PT2270050E

PT2270050E - Anticorpos anti-cd19 com imunogenicidade reduzida

Info

Publication number: PT2270050E
Application number: PT100080563T
Authority: PT
Inventors: Michael Super; Jonathan H Davis; Pascal Andre Stein
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2013-09-12
Also published as: PT1966245E; EP1966245A1; US8957195B2; US20070154473A1; CA2635623A1; CN101351477B; EP1966245B1; EP2270050A1; US20190241671A1; BRPI0620795A2; CA2635623C; KR20080090485A; JP2016014039A; DK2270050T3; US10072092B2; EA200870132A1; US11208496B2; JP2009521912A; US20140288288A1; EA016429B1

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS ANTI-CD19 COM IMUNOGENICIDADE REDUZIDA" Âmbito da invenção A invenção relaciona-se geralmente com regiões variáveis da cadeia leve e de cadeia pesada do anticorpo B4 monoclonal de murino anti-CD19 modificadas para reduzir a sua imunogenicidade e seu uso para o tratamento de linfoma em combinação com agentes quimioterapêuticos.

Antecedentes 0 CD19 é uma proteína de superfície encontrada nas células B e em certas células cancerígenas derivadas das células B, tais como muitos linfomas de células B. Os anticorpos anti-CD19 monoclonais têm sido gerados em ratinhos, e mostram-se algo promissores em modelos animais pré-clínicos de cancros derivados de células B. No entanto, os anticorpos derivados de rato são geralmente imunogénicos em humanos. Várias estratégias têm sido desenvolvidas para alterar anticorpos derivados de rato para minimizar a sua homogeneidade em humanos. Uma tal estratégia, a quimerização, envolve a fusão de regiões variáveis de ratinho com regiões constantes humanas. No entanto, as sequências das regiões variáveis derivadas de ratinho restantes depois da quimerização serão frequentemente imunogénicas. Outra dessas estratégias, a humanização, envolve a substituição das regiões da estrutura (FRs) derivadas de rato nas regiões variáveis com as sequências derivadas de humanos mais estreitamente relacionadas, com a reversão opcional de certos aminoácidos de volta para os correspondentes aminoácidos de rato com vista a manter a atividade de 2 ligação. No entanto, mesmo os anticorpos humanizados podem ser imunogénicos, uma vez que as regiões de determinação de complementaridade do anticorpo (CDRs) geralmente contêm epitopos de células B e epitopos de células T que não são os deles. De facto, mesmo anticorpos totalmente humanos são imunogénicos; isto é a base para a formação de anticorpos anti-idiotipo durante o decurso de uma resposta imunológica. Todos estes problemas podem ser aplicados aos anticorpos anti CD 19 derivados de ratinhos como fariam com qualquer outro tipo de anticorpo. Portanto, há a necessidade de anticorpos anti-CD19 com imunogenicidade reduzida.

Sumário da invenção A presente invenção é dirigida para um anticorpo B4 monoclonal de murino anti-CD 19 o qual foi modificado para reduzir a sua imunogenicidade em comparação com o anticorpo B4 do tipo selvagem como definido nas reivindicações. Mais especificamente, a região variável do anticorpo B4 da invenção é modificada para remover potenciais epitopos de células T. Como resultado, o anticorpo B4 da invenção melhorou as propriedades biológicas em comparação com os anticorpos B4 do tipo selvagem. A região da estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina não modificada, tem os resíduos de aminoácidos como especificado na SEQ ID NO: 13. A região da estrutura da cadeia leve de imunoglobulina não modificada tem os resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.

A invenção apresenta uma região variável de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO: 17, e, SEQ ID 3 NO: 29, em que a região variável do anticorpo se liga especificamente ao CD19.

Especificamente, a invenção relaciona-se com um método de tratamento de um doente que sofre de doenças de linfoma, o método compreendendo o passo de administrar a quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido de acordo com qualquer das formas de realização da invenção a um doente, em combinação com agentes de cromatografia específicos.

Em resumo a invenção relaciona-se com um anticorpo B4 manipulado e modificado compreendendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 29 para uso para o tratamento de doença de linfoma disseminada em combinação com um agente quimioterapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em ciclofosfamida, vincristina e doxorubicina, ou para uso para o tratamento do linfoma de Burkitt em combinação com ciclofosfamida.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 representa a sequência de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia pesada do anticorpo B4 (B4 VHO) (SEQ ID NO:1).

Figura 2 representa a sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar incorporando codões para as mutações Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A, e V93T (B4 VHv4) (SEQ ID NO:5). 4

Figura 3 representa a sequência de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia pesada do anticorpo B4 (B4 VKO) (SEQ ID NO:8).

Figura 4 representa a sequência de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia leve de um anticorpo B4 exemplar incorporando codões para as mutações I10T, Mil L, V19A, S51D, e L53T (B4 VKv4) (SEQ ID N0:12).

Figura 5 representa a sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada de um anticorpo B4 (B4 VHO) (SEQ ID NO:13).

Figura 6 representa a sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada de um anticorpo B4 exemplar com as mutações Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A, e V93T (B4 VHv4) (SEQ ID N0:17).

Figura 7 representa a sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve do anticorpo B4 (B4 VKO) (SEQ ID NO:25).

Figura 8 representa a sequência de aminoácido da região

variável da cadeia leve de um anticorpo B4 exemplar com as mutações I10T, M11L, V19A, S51D, e L53T (B4 VKv4) (SEQ ID NO: 2 9) .

Figura 9 representa a sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada do anticorpo B4. As regiões de determinação de complementaridade são sublinhadas. Os residuos de aminoácidos modificáveis são mostrados a negrito.

Figura 10 representa a sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve do anticorpo B4. As regiões de 5 determinação de complementaridade estão sublinhadas. Os residuos de aminoácidos modificáveis estão indicados a negrito.

Figura 11 é um alinhamento da sequência de aminoácido das regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo B4 VHO (SEQ ID NO:13), VHvl (SEQ ID NO:14), VHv2 (SEQ ID NO:15), VHv3 (SEQ ID NO:16), VHv4 (SEQ ID NO:17), VHv5 (SEQ ID NO: 18), VHvl1 (SEQ ID NO:20), e VHv34 (SEQ ID NO:21).

Figura 12 é um alinhamento da sequência de aminoácido das regiões variável da cadeia leve do anticorpo B4 VKO (SEQ ID NO:25), VKvl (SEQ ID NO:26), VKv2 (SEQ ID NO:27), VKv3 (SEQ ID NO:28) , VKv4 (SEQ ID NO:29), VKvll (SEQ ID NO: 30), e VKv34 (SEQ ID NO:31).

Figura 13 mostra os resultados de um ensaio de ADCC em células de linfoma de Daudi Burkitt realizado com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 expressado ou a partir de células HEK 293T (triângulos vazios) ou a partir de células YB2/0 (triângulos a cheio), e anticorpo B4 VHv5/VKv4 expressados a partir de uma linha de células NS/0 (circulos vazios) ou a partir de células YB2/0 (circulos a cheio) como descrito no Exemplo 4.

Figura 14 mostra os resultados do tratamento de ratinhos transplantados com PBMCs humanos tratados ou com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 da invenção (barras a tracejado), anticorpo Leu 16 (barras brancas) ou PBS (barras pretas) como descrito no Exemplo 5.

Figura 15 mostra os resultados do tratamento de ratinhos carregando células de linfoma de Namalwa tratados ou com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 da invenção (circulos vazios) ou PBS (estrelas) como descrito no Exemplo 6 6

Figura 16 mostra os resultados do tratamento de ratinhos carregando células de linfoma de Daudi Burkitt tratados ou com anticorpo B4 VHv4/VKv4 da invenção (triângulos vazios), ciclofosfamida (quadrados vazios), uma combinação do anticorpo B4 VHv4/VKv4 e ciclofosfamida (círculos vazios), ou PBS (estrelas) como descrito no exemplo 7.

Figura 17 mostra os resultados do tratamento de ratinhos carregando células de linfoma de Namalwa com um anticorpo da invenção combinado com vários agentes de quimioterapia, como descrito no Exemplo 8. Na Figura 17 (a) os tratamentos são ciclofosfamida (quadrados vazios), o anticorpo B4 VHv4/VKv4 (X) , uma combinação do anticorpo B4 VHv4/VKv4 e ciclofosfamida (quadrados a cheio), ou PBS (estrelas). Na Figura 17(b) os tratamentos são vincristina (triângulos vazios), o anticorpo B4 VHv4/VKv4 (X) , uma combinação do anticorpo B4 VHv4/VKv4 e vincristina (triângulos a cheio), ou PBS (estrelas) . Na Figura 17 (c) os tratamentos são doxorubicina (círculos vazios), o anticorpo B4 VHv4/VKv4 (X), uma combinação do anticorpo B4 VHv4/VKv4 e doxorubicina (círculos a cheio), ou PBS (estrelas) .

Descrição Pormenorizada da invenção A invenção fornece mutações num anticorpo B4 que têm o efeito de reduzir a imunogenicidade do próprio anticorpo B4, primeiramente removendo os epitopos das células T dentro do B4 que podem estimular uma resposta imunológica. A presente invenção é relacionada com um conjunto de regiões variáveis de anticorpo da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VK) modificadas do anticorpo B4 de murino anti-CDl9 (Nadler et al., (1983) J. Immunol. 130:2947 -2951; Roguska et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:969 - 973), os quais são aqui genericamente chamados de 7 "Β4 VHvx" e "B4 VKvy", respetivamente. Para referência, a sequência da região variável da cadeia pesada do anticorpo B4 de murino original (B4 VHO) e a sequência das regiões variáveis da cadeia leve do anticorpo B4 de murino original (B4 VKO), com os CDRs sublinhados, são fornecidas nas Figuras 9 e 10 respetivamente.

