CZ20003767A3 - Kompozice pro indukci imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buňek v organismu savce a její pouľití pro výrobu léčiva - Google Patents
Kompozice pro indukci imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buňek v organismu savce a její pouľití pro výrobu léčiva Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20003767A3 CZ20003767A3 CZ20003767A CZ20003767A CZ20003767A3 CZ 20003767 A3 CZ20003767 A3 CZ 20003767A3 CZ 20003767 A CZ20003767 A CZ 20003767A CZ 20003767 A CZ20003767 A CZ 20003767A CZ 20003767 A3 CZ20003767 A3 CZ 20003767A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- domain
- cytokine
- immunoconjugate
- antibody
- immune response
- Prior art date
Links
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims abstract description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 5
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims abstract description 77
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 68
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 44
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 231100000409 cytocidal Toxicity 0.000 claims abstract 5
- 230000000445 cytocidal effect Effects 0.000 claims abstract 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 139
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 109
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 109
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 57
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 57
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 48
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 38
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 38
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 claims description 17
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 claims description 16
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 claims description 13
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 claims description 12
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 claims description 11
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 6
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 6
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 6
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 claims description 5
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 5
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 229960003433 thalidomide Drugs 0.000 claims description 4
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 claims description 3
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 6
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 claims 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 62
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 13
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 13
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 12
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 11
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 10
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 10
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 10
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 10
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 10
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 9
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 9
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 8
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 8
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 8
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 8
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 8
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 7
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 6
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 5
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 4
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 4
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 4
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 4
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 4
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 4
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 4
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 3
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 3
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 3
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- -1 IFN-or Proteins 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 101001040747 Mus musculus Guanine nucleotide-binding protein-like 3 Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940111134 coxibs Drugs 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000003255 cyclooxygenase 2 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108010001463 Collagen Type XVIII Proteins 0.000 description 1
- 102000047200 Collagen Type XVIII Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 description 1
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 description 1
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 description 1
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 1
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000938391 Homo sapiens Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 102100022949 Immunoglobulin kappa variable 2-29 Human genes 0.000 description 1
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101001090482 Mus musculus Glutathione S-transferase LANCL1 Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- MSHZHSPISPJWHW-PVDLLORBSA-N O-(chloroacetylcarbamoyl)fumagillol Chemical compound C([C@H]([C@H]([C@@H]1[C@]2(C)[C@H](O2)CC=C(C)C)OC)OC(=O)NC(=O)CCl)C[C@@]21CO2 MSHZHSPISPJWHW-PVDLLORBSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000964 angiostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940064804 betadine Drugs 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 1
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000009163 protein therapy Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Kompozice pro indukci imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk v organismu savce a její použití pro výrobu léčiva
Oblast techniky
Vynález se týká kompozice pro indukci imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk v organismu savce a její použití pro výrobu léčiva. Vynález zejména popisuje imunokonjugáty, přesněji pak fúzní proteiny protilátka-cytokin, které jsou použitelné pro cílenou imunoterapii a celkovou stimulaci imunitního systému. Ještě přesněji lze říci, že vynález popisuje použití inhibitorů angiogeneze za účelem posílení imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk, například buněk v pevných nádorech, zprostředkované fúzním proteinem protilátka-cytokin.
Dosavadní stav techniky
Protilátky jsou po mnoho let používány k léčbě onemocnění lidí, přičemž jejich hlavní funkcí při této léčbě je navodit pasivní imunitu vůči virové nebo bakteriální infekci. V nedávné době začaly být protilátky a konjugáty protilátek rovněž využívány jako protinádorová agens. U většiny typů nádorů bylo obtížné prokázat protinádorovou aktivitu v případech, kdy se nejedná o model minimálního reziduálního onemocnění (Reithmuller a další,
Lancet, 94:1177 až 1183) nebo v případech, kdy je nádor . přístupný protilátkám v krevním oběhu, například v případech lymfomu B (Maloney a další, Blood, 84:2457 až 2466, 1994). Pevné nádory odolávají terapeutické intervenci pomocí protilátek daleko lépe než mikrometastatická ložiska na modelech minimálních reziduálních onemocnění.
Dřívější studie prokázaly, že účinnost léčby nádorů pomocí protilátek in vivo může být mnohonásobně zvýšena připojením cytokinů stimulujících imunitní systém k molekule použité protilátky. Fúzní proteiny protilátkacytokin jsou nicméně daleko méně účinné při ničení větších pevných nádorů než při eradikaci roztroušených metastatických ložisek (Xiang a další, Cancer Research, 57:4948 až 4955, 1997; a Lodě a další, Blood, 91:1706 až 1715, 1998).
V současnosti tedy stále existuje potřeba vyvinout přípravky a postupy využitelné k posílení imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk, například buňkám v pevných nádorech, zprostředkované fúzním proteinem protilátkacytokin.
Popis obrázků na výkresech
Cíle, charakteristické rysy a výhody předkládaného vynálezu uvedené v předcházejícím i následujícím textu, jakož i vynález sám, mohou být dokonale pochopeny z následujících výhodných provedení vynálezu a přiložených obrázků.
Obrázek 1 je schématických znázorněním ukázkového imunokonjugátu využitelného v praktické aplikaci vynálezu.
Na obrázcích 2A a 2B je graficky znázorněna exprese lidského EpCAM v transfekovaných buňkách myšího Lewisova karcinomu plic (LLC) analyzovaná metodou FACS (fluorescence-actívated cell sorting). Stejné počty transfekovaných buněk byly značeny buď samotnou sekundární protilátkou proti lidské doméně Fc, konjugovanou s fluorescein isothiokyanátem (FITC, panel A) nebo nejprve fúzním proteinem huKS-huIL2 a následným barvením sekundární protilátkou proti lidské Fc doméně konjugovanou s FITC (panel B).
·· · ·· · • · 4 · 4 · ·
4 4 4 ··· · • 444444 4444444 ·
Obrázek 3 je grafických znázorněním vlivu aplikace fúzního proteinu protilátka-cytokin na velikost podkožních nádorů. Fúzní protein protilátka-cytokin byl aplikován buď samostatně nebo v kombinaci s dalším fúzním proteinem protilátka-cytokin, v němž byl použit cytokin s antiangiogenní aktivitou. 5-ti denní léčba byla zahájena třináct dnů po implantaci buněk LLC. Myším byl podáván fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrem (prázdné kosočtverce); samotný fúzní protein huKS-muy2a-muIL2 v množství 15 pg/den (plné čtverečky); fúzní protein huKSmuy2a-muIL12 v množství 10 pg/den (plné trojúhelníky); a směs fúzního proteinu huKS-muy2a-muIL2 v množství 7,5 pg/den a fúzního proteinu huKS-muy2a-muIL12 v množství 5 pg/den (křížky).
Obrázek 4 je grafických znázorněním vlivu aplikace fúzního proteinu protilátka-cytokin na velikost podkožních nádorů. Fúzní protein protilátka-cytokin byl aplikován buď samostatně nebo v kombinaci s fúzním proteinem s endostatinem. Velikost podkožních nádorů CT26/EpCAM byla monitorována u myší, kterým byl podáván fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrem (plné kosočtverce); fúzní protein muFc-muEndo (plné čtverečky); fúzní protein huKShuy4-huIL2 (plné kosočtverce); a kombinace fúzního proteinu muFc-muEndo a fúzního proteinu huKS-huy4-huIL2 (křížky).
Obrázek 5 je grafických znázorněním vlivu aplikace fúzního proteinu protilátka-cytokin na velikost podkožních nádorů. Fúzní protein protilátka-cytokin byl aplikován buď samostatně nebo v kombinaci s indomethacinem. Velikost podkožních nádorů LLC-EpCAM byla monitorována u myší, kterým byl podáván fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrem (plné kosočtverce); fúzní protein huKS-muY2a-muIL2 (plné čtverečky); indomethacin (plné trojúhelníky); a • · • · · · • · · · · • · · · · · « · • ···· · · · ···· · · • · · · · · ···· · 9· · kombinace fúzního proteinu huKS-muY2a-muIL2 a indomethacinu (křížky).
Podstata vynálezu
Tento vynález je zčásti založen na objevu, že podáním nějakého imunokonjugátu do organizmu savce je možné vyvolat silnější imunitní odpověď vůči zvolenému typu buněk v případě, je-li tento imunokonjugát aplikován spolu s inhibitorem angiogeneze. Zvláště pak bylo zjištěno, že tyto kombinace jsou především výhodné pro zprostředkování zničení zvoleného typu buněk, jako například buněk v pevných nádorech nebo buněk infikovaných viry, imunitním systémem.
Jedna stránka vynálezu popisuje způsob indukce cytotoxické imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk v organizmu savců. Tento způsob zahrnuje podání: (i) imunokonjugátu zahrnujícího vazebné místo (odvozené z protilátky) schopné vázat se na zvolený typ buněk a nějaký cytokin schopný indukovat imunitní odpověď vůči tomuto zvolenému typu buněk; a (ii) inhibitoru angiogeneze v množství dostačujícím k posílení indukované imunitní odpovědi, a to ve srovnání s imunitní odpovědí stimulovanou pouze samotným imunokunjugátem.
Ve výhodném provedení vynálezu mohou být zvoleným typem buněk buňky rakovinné, například buňky v pevných nádorech a výhodněji pak buňky ve větších pevných nádorech (tj. nádorech větších než přibližně 100 mm3) . Alternativně mohou být zvoleným typem buněk buňky infikované nějakým virem, například buňky infikované virem lidské imunitní nedostatečnosti (HIV).
V jiném výhodném provedení vynálezu může být inhibitor angiogeneze aplikován současně s použitým imunokonjugátem.
• ·
• ·· • · · · • · · · · • ···· · v · • · β ·
Alternativně může být inhibitor angiogeneze aplikován před podáním tohoto ímunokonjugátu. Imunokonjugát může být rovněž podáván spolu s několika rozdílnými inhibitory angiogeneze. Alternativně může být inhibitor angiogeneze aplikován současně s několika rozdílnými imunokonjugáty.
Jiná stránka vynálezu popisuje přípravky použitelné pro indukci cytotoxické imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk v organizmu savců. Takový přípravek zahrnuje směs:
(i) imunokonjugátu zahrnujícího vazebné místo (odvozené z protilátky) schopné vázat se na zvolený typ buněk a nějaký cytokin schopný indukovat imunitní odpověď vůči tomuto zvolenému typu buněk v organizmu savců; a (ii) inhibitoru angiogeneze v množství dostačujícím k posílení indukované imunitní odpovědi, a to ve srovnání s imunitní odpovědí stimulovanou pouze samotným imunokunjugátem.
Ve výhodném provedení vynálezu zahrnuje vazebné místo (odvozené z protilátky) imunokonjugátu těžký řetězec imunoglobulinu nebo antigen-vazebný fragment tohoto řetězce. Těžký řetězec imunoglobulinu ve výhodném provedení zahrnuje, ve směru od N-konce k C-konci, variabilní doménu (VH) schopnou vázat zvolený antigen, konstantní doménu 1 (CH1) těžkého řetězce, konstantní doménu 2 (CH2) těžkého řetězce a volitelně dále konstantní doménu 3 (CH3) těžkého řetězce. Ve výhodnějším provedení vynálezu je imunokonjugátem fúzní protein zahrnující imunoglobulinový těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebný fragment připojený peptidovou vazbou k použitému cytokinu. Výhodně používané fúzní proteiny protilátka-cytokin tudíž, ve směru od Nkonce k C-konci, zahrnují: (i) vazebné místo (odvozené z protilátky) zahrnující variabilní doménu (VH) schopnou vázat povrchový antigen na zvoleném typu buněk, konstantní doménu 1 (CH1) těžkého řetězce, konstantní doménu 2 (CH2) těžkého řetězce (volitelně dále konstantní doménu 3 (CH3) těžkého ·· * • · ·· ··· · · ·· • · · · · · · · · · • ···« ♦ · · ···· · · · · • · · · · ··· ···· · ·· · ·· ··· řetězce); a (ii) cytokin. Způsoby přípravy a použití takových fúzních proteinů jsou detailně popsány v publikacích Gillies a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1428 až 1432, 1992; Gillies a další, J. Immunol.,
160:6195 až 6203, 1998; a přihláška US 5650150.
Domény konstantní oblasti imunoglobulinu (tj. domény CH1, CH2 a CH3) mohou být doménami obvykle asociovanými s doménou variabilní oblasti v přirozeně se vyskytujících protilátkách. Alternativně může být jedna nebo více domén konstantní oblasti imunoglobulinu odvozeno z protilátek, které jsou odlišné od protilátky sloužící jako zdroj domény variabilní oblasti. Jinak řečeno, domény variabilní a konstantních oblastí mohou pocházet z různých protilátek, například protilátek odvozených z odlišných živočišných druhů (viz. například přihláška US 4816567). Variabilní oblasti imunoglobulinu mohou dále zahrnovat sekvence FR (framework region, konstantní část ve variabilní doméně) odvozené z jednoho živočišného druhu, například lidské FR, a sekvence hypervariabilní oblasti (CDR, complementarity determining region) vmezeřené mezi sekvence FR, odvozené z jiného, odlišného živočišného druhu, například myši.
Způsoby přípravy takových chimérických variabilních oblastí imunoglobulinů jsou popsány například v přihláškách US 5225539 a 5585089.
Imunokonjugáty ve výhodném provedení dále zahrnují lehký řetězec imunoglobulinu, kde tento řetězec je výhodně kovalentně připojen k těžkému řetězci imunoglobulinu, a to například disulfidickou vazbou. Variabilní oblasti spojených řetězců (lehkého a těžkého) spoluvytvářejí jedinečné a kompletní vazebné místo pro vazbu zvoleného antigenu. V jiných provedeních vynálezu zahrnují zmíněné imunokonjugáty dva chimérické řetězce, kde každý z těchto řetězců zahrnuje alespoň část těžkého řetězce ·
··· ··· ··· • · · ···« · · * ···· 99 9 9999 99 · • · · · · 9 9 •999 9 99 9 99 9 imunoglobulinu spojenou s nějakým cytokinem. Zmíněné dva chimérické řetězce jsou ve výhodném provedení kovalentně spojeny například jednou nebo více intermolekulárními disulfidickými vazbami.
