CN114230665B - CD8α结合多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种CD8α结合多肽，所述CD8α结合多肽包含至少一个可变结构域，所述可变结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加。本申请还涉及包含所述CD8α结合多肽的组合物及其用于诊断和/或治疗包括例如肿瘤在内的各种疾病中的用途。

Description

CD8α结合多肽及其用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种CD8α结合多肽及其用途。
背景技术
发射型计算机断层成像术(Emission Computed Tomography，ECT)已用于肿瘤的诊断。ECT包括单光子发射计算机断层成像术(Single-Photon Emission ComputedTomography，SPECT)和正电子发射断层成像术(Positron Emission Tomography，PET)，其提供了高分辨率的肿瘤成像并且可通过图像进行定量分析。
在人类中，CD8主要在细胞毒性T淋巴细胞上表达，但也在树突状细胞、自然杀伤细胞等表达。CD8分子可以是由CD8α形成的同二聚体，或是由CD8α和CD8β形成的异二聚体，其中αβ异二聚体更普遍。
在体内监测CD8阳性肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的能力对于评估免疫治疗的反应和协助开发更有效的免疫细胞靶向单一和联合治疗具有重要意义。肿瘤浸润性T细胞的“免疫PET”显像可以提供一种特异、敏感的方法，帮助患者选择特定的免疫治疗方案，并确定治疗是否有效。
本领域需要能够用于检测表达CD8的细胞的检测剂，特别是适合于ECT检测的基于CD8α抗体的检测剂。
发明内容
一方面，本申请提供了一种CD8α结合多肽，所述CD8α结合多肽包含至少一个可变结构域，所述可变结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加。
在某些实施方式中，其中所述CD8α结合多肽具有以下性质中的一种或多种：
(i)其能够与PROTEIN A亲和层析柱的填料结合；
(ii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其能够以相同或更高的亲和力与CD8α结合；
(iii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其具有增加的表达量；和
(iv)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其等电点提高。
在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
在某些实施方式中，其中所述VHH是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15或SEQID NO:16所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，和所述CDR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，和所述CDR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，和所述CDR3包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，和所述CDR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸取代：
(a)E30；(b)S60；(c)E62；(d)S72；(e)Q78；(f)I83；(g)T85；(h)D109；和(i)M112。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：
(a)E30S，E30G，E30T或E30Y；(b)S60Y；(c)E62D；(d)S72R，S72H或S72K；(e)Q78H或Q78T；(f)I83M；(g)T85S；(h)D109A，D109V，D109L，D109I，D109G，D109S或D109T；和(i)M112L，M112A，M112V，M112I，M112G，M112S或M112L。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域包含选自以下一组或多组的氨基酸取代：
(i)S60Y/E62D/Q78H/I83M/T85S的氨基酸取代；
(ii)S72R、T85S、D109A、S72R/D109A或S72R/T85S/D109A的氨基酸取代；和
(iii)E30S/M112L的氨基酸取代。
在某些实施方式中，所述可变结构域经过人源化改造。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸取代：
(a)L2；(b)A14；(c)G56；(d)N57；(e)A75；(f)K87；(g)P88；和(h)K117。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：
(a)L2V；(b)A14P；(c)G56R；(d)N57R；(e)A75S；(f)K87R；(g)P88A；和(h)K117Q。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域包含以下氨基酸取代：L2Y和A14P。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域还包含以下氨基酸取代：A75S，K87R，P88A和/或K117Q。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域还包含以下氨基酸取代：G56R和/或N57R。
在某些实施方式中，所述可变结构域包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述可变结构域包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述可变结构域包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽的C末端还包含半胱氨酸修饰。
在某些实施方式中，其中所述半胱氨酸修饰包括以下形式：C、VDC、(GG)nC或(GS)mC，其中n或m各自独立地选自1，2，3和4。
在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽包含1个可变结构域。
在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQID NO:32所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供分离的一种或多种核酸分子，其编码前述的CD8α结合多肽。
另一方面，本申请提供一种载体，其包含前述的核酸分子。
另一方面，本申请提供一种细胞，其包含前述的核酸分子或前述的载体。
另一方面，本申请提供一种制备权利要求前述的CD8α结合多肽的方法，包括在允许所述CD8α结合多肽表达的条件下培养前述的细胞。
在某些实施方式中，所述方法还包括回收由所述细胞表达的CD8α结合多肽。
在某些实施方式中，所述方法还包括纯化和/或修饰所述CD8α结合多肽。
另一方面，本申请提供一种免疫缀合物，其包含前述的CD8α结合多肽。
在某些实施方式中，所述免疫缀合物还包括与所述CD8α结合多肽结合的至少一种可检测标记。
在某些实施方式中，其中所述可检测标记选自放射性核素、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子和酶。
在某些实施方式中，其中所述可检测标记包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、67Cu、67Ga、68Ga、68Ge、86Y、90Y、89Zr、94mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其他γ-、β-、或正电子发射体。
在某些实施方式中，其中所述CD8α结合多肽通过螯合剂与所述可检测标记缀合。
在某些实施方式中，其中所述螯合剂选自DTPA、EDTA、NOTA、DOTA、TRAP、TETA、NETA、CB-TE2A、Cyclen、Cyclam、Bispidine、TACN、ATSM、SarAr、AmBaSar、MAG3、MAG2、HYNIC、DADT、EC、NS3、H2dedpa、HBED、DFO、PEPA或者HEHA及其衍生物。
在某些实施方式中，其中所述可检测标记包括68Ga。
在某些实施方式中，其中所述螯合剂包括NOTA或其衍生物，例如NODAGA或Maleimide-NODAGA。
另一方面，本申请提供一种组合物，其包含前述的CD8α结合多肽、前述的核酸分子、前述的载体、前述的细胞和/或前述的免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。
在某些实施方式中，所述组合物包含前述的CD8α结合多肽或前述的免疫缀合物，所述组合物为检测剂。
在某些实施方式中，其中所述检测剂为造影剂。
在某些实施方式中，其中所述造影剂是ECT造影剂。
在某些实施方式中，其中所述ECT造影剂包括SPECT造影剂或PET造影剂。
另一方面，本申请提供前述的CD8α结合多肽、前述的核酸分子、前述的载体、前述的细胞、前述的免疫缀合物和/或前述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于监测、预防、缓解和/或治疗肿瘤。
在另一方面，本申请提供了本申请的CD8α结合多肽或本申请的免疫缀合物在制备用于检测CD8阳性细胞的检测剂中的用途。
另一方面，本申请提供一种检测生物学样品中CD8的存在和/或量的方法，包括：使所述生物学样品接触前述的CD8α结合多肽、前述的免疫缀合物或前述的组合物。
在某些实施方式中，其中所述接触在体外或离体进行。
在某些实施方式中，其中所述生物学样品为组织。
在某些实施方式中，其中所述组织选自血液组织、淋巴组织和肿瘤组织。
在某些实施方式中，所述方法包括检测生物学样品中CD8阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中通过成像确定生物学样品中CD8阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中通过流式细胞术确定生物学样品中CD8阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中所述CD8阳性细胞是CD8阳性T细胞。
另一方面，本申请提供一种检测和/或诊断与CD8相关的疾病或病症方法，包括向有此需要的受试者施用前述的CD8α结合多肽、前述的免疫缀合物或前述的组合物。
在某些实施方式中，其中所述方法还包括对所述受试者进行成像。
在某些实施方式中，其中所述成像包括ECT成像。
在某些实施方式中，其中所述ECT成像包括SPECT成像或PET成像。
在某些实施方式中，其中所述与CD8相关的疾病或病症包括肿瘤。
另一方面，本申请提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括：
1)向有需要的受试者施用前述的CD8α结合多肽、前述的免疫缀合物或前述的组合物；和
2)确定所述受试者的肿瘤是否包含CD8阳性细胞；
其中如果检测到所述肿瘤中CD8阳性细胞的存在，则给所述受试者施用抗肿瘤疗法。
另一方面，本申请提供一种用于监测抗肿瘤疗法在受试者中的功效的方法，所述方法包含：
1)给患有肿瘤且采用抗肿瘤疗法治疗的受试者施用前述的CD8α结合多肽、前述的免疫缀合物或前述的组合物；
2)确定所述受试者的肿瘤中CD8阳性细胞的量。
在某些实施方式中，通过成像所述受试者的肿瘤中CD8阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中所述抗肿瘤疗法是免疫检查点抑制剂疗法。
在某些实施方式中，其中所述抗肿瘤疗法选自施用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM3抑制剂、BTLA抑制剂、TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、GITR抑制剂、LAG3抑制剂、另一T细胞共抑制剂或配体的拮抗剂、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂、Ang2抑制剂、转化生长因子β(TGFβ)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、CD20抑制剂、针对肿瘤特异性抗原的抗体、疫苗、增加抗原呈递的佐剂、双特异性抗体、细胞毒素、化疗剂、环磷酰胺、放疗、IL-6R抑制剂、IL-4R抑制剂、IL-10抑制剂、细胞因子以及抗体-药物缀合物(ADC)。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，其中所述实体瘤选自结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、宫颈癌、膀胱癌、肛门癌、子宫癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌、骨癌、睾丸癌、皮肤癌、肾癌、胃癌、食管癌、头颈癌、唾液腺癌以及骨髓瘤。
另一方面，本申请提供一种用于分离CD8阳性细胞的方法，所述方法包括：使包含CD8阳性细胞的细胞群与前述的CD8α结合多肽或前述的免疫缀合物接触，回收结合至前述的CD8α结合多肽或前述的免疫缀合物的CD8阳性细胞。
在某些实施方式中，其中所述CD8阳性细胞是CD8阳性T细胞。
在某些实施方式中，其中所述包含CD8阳性细胞的细胞群是人外周血单个核细胞(PBMC)。
在某些实施方式中，其中前述的CD8α结合多肽或前述的免疫缀合物固定化于固体表面上。
在某些实施方式中，其中所述固体包括凝胶或磁珠。
另一方面，本申请提供一种试剂盒，其包含前述的CD8α结合多肽、前述的免疫缀合物或前述的组合物。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A显示的是本申请所述抗体C37同PROTEIN A亲和填料结合情况；
图1B显示的是本申请所述抗体C37-YDHMS同PROTEIN A亲和填料结合情况；
图2显示的是本申请所述抗体GSC-C37H在偶联前后及还原后的SEC-HPLC纯度分析图；
图3显示的是本申请所述抗体GSC-C37H偶联NODAGA前后的质谱分析数据；
图4显示的是本申请所述抗体GSC-C37H偶联NODAGA前后的ELISA检测数据；
图5A显示的是本申请所述68Ga-NODAGA-GSC-C37H单域抗体的Radio-TLC结果；
图5B显示的是本申请所述68Ga-NODAGA-GSC-C37H单域抗体的Radio-HPLC结果；
图6显示的是本申请所述68Ga-NODAGA-GSC-C37H在HSC-NPG动物模型PET/CT成像；
图7显示的是本申请所述68Ga-NODAGA-GSC-C37H在PBMC动物模型micro-PET成像；
图8A显示的是本申请所述PBMC人源化动物micro-PET显影后ROI的生物分布结果(给药1h后)；
图8B显示的是本申请所述PBMC人源化动物micro-PET显影2h后ROI的生物分布结果(给药2h后)；
图8C显示的是本申请所述PBMC人源化动物给药2h后解剖的离体生物分布结果(给药2h后)；
图9A显示的是本申请所述PBMC人源化动物的血液放射性ID％/g随时间的变化趋势图；
图9B显示的是本申请所述PBMC人源化动物的不同剂量的血液中放射性物质摄取％ID/gTAC曲线；
图10A显示的是本申请所述68Ga-NODAGA-GSC-C37H单域抗体的体外血清稳定性的Radio-TLC检测结果；
图10B显示的是本申请所述68Ga-NODAGA-GSC-C37H单域抗体的体外血清稳定性的Radio-HPLC检测结果；
图11A显示的是本申请所述小鼠给药后不同时间尿液样品的Radio-HPLC结果；
图11B显示的是本申请所述小鼠给药后不同时间血液样品的Radio-HPLC结果；
图12显示的是本申请所述68Ga-NODA-GA-GSC-C37H合成路线图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
术语“CD8”(分化簇8)是指主要在细胞毒性T淋巴细胞上表达，但也树突状细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞的亚群上表达的细胞表面糖蛋白。糖蛋白由两种同种型α和β(其由不同基因编码)组成，并且表达为αα同二聚体或αβ异二聚体，其中后者占主导。CD8共受体使T细胞受体MHC-1相互作用稳定，并且通过CD3相关免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的淋巴细胞特异性蛋白酪胺酸激酶(Lck)磷酸化引发胞内信号传导，以便活化。