Como comparado com os polipéptidos B4 VHO e B4 VHvy originais, os polipéptidos B4 VKvy e B4 VKvy têm imunogenicidade reduzida, primeiramente por remoção dos epitopos das células T nestes polipéptidos que podem estimular uma resposta imunológica. De acordo com a invenção, as composições de proteínas contendo as formas modificadas das regiões variáveis B4 são menos imunogénicas quando administradas a um ser humano, mas são ainda competentes para ligarem especificamente CD19 e para atingirem as células expressando CD19.

Como aqui usados, os termos "Regiões Determinantes de Complementaridade" e "CDRs" são entendidos para significarem as regiões hipervariáveis ou anças de uma região variável da imunoglobulina que interatua primeiramente com um antigénio. A região variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e a região variável da cadeia leve de imunoglobulina (VK) contêm ambas três CDRs interpostos entre as regiões da estrutura base, como mostrado nas Figuras 9 e 10, respetivamente. Por exemplo, com referência à sequência de aminoácidos que define a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina do anticorpo B4 como mostrado na Figura 34 (SEQ ID NO:13), os CDRs são definidos pelas sequências de aminoácidos desde Ser31 até His35 (CDR1), desde Glu50 até Asn59 (CDR2), e desde Gly99 até Tyrl09 (CDR3). Com referência à sequência de aminoácidos que define a região variável da cadeia leve de imunoglobulina do anticorpo B4 como mostrado na Figura 8 35 (SEQ ID NO: 25), os CDRs são definidos pelas sequências de aminoácidos desde Ser24 até His33 (CDR1), desde Asp49 até Ser55 (CDR2), e desde His88 até Thr94 (CDR3).

Como aqui usados, os termos "Regiões de estrutura" e "FRs" são entendidos para significar as regiões de uma região variável da imunoglobulina adjacentes às Regiões de Determinação de Complementaridade. A região variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e a região variável da cadeia leve de imunoglobulina (VK) contêm cada uma quatro FRs, como mostrado nas Figuras 34 e 35. Por exemplo, com referência à sequência de aminoácidos que define a cadeia pesada variável de imunoglobulina do anticorpo B4 como mostrado na Figura 34 (SEQ ID NO: 13), as FRs são definidas pelas sequências de aminoácidos desde Glnl até Thr30 (FR1), desde Trp36 até Gly49 (FR2), desde Tyr60 até Arg98 (FR3), e desde TrpllO até Serl20 (FR4). Com referência à sequência de aminoácidos que define a região variável da cadeia leve de imunoglobulina do anticorpo B4 como mostrado na Figura 35 (SEQ ID NO: 25), os FRs são definidos pelas sequências de aminoácidos desde Glnl até Cys23 (FR1), desde Trp34 até Tyr48 (FR2), desde Gly56 até Cys87 (FR3), e desde Phe95 até Lysl04 (FR4). Para além disso, os residuos de aminoácidos apresentados a negrito nas Figuras 34 e 35 são residuos de aminoácidos que são mutados de acordo com várias formas de realização da invenção.

Os epitopos das células T podem ser identificados por uma variedade de métodos computorizados e não computorizados, incluindo previsões baseadas em modelos computacionais com base na estrutura ou por sintese dos péptidos e testes de ligação às moléculas especificas MHC Classe II ou em ensaios de imunogenicidade. De acordo com a invenção, um potencial epitopo das células T é uma sequência que, quando considerada como um péptido isolado, é previsto ligar-se a uma molécula MHC Classe II ou uma equivalente numa espécie 9 não humana. Um potencial epitopo das células T é definido sem considerar outros aspetos de processamento de antigénio, tais como a eficiência de captação de proteína nas células de processamento de antigénio, a eficiência dos sítios de clivagem na proteína intacta para produzir um péptido que pode ligar-se a MHC Classe II, e assim por diante. Portanto, o conjunto dos epitopos das células T que são presentemente apresentadas nas MHC Classe II após administração de uma proteína a um animal é um subconjunto dos potenciais epitopos das células T. De acordo com a invenção, um epitopo das células T é um epitopo numa proteína que interage com uma molécula MHC classe II. Sem querer ser obrigado pela teoria, é entendido que um epitopo das células T é uma sequência de aminoácidos numa proteína que não sofre o processo de seleção negativa das células T durante o desenvolvimento das células T e portanto será de esperar que esteja presente na molécula MHC Classe II e seja reconhecida por um recetor das células T. A divulgação fornece métodos relacionados com a redução da imunogenicidade das regiões B4 VH e B4 VK. De acordo com uma forma de realização, potenciais epitopos não das próprias células T são identificados nas sequências de B4 VH ou B4 VK. Por exemplo, os potenciais epitopos não próprios das células T são identificados por métodos computacionais baseados no modelo dos péptidos que se ligam às moléculas MHC Classe II. As substituições de resíduos de aminoácidos específicos são depois feitas de modo a que a capacidade dos péptidos que contêm epitopos das células T potenciais para ligar às MHC Classe II sejam reduzidas ou eliminadas. 10

Sequência de Proteína Modificada das Regiões variáveis da invenção.

De acordo com uma forma de realização, o efeito de uma mutação ou mutações de aminoácidos especificas é previsto com base num modelo computorizado com base na estrutura. Por exemplo, ProPred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred; Singh e Raghava (2001) Bioinformatics 17:1236-1237) é uma ferramenta base da web disponível publicamente que pode ser usada para a previsão de péptidos que ligam os alelos HLA-DR. 0 ProPred é baseado num algoritmo de previsão de matriz descrito por Sturniolo para um conjunto de alelos 50 HLA-DR (Sturniolo et ai., (1999) Nature Biotechnol. 17:555-561). Usando um tal algoritmo, várias sequências de péptidos foram encontradas nas B4 VH e B4 VK as quais são previstas ligarem-se a alelos MHC classe II múltiplos e são igualmente para serem imunogénicas. Estas sequências de péptidos e a sua prevista frequência de ligação aos alelos HLA-DR são mostradas na Tabela 1.

Em relação à Tabela 1, a sequência de cada péptido 9-mer que se liga pelo menos aos alelos 5 HLA-DR está indicada, em conjunto com a sua posição (#) na região B4 VH (coluna da esquerda) ou na região B4 VK (coluna da direita). "Freq. de ligação" refere-se ao número de alelos, cerca de uns 50 alelos possíveis, a que o péptido se liga, acima de um limite arbitrário de ligação, neste caso 20%. Uma frequência de ligação de "+" indica que o péptido liga-se a 5-9 alelos, " + + " indica que o péptido liga-se a 10-19 alelos, e "+++" indica que o péptido liga-se a 20-50 alelos. O limite ligação arbitrário de 20% é relativo a uma pontuação máxima teórica de ligação, como calculado por um algoritmo como descrito por Sturniolo et al. 11

Tabela 1. Péptidos selecionados das regiões B4 V previstos para ligarem alelos HLA-DR de humanos.

Epitopos de células VH T (pos. de partida) freq. de ligação Epitopos de células VK T (pos. de partida) freq. de ligação (2) VQLQQPGAE + (2) IVLTQSPAI +++ (12) VKPGASVRL + (3) VLTQSPAIM ++ (18) VRLSCKTSG +++ (19) VTMTCSASS + (36) WVKQRPGQG + (29) VNYMHWYQQ + (60) YNQKFKGKA + (46) WIYDTSKLA ++ (64) FKGKAKLTV +++ (47) IYDTSKLAS + (80) YMEVSSLTS ++ (93) VYYCARGSN +

Estas sequências potencialmente imunogénicas nos polipéptidos B4 VH e B4 VK podem ser tornadas menos imunogénicas através da introdução de mutações específicas que reduzem ou eliminam a ligação de um péptido particular a um alelo HLA-DR humano (ver, por exemplo W098/52976 e WOOO/34317). Em alternativa, os epitopos das células T não humanas são mutados de modo a que correspondam aos próprios epitopos humanos que estão presentes nos anticorpos das células germinativas humanas (ver por exemplo a US 5,712,120).

Orientações para selecionar mutações apropriadas podem ser obtidas em relação às estruturas terciária e quaternária das regiões variáveis do anticorpo. As estruturas cristalinas dos domínios variáveis do anticorpo são conhecidas na técnica e verificou-se que as estruturas de FRs são geralmente muito semelhantes uma à outra. Um modelo teórico da região variável de anticorpo do anticorpo B4 VH0/VK0 anti-CD19 pode ser construído a partir das regiões variáveis das cadeias leve e pesada do anticorpo mais proximamente relacionadas para as quais tenha sido determinada uma estrutura, a qual pode ser identificada a partir de um alinhamento da estrutura primária (Altschul et 12 al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-415). É usado um algoritmo de segmentação para modelar as cadeias pesada e leve do B4 nas estruturas resolvidas (Marti-Renom et al., (2000) Annu Rev Biophys Biomol Struct 29:291-325), e as estruturas segmentadas podem ser adicionalmente refinadas para obter energias estereoquimicamente favoráveis (Weiner et al., (1984) J Am Chem Soc 10 6:7 65-784). Verificou-se que as estruturas resolvidas das cadeias pesada e leve designadas respetivamente pelos seus códigos de acesso à base de dados PDB 1 FBI (fragmento Fab de anticorpo monoclonal F9.13.7) e 1MIM (fragmento Fab de anticorpo quimérico Sdz Chi621 anti-CD25), são estruturas de referência úteis para este objetivo.

