CN111094559A - 新型治疗酶融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗酶和免疫球蛋白Fc区的融合蛋白、制造其的方法以及包括其的组合物。

Description

新型治疗酶融合蛋白及其用途

[技术领域]

本发明涉及为了增加治疗酶的体内半衰期而将免疫球蛋白Fc区与酶融合的治疗酶融合蛋白、用于其制备的方法以及包含其的组合物。

[背景技术]

溶酶体是胞质的细胞器，其功能是降解大分子，例如蛋白质、多核苷酸、多糖和脂类。溶酶体的内部环境是酸性的，并且在其中包含促进生物大分子水解的水解酶。还发现溶酶体通过细胞内吞作用在分子吸收中具有一定作用。

溶酶体贮积症(以下称为LSD)是以溶酶体功能丧失为特征的遗传性代谢疾病。LSD是由于缺乏降解例如脂类、蛋白质、多糖等物质的酶而引起的，并且它们通常发生的发生率是十万分之一，并且作为常染色体隐性性状遗传。当特异性降解酶不足或缺乏时，会出现LSD，并且当这些降解酶不足时，所得过量的物质会积累而不会被降解，这最终导致细胞功能上的问题。像许多其他遗传疾病一样，LSD遗传自父母。此外，这些疾病的每一种通过任何分别参与不同酶翻译的基因的突变而发生。导致这些疾病的酶通常具有相似的生化性质，并且所有的LSD都是通过溶酶体中物质的异常积累引起的。目前，已知约50种不同类型的LSD(例如，尼曼-匹克病、法布里氏病、戈谢病、亨特综合征、马-拉综合征(Maroteaux-Lamysyndrome)等)。治疗这些LSD的代表性方法可以是酶替代疗法(ERT)，并且目前正在进行许多相关研究(Frances M.Platt等，J Cell Biol.2012Nov 26；199(5)：723到34)。

LSD的代表亨特综合征是由于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)的缺乏所引起的疾病，其中由于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的缺乏，葡糖胺聚糖(GAG)不会降解，并在溶酶体中积累。亨特综合征的症状包括面部特征中独特的粗糙、大头、由于肝肿大和脾肿大造成的腹部肿胀等，并且其还伴有听力丧失、心脏瓣膜病、阻塞性呼吸道疾病、睡眠呼吸暂停等。已知亨特综合征在162,000中的1人发生，并以与X染色体相关的X连锁隐性形式遗传。目前使用

(重组IDS，Shire Pharmaceuticals Group)作为亨特综合征治疗的酶替代疗法。

通常地，蛋白质例如治疗酶具有低稳定性，并因此容易被血液中的蛋白酶变性和分解。因此，为了维持这些蛋白的血液浓度和效力，有必要对患者频繁给药。然而，在以注射形式向患者施用蛋白药物的情况下，为了维持活性多肽的血液浓度的频繁注射对患者可造成显著的痛苦。为了解决这些问题，一直努力通过增加治疗酶的血液稳定性和长时间段将它们的血液浓度保持在高水平以最大化药理效力。需要这种治疗酶长效制剂以增加治疗酶的稳定性，和同时将药物本身的效力维持在足够高的水平，以及不会导致患者的免疫反应。

具体地，LSD是由于可导致死亡的具体酶中的遗传缺陷引起的致命疾病，并且替代疗法对于治疗缺陷酶是必须的。酶替代疗法是LSD中的标准疗法，并且该疗法具有通过替代缺陷酶缓解现有症状或延缓疾病进展的效果。然而，由于需要一到两周一次持续2至6个小时的连续静脉内施用，患者及其家庭成员的日常生活可能受到限制。

由于用于人的LSD治疗的重组酶的半衰期非常短——处于10分钟到少于3小时的范围内，并且必须在患者余生中施用重组酶，因此给患者带来了不便。因此，对于延长重组酶半衰期具有很高的需求。

为了稳定蛋白质并且防止它们在肾脏中被去除，目前正在积极地研究使用免疫球蛋白Fc区的融合蛋白。

免疫球蛋白是血液的主要成分，并且具有五种不同类型(即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)。对于融合蛋白研究最常使用的类型是IgG，并且其分为四个亚型(IgG1～IgG4)。使用免疫球蛋白Fc制备的融合蛋白可以增加其尺寸，并从而防止其在肾脏中被移除和也结合到FcRn受体上，并且从而通过内吞作用和循环进入细胞具有增加血液半衰期的作用。

然而，免疫球蛋白Fc区的缺点在于其可导致意外的免疫应答，从而具有效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。这些功能通过免疫球蛋白Fc区与Fc受体或补体的结合、或通过Fc区的糖基化而发生。此外，很可能的是在体内可发生Fc本身的不稳定性。

因此，存在这样的缺点：在体内同时稳定地增加所需融合蛋白持续时间期间，不能维持融合蛋白的活性。

[发明内容]

[技术问题]

本发明的目的是提供酶融合蛋白，其中免疫球蛋白Fc区与治疗酶融合，以致与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶相比，该治疗酶具有增加的体内持续时间。

本发明的另一个目的是提供包含治疗酶融合蛋白的药物组合物。

本发明的仍另一个目的是提供编码治疗酶融合蛋白的多核苷酸、包含多核苷酸的表达载体和将表达载体引入其中的转化体。

本发明的仍另一个目的是提供制备酶融合蛋白的方法，其包括培养转化体。

[技术方案]

本发明的方面提供了酶融合蛋白，其中治疗酶和免疫球蛋白Fc区融合。

在具体的实施方式中，本发明涉及酶融合蛋白，其中免疫球蛋白Fc区与治疗酶融合，以致与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶相比，该治疗酶具有增加的体内持续时间。

以下对应本发明进一步的实施方式。

具体地，作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于酶选自β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性神经鞘磷脂酶(acid sphingomyelinsase)、半乳糖脑苷脂酶、芳香基硫酸酯酶A、芳香基硫酸酯酶B、β-己糖胺酶A、β-己糖胺酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶和髓过氧化物酶。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于酶融合蛋白中的治疗酶和免疫球蛋白Fc区通过肽接头融合。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于将免疫球蛋白Fc区分子和二聚的治疗酶融合。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于免疫球蛋白Fc区在天然免疫球蛋白Fc区的至少一个氨基酸中具有选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变异。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于免疫球蛋白Fc区具有SEQ ID NO：8的氨基序列，并且第2个氨基酸被脯氨酸取代；第71个氨基酸被谷氨酰胺取代；或者第2个氨基酸被脯氨酸取代以及第71个氨基酸被谷氨酰胺取代。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于在免疫球蛋白Fc区中没有链交换发生。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶相比，其具有增加的稳定性以及降低的与溶酶体受体的结合亲和力，因此具有高度组织分布。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于免疫球蛋白Fc区选自(a)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；(b)CH1结构域和CH2结构域；(c)CH1结构域和CH3结构域；(d)CH2结构域和CH3结构域；(e)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区或所述铰链区的部分的组合；和(f)介于重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域之间的二聚体。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于免疫球蛋白Fc区具有至少一种选自以下的特征(a)去除能够形成二硫键的区域、(b)在天然Fc的N-末端去除某些氨基酸残基、(c)在天然Fc的N-末端添加甲硫氨酸残基、(d)去除补体结合位点或(e)缺失抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于免疫球蛋白Fc区是非糖基化的。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于免疫球蛋白Fc区是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc片段。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于免疫球蛋白Fc区是具有不同来源的结构域的混杂物(hybrid)，其衍生自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于免疫球蛋白Fc区为IgG4 Fc区。

作为根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白，酶融合蛋白的特征在于IgG4Fc区的铰链区被IgG1铰链区取代。

本发明的另一方面提供用于预防或治疗溶酶体贮积症(LSD)的药物组合物。

在具体的实施方式中，本发明涉及用于预防或治疗LSD的包含酶融合蛋白的药物组合物。

作为根据前述具体实施方式中任一项的组合物，组合物的特征在于LSD选自粘多糖贮积症(MPS)、糖原贮积病、鞘脂类代谢障碍、尼曼-匹克病、法布里氏病、戈谢病、亨特综合征、马-拉综合征。

作为根据前述具体实施方式的组合物，组合物的特征在于酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)或芳香基硫酸酯酶B(ARSB)。

作为根据前述具体实施方式中任一项的组合物，组合物的特征在于其降低了治疗酶对溶酶体受体的结合亲和力。

本发明的仍另一方面提供了编码酶融合蛋白的多核苷酸。

本发明的仍另一方面提供了包含多核苷酸的表达载体。

本发明的仍另一方面提供了将表达载体引入其中的转化体。

本发明的仍另一方面提供了用于制备酶融合蛋白的方法。

在具体的实施方式中，本发明涉及用于制备酶融合蛋白的方法，其包括培养转化体以获得培养物；以及从培养物中回收酶融合蛋白。

[本发明的有利效果]