在本申请中，术语“CD8α结合多肽”意指任何能够特异性结合CD8α的多肽。在一些实施方案中，结合多肽是抗体。在其它实施方案中，结合多肽是例如抗体模拟物、细胞因子或生长因子。例如本申请的特异性结合CD8α的单域抗体。“CD8α结合多肽”或者可以指结合CD8α的单价多肽(即与CD8α的一个表位结合的多肽)，以及二价或多价结合多肽(即结合一个以上表位的结合多肽)。本申请的“CD8α结合多肽”可以包含至少一个结合CD8α的可变结构域。在一些实施方案中，本申请的“CD8α结合多肽”可以包含2、3、4或更多个结合CD8α的可变结构域。本申请的CD8α结合多肽除结合CD8α的可变结构域外也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的可变结构域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如PEG)和/或Fc区。在一些实施方案中，本申请的“CD8α结合多肽”还涵盖双特异性抗体，其含有结合不同抗原的可变结构域。
在本申请中，术语“抗体”是在最广泛的意义上加以使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性(Milleretal(2003)Jour.ofImmunology170:4854-4861)，即结合CD8α(诸如人CD8α，鼠CD8α，食蟹猴CD8α或恒河猴CD8α)。抗体可以是鼠、人、人源化、嵌合抗体，或源于其它物种。
全长抗体典型地是指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。
“全长抗体重链”通常是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。在一些实施方式中，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”通常是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CH1结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD，和IgE)。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。抗原中由抗体特异性地识别和结合的部分是称作如上文所述的“表位”。抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其并非必须包含两者。Fd片段例如具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、恒定轻链(CL)和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab’)2片段，具有由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(5)dAb片段(Ward等人,“Binding Activities of a Repertoire ofSingle Immunoglobulin Variable Domains Secreted From Escherichia coli,”Nature341:544-546(1989)，其以引用的方式整体并入本申请)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)；(7)单链Fv(scFv)，例如源于scFV-文库。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立基因编码，但其可通过合成连接子使用重组方法接合，合成连接子使得其被制备为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))(可参见例如Huston等人,“Protein Engineering of Antibody Binding Sites:Recovery of SpecificActivity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichiacoli,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))；和(8)VHH，“VHH”涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19，921-930；Muyldermans S.，2001，J Biotechnol.，74，277-302以及综述Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)和/或单域抗体。这些抗体片段使用所属领域的技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式评估所述片段的功能。
在本申请中，术语“可变结构域”通常是指能够特异性结合抗原表位的抗体的可变结构域。例如，抗体可变结构域VH及VL(VH结构域及VL结构域)。可变结构域的另一实例为“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、VHH结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoid oflight chains”；Nature 363,446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(其在本申请中称为“VH结构域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(其在本申请中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规4链抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。
在本申请中，“可变结构域”通常具有相同的大体结构，每个结构域包含4个序列高度保守的框架(FR)区，其中，FR区包括“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”，FR区“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”连接。可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。抗体可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
在本申请中，术语“CDR”通常是指抗体可变序列内的互补性决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在3个CDR，对于每个可变区，其称为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确界限已经根据不同系统进行了不同定义。Kabat描述的系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1987)和(1991))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了定义这三个CDR的精确残基界限。这些CDR可称为Kabat CDR。Chothia及其同事(Chothia&#x26；Lesk，J.MoI.Biol.196:901-917(1987)和Chothia等人，Nature 342:877-883(1989))发现，Kabat CDR内的一些亚部分几乎采取了相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大差异。这些亚部分指定为L1、L2和L3，或者H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别是指轻链和重链区域。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的界限。Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))和MacCallum(JMoI Biol 262(5):732-45(1996))中已经描述了定义与Kabat CDR重叠的CDR的其他界限。其他CDR界限可能没有严格遵照一个上述系统，但是仍然与Kabat CDR重叠，尽管根据以下预测或实验发现，他们可以被缩短或延长，特定残基或残基组或甚至整个CDR没有显著影响抗原结合。除非在说明书中另有明确说明，如本申请所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括上文所述的任何方法(Kabat、Chothia或IMGT)所定义的CDR。
在本申请中，术语“序列同一性”通常是指是使用序列比对程序比对时，两个或多个比对的序列相同的核酸或氨基酸序列。在此的术语“％序列同一性”通常指的是使用序列比对程序比对时，两个或多个比对序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysisof Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,20von Heinje,G.,AcademicPress,1987和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991。
在本申请中，氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸编码加以表示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”通常是指与另一序列相比，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在一些实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。在一些实施方式中，所述取代为非保守氨基酸取代，例如，Ala被Asp、Asn、Glu或Gin取代。
在本申请中，术语“亲和力”通常是指分子(例如，多肽或抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，靶标或抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的的常用方法测量，诸如表面等离子体共振，并且还包括本申请所报道的那些方法。分子X对其结合配偶体Y的较高的亲和力可见于较低的Kd值和/或EC50值。
在本申请中，术语“分离的”通常是指至少部分从在其天然状态中通常与其结合的其他分子中分离的分子(例如抗体、核酸等)。“分离的多肽”基本上没有其他生物分子，如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、细胞碎片和生长培养基。“分离的核酸”通常以不同于其天然发现的形式或背景存在。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指抗体或其抗体片段与其它活性剂连接而形成的缀合物，诸如化疗剂，毒素，免疫治疗剂，放射性元素、成像探针，光谱探针等等。所述连接可以是共价键，或例如通过静电力的非共价相互作用。可以使用本领域中已知的多种接头以形成免疫缀合物。该缀合物可以通过所述抗体或其抗原结合片段与靶细胞上的抗原特异性结合，将所述其他试剂递送至靶细胞(例如，肿瘤细胞)。此外，该免疫缀合物可以以融合蛋白的形式提供，所述融合蛋白可以从编码该免疫缀合物的多核苷酸表达。
在本申请中，术语“螯合剂”通常是指能够与金属离子形成络合物的有机分子。螯合剂常用来标记物蛋白质或肽。金属离子缀合物的终产物用于放射免疫检测、放射免疫疗法、磁共振成像、光动力疗法或其他相似的模式。螯合剂或络合剂的非限制性例子是DTPA(二亚乙基三胺五乙酸酐)和其衍生物，NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N’,N”-三乙酸)和其衍生物如NODA-GA(NODAGA)、Maleimide-NODAGA，DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸)(结合放射性金属离子)和其衍生物，TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸)和其衍生物，DTTA(N-(对-异硫氰酸苄基)-二亚乙基三胺-N,N’,N”,N”’-四乙酸)。这些和其他螯合剂从商业来源轻易可获得。
在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料。这类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的制剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在此所描述的配制品中的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂包括：例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等等。适合用于在此所描述的配制品中的这些和另外已知的药物载体、赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的，例如，如“雷明顿药物科学与实践(Remington:The Science&#x26；Practice of Pharmacy)”，第21版，利平科特威廉斯与威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&#x26；Wilkins)(2005)以及“医师案头参考(Physician’sDesk Reference)”，第60版，医药经济出版社(Medical Economics)，蒙特维尔(Montvale)，新泽西(2005)中所列出。可以常规地选择对于所希望或所要求的给予方式、溶解度和/或稳定性来说合适的药学上可接受的载体。
在本申请中，术语“施用(administer)”和类似术语通常不限于身体施用，合适的方法包括体外、先体外后体内或体内方法。例如，可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与组合物接触的任何施用方法。例如，可以通过任意引入或递送途径将所述化合物引入需要治疗的受试者的身体中。在一些实施方案中，本申请的组合物可以口服、局部、鼻内、肌内、皮下、皮内、鞘内、腹膜内或经皮施用。
在本申请中，术语“离体”与“体外”可互换，通常是指在受控的环境中在已从受试者体内移除的细胞、组织和/或器官中进行的活动。
在本申请中，术语“诊断”通常是指检测疾病或病症，或测定疾病或病症的状态或程度。术语“诊断”也可以包括检测疾病或病症的诱因，测定药物治疗的治疗效果，或预测对药物治疗的响应模式。
在本申请中，术语“治疗”通常是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/或病状相关联的症状消退。
在本申请中，术语“肿瘤”和“癌症”可互换使用，通常是指赘生性或恶性细胞生长。本申请的肿瘤可能是良性的，也可能是恶性的。本申请的肿瘤可能是实体的，也可能是非实体的。
在本申请中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴等。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、或约10％的范围内变动。
在本申请中，术语“包含”和其变形形式，包括“含有”、“包括”等其它形式，通常是指包含其它组分、元素、数值、步骤等。
发明详述
CD8α结合多肽
一方面，本申请提供了一种CD8α结合多肽，所述CD8α结合多肽可以包含至少一个可变结构域，所述可变结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，可以具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加。
在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽可以包含一个、或两个、或三个可变结构域。
在某些实施方式中，所述可变结构域可以包含相对于SEQ ID NO:1具有一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个、或七个、或八个、或九个、或十个、或十一个、或十二个、或十三个、或十四个、或十五个、或十六个、或十七个、或十八个、或十九个、或二十个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述可变结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，可以具有一个或几个氨基酸的取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
在某些实施方案中，氨基酸突变可以在靶向部分的CDR(例如，CDR1区、CDR2区或CDR3区)中。在另一个实施方案中，氨基酸变化可以在靶向部分的构架区(FR)(例如，FR1区、FR2区、FR3区或FR4区)中。
可以使用本领域中的任何已知技术，例如定点诱变或基于PCR的诱变来实现对氨基酸序列的修饰。此类技术描述于例如以下文献中：Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.,1989；和Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1989。