Do rozsahu vynálezu tudíž spadají fúzní proteiny, v nichž jsou kombinovány antigen-vazebná specifičnost a aktivita protilátky a účinná biologická aktivita cytokinu. Fúzní protein podle vynálezu může být využit k selektivnímu směrování cytokinu k cílové buňce in vivo tak, aby biologická aktivita tohoto cytokinu mohla být uplatněna v blízkosti cílové buňky. Ve výhodném provedení vynálezu se složka fúzního proteinu odvozená z protilátky specificky váže na nějaký antigen na povrchu rakovinné buňky a výsledkem je, že protinádorová aktivita použitého fúzního proteinu je lokalizována do blízkosti této buňky. V jiném výhodném provedení vynálezu se složka fúzního proteinu odvozená z protilátky specificky váže na buňku infikovanou virem, například infikovanou virem HIV, a výsledkem je, že antivirální aktivita použitého fúzního proteinu je lokalizována do blízkosti této buňky.
Mezi cytokiny výhodně inkorporované do imunokonjugátů podle vynálezu patří například tumor nekrotizující faktor, interleukiny, faktory stimulující růst kolonií a lymfokiny. Mezi výhodně používané tumor nekrotizující faktory patří tumor nekrotizující faktor a. Mezi výhodně používané interleukiny patří například interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-7 (IL-7), interleukin-12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15) a interleukin-18 (IL-18). Mezi výhodně používané faktory stimulující růst kolonií patří například faktor stimulující růst granulocytů-makrofágů (GM-CSF; granulocyte-macrophage colony stimulating factor) a faktor stimulující růst makrofágů (M-CSF). Mezi výhodně používané lymfokiny patří •··· 4 4 44444 například lymfotoxin (LF). Dalšími využitelnými cytokiny jsou interferony včetně IFN-oí, IFN-β a IFN-γ. Všechny tyto interferony vykazují imunologické účinky jakož i účinky anti-angiogenní, a tyto účinky jsou nezávislé na jejich účincích antivirálních.
Inhibitory angiogeneze výhodně používané při praktickém využití tohoto vynálezu zahrnují například endostatin, angiostatin, peptidy s vazebnou aktivitou vůči integrínu ανβ3, protilátky nebo jejich fragmenty s vazebnou aktivitou vůči integrinu ανβ3, peptidy s vazebnou aktivitou vůči receptoru pro epidermální růstový faktor (EGF), protilátky nebo jejich fragmenty s vazebnou aktivitou vůči receptoru pro EGF, inhibitory COX-2, fumagilin, thalidomid, antiangiogenní cytokiny jako například IFN-or, IFN-β a IFN-γ a fúzní proteiny cytokinů zahrnující některý z výše uvedených anti-angiogenních cytokinů.
Vynález rovněž popisuje výhodně používaná dávkování a dávkovači režimy pro současnou aplikaci imunokonjugátů podle vynálezu a inhibitorů angiogeneze.
Bylo zjištěno, že cytotoxické imunitní odpovědi iniciované prostřednictvím imunokonjugátu namířeného proti zvolenému typu buněk mohou být mnohonásobně zesíleny současnou aplikací takového imunokonjugátu a inhibitoru angiogeneze. Tato kombinovaná terapie je zvláště účinná při zprostředkování destrukce nemocných tkání, jako například nádorů nebo buněk infikovaných viry, imunitním systémem. Vynález popisuje způsoby přípravy a použití imunokonjugátů a rovněž stanovení využitelná k testování jejich farmakokinetických parametrů in vivo na preklinických živočišných modelech v případech, kdy jsou tyto imunokonjugáty kombinovány s vhodnými inhibitory angiogeneze.
9·
Termíny cytotoxická imunitní odpověď nebo cytotoxická imunitní reakce označují imunitní odpověď v organizmu savců, a to buď odpověď humorální nebo buněčnou, kde tato imunitní odpověď je stimulována imunokonjugáty podle vynálezu, a při níž je zvolený typ buněk buď zabíjen nebo je jiným způsobem snížena jeho životaschopnost. Této imunitní odpovědi se může účastnit jeden nebo více typů buněk, včetně T-buněk, přirozených zabíječů (NK-buněk) a makrofágů.
Termín imunokonjugát označuje nějaký konjugát zahrnující (i) vazebné místo (odvozené z protilátky) s vazebnou specifitou pro a se schopností vázat se na nějaký povrchový antigen rakovinných buněk nebo buněk infikovaných virem a (ii) cytokin schopný indukovat nebo stimulovat cytotoxickou imunitní odpověď vůči rakovinným buňkám nebo buňkám infikovaným virem. Daný imunokonjugát je tudíž schopný in vivo selektivně směrovat cytokin k cílové buňce tak, aby indukovaná imunitní odpověď byla lokalizována do blízkosti cílové buňky. Jestliže například složka imunokonjugátu odvozená z protilátky selektivně váže antigen na povrchu rakovinné buňky, například rakovinné buňky v pevném nádoru a zvláště pak velkém pevném nádoru větším než přibližně 100 mm3, pak je protinádorová aktivita tohoto imunokonjugátu lokalizována do blízkosti této buňky. Jestliže například složka imunokonjugátu odvozená z protilátky selektivně váže antigen na povrchu buňky infikované virem, například buňky infikované virem lidské imunitní nedostatečnosti (HIV), pak je antivirální aktivita tohoto imunokonjugátu lokalizována do blízkosti této. buňky.
Slovní spojení vazebné místo odvozené z protilátky, vazebné místo (odvozené z protilátky), složka imunokonjugátu odvozená z protilátky označují alespoň část těžkého řetězce imunoglobulinu, například variabilní oblast • · · 4 • 4444 4 · ·
44444 4
4
imunoglobulinu schopnou vazby na zvolený typ buněk. Ve výhodném provedení vazebné místo odvozené z protilátky zahrnuje alespoň část konstantní oblasti imunoglobulinu včetně například domény CH1, domény CH2 a volitelně domény CH3. Těžký řetězec imunoglobulinu může být dále asociován, buď kovalentně nebo nekovalentně, s lehkým řetězcem imunoglobulinu zahrnujícím například variabilní oblast lehkého imunoglobulinového řetězce a volitelně konstantní oblast lehkého imunoglobulinového řetězce. Předpokládá se tedy, že vazebné místo odvozené z protilátky může zahrnovat intaktní protilátku nebo fragment této protilátky schopné vazby na zvolený typ buněk.
Složka imunokonjugátu odvozená z protilátky může být k cytokinu připojena množstvím způsobů odborníkům v současnosti známých. Ve výhodném provedení je ve fúzním proteinu vazebné místo odvozené z protilátky spojeno s cytokinem například peptidovou vazbou. Jinou možností je připojení vazebného místa odvozeného z protilátky k cytokinu chemickou cestou využívající reaktivních skupin, jako například merkapto skupin přítomných v postranních řetězcích aminokyselin ve vazebném místě odvozeném z protilátky a cytokinu.
Termín cytokin zahrnuje jakýkoliv protein nebo peptid nebo jeho analog nebo funkční fragment, které jsou v organizmu savců schopny stimulovat nebo indukovat cytotoxickou imunitní odpověď vůči zvolenému typu buněk, například rakovinným buňkám nebo buňkám infikovaným virem. Do imunokonjugátů podle vynálezu může být tedy začleněno velké množství nejrůznějších cytokinů. Mezi výhodně používané cytokiny patří například tumor nekrotizující faktory, faktory' stimulující růst kolonií, lymfokiny a interleukiny, včetně druhově odlišných variant a zkrácených analogů, schopné stimulovat nebo indukovat zmíněné ·· cytotoxické imunitní reakce. Mezi výhodně používané tumor nekrotizující faktory patří TNFa. Mezi výhodně používané lymfokiny patří například LF. Mezi výhodně používané faktory stimulující růst kolonií patří například GM-CSF a M-CSF. Mezi výhodně používané interleukíny patří například IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15 a IL-18. Dalšími využitelnými cytokiny jsou například interferony včetně IFN~a, IFN-β a IFN-γ.
Gen kódující požadovaný cytokin může být nakloňován de novo, získán z dostupného zdroje nebo syntetizován standardními postupy na základě známé sekvence nukleotidů. Jsou například známé sekvence DNA kódující LT (viz. například Nedwin a další, Nucleic Acid Res., 13:6361,
1985), jakož i sekvence kódující IL-2 (viz. například Taniguchi a další, Nátuře, 302:305 až 318, 1983), GM-CSF (viz. například Gasson a další, Science, 266:1339 až 1342, 1984) a TNFa (viz. například Nedwin a další, Nucleic Acid Res., 13:6361, 1985).
Ve výhodném provedení vynálezu jsou zmíněnými imunokonjugáty rekombinantní fúzní proteiny produkované standardními rekombinantními technikami, tj. vytvořením konstruktu nukleové kyseliny kódujícího chimérický imunokonjugát. Konstrukce rekombinantních fúzních proteinů protilátka-cytokin byla popsána již dříve (viz. například Gillies a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1428 až 1432, 1992; Gillies a další, J. Immunol., 160:6195 až 6203 1998; a přihláška US 5650150). Ve výhodném provedení zahrnuje konstrukt kódující imunokonjugát podle vynálezu, orientaci od 5' k 3', segment DNA kódující oblast variabilní domény těžkého imunoglobulinového řetězce, segment DNA kódující konstantní část těžkého imunoglobulinového řetězce a sekvenci kódující cytokin. Tento fúzní gen je sestaven v nebo vložen do expresívního • · · · 9 ·····♦ vektoru použitelného k transfekci vhodných hostitelských buněk a v těchto buňkách exprimován. Takto připravený hybridní polypeptidový řetězec je ve výhodném provedení kombinován s lehkých řetězcem imunoglobulinu například takovým způsobem, že variabilní oblast těžkého imunoglobulinového řetězce (VH) a variabilní oblast lehkého imunoglobulinového řetězce (VL) vytvářejí jedinečné a kompletní místo pro vazbu zvoleného antigenu. Ve výhodném provedení jsou lehký a těžký imunoglobulinový řetězec spojeny kovalentně, například prostřednictvím intermolekulární disulfidické vazby. Dále mohou být kovalentně spojeny, například jednou nebo více intermolekulárními disulfidickými vazbami, dva imunoglobulinové těžké řetězce, kde buď jeden nebo oba jsou ve formě fúzního proteinu s cytokinem.
Obrázek 1 je schématických znázorněním imunokonjugátu (10). V tomto provedení vynálezu jsou molekuly cytokinu (2 a 4) připojeny peptidovou vazbou k C-koncům (6 a 8) oblastí CH3 (10 a 12) těžkých imunoglobulinových řetězců (14 a 16). Oblasti VL (26 a 28) jsou znázorněny ve formě páru s oblastmi VH (18 a 20) v typické konfiguraci imunoglobulinu IgG a na N-konci imunokonjugátu (10) tudíž vytvářejí dvě vazebná místa pro antigen (30 a 32). Na C-konci imunokonjugátu (10) se pak nalézají dvě místa vazby na receptor pro cytokin (40 a 42). Je zřejmé, že není nezbytné vytvářet páry imunokonjugátů jak jsou znázorněny na obrázku 1, ale postačující je připojit molekulu cytokinu pouze k jednomu ze dvou těžkých imunoglobulinových řetězců.
Imunokonjugáty podle vynálezu mohou být za chimérické považovány na základě dvou aspektů jejich struktury. Za prvé, imunokonjugát je označován jako chimérický, jestliže zahrnuje těžký imunoglobulinový řetězec specificky vážící antigen, připojený k danému cytokinu. Za druhé může být ·
• · 4 • 44 • 4444 4 • 4 • 44 4 4 • · · • · 4 4 • 4 4444 •44 ♦ · 4 β
4 4 • 4 imunokonjugát podle vynálezu označen jako chimérický, jestliže zahrnuje variabilní imunoglobulinovou oblast (V) a konstantní imunoglobulinovou oblast (C), kde každá z těchto oblastí je odvozena z rozdílné protilátky a vzniklý protein je tudíž chimérickým proteinem V/C. Variabilní a konstantní oblasti mohou být například odvozeny z přirozeně se vyskytujících molekul protilátek izolovatelných z rozdílných živočišných druhů (viz. například přihláška US 4816567). Jako chimérické jsou rovněž považovány konstrukty, kde jedna nebo obě variabilní imunoglobulinové oblasti zahrnují sekvence oblasti FR a hypervariabilní oblasti (CDR) odvozené z rozdílných živočišných druhů. Takové konstrukty jsou například popsány v publikacích Jones a další, Nátuře, 321:522 až 525, 1986; Verhoyen a další, Science, 239:1534 až 1535, 1988; přihlášky US 5225539 a 558.5089. Sekvence variabilních oblastí mohou být rovněž získány screeningem knihoven, například knihoven vystavených na povrchu fágů. Tímto způsobem mohou být získány sekvence variabilních oblastí, které se na zvolený antigen vážou s požadovanou afinitou. Způsoby přípravy a screeningu knihoven vystavených na povrchu fágů jsou popsány například v publikacích Huse a další, Science, 246:1275 až 1281, 1989; a Kang a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:11120 až 11123, 1991.
Oblasti konstantních domén těžkých imunoglobulinových řetězců v imunokonjugátech mohou být odvozeny z jakékoliv z pěti imunoglobulinových tříd označovaných jako IgA (Iga), IgD (Igó), IgE (Ige), IgG (Igy) a IgM (Igg). Ve výhodném provedení jsou nicméně využívány konstantní oblasti těžkých řetězců imunoglobulinů typu IgG. Vynález dále předpokládá, že těžké řetězce imunoglobulinů mohou být odvozeny z jakékoliv podtřídy IgG označovaných jako IgGl, IgG2, IgG3 nebo IgG4. Je známo, že každá konstantní oblast těžkého ·· · • · « • · · • ··*« • · ·>·· · *· · • · • · · • ···· · • · · ·· 9 ·· ·· · imunoglobulinového řetězce se skládá ze čtyř nebo pěti domén. Tyto domény jsou označovány následovně: CHl-pantová oblast-CH2-CH3-(-CH4). Doména CH4 se vyskytuje u IgM a imunoglobuliny typu IgM nemají pantovou oblast. Sekvence DNA jednotlivých domén těžkých řetězců vykazují zkříženou homologii mezi jednotlivými třídami imunoglobulinů. Doména CH2 imunoglobulinu IgG je například homologní s doménou CH2 imunoglobulinů IgA a IgD a s doménou CH3 imunoglobulinů IgM a IgE. Konstantní domény lehkých imunoglobulinových řetězců mohou být typu kappa (k) nebo lambda (λ) . Sekvence a sekvenční homologie těchto oblastí imunoglobulinů jsou v současnosti známé (viz. například Kabat a další, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, třetí vydání 1983, čtvrté vydání 1987; Huck a další, Nucleic Acid Res., 14:1779 až 1789,
1986) .