本发明涉及长效治疗酶融合蛋白，和具体地，涉及将免疫球蛋白Fc区与治疗酶融合的酶融合蛋白，致使治疗酶具有增加的稳定性并且降低了通过肾去除酶的机制。由于增加的持续时间，本发明的酶融合蛋白可被患者有效地使用。

[附图说明]

图1显示证实IDS-Fc融合蛋白表达的图。

图2显示证实ARSB-Fc融合蛋白表达的图。

图3显示证实本发明的IDS-Fc融合蛋白药物代谢动力学实验结果的图。

图4显示证实本发明的ARSB-Fc融合蛋白药物代谢动力学实验结果的图。

图5显示证实本发明的IDS-Fc融合蛋白体外酶活性的图。

图6显示证实本发明的ARSB-Fc融合蛋白体外酶活性的图。

图7显示图解了将本发明的IDS-Fc融合蛋白静脉内或皮下注射到IDS敲除的小鼠后尿中葡糖胺聚糖(GAG)水平的测量结果的图。

图8显示图解了将本发明的IDS-Fc融合蛋白静脉内或皮下注射到IDS敲除的小鼠中后组织中葡糖胺聚糖(GAG)水平的测量结果的图。

图9显示证实本发明的ARSB-Fc融合蛋白组织分布程度的图。

[具体实施方式]

下文中，将详细地描述本发明的示例性实施方式。同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式可应用于其他解释和示例性实施方式。即，本文公开的多种要素的所有组合都属于本发明的范围。此外，本发明的范围不应当被下文中提供的具体公开内容所限制。

此外，基于常规实验，本领域技术人员将能够认识到或确认本申请中描述的本发明的具体实施方式的许多等同物，并且这些等同物旨在包括在本发明中。

贯穿整个说明书，不仅使用用于天然存在氨基酸的常规一字母或三字母代码，而且使用通常允许用于其他氨基酸的那些三字母代码，例如α-氨基异丁酸(Aib)、Sar(N-甲基甘氨酸)、α-甲基-谷氨酸等。此外，根据IUPAC-IUB规则，本文以缩写提到的氨基酸描述如下：

丙氨酸 A； 精氨酸 R；

天冬酰胺 N； 天冬氨酸 D；

半胱氨酸 C； 谷氨酸 E；

谷氨酰胺 Q； 甘氨酸 G；

组氨酸 H； 异亮氨酸 I；

亮氨酸 L； 赖氨酸 K；

甲硫氨酸 M； 苯丙氨酸 F；

脯氨酸 P； 丝氨酸 S；

苏氨酸 T； 色氨酸 W；

酪氨酸 Y；和 缬氨酸 V。

本发明的方面提供了酶融合蛋白，其中免疫球蛋白Fc区与治疗酶融合，致使与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶相比，该治疗酶具有增加的体内持续时间。

在本发明中，酶融合蛋白可以是其中免疫球蛋白Fc区与治疗酶融合的蛋白，致使与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶相比，该治疗酶可维持其活性，同时降低其与溶酶体受体的结合亲和力，从而增加了其血液半衰期。

本发明人已经制备了具有免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，以增加治疗酶的血液半衰期。具体地，作为Fc区，使用了IgG4 Fc类似物，其中潜在的糖基化序列被取代以抑制糖基化，并且此外地，IgG4 Fc的铰链序列被取代以抑制链交换。结果，本发明人已经证实与免疫球蛋白Fc区融合的治疗酶融合蛋白的血液半衰期具有明显增加的血液半衰期，并且能够维持与已知酶的活性类似的活性，从而提供新形式的融合蛋白结构，其中治疗酶和免疫球蛋白Fc区融合。

本发明的酶融合蛋白中所包括的治疗酶可以包括与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶类型相比具有延长的体内持续时间优势的任何治疗酶，但该治疗酶不具体限于此。在本发明的示例性实施方式中，酶融合蛋白是治疗酶的融合蛋白。

此外，本发明的酶融合蛋白可以用做酶促替代疗法(ERT)的药物。酶促替代疗法可通过补充导致疾病的有缺陷或不足的酶，通过劣化酶的功能恢复来预防或治疗疾病。

在具体的实施方式中，治疗酶可以是选自β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性神经鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳香基硫酸酯酶A、芳香基硫酸酯酶B、β-己糖胺酶A、β-己糖胺酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶和髓过氧化物酶的治疗酶，但不管其来源或类型，任何对疾病具有治疗作用的治疗酶可以包括在本发明中。

在本发明中，术语“酶融合蛋白”可与“长效酶融合蛋白”互换使用。

如本文所用，术语“治疗酶”指用于治疗由于不足、缺乏、不起作用等而发生的疾病的酶，并且酶可以通过酶替代疗法、施用等来治疗患有疾病的受试者。具体地，酶可以是用于治疗可能由于溶酶体酶的不足、缺乏等发生的LSD的酶，但酶不限于此。

具体地，本发明的治疗酶可以是芳香基硫酸酯酶B(ARSB)或艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，但治疗酶不限于此，只要其是对靶疾病呈现出治疗效果的酶即可。

如本文所用，术语“芳香基硫酸酯酶B(ARSB)”指存在于肝脏、胰腺和肾脏的溶酶体中的芳香基硫酸酯酶，并且该酶具有通过分解葡糖胺聚糖来水解硫酸盐的作用。已知芳香基硫酸酯酶B与粘多糖贮积症VI型(马-拉综合征)有关。在本发明中，术语芳香基硫酸酯酶B可以与加硫酶(galsulfase)互换使用。具体地，芳香基硫酸酯酶B可包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其可通过SEQ ID NO：3的多核苷酸序列编码，但芳香基硫酸酯酶B不限于此。

如本文所用，术语“艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶”是与亨特综合征(MPS-II)相关的硫酸酯酶，并且其是溶酶体降解硫酸肝素和硫酸皮肤素必需的酶。在本发明中，术语艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可以与艾杜硫酸酯酶(idursulfase)互换使用。艾杜硫酸酯酶可以是艾杜硫酸酯酶α或艾杜硫酸酯酶β，但艾杜硫酸酯酶不限于此。具体地，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可以包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其可由SEQ ID NO：1的多核苷酸序列编码，但艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶不限于此。

可以通过本领域内已知的方法制备或制造治疗酶，和具体地，酶可以在培养插入动物表达载体的动物细胞后从培养物中纯化，或者可以在购买市售的酶后使用，但酶不限于此。

本发明的酶融合蛋白可以是其中一种或两种结合一分子的Fc区的形式，该Fc区具有二聚形式的两条免疫球蛋白链，但酶融合蛋白不限于此。具体地，本发明的酶融合蛋白可以是如此形式，其中单体Fc区与酶融合并表达，和然后两个单体Fc区通过二硫键形成一分子的二聚Fc区，并且两种酶的每一种与两个Fc区的每一个相连，但酶融合蛋白不限于此。酶可以通过共价键或非共价键彼此连接，或可以彼此独立，但酶融合蛋白不限于此。

具体地，在本发明的实施方式中，确认了与未融合Fc区的酶相比，长效酶融合蛋白——其中艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶或芳香基硫酸酯酶B的二聚体与一分子Fc区融合——显示出更高的体外酶活性，并且确认了这是由于包括治疗酶的二聚体的酶融合蛋白的结构特性(实施例5)。

此外，在另一方面，本发明的酶融合蛋白可以是其中免疫球蛋白Fc区通过肽接头与治疗酶融合的酶融合蛋白。

肽接头可以包括一个或多个氨基酸，例如1至1,000个氨基酸，但肽接头不具体限于此。在本发明中，任何已知的肽接头(例如，包括[GS]_x接头、[GGGS]_x接头和[GGGGS]_x接头等，其中x是1或更大(例如1、2、3、4、5或更大)的自然数)，并且更具体地，是SEQ ID NO：6的氨基酸序列，但肽接头不限于此。

出于本发明的目的，肽接头与治疗酶和免疫球蛋白Fc融合的位置没有限制，只要肽接头可以连接治疗酶和免疫球蛋白Fc同时保持治疗酶活性即可，具体地，连接治疗酶和免疫球蛋白Fc区的两端，和更具体地，连接治疗酶的C末端和免疫球蛋白Fc区的N末端，但位置不限于此。

如本文所用，术语“N末端”和“C末端”分别指蛋白质的氨基端和羧基端。例如，“N末端”或“C末端”不仅可包括N末端或C末端的最末端氨基酸残基，还包括与N末端或C末端的氨基酸残基相邻的氨基酸残基，和具体地，从末端自身的第1个氨基酸残基至第20个氨基酸残基，但N末端或C末端不具体限于此。

在本发明的实施方式中，通过重叠PCR使用治疗酶和接头(SEQ ID NO：6)-IgG4制备融合蛋白(SEQ ID NO：23或25)，其中IgG4的N-末端与治疗酶的C-末端融合，并且证实了融合蛋白的表达(实施例1至3)。