在某些实施方案中，所述取代、缺失或添加基本上不降低本申请的CD8α结合多肽特异性地结合至CD8α的能力。
可以用平衡解离常数(KD)来描述本申请的CD8α结合多肽对人CD8α的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其它天然存在或合成类似物、变体或突变体(包括单体、二聚、异源二聚、多聚和/或相关形式)的结合亲和力。所述CD8α结合多肽可以包含靶向部分，所述靶向部分结合至人CD8α的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其它天然存在或合成的类似物、变体或突变体(包括单体、二聚、异源二聚、多聚和/或相关形式)，其中KD低于约1uM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、或约5nM、或约1nM。
在某些实施方式中，其中所述CD8α结合多肽可以具有以下性质中的一种或多种：
(i)其能够与PROTEIN A亲和层析柱的填料结合；
(ii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其能够以相同或更高的亲和力与CD8α结合；
(iii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其具有增加的表达量；和
(iv)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其等电点提高。
在某些实施方式中，本申请的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其表达可以是约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
在某些实施方式中，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体(命名为C37)的等电点(PI)值为4.56，所述CD8α结合多肽的PI值不小于4.56。例如，所述CD8α结合多肽的PI值可以为约5，约5.5，约6.0，约6.5，约6.6，约6.7，约6.8，约6.9，或约7。
在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗体可以包括单克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段可以包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。例如，所述抗体或其抗原结合片段可以为VHH。
在某些实施方式中，所述VHH不局限于特定的生物学来源或特定的制备方法。举例来说，所述VHH一般可以通过以下方式获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的VHH结构域的“人源化”或通过编码此类人源化VHH结构域的核酸的表达；(4)通过来自任何动物物种，如来自哺乳动物物种，如来自人类的天然存在的VH结构域的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构域的核酸的表达；(5)通过如本领域中描述的“结构域抗体”或“Dab”的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构域的核酸的表达；(6)通过使用合成或半合成技术来制备本领域中已知的蛋白质、多肽或其它氨基酸序列；(7)通过使用本领域中已知的核酸合成技术来制备编码VHH的核酸，随后表达如此获得的核酸；和/或(8)通过上述一项或多项的任何组合。
在某些实施方案中，所述CD8α结合多肽可以包含已经“骆驼化”，即通过将来自常规4链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基置换为骆驼重链抗体的VHH结构域中对应位置上存在的一或多个氨基酸残基的VHH。在一些实施方案中，此类“骆驼化”取代被插入在形成和/或存在于VH-VL界面上的氨基酸位置上和/或在所谓的骆驼科标志残基上(参见例如WO9404678，所述文献的全部内容以引用的方式并入本申请)。在一些实施方案中，用作起始物质或起始点以供产生或设计骆驼化VHH用的VH序列是来自哺乳动物的VH序列，例如，人类的VH序列，如VH3序列。所述骆驼化VHH可以用本领域中已知的任何合适的方式获得(即，如以上第(1)至(8)点所指示)，并且因此不严格限于已经使用包含天然存在的VH结构域作为起始物质的多肽而获得的多肽。
在某些实施方式中，其中所述VHH可以是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在某些实施方案中，所述CD8α结合多肽可以包含已经“人源化”，即通过将天然存在的VHH序列的氨基酸序列中(且具体来说是构架序列中)的一个或多个氨基酸残基置换为来自人类的常规4链抗体的VH结构域中对应位置上存在的一个或多个氨基酸残基的VHH。这可以使用本领域中已知的人源化技术来进行。在一些实施方案中，可能的人源化取代或人源化取代的组合可以通过本领域中已知的方法来确定，例如，通过在VHH的序列与天然存在的人VH结构域的序列之间进行比较。在一些实施方案中，对所述人源化取代进行选择，以使所得人源化VHH仍保留有利的功能性质。一般来说，作为人源化的结果，本申请的VHH相较于对应的天然存在的VHH结构域可以变得更“像人的”，同时仍保留有利性质，如降低的免疫原性。本申请的人源化VHH可以用本领域中已知的任何合适的方式来获得，并且因此不严格限于已经使用包含天然存在的VHH结构域作为起始物质的多肽获得的多肽。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。所述CDR可以是Kabat CDR、AbM CDR、Chothia CDR或Contact CDR。在一些实施方案中，所述CDR是Chothia CDR。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含：CDR1，所述CDR1包含SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含：CDR1，所述CDR1包含SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含：CDR2，所述CDR2包含SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含：CDR2，所述CDR2包含SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含：CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含：CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
例如，所述可变结构域可以包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1可以包含SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列，所述CDR2可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，和所述CDR3可以包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
例如，所述可变结构域可以包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1可以包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列，所述CDR2可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，和所述CDR3可以包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
例如，所述可变结构域可以包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1可以包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列，所述CDR2可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，和所述CDR3可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
例如，所述可变结构域可以包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1可以包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列，所述CDR2可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，和所述CDR3可以包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸取代：
(a)E30；(b)S60；(c)E62；(d)S72；(e)Q78；(f)I83；(g)T85；(h)D109；和(i)M112。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以在以下位置包含氨基酸取代：(b)S60；(c)E62；(e)Q78；(f)I83；和(g)T85。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以在以下位置包含氨基酸取代：(d)S72；(f)I83；和/或(h)D109。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以在以下位置包含氨基酸取代：(a)E30；和/或(i)M112。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以在以下位置包含氨基酸取代：(a)E30；(b)S60；(c)E62；(d)S72；(e)Q78；(f)I83；(g)T85；(h)D109；和(i)M112。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：
(a)E30S，E30G，E30T或E30Y；(b)S60Y；(c)E62D；(d)S72R，S72H或S72K；(e)Q78H或Q78T；(f)I83M；(g)T85S；(h)D109A，D109V，D109L，D109I，D109G，D109S或D109T；和(i)M112L，M112A，M112V，M112I，M112G，M112S或M112L。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：
(a)E30S；(b)S60Y；(c)E62D；(d)S72R；(e)Q78H；(f)I83M；(g)T85S；(h)D109A；和(i)M112L。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含选自以下一组或多组的氨基酸取代：
(i)S60Y/E62D/Q78H/I83M/T85S的氨基酸取代；
(ii)S72R、T85S、D109A、S72R/D109A或S72R/T85S/D109A的氨基酸取代；和
(iii)E30S/M112L的氨基酸取代。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含以下氨基酸取代：S60Y、E62D、Q78H、I83M和T85S。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含以下氨基酸取代：S72R、T85S、D109A。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含以下氨基酸取代：E30S、M112L。
又例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含以下氨基酸取代：E30S、S60Y、E62D、S72R、Q78H、I83M、T85S、D109A、M112L。
在某些实施方式中，所述可变结构域可以经过人源化改造。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸取代：
(a)L2；(b)A14；(c)G56；(d)N57；(e)A75；(f)K87；(g)P88；和(h)K117。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以在以下位置包含氨基酸取代：(a)L2；(b)A14；(e)A75；(f)K87和(g)P88。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以在以下位置包含氨基酸取代：(a)L2；(b)A14；(e)A75；(f)K87；(g)P88；和(h)K117。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以在以下位置包含氨基酸取代：(a)L2；(b)A14；(c)G56；(e)A75；(f)K87；(g)P88；和(h)K117。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以在以下位置包含氨基酸取代：(a)L2；(b)A14；(d)N57；(e)A75；(f)K87；(g)P88；和(h)K117。
在某些实施方式中，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：
(a)L2V；(b)A14P；(c)G56R；(d)N57R；(e)A75S；(f)K87R；(g)P88A；和(h)K117Q。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含以下氨基酸取代：L2Y和A14P。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域还可以包含以下氨基酸取代：A75S，K87R，P88A和/或K117Q。
例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域还可以包含以下氨基酸取代：G56R和/或N57R。
又例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含以下氨基酸取代：L2Y、A14P、A75S、K87R和P88A。
又例如，所述的CD8α结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的CD8α结合多肽的可变结构域可以包含以下氨基酸取代：L2Y、A14P、E30S、S60Y、E62D、S72R、A75S、Q78H、I83M、T85S、K87R、P88A、D109A和M112L。
在某些实施方式中，所述可变结构域可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
例如，所述可变结构域可以包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述可变结构域可以包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13具有至少约90％，或约91％，或约92％，或约93％，或约94％，或约95％，或约96％，或约97％，或约98％，或约99％序列同一性的氨基酸序列。
又例如，所述可变结构域可以包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽可以包含一个可变结构域。例如，所述CD8α结合多肽可以包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13具有至少约90％，或约91％，或约92％，或约93％，或约94％，或约95％，或约96％，或约97％，或约98％，或约99％序列同一性的氨基酸序列。
又例如，所述CD8α结合多肽可以包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽的C末端还可以包含半胱氨酸修饰。
在某些实施方式中，其中所述半胱氨酸修饰可以包括以下形式：C、VDC、(GG)nC或(GS)mC，其中n或m各自独立地选自1，2，3和4。
在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽可以包含1个可变结构域。
在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽可以包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
核酸、载体和细胞
另一方面，本申请提供分离的一种或多种核酸分子，其可以编码前述的CD8α结合多肽。
在某些实施方案中，所述核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在某些实施方案中，所述核酸可以编码包含抗体的VHH的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供了编码抗CD8α重链可变区的分离的核酸，其中该核酸包含与编码SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的核酸序列具有至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列。