Ve výhodných provedeních vynálezu jsou variabilní oblasti odvozeny z protilátek specificky interagujicích se zvoleným antigenem na povrchu buněk (nějakým antigenem asociovaným s abnormální buňkou jako například rakovinnou buňkou nebo buňkou infikovanou virem) a konstantní oblasti zahrnují domény CH1, CH2 (a volitelně CH3) odvozené z protilátek, které jsou totožné nebo odlišné od protilátky, jenž je zdrojem použité variabilní oblasti. Ve výhodném provedení vynálezu jsou části imunokonjugátu odvozené z protilátek v organizmu příjemce neimunogenní nebo mírně imunogenní. Část imunokonjugátu odvozená z protilátky je tudíž, je-li to možné, získaná ze stejného živočišného druhu jakým je příjemce. Budou-li například imunokonjugáty podávány lidem, pak oblast konstantních domén je ve výhodném provedení lidského původu (viz. například přihláška US 4816567). Je-li variabilní oblast imunoglobulinu odvozena z jiného druhu než ke kterému • · • · · l ···· · náleží recipient, například jsou-li sekvence variabilní oblasti myšího původu a recipientem je člověk, pak ve výhodném provedení zahrnují tyto variabilní sekvence lidské FR sekvence a mezi nimi vložené myší CDR sekvence; tímto způsobem je připravena chimérická variabilní oblast, která specificky váže zvolený antigen a současně je minimalizována imunoreaktivita v organizmu příjemce. Návrh a syntéza takových chimérických variabilních oblastí jsou popsány v publikacích Jones a další, Nátuře, 321:522 až 525, 1986; Verhoyen a další, Science, 239:1534 až 1535, 1988; přihlášky US 5225539 a 5585089. Klonování a exprese fúzního proteinu humanizovaná protilátka-cytokin (fúzní protein KS-1/4 anti-EpCAM protilátka-IL-12) a schopnost tohoto fúzního proteinu ničit metastázy karcinomu tlustého střeva jsou popsány v publikaci Gillies a další, J.
Immunol., 160:6195 až 6203, 1998).
Gen kódující příslušný cytokin je ve stejném čtecím rámci připojen, buď přímo nebo prostřednictvím linkeru, například prostřednictvím DNA kódující linker (Gly<|-Ser) 3, ke 3' konci genu kódujícího konstantní oblast imunoglobulinu (například exon CH2 nebo CH3). V určitých provedeních vynálezu může zmíněný linker zahrnovat nukleotidovou sekvenci kódující proteolyticky štěpitelné místo. Toto místo, je-li umístěno mezi konstantní oblast imunoglobulinu a cytokin, může být navrženo tak, bylo umožněno proteolytické uvolnění daného cytokinu v cílovém místě. Je například dobře známo, že v místech, která jsou přístupná pro proteázy, je polypeptidový řetězec štěpen za argininem nebo lysinem prostřednictvím plasminu a trypsinu. V současnosti je známo množství jiných místně specifických proteáz a aminokyselinových sekvencí těmito proteázami štěpených. Výhodně používaná místa proteolytického štěpení a výhodně používané enzymy štěpící polypeptidové řetězce v ·· · _ * · · 1 • · · · • ♦···«· těchto místech jsou popsány v přihláškách US 5541087 a 5726044.
Konstrukt nukleové kyseliny může volitelně zahrnovat endogenní promotor a enhancer pro gen kódující variabilní oblast, kde tyto dvě složky regulují expresi chimérického *
polypeptidového řetězce. Geny kódující variabilní oblast mohou být například získány ve formě fragmentů DNA zahrnujících signální peptid, gen VJ (funkčně přeskupené variabilní oblasti (V) a spojující segment (J)) pro lehký řetězec nebo gen VDJ pro těžký řetězec a endogenní promotor a enhancer pro tyto geny. Gen kódující variabilní oblast může být alternativně získán bez endogenních regulačních prvků a použit v expresívním vektoru, který tyto regulační prvky obsahuje.
Geny kódující variabilní oblasti mohou být z buněk produkujících požadované protilátky získány standardními postupy klonování DNA. S využitím vhodných DNA sond, jako například segmentů DNA obsahujících sekvence oblasti J a sekvence dále po směru transkripce, může být proveden screening genomové knihovny za účelem nalezení specifických, funkčně přeskupených variabilních oblastí. Identifikace a potvrzení správnosti nalezených klonů může být provedeno sekvenací klonovaných genů a srovnáním získané sekvence s odpovídající sekvencí nezkrácené, řádně sestřižené mRNA.
Cíleným antigenem může být antigen na povrchu nádorových nebo rakovinných buněk, buněk infikovaných virem nebo jiných abnormálních buněk. Geny kódující vhodné variabilní oblasti mohou být získány z lymfoidních buněčných linií produkujících imunoglobuliny. Standardními postupy hybridizace somatických buněk v současnosti známými (viz. například přihláška, US 4196265) mohou být například vytvořeny buněčné linie hybridomů produkující • 4
4
4444
4 ·
4444 A · *
· · · 4 4 4 ·
imunoglobuliny specificky namířené proti antigenům asociovaným s nádory nebo proti virovým antigenům. Tyto buněčné linie produkující imunoglobuliny jsou zdrojem genů pro variabilní oblasti. Zmíněné geny se zde nacházejí ve funkčně přeskupené formě. Geny kódující variabilní oblasti budou obvykle myšího původu, protože myší systém umožňuje produkci velkého množství nejrůznějších imunoglobulinů s požadovanou specifitou. Sekvence variabilních oblastí mohou být rovněž získány screeningem knihoven, například knihoven vystavených na povrchu fágů. Tímto způsobem mohou být získány variabilní oblasti, které zvolený antigen vážou s požadovanou afinitou. Způsoby přípravy a screeningu knihoven vystavených na povrchu fágů jsou popsány například v publikacích Huse a další, Science, 246:1275 až 1281,
1989; a Kang a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:11120 až 11123, 1991.
Fragment DNA kódující funkčně aktivní variabilní oblast je připojen k fragmentu DNA obsahující gen kódující požadovanou konstantní oblast (nebo její část). Konstantní oblasti imunoglobulinů (lehký a těžký řetězec) mohou být z buněk produkujících protilátky získány standardními klonovacími postupy. Byly klonovány geny pro dvě třídy lidských lehkých řetězců (k a λ) a pro pět tříd lidských těžkých řetězců (α, δ, ε, γ a μ). Konstantní oblasti lidského původu jsou tedy z těchto klonů snadno dostupné.
Fúzovaný gen kódující hybridní těžký řetězec imunoglobulinů je sestaven v nebo vložen do expresívního vektoru vhodného pro transfekci hostitelských buněk. Zavedení zmíněného genového konstruktu do vektoru může být provedeno standardními postupy. Chimérický imunoglobulinový těžký řetězec může být v dané buňce exprimován společně s příslušným lehkým imunoglobulinovým řetězcem a tak může být současně exprimována a sestavena celá molekula
• · « 2 •··· · ·
·
4 4 4 4
imunoglobulinu. Za tímto účelem mohou být konstrukty lehkého a těžkého řetězce umístěny na stejném vektoru nebo na dvou samostatných vektorech.
Hostitelskými buněčnými liniemi jsou obvykle lymfoidní buňky. Ve výhodném provedení je hostitelskou buňkou myelom (nebo hybridom). Myelomy umožňují syntézu, sestavení (assembling) a sekreci imunoglobulinu kódovaných transfekovanými geny a rovněž umožňují glykosylaci těchto proteinů. Zvláště výhodně používanými hostitelskými buňkami jsou myelomy Sp2/0, které neprodukují endogenní imunoglobuliny, a buňky myšího myelomu NS/0. Po transfekci produkují tyto buňky pouze imunoglobuliny kódované transfekovanými geny. Transfekované myelomy mohou být kultivovány in vitro nebo v peritoneu myší. Z peritonea mohu být sekretované imunokonjugáty získány z ascitické tekutiny. Jako hostitelské buňky mohou být použity i jiné lymfoidní buňky jako například B-lymfocyty.
Existuje několik způsobů transfekce lymfoidních buněk vektory obsahujícími konstrukty nukleových kyselin kódujícími chimérické imunoglobulinové řetězce. Takové vektory mohou být do lymfoidních buněk zavedeny například fúzí sféroblastů (viz. například Gillies a další, Biotechnol., 7:798 až 804, 1989). Dalšími použitelnými způsoby jsou elektroporace nebo koprecipitace s fosforečnanem vápenatým (viz. například Sambrook a další, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
Další způsoby použitelné pro produkci imunokonjugátů podle vynálezu zahrnují přípravu sekvencí RNA kódujících příslušný konstrukt a jejich translaci ve vhodném expresívním systému in vitro nebo in vivo. Předpokládá se, že rekombinantní techniky pro syntézu genů kódujících fúzní proteiny protilátka-cytokin, pro zavádění takových genů do hostitelských buněk a jejich expresi v těchto buňkách a pro izolaci takto připravených fúzních proteinů jsou v současnosti dobře známé. Podrobné protokoly jsou uvedeny například v publikaci Sambrook a další, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Je zřejmé, že s využitím velkého množství postupů odborníkům známých mohou být připraveny imunokonjugáty, v nichž jsou jednotlivé části připojeny chemickou cestou. Protilátka nebo fragment protilátky mohou být například chemickou cestou připojeny k danému cytokinů. Při tomto způsobu mohou být využity chemicky reaktivní postranní řetězce aminokyselin v protilátce, fragmentu protilátky a cytokinů. Tyto postranní řetězce aminokyselin mohou být kovalentně spojeny například disulfidickou vazbou nebo prostřednictvím homo- nebo hetero-bifunkčních zesíťovadel včetně například N-sukcinimidyl 3(—2— pyridinyldithio)propionátu, esteru m-maleimidobenzoyl-Nhydroxysukcinátu a 1,4-di-[3' (2'pyridylthio)propionamido]butanu. Všechna tato činidla jsou komerčně dostupná například od společnosti Pierce,
Rockford, IL.
Termín inhibitor angiogeneze označuje jakoukoliv molekulu, které potlačuje nebo inhibuje tvorbu nových krevních kapilár v organizmu savců. Při léčbě rakoviny inhibitory angiogeneze potlačují nebo inhibují tvorbu nových krevních kapilár v nebo na nádorech, výhodně pak v nebo na pevných nádorech. Výhodně využitelné inhibitory angiogeneze mohou být identifikovány pomocí nejrůznějších stanovení v současnosti známých a používaných. Mezi taková stanovení patří například sledování proliferace bovinních endotheliálních buněk tvořících kapiláry, stanovení na kuřecích chorioalantoických membránách (CAM) nebo stanovení ·· · • · * • · · • ···· ♦ • J ···» · na myší rohovce. V současnosti je nicméně s výhodou používáno stanovení CAM (viz. například 0'Reilly a další, Cell, 79:315 až 328, 1994; a O'Reilly a další, Cell, 88:277 až 285, 1997). Stručně řečeno, z oplodněných bílých vajec (3 dny po oplození) jsou vyjmuta embrya spolu s nepoškozených žloutkem a tato jsou umístěna na Petriho misky. Po třídenní inkubaci při 37°C v atmosféře 3% CO2 je na chorioalantoicku membránu každého z embryí umístěn disk z methylcelulózy obsahující předpokládaný inhibitor angiogeneze. Po přibližně 48 hodinové inkubaci jsou chorioalantoické membrány pozorovány pod mikroskopem a jsou zde sledovány známky inhibice angiogeneze.
V současnosti je známo a dokonale popsáno velké množství inhibitorů angiogeneze. Příkladem inhibitorů angiogeneze použitelných při praktickém využití vynálezu jsou proteinové/peptidové inhibitory angiogeneze jako například: angiostatin, který je proteolytickým fragmentem plasminogenu (O'Reilly a další, Cell, 79:315 až 328, 1994; a přihlášky US 5733876, 5837682 a 5885795); endostatin, který je proteolytickým fragmentem kolagenu XVIII (0'Reilly a další, Cell, 88:277 až 285, 1997; a přihláška US 5854205); peptidy obsahující tripeptidovou sekvenci RGD, které jsou schopné se vázat na integrin ανβ3 (Brooks a další, Cell, 79:1157 až 1164, 1994); a určité protilátky, . jejich antigen-vazebné fragmenty a peptidy, které interagují s integrinem ανβ3 exprimovaným na epitheliálních buňkách tvořících vaskulaturu nádorů (Brooks a další, viz. výše) nebo které interagují s receptorem pro EGF (Ciardello a další, J. Nati. Cancer Inst,, 88:1770 až 1776, 1996). Příkladem jiných inhibitorů angiogeneze jsou: inhibitory COX-2 (Masferrer a další, Proč. Amer. Assoc. Cancer Res., 39:271, 1998); fumagilin a jeho analogy jako například AGM1470 (Ingber a další, Nátuře, 348:555 až 557, 1990); a jiné • · * • · · · • ···· · · ♦ · · • 6 « « 4444 ♦ · • 4 · · • · 4 · · · ·
4 ·
malé molekuly jako například thalidomid (D'Amanto a další, Proč. Nati. Acad. Sej.. USA, 91:4082 až 4085, 1994). Ve výhodných provedeních jsou však používány endostatin a angiostatin. ,
Antiangiogenní aktivita byla rovněž popsána u několika cytokinu včetně jejich druhových variant a zkrácených analogů. Tyto sloučeniny jsou tedy rovněž použitelné při praktickém provedení vynálezu. Příkladem jsou IL-12, který účinkuje mechanizmem závislým na IFN-γ (Voest a další, J. Nati. Canc. Inst., 87:581 až 586, 1995); IFN-γ, který indukuje tvorbu chemokinu (IP-10) s angiostatickou aktivitou (Arenberg a další, J. Exp. Med., 184:981 až 992, 1996). IL-12, IFN-γ a IP-10 tedy reprezentují inhibitory angiogeneze na různých místech stejné inhibiční dráhy. Bylo prokázáno, že i další interferony, zvláště pak IFN-oí, vykazují antiangiogenní aktivitu a to buď samostatně nebo v kombinaci s jinými inhibitory (Brém a další, J. Pediatr. Surg., 28:1253 až 1257, 1993). Interferony IFN-a, IFN-β a IFN-γ vykazují imunomodulační účinky a rovněž účinky antiangiogenní, kde tyto účinky jsou nezávislé na jejich antivirálním působení. GM-CSF je dalším inhibitorem angiogeneze a inhibiční vliv tohoto faktoru je zprostředkován indukcí produkce angiostatinu (Kumar a další, Proč. Amer. Assoc. Cancer Res., 39:271, 1998).