本发明的酶融合蛋白中包含的治疗酶可以是天然存在的类型和由治疗酶或治疗酶类似物的一部分组成的片段，其中发生选自一些氨基酸的取代、添加、缺失和修饰及其组合的变异，只要其活性等同于天然存在类型的治疗酶的活性，就可以非限制性地包括在本发明中。

此外，治疗酶的类似物包括所有将一种或多种氨基酸添加到天然存在类型的治疗酶的氨基和/或羧基末端的治疗酶类似物。

对于氨基酸的取代或添加，不仅可以使用人蛋白质中常见的20种氨基酸，也可以使用非典型或非天然存在的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源可包括Sigma-Aldrich,ChemPep Inc.,Genzyme Pharmaceuticals等。包括这些氨基酸和非典型肽序列的肽可以合成以及从商业供应商购买，例如，American Peptide Company,Bachem(USA)或Anygen(Korea)，但商业来源不限于此。

如本文所用，术语“片段”指去除天然治疗酶或天然治疗酶的类似物的氨基或羧基末端的一个或多个氨基酸的形式。天然治疗酶或其类似物，无论片段的大小或氨基酸的种类如何，只要它们具有治疗酶的活性就属于本发明的范围。

治疗酶类似物可包括相应治疗酶的生物类似物(biosimilars)和生物改良剂(biobetters)。例如，对于生物类似物，考虑与已知的治疗酶相比宿主对其表达的差异，糖基化特征及其程度的差异，以及根据取代程度非100％取代的标准序列，相应酶的特定氨基酸残基中取代程度的差异，它们属于用作本发明的酶融合蛋白的生物类似酶。可以通过本领域中已知的方法，具体是通过在动物细胞、大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞、活体动物等中的基因重组来生产治疗酶，并且制备方法不限于此，以及可以购买和使用市售的酶，但酶不限于此。

此外，治疗酶可包括氨基酸序列，其对比上述酶或其类似物至少具有80％、更具体地90％、甚至更具体地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性，并且治疗酶可通过重组技术从微生物中获得或者是市售的那些治疗酶，但治疗酶不限于此。

如本文所用，术语“同源性”表示与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列的相似度，并且可以通过肉眼或使用可容易购买的比较程序进行同源性比较。使用商用计算机程序可以以百分比(％)计算两个或更多个序列之间的同源性。对于相邻序列可计算同源性(％)。

关于治疗酶或其类似物的序列和编码其的核苷酸序列的信息可以从已知的数据库(例如NCBI等)中获得。

如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc区”指免疫球蛋白分子的区域，其包括重链恒定区2(CH2)和/或重链恒定区3(CH3)，不包括重链和轻链的可变区。为了本发明的目的，这类免疫球蛋白Fc区可包括在重链恒定区的修饰铰链区，但不限于此。

这类免疫球蛋白Fc区可以包括在重链恒定区中的铰链区，但不限于此。此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是延伸的Fc区，其包括重链恒定区1(CH1)和/或轻恒定区1(CL1)的部分或全部，不包括免疫球蛋白的重链和轻链的可变区，只要免疫球蛋白Fc区具有与其天然型相同或等同的作用即可。此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是如此区域，其中去除了对应于CH2和/或CH3的显著长的氨基酸序列的部分。

在另一方面，本发明提供了免疫球蛋白Fc区，其可以选自：1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；2)CH1域和CH2域；3)CH1域和CH3域；4)CH2域和CH3域；5)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区(或铰链区的部分)之间的组合；6)介于重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域之间的二聚体，但免疫球蛋白Fc区不限于此。

如本文所用，术语“链交换”指以下问题，其中当将IgG4 Fc用作融合蛋白的载体时，IgG4 Fc与体内存在的IgG4形成混杂物或作为单体存在并改变了最初的结构以具有带有低治疗活性的结构，并且先前报道，当将融合蛋白质的融合蛋白用于治疗目的时，具有显著的困难(van der Neut Kolfschoten等，Science，317：1554至1557.2007)。

在本发明中，本发明人努力通过替代免疫球蛋白Fc区中铰链区的序列以解决上述问题。具体地，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是如此区，其中有效的糖基化序列被取代用于调节糖基化，或参与链交换的序列被取代，或者可以对应于该两种情况。

在具体的实施方式中，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是其中SEQ ID NO：8的免疫球蛋白Fc区的第2个氨基酸和/或第71个氨基酸被不同的氨基酸取代以防止链交换和N-糖基化的区。更具体地，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是1)其中第2个氨基酸(即丝氨酸)被脯氨酸取代的区，2)其中第71个氨基酸(即天冬酰胺)被谷氨酰胺取代的区，但免疫球蛋白Fc区不限于此。除了上述变化之外，免疫球蛋白Fc区可包括适当的变异作为增加治疗酶稳定性的药物载体。

具体地，免疫球蛋白Fc区可以是其中免疫球蛋白IgG4 Fc的铰链区被IgG1铰链区取代的区，但免疫球蛋白Fc区不限于此。

在本发明的实施方式中，SEQ ID NO：8的免疫球蛋白Fc区的第2个氨基酸被脯氨酸取代，并且SEQ ID NO：8的免疫球蛋白Fc区的第71个氨基酸被谷氨酰胺取代，并从而减少链交换和N-糖基化。制备的免疫球蛋白Fc的序列具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列(实施例1)。

在实施方式中，铰链区可以是其中缺失或修饰具有以下氨基酸序列的铰链序列的一部分的区。

Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：26)

具体地，铰链区可以是具有变异的区，其中缺失铰链区的一部分使仅包括一个半胱氨酸(Cys)残基；或该区可以是其中参与链交换的丝氨酸(Ser)残基被脯氨酸(Pro)残基取代的区，和更具体地，是其中铰链序列的第2个丝氨酸被脯氨酸残基取代的区，但铰链区不限于此。

在本发明中，免疫球蛋白Fc区可通过包括其天然形式的铰链区或修饰的铰链区而增加融合治疗酶的稳定性，同时防止Fc区中的链交换和单体形成。

此外，在另一个具体实施方式中，本发明的免疫球蛋白Fc区不仅包括天然氨基酸序列，也包括其序列类似物。氨基酸类似物指在天然氨基酸序列的至少一个氨基酸残基中发生选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变异。

例如，可以将已知对连接重要的IgG Fc中的位置214至238、297至299、318至322或327至331处的氨基酸残基用作适合变异的位点。此外，多种类型的类似物是可能的，例如，其中去除能够形成二硫键的位点的类似物、其中去除天然Fc中数个N-末端氨基酸的类似物、其中将甲硫氨酸残基添加到天然Fc的N-末端的类似物等。此外，可以去除补体结合位点(例如C1q结合位点)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点以去除效应器功能。用于制备免疫球蛋白Fc区的序列类似物的技术在国际公开号WO97/34631、WO 96/32478等中公开。

不改变分子整体活性的蛋白质或肽分子中的氨基酸取代是本领域所公知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，纽约，1979)。最常见的取代发生在介于Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly的氨基酸残基之间。在一些情况下，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙酰化、酰胺化等修饰氨基酸。

此外，上述的Fc类似物可以是如此类似物，其表现出与本发明的Fc区活性相同的生物学活性，并且具有抗热、抗pH等Fc区的增加的结构稳定性。

此外，这类Fc区可以由分离自人或动物例如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等的天然类型中获得，或者可以是从转化的动物细胞或微生物中获得的其重组体或类似物。在本文中，它们可以通过从人或动物生物体中分离完整免疫球蛋白并用蛋白酶对其处理从天然Fc中获得。木瓜蛋白酶将天然Fc区消化成Fab和Fc区，并且胃蛋白酶处理导致pF'c和F(ab)₂片段的产生。这些片段可以进行尺寸排阻色谱法以分离Fc或pF'c。在更具体的实施方式中，Fc区可以是从微生物中获得的重组免疫球蛋白Fc区，其是人源的Fc区。

此外，免疫球蛋白Fc区可以是天然聚糖的形式、与其天然类型相比增加或降低的聚糖或去糖基化的形式。可以通过常规方法，例如化学法、酶促法和使用微生物的基因工程法实现免疫球蛋白Fc聚糖的增加、减少或去除。具体地，从Fc区去除聚糖的免疫球蛋白Fc区显示了对补体(C1q)的结合亲和力的明显降低，以及抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或去除，并且因此其没有在体内诱导不必要的免疫应答。在这方面，去糖基化或非糖基化的免疫球蛋白Fc区中的免疫球蛋白Fc区可以是更合适的形式以满足本发明作为药物载体的原始目的。

如本文所用，术语“去糖基化”指通过酶从Fc区去除糖部分，并且术语“非糖基化”指在原核生物，更具体地，大肠杆菌中产生的未糖基化的Fc区。

同时，免疫球蛋白Fc区可以源自人或动物，其包括牛、山羊、猪，小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠，并且更具体地，它可以源自人。