Mutações preferidas não interferem indevidamente com a expressão, dobragem, ou atividade da proteína. Aminoácidos nas posições Q5, V12, R19, L20, K23, T24, K38, R40, G42, Q43, K65, K69, S85, S88, ou V93 em B4 VH e os aminoácidos nas posições Ql, V3, S7, 110, Mil, V19, V29, S51, L53, A54, ou S75 em B4 VK podem ser mutados ao mesmo tempo que mantêm a capacidade de o anticorpo ser expresso e de se ligar a CD19 a níveis comparáveis aos da forma não modificada de B4. Portanto a divulgação fornece anticorpos B4 com pelo menos uma modificação na sequência VH selecionada a partir do grupo de posições de aminoácido que consistem em Q5, V12, RI 9, L20, K23, T24, K38, R40, G42, Q43, K65, K69, S85, S88, e V93 e/ou com pelo menos uma modificação na sequência VK selecionada a partir do grupo de posições de aminoácido que consistem de Ql, V3, S7, 110, Mil, V19, V29, S51, L53, A54, e S75.

Uma lista não exaustiva de posições específicas encontradas para tolerar substituições de aminoácidos é apresentada na Tabela 2, em conjunto com substituições exemplares naquelas posições. 13

Tabela 2. Substituições nas regiões B4 V.

Posição em B4 VH Substituição Posição em B4 VK Substituição Gln5 Glu Glnl Asp Vall2 Lys Val3 Ala Argl 9 Lys Ser7 Glu Leu20 Vai Ile 10 Thr Lys23 Glu, Asp Metll Leu Thr24 Ala Vai 19 Ala Lys38 Arg Val29 Ala Arg40 Ala, Thr Ser51 Asp Gly42 Asp, Glu Leu53 Thr Gin43 Lys Ala54 Asp Lys65 Asp, Glu Ser75 Glu Lys69 Glu, Asp Ser85 Asp, Glu Ser88 Ala Val93 Thr

Um conjunto de formas de realização inclui substituições de aminoácidos nos polipéptidos B4 VH, selecionados a partir de Q5E, V12K, R19K, L20V, K23E, T24A, K38R, R40T, G42D, Q43K, K65D, K69E, S85D, S88A, e V93T. Adicionalmente as substituições contempladas são K23D, G42E, K65E e K69D. Comunicações especificas de mutações verificou-se serem também úteis. Numa forma de realização especifica as substituições Q5E, R19K, L20, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A, e V93T são incluídas, como exemplificadas por B4 VHv4 (SEQ ID NO:17).

Outro conjunto de formas de realização inclui substituições de aminoácidos no polipéptido B4 VK, selecionadas a partir de Q1D, V3A, S7E, I10T, M11L, V19A, V29A, S51 D, L53T, A54D, e S75E. Numa forma especifica de realização, está incluída a substituição A54D. Comunicações específicas de mutações verificou-se serem também úteis. Numa forma de realização específica, as substituições I10T, M11L, V19A, S51 D, e L53T são incluídas, como exemplificadas por B4 VKv4 (SEQ ID NO:29). 14

Um alinhamento de estrutura primária de algumas sequências exemplares de B4 VHvx e B4 VKvx da invenção, descritas acima, é apresentado nas Figuras 11 e 12, respetivamente. Os aminoácidos apresentados a negrito são posições de VHO e VKO que podem ser mutadas de acordo com a invenção, e os aminoácidos sublinhados representam CDRs. VHvl - VHv34 e VKvl - VKv34 são cadeias pesada e leve representativas, respetivamente, com substituições de aminoácidos específicos que reduzem a imunogenicidade.

Composições de região variável incluem pelo menos uma cadeia pesada ou uma cadeia leve da invenção. Numa forma de realização especifica, a região variável contém B4 VHv4 (SEQ ID NO:17) e B4 VKv4 (SEQ ID NO:29).

Verificação da Imunogenicidade reduzida das Regiões variáveis da invenção. Para verificar que uma mutação resultou de facto em imunogenicidade reduzida, testes experimentais padrão, os quais são bem conhecidos na técnica, podem ser empregues. Por exemplo, pode ser usado um ensaio de estimulação de Célula T (por exemplo Jones et al., (2004), J. Interferon Cyitokine Res., 24:560). Num ensaio destes, células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) são obtidas e cultivadas de acordo com condições padrão. Após uma pré-estimulação opcional, um péptido correspondente a um epitopo MHC Classe II potencial é adicionado à cultura de PBMCs; as PBMCs são depois encubadas adicionalmente, e mais tarde é adicionada timidina tritiada. O péptido pode ser um minimo de 9-mer, ou pode ter cerca de 10 até 15, ou mais que 15, aminoácidos. Após a incubação adicional das células, a incorporação da timidina tritiada no DNA é depois medida por técnicas padrão. 15 0 ensaio de estimulação das células T é pensado para funcionar pelos mecanismos a seguir. Primeiro, se um péptido é usado como um estimulador, o péptido deve primeiro ligar a uma molécula MHC Classe II presente numa célula entre os PBMCs. Segundo, o complexo MHC Classe II/péptido deve interatuar produtivamente com um recetor de célula T numa Célula T CD4+. Se o péptido de teste é incapaz de se ligar de modo suficientemente forte a uma molécula MHC Classe II, não resultará qualquer sinal. Se o péptido é capaz de se ligar a uma molécula MHC Classe II e há células T que expressam um recetor de Célula T rearranjado apropriadamente capaz de reconhecer um complexo particular MHC Classe II/péptido, deverá resultar um sinal. No entanto, se essas Células T tiverem sido deletadas em resultado de um processo de seleção negativa, não será produzido qualquer sinal. Estes mecanismos são considerados relevantes para a imunogenicidade de uma sequência de proteína, como inferido pela estimulação ou pela falta de estimulação por um dado péptido.

Se as células T de reconhecimento estão presentes em muito baixo número na população de PBMC por razões estocásticas relacionadas com a falta de existência de um recetor de células T apropriado ou com a proliferação de outras, células T não relacionadas seguidas por homeostase da população de células T, pode também não ser produzido qualquer sinal mesmo que o sinal seja esperado. Deste modo, podem ocorrer falsos resultados negativos. Com base nestas considerações, é importante usar um largo número de fontes diferentes de PBMCs e testar estas amostras independentemente. É também geralmente útil testar os PBMCs de um conjunto etnicamente diverso de seres humanos, e determinar os alelos do MHC Classe II presentes em cada população PBMC. 16

Ensaios padrão de células T têm a desvantagem de o sinal de incorporação de tritio ser frequentemente somente duas vezes maior que a incorporação de fundo. As proteínas e péptidos da invenção podem também ser testadas num ensaio de células T modificado no qual, por exemplo, as células CD4+ T purificadas e as células dendríticas purificadas são co-cultivadas na presença do péptido de teste, seguido de exposição à timidina tritiada e depois ensaiadas quanto à incorporação de timidina tritiada. Este segundo ensaio tem a vantagem de a incorporação de timidina tritiada em células irrelevantes, tais como células CD8+ T, ser essencialmente eliminada e a de fundo ser assim reduzida.

Um terceiro ensaio envolve o teste de uma proteína candidata com imunogenicidade reduzida num animal tal como um primata. Um tal ensaio deve geralmente envolver o teste de uma composição de proteína B4 VHvx/VKvy, tal como um anticorpo, que tenha sido concebido por meio de testes de componentes individuais peptídicos quanto à imunogenicidade potencial num ensaio baseado em células tal como é descrito acima. Uma vez que uma composição de proteína B4 VHvx/VKvy candidata é concebida e expressa, a proteína é testada quanto à imunogenicidade por injeção num animal. A injeção da composição da proteína B4 VHvx/VKvy é geralmente realizada do mesmo modo que as vias antecipadas de distribuição durante o uso terapêutico em humanos. Por exemplo, podem ser usadas injeções intradérmicas, subcutâneas, intramusculares, intraperitoneais ou infusão intravenosa. Se for usada mais que uma forma de administração, as administrações podem ser por vias diferentes.

Para fins de teste de imunogenicidade, pode ser útil co-administrar um adjuvante para aumentar o sinal e minimizar 17 o número de animais que é necessário usar. Se é usado um adjuvante, é possível usar um adjuvante com falha de um componente proteico, tal como DNA com dinucleótidos CpG não metilados, lípido A bacteriano, N-formil metionina, ou outros componentes bacterianos não-proteicos. Sem desejar estar ligado a uma teoria, o procedimento racional para evitar os adjuvantes contendo proteína é que outras proteínas possam fornecer os epitopos das células T que, em última análise, vão contribuir para uma resposta de anticorpo contra a proteína candidata.

Após uma ou mais administrações da composição de proteína B4 VHvx/VKvy candidata, a presença de anticorpos anti-idiotipo é testada de acordo com as técnicas padrão, tais como o método ELISA. Verificou-se que a composição das proteínas B4 VHvx/VKvy da invenção induzem a formação de anticorpo menos frequentemente, e numa extensão menor, do que as moléculas correspondentes contendo as sequências B4 VH/VK originais.

