태 98 또는 99에 있어서, 히스티딘 및 슈크로스를 추가로 포함하는 제약학적 제형.
실시예
실시예 1: 인간 CD8에 대한 VHH의 발생 및 특성화
항-CD8 VHH의 발견 및 초기 스크리닝
라마는 2개의 항원, C-말단 hFc-태그부착된 CD8α 수용체 (CD8α-Fc) 또는 CD8α가 링커를 통해 CD8β에 융합된 C-말단 히스티딘 태그 단일 쇄 단백질 (CD8αβ-His)로 면역화되었다. 표준 면역화 프로토콜은 문헌 [Ghahroudi et al. FEBS 1997]에 기재된 바와 같이 수행되었다 (또한 미국 특허 번호 6,015,695 참조). 표준 RT-PCR 방법을 사용하여, VHH 중쇄 레퍼토리를 증폭시키고, 파지미드 벡터 내로 클로닝하여 면역 파지 라이브러리를 구축하였다. 이어서, 다양한 농도, 세척 시간 및 용리 조건으로 CD8αβ-His 또는 CD8α-Fc를 사용하여 파지 라이브러리를 사용한 여러 라운드의 시험관내 선택을 수행하였다. 3 및 4 라운드의 선택 후에, 개별 파지 클론을 ELISA에 의해 특성화하고, 생어(Sanger) 서열분석에 적용하였다.
추가적으로, 인간 (huCD8a-Fc) 및 시노몰구스 (cynoCD8a-Fc) CD8 모두에 대한 선택된 VHH 항체의 결합 친화도를 SPR에 의해 결정하였다. 특히, 2C8.1-H (본원에서 "wt2C8"로도 지칭된다)는 huCD8+ HPBALL 세포에 대해 허용가능한 친화도 및 결합을 나타내었다(도 3).
VHH 발현 및 정제
파지 패닝으로부터 식별된 고유한 서열을 C-말단 His 태그를 함유하는 포유동물 발현 벡터에서 발현시켰다. 발현된 VHH를 2-단계 정제에 적용하였다: Ni 세파로스(Sepharose) 엑셀(excel) 히스티딘-태그부착된 단백질 정제 수지 (GE 헬스케어(GE Healthcare))에 이어서 크기-배제 크로마토그래피 (SEC). 태그 없는 VHH는 또한 포유동물 세포에서 발현되었다. 태그부착되지 않은 VHH를 이온 교환 정제 (SP 컬럼) 또는 재조합 단백질 A 수지 (GORE), 이어서 SEC에 적용하였다.
SPR 특성화
인간 (단일-아암 단일 쇄 huCD8α/huCD8β-Fc) 및 시노몰구스 원숭이 (단일-아암 단일 쇄 cynoCD8α/cynoCD8β-Fc) 모두에 대한 각각의 VHH 변이체의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정하였다. SPR 실험을 HBS-P+ (GE 헬스케어) 구동 완충제를 사용하여 37 ℃에서 비아코어(Biacore) T200 (GE 헬스케어) 상에서 실행하였다. 1.5 μg/mL의 CD8αβ-Fc를 항-HuIgG1 Fc 포획 키트 (GE 헬스케어)를 사용하여 포획하고, 단량체 VHH를 분석물로서 용액 중에 100 μL/분의 유속으로 첨가하였다. VHH를 100-0 nM의 일련의 희석액을 사용하여 적정하였다. 센서그램을 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델에 피팅하여 KD, kon 및 koff를 비롯한 동역학적 매개변수를 식별하였다.
CD8 + 세포-특이적 VHH 변이체의 식별
C-말단 huIgG1 Fc에 융합된 재조합 VHH를 발현시키고, 정제하고, CD8-발현 인간 T-세포 백혈병 세포주 (DSMZ, 독일)인 huCD8+ HPBALL 세포에 대해 FACS에 의해 스크리닝하였다. ATCC로부터 수득된 인간 배아 신장 세포 (HEK)를 비-CD8 발현 대조군 세포주로서 포함시켰다. 대략 300,000개의 세포를 10%v/v 소태아 혈청 및 1%v/v 페니실린-스트렙토마이신 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))으로 보충된 100 μL RPMI 배지의 존재 하에 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 인간- IgG Fc에 융합된 VHH 변이체를 10 μg/mL 농도의 세포와 함께 60분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 VHH를 후속적으로 세척하고, 알렉사 플루오르(ALEXA FLUOR)® 647 염소 항 인간 IgG Fc 항체 (잭슨 이뮤노 리서치, 인크. (Jackson Immuno Research, Inc.))를 37 ℃에서 60분 동안 7.5 μg/mL의 농도로 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 0.5% 소혈청 알부민으로 보충된 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)로 2회 세척하고, FACSCalibur 유세포 분석기(BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 의해 분석하였다. 샘플은 이중으로 분석되었다. 인간 CD8a에 결합하는 4-쇄 항체로부터 유래된 OKT8-Fc는 양성 대조군으로 사용되었다.
결과는 도 3에 제시되며, 이는 2C8 VHH-Fc 가 HPBALL 세포에 대해 OKT8-Fc와 유사한 친화도 및 결합을 갖는다는 것을 보여준다.
전혈 세포 및 PBMC에 대한 결합
2C8 VHH는 인간 전혈 및 상응하는 PBMC 샘플에 대한 추가의 FACS 분석을 위해 선택되었다. VHH를 His-태그부착된 단량체로서 발현시키고, 알렉사 플루오르® 647로 직접 표지하였다.
간략하게 설명하면, 4명의 건강한 공여자 (헬스 센터(Health center), 제넨테크)로부터의 전혈 샘플을 실온에서 수집하고, 채혈 후 30분 이내에 처리하였다. 각각의 공여자에 대해, 1 mL 샘플을 직접 염색을 위해 보관하고, 4 mL 샘플을 염색 전에 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 단리 (피콜-파퀘(Ficoll-Paque) 분리)를 위해 사용하였다. 비특이적 결합을 피하기 위해, 전혈 또는 PBMC를 각각 1000 μL 또는 107개 세포당 20 μL FcR 차단 인간 시약 (밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotech))으로 염색하기 전에 인큐베이션하였다. 100 μL의 전혈 또는 5x104개 PBMC를 유세포 분석 염색을 위해 96딥-웰 플레이트에 분배하였다. 형광 표지된 항체는 제조업체의 프로토콜 (써모 피셔 사이언티픽)에 따라 알렉사 플루오르® 647 (AF647) 염료와의 EDC-NHS 매개 접합에 의해 제조되었다.