此外，免疫球蛋白Fc区可以是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或混杂物的Fc区。在更具体的实施方式中，它可以衍生自IgG或IgM，它们是人血液中最丰富的蛋白质之一，和在甚至更具体的实施方式中，它可以衍生自IgG，已知其可提高配体结合蛋白的半衰期。在更具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc区可以是IgG4 Fc区，在甚至更具体的实施方式中，它可以是源自人IgG4的非糖基化的Fc区，并且在最具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc区可以是IgG4 Fc区，其包括其中具有免疫球蛋白Fc区的SEQ ID NO：8的氨基酸序列的第2个氨基酸被脯氨酸取代和/或第71个氨基酸被谷氨酰胺取代的变异；或者，免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列为SEQ ID NO：9和编码氨基酸序列的多核苷酸是SEQ ID NO：7，但免疫球蛋白Fc区不限于此。

如本文所用，术语“组合”指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。即，可以从选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc的Fc片段的两个或更多个片段制备二聚体或多聚体。

此外，本发明的蛋白质可以是其中蛋白质的N-末端和/或C-末端未被修饰的蛋白质，但为了保护治疗酶免受体内蛋白质裂解酶的破坏和增加治疗酶的稳定性，根据本发明的蛋白质的范围内也包括如此蛋白，其中，通过有机基团化学上修饰或保护治疗酶的N-末端和/或C-末端，或者通过添加氨基酸修饰治疗酶的氨基末端等。当治疗酶的C-末端未被修饰时，根据本发明的蛋白质的末端可以具有羧基末端，但本发明的蛋白质不具体限于此。

具体地，由于化学合成的蛋白质的N-末端和C-末端具有电荷，因此可N-末端将乙酰化和/或可将C-末端酰胺化以便去除这些电荷，但是方法不具体限于此。

除非本说明书中另有说明，否则根据在本发明的具体实施方式或权利要求中描述的本发明，关于“酶”或“融合蛋白”的技术将不仅应用于对象酶或融合蛋白，而且应用到包括对象酶或融合蛋白的所有盐(例如，融合蛋白的药学上可接受的盐)或其溶剂化物的范围。因此，尽管在说明书中其简单地描述为“酶”或“融合蛋白”，但是本主题描述将同样应用于具体盐、具体溶剂化物和具体盐的具体溶剂化物。例如，这类盐形式可以是使用任何药学上可接受的盐的形式，但盐的种类没有具体限制。例如，那些盐形式可以是对哺乳动物安全且有效的盐形式，但是盐形式不具体限于此。

如本文所用，术语“药学上可接受的”指可以在医药决策的范围内有效地用于预期用途而不会引起过度的毒性、刺激或过敏反应等的材料。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指衍生自药学上可接受的无机盐、有机盐或碱的盐。适合的盐的实例可以包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。衍生自适合的碱的盐的实例可包括碱金属，例如钠、钾等；碱土金属，例如镁；铵等。

此外，如本文所用，术语“溶剂化物”指在酶、根据本发明的融合蛋白或其盐与溶剂分子之间形成的复合物。

本发明的酶融合蛋白可以通过本领域已知的方法制备。

在本发明的实施方式中，制备了重组载体，其中艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)和芳香基硫酸酯酶B(ARSB)(即，治疗酶)的每个可以以融合至肽接头-免疫球蛋白Fc的形式表达，并且通过在CHO细胞系中表达它们制备这些治疗酶(实施例1至3)。

然而，可以通过上述实施方式中描述的那些以外的方法制备本发明的酶融合蛋白。酶融合蛋白可以包括SEQ ID NO：23或25的氨基酸序列，但氨基酸序列不限于此。

通过将治疗酶融合至免疫球蛋白Fc区，根据本发明的酶融合蛋白可增加对LSD表现出治疗效果的治疗酶的半衰期，同时保持治疗酶的活性。具体地，与修饰的免疫球蛋白Fc区融合的治疗酶减少了链交换和糖基化，并且因此与未融合Fc的治疗酶相比，其可对溶酶体受体具有较低的结合亲和力，并且可从而具有高的持续时间，这证实了这种治疗酶对LSD的治疗有效。

在本发明的实施方式中，证实了与未融合Fc区的天然存在的酶相比，根据本发明的酶融合蛋白可以保持体外酶活性(实施例5)，同时具有明显优异的半衰期(T_1/2)、血液中的最大药物浓度(C_max)和体内利用度(AUC)(实施例4)，并且从这些结果证实，与常规药物相比，甚至可以以低剂量使用药物(实施例6)。

本发明的仍另一方面提供了用于预防或治疗溶酶体贮积症(LSD)的药物组合物，该药物组合物包含酶融合蛋白，其根据制备酶融合蛋白的方法或酶融合蛋白制备。

根据本发明的组合物的特征在于增加了治疗酶的体内持续时间和稳定性。

在具体的实施方式中，本发明的药物组合物的酶融合蛋白可以是其中将艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)或芳香基硫酸酯酶B(ARSB)融合到免疫球蛋白Fc区上的酶融合蛋白，但酶融合蛋白不限于此。

如本文所用，术语“溶酶体”是细胞质中存在的细胞器之一，其包含许多水解酶，和因此分解体内不需要的物质，例如大分子、细菌等，并且有助于分解的产物在细胞的其他部分中使用。许多酶可以执行溶酶体的功能。当由于突变、缺乏等使特定的酶丧失其功能时，会造成溶酶体的分解功能丧失，并导致必须分解的大分子等在细胞内积累并诱导细胞损伤等，从而导致疾病。

如本文所用，术语“溶酶体贮积病(LSD)”指由于上述溶酶体功能的丧失引起的罕见遗传病，并且使用缺陷酶的酶替代疗法是必须的。根据缺乏的酶，LSD可能包括粘多糖贮积症(MPS)、糖原贮积病、鞘脂类代谢障碍、尼曼-匹克病、法布里氏病、戈谢病、亨特综合征、马-拉综合征等。

在下文中，根据其分类将详细描述LSD。

如本文所用，属于VI型粘多糖贮积症(MPS)疾病的术语“马-拉综合征”(Maroteaux-Lamy syndrome)是常染色体隐性遗传疾病，其由于分解葡糖胺聚糖所必需的芳香基硫酸酯酶B(N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)的缺乏而发生。马-拉综合征是一种由于硫酸皮肤素沉积而发生的疾病——由于骨头、心脏瓣膜、脾脏、肝脏、角膜等中酶的缺乏使硫酸皮肤素并未分解。

如本文所用，术语“芳香基硫酸酯酶B(ARSB)”指存在于肝、胰腺和肾脏的溶酶体中的芳香基硫酸酯酶，并且该酶具有通过分解葡糖胺聚糖而水解硫酸盐的作用。已知芳香基硫酸酯酶B与粘多糖贮积症VI型(马-拉综合征)有关。在本发明中，术语芳香基硫酸酯酶B可以与加硫酶(galsulfase)互换使用。

如本文所用，术语“亨特综合征(亨特病)”是由于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)的缺乏发生的X连锁隐性遗传病，并且已知由于该酶的缺乏导致硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素积累。亨特综合征的症状包括功能退化、进行性听力丧失、色素性视网膜炎、视神经乳头水肿、脑积水等。在本发明中，术语“粘多糖贮积症II型”可以与“亨特综合征”互换使用。

如本文所用，术语“艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶”是硫酸肝素和硫酸皮肤素的溶酶体降解所必需的酶，该酶是与亨特综合征(MPS-II)相关的硫酸酯酶。在本发明中，术语“艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶”可以与“艾杜硫酸酯酶”互换使用。例如，艾杜硫酸酯酶可以是艾杜硫酸酯酶α或艾杜硫酸酯酶β，但艾杜硫酸酯酶不限于此。

可以通过本领域已知的方法制备或制造治疗酶，和具体地，该酶可以在培养插入动物表达载体的动物细胞后从培养物中纯化，或者可以在购买市售的酶后使用，但该酶不限于此。

通过将治疗酶融合至免疫球蛋白Fc区，包含在本发明的组合物中的酶融合蛋白可增加治疗酶的半衰期，其对LSD表现出治疗效果同时保持治疗酶的活性。具体地，与修饰的免疫球蛋白Fc区融合的治疗酶减少了链交换和糖基化，并且因此与未融合Fc的治疗酶相比，对溶酶体受体可以具有较低的结合亲和力，和从而可具有高的持续时间，这证实了这种治疗酶对LSD的治疗有效。

在本发明的实施方式中，已确认与未融合Fc区的酶相比，本发明的酶融合蛋白，甚至以更低的施用频率，在IDS敲除小鼠中降低了葡糖胺聚糖(GAG)的值(实施例6)。

此外，在本发明的另一个实施方式中，已确认与未融合Fc区的天然酶相比，本发明的酶融合蛋白不仅在骨髓和脾脏中显示出高度分布，而且在肺、肾、心脏等中显示了其分布，尽管未在受试者组织中确认天然酶的分布(实施例7)。