Část imunokonjugátu odvozená z protilátky se specificky váže na zvolený antigen, cytokin se specificky váže na receptor pro cytokin a inhibitor angiogeneze se specificky váže na receptor pro tento inhibitor, jestliže vazebná afinita pro takový antigen nebo receptor je vyšší než 105 M’ 1 nebo ve výhodném provedení vyšší než 107 M1. Termíny angiostatin, endostatin, TNF, IL, GM-CSF, M-CSF, LT a IFN neoznačují pouze intaktní proteiny, ale rovněž jejich biologicky aktivní fragmenty a/nebo analogy. Jako ·· · ϊ 9 9 · ·:·:··: :
• : .. · ·· · ···* * * biologicky aktivní fragmenty jsou označovány části intaktního proteinu, které vykazují alespoň 30%, ve výhodném provedení alespoň 70% a nejvýhodněji pak přinejmenším 90% biologické aktivity příslušných intaktních proteinů. Jako analogy jsou v přihlášce označovány druhové nebo alelické varianty intaktních proteinů nebo proteiny s aminokyselinovými záměnami, inzercemi nebo delecemi, které vykazují alespoň 30%, ve výhodném provedení alespoň 70% a nejvýhodněji pak přinejmenším 90% biologické aktivity příslušných intaktních proteinů.
Inhibitory angiogeneze mohou být podávány spolu s imunokonjugátem nebo jsou aplikovány samostatně jinými způsoby. Přípravky podle vynálezu mohou být aplikovány jakýmkoliv způsobem slučitelných s příslušnou molekulou.
Je-li to tedy vhodné, podání může být orální nebo parenterální, včetně intravenózního a intraperitoneálního způsobu aplikace.
Přípravky podle vynálezu mohou být živočichům aplikovány jakýmkoliv vhodným způsobem, přímo (tj. lokálně jako například injekcí, implantátem nebo lokální aplikací na postiženou tkáň) nebo systemicky (například parenterálně nebo orálně). Je-li přípravek aplikován parenterálně, například intravenózně, subkutánně, do oka, intraperitoneálně, intramuskulárně, na tkáň tváře, rektálně, vaginálně, intraorbitálně, intracerebrálně, intrakraniálně, intraspinálně, intravetrikulárně, intrathekálně, intracisternálně, intrakapsulárně, intranazálně nebo prostřednictvím aerosolu, pak ve výhodném provedení část tohoto přípravku zahrnuje vodnou suspenzi nebo roztok nebo suspenzi nebo roztok v jiné fyziologicky přijatelné kapalině. Použitý nosič nebo vehikulum jsou tudíž fyziologicky přijatelné, takže s výjimkou umožnění aplikace daného přípravku do organizmu pacienta, tyto ♦ · · • · · • · · < ···· * ·· * složky žádným nežádoucím způsobem neovlivňují rovnováhu elektrolytů a/nebo objem v organizmu pacienta. Kapalné médium pro použitou sloučeninu může tudíž například zahrnovat fyziologický roztok (například 9,85% vodný roztok NaCl, 0,15 M, pH 7,0 až 7,4).
Ve výhodném provedení je na jednu aplikaci použito množství imunokonjugátu v intervalu 0,1 mg/m2 až 100 mg/m2, výhodněji pak 1 mg/m2 až 20 mg/m2 a nejvýhodněji 2 mg/m2 až 6 mg/m2. Výhodně používané dávky inhibitorů angiogeneze budou obecně záviset na typu použitého inhibitoru angiogeneze. Optimální dávkování může být nicméně stanoveno standardními experimenty. Podávání imunokonjugátu a/nebo inhibitoru angiogeneze může být uskutečňováno injekcemi v pravidelných intervalech nebo kontinuální intravenózní nebo intraperitoneální aplikací z externího (například z intravenózního vaku) nebo interního (například z biologicky degradovatelného implantátu) zdroje. Imunokonjugát podle vynálezu může být rovněž aplikován spolu s větším množství rozdílných inhibitorů angiogeneze. Optimální kombinace imunokonjugátu a inhibitorů angiogeneze, způsoby aplikace a dávkování mohou být stanoveny na základě výsledků standardních experimentů v současnosti známých.
Účinnost kombinované terapie využívající fúzní proteiny protilátka-cytokin a inhibitory angiogeneze na imunitní odpověď může být stanovena množstvím nejrůznějších způsobů. Ke zjištění, které inhibitory angiogeneze, nebo které kombinace inhibitorů angiogeneze jsou nejúčinnější v kombinaci s daným imunokonjugátem, například fúzním proteinem protilátka-cytokin (například fúzním proteinem protilátka-IL2), při indukci destrukce nádorů imunitním systémem, mohou odborníci využít napřiklad.živočišný model popsaný v příkladu 1 nebo jiné živočišné modely. Inhibitor angiogeneze nebo směs inhibitorů angiogeneze mohou být podávány před nebo spolu s aplikací imunokonjugátu a vliv této terapie na nádor může být snadno vyhodnocován sledováním objemu tohoto nádoru. Jakmile budou identifikovány nové inhibitory angiogeneze, pak s využitím postupů popsaných v této přihlášce budou odborníci schopni odhadnout potenciál těchto nově identifikovaných inhibitorů zesílit protinádorovou aktivitu použitých fúzních proteinů protilátka-cytokin.
Alternativně mohou být nádory po ukončení terapie vyjmuty, rozřezány a obarveny standardními histologickými postupy nebo specifickými imunohistologickými sloučeninami. Tak může být stanoven vliv kombinované terapie na imunitní odpověď. Například jednoduché barvení hematoxylinem a eosinem může odhalit rozdíly v infiltraci lymfocytů do pevných nádorů. Intenzita této infiltrace je pak indikátorem buněčné imunitní odpovědi. Imunologické barvení řezů s využitím protilátek specificky interagujicích s jednotlivými typy buněk imunitního systému může navíc odhalit .charakter takto indukované imunitní reakce. Ke stanovení typu imunitní odpovědi zprostředkované imunokonjugáty podle vynálezu mohou být například využity protilátky, které se váží na CD45 (obecný markér leukocytů), CD4 a CD8 (identifikace podtříd T-buněk) a NK1.1 (markér na NK-buňkách).
Typ imunitní odpovědi zprostředkované imunokonjugáty může být alternativně stanoven postupy využívajícími odstranění určitých typů buněk. Tyto metody jsou popsány například v publikaci Lodge a další, Blood, 91:1706 až 1715, 1998. Příkladem protilátek využívaných k odstranění jednotlivých typů buněk jsou protilátky reagující s CD4 a CD8 (markéry T-buněk), jakož i protilátky, které specificky vážou NK1.1 a asialoGM (markéry NK-buněk). Stručně řečeno, tyto protilátky jsou, před započetím léčby využívající « ·· ·· a *
fúzní protein protilátka-cytokin, ve vysoké dávce (například v dávce přibližně 0,5 mg/myš) injikovány do organizmu pokusných živočichů a tato aplikaci pokračuje v týdenních intervalech až do skončení experimentu. Tímto způsobem mohou být identifikovány typy buněk nezbytné k indukci pozorované imunitní odpovědi v organizmu savců.
Jiným přístupem je srovnání cytotoxické aktivity splenocytů izolovaných z živočichů podstoupivších kombinovanou terapii s cytotoxickou aktivitou splenocytů izolovaných z jiných skupin živočichů. Kultury splenocytů mohou být připraveny mechanickou dezintegrací sterilně odebraných slezin standardními způsoby. Tyto postupy jsou popsány ve většině imunologických laboratorních manuálů (viz. například Coligan a další, Current Protocols in Immunology, Jonh Wiley and Sons, lne., 1998). Takto připravené buňky jsou následně kultivovány ve vhodném kultivačním médiu (například médium DMEM, Gibco) obsahujícím sérum, antibiotika a nízké koncentrace IL-2 (přibližně 10 U/ml). Pro srovnání aktivit NK-buněk je například optimální kultivovat tyto buňky po dobu 3 dní, zatímco pro T-buňky je obvyklá optimální doba kultivace 5 dnů. Cytotoxické aktivita může být měřena s využitím cílových nádorových buněk (například buněk LLC) radioaktivně značených izotopem 51Cr po dobu 30 minut. Po odstranění nadbytku radioaktivní značky jsou značené buňky smíchány s různými koncentracemi kultivovaných splenocytů a inkubace probíhá 4 hodiny. Po ukončení inkubace je na detektoru záření gama stanoveno množství izotopu 51Cr uvolněného z buněk a tato hodnota je použita pro kvantifikaci lýze buněk indukované použitými buňkami imunitního systému. Cytotoxické aktivita T-lymfocytů (CTL) je obvykle stanovována tímto způsobem.
• · ·
99 99
Příklady provedení vynálezu
Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které ovšem nelimitují rozsah vynálezu.
Příklad 1
Živočišný model
Za účelem sledování vlivu kombinované terapie fúzními proteiny protilátka-cytokin spolu s inhibitory angiogeneze na indukci účinné protinádorové imunitní odpovědi byl připraven myší model rakoviny. Fúzní proteiny protilátkacytokin, používané v následujících příkladech, se vážou na EpCAM, což je antigen lidských nádorů exprimovaný na většině nádorů odvozených z epitheliálních buněk (viz.
Perez a Walker, J. Immunol., 142:3662 až 3667, 1989). Aby bylo možné testovat účinnost terapie na imunokompetentním myším modelu, bylo nezbytné exprimovat tento lidský antigen na povrchu myší nádorové buňky, která je syngenní s myším hostitelem. Pro tento účel byly zvoleny buňky Lewisova karcinomu plic (LLC), což je dobře prozkoumaná buněčná linie myších nádorových buněk.
Buňky LLC byly transfekovány expresívním plazmidem obsahujícím cDNA kódující lidský antigen EpCAM (rozpoznávaný protilátkou KS-1/4, popsáno v publikaci Vurki a další, Cancer. Res., 44:681, 1984), která je pod kontrolou časného promotoru cytomegaloviru (CMV; Immunogen, Carlsbad, CA). Antigen KS (KSA neboli EpCAM) byl nakloňován PCR přístupem z cDNA připravené z buněk lidského karcinomu prostaty (LNCaP). Použitý přímý primer měl oligonukleotidovou sekvenci 5'TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC (SEK. ID. Č.: 1), kde ATG je kodon pro iniciaci translace, a jako reverzní primer byl použit oligonukleotid o sekvenci 5'CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT (SEK. ID. Č.: 2), kde TTA je ·
4
4 antikodon terminátoru translace. cDNA kódující EpCAM byla zaklonována do retrovirového vektoru pLNCS (Clontech, Palo Alto, CA) a transfekce byla provedena standardním postupem (Ausubel a další, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons). Stručně řečeno, pakovací buněčná linie PA317 (ATCC CRL 9078) byla transfekována plazmidem pLNCX-EpCAM metodou využívající koprecipitace s fosforečnanem vápenatým a kondiciované médium obsahující virové částice bylo použito k transfekci buněk LLC. Za účelem selekce stabilních klonů bylo k transfekovaným buňkám přidáno G418 (Sigma Chemical Co.) v koncentraci 1 mg/ml. Klony exprimujicí lidský antigen EpCAM (LLC-Ep) byly identifikovány imunoznačením a analýzou FACS (fluorescence activated cell sorting).
Jak je patrno z obrázku 1, klony buněk LLC-Ep značené nejprve fúzním proteinem hu-KS-IL2 (viz. příklad 2) a následně pak protilátkou specificky interagující s lidskými Fc značenou fluorescein isothiokyanátem (FITC) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) vykazovaly stejnoměrnou hladinu exprese lidského EpCAM. Hladina exprese EpCAM u těchto klonů byla výrazně vyšší než u klonů značených pouze protilátkou (značenou FITC) specificky interagující s lidskými Fc.
Aby bylo možné určit, zda exprese lidského povrchového proteinu nezvýšila imunogenicitu buněk LLC-EP, byly myši C57B1/6 subkutánně injikovány různým počtem těchto buněk.
Po injekci 5 x 105 buněk byl u všech myší pozorován vznik rychle rostoucích nádorů s přibližně stejnými kinetikami růstu pozorovanými při použití rodičovské buněčné linie LLC. Všechna umírající pokusná zvířata byla usmrcena,. aby bylo zamezeno jejich zbytečnému trápení.
Příklad 2 • 4
4 • 4 4
4 4 • 4··· • ·
4 4 4 ·
44444 4
Příprava fúzních proteinů protilátka-cytokin nebo protilátka-inhibitor angiogeneze
V následujících příkladech je popsáno množství fúzních proteinů protilátka-cytokin. Přesněji řečeno, v příkladu 3 je popsáno použití fúzních proteinů humanizovaný KS-myší Y2a-myší IL2 (huKS-muY2a-muIL2) a humanizovaný KS-myší y2amyší IL12 (huKS-muY2a-muIL12). Příklad 4 popisuje použití fúzniho proteinu huKS-muY2a-muIL2 spolu s fúzními proteiny myší Fc-myší angiostatin (muFc-muAngio) a myší Fc-myší endostatin (muFc-muEndo). Příklad 5 popisuje použití fúzních proteinů humanizovaný KS-lidský Y4-lidský IL2 (huKS-huY4-huIL2) a muFc-muEndo. Příklad 6 popisuje použití fúzního proteinu humanizovaný KS-lidský γΐ-lidský IL2 (huKS-huyl-huIL2) spolu s indomethacinem. Konstrukce těchto fúzním proteinů je popsána v následujícím textu.