Outras configurações das Regiões Variáveis da Invenção.

Para além do uso das regiões V da invenção num anticorpo nú, é também possível configurar as regiões V da invenção em proteínas de fusão de anticorpo que visam toxinas, estimuladores imunológicos, e outras proteínas, assim como Fabs, Fvs de cadeia simples, anticorpos bi-específicos, e outras configurações conhecidas na técnica da manipulação de anticorpos.

Em certas formas de realização da invenção, a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada podem ser acopladas, respetivamente, a uma região constante da cadeia leve e a uma região constante cadeia pesada de uma imunoglobulina. As cadeias leves de 18 imunoglobulina têm regiões constantes que são designadas ou por cadeias kapa ou por cadeias lambda. Numa forma de realização particular da invenção, a região constante da cadeia leve é uma cadeia kapa. As regiões constantes da cadeia pesada, e várias modificações e combinações destas são discutidas a seguir com maior pormenor.

Porção Fc

Os domínios variáveis de anticorpo da presente invenção são opcionalmente fundidos a uma porção Fc. Como aqui usada, a porção Fc engloba domínios derivados a partir da região constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina, preferencialmente uma imunoglobulina humana, incluindo um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. A região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina é definida como um polipéptido produzido sinteticamente ou de ocorrência natural homologo a pelo menos uma porção da região C-terminal da cadeia pesada, incluindo os domínios CHI, de junção, CH2, CH3, e, para algumas classes de cadeias pesadas, CH4. A região "de junção" liga o domínio CHI à região CH2-CH3 de uma porção Fc. A região constante das cadeias pesadas de todas as imunoglobulinas de mamífero exibem similaridade de sequência de aminoácidos extensiva. As sequências de DNA para estas regiões de imunoglobulina são bem conhecidas na técnica. (Ver, por exemplo, Gillies et al. (1989) J. Immunol. Meth. 125:191).

Na presente invenção, a porção Fc tipicamente inclui pelo menos um domínio CH2. Por exemplo, a porção Fc pode incluir toda a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (CHI-junção-CH2-CH3) . Em alternativa, a porção Fc pode incluir toda ou uma porção da região de junção, o domínio CH2 e o domínio CH3. 19 A região constante de uma imunoglobulina é responsável por muitas das funções efetoras de anticorpo importantes, incluindo as mediadas pela ligação ao recetor Fc (FcR) e por ligação complementar. Existem cinco classes maioritárias da região constante da cadeia pesada, classificadas como IgA, IgG, IgD, IgE, e IgM, cada uma com funções efetoras designadas por isotipos. A IgG, por exemplo, é separada em quarto isotipos γ: γ1, γ2, γ3, e γ4, também conhecidos como IgGl IgG2, IgG3 e IgG4, respetivamente. As moléculas IgG podem interagir com múltiplas classes de recetores celulares incluindo três classes de recetores Fcy (FcyR) especificas para a classe IgG de anticorpo, nomeadamente FcyRI, FcyRII, e FcyRIII. As sequências importantes para a ligação da IgG aos recetores FcyR foram referidas para estarem nos dominios CH2 e CH3.

Funções efetoras de anticorpos largamente reconhecidas, particularmente da classe IgG, incluem citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Todas as subclasses IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) medeiam CDC e ADCC em alguma extensão, com IgGl e IgG3 sendo as mais potentes para ambas as atividades (Capitulo 3, Tabela 3 em Paul, Essential Immunology 4.sup.th Ed., p. 62). Acredita-se que CDC ocorre por mecanismos múltiplos; um mecanismo é iniciado quando um anticorpo se liga a um antigénio na superfície das células. Uma vez que o complexo antigénio-anticorpo seja formado, acredita-se que a molécula Clq é para ligar o complexo antigénio-anticorpo. A Clq cliva-se então ela própria para iniciar uma cascata de ativação enzimática e a clivagem de outras proteínas complementares as quais depois ligam a superfície da célula alvo e facilitam a sua morte através de, por exemplo, lise celular e/ou ingestão por um 20 necrófago. Acredita-se que ADCC ocorre quando os recetores Fc nas células citotóxicas, tais como células assassinas naturais (NK), macrófagos e neutrófilos, se ligam à região Fc dos anticorpos ligados a antigénio numa superfície celular. A ligação ao recetor Fc dá sinal à célula citotóxica para matar a célula alvo. Caracteristicamente, as células NK, que se acredita serem os mediadores primários de ADCC, expressam somente FcYlIIa. É muitas vezes útil alterar as funções efetoras de um anticorpo. Por exemplo, para tratar cancros associados com uma malignidade da célula B ou para tratar doenças autoimunes com um componente da célula B, é útil aumentar a atividade ADCC do anticorpo. Pode ser particularmente útil aumentar a atividade ADCC de um anticorpo dirigida a antigénios de superfície da célula B presentes em densidade relativamente baixa (Niwa et al., (2005) Clin. Câncer Res. 11:2327-2336), tal como para CD19. Acredita-se que a densidade de antigénio do CD19 em relação ao CD20 na superfície das células B é aproximadamente dez vezes mais baixo. Alterações nos anticorpos que aumentam a atividade de um anticorpo em relação ao seu anticorpo parente são conhecidas na técnica, e geralmente correlacionam-se com modificações que aumentam a afinidade de ligação do anticorpo variante a FcyRIII (ver por exemplo, a Pat. US No. 6,737,056). Por exemplo, são introduzidas mutações na região Fc numa ou mais posições (com referência à sua posição em IgGYl) selecionadas a partir de 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 339, 360, 378 e 430 (numeração de acordo com Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991). Mutações preferidas são numa ou mais posições selecionadas a partir de 298, 333, e 334. Por exemplo, podem ser introduzidas substituições alanina. 21 [0043] A atividade ADCC do anticorpo é também influenciada pela linha de células especifica usada para produzir o anticorpo. Por exemplo, anticorpos produzidos nas células NS/0 de mieloma de ratinho (ou células SP2/0) geralmente têm baixa ADCC, e os anticorpos produzidos nas células YO de mieloma de ratazana (ou YB2/0) têm alta ADCC (Lifely et al., (1995) Glycobiology 5:813 - 822). É conhecido na técnica que o tipo de linha de células usadas para expressão de anticorpo afeta a estrutura de hidrato de carbono da cadeia de glicosilo ligada a N, as quais são anexadas à região Fc do anticorpo na posição correspondente a N2 97 em IgGyl. A estrutura de hidrato de carbono de anticorpos produzidos nas células CHO é fucosilada, enquanto que a cadeia de hidrato de carbono dos anticorpos produzidos em YB2/0 é largamente sem fucose (Shinkawa et al., (2003) JBC 278:3466- 3473). Os anticorpos sem fucose na estrutura de hidrato de carbono ligam a FcyRIIIa humano com alta afinidade (Shields et al., (2002) JBC 277:26733-26740). Em determinadas formas de realização, os anticorpos anti-CD19 com regiões variáveis da invenção são caracterizadas por terem reduzida fucosilação na cadeia glicosilo ligada a N da porção Fc do anticorpo. É também muitas vezes útil alterar a meia vida do soro do anticorpo. A meia vida do soro de um anticorpo, como a de uma proteina de fusão de imunoglobulina, é influenciada pela capacidade daquele anticorpo se ligar a um recetor Fc (FcR) (Gillies et al., Câncer Research (1999) 59:2159-66). Os domínios CH2 e CH3 de IgG2 e IgG4 têm indetetável ou reduzida afinidade de ligação aos recetores Fc em comparação com os de IgGl. Deste modo, a meia vida do soro das características do anticorpo podem ser aumentadas usando o domínio CH2 e/ou CH3 dos isotipos IgG2 ou IgG4. Em alternativa, o anticorpo pode incluir um domínio CH2 e/ou CH3 de IgGl ou IgG3 com modificação num ou mais aminoácidos 22 nestes domínios para reduzir a afinidade de ligação aos recetores Fc (ver, por exemplo, pedido de patente U.S. Ser. No. 09/256,156, publicado como publicação do pedido de patente U.S. 2003-0105294). A região de junção da porção Fc normalmente é adjacente ao C-terminal do domínio CHI da região constante da cadeia pesada. Quando incluída nas proteínas da presente invenção, a junção é homóloga a uma região imunoglobulina de ocorrência natural e tipicamente inclui resíduos de cisterna ligando duas cadeias pesadas via ligações dissulfureto como nas imunoglobulinas naturais. Sequências representativas de regiões de junção para imunoglobulina humana e de rato podem ser encontradas em ANTIBODY ENGINEERING, a PRACTICAL GUIDE, (Borrebaeck, ed., W. H. Freeman e Co., 1992).

Regiões de junção adequadas para a presente invenção podem ser derivadas a partir de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, e de outros isotipos de imunoglobulina. O isotipo IgGl tem duas ligações dissulfureto na região de junção permitindo a eficiente e consistente formação de ligação dissulfureto. Deste modo, uma região de junção preferida da presente invenção é derivada da IgGl. Opcionalmente, em primeiro lugar, a maioria da cisteína N-terminal de uma junção da IgGl é mutada para aumentar a expressão e agrupamento de anticorpos ou de proteínas de fusão do anticorpo da invenção (ver, por exemplo, pedido de patente U.S. Ser. No. 10/093,958, publicado como publicação do pedido de patente U.S. 2003-0044423).