这些结果表明，当基于高稳定性施用时，本发明的酶融合蛋白不仅可以通过降低施用频率增加患者的便利性，而且由于其在组织中的高度分布，还允许皮下施用。

如本文所用，术语“防止”指通过施用酶融合蛋白或包含酶融合蛋白的组合物抑制或延迟LSD发生的所有活动，和术语“治疗”指通过施用酶融合蛋白或包含酶融合蛋白的组合物改善或有利地改变LSD症状的所有活动。

如本文所用，术语“施用”指通过任何适当的方法将具体物质引入到患者中，并且组合物的施用途径可以是能够将组合物递送至体内靶标的任何常规途径，例如、腹膜内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用等。然而，由于肽在口服施用时被消化，用于口服施用的组合物的活性成分优选地被包衣或被配制以防止在胃中降解，和具体地，可以以注射形式施用。此外，可以使用能够将活性成分运输到靶细胞中的某种装置来施用药物组合物。

本发明的组合物的总有效剂量根据分次治疗方案可以以单剂量施用至患者或可以以多剂量施用很长的时间段。在本发明的药物组合物中，活性成分的含量可以根据疾病的严重程度而变化。具体地，本发明的融合蛋白的总日剂量可以是患者每1kg体重约0.0001mg至500mg。然而，除了药物组合物的施用途径和治疗频率外，还考虑多种因素，其包括患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食、排泄率等，确定融合蛋白的有效剂量。在这方面，本领域技术人员可以容易地确定适合于本发明药物组合物的具体使用的有效剂量。根据本发明的药物组合物不具体限于制剂、施用途径和方法，只要其显示出本发明的效果。

在本发明中，酶融合蛋白的实际剂量可以基于用作活性成分的治疗酶的类型以及例如待治疗的疾病，施用途径，患者的年龄、性别和体重，疾病的严重程度等多种因素来确定。由于本发明的酶融合蛋白具有显著优异的体内持续时间和活性，因此包含本发明的酶融合蛋白的药物制剂的施用剂量、数量和频率可显著地降低。

本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载体可以是非天然存在的。

如本文所用，术语“药学上可接受的”指具有足够的量以表现出治疗效果并且不会引起不良影响的性质，并且其基于医学领域众所周知的因素，例如疾病的种类，患者的年龄、重量、健康状况、性别、药物敏感性，施用途径，施用方法，施用频率，治疗的持续时间，混合或同时施用的药物(一种或多种)等，本领域技术人员可容易地确定。

药学上可接受的载体可包括：对于口服施用，粘合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、调味剂等；对于注射剂，可以组合使用的缓冲剂、保藏剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等；和对于局部施用，碱、赋形剂、润滑剂、保藏剂等，但药学上可接受的载体不限于此。

本发明的组合物的制剂类型可以通过与上述药学上可接受的载体组合不同地制备。例如，对于口服施用，可以将组合物配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等。对于注射剂，可以将组合物配制成单位剂量的安瓿或多剂量的容器。此外，也可以将组合物配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂等。

同时，适合的载体、赋形剂和稀释剂的实例可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶(acacia rubber)、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。此外，组合物可进一步包含填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、防腐剂等。

此外，可以通过将酶融合蛋白与多种批准用作药物的药学上可接受的载体例如生理盐水或有机溶剂混合使用酶融合蛋白。为了增加稳定性或吸收性，可以将碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，和抗氧化剂例如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质或其他稳定剂用作药物。

药物组合物可以包含0.01％至99％(w/v)的量的上述成分(活性成分)，但量不限于此。

本发明的仍另一方面提供了编码根据本发明的酶融合蛋白的多核苷酸。

编码根据本发明的酶融合蛋白的多核苷酸可以是如此形式的多核苷酸，其中编码治疗酶的区域与编码肽接头-免疫球蛋白Fc区的区域被连接，并且具体地，编码融合蛋白的多核苷酸，其中通过GGGGS接头将免疫球蛋白Fc区的N-末端与治疗酶的C-末端连接，但多核苷酸不限于此。更具体地，本发明的多核苷酸可以包括SEQ ID NO：1或3的序列，但序列不限于此，只要多核苷酸可以编码包括治疗酶和免疫球蛋白Fc区的融合蛋白即可。

本发明的仍另一方面提供了包括多核苷酸的重组表达载体。

如本文所用，术语“重组载体”指DNA构建体，其中靶肽(例如，酶融合蛋白)可操作地连接至适合的控制序列以使靶肽(例如，酶融合蛋白)在适合的宿主中表达。根据本发明的重组载体可以构建为用于典型克隆的载体或用于表达的载体，并且可以使用原核细胞或真核细胞作为宿主细胞构建。

控制序列包括能够启动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、编码适合的mRNA核糖体结合结构域的序列以及控制转录和翻译终止的序列。在被转化入适合的宿主细胞后，重组载体可以与宿主基因组无关地进行复制或起作用，或者可以整合入宿主基因组本身。

本发明中使用的重组载体可以不被具体限制，只要载体能够在宿主细胞中复制即可，并且可以使用本领域已知的任何载体构建。载体的实例可以包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。本发明中可用的载体没有具体限制，但可以使用任何已知的表达载体。

重组载体用于宿主细胞的转化以产生本发明的酶融合蛋白。此外，作为本发明的一部分，这些转化的细胞可用于核酸片段和载体的扩增，或者它们可以是本发明的酶融合蛋白的重组生产中使用的培养细胞或细胞系。

如本文所用，术语“转化”指将包括编码靶蛋白的多核苷酸的重组载体引入宿主细胞的方法，从而使该多核苷酸编码的蛋白能够在宿主细胞中表达。对于转化的多核苷酸，只要可以在宿主细胞中表达，无论其插入到宿主细胞的染色体中并位于染色体中或位于染色体外都不要紧，并且包括这两种情况。

此外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式插入，只要可以将其引入宿主细胞并在其中表达即可。例如，可以以表达盒的形式将多核苷酸引入宿主细胞，表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体。表达盒常规地可包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，可以将多核苷酸原样引入宿主细胞中并且可操作地连接至其在宿主细胞中表达所必需的序列上，但多核苷酸不限于此。

此外，如本文所用，术语“可操作地连接”指介于启动子序列——其启动并介导编码本发明的靶肽的多核苷酸的转录——和上述基因序列之间的功能性连接。

只要可以表达本发明的多核苷酸，不会具体限制用于本发明的适合的宿主。适合的宿主的实例可包括属于埃希菌属的细菌，例如大肠杆菌；属于芽孢杆菌属的细菌，例如枯草芽孢杆菌；属于假单胞菌属的细菌，例如恶臭假单胞菌；酵母，例如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母和裂殖酵母；昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Sf9)；和动物细胞，例如CHO、COS、BSC等。

本发明的仍另一方面提供了导入表达载体的转化体。

为了本发明的目的，导入本发明的表达载体的转化体没有限制，只要转化体可以表达并产生酶融合蛋白即可，而转化体可以是埃希菌属的细菌，例大肠杆菌；属于芽孢杆菌属的细菌，例如枯草芽孢杆菌；属于假单胞菌属的细菌，例如恶臭假单胞菌；酵母，例如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母和裂殖酵母；昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Sf9)；和动物细胞，例如CHO、COS、BSC等。

本发明的仍另一方面提供了用于制备根据本发明的酶融合蛋白的方法。

具体地，方法可包括(a)培养转化体以获得培养物；和(b)从培养物中回收酶融合蛋白，但方法不限于此。

在本发明中，用于培养转化体的培养基必须以适合的方式满足宿主细胞培养的要求。可以根据其制备的转化体的类型，通过本领域技术人员的决定，适当地选择用于宿主细胞生长的培养基中可包含的碳源，并可以选择适当的培养条件，以便控制培养的时期和量。

培养基中使用的糖源的实例可包括糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油类和脂肪，例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；和有机酸，例如乙酸。可以单独或组合使用这些材料。

使用的氮源的实例可包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。也可以单独或组合使用氮源。

使用的磷源的实例可包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。此外，培养基可包含生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。

最后，可以使用必需的生长材料，例如氨基酸和维生素。此外，也可以使用用于培养基的适合前体。可以在分批培养或连续培养的培养期间中将上述来源适当地添加到培养物中。可以使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾和氨，或酸性化合物例如磷酸或硫酸适当地调节培养物的pH。此外，可以添加消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯，以防止泡沫产生。此外，为了维持培养物的有氧状态，可以将氧气或含氧气体(例如空气)注入到培养物中。

本发明的转化体可以在20℃至45℃下培养，并且具体是25℃至40℃。此外，继续培养直至获得期望的酶融合蛋白的最大生产量，并且在这方面，培养一般可以持续10小时至160小时。

如上所述，当根据宿主细胞提供适合的培养条件时，本发明的转化体可产生酶融合蛋白，并且根据宿主细胞的载体构造和特性产生的酶融合蛋白可以在细胞质中分泌或分泌入宿主细胞的周质空间中或在细胞外分泌。