OKT8-AF647 또는 VHH-AF647 변이체 (20 ng/mL), 항-CD14 바이오블루(VioBlue) (밀테니 바이오테크; 1/25), 항-CD16 PerCP Cy5.5 (벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson); 1/200), 항-CD4 바이오브라이트(VioBright)-FITC (밀테니 바이오테크; 1/50), 항-CD3 APC-Vio770 (밀테니 바이오테크; 1/50)을 예비혼합된 항체 칵테일로서 10분 동안 실온에서 첨가하였다. 이어서, 샘플을 2 mL의 적혈구 용해 용액 (벡톤 디킨슨)으로 재현탁시키고, 완전히 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액 제거 후, 펠릿을 PBS 1X, BSA 0.5%로 세척한 후, 맥스퀀트(MacsQuant) 10 분석기 (밀테니 바이오테크) 상에서 획득하였다.
적혈구 용해 단계를 수행하지 않은 것을 제외하고는 동일한 프로토콜을 PBMC 염색에 적용하였다.
도 4는 전혈 세포 샘플을 사용한 결과를 나타낸다. OKT8 및 2C8 VHH는 CD8+ T 세포의 강한 염색 및 CD3 세포 (예를 들어, NK 세포)의 낮은 수준의 염색을 포함한 유사한 염색 패턴을 보여준다. PBMC 샘플을 사용한 실험은 유사한 결과를 산출하였다. 2C8 VHH는 전혈 (다핵 및 단핵 세포를 함유한다) 및 PBMC (단핵 세포만을 함유한다) 모두에서 CD3+CD8+ T 세포 집단에만 강하게 결합하여, 인간 CD8에 대한 특이성을 확인시킨다.
구조적 특성화
CD8α 상의 2C8의 에피토프를 결정하기 위해, 동종이량체 CD8αα에 결합된 2C8의 결정 구조를 결정하였다 (도 5). 2C8은 CD8α의 정점에 결합하고, Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96, 및 Thr97과 접촉한다. 이들 CD8α 아미노산 잔기는 각각 결정 구조에서 2C8의 하나 이상의 아미노산 잔기로부터 약 4.5 Å 내에 있다. 이 에피토프는 MHCI와 복합체를 형성한 마우스 CD8αβ의 결합 에피토프와 중첩되지 않는다 (Wang et al. J Immunol 2009).
VHH CDR의 NNK 워크(walk)를 통한 친화도 성숙
2C8의 초기 친화도는 문헌 [Rashidian et al. JEM 2017]에 기재된 바와 같은 PEG화와 같은 일부 반감기 연장 메커니즘 없이 CD8+ 세포의 감도 검출에 대해 최적에 준하는 것으로 간주되었다. 친화도를 개선시킨 2C8에서의 돌연변이를 식별하기 위해, 본 발명자들은 문헌 [Koenig, et al. JBC 2015]에 기재된 바와 같이 2C8의 CDR의 NNK 워크를 수행하였다.
간략하게 설명하면, 각각의 돌연변이체가 단일 돌연변이를 함유하고 전체 라이브러리가 VHH 내의 모든 CDR 위치에 모든 20개의 아미노산을 포함하는 CDR NNK 스캐닝 라이브러리를 생성하였다. 라이브러리를 파지미드 벡터 내로 클로닝하고, 농도를 감소시키고 세척 시간을 증가시키면서 CD8α-hFc에 대한 여러 라운드의 파지 패닝에 적용하였다. VHH 도메인을 초기 라이브러리 및 선택된 라이브러리의 라운드 3으로부터 증폭시키고, 차세대 서열분석 (NGS)에 적용하였다. MiSeq (일루미나(Illumina)) 기기를 사용하여 증폭된 DNA 앰플리콘 상에서 NGS를 수행하였다. 3 라운드의 선택 후의 각각의 돌연변이의 빈도를 초기 라이브러리에서의 각각의 돌연변이의 빈도로 나눔으로써 농축 비율을 결정하였다.
NGS 결과의 분석 시, 본 발명자들은 A99G 및 A100fD가 강하게 농축되었음을 관찰하였다. A99G 및 A100fD 돌연변이를 갖는 2C8의 생성은 모 클론에 비해 친화도를 ~10배 개선하였다.
2C8의 인간화
본 발명자들은 IGHV3-23*04 상에 CDR (30-35 (H1), 50-65 (H2), 및 94-102 (H3))을 이식함으로써 2C8을 인간화하였다. 라마로부터의 모든 버니어(Vernier) 위치를 또한 그의 각각의 위치에 이식하였다. 본 발명자들은 VHH의 결합, 안정성 및 가용성 발현을 유지하는데 필요하기 때문에 프레임워크에 여러 라마 잔기 (F37, R45, G47및 L49)를 남겨두었다. SPR 특성화 후에, 본 발명자들은 S71 및 V78 버니어 잔기만이 높은 친화도 결합을 유지하는데 필요한 것으로 결정하였다. 인간화 시, 본 발명자들은 모든 단백질 A 접촉 부위에 바람직한 잔기를 가짐에도 불구하고 단백질 A 수지에 대한 결합이 매우 불량함을 인지하였다 (문헌 [Henry et al. PLoS One 2016]에 기재된 바와 같다). 본 발명자들은 단백질 A 결합에 중요한 VHH 잔기의 형태를 간접적으로 변경시킬 수 있는, 단백질 A에 직접 접촉하는 잔기 외부의 잠재적인 잔기를 조사하였다. 본 발명자들은 L49를 이러한 잔기 중 하나로 식별하였다. Ala (L49A)로의 돌연변이시에, 본 발명자들은 단백질 A 잔기를 통한 정제 후에 VHH 회수의 큰 증가를 관찰하였다 (표 3).
표 3. 단백질 A 및 SEC 정제 후의 정제된 VHH의 수율
Figure pct00007
기존의 ADA에 대한 결합의 감소
VHH를 사용한 이전의 임상 데이터는 환자에서 기존의 항-VHH 항체를 보여주었다 [Cordy et al. Clin Exp Immunol 2015; Holland et al. J Clin Immunol 2013; Papadopoulos et al. Cancer Chemother Pharmacol 2015]. 본 발명자들은 기존의 항-VHH 항체에 대한 VHH 변이체의 결합을 평가하였고, 4개의 프레임워크 돌연변이 (V89T, T110Q, S112Q 및 A114 첨가)를 도입하여 이들 기존의 항체에 대한 결합과 관련된 위험을 완화시켰다.
VHH 항-약물 항체 분석을 수행하기 위해, VHH 변이체를 4 ℃에서 밤새 PBS 중 2 μg/mL로 맥시소르프(Maxisorp) 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 PBS + 0.5% BSA + 0.1% 트윈20(Tween20) (PBSBT)으로 세척하고, 2시간 동안 25 ℃에서 2% BSA로 차단하였다. 96명의 상이한 건강한 공여자로부터의 개별 혈청 샘플을 1:50으로 희석하고, VHH-코팅된 빈 웰과 함께 1-2시간 동안 25 ℃에서 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 세척 후, 항-인간 Fc-특이적 HRP 2°항체 (1:10,000)를 25 ℃에서 30분 동안 진탕시키면서 첨가하였다. PBSBT로 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질로 10분 동안 현상하고, 650 nm에서 검출하였다.