·
9 9 • · · • ♦ ··· • ·
9*99 9 huKS-huyl-huIL.2
Gen kódující fúzní protein huKS-huyl-huIL.2 byl připraven a exprimován způsobem v podstatě identickým s postupem popsaným v publikacích Gillies a další, J. Immunol.,
160:6195 až 6203, 1998; a přihláška US 5650150. Stručně řečeno, humanizované variabilní oblasti myší protilátky KS 1/4 (Varki a další, Cancer Res., 44:681 až 687, 1984) byly vytvořeny postupy popsanými v publikaci Jones a další, Nátuře, 321:522 až 525, 1986. Tyto postupy zahrnovaly vložení hypervariabilních smyček (CDR) z variabilních oblastí KS 1/4 do konzervovaných FR sekvencí lidských variabilních oblastí s co možná nejvyšším stupněm homologie. Molekulové modelování na pracovní stanici Silicon Graphic Indigo s programovým vybavením BioSym potvrdilo, že tvary CDR zůstaly zachovány. Takto získané sekvence proteinů byly zpětně přepsány do sekvencí oligonukleotidových a příslušné geny byly vytvořeny ligací překrývajících se oligonukleotidů.
Takto získané sekvence kódující variabilní oblasti byly, způsobem v podstatě identickým s postupem popsaným v publikaci Gillies a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1428 až 1432, 1992, vloženy do expresívního vektoru obsahujícího konstantní oblast lidského lehkého řetězce κ a konstantní oblast lidského těžkého řetězce Cyl. Jediným rozdílem byla skutečnost, že metalothioneinové promotory a posilovače transkripce (enhancery) pro imunoglobulinový těžký řetězec byly pro oba řetězce nahrazeny promotorem/enhancerem z CMV. Připojení sekvencí maturovaného IL-2 k COOH-konci lidských těžkých řetězců bylo provedeno postupem podle Gillies a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1428 až 1432, 1992, pouze s tím rozdílem, že 3' nepřekládané oblasti genu pro IL-2 byly odvozeny z polyA oblasti SV40.
9 » 9 9
9 9 • 9999
9
9·
Tento fúzní protein s IL-2 byl exprimován po transfekci plazmidu připraveného výše uvedeným postupem do myelomové buněčné linie NS/0 kultivované v selekčním médiu obsahujícím 0,1 μΜ methotrexát. Stručně řečeno, stabilně transfekované klony byly připraveny elektroporací plazmidové DNA do buněk myšího myelomu NS/0. Buňky NS/0 byly kultivovány v Eaglově médiu modifikovaném podle Dulbecca doplněném 10% fetálním telecím sérem. Přibližně 5 x 105 buněk bylo jednou promyto PBS a rozsuspendováno v 0,5 ml PBS. S takto připravenými buňkami bylo následně v elektroporační kývete Gene Pulser (vzdálenost elektrod 0,4 cm, BioRad) po dobu 10 minut při 0°C inkubováno deset mikrogramů linearizované plazmidové DNA. Elektroporace byla provedena elektroporátorem Gene Pulser (BioRad, Hercules,
CA) s nastaveními 0,25V a 500 μΕ. Buňky byly ponechány 10 minut na ledu a poté rozsuspendovány v kultivačním médiu a vysety na 96-ti jamkové destičky. Stabilně transfekované klony byly selektovány kultivací v médiu obsahujícím 100 nM methotrexát (MTX), který byl do médiu přidán dva dny po transfekci. Selekční médium bylo měněno každé tři dny a klony rezistentní vůči methotrexátu se začaly objevovat za 2 až 3 týdny.
Klony exprimující požadovaný konstrukt byly identifikovány metodou ELISA s využitím vhodných protilátek proti Fc nebo cytokinu (viz. například Gillies a další, Biotechnol., 7:798 až 804, 1989). Exprimovaný fúzní protein byl postupem doporučeným výrobcem purifikován chromatografií na Sepharóze s navázaným proteinem A (Pharmacia).
huKS-huy4-huIL2
Gen kódující fúzní protein huKS-huy4-huIL2 byl připraven a exprimován způsobem v podstatě identickým s postupem «
4 • · · • 4 · ···· · • · • 4444 4 popsaným v přihlášce USSN 09/256156, podané 24. února 1999. Tato přihláška je prioritní vzhledem k přihlášce USSN 60/075887, podané 25. února 1999.
Stručně řečeno, Igy4 verze fúzního proteinu huKS-huylhuIL2 popsaného výše byla připravena odstraněním fragmentu genu kódujícího imunoglobulinovou konstantní oblast Cyl z expresívního vektoru huKS-huyl-huIL2 a nahrazením této sekvence odpovídající sekvencí lidského genu Cy4 . Sekvence konstantních oblastí lidských těžkých řetězců Cyl, Cy2, Cy3 a Cy4 a jejich srovnání jsou uvedeny v publikaci Huck a další, Nucleic Acid Res., 14:1779 až 1789, 1986.
Záměna fragmentů Cyl a Cy4 byla provedena rozštěpením původní plazmidové DNA obsahující Cyl restrikčními enzymy HindlII a Xhol a purifikací velkého 7,8 kb fragmentu elektroforézou na agarózovém gelu. Druhá plazmidová DNA obsahující Cy4 byla rozštěpena restrikčními enzymy HindlII a Nsil a purifikován byl fragment o velikosti 1,75 kb.
Třetí plazmid, obsahující cDNA lidského IL2 a polyA sekvenci z SV40, připojené k COOH konci genu pro lidský Cyl, byl rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a Nsil a purifikován byl malý fragment o velikosti 470 bp. Všechny tři takto získané fragmenty byly zaligovány v přibližně ekvimolárních množstvích. Produktem této ligační reakce byly transformovány kompetentní buňky E.coli. Selekce transformantů byla provedena na miskách s agarem obsahujícím ampicilin. Identifikace správně sestavených rekombinantních plazmidů izolovaných z transformantů byla provedena restrikční analýzou. K odlišení inzertů Cyl (žádné FspI místo) a Cy4 (jedno FspI místo) bylo využito štěpení restrikčním enzymem FspI.
Výsledným vektorem obsahujícím část Cy4-IL2 byly transfekovány (elektroporace, 0,25V a 500 pF) buňky myšího myelomu NS/0 a transfektanty byly selektovány kultivací v • 4
4
4 4
4 4
4···
4 4
4444 médiu obsahujícím methotrexát (0,1 pM). Klony exprimující velké množství fúzního proteinu huKS-huy4-huIL2 byly namnoženy a tento fúzní protein byl ze supernatantů purifikován chromatografií na Sepharóze s navázaným proteinem A. Čistota a integrita purifikovaného fúzního proteinu Cy4 byla analyzována elektroforézou na SDSpolyakrylamidovém gelu. Aktivita IL-2 byla stanovena měřením proliferace T-buněk (Gillis a další, J. Immunol., 120:2027 až 2032, 1978) a bylo zjištěno, že je totožná s aktivitou pozorovanou u konstruktu yl.
huKS-muy2a-muIL2
Gen kódující fúzní protein huKS-muy2a-muIL2 byl připraven nahrazením konstantních oblastí lidské protilátky a lidského IL-2 ve fúzním proteinu huKS-huyl-huIL2 (popsán v předchozím textu) odpovídajícími myšími sekvencemi. Přesněji řečeno, DNA kódující lidský Cyl-IL2 byla nahrazena, fragmentem cDNA kódujícím myší Cy2a připojeným k DNA kódující myši IL-2. Stručně řečeno, oblast VH z huKS byla připojena (ve správném čtecím rámci) k cDNA kódující myší y2a. K tomuto účelu byl použit PCR přístup využívající překrývající se oligonukleotidové primery:
přímý: 5' CCGTCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTC (SEK. ID. Č. :
3) reverzní: 5' GGGGCTGTTGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACTGACG (SEK. ID. Č. : 4) přímý: 5'CTTAAGCCAGATCCAGTTGGTGCAG (SEK. ID. Č.: 5) reverzní: 5'CCCGGGGTCCGGGAGAAGCTCTTAGTC (SEK. ID. Č.: 6)
Oligonukleotidy popsané SEK. ID. Č.: 3 a 4 byly navrženy tak, aby hybridizovaly s místem spojení domény VH z huKS a cDNA kódující konstantní oblast myší y2a (kurzívou). V
4··· ♦
4
44··
4 4 prvním kole PCR byly provedeny dvě amplifikační reakce. V první reakci byla jako templát použita DNA kódující VH z huKS a oligonukleotidy popsané SEK. ID. Č.: 4 a 5. Primer popsaný SEK. ID. Č.: 5 zavádí proti směru transkripce od sekvence kódující NH2~konec maturované huKS VH (tučně) restrikční místo AflII (CTTAAG). Ve druhé reakci byla jako templát použita cDNA kódující myší y2a a oligonukleotidy popsané SEK. ID. Č.: 3 a 6. Primer popsaný SEK. ID. Č.: 6 hybridízuje s cDNA kódující oblast kolem COOH konce y2a a zavádí restrikční místo Xmal (CCCGGG) použité při následné ligaci k cDNA pro muIL2. Produkty získané těmito dvěma amplifikačními reakcemi byly smíchány a použity při druhém kole PCR s oligonukleotidy popsanými SEK. ID. Č.: 5 a 6. Po ověření sekvence byl získaný produkt (fragment AflII-Xmal kódující VH z huKS a konstantní oblast myší y2a) použit k ligaci s DNA kódující signální peptid (ohraničený místem AflII) a cDNA kódující muIL2 (ohraničená místem Xmal).
cDNA kódující myší IL2 byla klonována z mRNA myších mononukleárních buněk z periferní krve z využitím oligonukleotidů popsaných SEK. ID. Č.: 7 a 8:
přímý: 5'GGCCCGGGTAAAGCACCCACTTCAAGCTCC (SEK. ID. Č.: 7) reverzní: 5' CCCTCGAGTTATTGAGG.GCTTGTTG (SEK. ID. Č. : 8).
Primer popsaný SEK. ID. Č.: 7 modifikoval muIL2 (sekvence uvedená tučně) tak, aby mohla být připojena k muy2a v restrikčním místě Xmal (CCCGGG). Primer popsaný SEK. ID. Č.: 8 zavádí okamžitě za kodon pro terminaci translace (tučně, antikódující vlákno) restrikční místo Xhol (CTCGAG).
Obdobným způsobem byla k cDNA sekvenci muK připojena doména variabilní oblasti lehkého řetězce (VL) huKS. Použitými překrývajícími se oligonukleotidy byly:
4
4 4
4
4
4 4 * • 4444 4 4 přímý: 5'GGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTG (SEK. ID. Č.: 9) reverzní: 5' GCAGCATCAGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCC (SEK. ID.
Č.: 10) přímý: 5'CTTAAGCGAGATCGTGCTGACCCAG (SEK. ID. Č. : 11) reverzní: 5'CTCGAGCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC (SEK. ID. Č.: 12)
Tyto oligonukleotidy byly navrženy tak, aby hybridizovaly s místem spojení domény VL z huKS a cDNA kódující konstantní oblast myšího řetězce κ (kurzívou). V prvním kole PCR byly provedeny dvě amplifikačni reakce. V první reakci byla jako templát použita DNA kódující VL z huKS a oligonukleotidy popsané SEK. ID. Č.: 10 a 11. Primer popsaný SEK. ID. Č.: 11 zavádí proti směru transkripce od sekvence kódující NH2~konec maturované huKS VL (tučně) restrikční místo AflII (CTTAAG). Ve druhé reakci byla jako templát použita cDNA kódující myší řetězec κ a oligonukleotidy popsané SEK. ID. Č.: 9 a 12. Primer popsaný SEK. ID. Č.: 12 zavádí za kodon pro terminaci translace (tučně, antikódující vlákno) restrikční místo Xhol.
Produkty získané těmito dvěma amplifikačními reakcemi byly smíchány a použity při druhém kole PCR s oligonukleotidy popsanými SEK. ID. Č.: 11 a 12. Po ověření sekvence byl výsledný produkt (fragment AflII-XhoI kódující VL z huKS a konstantní oblast myšího řetězce κ) použit k ligaci s DNA kódující signální peptid ohraničený místem AflII.
K záměně lidských sekvencí byly. v konstruktu pdHL7 použity sekvence kódující jak těžký, tak lehký myší řetězec. Výsledným vektorem exprimujícím danou protilátku a jako selekční markér obsahujícím gen pro dhfr byly transfekovány (elektroporace, 0,25V a 500 pF) buňky myšího myelomu NS/0 a transfektanty byly selektovány kultivací v
9
9 9
9999 ·
• · 4 • · · • 4444 • · «444 ·
9 9 ·
·
4 • 4 · médiu obsahujícím methotrexát (0,1 μΜ) . U transfekovaných klonů rezistentních vůči methotrexátu byla standardními ELISA technikami testována sekrece protilátkových determinant. Eúzní proteiny byly postupem doporučeným výrobcem purifikovány chromatografií na Sepharóze s navázaným proteinem A.
huKS-muY2a-muIL12
Gen kódující fúzní protein huKS-muY2a-muIL12 byl připraven a exprimován způsobem v podstatě identickým s postupem popsaným v přihlášce USSN 08/986997, podané 8, prosince 1997, a publikaci Gillies a další, J. Immunol., 160:6195 až 6203, 1998. Stručně řečeno, cDNA kódující podjednotku p35 myšího IL12 byla připojena k oblasti kódující těžký řetězec huKS-muY2a (připravený dříve). Tímto vektorem byla následně transfekována buněčná linie myelomu NS/0, která již byla transfekována dříve a byla schopna exprimovat podjednotku p40 IL-12. Jinak řečeno, tato buněčná linie byla nejprve transfekována pouze samotnou podjednotkou p40 a vyselektované stabilní transfektanty s vysokou hladinou exprese byly následně použity jako recipientní buňky pro transfekci konstruktem kódujícím fúzní protein zahrnující p35 (tj. následné transfekce).
Podjednotky p35 a p40 myšího IL-12 byly izolovány PCR přístupem z mRNA připravené ze slezinných buněk aktivovaných konkavalinem A (5 pg/ml v kultivačním médiu po dobu tří dnů). Primery použitými při PCR izolaci nukleotidové sekvence kódující podjednotku p35 byly:
5'CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (SEK. ID. Č.: 13)
5'CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (SEK. ID. Č.: 14) • 9 ·
9 9 • 9 9 • «9·· • 9 • •99 9 • 9 9 · • · ···· • · · ·
9 •
·· ·
Tyto primery rovněž modifikovaly cDNA kódující p35 tak, aby mohla být zaligována jako fragment ohraničený restrikčními místy Xmal a Xhol.