可通过常规方法纯化在宿主细胞内或宿主细胞外表达的蛋白质。纯化方法的实例可包括盐析(例如硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀等)、溶剂沉淀(例如使用丙酮或乙醇的蛋白质级分沉淀等)、透析、凝胶过滤、离子交换或色谱法，例如反向柱色谱、超滤等，并且可以单独或组合使用这些方法。

本发明的仍另一方面提供了用于预防或治疗受试者LSD的方法，其包括施用酶融合蛋白或包含酶融合蛋白的组合物。

由于本发明的酶融合蛋白包含可以预防或治疗LSD的治疗酶，因此可以通过施用包含治疗酶的酶融合蛋白或包含酶融合蛋白的药物组合物预防或治疗被怀疑患有LSD的受试者。

如本文所用，术语“受试者(subject)”指被怀疑患有LSD的受试者，并且被怀疑患有LSD的受试者指患有LSD或处于发展LSD风险下的哺乳动物，其包括人、大鼠、牛等，但非限制性地包括可以用本发明的酶融合蛋白或包含酶融合蛋白的组合物治疗的任何受试者。

本发明的方法可包括施用药学上有效量的含有酶融合蛋白的药物组合物。可以在从业者正确的医学判断范围内确定组合物适合的总日剂量，并且可以一次或以分剂量多次施用组合物。然而，出于本发明的目的，优选地，根据多种因素，差异地施加用于任何特定患者的组合物的具体治疗有效剂量，该因素包括待实现的应答的种类和程度，具体的组合物(包括其他试剂是否偶尔随之一起使用)，患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食，施用时间，施用途径，组合物的排泄率，治疗持续时间、与特定组合物组合或同时使用的其他药物以及在医学领域众所周知的类似因素。

同时，用于LSD的预防或治疗的方法可以是组合疗法，其进一步包括施用对至少一种LSD具有治疗作用的化合物或材料，但方法不限于此。

如本文所用，术语“组合”必须理解为指同时、分开或顺序的施用。当施用是连续或分开的时，允许施用第二成分的间隔必须是不应当失去组合的有益效果的间隔。

对LSD具有治疗活性的酶融合蛋白的施用剂量可以是患者每1kg体重约0.0001μg至500mg，但剂量没有具体限制。

本发明的仍另一方面提供了酶融合蛋白或包含酶融合蛋白的组合物在制备用于LSD预防或治疗的药物(或药物组合物)中的用途。

在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明性目的，并且本发明的范围不受这些实施例限制。

实施例1：融合蛋白表达载体的制备

为了生产酶融合蛋白，使用表达载体(IDS cDNA，目录号EX-C0003-M02，Gencopoeia；ARSB cDNA，目录号EX-C0073-M02，Genecopoeia)——其中将天然存在的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS，SEQ ID NO：1)和芳香基硫酸酯酶B(ARSB，SEQ ID NO：3)分别插入——、合成的接头(SEQ ID NO：5)和IgG4 Fc区(SEQ ID NO：7)通过重叠PCR制备融合蛋白的表达载体。由于当扩增酶和接头-Fc的每一个时重叠PCR技术包括与引物重叠的序列，因此产生的PCR产物将包括重叠序列。为了扩增融合蛋白，进行如下PCR：1)初级PCR(25个循环，其由95℃持续1分钟；57℃持续30秒；68℃持续3分钟组成)和2)次级PCR(25个循环，其由95℃持续1分钟；57℃持续30秒；和68℃持续4分钟组成)。

具体地，对于IDS，使用SEQ ID NOS：10和11的引物进行PCR，并且对于接头-Fc，使用SEQ ID NOS：12和13的引物进行PCR。结果，IDS PCR产物包括在3'末端的接头-Fc序列，并且接头-Fc PCR包括在5'末端的IDS序列。

使用在初级PCR中获得的两种PCR产物作为模板连同引物(SEQ ID NOS：10和13)进行次级PCR，和然后获得具有IDS-Fc序列的PCR产物。用限制酶(KpnI和XhoI)消化具有IDS-Fc序列的产物中的重叠序列，并将所得PCR产物插入到X0GC载体中以制备表达载体(pX0GC-酶-Fc)。

以相同的方式，使用引物(SEQ ID NO：14、15、16和17)获得具有ARSB-Fc序列的PCR产物。用限制酶(KpnI和XhoI)消化所得的PCR产物，并插入已经用相同的限制酶(KpnI和XhoI)消化的X0GC载体，以制备用于融合蛋白的表达载体。

[表1]重叠PCR引物

通过定点诱变PCR技术去除制备的融合蛋白序列的Fc区中的链交换和N-糖基化位点。

具体地，使用引物(SEQ ID NOS：18和19)，以脯氨酸取代参与链交换的Fc区的第2个氨基酸(即丝氨酸)，并且以谷氨酰胺取代参与N-糖基化的Fc区的第71个氨基酸(即天冬酰胺)。在下表3所示的蛋白质序列中，每个粗体的字母表明对象氨基酸被取代，并且斜体的字母表明接头。

[表2]诱变引物

用于在以上实施例中制备的酶融合蛋白的表达载体分别命名为IDS-Fc载体和ARSB-Fc载体。可选地，这些载体可与pX0GC-酶-Fc互换使用。

[表3]酶融合蛋白的DNA序列和蛋白质序列

实施例2：使用融合蛋白的表达载体转化CHO细胞系

将实施例1中制备的重组表达载体pX0GC-酶-Fc引入DG44/CHO细胞系(CHO/dhfr-)(Urlaubet等，Somat.Cell.Mol.Genet.，12，555到566，1986)——其中DHFR基因被破坏，并因此其核酸的生物合成过程不完美——以获得转化体，并且在该转化体中表达酶融合蛋白(酶-Fc)。

具体地，将DG44/CHO细胞系培养至汇合，致使细胞覆盖容器底部的约80％至约90％，并且用Opti-MEM(Gibco，目录号51985034)洗涤细胞3次。

同时，将Opti-MEM(3mL)和pX0GC-酶-Fc(表达载体，5μg)的混合物以及Opti-MEM(3mL)和lipofectamine 2000(Gibco，目录号11668-019，20μL)的混合物在室温下放置30分钟。然后，将两种混合物混合在一起，并向其添加培养的DG44/CHO细胞系，并在37℃和5％CO₂的条件下培养约18小时，以将pX0GC-酶-Fc表达载体引入DG44/CHO细胞系。

然后，以含有10％FBS(Gibco，目录号11330)的DMEM-F12培养基洗涤培养的细胞3次，并向其添加培养基并再培养48小时。将胰蛋白酶添加到培养的细胞中以分离培养的细胞，并将这些分离的细胞接种到不含有HT补充剂(次黄嘌呤-胸苷)但含有10％FBS和1mg/mLG418(Cellgro，目录号61-234-RG)的选择培养基(α-MEM培养基(WELGENE，目录号LM008-02))中。通过培养细胞，同时以2天或3天的间隔更换培养基，直到仅有转化的细胞存活并形成集落，从选择培养基中选择转化的细胞。具体地，为了改善所选择转化细胞中酶融合蛋白的表达水平，将10nM MTX(Sigma，目录号M8407)添加至选择培养基，并逐渐地增加浓度，并从而使这些转化的细胞的MTX量在此后一到二周增加至20nM。

实施例3：通过ELISA确认IDS-Fc、ARSB-Fc融合蛋白的表达

将实施例2中制备的转化细胞的一部分以1×10⁷个细胞的浓度转移到每个175-T细胞培养瓶中，并且培养到直至细胞几乎覆盖培养容器的底部，并然后将含有1mM丁酸钠(Sigma，目录号B5887)的15mL无血清的Ex-cell培养基(按定制订单从Sigma购买，目录号14360C)添加至每个烧瓶中，并将其在培养箱(33℃，5％CO₂)中培养48小时。将每个细胞培养物转移至50mL管中，离心并再次收集上清液，并且测量融合蛋白(IDS-Fc和ARSB-Fc)的表达水平。

首先，通过施加间接ELISA方法进行IDS-Fc的表达水平。将以1μg/mL浓度在PBS中稀释的人α-IDS抗体(R&D Systems，目录号AF2449)以100μL/孔的量添加到96孔ELISA板(Nunk，目录号44-2404-21)中，并且在冰箱(4℃)中反应过夜。在第二天，用PBS-T缓冲液洗涤生成物5次，并将培养物样品和IDS标准产品(Shire Pharmaceuticals Group,