도 6에 제시된 바와 같이, 프레임워크 돌연변이는 96명의 건강한 공여자로부터 풀링된 기존의 항-VHH 항체에 대한 항-CD8 VHH의 결합을 제거한다.
전반적으로, 본 발명자들은 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD8α 모두에 강하게 결합하는 여러 인간화 및 최적화된 클론 (v130, v142 및 v144)을 개발하였다. 도 1 및 표 4는 예시적인 VHH 클론의 아미노산 서열을 보여준다.
표 4. VHH 서열
Figure pct00008
표 5 및 6은 각각 SPR에 의해 결정된 바와 같은 αβ에 대한 2C8v142 및 2C8v144의 친화도를 보여준다. 2C8v144는 인간 및 시노몰구스 CD8α에 대한 높은 친화도, 및 비교적 느린 오프율(off-rate)를 갖는다. 2C8v142 클론은 2C8v144와 비교해서 CDR3 내에 W98F 돌연변이를 함유하는데, 이는 2C8v144와 비교해서 높은 수준의 방사선에 노출된 경우 2C8v142가 산화되기 쉽지 않게 만든다.
표 5. 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD8αβ에 대한 2C8v142의 친화도
Figure pct00009
표 6. 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD8αβ에 대한 2C8v144의 친화도
Figure pct00010
T 세포 기능에 미치는 영향
CD8+ T 세포 기능에 대한 2C8 VHH 결합의 잠재적 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 2C8.v130의 존재 하에 시험관내 T 세포 증식 분석을 수행하였다.
간략하게 설명하면, 3명의 건강한 공여자로부터 새로 단리된 PBMC를 PBS 1X 중에서 세척하고, 펠릿을 PBS 1X 중 mL당 10x106개 세포로 재현탁시켰다. 동일 부피의 새로 제조된 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 2.5 μM 작업 용액을 첨가한 후 (몰레큘라 프로브(Molecular Probe)), 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 9 부피의 RPMI, 10% FBS를 첨가하여 표지를 중지시킨 후, 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포 계수 및 분포 전에 RPMI, 10% FBS 배지로 2회의 추가 세척을 수행하였다.
0.2 μg/mL의 항-CD3 (벡톤 디킨슨; 사전-코팅된 플레이트) 및 새로 첨가된 1 μg/mL의 항-CD28 또는 0.4 μg/mL의 초항원 스타필로코쿠스 장독소 B (SEB) (트루컬쳐(TruCulture) 튜브; 미리아드(Myriad) RBM)를 사용한 폴리클로날 자극을 위해 100,000개의 CFSE-표지된 세포를 둥근-바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 항원 특이적 자극을 위해, 500,000개의 CFSE-표지된 세포를 둥근-바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 2 μg/mL의 CEF 펩티드 풀 (맙테크(Mabtech))을 각각의 웰에 첨가하였다. 10 ng/mL의 지질다당류 ("LPS", 시그마(Sigma))를 선천성 세포 활성화제 대조군으로서 사용하고, 배지 단독 (RPMI, 10% FBS)을 음성 대조군으로서 사용하였다. 마지막으로, 모든 조건에 대해, PBS 1X, 2C8v130 VHH (1 μg/mL 및 10 μg/mL 최종 농도) 또는 Lys2 VHH (10 μg/mL), 대조군을 웰당 200 μL의 최종 부피에 대해 삼중으로 첨가하였다. 대조군 Lys2 VHH는 리소자임에 결합하며, 문헌 [De Genst, et al. JBC 2005]에 기재되었다.
추가적으로, VHH 결합의 효과에 대한 순환 인간 혈액 분자의 잠재적인 영향을 평가하기 위해, 배양 배지 내의 FBS를 자극 없이 또는 SEB 0.4 μg/mL로 10%의 자가 혈장으로 교체하였다. 플레이트는 분석 전에 37 ℃에서 5일 동안 인큐베이션되었다.
플레이트 원심분리 후, 상청액을 제거하고, 펠릿을 PBS 1X로 1회 세척하였다. 100 μL의 희석된 고정가능한 생존성 염료 용액을 첨가하고 (라이브 데드 아쿠아(Live Dead Aqua), 써모피셔), 세포를 4 ℃에서 15분 인큐베이션한 후, PBS, 0.5% BSA로 세척하였다. 항-CD4 APC-Vio770 (밀테니 바이오테크; 1/50), 항-CD3 퍼시픽 블루(Pacific Blue) (벡톤 디킨슨; 1/100), 항-CD8α APC (벡톤 디킨슨; 1/100)을 함유하는 사전혼합된 항체 칵테일을 펠릿에 첨가하였다. 세포를 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션한 후, PBS 세척하고, 맥스퀀트 10 (밀테니 바이오테크)을 사용하여 유세포 분석하였다.
도 7a-7e는 2C8.v130의 높은 (10 μg/mL) 또는 더 낮은 (1 μg/mL) 포화 농도, 높은 농도 (10 μg/mL)의 비-CD8-결합 VHH (Lys2), 또는 PBS (비히클)의 존재 하에 CFSE 표지된 인간 PBMC (n=3)를 사용한 증식 분석의 결과를 보여준다. 자극 없이 (배양 배지, 도 7a), 2C8.v130 및 Lys2-VHH 모두 시험된 3명의 공여자 중에서 배경 증식을 유도하지 않았으며, 이는 CD8+ 세포에의 결합과 함께 또는 결합 없이 VHH의 첨가가 비-특이적 T 세포 활성화를 촉발하지 않는다는 것을 나타낸다. 항- CD3/CD28 폴리클로날 자극시 (도 7b), 최적의 CD8+ T 세포 증식 (CFSE 희석액의 90% 초과)이 모든 공여자에 대해 수득되었고, 2C8.v130 또는 Lys2 VHH의 첨가는 T 세포 활성화에 영향을 미치지 않았다. 초항원 SEB는 MHC-II와 TCR 사이의 가교를 유도하지만, 샘플에의 SEB의 첨가는 높은 세포 사멸로 인해 최적의 증식 속도 (CFSE low의 15% 미만)를 제공하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 단일 공여자에 대해 상이한 조건에 걸쳐 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (도 7c). 보다 생리학적인 MHC-I/TCR/CD8 복합체 맞물림을 모방하기 위해, CEF 펩티드 풀을 사용하여 TCR 특이적 CD8+ T 세포를 활성화시켰다. 그러나, 증식 속도가 배양 배지 조건과 유사하였기 때문에 (도 7d), 시험된 공여자 중 어느 것도 검출가능한 반응 CD8+ T 세포를 갖지 않았으며, 이는 VHH-유도된 배경 증식의 부재를 확인시켜 준다. 동일한 방식으로, 단핵구 상에서의 TLR4 자극시 (LPS 조건), VHH가 첨가된 경우에는 간접적인 T 세포 증식이 관찰되지 않았다 (도 7e).