Primery použitými při PCR izolaci nukleotidové sekvence kódující podjednotku p40 byly:
5'TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (SEK. ID. Č.: 15) 5'CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEK. ID. Č.: 16)
Plazmid pdHL7-huKS-muY2a-p35 byl vytvořen popsaným postupem (Gillies a další, J. Immunol. Methods, 125:191) a obsahuje gen pro selekční markér dhfr, transkripční jednotku kódující humanizovaný lehký řetězec protilátky KS a transkripční jednotku kódující myší těžký řetězec zfázovaný s podjednotkou p35 myšího IL-12. Tato fúze byla uskutečněna ligací fragmentu cDNA kódujícího podjednotku p35 ohraničeného restrikčními místy Xmal a Xhol do jedinečného místa Xmal nacházejícího se na konci exonu CH3 v genu pro myší y2a, připraveného postupem uvedeným výše. Obě transkripční jednotky, jak pro H tak pro L řetězec, obsahují na 5' konci namísto metalothioneinového promotoru (v původní práci) promotor odvozený z cytomegaloviru (CMV) a na 3' konci polyadenylační signál.
Za účelem exprese samostatné podjednotky p40 byl zkonstruován obdobný vektor (pNC-p40). Tento vektor zahrnuje gen pro selekční markér (gen pro rezistenci vůči neomycinu) a rovněž využívá CMV promotor pro zahájení transkripce. V tomto vektoru zahrnuje kódující oblast přirozenou signální sekvenci podjednotky p40 pro translokaci této podjednotky do endoplazmatického retikula a správné sestavení s fúzním proteinem. Buňky byly transfekovány (elektroporací) plazmidem pNC-p40, vysety na misky a kultivovány v selekčním médiu obsahujícím G418. V • 4 4
9
4
4 4
I 9999 9 supernatantech z jamek obsahujících klony rezistentní vůči G418 byla metodou ELISA stanovována přítomnost podjednotky p40.
Buněčná linie NS/0 exprimujicí myší p40 byla transfekována (elektroporací) expresívním vektorem pdHL7huKS-muY2a-p35 (postupem popsaným v publikaci Gillies a další, J. Immunol., 160:6195 až 6203, 1998). U transfekovaných klonů rezistentních vůči methotrexátu byla standardními metodami ELISA testována schopnost sekrece determinant protilátek a sekrece myšího IL-12. Výsledný protein byl postupem doporučeným výrobcem purifikován afinitní chromatografií na sloupci Sepharózy s navázaným proteinem A.
muEc-muEndo
Gen kódující fúzní protein muEc-muEndo byl zkonstruován a exprese byla provedena postupem v podstatě shodným s postupem uvedeným v přihlášce USSN 60/097883, podané 25. října, 1998.
Stručně řečeno, myší endostatin a myší Fc byly exprimovány ve formě fúzního proteinu muFc-muEndo. Gen pro endostatin byl amplifikován metodou PCR tak,'aby mohl být vpraven do expresívního vektoru pdCs-muFc(D4K) (Lo a další, Protein Engineering,. 11:495 až 500, 1998). Tento vektor obsahuje sekvenci Asp4-Lys rozpoznávanou enterokinázou (LaVallie a další, J. Biol. Chem., 268:23311 až 23317, 1993). Použitým přímým primerem byl primer 5'CCCCAAGCTTCATACTCATCAGGACTTTC (SEK. ID. Č.: 17), kde sekvenci kódující N-konec endostatinu (tučně) předcházela sekvence AAGCTT (restrikční místo HindlII). Použitým reverzním primerem byl primer 5'CCCCTCGAGCTATTTGGAGAAAGAGGTC (SEK. ID. Č.: 18), který byl navržen tak, aby okamžitě za C-konec endostatinu zavedl • ···· 9 kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) následovaný restrikčním místem Xhol (CTCGAG) .
Produkt amplifi kovaný PCR byl osekvenován a fragment kódující endostatin a ohraničený restrikčním! místy HindlII/Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-muFc (D4K) . Byly vyselektovány stabilní klony NS/0 exprimující muFc(D4K)~ muEndo. Exprese muFc (D4K)-muEndo byla testována metodou ELISA využívající protilátky proti muFc. Fúzní protein muFc (D4K)-muEndo byl exprimován a následně purifikován chromatografií na sloupci Sepharózy s navázaným proteinem A.
muFc-muAngio
Gen kódující fúzní protein muFc-muAngio byl zkonstruován a exprese byla provedena postupem v podstatě shodným s postupem uvedeným v přihlášce USSN 60/097883, podané 25. října, 1998.
Stručně řečeno, myší angiostatin a myší Fc byly exprimovány ve formě fúzního proteinu muFc-muAngiostatin.
Gen pro angiostatin, poskytnutý laboratoří vedenou Dr.
Judah Folkman, Childrens Hospital Boston, MA, byl amplifikován metodou PCR tak, aby mohl být vpraven do expresívního vektoru pdCs-muFc(D4K) (Lo a další, Protein Engineering, 11:495 až 500, 1998). Použitým přímým primerem byl primer 5'CCCCAAGCrFGTGTATCTGTCAGAATGTAAGCCCTCCTGTCTCTGAGCA (SEK. ID. Č. : 19), kde sekvenci kódující N-konec angiostatinu (tučně) předcházela sekvence AAGCTT (restrikční místo HindlII). Použitým reverzním primerem byl primer 5'CCCCTCGAGCTACCCTCCTGTCTCTGAGCA (SEK. ID. Č.: 20), který byl navržen tak, aby okamžitě za C-konec endostatinu zavedl kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) následovaný restrikčním místem Xhol (CTCGAG).
4
Produkt amplifikovaný PCR byl osekvenován a fragment kódující angiostatin a ohraničený restrikčními místy HindlII/Xhol byl zaligován do vektoru pdCs-muFc (D4K) . Byly vyselektovány stabilní klony NS/0 exprimujicí muFc(D4K)muAngio. Exprese muFc (D4K) -muAngio byla testována metodou ELISA využívající protilátky proti muFc. Fúzní protein muFc (D4K)-muAngio byl exprimován a následně purifikován chromatografií na sloupci Sepharózy s navázaným proteinem A.
Příklad 3
Kombinovaná terapie pro léčbu nádorů LLC-Ep využívající fúzní proteiny KS-IL2 a KS-IL12
Samicím myší C57B1/6 byly do střední části hřbetu subkutánně injikovány buňky LLC-Ep (5 x 106 na jednu myš) kultivované in vitro. Po dvou týdnech byla zvířata s hmatatelnými nádory o objemu 150 až 400 mm3 rozdělena do čtyř skupin tak, aby v každé skupině bylo rovnoměrné zastoupení nádorů různých velikostí. Pokusný zvířatům byly aplikovány následující látky: v první skupině bylo myším aplikováno samotné PBS (kontrolní skupina); ve druhé skupině byl myším aplikován samotný fúzní protein huKSmuy2a-muIL2; ve třetí skupině byl myším aplikován samotný fúzní protein huKS-muy2a-muIL12; a ve čtvrté skupině byla myším aplikována směs fúzních proteinů huKS-muy2a-muIL2 a huKS-muy2a-muILl2. Růst nádorů byl monitorován měřením jejich objemů až do doby, kdy zvířata v kontrolní skupině počala umírat a musela být usmrcena. Po změření kaliperem byl objem nádorů vypočítán podle vzorce
V = 4n/3 (0,5L x 0,5W x 0,5H), kde L označuje délku, W šiřku a H výšku nádoru.
Získané výsledky jsou shrnuty na obrázku 3. Myším byl podáván PBS (prázdné kosočtverce); samotný fúzní protein ·· « huKS-muY2a-muIL2 v množství 15 pg/den (plné čtverečky) ; fúzní protein huKS-muy2a-muIL12 v množství 10 pg/den (plné trojúhelníky); a směs fúzního proteinu huKS-muY2a-muIL2 v množství 7,5 pg/den a fúzního proteinu huKS-muY2a-muIL12 v množství 5 pg/den (křížky).
Jak je znázorněno na obrázku 3, aplikace fúzního . proteinu huKS-muY2a-muIL2 (15 pg v pěti po sobě následujících dnech) neoddělila ani nesnížila rychlost růstu nádorů LLC-Ep (plné čtverečky). U skupiny myší, kterým byl v pěti po sobě následujících dnech aplikován samotný fúzní protein huKS-muy2a-muIL12 v množství 10 pg/dávka (plné trojúhelníky), byla pozorována pouze slabá protinádorové aktivita. Nicméně u skupiny, které byly současně aplikovány oba výše zmíněné fúzní proteiny v polovičních množstvích vzhledem k původním dávkám (huKSmuY2a-muIL2 v množství 7,5 pg a huKS-muy2a-muIL12 v množství 5 pg), bylo pozorováno překvapivé zpomalení růstu nádorů (křížky). Tato skutečnost naznačuje, že tyto dva fúzní proteiny působí synergicky.
Příklad 4
Léčba využívající fúzní protein protilátka-cytokin a kombinaci angiostatinu a endostatinu
Samicím myší C57B1/6 byly do střední části hřbetu subkutánně injikovány buňky LLC-Ep (5 x 106 na myš) kultivované in vitro. Po přibližně dvou týdnech byla zvířata s hmatatelnými nádory o objemu 150 až 400 mm3 rozdělena do čtyř skupin s následujícím režimem léčby: (1) skupina, které bylo aplikováno pouze PBS; (2) skupina, které byla aplikována směs muEc-Angio a muFc-Endo; (3) skupina, které byl aplikován fúzní protein huKS-muy2amuIL2; a (4) skupina, které byl aplikován fúzní protein huKS-muY2a-muIL2 spolu se směsí muFc-Angio a muFc-Endo.
»· 4 • 44 4 4 4 4 4 4
4444 44 4 4444 · 4 ·
4 · 4 4 4 ·
4 « 4 * ·* · ·*
Pokusným zvířatům byly dané látky/směsi injikovány po dobu pěti po sobě následujících dnů.
muFc-Angio a muFc-Endo byly myším s vytvořenými nádory podávány v dávce 5 mg/kg. Denní dávka huKS-muy2a-muIL2 byla 10 pg v pěti po sobě následujících dnech. Růst nádorů byl monitorován měřeních .jejich objemů.
Bylo pozorováno, že léčba samotnou směsí muFc-Angio a muFc-Endo měla za následek zmenšení objemu nádorů LLC v průběhu dvou týdnů. Bylo nicméně rovněž pozorováno, že tato léčba není až tak účinná v kratším časovém období, například v průběhu pěti dnů. Bylo rovněž pozorováno, že aplikace samotného fúzního proteinu huKS-muY2a-muIL2 vykazuje u pokusných zvířat pouze minimální protinádorovou aktivitu. U skupiny, které byl aplikován fúzní protein huKS-muY2a-muIL2 spolu se směsí muFc-Angio a muFc-Endo, bylo nicméně pozorováno podstatné zpomalení růstu nádorů, ve srovnání se skupinami léčenými buď samotnou směsí muFcAngio a muFc-Endo nebo samotným fúzním proteinem huKSmuY2a-muIL2.
Příklad 5
Kombinovaná terapie využívající fúzní protein protilátka-cytokin a endostatin
Myším BALB/c byly do vyholených hřbetů subkutánně injikovány buňky myšího karcinomu CT26 exprimujíci lidský EpCAM (2 x 106 buněk/injekce). Jakmile dosáhly nádory velikosti 100 až 200 mm3 (po přibližně 7 až 14 dnech), byly myši rozděleny do čtyř čtyřčlenných skupin. První skupině bylo denně intravenózně aplikováno 0,2 ml PBS. Druhé skupině byl denně intravenózně aplikován muFc-muEndostatin (320 pg/myš) v PBS. Třetí skupině byl denně po dobu 5 dnů intravenózně aplikován fúzní protein huKS-huY4-huIL2 (10 pg/myš) v PBS. Čtvrté skupině byla denně po dobu 5 dnů • · · • · · · · • « • · · · *
9999 9 » intravenózně aplikována směs fúzního proteinu huKS-huy4huIL2 (10 pg/myš) a muFc-muEndo (320 pg/myš) v PBS a poté následovaly denní injekce samotným muFc-muEndo (320 pg/myš) v PBS. Objemy nádorů byly stanoveny postupem popsaným v příkladu 3.
Získané výsledky jsou shrnuty na obrázku 4. Skupina, které byl aplikován fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrem je reprezentována plnými kosočtverci, skupina injikovaná fúzním proteinem muFc-muEndo je reprezentována plnými čtverečky; skupina injikovaná fúzním proteinem huKS-muy4-huIL2 je reprezentována plnými kosočtverci a skupina injikovaná kombinací fúzního proteinu muFc-muEndo a fúzního proteinu huKS-muy4-huIL2 je reprezentována křížky.
Z obrázku 4 je patrné, že při použití kombinace fúzního proteinu protilátka-cytokin a antiangiogenního proteinu muFc-muEndo bylo dosaženo výrazně lepších výsledků než při použití těchto látek samostatně. Po 19 dnech léčby byl poměr T/C (průměrná velikost nádorů v léčené skupině/ průměrná velikost nádorů v kontrolní skupině) pro kombinovanou terapii huKS-huy4-huIL2 a muFc-muEndo 0,25, což je výrazně lepší než poměr T/C u skupiny léčené huKShuy4-huIL2 (0,31) nebo skupiny léčené muFc-muEndo (0,42).
Příklad 6
Kombinovaná terapie využívající fúzní protein protilátka-cytokin a indomethacin
Samicím myší C57B1/6 byly do střední části hřbetu subkutánně injikovány buňky LLC-Ep (2 x 106 na myš). Myši byly usmrceny, jakmile nádory dosáhly objemu 600 až 1200 mm3. Kůže na nádorech byla dezinfikována betadinem a ethanolem, nádory byly vyjmuty a nekrotická tkáň odstraněna. Suspenze nádorových buněk ve fyziologickém
4 4
4 4 4 4 *
4 4 4 4 4 4
44444· 444·· • 4 4 · 4
4 4 4 » ·· ♦ • 4
4> · roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem byla připravena protlačením nádorové tkáně přes sítko a následným protažením injekčními jehlami o zmenšujících se průměrech (22 až 30 G). Koncentrace buněk byla upravena na hodnotu 1 x 107 buněk/ml a buňky byly umístěny na led. Následně byla myším C57BL/6 do střední části hřbetu subkutánně injikována. 0,1 ml čerstvě rozsuspendovaných buněk (1 x 106 buněk/myš).