批号TEPE09A17)——将其以多种浓度稀释——各自以100μL/孔的量分配，并在室温下反应1小时。一小时后，洗涤板，并向其添加生物素标记的人α-IDS抗体(R&DSystems，目录号BAF2449)，并且将混合物在室温下反应一小时。最后，将抗生蛋白链菌素-HRP(GE Healthcare，目录号RPN440IV)以1：30,000的比例稀释和以100μL/孔的量添加稀释的混合物，并反应1小时。洗涤生成物，并向其添加底物溶液和反应约10分钟。在用反应终止液终止反应后，在450nm处测量生成物的吸光度。在使用人IDS标准产品的浓度和吸光度值获得标准曲线和函数后，定量人IDS-Fc融合蛋白的量。结果，确认人IDS-Fc融合蛋白从选择的转化细胞中以一定的量表达(图1)。

此外，通过可以定量人IgG的酶免疫测定(Bethyl，目录号E80-104)测量ARSB-Fc融合蛋白的表达水平。将以10μg/mL浓度在碳酸盐缓冲液(0.05M碳酸盐-碳酸氢盐，pH 9.6)中稀释的人IgG-Fc抗体(Bethyl，目录号A80-104A-9)以100μL/孔的量添加到96孔ELISA板(Nunk，目录号44-2404-21)中，并在室温下反应1小时。一小时后，用洗涤液将ELISA板洗涤5次，并将每个培养物样品和包含在人IgG定量试剂盒(Bethyl，目录号RS10-110-4)中的人IgG标准产品以多种浓度稀释，每个以100μL/孔的量分配，并且在室温下反应1小时。一小时后，洗涤板，并向其添加以1：150,000的比例稀释的HRP标记的人IgG-Fc抗体(Bethyl，目录号A80-104P-87)，以及在室温下反应一小时。最后，将抗生蛋白链菌素-HRP(GEHealthcare，目录号RPN440IV)以1：30,000的比例稀释，并以100μL/孔的量添加，以及反应1小时。洗涤生成物，并向其添加底物溶液并反应约15分钟。在用反应终止溶液终止反应后，在450nm下测量生成物的吸光度。

在使用人IgG标准产品的浓度和吸光度值获得标准曲线和函数后，定量人ARSB-Fc融合蛋白的量。结果，确认人ARSB-Fc融合蛋白从选择的转化细胞中以一定的量表达(图2)。

实施例4：长效酶融合蛋白药物代谢动力学的确认

通过检查以上制备的长效酶融合蛋白和未与Fc区融合的酶的药物代谢动力学，比较融合蛋白制品的效果。

实施例4-1：长效艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶融合蛋白的药物代谢动力学实验

本发明人尝试通过检查在以上实施例中制备的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白的药物代谢动力学确认本发明的融合蛋白的治疗持续时间。

出于这个目的，分别对3只ICR小鼠施用艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(艾杜硫酸酯酶，对照组)和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白(IDS-Fc融合蛋白，实验组)，并且比较根据每组的血液中稳定性和每个血液样品采集的药物代谢动力学系数。

具体地，基于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的浓度，通过分别以0.5mg/kg和1.0mg/kg的浓度静脉内和皮下注射向对照组和实验组的ICR小鼠施用蛋白质。在注射后0、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、72、96、120、144和168小时从通过静脉内注射施用的组中收集血液样品，和在注射后0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192和216小时从通过皮下注射施用的组中收集血液样品。通过ELISA方法使用人特异性抗艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶抗体测量血清中蛋白质的量。分析结果在图3和表4中显示。

[表4]

如上述结果中可见，与对照组的那些相比，根据本发明的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白显示出显著优异的药物代谢动力学特性。这些结果表明，与非长效融合蛋白的酶相比，本发明的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白通过长效作用具有在药物实际施用中减少药物施用间隔的优点。

如图3和表4的药物代谢动力学结果中可见，在艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白的情况下，增加了半衰期(T_1/2)、血液中的最大药物浓度(C_max)和体内生物利用度(AUC)的所有项。具体地，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白的体内生物利用度为64.9％，因此与非长效融合蛋白的酶相比，显示出优异的体内生物利用度。

实施例4-2：长效芳香基硫酸酯酶B融合蛋白的药物代谢动力学实验

本发明人尝试检查在以上实施例中制备的芳香基硫酸酯酶B(ARSB-Fc融合蛋白)的长效融合蛋白的药物代谢动力学，并因此测量芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白的药物代谢动力学，并与芳香基硫酸酯酶B的那些结果进行比较。

具体地，基于芳香基硫酸酯酶B的浓度，以每个5.0mg/kg的浓度通过静脉内和皮下注射向对照组(天然存在的芳香基硫酸酯酶B：

BioMarin)和实验组(芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白)的ICR小鼠施用蛋白质。不论施用方法如何，在注射后0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、4、8和24小时从对照组收集血液样品。在实验组中，在注射后0、0.25、0.5、1、1.5、2、4、8、24、48、96和168小时从通过静脉内注射施用的ICR小鼠中收集血液样品，并在注射后0、0.5、1、2、4、8、24、48、96和168小时，从通过皮下注射施用的那些小鼠中收集血液样品。

将每个组中收集的血液样品离心和分离成血清，并且通过酶免疫测定法定量血液中芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白和天然存在的芳香基硫酸酯酶B的量，并且分析结果在图4和表5中显示。

[表5]

如以上结果中可见，与

(即天然存在的芳香基硫酸酯酶B)相比，根据本发明的芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白显示出显著优异的药物代谢动力学特性。这些结果表明，与酶相比，本发明的芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白通过长效作用具有在药物实际施用中减少药物施用间隔的优点。

如图4和表5的药物代谢动力学结果中可见，在芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白的情况下，增加了半衰期(T_1/2)、血液中最大药物浓度(C_max)和体内生物利用度(AUC)的所有项。具体地，芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白的体内生物利用度为65.8％，因此与非长效融合蛋白的酶相比，显示出优异的体内生物利用度。

作为检查实施例4-1和4-2中酶融合蛋白的药物代谢动力学的结果，确认与未融合Fc区的那些酶相比，这些酶融合蛋白显示出显著增加的半衰期、体内生物利用度等，并因此可以预期这些酶融合蛋白的长效作用。

实施例5：长效酶融合蛋白的酶活性的确认

将上面制备的酶融合蛋白中包含的酶的活性与未融合Fc区的酶进行比较。

实施例5-1：长效艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶融合蛋白的体外酶活性

本发明人尝试测量根据以上实施例中制备的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白制品的酶活性的变化，并因此测量体外酶活性。

具体地，将已知作为酶底物的4-甲基香豆素基(methylumbelliferyl)α-L-吡喃艾杜糖醛酸(idopyranosiduronic acid)-2-硫酸钠盐(4MU-α-IdopyraA-2)与艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白在37℃下反应4小时，并然后在37℃下与α-艾杜糖苷酸酶(即次级反应酶)反应24小时。然后，测量最终产物4-甲基伞形酮(4MU)的荧光，以测量相应物质的酶活性。

结果，确认艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白分别具有32.0±1.58nmol/min/mM和87.3±6.49nmol/min/mM的酶活性(比活性)。由于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白具有其中两个艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶连接到一个Fc分子的结构——其是两条Fc链的二聚形式，因此测量结果显示与非融合蛋白的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶相比，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白具有约高2.7倍的体外酶活性。这些结果表明，具有两个艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白的结构特征相对于未形成融合蛋白的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶在酶活性方面具有优势(图5)。

实施例5-2：长效芳香基硫酸酯酶B融合蛋白的体外酶活性

本发明人比较并测量了在以上实施例中制备的芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白的酶活性与天然存在的酶——芳香基硫酸酯酶B(

BioMarin)——的酶活性。

具体地，在37℃下，将芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白和芳香基硫酸酯酶B与4-甲基香豆素基硫酸酯反应20分钟，并通过测量在切割硫酸基团后形成的4-甲基香豆素基的荧光来测量芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白的体外酶活性。

结果，确认芳香基硫酸酯酶B和芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白分别具有438.5±29.4nmol/min/mM和823.8±37.0nmol/min/μM的酶活性(比活性)。由于芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白具有其中两个芳香基硫酸酯酶B连接至一个Fc分子的结构——其是两条Fc链的二聚形式，因此测量结果显示，与非融合蛋白的芳香基硫酸酯酶B相比，芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白具有约高1.9倍的体外酶活性。这些结果证实在分子水平上的芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白相对于芳香基硫酸酯酶B的区别结构特征归因于优异的酶活性(图6)。

作为检查实施例5-1和5-2中酶融合蛋白的药物代谢动力学的结果，确认与未融合Fc区的那些酶相比，这些酶融合蛋白显示出高的体外酶活性。

实施例6：长效艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶融合蛋白的施用功效的确认

本发明的酶融合蛋白的施用功效通过研究向艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)-敲除小鼠施用药物后的组织和尿中葡糖胺聚糖(GAG)的量的变化来检查。

具体地，除了正常小鼠作为阴性对照组之外，基于尿液中的GAG含量，将7至14周龄的IDS敲除小鼠分为总共四组。以0.5mg/kg(对照组)的浓度向尾静脉总共4次(第0天、第7天、第14天和第21天)施用艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(