도 8a-8d는 배양 배지로서 10% FBS 또는 자가 공여자 혈장을 사용한 증식 분석의 결과를 비교한다. PBMC 단리 전에 자가 공여자 혈장 샘플을 수득하였고, 생리학적인 조건을 모방하는 증식 분석에 사용하였다. 자극 없이, 모든 공여자에 대해 10% FBS 배지 또는 자가 공여자 혈장을 사용한 실험 사이에 차이는 관찰되지 않았다 (도 8a 및 8b). 따라서, 가용성 인간 혈장 인자의 존재 하에, VHH는 또한 배경 T 세포 증식을 유도하지 않는다.
실시예 2: 분자 영상화를 위한 2C8v144 VHH의 평가
2C8 VHH의 표지
18F 대조군 VHH 및 18F 항-CD8 VHH를 포함하는 RESCA (제한된 착화제)-변형된 VHH 및 18F-AlF-RESCA-변형된 VHH의 생산을 위한 절차를 이전에 기재된 프로토콜로부터 적응시켰다 (Cleeren F. et al. Nature Protocols 13, 2330-2347 (2018)). 예시적인 RESCA는 화학식 (I)의 화학 구조를 갖는다. 간략하게 설명하면, RESCA-접합된 VHH를 아세트산나트륨 또는 아세트산나트륨과 메티오닌 및 N-아세틸-트립토판으로 구성된 반응 배지 중 18F-플루오라이드의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 히스티딘, 메티오닌, N-아세틸 트립토판 및 슈크로스로 상태 조정된 제형 완충제로 평형화된 탈염 컬럼을 사용하여 정제하였으며, 이는 VHH 상의 산화 속도를 감소시킨다. 대조군으로서, 제형 완충제를 포스페이트 완충 염수로 상태 조정하였다. 히스티딘 제형 완충제를 pH 및 온도에 대해 조심스럽게 제어하여 RESCA로부터의 18F-AlF의 해리율을 제한하였다. 최종 생성물을 SE-HPLC에 의해 단백질 농도, 단백질 순도, 및 방사화학적 순도, 뿐만 아니라 SE-HPLC 및 SPR에 의해 표적 결합 (적절한 경우 면역반응성 분획)에 대해 분석하였다.
2C8v145 VHH를 사용한 18F 대조군 VHH 및 2C8v144를 사용한 18F 항-CD8 VHH를 40-60% 방사화학적 수율 (비-붕괴 보정)로 수득하였다. 최종 생성물은 3.0-8.0 Ci/μmol의 비활성 범위, 95% 초과의 방사화학적 순도, 및 18F 항-CD8 VHH의 경우, 94% 초과의 면역반응성 분획을 나타내었다.
어떠한 이론 또는 가설에 얽매이지는 않고, 방사성핵종 표지에 대한 항-CD8 VHH의 접합은 하나 이상의 VHH 잔기, 예컨대 감소된 CD8 결합 능력을 유도하는 트립토판의 산화를 유발할 수 있다. 접합 반응 완충제, 정제 완충제 및/또는 제형 완충제 중 항산화제 화합물, 예컨대 메티오닌 및/또는 N-아세틸 트립토판의 사용은 VHH 잔기의 산화를 감소시켜, 기능성 표지된 항-CD8 VHH의 수율을 개선시킬 수 있다.
마우스에서 키메라 CD8 + 종양 이종이식편의 PET 영상화
18F-항-CD8 VHH의 감도 및 동적 범위를 마우스에서 키메라 CD8+ 종양 이종이식편의 PET 영상화를 수행함으로써 평가하였다.
간략하게 설명하면, HPBALL, CD8-발현 인간 T-세포 백혈병 세포주 (DSMZ, 독일)를 CD8이 없는 인간 림프종 세포주 (DSMZ, 독일)인 다우디(Daudi)와 다양한 비율로 혼합하여 18F-항-CD8 VHH를 사용한 PET 영상화를 위해 다양한 CD8 농도의 키메라 종양을 생성하였다. 간략하게 설명하면, 암컷 CB17.SCID.bg 마우스에게 각각 HBSS:matrigel의 50:50 혼합물 중 1천만개의 세포를 등쪽 흉부 영역 내로 피하로 접종하였다. 종양이 대략 400 mm3 크기에 도달하면, 동물에게 꼬리 정맥을 통해 18F-항-CD8 VHH를 주사하고, 인베온(Inveon) PET/컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캐너 (지멘스 프리클리니칼 솔루션즈, 인크. (Siemens Preclinical Solutions, Inc.)) 상에서 동적 60분 PET 스캔을 적용시켰다.
PET 영상화의 완료 후에 CD8 발현을 평가하기 위해, 키메라 종양을 마우스로부터 절제하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 젠틀맥스 옥토 디쏘시에이터(gentleMACS Octo Dissociator) (밀테니 바이오텍)를 사용하여 해리시켰다. 이어서, 제작된 세포 현탁액을 70 μm 세포 여과기 (코닝(Corning))에 통과시켜 응집체를 제거하였다. 이어서, 종양 세포를 계수하고, 300,000개의 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 100 μL RPMI 배지의 존재 하에 플레이팅하였다. 세포를 20 nM의 알렉사 플루오르® 647-태그 부착된 OKT8 항-CD8 항체 (60분, 4 ℃) 뿐만 아니라 시톡스(Sytox) 오렌지 죽은 세포 염색 (15분, 4 ℃) (써모 피셔 사이언티픽)으로 염색하였다. 세포를 세척한 다음, FACS 칼리버(Calibur) 유세포 분석기에 의해 분석하여 종양 내 CD8+ 세포의 백분율을 결정하였다.
도 9에 제시된 바와 같이, 18F-항-CD8 VHH는 10% CD8+ HPBALL 세포만큼 낮은 PET 영상화에 의해 CD8+ 종양 세포의 명확한 시각화를 가능하게 한다. 결과는 또한 PET 흡수 (%ID/g)와 CD8+ HPBALL 세포의 농도 사이의 명확한 상관관계를 입증한다. 이전의 FAC 데이터에 기반하여, 각각의 HPBALL 세포는 약 55,000-85,000 카피의 CD8 분자를 갖는 반면, 각각의 실험받은 적 없는 CD8+ T 세포는 200,000-300,000 카피의 CD8 분자를 갖는 것으로 추정되었다. 18F-항-CD8 VHH는 종양 세포 상에서 낮은 수준 (약 1-30 nM 감도)의 CD8 발현을 검출할 수 있는 민감성 영상화제이다.