另一方面，本申请提供一种载体，其包含前述的核酸分子。
另一方面，本申请提供一种细胞，其包含前述的核酸分子或前述的载体。
编码本申请的CD8α结合多肽的核酸可以并入(连接)至表达载体中，所述表达载体可以通过转染、转化或转导技术而引入宿主细胞中。举例来说，可以通过反转录病毒转导将编码本申请的CD8α结合多肽的核酸引入至宿主细胞中。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0,NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，宿主细胞是原核的，例如大肠杆菌细胞。
另一方面，本申请提供了一种生成CD8α结合多肽的方法，其中该方法可以包含在适合于CD8α结合多肽表达的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的细胞，和任选地自细胞(或细胞培养液)回收所述CD8α结合多肽。
在某些实施方式中，所述方法还可以包括纯化和/或修饰所述CD8α结合多肽。
具体的表达和纯化条件将取决于所采用的表达系统而变化。举例来说，如果在大肠杆菌中表达基因，那么首先通过将工程化的基因置于合适的细菌启动子例如Trp或Tac和原核信号序列的下游而将它克隆至表达载体中。在另一个实例中，如果将要在真核细胞，例如CHO细胞中表达工程化的基因，那么首先将它插入含有例如合适的真核启动子、分泌信号、增强子和各种内含子的表达载体中。可以使用转染、转化或转导技术将基因构建体引入至宿主细胞中。
本申请的CD8α结合多肽也可以在体内例如患者中表达。举例来说，在某些实施方案中，本申请的CD8α结合多肽可以呈编码本申请的CD8α结合多肽的核酸形式施用。所述核酸可以是DNA或RNA。在一些实施方案中，本申请的CD8α结合多肽是由经修饰的mRNA，即包含一个或多个经修饰的核苷酸的mRNA编码。在一些实施方案中，本申请涉及包含所述经修饰的mRNA的基因治疗载体。在一些实施方案中，本申请涉及包括所述基因治疗载体的基因治疗方法。在某些实施方案中，所述核酸呈溶瘤病毒，例如腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹、单纯疱疹、新城疫病毒或牛痘的形式。
免疫缀合物
另一方面，本申请提供一种免疫缀合物，其包含前述的CD8α结合多肽。
在某些实施方式中，所述免疫缀合物还包括与所述CD8α结合多肽结合的至少一种可检测标记。
在某些实施方式中，其中所述可检测标记可以选自放射性核素、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子和酶。
可用于缀合的荧光剂包括但不限于异硫氨酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺；可用于缀合的化学发光剂包括但不限于鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯；可用于缀合的生物发光剂包括但不限于荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。可用于缀合的顺磁离子包括但不限于铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钻(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，或者是不透辐射的材料，如坝、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘因他酸、碘达胺、胆影酸、碘沙酸、碘古酰胺、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘砜葡胺、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胶、甲泛影盐、丙碘酣和氧化亚铊。可用于缀合的酶包括但不限于辣根过氧化物酶等。
在某些实施方式中，所述可检测标记可以是放射性核素。可用于缀合的放射性核素可以是能量在20-4000KeV之间的放射性核素，包括但不限于110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、67Cu、67Ga、68Ga、68Ge、86Y、90Y、89Zr、94mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其他γ-、β-、或正电子发射体。
在某些实施方案中，所述可检测标记可以为68Ga或125I。
将可检测标记于多肽缀合的方法是本领域技术人员熟知的。例如，在某些实施方式中，所述CD8α结合多肽可以通过螯合剂与所述可检测标记缀合。
在某些实施方式中，为了用放射性核素如68Ga标记本申请的CD8α结合多肽，有必要使本申请的CD8α结合多肽和具有长尾的试剂反应，该长尾附着有多个用于结合离子的整合基团。这样的尾可以是例如聚赖氨酸、多聚糖或其它具有侧基的衍生的或可衍生的链的聚合物，该侧基可结合螯合基团，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸)、NOTA、TETA、NETA、卟啉、聚胺、冠状醚、双缩氨硫脲、聚肟以及己知可用于此目的类似基团。
在某些实施方式中，可检测标记通过螯合剂与本申请的CD8α结合多肽缀合。所用的螯合剂包括但不限于DTPA、EDTA、NOTA、DOTA、TRAP、TETA、NETA、CB-TE2A、Cyclen、Cyclam、Bispidine、TACN、ATSM、SarAr、AmBaSar、MAG3、MAG2、HYNIC、DADT、EC、NS3、H2dedpa、HBED、DFO、PEPA或者HEHA及其衍生物。
在某些实施方式中，其中所述可检测标记可以为68Ga。
在某些实施方式中，其中所述螯合剂可以为NOTA或其衍生物。例如，所述可检测标记可以是68Ga且所述螯合剂可以是NOTA。例如，所述可检测标记可以是68Ga且所述螯合剂可以是NODAGA。
在另一方面，本申请提供一种制备本申请的放射性核素如68Ga标记的免疫缀合物的方法，其包含1)使本申请的CD8α结合多肽与螯合剂缀合以生成所述CD8α结合多肽与螯合剂的缀合物；和2)使步骤1)的产物与放射性核素如68Ga接触，由此放射性核素如68Ga通过螯合剂的螯合作用标记本申请的CD8α结合多肽。在一些实施方案中，所述螯合剂是NOTA，且步骤1)中通过使所述CD8α结合多肽与p-SCN-Bn-NOTA或p-NH2-Bn-NOTA反应而生成所述CD8结合多肽与NOTA的缀合物。在另一些实施方案中，所述螯合剂是NODAGA，且步骤1)中通过使所述CD8α结合多肽与Maleimide-NODAGA反应而生成所述CD8结合多肽与NODAGA的缀合物。
在另一方面，本申请提供一种制备本申请的125I标记的缀合分子的方法，其包含1)使本申请的CD8α结合多肽在氯胺T存在下与125I反应；和2)用偏重亚硫酸钠终止反应。
组合物
另一方面，本申请提供一种组合物，其包含前述的CD8α结合多肽、前述的核酸分子、前述的载体、前述的细胞和/或前述的免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。
本申请描述的CD8α结合多肽可以具有能与无机或有机酸反应的充分碱性的官能团，或能与无机或有机碱反应的羧基，以形成药学上可接受的盐。如本领域中众所周知，药学上可接受的酸加成盐是由药学上可接受的酸形成。此类盐包括例如以下文献中列出的药学上可接受的盐：Journal of Pharmaceutical Science,66,2-19(1977)；和The Handbookof Pharmaceutical Salts；Properties,Selection,and Use.P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Verlag,Zurich(Switzerland)2002，所述文献以引用的方式整体并入本申请。在一些实施方案中，本申请描述的组合物呈药学上可接受的盐的形式。
本申请描述的任何组合物都可以作为包含药学上可接受的载体的组合物的组分施用至受试者。此类组合物可以任选地包含适量的药学上可接受的赋形剂，以便提供用于适当施用的形式。
药物赋形剂可以是液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些液体，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。所述药物赋形剂可以是例如生理盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、脲等等。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用至受试者时，所述药学上可接受的赋形剂是无菌的。当本申请描述的任何剂经静脉内施用时，水是可用的赋形剂。还可以采用生理盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液作为液体赋形剂，具体来说，用于可注射溶液。合适的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。合适的药物赋形剂的其它实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(AlfonsoR.Gennaro编,第19版,1995)中，所述文献以引用的方式并入本申请。
本申请包括所描述的组合物(和/或其它治疗剂)的各种调配物形式。本申请描述的任何发明组合物(和/或其它治疗剂)可以呈溶液、悬浮液、乳液、滴剂、片剂、丸剂、丹剂、胶囊剂、含有液体的胶囊剂、明胶胶囊、粉剂、持续释放调配物、栓剂、乳液、气雾剂、喷雾剂、悬浮液、冻干粉剂、冷冻悬浮液、干燥粉剂的形式或任何其它合用的形式。在一个实施方案中，所述组合物呈胶囊剂形式。在另一个实施方案中，所述组合物呈锭剂形式。在另一个实施方案中，所述组合物被配制呈软凝胶胶囊形式。在另一个实施方案中，所述组合物被配制呈明胶胶囊形式。在另一个实施方案中，所述组合物被配制为液体。
本申请描述的任何组合物根据常规程序配制为适合于本申请描述的施用模式的组合物。
施用途径包括例如：口服、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、叶鞘内、经皮、直肠、通过吸入或局部。施用可以是局部的或全身的。在一些实施方案中，所述施用是通过口服实现。在另一个实施方案中，所述施用是通过肠胃外注射。施用模式可以留给医师判断，并且部分取决于医学病状的部位。
在某些实施方式中，所述组合物可以包含本申请的免疫缀合物，所述组合物可以为检测剂。在某些实施方式中，其中所述检测剂可以为造影剂。例如，所述造影剂可以是ECT造影剂。又例如，所述ECT造影剂可以包括SPECT造影剂或PET造影剂。
检测/诊断用途
另一方面，本申请提供前述的CD8α结合多肽、前述的核酸分子、前述的载体、前述的细胞、前述的免疫缀合物和/或前述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于监测、预防、缓解和/或治疗肿瘤。
在另一方面，本申请提供了本申请的CD8α结合多肽或本申请的免疫缀合物在制备用于检测CD8阳性细胞的检测剂中的用途。在一些实施方案中，所述检测剂可以用于检测对象体内的组织中的CD8阳性细胞的存在和/或量。在一些实施方案中，所述组织是肿瘤组织。在一些实施方案中，所述CD8阳性细胞可以是CD8阳性T细胞。在一些实施方案中，所述检测剂可以是造影剂。在一些实施方案中，所述造影剂可以是ECT造影剂，例如SPECT造影剂或PET造影剂。
另一方面，本申请提供一种检测生物学样品中CD8的存在和/或量的方法，包括：使所述生物学样品接触前述的CD8α结合多肽、前述的免疫缀合物、前述的组合物或前述的检测剂。
在某些实施方式中，其中所述接触可以在体外或离体进行。
在某些实施方式中，其中所述生物学样品可以为组织。
在某些实施方式中，其中所述组织可以选自血液组织、淋巴组织和肿瘤组织。
在某些实施方式中，所述方法可以包括检测生物学样品中CD8阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中可以通过成像确定生物学样品中CD8阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中可以通过流式细胞术确定生物学样品中CD8阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中所述CD8阳性细胞可以是CD8阳性T细胞。
另一方面，本申请提供一种检测和/或诊断与CD8相关的疾病或病症方法，可以包括向有此需要的受试者施用前述的CD8α结合多肽、前述的免疫缀合物、前述的组合物或前述的检测剂。
在某些实施方式中，其中所述方法还可以包括对所述受试者进行成像。
在某些实施方式中，其中所述成像可以包括ECT成像。
在某些实施方式中，其中所述ECT成像可以包括SPECT成像或PET成像。
在某些实施方式中，其中所述与CD8相关的疾病或病症可以包括肿瘤。
另一方面，本申请提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法可以包括：
1)向有需要的受试者施用前述的CD8α结合多肽、前述的免疫缀合物、前述的组合物或前述的检测剂；和
2)确定所述受试者的肿瘤是否包含CD8阳性细胞；
其中如果检测到所述肿瘤中CD8阳性细胞的存在，则给所述受试者施用抗肿瘤疗法。
另一方面，本申请提供一种用于监测抗肿瘤疗法在受试者中的功效的方法，所述方法可以包含：
1)给患有肿瘤且采用抗肿瘤疗法治疗的受试者施用前述的CD8α结合多肽、前述的免疫缀合物、前述的组合物或前述的检测剂；
2)确定所述受试者的肿瘤中CD8阳性细胞的量。
在某些实施方式中，通过成像所述受试者的肿瘤中CD8阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中所述抗肿瘤疗法是免疫检查点抑制剂疗法。
在某些实施方式中，其中所述抗肿瘤疗法可以选自施用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM3抑制剂、BTLA抑制剂、TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、GITR抑制剂、LAG3抑制剂、另一T细胞共抑制剂或配体的拮抗剂、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂、Ang2抑制剂、转化生长因子β(TGFβ)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、CD20抑制剂、针对肿瘤特异性抗原的抗体、疫苗、增加抗原呈递的佐剂、双特异性抗体、细胞毒素、化疗剂、环磷酰胺、放疗、IL-6R抑制剂、IL-4R抑制剂、IL-10抑制剂、细胞因子以及抗体-药物缀合物(ADC)。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤可以包括实体瘤。
在某些实施方式中，其中所述实体瘤可以选自结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、宫颈癌、膀胱癌、肛门癌、子宫癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌、骨癌、睾丸癌、皮肤癌、肾癌、胃癌、食管癌、头颈癌、唾液腺癌以及骨髓瘤。
另一方面，本申请提供一种用于分离CD8阳性细胞的方法，所述方法可以包括：使包含CD8阳性细胞的细胞群与前述的CD8α结合多肽或前述的免疫缀合物接触，回收结合至前述的CD8α结合多肽或前述的免疫缀合物的CD8阳性细胞。
在某些实施方式中，其中所述CD8阳性细胞可以是CD8阳性T细胞。
在某些实施方式中，其中所述包含CD8阳性细胞的细胞群可以是人外周血单个核细胞(PBMC)。
在某些实施方式中，其中前述的CD8α结合多肽或前述的免疫缀合物可以固定化于固体表面上。
在某些实施方式中，其中所述固体可以包括凝胶或磁珠。
另一方面，本申请提供一种试剂盒，其可以包含前述的CD8α结合多肽、前述的免疫缀合物或前述的组合物。
在所述试剂盒中可以包括使用说明书。使用说明书典型地包括有形表示，其描述了使用所述试剂盒的组分实现所期望的治疗结果，诸如治疗癌症时将要采用的技术。任选地，所述试剂盒还含有本领域技术人员容易了解的其他有用组分，诸如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、敷涂器、吸移工具或测量工具、包扎材料或其他有用的附件。
装配在试剂盒中的材料和组分可以提供给从业人员，以保持其可操作性和效用的任何便利且适合的方式储存。举例来说，这些组分可以在室温、冷藏温度或冷冻温度下提供。这些组分典型地包含在合适的包装材料中。在某些实施方案中，包装材料是由众所周知的方法构造，优选地以提供无菌、无污染的环境。包装材料可以具有指示所述试剂盒和/或其组分的内含物和/或目的的外部标签。
具体地，本申请还提供了以下具体实施方式：
1.一种CD8α结合多肽，所述CD8α结合多肽包含至少一个可变结构域，所述可变结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加。
2.根据实施方式1所述的CD8α结合多肽，其中所述CD8α结合多肽具有以下性质中的一种或多种：