Em contraste com a IgGl, a região de junção da IgG4 é conhecida por formar ineficientemente ligações dissulfureto intercadeias (Angal et al., (1993), Mol. Immunol. 30:105-8). Também, a região de junção de IgG2 tem quatro ligações dissulfureto que tendem a promover oligomerização e possivelmente as ligações dissulfureto incorretas durante a 23 secreção em sistemas recombinantes. Uma região de junção adequada para a presente invenção pode ser derivada a partir da região de j unção de IgG4, contendo preferencialmente uma mutação que aumenta a formação correta das ligações dissulfureto entre as frações derivadas da cadeia pesada (Angal et ai., (1993), Mol. Immunol. 30(1): 105-8). Outra região de junção preferida é derivada de uma junção IgG2 na qual as primeiras duas cisteinas são cada uma mutada num outro aminoácido, tais como, por ordem geral de preferência, serina, alanina, treonina, prolina, ácido glutâmico, glutamina, lisina, histidina, arginina, asparagina, ácido aspártico, glicina, metionina, valina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, triptofano ou selenocisteina (ver, por exemplo, publicação do pedido de patente U.S. 2003-0044423).

Uma porção Fc fundida a uma região variável de anticorpo pode conter domínios CH2 e/ou CH3 e uma região de junção que derivam de diferentes isotipos de anticorpo. Por exemplo, a porção Fc pode conter domínios CH2 e/ou CH3 de IgG2 ou IgG4 e uma região de junção de IgGl. A união destas porções de híbridos Fc foi descrita na publicação do pedido de patente U.S. 2003-0044423.

Quando fundida a uma região variável de anticorpo, a porção Fc pode conter uma ou mais modificações de aminoácidos que geralmente prolongam a meia vida do soro de uma proteína de fusão Fc. Essas modificações de aminoácido incluem mutações que substancialmente diminuem ou eliminam a ligação ao recetor Fc ou a atividade de fixação de complemento. Por exemplo, um desses tipos mutações remove o sítio de glicolização da porção Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Na IgGl, o sítio de glicolização é Asn297 (ver, por exemplo, o pedido de patente U.S. Ser. No. 10/310,719, publicado como publicação do pedido de patente U.S. 2003-0166163).

As regiões variáveis de anticorpo da invenção podem ser anexadas a um agente de diagnóstico e/ou terapêutico. O agente pode ser fundido ao anticorpo para produzir uma proteina de fusão. Em alternativa, o agente pode ser acoplado quimicamente ao anticorpo para produzir um imuno-conjugado. O agente pode ser, por exemplo, uma toxina, radiomarcador, agente de imagem, fração imunoestimuladora ou afins. A região variável do anticorpo pode ser anexada a uma citocina. Citocinas preferidas incluem interleucinas tais com interleucina-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, e IL-23, fatores hematopoiéticos tais como fator de estimulação de colónia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) , fator de estimulação de colónia de granulócitos (G-CSF) e eritropoeitina, fatores de necrose tumural (TNF) tais como TNFa, linfocinas tais como linfotoxina, reguladores de processos metabólicos tais como leptina, interferões tais como interferão a, interferão β, e interferão γ, e quimiocinas. Preferencialmente, a proteina de fusão de anticorpo-citocina ou o imunoconjugado apresentam atividade biológica de citocina. Numa forma de realização, o domínio variável de anticorpo é fundido a IL-2. Preferencialmente, vários aminoácidos dentro da fração IL-2 são mutados para reduzir a toxicidade, como descrito na publicação do pedido de patente U.S. 2003-0166163.

Opcionalmente, os complexos de proteínas podem incluir adicionalmente um segundo agente, tal como uma segunda citocina. Numa forma de realização, uma proteína de fusão de anticorpo B4 VHvx/VKvy inclui IL-12 e IL-2. A construção 25 dos complexos de proteína que contém um domínio de imunoglobulina e duas citocinas diferentes é descrita com pormenor na Pat. U.S. No. 6,617,135.

Produção de anticorpo

Anticorpos, assim como outra região variável contendo proteínas da invenção, são produzidos por métodos bem conhecidos na técnica da manipulação de proteínas. Vetores de ácidos nucleicos capazes de expressar uma cadeia pesada e uma cadeia leve as quais incluem sequências da invenção são introduzidos na célula apropriada e o produto da proteína recombinante é expresso e purificado. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser produzidos em linhas de células de mamífero manipuladas tais como células NS/0, células CHO, células SP2/0 (SP2/0-Agl4; ATCC-CRL 1581), células YB2/0 (YB2/3HL.P2.Gll.16Ag.20; ATCC CRL-1662), ou outras células de mamífero bem conhecidas na técnica da produção de anticorpos. Numa forma de realização, são produzidos em células YB2/0. Em alternativa, podem ser usadas leveduras, plantas, células de inseto, ou bactérias para produzir proteínas contendo regiões variáveis.

Administração

Os anticorpos são usados para tratar doentes com doenças das células B tais como linfoma da célula B. Para o linfoma das células B, dependendo da opinião do médico, pode ser útil tratar o doente em que tenham falhado outras terapias. Por exemplo, alguns doentes que foram tratados com Rituxan™ podem inicialmente responder, mas podem aparecer células de cancro resistentes a Rituxan™. Esses doentes poderão geralmente responder também aos anticorpos da invenção. 26

No caso dos anticorpos direcionados contra CD19, é muitas vezes útil purificar as células B normais do corpo, dado que é provável que estas células titulem o anticorpo. 0 Rituxan™ pode ser usado para este fim, de acordo com os procedimentos padrão podem ser usados para purificar as células B normais do corpo, por exemplo como descrito no Exemplo 5 e Exemplo 9. A infusão é o método de administração preferido. Outros métodos de administração incluem vias de injeção tais como aplicação subcutânea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, ou aplicação intravenosa (bolus). A inalação e aplicação oral são também métodos de aplicação possíveis.

Para um indivíduo humano de 70 quilogramas, uma dose típica é numa gama de cerca de 50 miligramas até 2 gramas, com uma dose preferida numa gama de cerca de 400 - 600 miligramas. A dosagem pode ser repetida cerca uma vez cada três a seis semanas, por exemplo, durante as quais as células B normais e as células tumorais são monitorizadas.

As proteínas de fusão são úteis no tratamento de doenças em seres humanos, tais como cancro. Quando se trata cancro, é útil, por exemplo, administrar uma proteína de fusão de anticorpo IL-2 compreendendo as regiões variáveis da invenção por infusão ou injeção subcutânea, usando doses de 0,1 até 100 miligramas/metro2/doente. Numa forma de realização preferida, é particularmente útil administrar uma proteína de fusão de anticorpo-IL-2 compreendendo as regiões variáveis da invenção por infusão ou injeção subcutânea, usando doses de 1 até 10 miligramas/metro2/doente, e mais preferencialmente cerca de 3 até 6 miligramas/metro2/doente. 27

As composições farmacêuticas da invenção podem ser usadas na forma de formas de dosagem sólidas, semisólidas, ou liquidas, tais como, por exemplo, pílulas, cápsulas, pós, líquidos, suspensões, ou afins, preferencialmente nas formas de dose unitária adequadas para administração de dosagens precisas. As composições incluem um transportador ou excipiente farmacêutico convencional e, adicionalmente, podem incluir outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, transportadores, adjuvantes, etc. Esses excipientes podem incluir outras proteínas, tais como, por exemplo, albumina de soro humano ou proteínas plásmicas. Métodos atuais para preparar estas formas de dosagem são conhecidos ou são evidentes para os especialistas na técnica. A composição ou formulação a ser administrada deverá, em qualquer circunstância, conter uma quantidade de componente(s) ativos numa quantidade eficaz para atingir o desejado efeito no indivíduo em tratamento. A administração das composições deste documento pode ser através de qualquer dos modos de administração aceites para os agentes que exibam essa atividade. Estes métodos administram-se localmente ou por via sistémica. A injeção intravenosa num transportador farmaceuticamente aceitável é um método de administração preferido. A quantidade do composto ativo administrada deverá, evidentemente, depender do indivíduo a tratar, da gravidade da situação, do modo de administração, e da opinião do médico que o prescreve. A invenção é adicionalmente ilustrada através dos seguintes exemplos não limitativos. Exemplo 1. Construção de Anticorpos Anti-CD19 Contendo Região Variável das Cadeias Pesada e Leve. Técnicas padrão de engenharia genética foram usadas para introduzir sequências de ácido nucleico que codificam uma 28 região da cadeia pesada e uma região da cadeia leve da divulgação num vetor de expressão de mamífero apropriado. Estratégias de clonagem exemplificativas são descritas a seguir. 0 vetor de expressão pdHL12 é um vetor de expressão pdHL de última geração modificado para conter sítios de restrição únicos para a inserção de cassetes de ácido nucleico que codificam regiões variáveis das cadeias pesada e leve. 0 pdHL12 é desenhado para aceitar ácidos nucleicos que codificam a região variável da cadeia pesada como um fragmento Nhe I/Hind III, e ácidos nucleicos que codificam a região variável da cadeia leve como um fragmento Afl II/Bam Hl, e para co-expressar as cadeias pesada e leve intactas de anticorpo (ver, por exemplo pedido de patente US 2003/0157054).