마우스에서 TALL1 종양 이종이식편의 PET 영상화
18F-항-CD8 VHH 및 89Zr-단일 아암 ("OA")-항-CD8 항체 (국제 특허 출원 공개 번호 WO2019/033043 A2 참조)를 사용하여 마우스에서 TALL1 종양 이종이식편을 영상화하였다. TALL1은 낮은 CD8 발현 백혈병 세포주이다. 이전의 FACS 데이터에 기반하여, 각각의 TALL1 세포는 약 12,000-15,000 카피의 CD8 분자를 갖는 것으로 추정되었다.
간략하게 설명하면, 암컷 CB17.SCID.bg 마우스에게 HBSS:matrigel의 50:50 혼합물 중 1천만개의 TALL1 세포를 우측 측복부에 피하로 접종하였다. 종양이 대략 400 mm3 크기에 도달하면 동물을 PET 영상화를 위해 그룹화하였다. 89Zr-OA-항-CD8 항체를 사용한 영상화를 위해, 동물은 꼬리 정맥을 통해 주사되고, 제0일, 제1일, 제2일 및 제5일에 정적 PET 스캔에 적용되었다. 18F-항-CD8 VHH를 사용한 영상화를 위해, 동물은 꼬리 정맥을 통해 주사되고, 이전과 같이 동적 60-분 PET 스캔에 적용되었다.
IRW 소프트웨어 (지멘스 프리클리니칼 솔루션즈, 인크.)를 사용하여 조직의 다중 축 슬라이스 상에서 관심 영역 (ROI) 측정을 수행하였다. 기관의 붕괴-보정된 신호 강도는 연조직 1 그램에서의 1 cc 등가성을 가정하여 그램당 주사된 용량의 백분율 (%ID/g)로서 측정하였다.
18F-항-CD8 VHH는 1시간 내에 낮은 CD8-발현 TALL1 이종이식편 종양의 신속한 시각화를 가능하게 한다. 도 10에 제시된 바와 같이, CD8-발현 TALL1 이종이식편 종양은 주사 90분 후에 명확하게 시각화될 수 있고, 14의 높은 종양-대-혈액 비가 달성되었다. 18F-항-CD8 VHH를 사용한 영상화는 0.5 - 4시간 내에 완료될 수 있었다. 비교하면, 89Zr-OA-항-CD8 항체는 더 긴 시점, 즉 주사 후 1 내지 5일에서 의미있는 영상화에 적합하다. 18F-항-CD8 VHH는 이의 크기가 작기 때문에, 조직을 매우 신속하게 침투하고, 신속한 신장 클리어런스를 나타내어, 동일한 날 나중에 동일한 환자에서 추가의 PET 스캔 (예컨대 FDG PET)을 용이하게 하거나, 또는 다음날 바로 반복된 CD8 스캔을 용이하게 한다. 18F 표지화 (또는 68Ga와 같은 다른 표지)와의 혼용성은 환자에게 비교적 낮은 방사선 부담을 초래하는 항-CD8 VHH와의 영상화 절차를 제공하여, 인간 환자에 대한 통상적인 선량측정 가이드라인 내에서 치료 과정 전반에 걸쳐 추가의 스캔이 수행될 수 있도록 한다. 예를 들어, 18F-항-CD8 VHH를 사용하여, 전형적인 수개월- 또는 수년-긴 치료 및 추적 과정에 걸쳐 동일한 환자를 최대 약 5회까지 재영상화하는 것이 가능할 것이다.
레서스 원숭이에서의 PET 영상화 연구
레서스 원숭이에서 18F-항-CD8 VHH로 영상화 실험을 수행하여, 흡수가 정상적으로 CD8-풍부 조직에서 검출될 수 있는지 여부를 결정하였다. 레서스 원숭이 (2.5 kg)에 1.2 mCi 방사선 선량을 함유하는 64 마이크로그램의 18F-항-CD8 VHH를 주사하였다. CD8-풍부 조직, 예컨대 림프절, 흉선 및 비장은 주사 1시간 내에 명확하게 영상화될 수 있다. 예를 들어, 도 11의 상단 그림은 주사 1시간 후의 PET MIP 영상을 나타낸다. 대조적으로, CD8-풍부 조직은 18F-대조군 VHH의 주사 1시간 후에 PET MIP 영상에서 보이지 않았다 (도 11 하단). 신장에 대한 클리어런스만이 뚜렷하였다.
실시예 3: 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질환에 대한 면역요법의 효능을 결정하기 위해 CD8 영상화를 사용하는 방법
본원에 기재된 CD8 결합제, 예컨대 18F-항-CD8 VHH를 사용하여 CD8+ 세포에 의한 종양 및 림프절 침윤을 평가한다. 이러한 영상화는 환자 예후 및/또는 면역요법에 대한 반응을 예측하는 면역 표현형을 식별하는데 사용된다. 이러한 영상화는, 예를 들어 질환 조직 (예를 들어, 종양) 및 다른 림프절에서 CD8+ T-세포의 유병률(prevalence)을 결정하는데 사용된다. 이러한 영상화는 암, 자가면역 질환 또는 상태 (예컨대 관절염, 결장염 또는 복강 질환), 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 환자를 위한 하나 이상의 면역요법제를 포함하는 면역요법제 또는 병용 요법제를 선택하는데 사용된다.
본원에 개시된 모든 실시양태에서, 암 환자에 대한 면역요법은, 예를 들어, 본원에 개시된 임의의 항-PD1 작용제 또는 항-PDL1 작용제, 예컨대 암을 치료하기 위한 모노클로날 항체, T 세포 및 종양 관련 단백질에 결합하는 이중특이적 항체, NK 세포 및 종양 관련 단백질에 결합하는 이중특이적 항체, 시토카인, CAR-T 세포 요법, 비-특이적 암 면역요법 및 보강제, 및 면역 체크포인트 억제제다. T 세포 및 종양 관련 단백질에 결합하는 이중특이적 항체는, 예를 들어 항-CD3 이중특이적 항체를 포함한다. NK 세포 및 종양 관련 단백질에 결합하는 이중특이적 항체는, 예를 들어 항-CD16 (FcgammaRIII) 이중특이적 항체, 항-CD16A 이중특이적 항체, 항-CD56 이중특이적 항체, 항-NKp46 이중특이적 항체, 및 임의의 다른 NK-세포 결합 이중특이적 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제 (예를 들어, 18F-항-CD8 VHH)는 본원에 기재된 바와 같은 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환과 같은 질환의 치료, 진단, 예후, 동반 진단, 및 이의 진행/완화를 모니터링하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD8 결합제 (예를 들어, 18F-항-CD8 VHH)는 질환 (예컨대 암, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환)에 대해 면역요법제를 이용한 치료 실패를 경험한 대상체를 영상화하는데 사용될 수 있으며, 여기서 영상화 결과는 치료 실패의 메커니즘(들)을 설명한다. 예를 들어, 대상체는 아테졸리주맙 조합을 받을 수 있고, 치료에 반응하는데 실패할 수 있다. 영상화 결과는 대상체가 CD8+ 종양 세포를 상실하였거나, 또는 여전히 CD8+ 종양 세포를 갖지만 치료제가 소진되었거나 또는 CD8+ 종양 세포에 대해 더 이상 강력하지 않다는 것을 밝혀낼 수 있다.