(i)其能够与PROTEIN A亲和层析柱的填料结合；
(ii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其能够以相同或更高的亲和力与CD8α结合；
(iii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其具有增加的表达量；和
(iv)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其等电点提高。
3.根据实施方式1-2中任一项所述的CD8α结合多肽，其包括抗体或其抗原结合片段。
4.根据实施方式3所述的CD8α结合多肽，所述抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
5.根据实施方式3-4中任一项所述的CD8α结合多肽，所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
6.根据实施方式5所述的CD8α结合多肽，其中所述VHH是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
7.根据实施方式1-6中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含SEQID NO:14所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。
8.根据实施方式1-7中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含SEQID NO:2、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。
9.根据实施方式1-8中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含：CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
10.根据实施方式1-9中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含：CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
11.根据实施方式1-10中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含：CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
12.根据实施方式1-11中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含：CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
13.根据实施方式1-12中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含：CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
14.根据实施方式1-13中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含：CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
15.根据实施方式1-14中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列，和所述CDR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
16.根据实施方式1-15中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列，和所述CDR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
17.根据实施方式1-15中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列，和所述CDR3包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
18.根据实施方式1-15中任一项所述的CD8α结合多肽，其中所述可变结构域包含：CDR1，CDR2和CDR3；所述CDR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列，和所述CDR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
19.根据实施方式1-18中任一项所述的CD8α结合多肽，与氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的参比抗体相比，所述可变结构域在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸取代：
(a)E30；(b)S60；(c)E62；(d)S72；(e)Q78；(f)I83；(g)T85；(h)D109；和(i)M112。
20.根据实施方式1-19中任一项所述的CD8α结合多肽，与氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的参比抗体相比，所述可变结构域包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：
(a)E30S，E30G，E30T或E30Y；(b)S60Y；(c)E62D；(d)S72R，S72H或S72K；(e)Q78H或Q78T；(f)I83M；(g)T85S；(h)D109A，D109V，D109L，D109I，D109G，D109S或D109T；和(i)M112L，M112A，M112V，M112I，M112G，M112S或M112L。
21.根据实施方式1-20中任一项所述的CD8α结合多肽，与氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的参比抗体相比，所述可变结构域包含选自以下一组或多组的氨基酸取代：
(i)S60Y/E62D/Q78H/I83M/T85S的氨基酸取代；
(ii)S72R、T85S、D109A、S72R/D109A或S72R/T85S/D109A的氨基酸取代；和
(iii)E30S/M112L的氨基酸取代。
22.根据实施方式1-21中任一项所述的CD8α结合多肽，所述可变结构域经过人源化改造。
23.根据实施方式1-22中任一项所述的CD8α结合多肽，与氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的参比抗体相比，所述可变结构域在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸取代：
(a)L2；(b)A14；(c)G56；(d)N57；(e)A75；(f)K87；(g)P88；和(h)K117。
24.根据实施方式1-23中任一项所述的CD8α结合多肽，与氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的参比抗体相比，所述可变结构域包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：
(a)L2V；(b)A14P；(c)G56R；(d)N57R；(e)A75S；(f)K87R；(g)P88A；和(h)K117Q。
25.根据实施方式1-24中任一项所述的CD8α结合多肽，与氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的参比抗体相比，所述可变结构域包含以下氨基酸取代：L2Y和A14P。
26.根据实施方式1-25中任一项所述的CD8α结合多肽，与氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的参比抗体相比，所述可变结构域还包含以下氨基酸取代：A75S，K87R，P88A和/或K117Q。
27.根据实施方式1-26中任一项所述的CD8α结合多肽，与氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的参比抗体相比，所述可变结构域还包含以下氨基酸取代：G56R和/或N57R。
28.根据实施方式1-27中任一项所述的CD8α结合多肽，所述可变结构域包含SEQID NO:14所示的氨基酸序列。
29.根据实施方式1-28中任一项所述的CD8α结合多肽，所述可变结构域包含SEQID NO:2、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
30.根据实施方式1-29中任一项所述的CD8α结合多肽，所述可变结构域包含SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
31.根据实施方式1-30中任一项所述的CD8α结合多肽，所述CD8α结合多肽的C末端还包含半胱氨酸修饰。
32.根据实施方式31所述的CD8α结合多肽，其中所述半胱氨酸修饰包括以下形式：C、VDC、(GG)nC或(GS)mC，其中n或m各自独立地选自1，2，3和4。
33.根据实施方式1-32中任一项所述的CD8α结合多肽，所述CD8α结合多肽包含1个可变结构域。
34.根据实施方式1-33中任一项所述的CD8α结合多肽，所述CD8α结合多肽包含SEQID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
35.分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽。
36.载体，其包含根据实施方式35所述的核酸分子。
37.细胞，其包含根据实施方式35所述的核酸分子或根据实施方式36所述的载体。
38.制备实施方式1-34中任一项的CD8α结合多肽的方法，包括在允许所述CD8α结合多肽表达的条件下培养实施方式37所述的细胞。
39.根据实施方式38所述的方法，所述方法还包括回收由所述细胞表达的CD8α结合多肽。
40.根据实施方式39所述的方法，所述方法还包括纯化和/或修饰所述CD8α结合多肽。
41.免疫缀合物，其包含实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽。
42.根据实施方式41所述的免疫缀合物，所述免疫缀合物还包括与所述CD8α结合多肽结合的至少一种可检测标记。
43.根据实施方式42所述的免疫缀合物，其中所述可检测标记选自放射性核素、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子和酶。
44.根据实施方式43所述的免疫缀合物，其中所述可检测标记包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、67Cu、67Ga、68Ga、68Ge、86Y、90Y、89Zr、94mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其他γ-、β-、或正电子发射体。
45.根据实施方式41-44中任一项的免疫缀合物，其中所述CD8α结合多肽通过螯合剂与所述可检测标记缀合。
46.根据实施方式45所述的免疫缀合物，其中所述螯合剂选自DTPA、EDTA、NOTA、DOTA、TRAP、TETA、NETA、CB-TE2A、Cyclen、Cyclam、Bispidine、TACN、ATSM、SarAr、AmBaSar、MAG3、MAG2、HYNIC、DADT、EC、NS3、H2dedpa、HBED、DFO、PEPA或者HEHA及其衍生物。
47.根据实施方式42-46中任一项所述的免疫缀合物，其中所述可检测标记包括68Ga。
48.根据实施方式45-47中任一项所述的免疫缀合物，其中所述螯合剂包括NOTA或其衍生物。
49.根据实施方式48所述的免疫缀合物，其中所述螯合剂包括NODAGA或Maleimide-NODAGA。
50.组合物，其包含实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽、实施方式35所述的核酸分子、实施方式36所述的载体、实施方式37所述的细胞和/或实施方式41-49中任一项所述的免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。
51.根据实施方式50所述的组合物，所述组合物包含实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽或实施方式41-49中任一项所述的免疫缀合物，所述组合物为检测剂。
52.根据实施方式51所述的组合物，其中所述检测剂为造影剂。
53.根据实施方式52所述的组合物，其中所述造影剂是ECT造影剂。
54.根据实施方式53所述的组合物，其中所述ECT造影剂包括SPECT造影剂或PET造影剂。
55.实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽、实施方式35所述的核酸分子、实施方式36所述的载体、实施方式37所述的细胞、实施方式41-49任一项的免疫缀合物和/或实施方式50-54任一项的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于监测、预防、缓解和/或治疗肿瘤。
56.实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽或实施方式41-49任一项的免疫缀合物在制备用于检测CD8阳性细胞的检测剂中的用途。
57.一种检测生物学样品中CD8的存在和/或量的方法，包括：使所述生物学样品接触实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽、实施方式41-49中任一项所述的免疫缀合物、实施方式50-54中任一项所述的组合物。
58.根据实施方式57所述的方法，其中所述接触在体外或离体进行。
59.根据实施方式57-58中任一项所述的方法，其中所述生物学样品为组织。
60.根据实施方式59所述的方法，其中所述组织选自血液组织、淋巴组织和肿瘤组织。
61.根据实施方式57-60中任一项所述的方法，所述方法包括检测生物学样品中CD8阳性细胞的存在和/或量。
62.根据实施方式61所述的方法，其中通过成像确定生物学样品中CD8阳性细胞的存在和/或量。
63.根据实施方式62所述的方法，其中通过流式细胞术确定生物学样品中CD8阳性细胞的存在和/或量。
64.根据实施方式61-63中任一项所述的方法，其中所述CD8阳性细胞是CD8阳性T细胞。
65.一种检测和/或诊断与CD8相关的疾病或病症方法，包括向有此需要的受试者施用实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽、实施方式41-49中任一项所述的免疫缀合物或实施方式50-54中任一项所述的组合物。
66.根据实施方式65所述的方法，其中所述方法还包括对所述受试者进行成像。
67.根据实施方式66所述的方法，其中所述成像包括ECT成像。
68.根据实施方式67所述的方法，其中所述ECT成像包括SPECT成像或PET成像。
69.根据实施方式65-68中任一项所述的方法，其中所述与CD8相关的疾病或病症包括肿瘤。
70.一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括：
1)向有需要的受试者施用实施方式1-34中任一项CD8α结合多肽、实施方式41-49中任一项的免疫缀合物或实施方式50-54中任一项的组合物；和
2)确定所述受试者的肿瘤是否包含CD8阳性细胞；
其中如果检测到所述肿瘤中CD8阳性细胞的存在，则给所述受试者施用抗肿瘤疗法。
71.一种用于监测抗肿瘤疗法在受试者中的功效的方法，所述方法包含：
1)给患有肿瘤且采用抗肿瘤疗法治疗的受试者施用实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽、实施方式41-49中任一项所述的免疫缀合物或实施方式50-54中任一项所述的组合物；
2)确定所述受试者的肿瘤中CD8阳性细胞的量。
72.根据实施方式70-71中任一项所述的方法，通过成像确定所述受试者的肿瘤中CD8阳性细胞的存在和/或量。
73.根据实施方式70-72中任一项所述的方法，其中所述抗肿瘤疗法是免疫检查点抑制剂疗法。
74.根据实施方式70-73中任一项所述的方法，其中所述抗肿瘤疗法选自施用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM3抑制剂、BTLA抑制剂、TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、GITR抑制剂、LAG3抑制剂、另一T细胞共抑制剂或配体的拮抗剂、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂、Ang2抑制剂、转化生长因子β(TGFβ)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、CD20抑制剂、针对肿瘤特异性抗原的抗体、疫苗、增加抗原呈递的佐剂、双特异性抗体、细胞毒素、化疗剂、环磷酰胺、放疗、IL-6R抑制剂、IL-4R抑制剂、IL-10抑制剂、细胞因子以及抗体-药物缀合物(ADC)。