Sequências de ácido nucleico das regiões variáveis da cadeia pesada, flanqueadas por sequências com sequências de reconhecimento de restrição da endonuclease 5'-CTTAAGC - 3' (montante, contendo o sítio Nhe I) e 5'-CGTAAGTGGATCC - 3' (jusante, contendo o sítio Hind III), foram sintetizadas de novo e inseridas num plasmídeo transportador derivado do vetor pUC (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA). O ácido nucleico foi excisado do plasmídeo transportador como um fragmento Nhe I / Hind III e ligado ao fragmento de vetor apropriado de um plasmídeo pdHL 12 digerido do mesmo modo. São mostradas as sequências de ácido nucleico para B4 VHO (SEQ ID NO: 1) , B4 VHvl (SEQ ID NO: 2) , B4 VHv2 (SEQ ID NO: 3) , B4 VHv3 (SEQ ID NO:4), B4 VHv4 (SEQ ID NO:5), B4 VHv5 (SEQ ID NO:6), e B4 VHv6 (SEQ ID NO:7).

De modo semelhante, os ácido nucleicos das regiões variáveis da cadeia leve da invenção, flanqueadas por sequências com as sequências de reconhecimento de restrição da endonuclease 5' - GCTAGCTCCAGC -3' (montante, contendo o sítio Afl-II)- e 5'-GGTAAGCTT - 3' (jusante, contendo o 29 sítio Bam Hl), foram sintetizadas de novo e inseridas num transportador de plasmídeo derivado de vetor pUC (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA) . 0 ácido nucleico foi excisado a partir do plasmídeo transportador como um fragmento Afl II/Bam Hl e ligado ao fragmento de vetor apropriado de um plasmídeo pdHL12 digerido de modo semelhante. São mostradas sequências de ácido nucleico que codificam B4 VKO (SEQ ID NO:8), B4 VKvl (SEQ ID NO:9), B4 VKv2 (SEQ ID NO:10), B4 VKv3 (SEQ ID NO:11), e B4 VKv4 (SEQ ID NO:12).

[0064] Inserindo as sequências de ácido nucleico que codificam as diferentes regiões variáveis da cadeia pesada e leve de modo combinatório no pdHL12, foi gerado um painel de plasmídeos que codificam anticorpos B4 da invenção, B4 VHvx/VKvy.

Exemplo 2. Expressão e Purificação de Anticorpos da Invenção.

As técnicas gerais seguintes são usadas nos Exemplos subsequentes. IA. Cultura e Transfeção de Células

Para expressar anticorpos transientemente das células de mamífero, o DNA de plasmídeo é introduzido em células de rim 293 de embrião humano, ou em células de rim de hamster bebé (BHK) , por co-precipitação do DNA de plasmídeo com fosfato de cálcio e as células foram crescidas sem seleção para manutenção de plasmídeos [Sambrook et al. (1989)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.]. Clones transfetados estavelmente são obtidos por um dos vários métodos padrão, por exemplo, por eletroporação 30 ou por nucleofeção. A eletroporação de DNA nas células NS/0 de mieloma de ratinho é realizada como se segue. As células NS/0 são crescidas em meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM, Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal de bovino, glutamina 2mM, piruvato de sódio 1 mM e lx penicilina/estreptomicina. Cerca de 5xl06 células foram lavadas uma vez com PBS e resuspendidas em 0,5 mL de solução de tampão fosfato (PBS) . Dez microgramas de DNA de plasmideo linearizado são depois incubados com as células numa Cuvete Gene Pulser (elétrodo gap 0,4 cm, BioRad) durante 10 minutos em gelo. A eletroporação é realizada usando um Gene Pulser (BioRad) com ajustes a 0,25 V e microF. As células foram deixadas recuperar durante 10 minutos sobre gelo, após o que foram resuspendidas em meio de crescimento e depois plaqueadas para duas placas de 96 poços. Os clones transfetados estavelmente foram selecionados pelo crescimento na presença de 100 nM de metotrexato (MTX) , o qual foi introduzido dois dias após a transfeção. As células são alimentadas todos os 3 dias duas, três ou mais vezes, e os clones resistentes a MTX geralmente apareciam num período de 2 até 3 semanas. Os sobrenadantes dos clones são analisados por ELISA Fc anti-humano para identificar os altamente produtores [Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191]. Os clones altamente produtores são isolados e propagados em meio de crescimento contendo 100 nM de MTX.

De modo semelhante, podem ser usadas outras linhas de células para obter clones transfetados estavelmente essencialmente pelo mesmo método, tais como células CHO, células BHK, células SP2/0, e células YB2/0. Quando foram usadas as células YB2/0, os clones transfetados estavelmente foram geralmente selecionados quanto ao crescimento na presença de 50 nM MTX. 31

Clones transfetados estavelmente, por exemplo a partir de células YB2/0 de mieloma de ratazana, foram também obtidos por nucleofeção. Cerca de 2xl06 células YB2/0, crescidas em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) suplementado com 10 % de soro fetal bovino inativado pelo calor, glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, e 1 x penicilina / estreptomicina, foram centrifugados a 90xg à temperatura ambiente durante 10 min e resuspendidas em 100 μ]1 de

Solução Nucleofetora V suplementada. 100 μ]1 da suspensão de células foram misturados com 2 μρ de DNA de plasmídeo linearizado (linearizado no sitio Fsp I na sequência β-lactamase), transferidos para uma cuvete (Amaxa), e a nucleofeção foi realizada usando o programa Nucleofetor apropriado (Amaxa), Q-20. 500 μΐ de meio de cultura pré- aquecido foram adicionados e a amostra foi transferida para uma placa de 12 poços. Um dia após a transfeção, as células foram resuspendidas em meio de crescimento e plaqueadas para placas de 96 poços com densidades de células variando desde aproximadamente 10 células/poço até aproximadamente 600 células/poço. Os clones transfetados estavelmente foram selecionados quanto ao crescimento na presença de 50 nM de metotrexato (MTX) , o qual foi introduzido dois dias após transfeção. As células foram alimentadas todos os 2 ou 3 dias duas vezes mais, e os clones resistentes a MTX apareceram geralmente em 2 até 3 semanas. Os sobrenadantes dos clones foram analisados por ELISA Fc antihumano para identificar os altamente produtores [Gillies et al. (1989) J. Immunol. Métodos 125:191]. Os clones altamente produtores foram isolados e propagados em meio de crescimento contendo 50 nM de MTX.

As células podem ser crescidas num meio alternativo conhecido na técnica, tal como HSFM suplementado com soro 32 fetal bovino a 2,5% e 100 nM de metotrexato, ou num meio sem proteína tal como o meio CD. 1B. ELISAs

Foram usados diferentes ELISAs para determinar as concentrações dos produtos de proteína nos sobrenadantes dos clones resistentes a MTX e outras amostras de teste. Por exemplo, o ELISA anti-huFc é usado para medir a quantidade de proteínas contendo Fc humano, por exemplo, anticorpos quiméricos, e o ELISA anti-hu kapa é usado para medir a quantidade da cadeia leve kapa (das imunoglobulinas quiméricas ou humanas). O ELISA anti-huFc é descrito em pormenor a seguir. A. Placas de Revestimento

As placas ELISA são revestidas com IgG (H+L) anti-humano de cabra AffiniPure (Jackson Immuno Research) a 5 microgramas/mL em PBS, e 100 μΒ/poço em placas de 96 poços (Nunc-Immuno placa Maxisorp). As placas revestidas são cobertas e incubadas a 4°C durante a noite. As placas são depois lavadas 4 vezes com Tween a 0,05% (Tween 20) em PBS, e bloqueadas com BSA a 1%/soro de cabra a 1% em PBS, 200 microlitros/poço. Após incubação com o tampão de bloqueio a 37°C. durante 2 horas, as placas são lavadas 4 vezes com Tween a 0,05% em PBS e secas por absorção com toalhetes de papel. B. Incubação com Amostras de Teste e Anticorpo Secundário

As amostras de teste são diluídas até concentrações convenientes no tampão da amostra, o qual contem 1 % de BSA/1 % soro de cabra/0,05% de Tween em PBS. É preparada 33 uma curva padrão com um anticorpo quimérico (com um Fc humano), cuja concentração é conhecida. Para preparar uma curva padrão, são feitas diluições seriadas de uma amostra de tampão para dar uma curva padrão variando desde 125 ng/mL até 3,9 ng/mL. As amostras e os padrões diluidos são adicionados à placa, 100 microlitros/poço, e as placas são incubadas a 37° C. durante 2 horas.