실시예 4: 미생물총 연구 및 면역 표현형 식별을 위해 CD8 영상화를 사용하는 방법
본원에 기재된 CD8 결합제, 예컨대 18F-항-CD8 VHH는 CD8+ 세포에 의한 종양 및 림프절 침윤을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 영상화는 환자 예후 및/또는 암 면역요법에 대한 반응을 예측하는 미생물총 시그너쳐(signature)의 기초가 되는 면역 표현형을 식별하는데 사용된다.
또한, 본원에 기재된 CD8 결합제, 예컨대 18F-항-CD8 VHH는 CD8+ T-세포의 생체내 분포에서 특정한 전신 패턴과 관련된 미생물총 시그너쳐를 식별하는데 사용될 수 있다. 이러한 영상화는, 예를 들어 종양 및 다른 림프절에서 CD8+ T-세포의 유병률을 결정하는데 사용된다. 이러한 영상화는 결과와의 직접적인 연관성이 잡음이 있거나 약한 경우에도 가장 강건한 미생물총 바이오마커를 선택하는데 사용된다.
상주성 장내 박테리아는 암 면역요법에 대한 환자 반응에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gopalakrishnan et al. (2018) Science. 359(6371): 97-103]을 참조하라. 따라서, 암 면역요법에 대한 환자 반응성과 관련된 주요 미생물 균주를 확인하는 것은 암 환자에 대한 적절한 치료 요법을 식별하는데 유용할 수 있다. 본원에 기재된 CD8 결합제, 예컨대 18F-항-CD8 VHH는 면역요법 (예를 들어, 본원에 논의된 면역요법)에 대한 환자 반응성과 상관관계가 있는 미생물총 프로파일(들) (예를 들어, 장내 세균총 조성물(들))을 식별하는데 사용될 수 있다.
간략하게 설명하면, 장내 미생물총 샘플 (예를 들어, 분변 샘플)은 면역요법 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 면역요법)을 받게 될 암 환자로부터 얻어진다. 본원에 기재된 CD8 결합제, 예컨대 18F-항-CD8 VHH는 암 면역요법을 받기 전에 각각의 환자에게 투여되고, CD8+ 세포에 의한 종양 및 림프절 침윤은 각각의 환자에서 평가된다. 다음으로, 환자는 각각 암 면역요법 (예를 들어, 본원에 기재된 면역요법)을 받는다. 본원에 기재된 CD8 결합제, 예컨대 18F-항-CD8 VHH는 암 면역요법 후에 다시 환자에게 투여되고, CD8+ 세포에 의한 종양 및 림프절 침윤은 각각의 환자에서 재차 평가된다. 면역요법 후 환자의 종양(들) 및 림프절에서의 CD8 침윤 수준을 평가하고, 각각의 환자의 미생물총 프로파일 (예를 들어, 장내 미생물총 샘플에 존재하는 미생물의 유형, 뿐만 아니라 미생물의 각각의 유형의 풍부함)을 결정한다. 종양(들) 및 림프절로의 CD8+ T 세포 침윤을 입증하는 환자의 장내 미생물총 샘플에 존재하는 주요 미생물 균주가 식별된다.
림프절 및/또는 종양으로의 CD8+ T 세포 침윤을 갖는 환자에서의 주요 미생물 균주의 확인 후, 주요 미생물 균주를 포함하는 미생물총 약물을 이러한 환자로부터 수득된 공여자 대변으로부터 제조한다. 미생물총 약물은 림프절 또는 종양으로의 CD8+ T 세포 침윤을 나타내지 않는 환자에게 투여된다. 대안적으로, FMT (분변 미생물총 이식) 절차는 림프절 및/또는 종양으로의 CD8+ T 세포 침윤을 입증하는 환자로부터 수집된 공여자 대변을 사용하여 림프절 및/또는 종양으로의 CD8+ T 세포 침윤을 입증하지 않는 환자에 대해 수행된다. 일부 실시양태에서, FMT 또는 미생물총 약물은 암 면역요법 시 림프절 및/또는 종양 내로의 CD8+ 침윤을 나타내지 않는 환자를 암 면역요법에 반응하는 환자로 변환시킨다.
일부 실시양태에서, CD8 영상화는 FMT 전에 또는 미생물총 약물의 투여 전에 림프절 및/또는 종양 내 CD8+ 침윤을 나타내지 않는 환자에 대해 수행된다. FMT 또는 마이크로바이옴 약물의 투여 후에, 환자는 면역요법을 받는다. 면역요법 후에, FMT 또는 미생물총 약물이 림프절 및/또는 종양으로의 CD8+ 침윤을 증가시키는지를 결정하기 위해 환자에 대해 영상화가 수행된다. 일부 실시양태에서, 증가된 CD8+ 침윤이 FMT 또는 다른 미생물총 약물 후에 암 면역요법 치료에 반응하여 관찰되면, FMT 또는 다른 미생물총 약물은 성공적인 것으로 간주된다.
미생물총 연구 및 발견과 함께 사용되는 CD8 영상화제는 wt2C8 VHH, 2C8v130 VHH, 2C8v142 VHH 또는 2C8v144 VHH를 사용하는 본원에 기재된 임의의 CD8 결합제, 예컨대 18F-항-CD8 VHH일 수 있다.
일부 실시양태에서, 암 면역요법은 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 암 면역요법은 T-세포 표적화 요법이다. 일부 실시양태에서, T-세포 표적화 요법은 T-세포 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 암 면역요법은 NK 세포 표적화 요법이다. 일부 실시양태에서, NK 세포 표적화 요법은 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CD8 결합제, 예컨대 18F-항-CD8 VHH를 사용한 CD8 영상화는 체크포인트 억제제 또는 면역 조정 분자, 예컨대 CD16 또는 CD3 표적화 모이어티의 투여 전, 동안 및 후에 종양 및 림프절 CD8+ 침윤을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 영상화는 체크포인트 억제제 또는 면역 조정 분자, 예컨대 CD16 또는 CD3 표적화 모이어티의 효능과 관련된 미생물총 바이오마커를 결정하는데 사용된다.
본 실시예에서 사용된 체크포인트 억제제는 임의의 체크포인트 억제제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 항-PD1 또는 항-PDL1 항체이다. 일부 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 아테졸리주맙 (TECENTRIQ®)이다.