Jakmile dosáhly nádory velikosti 100 až 200 mm3 (po přibližně 7 až 14 dnech), byly myši rozděleny do čtyř pětičlenných skupin. První skupině bylo denně intravenózně aplikováno 0,2 ml PBS. Druhé skupině byl denně po dobu 5 dnů intravenózně aplikován huKS-huy4-huIL2 (25 pg/myš) v PBS. Třetí skupině byl po celou dobu experimentu orálně (v pitné vodě) podáván indomethacin (20 pg/ml, nebo přibližně 60 až 70 pg indomethacinu na myš denně). Čtvrté skupině byl denně po dobu 5 dnů intravenózně aplikován huKS-huy4-huIL2 (25 pg/myš) a po celou dobu experimentu orálně (v pitné vodě) indomethacin (20 pg/ml). Objemy nádorů byly stanoveny postupem popsaným v příkladu 3.
Získané výsledky jsou shrnuty na obrázku 5. Skupina, které byl aplikován fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrem je reprezentována plnými kosočtverci, skupina injikovaná fúzním proteinem huKS-huy4-huIL2 je reprezentována plnými čtverečky, skupina orálně přijímající indomethacin je reprezentována plnými trojúhelníky a skupina léčená kombinací fúzního proteinu huKS-huy4-huIL2 a indomethacinu je reprezentována křížky.
Z obrázku 5 je patrné, že při použití kombinace fúzního proteinu protilátka-cytokin a antiangiogenní sloučeniny indomethacinu bylo dosaženo výrazně lepších výsledků než při použití těchto látek samostatně. Po 22 dnech léčby byl poměr T/C pro kombinovanou terapii huKS-huy4-huIL2 a indomethacinem 0,40, což je výrazně lepší než poměr T/C u • 9 · ····
9
9 9 9 ·
9* « skupiny léčené huKS--huy4-huIL2 (0,61) nebo skupiny léčené indomethacinem (0,60).
Předkládaný vynález může být, bez odchýlení se od své podstaty nebo základních charakteristik, aplikován i jinými než popsanými způsoby. Příklady provedení vynálezu uvedené v předchozích textu by tudíž měly být považovány za toliko ilustrativní a ne jakýmkoliv způsobem limitující rozsah vynálezu. Rozsah vynálezu je tudíž definován především připojenými patentovými nároky a ne uvedeným popisem a veškeré změny, které jsou ekvivalentní údajům popsaným patentovými nároky spadají rovněž do rozsahu vynálezu.
Všechny patentové přihlášky a vědecké publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Claims (27)
1. Použití kompozice pro výrobu léčiva pro indukci cytocidní imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk v organismu savce, kterýžto způsob zahrnuje podání savci:
(i) imunokonjugátu zahrnujícího protilátkové vazebné místo schopné vázat se na zvolený typ buněk a cytokin schopný indukovat cytocidní imunitní odpověď vůči zvolenému typu buněk; a (ii) inhibitor angiogeneze.
2. Použití podle nároku 1, kde zvoleným typem buňky je nádorová buňka.
3. Použití podle nároku 1, kde zvoleným typem buňky je buňka infikovaná virem.
4. Použití podle nároku 1, kde inhibitor angiogeneze se podává spolu s imunokonjugátem.
/
5. Použití podle nároku 1, kde inhibitor angiogeneze se podává před podáním imunokonjugátu.
6. Použití podle nároku 1, kde protilátkové vazebné místo obsahuje ve směru od aminového konce ke karboxylovému konci variabilní oblast imunoglobulinů, doménu CH1 a doménu CH2.
7. Použití podle nároku 6, kde protilátkové vazebné místo dále zahrnuje doménu CH3 připojenou ke karboxylovému konci domény CH2.
8. Použití podle nároku 1, kde imunokonjugátem je fúzní protein zahrnující ve směru od aminového konce ke karboxylovému konci: (i) protilátkové vazebné místo zahrnující variabilní doménu imunoglobulinů schopnou vázat povrchový • · buněčný antigen na zvoleném typu buněk, imunoglobulinovou doménu CH1, imunoglobulinovou doménu CH2; a (ii) cytokin.
9. Použití podle nároku 8, kde protilátkové vazebné místo dále zahrnuje doménu CH3 umístěnou mezi doménou CH2 a cytokinem.
10. Použití podle nároku 1, kde cytokin v imunokonjugátu je vybrán ze skupiny sestávající z tumor nekrotizujíčího faktoru, interleukinu, faktoru stimulujícího kolonie a lymfokinu.
11. Použití podle nároku 1, kde inhibitor angiogeneze je vybrán ze skupiny sestávající z endostatinu, angiostatinu, peptidu s vazebnou afinitou k integrinu «νβ3, protilátky s vazebnou afinitou k integrinu ανβ3, peptidu s vazebnou afinitou k receptoru pro epidermální růstový faktor (EGF), protilátky s vazebnou afinitou k receptoru pro EGF, inhibitoru C0X-2-fumagilinu, thalidomidu, antiangiogenního cytokinu a fúzního proteinu s cytokinem.
12. Použití kompozice pro výrobu léčiva pro indukci cytocidní imunitní odpovědi vůči rakovinným buňkám v organismu savce, kterýžto způsob zahrnuje podání savci:
(i) imunokonjugátu zahrnujícího protilátkové vazebné místo schopné vázat se rakovinnou buňku a cytokin schopný indukovat cytocidní imunitní odpověď vůči rakovinné buňce;
(ii) inhibitoru angiogeneze, vybraného ze souboru sestávajícího z endostatinu a angiostatinu.
13. Použití podle nároku 12, kde inhibitor angiogeneze se podává spolu s imunokonjugátem.
14. Použití podle nároku 12, kde inhibitor angiogeneze se podává před podáním imunokonjugátu.
4 4 4 • 44
15. Použití podle nároku 12, kde protilátkové vazebné místo obsahuje ve směru od aminového konce ke karboxylovému konci variabilní oblast imunoglobulinu, doménu CH1 a doménu CH2.
16. Použití podle nároku 15, kde protilátkové vazebné místo dále zahrnuje doménu CH3 připojenou ke karboxylovému konci domény CH2.
17. Použití podle nároku 12, kde imunokonjugátem je fúzní protein zahrnující ve směru od aminového konce ke karboxylovému konci: (i) protilátkové vazebné místo zahrnující variabilní doménu imunoglobulinu schopnou vázat povrchový buněčný antigen na zvoleném typu buněk, imunoglobulinovou doménu CH1, imunoglobulinovou doménu CH2; a (ii) cytokin.
18. Použití podle nároku 17, kde protilátkové vazebné místo dále zahrnuje doménu CH3 umístěnou mezi doménou CH2 a cytokinem.
19. Použití podle nároku 12, kde cytokin v imunokonjugátu je vybrán ze skupiny sestávající z tumor nekrotizujícího faktoru, interleukinu, faktoru stimulujícího kolonie a lymfokinu.
20. Kompozice pro indukci imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk v organismu savce, vyznačující se tím, že zahrnuje kombinaci: (i) imunokonjugátu zahrnujícího protilátkové vazebné místo schopné vázat se na zvolený typ buněk a cytokin schopný indukovat imunitní odpověd vůči zvolenému typu buněk v organismu savce; a (ii) inhibitoru angiogeneze v množství dostačujícím k posílení indukované imunitní odpovědi ve srovnání s imunitní odpovědí indukovanou samotným imunokonjugátem.
21. Kompozice podle nároku 20, vyznačující se t í m , že protilátkové vazebné místo obsahuje ve směru od aminového konce ke karboxylovému konci variabilní oblast imunoglobulinů, doménu CH1 a doménu CH2.
22. Kompozice podle nároku 21, vyznačující se t í m , že protilátkové vazebné místo dále zahrnuje doménu CH3 připojenou ke karboxylovému konci domény CH2.
23. Kompozice podle nároku 20, vyznačující se t í m , že imunokon jugá tem je fúzní protein zahrnující ve směru od aminového konce ke karboxylovému konci: (i) protilátkové vazebné místo zahrnující variabilní doménu imunoglobulinů schopnou vázat povrchový buněčný antigen na zvoleném typu buněk, imunoglobulinovou doménu CH1, imunoglobulinovou doménu CH2; a (ii) cytokin.
24. Kompozice podle nároku 23, vyznačující se t i m , že protilátkové vazebné místo dále zahrnuje doménu CH3 umístěnou mezi doménou CH2 a cytokinem.
25. Kompozice podle nároku 20, vyznačující se t i m , že cytokin v imunokonjugátu je vybrán ze skupiny sestávající z tumor nekrotizujíčího faktoru, interleukinu, faktoru stimulujícího kolonie a lymfokinu.
26. Kompozice podle nároku 20, vyznačující se t í m , že inhibitor angiogeneze je vybrán ze skupiny sestávající z endostatinu, angiostatinu, peptidu s vazebnou afinitou k integrinu ανβ3, protilátky s vazebnou afinitou k integrinu ανβ3, peptidu s vazebnou afinitou k receptoru pro epidermální růstový faktor (EGF), protilátky s vazebnou afinitou k receptoru pro EGF, inhibitoru C0X-2-fumagilinu, thalidomidu, antiangiogenního cytokinu a fúzního proteinu s cytokinem.
27. Kompozice podle nároku 20, vyznačující se t í m , že zvoleným typem buněk jsou rakovinné buňky tr
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8186398P | 1998-04-15 | 1998-04-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20003767A3 true CZ20003767A3 (cs) | 2002-01-16 |
Family
ID=22166892
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20003767A CZ20003767A3 (cs) | 1998-04-15 | 1999-04-15 | Kompozice pro indukci imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buňek v organismu savce a její pouľití pro výrobu léčiva |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040180035A1 (cs) |
| EP (1) | EP1071468B1 (cs) |
| JP (1) | JP2002511432A (cs) |
| CN (1) | CN1318092C (cs) |
| AT (1) | ATE329622T1 (cs) |
| AU (1) | AU758860B2 (cs) |
| BR (1) | BR9909583A (cs) |
| CA (1) | CA2328076C (cs) |
| CZ (1) | CZ20003767A3 (cs) |
| DE (1) | DE69931908T2 (cs) |
| ES (1) | ES2267263T3 (cs) |
| HK (1) | HK1038882A1 (cs) |
| HU (1) | HUP0101352A3 (cs) |
| MX (1) | MXPA00010070A (cs) |
| NO (1) | NO20005155L (cs) |
| PL (1) | PL343462A1 (cs) |
| RU (1) | RU2229305C2 (cs) |
| WO (1) | WO1999052562A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200005475B (cs) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1037927B1 (en) | 1997-12-08 | 2004-05-19 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
| US20030105294A1 (en) * | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
| DE69942207D1 (de) * | 1998-08-25 | 2010-05-12 | Merck Patent Gmbh | Expression und export von angiostatin und endostatin als immunofusins |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| MXPA02001417A (es) * | 1999-08-09 | 2002-08-12 | Lexigen Pharm Corp | Complejos multiples de citosina-anticuerpo. |
| ES2311507T3 (es) | 2000-02-10 | 2009-02-16 | MASSACHUSETTS EYE & EAR INFIRMARY | Terapia fotodinamica para tratamiento de afecciones oftalmicas. |
| ES2269366T3 (es) | 2000-02-11 | 2007-04-01 | Merck Patent Gmbh | Mejoramiento de la vida media en circulacion de proteinas de fusion basadas en anticuerpos. |
| DE60129695T2 (de) * | 2000-06-29 | 2008-06-05 | Merck Patent Gmbh | Steigerung von durch antikörper-zytokin-fusionsproteine mediierten immunantworten durch eine kombinierte behandlung mit mitteln zur erhöhung der immunzytokinaufnahme |
| US6911204B2 (en) | 2000-08-11 | 2005-06-28 | Favrille, Inc. | Method and composition for altering a B cell mediated pathology |
| CN1330664C (zh) | 2001-03-07 | 2007-08-08 | 默克专利有限公司 | 用于含杂合同种型抗体部分的蛋白质的表达技术 |
| US6992174B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| CN100503639C (zh) | 2001-05-03 | 2009-06-24 | 默克专利有限公司 | 重组肿瘤特异性抗体及其应用 |
| MXPA04005266A (es) | 2001-12-04 | 2004-10-11 | Merck Patent Gmbh | Inmunocitocinas con selectividad modulada. |
| EP2075256A2 (en) | 2002-01-14 | 2009-07-01 | William Herman | Multispecific binding molecules |
| US20050069521A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins |
| WO2005063820A2 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-14 | Merck Patent Gmbh | Il-7 fusion proteins |
| DK1699821T3 (da) * | 2003-12-31 | 2012-07-16 | Merck Patent Gmbh | Fc-ERYTHROPOIETIN-FUSIONSPROTEIN MED FORBEDREDE FARMAKOKINETIKKER |
| CA2552590A1 (en) | 2004-01-05 | 2005-07-21 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin |
| WO2005070967A2 (en) * | 2004-01-22 | 2005-08-04 | Merck Patent Gmbh | Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation |
| US7670595B2 (en) * | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
| US7589179B2 (en) * | 2004-12-09 | 2009-09-15 | Merck Patent Gmbh | IL-7 variants with reduced immunogenicity |
| TW200732472A (en) * | 2005-10-21 | 2007-09-01 | Hoffmann La Roche | Method for the recombinant expression of a polypeptide |
| PT2270050E (pt) | 2005-12-30 | 2013-09-12 | Merck Patent Gmbh | Anticorpos anti-cd19 com imunogenicidade reduzida |
| ES2384055T3 (es) | 2005-12-30 | 2012-06-28 | Merck Patent Gmbh | Variantes de la interleucina-12p40 con estabilidad mejorada |
| GB2441789B (en) * | 2006-09-18 | 2012-03-28 | Angus Buchan Gordon | Use of a Tumour Volume Measuring Device |
| CA2759333A1 (en) | 2009-04-22 | 2010-10-28 | Merck Patent Gmbh | Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites |
| EP2561888A1 (en) * | 2011-08-23 | 2013-02-27 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Protein comprising NC-1 for treating angiogenesis-related diseases |
| GB201403775D0 (en) | 2014-03-04 | 2014-04-16 | Kymab Ltd | Antibodies, uses & methods |
| CN104830901A (zh) * | 2015-01-21 | 2015-08-12 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种鼠肿瘤模型的构建方法及其应用 |
| US9567399B1 (en) | 2016-06-20 | 2017-02-14 | Kymab Limited | Antibodies and immunocytokines |
| EP3534947A1 (en) | 2016-11-03 | 2019-09-11 | Kymab Limited | Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods |
| EP3675892A4 (en) | 2017-07-03 | 2021-10-06 | Torque Therapeutics, Inc. | IMMUNOSTIMULATORY FUSION MOLECULES AND THEIR USES |
Family Cites Families (94)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4196265A (en) * | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