Após incubação, a placa é lavada 8 vezes com 0,05% de Tween em PBS. A cada poço são depois adicionados 100 microlitros do anticorpo secundário, a IgG anti-humana conjugada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson Immuno Research), diluido a cerca de 1:120.000 no tampão de amostra. A diluição exata do anticorpo secundário tem de ser determinada para cada um dos lotes de IgG anti-humana conjugada com HRP. Após incubação a 37°C. durante 2 horas, a placa foi lavada 8 vezes com 0,05% de Tween em PBS. C. Desenvolvimento A solução de substrato é adicionada à placa a 100 μΒ/poço. A solução de substrato é preparada dissolvendo 30 mg de dihidrocloreto de o-fenilenodiamina (OPD) (1 comprimido) em 15 mL de ácido cítrico 0,025 M/tampão Na2HP04 0,05M, pH 5, a qual contém 0,03% de H202 adicionada de fresco. A cor é deixada desenvolver durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. O tempo de desenvolvimento está sujeito a mudança, dependendo da variabilidade das placas revestidas de lote a lote, do anticorpo secundário, etc. O desenvolvimento da cor na curva padrão é observado para determinar quando parar a reação. A reação é parada adicionando H2S04 4N, 100 μL/poço. A placa é lida através de uma placa de leitura, a qual é ajustada a 490 nm e a 650 34 nm e programada para subtrair a DO de base a 650 nm da DO a 490 nm. O ELISA kapa anti-hu segue o mesmo procedimento como descrito acima, exceto que o anticorpo secundário usado é kapa anti-hu de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Southern Biotechnology Assoe. Inc., Birmingham, Ala.), usado a uma diluição de 1:4000

Purificação

Foram seguidos os procedimentos padrão de purificação de anticorpo. Tipicamente, composições anticorpo B4 VHvxNKvy da invenção foram purificadas a partir de sobrenadantes de cultura de células via cromatografia de Proteina A baseada na afinidade da porção Fç para a Proteina A. O sobrenadante condicionado das células que expressam composições de anticorpo B4 VHvx/VKvy foi carregado a uma coluna de Sepharose de Proteina A de Fluxo Rápido pré-equilibrada. A coluna foi lavada extensivamente com tampão de fosfato de sódio (Fosfato de Sódio 50 mM, NaCl 150 mM a pH neutro). A proteina ligada foi eluida com um tampão fosfato de sódio de baixo pH (pH 2,5 - 3) (composição como acima) e as frações eluidas foram imediatamente neutralizadas até cerca de pH 6,5 com base Tris 1 M. As composições foram armazenadas em Fosfato de Sódio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5 suplementado com Tween 80 até 0,01 %. A pureza e integridade do produto foram rotineiramente avaliadas por cromatografia de HPLC de exclusão de tamanho e por SDS-PAGE. Os resultados mostraram que os anticorpos B4 VHvx/VKvy da invenção foram tipicamente superiores a 90 % não-agregados e intatos, com pequena evidência de produtos de degradação. 35

Exemplo 3. Determinação da Afinidade de Ligação Relativa dos Anticorpos B4 da invenção a Células Apresentando CD-19.

Para verificar se os anticorpos da invenção retêm a ligação a CD19 foi usado um ensaio de competição, no qual foi medida a força destes anticorpos para inibir a ligação de anticorpo B4 parente marcado (B4 VHO/VKO) às células de linfoma de Daudi, as quais carregam o antigénio CD19. 0 anticorpo B4 VHO/VKO marcado com biotina foi preparado usando o Kit de Biotinilação EZ-link Sulfo-NHS-LC (Pierce, # 21430) de acordo com o protocolo fornecido. O produto foi dializado com um Slide-a-lyzer (Pierce, # 66425), e analisado por cromatografia de HPLC de exclusão de tamanho.

[0079] Em resumo, foi preparada uma série de titulação de anticorpo B4 VHO/VKO marcado com biotina pré-misturado a uma concentração final de 100 ng/mL com um dos anticorpos B4 VHvx/VKvy experimentais, não marcados, a 800 ng/mL, 400 ng/mL, 200 ng/mL, 100 ng/mL, e 50 ng/mL num tampão PBS/soro a 2 %. Como um controlo, o anticorpo marcado com biotina foi pré-misturado com anticorpo B4 VHO/VKO não marcado nas mesmas concentrações como acima (controlo de inibição) ou somente com tampão (controlo positivo de ligação). Os anticorpos combinados foram adicionados às células de Daudi durante 30 minutos a 4 o C. Uma diluição 1 :200 de esteptavidina marcada com FITC foi adicionada às células e as amostras foram incubadas durante um periodo adicional de 30 minutos a 4° C. A quantidade de anticorpo B4 VHO/VKO marcado ligado foi quantificada por análise FACS, e os resultados foram expressos como "percentagem de inibição", relativa ao controlo de ligação positivo. Os anticorpos testados foram B4 VHO/VKO (C), B4 VHvl/VKvl (1), B4 36 VHv2/VKvl (2) , B4 VHv3/VKv3 (5) , B4 VHv4/VKv4 (8) , B4 VHvl/VKv2 (3) , B4 VHv4/VKv3 (6) , B4 VHv5/VKv4 (9) , e

Resultados representativos de duas mostrados na Tabela 3 e Tabela 4. VHv2/VKv2 (4) , B4 VHv3/VKv4 (7) , B4 B4 VHv6/VKv4 (10) . experiências são

Tabela 3: Inibição da ligação da Biotina-B4 VHO/VKO às células Daudi por anticorpos da invenção.

Proporção(não marcado/marcado) Anticorpo (% de inibição de ligação do B4 marcado) C 12345678 8X 68 56 56 56 56 60 56 60 60 4X 56 44 40 44 44 40 44 52 48 2X 44 28 28 32 32 36 32 36 32 IX 28 16 16 20 16 20 16 20 16 0,5X 16 12 8 12 8 12 12 12 12

Tabela 4: Inibição da ligação da Biotina-B4 VHONKO às células Daudi por anticorpos da invenção

Proporção (não marcado/marcado) Anticorpo (% de inibição de ligação do B4 marcado) C 9 10 8X 93 90 87 4X 90 87 80 2X 83 70 70 IX 67 57 60 0,5X 50 47 53

Como mostrado na Tabela 3 e Tabela 4, verificou-se que os anticorpos B4 VHvx/VKvy inibiram a ligação de anticorpo B4 marcado a uma célula Daudi numa extensão semelhante à feita pelo anticorpo B4 VHO/VKO não marcado, indicando que as afinidades dos anticorpos B4 VHvx/VKvy e anticorpo B4 VHO/VKO são semelhantes. 37

Exemplo 4. Atividade ADCC de anticorpos da divulgação

Foi avaliada a atividade ADCC mediada pelos anticorpos da divulgação produzidos em várias linhas de células. A ADCC foi determinada por um ensaio padrão de libertação de 51Cr, como praticado na técnica. Foi preparada uma diluição seriada dos anticorpos (diluições 4 vezes numa gama desde 100 ng/mL até 0,025 ng/mL), e a lise pelas PBMCs humanas purificadas (células efetoras) das células Daudi marcadas com 51Cr (alvo; E:T é 100:1) na presença dos anticorpos foi medida por libertação de 51Cr especifico, em relação ao 51Cr celular total (ajustando em relação ao 51Cr libertado espontaneamente). Foram testados os anticorpos B4 VHv4/VKv4 produzidos a partir de células 293T de rim de embrião humano ou de células YB2/0, e os anticorpos B4 VHv5/VKv4 produzidos a partir de uma linha de célula NS/0 ou de linha de células YB2/0. A Figura 13 mostra os resultados dessa experiência. Ambos os anticorpos obtidos a partir da expressão celular YB2/0 foram igualmente ativos na mediação de ADCC, e pelo menos 50 vezes mais ativos que o correspondente anticorpo obtido por expressão a partir de uma linha de células NS/0 ou a partir de células 293T. 0 B4 VHv4/VKv4 produzido a partir de células 293T foi mais ativo que ο B4 VHv5/VKv4 produzido a partir de uma linha de células NS/0.

Exemplo 5. Depleção células B de ser humano enxertadas em ratinhos SCID pelos anticorpos da divulgação A depleção de células B é útil em vários contextos terapêuticos. Por exemplo, doenças dirigidas por anticorpos 38 podem ser tratadas com os anticorpos da invenção para reduzir ou eliminar totalmente as células B. Em alternativa, quando se trata com um agente que visa tumores tais como Zepelim™ ou Bexxar™ ou uma proteina de fusão Leul6-IL2 (W02005/016969), é útil eliminar primeiro as células B normais.

Para saber se um anticorpo da invenção pode ser usado para destruir células B humanas, foram realizadas as seguintes experiências. Ao dia 0_, machos de ratinhos SCID CB17 (n = 3) foram enxertados com PBMCs humanas purificadas nas quais cerca de 4,5 x 107 células em 0,2 mLs de PBS foram injetados intraperitonealmente, seguindo essencialmente um protocolo descrito para transferir as células do baço humano (Yacoub-Youssef et al., Transpl. Immunol. (2005) 15:157-164). No dia 3, os ratinhos foram injetados intraperitonealmente com PBS ou com 50 microgramas do anticorpo Leul6 anti-CD20 ou com o anticorpo K4H4 anti-CD19. Os níveis de IgM humano foram medidos através de um kit de quantificação ELISA de IgM humano (Bethyl Laboratories; Cat # E80-100) nos dias 7, 14, e 21. A Figura 14 mostra resultados típicos. Nos controlos tratados com PBS, o título de IgM humano aumenta continuamente, atingindo cerca de 800 microgramas/mL aos 42 dias. Nos ratinhos tratados com Leul6 ou com anticorpo B4 VHv5/VKv4, os títulos de IgM humano estavam basicamente ausentes, indicando que as células B humanas foram destruídas por estes tratamentos com anticorpo.

Exemplo 6. Tratamento de um mamífero com linfoma com um anticorpo da divulgação. 39

Para saber se os anticorpos da invenção são funcionais in vivo, o anticorpo B4 VHv4/VKv4, expressado nas células YB2/0, foi testado num modelo animal de linfoma humano. Ratinhos SCID CB17 com oito semanas (n = 6) foram injetados intravenosamente com cerca de lxlO6 células 'Namalwa' Nalm-6-UM-l viáveis no dia 0. Nos dias 1, 3 e 5, os ratinhos foram tratados intraperitonealmente com 500 microgramas de anticorpo ou com PBS. Cerca de uma até duas vezes por semana os ratinhos foram examinados para ver quais os ratinhos que ficaram doentes de modo a necessitarem de eutanásia. A Figura 15 mostra resultados típicos de uma dessas experiências. Os ratinhos tratados com PBS ficaram todos doentes dentro de 10 semanas de injeção das células tumorais, enquanto que os ratinhos tratados com o anticorpo B4 VHv4NKv4 ficaram doentes mais tarde, e três dos seis ratinhos neste grupo permaneceram saudáveis ao longo do periodo das 30 semanas da experiência.