면역 조정 분자는 CD8 세포 증식 및 침윤에 영향을 미치는 임의의 분자일 수 있다. 예에는 T-세포 이중특이적 분자, 예컨대 CD3 및 종양 관련 항원에 결합하는 항체 및 CD16 및 종양 관련 항원에 결합하는 분자가 포함된다.
예시적인 실시양태 및 실시예는 오직 설명을 위하여 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 출원의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사실상, 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 다양한 변형이 전술한 설명로부터 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해질 것이고, 이는 첨부된 청구범위의 범위 내에 속할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> CD8 BINDING AGENTS AND USES THEREOF <130> 14639-20492.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/895,865 <151> 2019-09-04 <160> 15 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val 35 40 45 Leu Cys Ile Arg Ile Phe Asp Arg His Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu His Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ser Phe Trp Ala Cys Thr Arg Pro Glu Gly Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Cys Ile Arg Ile Phe Asp Arg His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ser Phe Phe Gly Cys Thr Arg Pro Glu Gly Asp Met Asp 100 105 110 Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gln Ser Ala 115 120 125 <210> 3 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Val Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Cys Ile Arg Ile Phe Asp Arg His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 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Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys 245 250 255 Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser Gly Gly Lys Pro Ser Leu Ser 260 265 270 Asp Arg Tyr Val 275 <210> 15 <211> 276 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 15 Met Arg Asn Gln Ala Pro Gly Arg Pro Lys Gly Ala Thr Ser Pro Pro 1 5 10 15 Pro Leu Pro Thr Gly Ser Arg Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Leu Arg 20 25 30 Ala Glu Pro Arg Pro Gly Glu Arg Val Met Ala Pro Pro Val Thr Ala 35 40 45 Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Gln 50 55 60 Phe Arg Val Ser Pro Leu Gly Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val 65 70 75 80 Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser 85 90 95 Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Thr Ala Ala Arg Pro Thr Phe Leu Leu 100 105 110 Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln 115 120 125 Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr Leu Arg 130 135 140 Asp Phe Arg Gln Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser 145 150 155 160 Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala 165 170 175 Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Ser Pro Thr Pro Ala Pro Thr 180 185 190 Thr Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 195 200 205 Ala Gly Gly Ser Val Asn Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 210 215 220 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ala Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 225 230 235 240 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys 245 250 255 Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser Gly Gly Lys Pro Ser Leu Ser 260 265 270 Asp Arg Tyr Val 275

Claims (80)

  1. 중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인 (VHH 도메인)을 포함하며, 인간 CD8에 약 1 nM 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 CD8 결합제.
  2. 제1항에 있어서, 인간 CD8에 약 0.002/s 이하의 koff로 결합하는 CD8 결합제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시노몰구스 CD8에 약 1 nM 이하의 KD로 결합하는 CD8 결합제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시노몰구스 CD8에 약 0.004/s 이하의 koff로 결합하는 CD8 결합제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CD8+ T 세포의 활성화를 자극하거나 억제하지 않는 CD8 결합제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CD8+ T 세포 증식을 유도하지 않는 CD8 결합제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포에 결합하지 않는 CD8 결합제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, VHH 도메인이 라마 VHH인 CD8 결합제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, VHH 도메인이 인간화된 것인 CD8 결합제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, VHH 도메인이 Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 및 Thr97을 포함하는 인간 CD8α 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 13에 따른 것인 CD8 결합제.
  11. 제10항에 있어서, VHH 도메인이 서열식별번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 (CDR) 1; 서열식별번호: 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열식별번호: 10-12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 CD8 결합제.
  12. 제11항에 있어서, VHH 도메인이
    (1) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (2) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (3) 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
    (4) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
    을 포함하는 것인 CD8 결합제.
  13. 제11항에 있어서, VHH 도메인이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 CD8 결합제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, VHH 도메인이 L49A를 포함하고, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른 것인 CD8 결합제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, VHH 도메인이 V89T 치환, T110Q 치환, S112Q 치환 및 A114 첨가로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링에 따른 것인 CD8 결합제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, VHH 도메인이 서열식별번호: 1-4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CD8 결합제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 Fc 영역을 포함하지 않는 것인 CD8 결합제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 CD8 결합제를 인코딩하는 단리된 핵산.
  19. 제18항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  20. 제18항의 핵산 또는 제19항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포 (예를 들어, Expi293 세포), 또는 원핵 세포인 숙주 세포.
  22. a) 작용제가 생산되는 조건 하에 제20항 또는 제21항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 숙주 세포에 의해 생산된 CD8 결합제를 회수하는 단계
    를 포함하는 CD8 결합제의 제조 방법.
  23. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, VHH 도메인이 표지에 접합된 것인 CD8 결합제.
  24. 제23항에 있어서, 표지가 형광 염료, 방사성핵종 또는 효소인 CD8 결합제.
  25. 제24항에 있어서, 표지가 방사성핵종인 CD8 결합제.
  26. 제25항에 있어서, 방사성핵종이 18F, 89Zr, 99mTc, 67Ga, 68Ga, 64Cu, 52Mn, 111In 또는 124I인 CD8 결합제.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, VHH 도메인이 킬레이팅 모이어티를 통해 표지에 접합되는 것인 CD8 결합제.
  28. 제27항에 있어서, 킬레이팅 모이어티가 리신 잔기를 통해 VHH 도메인에 공유 결합된 것인 CD8 결합제.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 표지가 금속과 복합체를 형성하며, 여기서 복합체는 킬레이팅 모이어티에 의해 킬레이트화되는 것인 CD8 결합제.
  30. 제29항에 있어서, 표지가 18F이고, 금속이 알루미늄인 CD8 결합제.
  31. 제30항에 있어서, 킬레이팅 모이어티가 하기 화학식 (I)의 화합물인 CD8 결합제.
    Figure pct00011
    (I)
  32. a) 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계; 및
    b) 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하며, 여기서 결합의 검출은 CD8+ 세포의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 대상체에서 CD8+ 세포를 검출하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 대상체에서 CD8+ 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것이 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것을 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 대상체에서 CD8+ 세포를 영상화하는 것이 대상체에서 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CD8+ 세포가 CD8+ T 세포 또는 CD8+ 종양 세포인 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 투여 후 약 1일 또는 그 미만 이내에 실행되는 것인 방법.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 1회 이상 반복되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 방법이 CD8 결합제의 이전 투여 후 약 1일 후에 반복되는 것인 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 방법이 연간 1 내지 4회 반복되는 것인 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 1년 초과 동안 반복되는 것인 방법.
  41. 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 약 1 nM 내지 약 30 nM의 감도를 갖는 것인 방법.
  42. 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 또는 비-인간 영장류인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 비-인간 영장류가 시노몰구스 원숭이 또는 레서스 원숭이인 방법.
  44. 제32항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 암을 갖는 것인 방법.
  45. 제32항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 것인 방법.