| US4469797A (en) * | 1982-09-23 | 1984-09-04 | Miles Laboratories, Inc. | Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives |
| US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| KR850004274A (ko) * | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
| US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| US5807715A (en) * | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
| US5643565A (en) * | 1985-09-20 | 1997-07-01 | Chiron Corporation | Human IL-2 as a vaccine adjuvant |
| US4676980A (en) * | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
| US4935233A (en) * | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
| US5359035A (en) * | 1985-12-21 | 1994-10-25 | Hoechst Aktiengesellschaft | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) |
| US5225539A (en) * | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| US4946778A (en) * | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| US5508031A (en) * | 1986-11-21 | 1996-04-16 | Cetus Oncology Corporation | Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2 |
| US5019368A (en) * | 1989-02-23 | 1991-05-28 | Cancer Biologics, Inc. | Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy |
| WO1988007089A1 (en) * | 1987-03-18 | 1988-09-22 | Medical Research Council | Altered antibodies |
| JP3040121B2 (ja) * | 1988-01-12 | 2000-05-08 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法 |
| US5120525A (en) * | 1988-03-29 | 1992-06-09 | Immunomedics, Inc. | Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer |
| US5601819A (en) * | 1988-08-11 | 1997-02-11 | The General Hospital Corporation | Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| US6750329B1 (en) * | 1989-05-05 | 2004-06-15 | Research Development Foundation | Antibody delivery system for biological response modifiers |
| US6291158B1 (en) * | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for tapping the immunological repertoire |
| DE69019609T2 (de) * | 1989-07-07 | 1995-11-30 | Takeda Chemical Industries Ltd | Proteine und deren Herstellung. |
| US5856298A (en) * | 1989-10-13 | 1999-01-05 | Amgen Inc. | Erythropoietin isoforms |
| US5314995A (en) * | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
| US5349053A (en) * | 1990-06-01 | 1994-09-20 | Protein Design Labs, Inc. | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses |
| WO1992002240A2 (en) * | 1990-07-27 | 1992-02-20 | Repligen Corporation | Novel methods and compositions for treatment of angiogenic diseases |
| US5650150A (en) * | 1990-11-09 | 1997-07-22 | Gillies; Stephen D. | Recombinant antibody cytokine fusion proteins |
| JPH09506761A (ja) * | 1990-11-09 | 1997-07-08 | ステファン ディー．ギリーズ | サイトカインの免疫複合体 |
| US5709859A (en) * | 1991-01-24 | 1998-01-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Mixed specificity fusion proteins |
| US5199942A (en) * | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
| US20020037558A1 (en) * | 1991-10-23 | 2002-03-28 | Kin-Ming Lo | E.coli produced immunoglobulin constructs |
| US6627615B1 (en) * | 1991-12-17 | 2003-09-30 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for in vivo gene therapy |
| EP0615451B1 (en) * | 1992-05-26 | 2005-12-07 | Immunex Corporation | Novel cytokine that binds cd30 |
| US5614184A (en) * | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
| WO1994009820A1 (en) * | 1992-11-05 | 1994-05-11 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Prostate-specific membrane antigen |
| US5738849A (en) * | 1992-11-24 | 1998-04-14 | G. D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them |
| US5543297A (en) * | 1992-12-22 | 1996-08-06 | Merck Frosst Canada, Inc. | Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity |
| US6096331A (en) * | 1993-02-22 | 2000-08-01 | Vivorx Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents |
| US5759551A (en) * | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| HUT73876A (en) * | 1993-04-29 | 1996-10-28 | Abbott Lab | Erythropoietin analog compositions and methods |
| CA2125763C (en) * | 1993-07-02 | 2007-08-28 | Maurice Kent Gately | P40 homodimer of interleukin-12 |
| EP0758390B1 (en) * | 1994-04-26 | 2007-02-28 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin and method of use for inhibition of angiogenesis |
| US5639725A (en) * | 1994-04-26 | 1997-06-17 | Children's Hospital Medical Center Corp. | Angiostatin protein |
| CU22615A1 (es) * | 1994-06-30 | 2000-02-10 | Centro Inmunologia Molecular | Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos |
| US6429199B1 (en) * | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
| US5888773A (en) * | 1994-08-17 | 1999-03-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing single-chain Fv molecules |
| US5541087A (en) * | 1994-09-14 | 1996-07-30 | Fuji Immunopharmaceuticals Corporation | Expression and export technology of proteins as immunofusins |
| EP0706799B1 (en) * | 1994-09-16 | 2001-11-14 | MERCK PATENT GmbH | Immunoconjugates II |
| US6485726B1 (en) * | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
| US6086875A (en) * | 1995-01-17 | 2000-07-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of immunogens |
| US5552524A (en) * | 1995-01-31 | 1996-09-03 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5891680A (en) * | 1995-02-08 | 1999-04-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12 |
| WO1996028548A1 (en) * | 1995-03-10 | 1996-09-19 | Genentech, Inc. | Receptor activation by gas6 |
| US5719266A (en) * | 1995-03-17 | 1998-02-17 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| CA2225454A1 (en) * | 1995-06-30 | 1997-01-23 | Thomas Wesley Stephens | Methods for treating diabetes |
| US6406689B1 (en) * | 1995-10-03 | 2002-06-18 | Frank W. Falkenberg | Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases |
| DE69629826T2 (de) * | 1995-10-23 | 2004-07-01 | Children's Medical Center Corp., Boston | Therapeutische antiangiogenische zusammensetzungen und verfahren |
| US6620413B1 (en) * | 1995-12-27 | 2003-09-16 | Genentech, Inc. | OB protein-polymer chimeras |
| US6080409A (en) * | 1995-12-28 | 2000-06-27 | Dendreon Corporation | Immunostimulatory method |
| US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
| US6750334B1 (en) * | 1996-02-02 | 2004-06-15 | Repligen Corporation | CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor |
| CN1136197C (zh) * | 1996-05-30 | 2004-01-28 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 新的哒嗪酮衍生物 |
| US5922685A (en) * | 1996-06-05 | 1999-07-13 | Powderject Vaccines, Inc. | IL-12 gene therapy of tumors |
| CA2258593A1 (en) * | 1996-07-02 | 1998-01-08 | Abraham Nudelman | Retinoyloxy(substituted)alkylene butyrates useful for the treatment of cancer and other proliferative diseases |
| ES2176574T3 (es) * | 1996-09-03 | 2002-12-01 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Utilizacion de anticuerpos bi y triespecificos para la induccion de inmunidad tumoral. |
| US6100387A (en) * | 1997-02-28 | 2000-08-08 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric polypeptides containing chemokine domains |
| US6277375B1 (en) * | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
| DE69808609T2 (de) * | 1997-04-11 | 2003-06-12 | Searle & Co | Antagonistische anti-avb3 integrin antikörper |
| EP1037927B1 (en) * | 1997-12-08 | 2004-05-19 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
| US20030105294A1 (en) * | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
| CA2328081A1 (en) * | 1998-04-17 | 1999-10-28 | Lexigen Pharmaceuticals Corporation | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor |
| WO1999054484A1 (en) * | 1998-04-20 | 1999-10-28 | The Regents Of The University Of California | Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof |
| US6620382B1 (en) * | 1998-05-22 | 2003-09-16 | Biopheresis Technologies, Llc. | Method and compositions for treatment of cancers |
| DE69942207D1 (de) * | 1998-08-25 | 2010-05-12 | Merck Patent Gmbh | Expression und export von angiostatin und endostatin als immunofusins |
| US6335176B1 (en) * | 1998-10-16 | 2002-01-01 | Pharmacopeia, Inc. | Incorporation of phosphorylation sites |
| BR0007414A (pt) * | 1999-01-07 | 2001-10-16 | Lexigen Pharm Corp | Expressão e exportação de proteìnas antiobesidade como proteìnas de fusão fc |
| US6348192B1 (en) * | 1999-05-11 | 2002-02-19 | Bayer Corporation | Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells |
| DE60035871T2 (de) * | 1999-05-19 | 2008-06-05 | Merck Patent Gmbh | Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine |
| CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
| PE20010288A1 (es) * | 1999-07-02 | 2001-03-07 | Hoffmann La Roche | Derivados de eritropoyetina |
| MXPA02001417A (es) * | 1999-08-09 | 2002-08-12 | Lexigen Pharm Corp | Complejos multiples de citosina-anticuerpo. |
| US6586398B1 (en) * | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
| JP2004528001A (ja) * | 2000-05-12 | 2004-09-16 | ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド | インビトロにおけるフコシル化組換えグリコペプチド |
| DE60129695T2 (de) * | 2000-06-29 | 2008-06-05 | Merck Patent Gmbh | Steigerung von durch antikörper-zytokin-fusionsproteine mediierten immunantworten durch eine kombinierte behandlung mit mitteln zur erhöhung der immunzytokinaufnahme |
| MXPA03006294A (es) * | 2001-01-18 | 2003-09-16 | Merck Patent Gmbh | Proteinas de fusion disfuncionales con actividad glucocerebrosidasa. |
| KR100899970B1 (ko) * | 2001-02-19 | 2009-05-28 | 메르크 파텐트 게엠베하 | Ｔ-세포 에피토프의 동정 방법 및 감소된 면역원성을 갖는분자의 제조를 위한 용도 |
| US7189830B2 (en) * | 2001-02-19 | 2007-03-13 | Merck Patent Gmbh | Anti-KSA/IL-2 fusion proteins with reduced immunogenicity |
| CN1330664C (zh) * | 2001-03-07 | 2007-08-08 | 默克专利有限公司 | 用于含杂合同种型抗体部分的蛋白质的表达技术 |
| US6992174B2 (en) * | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| CN100503639C (zh) * | 2001-05-03 | 2009-06-24 | 默克专利有限公司 | 重组肿瘤特异性抗体及其应用 |
| MXPA04005266A (es) * | 2001-12-04 | 2004-10-11 | Merck Patent Gmbh | Inmunocitocinas con selectividad modulada. |
| US20050069521A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins |
-
1999
- 1999-04-15 CA CA002328076A patent/CA2328076C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-15 DE DE69931908T patent/DE69931908T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 WO PCT/US1999/008335 patent/WO1999052562A2/en active IP Right Grant
- 1999-04-15 CZ CZ20003767A patent/CZ20003767A3/cs unknown
- 1999-04-15 JP JP2000543172A patent/JP2002511432A/ja not_active Withdrawn
- 1999-04-15 CN CNB998072494A patent/CN1318092C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-15 AT AT99917558T patent/ATE329622T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-04-15 BR BR9909583-1A patent/BR9909583A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-04-15 PL PL99343462A patent/PL343462A1/xx unknown
- 1999-04-15 AU AU35650/99A patent/AU758860B2/en not_active Ceased
- 1999-04-15 HU HU0101352A patent/HUP0101352A3/hu unknown
- 1999-04-15 RU RU2000125521/15A patent/RU2229305C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-04-15 EP EP99917558A patent/EP1071468B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 ES ES99917558T patent/ES2267263T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-15 MX MXPA00010070A patent/MXPA00010070A/es active IP Right Grant
-
2000
- 2000-10-06 ZA ZA200005475A patent/ZA200005475B/xx unknown
- 2000-10-13 NO NO20005155A patent/NO20005155L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-01-21 HK HK02100466.3A patent/HK1038882A1/zh unknown
-
2003
- 2003-11-14 US US10/714,165 patent/US20040180035A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0101352A2 (hu) | 2001-08-28 |
| HK1038882A1 (zh) | 2002-04-04 |
| DE69931908D1 (de) | 2006-07-27 |
| NO20005155D0 (no) | 2000-10-13 |
| WO1999052562A2 (en) | 1999-10-21 |
| HUP0101352A3 (en) | 2003-08-28 |
| CA2328076A1 (en) | 1999-10-21 |
| US20040180035A1 (en) | 2004-09-16 |
| AU3565099A (en) | 1999-11-01 |
| EP1071468B1 (en) | 2006-06-14 |
| ATE329622T1 (de) | 2006-07-15 |
| WO1999052562A3 (en) | 1999-11-18 |
| MXPA00010070A (es) | 2004-03-10 |
| EP1071468A2 (en) | 2001-01-31 |
| AU758860B2 (en) | 2003-04-03 |
| RU2229305C2 (ru) | 2004-05-27 |
| NO20005155L (no) | 2000-12-13 |
| CA2328076C (en) | 2009-10-06 |
| CN1318092C (zh) | 2007-05-30 |
| PL343462A1 (en) | 2001-08-13 |
| JP2002511432A (ja) | 2002-04-16 |
| DE69931908T2 (de) | 2007-01-11 |
| BR9909583A (pt) | 2002-01-15 |
| CN1305386A (zh) | 2001-07-25 |
| ZA200005475B (en) | 2001-11-13 |
| ES2267263T3 (es) | 2007-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20003767A3 (cs) | Kompozice pro indukci imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buňek v organismu savce a její pouľití pro výrobu léčiva | |
| CZ20003817A3 (cs) | Léčivo pro indukci cytocidní imunitní odpovědi | |
| AU2001271729B2 (en) | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents | |
| AU2001271729A1 (en) | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents | |
| RU2129018C1 (ru) | Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция | |
| US20050063948A1 (en) | Methods for targeting interleukin-12 to malignant endothelium | |
| EP3660039A1 (en) | Il2 immunoconjugates |