Exemplo 7. Tratamento de um mamífero carregando linfoma de Burkitt com um anticorpo da invenção em combinação com quimioterapia.

Para saber se os anticorpos da divulgação podem ser usados in vivo em combinação com quimioterapia, o anticorpo B4 VHv4/VKv4 foi testado em modelos animais de linfoma humano que foram mais rigorosos do que no exemplo anterior, correspondendo a formas de tratamento mais avançadas ou a formas de linfoma mais difíceis de tratar. Numa experiência representativa, a linha de células Daudi, que é uma linha de células de linfoma de Burkitt, foi tratada com o anticorpo B4 VHv4/VKv4, expresso nas células YB2/0, com ou 40 sem ciclofosfamida (CPA) . Ratinhos SCID CB17 (n = 6) com oito semanas foram injetados intravenosamente com cerca de 5xl06 células Daudi viáveis no dia 0. Nos dias 8 e 12, os ratinhos foram tratados com 100 microgramas de anticorpo ou com PBS. No dia 7, os ratinhos foram tratados com PBS ou 75 microgramas de CPA por quilograma de peso corporal. Os tratamentos foram administrados intraperitonealmente em 0,2 mLs. Cerca de uma a duas vezes por semana os ratinhos foram examinados para ver quais os ratinhos que ficaram suficientemente doentes para necessitarem de eutanásia. A Figura 16 mostra os resultados de uma experiência típica. No grupo controlo não tratado nem com anticorpo nem com CPA, todos os ratinhos ficaram doentes no período de quatro semanas após injeção das células de linfoma. Nos grupos dos ratinhos tratados isoladamente com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 ou com CPA, 5 dos 6 ratinhos estiveram saudáveis durante pelo menos cinco semanas mas ficaram doentes ao fim de cerca das seis semanas. No grupo de ratinhos tratados com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 e com CPA, todos os ratinhos permaneceram saudáveis durante pelo menos oito semanas.

Exemplo 8. Tratamento de doença disseminada de linfoma com um anticorpo da invenção combinado com quimioterapia

Num outro conjunto de experiências, as células Namalwa foram injetadas intravenosamente nos ratinhos como descrito no Exemplo anterior, excetuando que foram usadas 2xl06 células em vez de lxlO6 células. Este aumento no número de células resulta numa evolução da doença mais agressiva, como indicado através da comparação com os ratinhos tratados com PBS na Figura 42, os quais ficaram doentes num periodo de três semanas, em oposição aos ratinhos tratados com PBS na Figura 40, os quais ficaram doentes entre cinco 41 e 10 semanas. Os ratinhos (n=5) foram tratados intraperitonealmente com 500 microgramas do anticorpo ou com PBS nos dias 3, 7 e 11. Os ratinhos foram também tratados com ciclofosfamida (75 mg/kg, i.p.), ou vincristina (0,4 mg/kg, i.v.) ou doxorubicina (3 mg/kg, i.v.) ou PBS (i.v.) nos dias 3, 7, e 11. Os resultados são mostrados na Figura 17 (a-c) . Os resultados indicaram que cada um dos três agentes quimioterapêuticos pode ser combinado com um anticorpo da invenção.

Exemplo 9. Tratamento de um doente humano com anticorpos e métodos da divulgação (para melhor ilustração geral).

Os anticorpos anti-CD19 da invenção são usados para tratar doenças e distúrbios de seres humanos como se segue. Em geral, o método preferido de administração é por infusão intravenosa ou injeção intravenosa, embora a injeção subcutânea, inalação, aplicação oral, e outros métodos sejam também possíveis. São usadas administrações cerca de uma vez todas as 2, 3 ou 4 semanas, embora a frequência de administração possa variar dependendo das necessidades do doente. Uma dose típica é cerca de 100 até 800 mg para um ser humano adulto. Os doentes tratados foram monitorizados quanto aos sinais de infeção que podem resultar da imunossupressão.

Por exemplo, um doente com doença de Castleman é tratado com anticorpo B4 VHv4/VKv4 anti-CD19 da invenção cerca de uma vez todas as duas semanas com uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão de gotas durante cerca de 1 hora.

Um doente com artrite reumatóide é tratado com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 anti-CD19 cerca uma vez a cada quatro semanas 42 com uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão de gotas durante cerca de 1 hora. A progressão da destruição articular verificou-se ser significativamente inibida por monoterapia, mesmo quando comparada com fármacos antireumáticos modificadores de doença.

Um doente com doença de Crohn é tratado com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 anti-CD19 cerca de uma vez cada quatro semanas com uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão por gotas durante cerca de 1 hora.

Um doente com mieloma múltiplo é tratado com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 anti-CD19 cerca de uma vez cada três semanas com uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão de gotas durante cerca de 1 hora. 0 tratamento com ο B4 VHv4/VKv4 anti-CD19 é combinado com um tratamento padrão de cuidados para mieloma múltiplo como determinado por um médico como apropriado para o doente.

Um doente com um linfoma da célula B é tratado com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 anti-CD19 cerca de uma vez cada três semanas com uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão por gotas durante cerca de 1 hora, opcionalmente em combinação com um anticorpo tal como Rituxan™ a cerca de 375 miligramas por metro quadrado de área corporal, o qual é administrado todas as semanas, ou com o anticorpo anti-CD22 epratuzumab. Em alternativa, no caso de um doente com linfoma refratário, o tratamento com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 anti-CD19 é combinado com um radioimunoconjugado tal como Bexxar™ ou Zevalin™.

Mais especificamente, um doente com um linfoma das células B é tratado com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 anti-CD19 cerca de uma vez, todas as três semanas, a uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão por gotas durante 43 cerca de 1 hora, opcionalmente em combinação com um regime quimioterapêutico tal como ciclofosfamida mais vincristina mais doxorubicina mais prednisolona ("CHOP"), ou CHOP mais bleomicina, ou CHOP mais etoposida, ou mitoxantrona mais vincristina mais tiotepa, ou etoposido mais prednisolona mais citarabina mais cisplatina, ou mesna mais ifosfamida mais mitoxantrona mais etoposido, ou bendamustina, ou fludaribina e 2-CdA.

Numa estratégia de tratamento alternativo, um doente com um linfoma das células B é tratado inicialmente com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 anti-CD19 com uma dose de cerca de 8 mg/kg, e é depois tratado com uma proteina de fusão anti-CD20-IL2 tal como descrito na W02005/016969. Por exemplo, um doente é tratado um dia 1 com o anticorpo B4 VHv4/VKv4 anti-CD19 com administração por infusão de gotas durante cerca de 1 hora, e depois tratado ao dia 2 e ao dia 4 com uma proteina de fusão anti-CD20-IL2 a uma dose de cerca de 150 microgramas por kg com administração por infusão por gotas durante cerca de 4 horas, e este ciclo é repetido cerca de todas as 3 semanas. Sem desejar estar ligado a uma teoria, o anticorpo B4 VHv4NKv4 anti-CD19 tem o efeito de limpar a maioria das células B normais do doente, de modo a que a proteina de fusão anti-CD20-IL2 exerça os seus efeitos ligando-se às células de tumor restantes.

Lisboa, 05 de Setembro de 2013

Claims

1 REIVINDICAÇÕES Um anticorpo anti-CD-19 manipulado o qual foi modificado em comparação com anticorpo B4 anti-CD-19 de murino, para uso para o tratamento de doença disseminada de linfoma em combinação com um agente quimioterapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em ciclofosfamida, vincristina e doxorubicina, em que o referido anticorpo anti-CD19 modificado é obtido pela expressão das células YB2/0, e a modificação no referido anticorpo consiste na substituição da região variável de cadeia pesada de murino da SEQ ID NO: 13 do anticorpo parente B4 pela SEQ ID NO: 17, e a substituição da região variável de cadeia leve de murino da SEQ ID NO:25 do anticorpo B4 parente pela SEQ ID NO:29, e o anticorpo modificado é menos imunogénico que o anticorpo parente B4 anti-CDl9 de murino não modificado quando administrado a um ser humano mas é ainda competente para ligar especificamente CD 19 e as células alvo que expressam CD 19.

2. Um anticorpo anti-CD 19 o qual é modificado em comparação com o anticorpo B4 anti-CD 19 de murino, para uso para o tratamento de linfoma de Burkitt em combinação com o agente quimioterapêutico ciclofosfamida, em que o referido anticorpo anti-CD 19 modificado é obtido por expressão a partir das células YB2/0, e a modificação no referido anticorpo consiste na substituição da região variável de cadeia pesada de murino da SEQ ID NO: 13 do anticorpo B4 pela SEQ ID NO:17, e a substituição da região variável de cadeia leve de murino da SEQ ID NO: 25 do anticorpo B4 parente pela SEQ ID NO: 29, e o anticorpo modificado é menos imunogénico que o anticorpo parente B4 anti-CD 2 19 de murino não modificado quando administrado a um ser humano mas que ainda é competente para ligar especificamente CD 19 e as células alvo que expressam CD 19. Lisboa, 05 de Setembro de 2013