75.根据实施方式70-74中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包括实体瘤。
76.根据实施方式75中任一项所述的方法，其中所述实体瘤选自结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、宫颈癌、膀胱癌、肛门癌、子宫癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌、骨癌、睾丸癌、皮肤癌、肾癌、胃癌、食管癌、头颈癌、唾液腺癌以及骨髓瘤。
77.一种用于分离CD8阳性细胞的方法，所述方法包括：使包含CD8阳性细胞的细胞群与实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽或实施方式41-49中任一项所述的免疫缀合物接触，回收结合至实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽或实施方式41-49中任一项所述的免疫缀合物的CD8阳性细胞。
78.根据实施方式77所述的方法，其中所述CD8阳性细胞是CD8阳性T细胞。
79.根据实施方式78所述的方法，其中所述包含CD8阳性细胞的细胞群是人外周血单个核细胞(PBMC)。
80.根据实施方式77-79中任一项所述的方法，其中实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽或实施方式41-49中任一项所述的免疫缀合物固定化于固体表面上。
81.根据实施方式80所述的方法，其中所述固体包括凝胶或磁珠。
82.一种试剂盒，其包含实施方式1-34中任一项所述的CD8α结合多肽、实施方式41-49中任一项所述的免疫缀合物或实施方式49-54中任一项所述的组合物。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗体、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。在本申请中，CD8单域抗体或CD8α单域抗体如CN202010703962.9中所披露的，将所述文献通过引用以其全部内容并入本申请。
实施例
实施例1
1.1针对C37抗体同亲和填料结合部分进行序列优化
经过前期筛选与鉴定，在候选抗体中选定C37-cHis为最终的抗体序列(包含组氨酸标签)，同时构建无标签的重组质粒C37。将上述重组构建的单域抗体C37融合蛋白质粒转染HEK293细胞进行抗体表达。并由PROTEIN A亲和层析进行纯化，经鉴定发现C37抗体同PROTEIN A(ProteinA)亲和层析填料不结合，为后续纯化得到蛋白增加了困难，因此需要对C37抗体序列进行优化改造，使其可以经由亲和层析进行纯化。
对C37抗体序列的FR(Framework region)框架区进行分析，选取同PROTEIN A亲和填料结合相关的关键氨基酸进行突变，经过几轮突变，最终突变体C37-YDHMS可以同PROTEIN A亲和层析填料进行结合。
突变体的命名及氨基酸序列
/>
注：划横线部分为突变点
将重组质粒C37以及突变后的重组质粒C37-YDHMS分别经由HEK293细胞进行抗体表达，并通过PROTEIN A亲和层析填料进行纯化，来验证突变后同亲和填料的结合情况，图1为突变前后抗体纯化后SDS-PAGE分析结果。图1A所示C37纯化SDS-page图，如图所示，C37与填料PROTEIN A不结合，部分目的蛋白在流穿液中直接流穿，部分目的蛋白在平衡缓冲液buffer A中洗出。图1B所示C37-YDHMS，如图所示，流穿液和平衡缓冲液A和B中均未见目的蛋白，洗脱缓冲液C和D中含有较纯的目的蛋白，表明改造后的C37-YDHMS可以与填料PROTEIN A正常结合。
1.2针对C37抗体的结合活性、表达量、PI值进行序列优化
抗体类分子一般要求等电点(PI)高于7，从而保证该分子能够适用于下游纯化工艺平台中的离子交换层析。而且宿主DNA的等电点主要分布在4～4.5，若抗体PI值与其接近，很难达到去除效果。C37抗体的PI值为4.56，与DNA的等电点接近，去除效果预计会比较差，同时为了使下游纯化更容易选择离子交换填料，因此需要对C37抗体序列进行突变改造，以提高PI值。
对C37抗体序列的FR(Framework region)框架区和CDR(Complementarity-determing region)区进行分析，选取同亲和力、表达量以及PI值相关的氨基酸进行突变尝试。先选取单个氨基酸进行突变，再进行多个氨基酸突变，在同表达量及结合活性相关的部分共计进行15组突变。
突变体的命名及氨基酸序列
/>
注：下划线部分为突变后的氨基酸
分别对各突变体进行表达量和结合活性的检测。为了检测方便，此部分采用带有组氨酸标签的重组质粒进行瞬时转染，瞬转后用相应的Ni+树脂凝胶对重组蛋白进行亲和层析纯化，得到的目的蛋白即可用于表达量及结合活性的检测。
亲和活性的检测：CD8α-Fc融合蛋白0.5μg/孔包被平板4℃过夜，PBST洗涤过后加入3％的BSA进行封闭，之后加入各突变体C37单域抗体蛋白的梯度稀释系列，室温下反应1小时。洗涤之后加入anti-his辣根过氧化物酶标记抗体，室温反应1小时。洗涤之后加入显色液，450nm波长读取吸收值。应用软件SotfMaxPro v5.4进行数据处理和作图分析，通过四参数拟合，得到突变后抗体对CD8α结合曲线，并以C37抗体为对照，比较不同突变体的相对活性，以反映抗体对CD8α的亲和能力。
表达量的计算：根据一步亲和层析纯化后得到的目的蛋白总量来计算表达量。
表1各突变体对CD8α的结合情况及表达量
名称 相对活性(％) 表达量(g/L)
C37 100 0.073
C37-S72R 115 0.106
C37-KL-QQ 141 0.101
C37-D109A 476 0.054
C37-D111A 84.6 0.037
C37-D31Y 48.4 0.017
C37-T85S 162 0.107
C37-M112L 206 0.011
C37-TMS 107 0.004
C37-E30S 126 0.020
C37-RA 108 0.092
C37-SA 257 0.063
C37-SR 42 0.036
C37-RSA 103 0.098
C37-SRA 40 0.033
C37-SRS 33 0.043
综合各个突变体同CD8α抗原的亲和力及表达量进行分析，此部分选择的突变体为C37-S72R、C37-T85S、C37-D109A进行组合，即C37-RSA为此部分最终的变体。
将同亲和层析纯化相关的突变点以及亲和力、表达量相关的突变点进行组合，并在此基础上继续分析抗体序列中带负电荷的氨基酸，并根据序列整体情况进行综合分析，将带负电的氨基酸进行突变，以提高抗体整体的PI值。
突变体命名及氨基酸序列
/>
/>
注：下划线部分为突变后的氨基酸
经过对C37单域抗体序列的一系列突变改造，最终确定C37-F1为此阶段的最终的突变体。相对应改造前的C37原始单域抗体，其PI值从4.56提高到了6.75。
1.3对C37-F1单域抗体进行人源化
骆驼抗体具有传统抗体不具备的优势，比如分子量小、体内渗透性好，极易穿过血管或者组织到达靶部位，这些优势使得纳米抗体被广泛的用于疾病诊断与检测的工具。但是多价的抗体如果长期用于临床可能会产生不同程度的免疫反应，影响治疗效果，因此需要对C37-F1抗体进行人源化。人源化采用的是蛋白表面氨基酸人源化的方法以及VHH人源化通用框架部分移植法来完成。
人源化步骤如下：获取Cecile Vincke等人根据序列同源性设计完成的通用性人源化VHH框架h-NbBcIII0FGLA(PDB编号为：3EAK)，该框架设计基于纳米抗体NbBcIII0抗体(PDB编号为：3DWT)，参考人源抗体进行蛋白表面氨基酸人源化，根据C37-F1纳米抗体序列的具体情况选择需要人源化的位点。
对C37-F1抗体进行人源化，共获得5种抗体株C37-F1的人源化变体。表2列出了这些人源化变体的氨基酸变化以及突变后抗体的命名，其中氨基酸残基编号比照Kabat编号，最终选择人源化变体C37H作为人源化后的突变抗体。
表2氨基酸突变对比表
L2V A14P G56R N57R A75S K87R P88A K117Q
C37H √ √ √ √ √
C37H1 √ √ √ √ √ √ √
C37H2 √ √ √ √ √ √ √
C37H3 √ √ √ √
C37H4 √ √ √
突变体具体命名及氨基酸序列如下
注：划横线部分为突变氨基酸
突变完成后对各突变体进行亲和力以及表达量的分析，具体检测结果如表3所示。
表3人源化变体亲和力及表达量检测
名称 相对活性(％) 表达量(g/L) PI值
C37-F1 100 0.045 6.75
C37H 151 0.078 6.75
C37-H1 110 0.016 6.75
C37-H2 122 0.004 6.75
C37-H3 171 0.032 6.75
C37-H4 141 0.052 6.75
1.4对C37H抗体进行末端cystine修饰
C37H抗体序列中共有四个赖氨酸，在进行NOTA/DOTA等小分子偶联时，批次间的不确定性可能会增加，因此对C37H抗体序列进行末端cystine修饰，以进行定点偶联。共进行四种形式的修饰，分别在其末端添加单独的半胱氨酸C，以及VDC，GGC和GSC这三种形式的氨基酸序列。构建完成后对其进行瞬时转染，计算表达量，并分别对其进行偶联方法的优化及验证，以选择最优的末端cystine修饰形式。
C37H末端cystine修饰后序列
实施例2 NODAGA-GSC-C37H单域抗体前体偶联
将双功能螯合剂Maleimide-NODAGA偶联至C37H-GSC单域抗体末端半胱氨酸上，偶联产物通过10kDa超滤管纯化并更换缓冲液至纯水，紫外分光光度计测280nm的吸光度，通过SEC-HPLC分析偶联效率。通过ELISA分析其体外与CD8α蛋白的亲和能力。具体方法如下：
将TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydro-chloride，Sigma)溶解于PBS，将TCEP溶液与C37H-GSC混合，断开蛋白末端半甘氨酸形成的二硫键。通过超滤管进行超滤后，将多余的TCEP与游离的半胱氨酸去除。将Maleimide-NODAGA溶液与C37H-GSC混合，于37℃下反应。反应后，用超滤管去除多余的Maleimide-NODAGA，得到产物NODAGA-GSC-C37H单域抗体。
使用SEC-HPLC(图2)及LC-MS(图3)进行表征，结果显示，抗体偶联小分子后，分子量略有增加，在SEC-HPLC结果上显示出峰位置略有提前。质谱结果显示，GSC-C37H分子量为14031，还原掉一分子的cystine(分子量为119)后偶联一分子的NODAGA(分子量为497)，最终NODAGA-GSC-C37H分子量为14409，和理论相符。
用ELISA测定上述偶联后NODAGA-GSC-C37H的活性，具体方法如下：CD8α-Fc融合蛋白5μg/孔包被平板，4℃放置过夜。3％的BSA 37℃封闭后，加入梯度稀释的样品(以未偶联的C37H-GSC单域抗体为标准品)，37℃下作用1小时。之后加入抗-his-HRP(购自Abcam公司)，室温反应1小时。之后加入显色液，450nm波长读取吸收值。ELISA的活性总结如表4和图4所示，结果显示，GSC-C37H在还原后及偶联NODAGA后，并未影响其与抗原的结合能力。
表4 NODAGA-GSC-C37H的ELISA活性结果汇总
单域抗体编号 相对活性(％)
C37H-GSC 100
C37H-GSC TCEP还原后 96.8
NODAGA-C37H-GSC偶联后(批次#1) 85
NODAGA-C37H-GSC偶联后(批次#2) 128.8
实施例3 68Ga-NODAGA-GSC-C37H放射性标记
用0.1M的无菌HCl淋洗Eckert&Ziegler IGG100锗68/镓68(Ge 68/Ga 68)发生器制备68Ga淋洗液，添加等体积0.2M醋酸钠溶液，并加入1/4体积含有上述NODAGA-GSC-C37H抗体pH为5.3的0.1M醋酸钠缓冲液，反应体系的pH在4.5～4.7之间，室温反应10分钟。经PD-10柱去除未反应的离子镓，并用0.22um滤膜过滤。产物(68Ga-NODAGA-GSC-C37H单域抗体注射液)通过分析pH、Radio-TLC、Radio-HPLC、放射活度、放射化学纯度等进行质量控制。另：也可用0.05M的无菌HCl淋洗ITG锗68/镓68(Ge-68/Ga-68)发生器制备68Ga淋洗液，其他反应及质量控制条件均相同。
取少量样品进行Radio-TLC及Radio-HPLC检验，通过在谱图上对峰积分计算放射化学纯度(RCP)，分析结果如图5A-5B所示，表明正电子核素68Ga成功标记单域抗体。图5A为放射性标记样品的Radio-TLC结果，图5B为放射性标记样品的Radio-HPLC结果。
Radio-HPLC结果与Radio-TLC结果保持一致，Radio-TLC结果显示游离68Ga迁移较快，在迁移因子在0.9左右，而68Ga-NODAGA-GSC-C37H迁移因子为0.2左右，Radio-HPLC结果显示游离68Ga在1分钟左右出峰，68Ga-NODAGA-GSC-C37H出峰时间在18分钟左右，与蛋白出峰时间基本保持一致，两种方法表明标记效率均达95％以上。
实施例4 HSC-NPG人源化动物PET/CT显影实验
4.1.用于研究的HSC-NPG动物模型
用6～8周龄的HSC-NPG小鼠进行体内研究。对于异种移植，在小鼠右前腿皮下植入100μl的细胞MC38-CD8/PBS，同时在小鼠左前腿皮下植入100μl的细胞MC38/PBS。细胞接种密度约为5～6×106个细胞/小鼠。在异氟烷麻醉下实施植入。在这些条件下，在多于90％的注射的动物中，在1～2周后得到可用的肿瘤(100-300mm3)(MC38-CD8或MC38)。
4.2.Micro-PET/CT成像
按照4.1的方法接种MC38-CD8+/-肿瘤模型。采用Micro-PET/CT(IRIS PET/CT,inviscan,Strasbourg,France)扫描，测量病灶％ID/g。在120分钟进行连续小动物PET/CT扫描，分析多个时间点的肿瘤、肌肉、心脏(血)、肝、脾、肺及肾脏的放射性吸收情况，如图6所示。
图6为HSC-NPG人源化动物的PET/CT显影结果，左侧为CD8阴性表达的MC38移植瘤，右侧为CD8阳性表达MC38-CD8移植瘤。
如图6所示，注射上述PET示踪剂68Ga-NODAGA-GSC-C37H后，MC38-CD8移植瘤均清晰可见，而CD8阴性表达的MC38移植瘤在注射后未见有摄取。因此，MC38-CD8肿瘤与对侧阴性对照肿瘤相比具有良好的区分度。肾脏的放射性信号最高，证明68Ga-NODAGA-GSC-C37H主要经由肾脏代谢。
与非人源化动物相比，HSC-NPG人源化动物模型因为在其心脏(血)、肝、脾、肺等组织器官表达人的CD8，故而68Ga-NODAGA-GSC-C37H在相应的肝、脾、肺等组织也有一定摄取。进一步证明了68Ga-NODAGA-GSC-C37H的CD8示踪潜力。
实施例5 PBMC人源化动物剂量探索实验
5.1.用于研究的PBMC动物模型。
用6～8周龄的PBMC小鼠进行体内研究。对于异种移植，在小鼠右前腿皮下植入100μl的细胞MC38-CD8/PBS,同时在小鼠左前腿皮下植入100μl的细胞MC38/PBS。细胞接种密度约为5～6×106个细胞/小鼠。在异氟烷麻醉下实施植入。在这些条件下，在多于90％的注射的动物中，在1～2周后得到可用的肿瘤(100-300mm3)(MC38-CD8或MC38)。
5.2.给药方式及剂量选择
68Ga-NODAGA-GSC-C37H的给药方式拟采用冷热蛋白共注射给药(Co-injection)，在PBMC人源化动物剂量探索实验中，共设置总蛋白含量为：0.3μg、1μg、5μg、30μg、150μg、500μg的6个剂量组，进行micro-PET扫描(ROI勾画组织分布)、离体组织分布、离体采血PK等实验为评估手段，确定PBMC人源化动物模型的剂量-药效变化关系，以推测68Ga-NODAGA-GSC-C37H最佳临床给药剂量。
5.3.micro-PET成像
按照5.1的方法接种MC38-CD8+/-肿瘤模型。将小鼠异氟烷麻醉后置于PET床，按照0.3μg、1μg、5μg、30μg、150μg、500μg的6个剂量组(～100μCi)分别尾静脉注射给予小鼠药物。在120分钟进行连续PET扫描，分析多个时间点的肿瘤、心脏(血)、肝、脾、肺及肌肉及肾脏等的放射性吸收情况。并使用MIM软件勾画ROI，计算生物分布及活度时间曲线。
图7为PBMC动物的剂量爬坡试验的microPET显像图(给药后1h)，左侧为CD8阴性表达的MC38移植瘤，右侧为CD8阳性表达MC38-CD8移植瘤。
如图7结果显示，0.3～500μg放射性标记的单域抗体(～100μCi/0.3～500μg)尾静脉注射给予小鼠后，MC38-CD8移植瘤均清晰可见，而CD8阴性表达的MC38移植瘤在注射后未见有摄取。因此，MC38-CD8肿瘤与对侧阴性对照肿瘤相比具有良好的区分度。肾脏的放射性信号最高，证明68Ga-NODAGA-GSC-C37H主要经由肾脏代谢。与非人源化动物相比，PBMC人源化动物模型因为在其心脏(血)、肝、脾、肺等组织器官表达人的CD8，故而68Ga-NODAGA-GSC-C37H在相应的肝、脾、肺等组织也有一定摄取。
而随着总蛋白剂量的升高，CD8+肿瘤的摄取逐渐降低，且呈显著相关性，而肝、脾、肺等CD8+人源化组织器官的摄取也随之降低，证明了68Ga-NODAGA-GSC-C37H特异性结合CD8+。
5.4.体内分布