  46. a) 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계; 및
    b) 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신에 대한 암을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    (c) 결합이 검출되었던 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신을 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  48. a) 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계, 및
    b) 1차 시점 및 2차 시점에서 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    (c) 2차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준이 1차 시점에서의 종양 조직 내 CD8+ T 세포의 수준보다 높은 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신을 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  50. i) 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신과 함께 투여하는 단계, 및
    ii) 1차 시점 및 2차 시점에서 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는, 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신을 제공받았거나 이를 제공받고 있는 암을 가진 대상체에서 치료 진행을 모니터링하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 표지된 CD8 결합제가 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신 전에 투여되며, 여기서 1차 시점은 표지된 CD8 결합제의 투여 후 및 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신의 투여 전이고, 여기서 2차 시점은 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신의 투여 후인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신이 표지된 CD8 결합제 전에 투여되며, 여기서 1차 시점은 면역요법제, 세포 요법 또는 암 백신의 투여 후 및 표지된 CD8 결합제의 투여 후이고, 여기서 2차 시점은 1차 시점 후인 방법.
  53. 제46항 내지 제47항 및 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 면역요법제가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 면역요법제가 항-PDL1 항체, 항-PD1 항체, 항-TIGIT 항체, TIGIT 길항제, 항-CSF-1R 항체, 항-CSF-1R 길항제, 항-CEA 항체, 항-CEA 길항제, 항-CTLA4 항체, CTLA4길항제, 항-OX40 항체, 또는 OX40 효현제인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 면역요법제가 항-PD-L1 항체인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 항-PD-L1 항체가 아테졸리주맙인 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 항-PD-L1 항체가 하나 이상의 치료제와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 하나 이상의 치료제가 타르세바® (에를로티닙), 젤보라프® (베무라페닙), 가지바® (오비누투주맙), 아바스틴® (베바시주맙), 코텔릭® (코비메티닙), 젤보라프® (베무라페닙) 및 코텔릭® (코비메티닙), 알렉센사® (알렉티닙), 카드실라® (아도-트라스투주맙 엠탄신), 헤르셉틴® (트라스투주맙), 페르제타® (페르투주맙), 폴라투주맙, INF-알파, 항-CD40 작용제, 항-OX40 항체, OX40 효현제, 항-CSF-1R 항체, 항-CEA 항체, IDO 억제제 또는 항-TIGIT 항체인 방법.
  59. 제53항에 있어서, 면역요법제가 시토카인, 예컨대 IL2, 조작된 IL2, IL15, 또는 조작된 IL15인 방법.
  60. 제53항에 있어서, 면역요법제가 수지상 세포 조정제, 예컨대 수지상 세포 활성화제 또는 수지상 세포 성장 인자인 방법.
  61. 제53항에 있어서, 면역요법제가 CD3 또는 CD16, 예컨대 CD16A에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자인 방법.
  62. 제46항 내지 제47항 및 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 암 백신이 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 암 백신이 맞춤형 암 백신 (PCV)인 방법.
  64. 제46항 내지 제47항 및 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 요법이 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 세포 요법이 CAR-T 또는 신생항원-특이적 T 세포인 방법.
  66. a) 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계; 및
    b) 표지된 CD8 결합제가 대상체의 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 결합하는 것을 검출하며, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 면역요법제에 대한 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    (c) 결합이 검출되었던 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제를 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  68. a) 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 투여하는 단계, 및
    b) 1차 시점 및 2차 시점에서 대상체의 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하며, 여기서 1차 시점 및 2차 시점으로부터의 CD8+ T 세포의 증가는 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환이 진행되었다는 표시인 것인 단계
    를 포함하는, 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체에서 질환 진행을 모니터링하는 방법.
  69. 제68항에 있어서,
    (c) 2차 시점에서의 질환 조직 내 CD8+ T 세포의 수준이 1차 시점에서의 질환 조직 내 CD8+ T 세포의 수준보다 낮은 대상체에게 치료적 유효량의 면역요법제를 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  70. i) 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표지된 CD8 결합제를 대상체에게 면역요법제와 함께 투여하는 단계, 및
    ii) 1차 시점 및 2차 시점에서 질환 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는, 면역요법제를 제공받았거나 이를 제공받고 있는 자가면역 질환 또는 상태, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질환을 갖는 대상체에서 치료 진행을 모니터링하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 표지된 CD8 결합제가 면역요법제 전에 투여되며, 여기서 1차 시점은 표지된 CD8 결합제의 투여 후 및 면역요법제의 투여 전이고, 여기서 2차 시점은 면역요법제의 투여 후인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 면역요법제가 표지된 CD8 결합제 전에 투여되며, 여기서 1차 시점은 면역요법제의 투여 후 및 표지된 CD8 결합제의 투여 후이고, 여기서 2차 시점은 1차 시점 후인 방법.
  73. 제46항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 CD8+ T 세포에 대한 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출하는 것이 대상체에서 CD8+ T 세포를 영상화하는 것을 포함하는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 대상체에서 CD8+ T 세포를 영상화하는 것이 대상체에 대해 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영 (PET/CT) 스캔을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  75. 제48항 내지 제65항 및 제68항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 적어도 1년 동안 모니터링되는 것인 방법.
  76. a) 면역요법제를 이용한 치료에 반응성인 대상체 및 면역요법제를 이용한 치료에 반응성이 아닌 대상체를 포함하는, 암을 갖는 대상체의 집단으로부터 장내 미생물총 샘플을 수득하는 단계;
    b) 치료에 반응성인 대상체의 장내 미생물총 샘플 및 치료에 반응성이 아닌 대상체의 장내 미생물총 샘플을 분석하는 단계; 및
    c) 치료에 반응성인 대상체와 관련된 장내 미생물 균주를 식별하고, 여기서 반응성은 대상체의 종양 조직 내 CD8+ T 세포에 대한 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표지된 CD8 결합제의 결합을 검출함으로써 결정되고, 여기서 결합의 검출은 대상체가 면역요법제에 반응성임을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 면역요법제를 이용한 치료에 대한 반응성과 관련된 장내 미생물 균주를 식별하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 면역요법제에 대한 반응성과 관련된 장내 미생물 균주를 포함하는 미생물총-기반 약물을 제조하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 면역요법제가 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체, 예컨대 아테졸리주맙인 방법.
  79. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표지된 CD8 결합제를 포함하는 키트.
  80. 킬레이팅 모이어티를 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 CD8 결합제의 VHH 도메인에 접합시켜 접합체를 제공하는 단계, 및 상기 접합체를 18F를 포함하는 플루오린화알루미늄 복합체와 접촉시켜 표지된 CD8 결합제를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 킬레이팅 모이어티는 하기 화학식 (I)의 화합물인, 표지된 CD8 결합제를 제조하는 방법.
    Figure pct00012
    (I)
KR1020227010647A 2019-09-04 2020-09-03 Cd8 결합제 및 이의 용도 KR20220057563A (ko)

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