按照5.1的方法接种MC38-CD8+/-肿瘤模型。将小鼠异氟烷麻醉后，按照0.3μg、1μg、5μg、30μg、150μg、500μg的6个剂量组(～100μCi)分别尾静脉注射给予小鼠药物。在2小时采集数据，每个时间点使3只小鼠安乐死。对血液、肾、肝、脾、肺、心、肠、胃、肌肉、皮肤、脑、骨及CD8+/-肿瘤等目的组织解剖，并且在γ计数器上计数以收集数据。以注射剂量为总注射剂量。对于每一种器官，基于该总注射剂量确定％注射剂量(％ID)，并且将器官称重，用于确定每克的％注射剂量(％ID/g)。将micro-PET显影后，MIM软件勾画ROI的生物分布结果与离体γ计数器检测的生物分布结果进行对比研究。
图8A为给药1h后micro-PET显影后，MIM软件勾画ROI的生物分布结果；图8B为给药2h后micro-PET显影后，MIM软件勾画ROI的生物分布结果；图8C为给药2h后解剖的离体生物分布结(n＝3)。
如图8A-8C所示，给药1h和2h后的PET扫描数据与2h的离体组织分布的结果相似。两种检测方法的各项组织摄取值和其随剂量变化的趋势均相似，尤其是CD8+瘤组织及肝、脾和肺摄取以及随剂量变化的趋势基本一致。
0.3～500μg放射性标记的单域抗体(～100μCi/0.3～500μg)尾静脉注射给予小鼠后，MC38-CD8移植瘤有较高摄取，而CD8阴性表达的MC38移植瘤在注射后未见有摄取。
而随着总蛋白剂量的升高，CD8+肿瘤的摄取逐渐降低，且呈显著相关性，而肝、脾、肺等CD8+人源化组织器官的摄取也随之降低，证明了68Ga-NODAGA-GSC-C37H特异性结合CD8+。而0.3μg剂量下，CD8+阳性瘤并没有高于1μg的给药剂量；且与500μg时相比较，150μg的给药剂量已完全阻断CD8+阳性瘤摄取。经由两种检测方法的生物分布研究交叉验证，该动物模型的最佳给药剂量为1μg，最低阻断剂量为150μg。
5.5.离体采血药代动力学(PK)
按照5.1的方法接种MC38-CD8+/-肿瘤模型。将小鼠异氟烷麻醉后，按照0.3μg、1μg、5μg、30μg、150μg、500μg的6个剂量组(～100μCi)分别尾静脉注射给予小鼠药物。在给药后2、5、10、15、30、60、90、120min进行眼内眦采血0.5～0.8mL并称重，用γ计数仪进行血样的γ计数测定，计算ID％/g；
图9A为血液放射性ID％/g随时间的变化趋势图，0.3～500μg放射性标记的单域抗体(～100μCi/0.3～500μg)尾静脉注射给予小鼠后，血液半衰期较短，清除较快。提示68Ga-NODAGA-GSC-C37H与其他纳米抗体类放射性药物一样，具有较快的代谢清除速率。总体趋势来讲，随着总蛋白剂量的升高，放射性在血液的半衰期延长，清除速率减慢。且低剂量早期摄取高，但半衰期较短，清除较快；高剂量则相反。
图9B为不同剂量的血液中放射性物质摄取％ID/g TAC曲线：0.3μg低剂量组的半衰期与前期非人源化动物接近，为20-30min。而剂量>1ug后，半衰期差异并不显著。
实施例6 68Ga-NODAGA-GSC-C37H稳定性实验
6.1 68Ga-NODAGA-GSC-C37H体外血清稳定性分析
取300μL人血清，加入500μL 68Ga-NODAGA-GSC-C37H 74MBq(1mCi/100μL PBS)，混合后于37℃放置，于0h、0.5h、1h、2h、4h进行Radio-TLC和Radio-HPLC检测。
如图10A-10B所示，在37℃条件下，血清中未见明显的游离68Ga增加，未见明显降解峰出现，表明放射性标记抗体结构稳定，体外血清稳定应较好。
6.2 68Ga-NODAGA-GSC-C37H体内稳定性分析
取正常小鼠，自尾静脉注射68Ga-NODAGA-GSC-C37H 74MBq(1mCi/100μL PBS)。注射后15min和1.5h、4h后，采集尿液样品，将所有样品加一定量的50％乙腈水溶液溶解后，8000转/min离心15min，取上清过0.22μm滤膜后，滤液用Radio-TLC及Radio-HPLC进行分析。
如图11A-11B所示，小鼠给药4h后，尿液中游离68Ga的含量未见明显增加，给药后30min血液样品，未见游离68Ga含量，未见其他降解峰增加，结果表明放射性标记抗体在血液和尿液中基本以完整状态存在，结构稳定。
序列表
<110> 苏州智核生物医药科技有限公司
<120> CD8α结合多肽及其用途
<130> 0173-PA-006
<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37 VHH
<400> 1
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<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YHDMS VHH
<400> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-S72R VHH
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-T85S VHH
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-D109A VHH
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-RA VHH
<400> 6
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 7
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 8
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<400> 9
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-H1 VHH
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-H2 VHH
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Arg Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn His Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-H3 VHH
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn His Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-H4 VHH
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn His Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YHDMS VHH; C37-S72R VHH; C37-T85S VHH; C37-D109A VHH; C37-RA VHH; C37-RSA VHH; C37-F1 VHH; C37H VHH; C37-H1 VHH; C37-H2 VHH; C37-H3VHH; C37-H4 VHH
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa = Glu或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> Xaa = Gly或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Xaa = Asn或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> Xaa = Ser或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(62)
<223> Xaa = Asp或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> Xaa = Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> Xaa = Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> Xaa = His或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> Xaa = Ile或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> Xaa = Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(109)
<223> Xaa = Ala或Asp
<220>
<221> misc_feature
<222> (112)..(112)
<223> Xaa = Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (117)..(117)
<223> Xaa = Lys或Gln
<400> 14
Gln Xaa Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Xaa Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Xaa Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Ala Xaa Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Xaa Asp Asn Xaa Lys Asn Xaa Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Xaa Asn Xaa Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Xaa Tyr Asp Xaa
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Xaa Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 15
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-S72R VHH; C37-T85S VHH; C37-D109A VHH; C37-RA VHH; C37-RSAVHH
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> Xaa = Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(109)
<223> Xaa = Ala或Asp
<400> 15
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Xaa Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Xaa Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Xaa Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 16
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-F1 VHH; C37H VHH; C37-H1 VHH; C37-H2 VHH; C37-H3 VHH; C37-H4 VHH
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> Xaa = Gly或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Xaa = Asn或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> Xaa = Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> Xaa = Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (117)..(117)
<223> Xaa = Lys或Gln
<400> 16
Gln Xaa Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Xaa Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Xaa Xaa Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Lys Asn His Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Xaa Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YHDMS CDR1; C37-S72R CDR1; C37-T85S CDR1; C37-D109A CDR1;C37-RA CDR1; C37-RSA CDR1
<400> 17
Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-F1 CDR1; C37H CDR1; C37-H1 CDR1; C37-H2 CDR1; C37-H3 CDR1;C37-H4 CDR1
<400> 18
Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YHDMS CDR1; C37-S72R CDR1; C37-T85S CDR1; C37-D109A CDR1;C37-RA CDR1; C37-RSA CDR1; C37-F1 CDR1; C37H CDR1; C37-H1 CDR1; C37-H2 CDR1;C37-H3 CDR1; C37-H4 CDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Glu或Ser
<400> 19
Gly Leu Thr Phe Xaa Asp Tyr
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YHDMS CDR2; C37-S72R CDR2; C37-T85S CDR2; C37-D109A CDR2;C37-RA CDR2; C37-RSA CDR2; C37-F1 CDR2; C37H CDR2; C37-H3 CDR2; C37-H4 CDR2
<400> 20
Arg Ile Tyr Asp Gly Asn
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-H1 CDR2
<400> 21
Arg Ile Tyr Asp Gly Arg
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-H2 CDR2
<400> 22
Arg Ile Tyr Asp Arg Asn
1 5
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YHDMS CDR2; C37-S72R CDR2; C37-T85S CDR2; C37-D109A CDR2;C37-RA CDR2; C37-RSA CDR2; C37-F1 CDR2; C37H CDR2; C37-H3 CDR2; C37-H4 CDR2;C37-H1 CDR2; C37-H2 CDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Gly或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Asn或Arg
<400> 23
Arg Ile Tyr Asp Xaa Xaa
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YHDMS CDR3; C37-S72R CDR3; C37-T85S CDR3
<400> 24
Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-D109A CDR3; C37-RA CDR3; C37-RSA CDR3
<400> 25
Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-F1 CDR3; C37H CDR3; C37-H1 CDR3; C37-H2 CDR3; C37-H3 CDR3;C37-H4 CDR3
<400> 26
Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YHDMS CDR3; C37-S72R CDR3; C37-T85S CDR3; C37-D109A CDR3;C37-RA CDR3; C37-RSA CDR3; C37-F1 CDR3; C37H CDR3; C37-H1 CDR3; C37-H2 CDR3;C37-H3 CDR3; C37-H4 CDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ala或Asp
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Leu或Met
<400> 27
Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Xaa Tyr Asp Xaa Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YHDMS CDR3; C37-S72R CDR3; C37-T85S CDR3; C37-D109A CDR3;C37-RA CDR3; C37-RSA CDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ala或Asp
<400> 28
Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Xaa Tyr Asp Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 29
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37H-C VHH
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn His Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys
115 120 125
<210> 30
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37H-VDC VHH
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn His Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Val Asp Cys
115 120 125
<210> 31
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37H-GSC VHH
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn His Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Cys
115 120 125
<210> 32
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37H-GGC VHH
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn His Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
115 120 125
<210> 33
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-cHis VHH
<400> 33
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Met
115 120 125
Asp Pro Gly Gly Ser His His His His His His His His
130 135 140
<210> 34
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-S60Y VHH
<400> 34
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-ST-YS VHH
<400> 35
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 36
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YDS VHH
<400> 36
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 37
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YMS VHH
<400> 37
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 38
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YDMS VHH
<400> 38
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 39
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-KL-QQ VHH
<400> 39
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 40
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-D111A VHH
<400> 40
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 41
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-D31Y VHH
<400> 41
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 42
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-M112L VHH
<400> 42
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 43
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-TMS VHH
<400> 43
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 44
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-E30S VHH
<400> 44
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 45
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-SA VHH
<400> 45
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 46
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-SR VHH
<400> 46
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 47
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-SRA VHH
<400> 47
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 48
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-SRS VHH
<400> 48
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 49
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-R VHH
<400> 49
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 50
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-TRA VHH
<400> 50
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 51
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YDMS-A VHH
<400> 51
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 52
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YDTMS-A VHH
<400> 52
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 53
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YDTMS-R VHH
<400> 53
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 54
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YDMS-SR VHH
<400> 54
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Asp Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 55
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-YDMS-SRA VHH
<400> 55
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 56
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-F VHH
<400> 56
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 57
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-F2 VHH
<400> 57
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Gln Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 58
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-F4 VHH
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 59
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C37-F5 VHH
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ile Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser Cys Ser Val Tyr Pro Ala Tyr Asp Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

Claims (32)

1.一种CD8α结合多肽，所述CD8α结合多肽为VHH单域抗体，
其氨基酸序列如SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 13所示。
2.根据权利要求1所述的CD8α结合多肽，其中所述VHH是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
3.根据权利要求1所述的CD8α结合多肽，所述CD8α结合多肽的C末端还包含半胱氨酸修饰。
4.根据权利要求3所述的CD8α结合多肽，其中所述半胱氨酸修饰包括以下形式：C、VDC、(GG)nC或(GS)mC，其中n或m各自独立地选自1，2，3和4。
5.分离的一种核酸分子，其编码权利要求1-4中任一项所述的CD8α结合多肽。
6.载体，其包含根据权利要求5所述的核酸分子。
7.细胞，其包含根据权利要求5所述的核酸分子或根据权利要求6所述的载体。
8.制备权利要求1-4中任一项所述的CD8α结合多肽的方法，包括在允许所述CD8α结合多肽表达的条件下培养权利要求7所述的细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，所述方法还包括回收由所述细胞表达的CD8α结合多肽。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括纯化和/或修饰所述CD8α结合多肽。
11.免疫缀合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的CD8α结合多肽。
12.根据权利要求11所述的免疫缀合物，所述免疫缀合物还包括与所述CD8α结合多肽结合的至少一种可检测标记。
13.根据权利要求12所述的免疫缀合物，其中所述可检测标记选自放射性核素、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子和酶。
14.根据权利要求13所述的免疫缀合物，其中所述可检测标记包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、67Cu、67Ga、68Ga、68Ge、86Y、90Y、89Zr、94mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其他γ-、β-、或正电子发射体。
15.根据权利要求12所述的免疫缀合物，其中所述CD8α结合多肽通过螯合剂与所述可检测标记缀合。
16.根据权利要求15所述的免疫缀合物，其中所述螯合剂选自DTPA、EDTA、NOTA、DOTA、TRAP、TETA、NETA、CB-TE2A、Cyclen、Cyclam、Bispidine、TACN、ATSM、SarAr、AmBaSar、MAG3、MAG2、HYNIC、DADT、EC、NS3、H2dedpa、HBED、DFO、PEPA或者HEHA及其衍生物。
17.根据权利要求15所述的免疫缀合物，其中所述可检测标记包括68Ga。
18.根据权利要求15所述的免疫缀合物，其中所述螯合剂包括NOTA或其衍生物。
19.根据权利要求18所述的免疫缀合物，其中所述螯合剂包括NODAGA或Maleimide-NODAGA。
20.组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的CD8α结合多肽、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的细胞或权利要求11-19中任一项所述的免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。
21.组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的CD8α结合多肽或权利要求11-19中任一项所述的免疫缀合物，所述组合物为检测剂。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述检测剂为造影剂。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述造影剂是ECT造影剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述ECT造影剂包括SPECT造影剂或PET造影剂。
25.权利要求1-4中任一项所述的CD8α结合多肽、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的细胞、权利要求11-19任一项的免疫缀合物或权利要求20-24中任一项的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于监测、预防、缓解和/或治疗肿瘤。
26.权利要求1-4中任一项所述的CD8α结合多肽或权利要求11-19中任一项的所述的免疫缀合物在制备用于检测CD8阳性细胞的检测剂中的用途。
27.一种用于分离CD8阳性细胞的方法，所述方法包括：使包含CD8阳性细胞的细胞群与权利要求1-4中任一项所述的CD8α结合多肽或权利要求11-19中任一项所述的免疫缀合物接触，回收结合至权利要求1-4中任一项所述的CD8α结合多肽或权利要求11-19中任一项所述的免疫缀合物的CD8阳性细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述CD8阳性细胞是CD8阳性T细胞。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述包含CD8阳性细胞的细胞群是人外周血单个核细胞(PBMC)。
30.根据权利要求27中所述的方法，其中所述的CD8α结合多肽或所述的免疫缀合物固定化于固体表面上。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述固体包括凝胶或磁珠。
32.一种试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项所述的CD8α结合多肽、权利要求11-19中任一项所述的免疫缀合物或权利要求20-24中任一项所述的组合物。
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