Genzyme)。艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白的施用通过分成两个组进行：一组以2.0mg/kg(第0天)的浓度向尾静脉施用一次艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白，和另一组以4.0mg/kg(第0天)的浓度皮下施用一次艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白。

在施用前以及药物施用后的第7、14、21和28天从每个组中收集尿液样品。在药物施用后第28天，从肝脏、脾脏、心脏和骨髓中收集所有组织。然后，以5体积(对于骨髓为9体积)的量将组织粉碎缓冲液(包含抑肽酶(1μg/mL)、1mM PMSF和2mM EDTA的PBS)添加到每个组织中，并使用超声波仪将混合物粉碎并且离心，并且将每个上层清液用于GAG含量的分析。

然后，将由收集的尿液样品和每个组织粉碎后获得的上清液的50μL添加到96孔板中，添加二甲基亚甲基蓝溶液(250μL)并混合，并在525nm波长下定量GAG的含量。在尿液中GAG含量的情况下，通过参考肌酸的量进行调整来计算值。使用计算的值使用单向ANOVA在对照组和测试组之间进行统计分析。尿液和每个组织中测量的GAG含量分别在图7和8中显示。

如图7和图8所示，确认与IDS敲除小鼠相比，即使每月单次静脉内或皮下施用，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白将尿液和每个组织中GAG值显著地降低至类似于每周一次静脉内施用

的疗法的水平，

是未融合Fc区的酶。

通过该实施例，确认由于延长的血液半衰期，即使每月单次静脉内或皮下施用，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白可表现出与每周一次施用药物的现有药物疗法相当的效果。此外，在每月一次皮下施用艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白的组中，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白表现出降低GAG值的效果的结果，证实艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白具有皮下注射作为本发明融合蛋白的施用途径的潜力。因此，建议通过每月一次施用或皮下施用，根据本发明的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的长效融合蛋白可用来治疗亨特综合征患者。

实施例7：长效融合蛋白(芳香基硫酸酯酶B)的组织分布的确认

本发明人尝试确认在以上实施例中制备的本发明的酶融合蛋白的分布程度。

在这方面，对于每组样品收集和根据每组比较了3只ICR小鼠的组织和器官中芳香基硫酸酯酶B(对照组)和芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白(实验组)的分布程度。

具体地，基于芳香基硫酸酯酶B的浓度，以5.0mg/kg的浓度通过静脉内注射施用对照组和实验组。

对于对照组的天然存在的芳香基硫酸酯酶B

和实验组的芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白，通过在施用天然存在的芳香基硫酸酯酶B

和芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白后移出小鼠器官，通过酶免疫测定法测量和比较了组织(骨髓、肝脏、脾脏、肺、肾脏和心脏)中每种材料的浓度。

结果，与天然存在的芳香基硫酸酯酶B——用作对照组并且未融合Fc区——相比，芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白显示出在所有组织中、相同时间段下以更高的程度或持续更长的时间段分布的结果。

具体地，确认与天然存在的芳香基硫酸酯酶B相比，芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白在骨髓和脾脏中具有显著高的分布程度。此外，确认芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白在肺、肾脏和心脏中分布，同时在那些组织中未检测到芳香基硫酸酯酶B(图9)。

从这些实验结果中，确认芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白相比于

(即天然存在的芳香基硫酸酯酶B)具有优异的药物代谢动力学特性。具体地，与现有的每周一次静脉内施用疗法相比，用于每月一次施用的芳香基硫酸酯酶B的长效融合蛋白的潜在用途不仅可减少施用频率，而且可以通过转换为皮下施用来有助于改善患者的生活质量。

从前述内容中，本发明所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本发明的技术构思或基本特征的情况下，本发明可以以其他具体形式实施。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于说明性目的，并且不应当被解释为限制本发明的范围。相反，本发明旨在不仅覆盖示例性的实施方式，而且覆盖可以包括在由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的多种选择、修改、等同物和其他实施方式。

<110> 韩美药品株式会社

<120> 新型治疗酶融合蛋白及其用途

<130> OPA18228

<150> KR 10-2017-0086594

<151> 2017-07-07

<160> 26

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1650

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60

tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120

ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180

tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240

caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300

cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360

cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420

atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480

tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540

aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600

agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660

ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720

ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780

cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840

atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900

tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960

cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020

gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080

ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140

ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200

gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260

cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320

cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380

attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440

agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500

gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560

gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620

ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct 1650

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val

1 5 10 15

Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser

20 25 30

Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg

35 40 45

Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile

50 55 60

Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln

65 70 75 80

Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg

85 90 95

Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His

100 105 110

Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr

115 120 125

Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn

130 135 140

His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro

145 150 155 160

Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly

165 170 175

Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro

180 185 190

Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu

195 200 205

Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly

210 215 220

Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys

225 230 235 240

Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro

245 250 255

Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln

260 265 270

Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile

275 280 285

Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val

290 295 300

Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp

305 310 315 320

Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly

325 330 335

Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp

340 345 350

Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala

355 360 365

Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe

370 375 380

Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu

385 390 395 400

Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu

405 410 415

Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys

420 425 430

Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu

435 440 445

Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser

450 455 460

Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro

465 470 475 480

Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp

485 490 495

Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala

500 505 510

Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp

515 520 525

Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu

530 535 540

Phe Gln Leu Leu Met Pro

545 550

<210> 3

<211> 1599

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

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cccgtcgtcc tcccgctgct gctgctgctg ttgttggcgc cgccgggctc gggcgccggg 120

gccagccggc cgccccacct ggtcttcttg ctggcagacg acctaggctg gaacgacgtc 180

ggcttccacg gctcccgcat ccgcacgccg cacctggacg cgctggcggc cggcggggtg 240

ctcctggaca actactacac gcagccgctg tgcacgccgt cgcggagcca gctgctcact 300

ggccgctacc agatccgtac aggtttacag caccaaataa tctggccctg tcagcccagc 360

tgtgttcctc tggatgaaaa actcctgccc cagctcctaa aagaagcagg ttatactacc 420

catatggtcg gaaaatggca cctgggaatg taccggaaag aatgccttcc aacccgccga 480

ggatttgata cctactttgg atatctcctg ggtagtgaag attattattc ccatgaacgc 540

tgtacattaa ttgacgctct gaatgtcaca cgatgtgctc ttgattttcg agatggcgaa 600

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ctcacgggct acccaggctg tggttactgg ttccctccac cgtctcaata caatgtttct 1380

gagataccct catcagaccc accaaccaag accctctggc tctttgatat tgatcgggac 1440

cctgaagaaa gacatgacct gtccagagaa tatcctcaca tcgtcacaaa gctcctgtcc 1500

cgcctacagt tctaccataa acactcagtc cccgtgtact tccctgcaca ggacccccgc 1560

tgtgatccca aggccactgg ggtgtggggc ccttggatg 1599

<210> 4

<211> 533

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Gly Pro Arg Gly Ala Ala Ser Leu Pro Arg Gly Pro Gly Pro Arg

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Pro Val Val Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

20 25 30

Ala Pro Pro Gly Ser Gly Ala Gly Ala Ser Arg Pro Pro His Leu Val

35 40 45

Phe Leu Leu Ala Asp Asp Leu Gly Trp Asn Asp Val Gly Phe His Gly

50 55 60

Ser Arg Ile Arg Thr Pro His Leu Asp Ala Leu Ala Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Leu Leu Asp Asn Tyr Tyr Thr Gln Pro Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ser

85 90 95

Gln Leu Leu Thr Gly Arg Tyr Gln Ile Arg Thr Gly Leu Gln His Gln

100 105 110

Ile Ile Trp Pro Cys Gln Pro Ser Cys Val Pro Leu Asp Glu Lys Leu

115 120 125

Leu Pro Gln Leu Leu Lys Glu Ala Gly Tyr Thr Thr His Met Val Gly

130 135 140

Lys Trp His Leu Gly Met Tyr Arg Lys Glu Cys Leu Pro Thr Arg Arg

145 150 155 160

Gly Phe Asp Thr Tyr Phe Gly Tyr Leu Leu Gly Ser Glu Asp Tyr Tyr

165 170 175

Ser His Glu Arg Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Asn Val Thr Arg Cys

180 185 190

Ala Leu Asp Phe Arg Asp Gly Glu Glu Val Ala Thr Gly Tyr Lys Asn

195 200 205

Met Tyr Ser Thr Asn Ile Phe Thr Lys Arg Ala Ile Ala Leu Ile Thr

210 215 220

Asn His Pro Pro Glu Lys Pro Leu Phe Leu Tyr Leu Ala Leu Gln Ser

225 230 235 240

Val His Glu Pro Leu Gln Val Pro Glu Glu Tyr Leu Lys Pro Tyr Asp

245 250 255

Phe Ile Gln Asp Lys Asn Arg His His Tyr Ala Gly Met Val Ser Leu

260 265 270

Met Asp Glu Ala Val Gly Asn Val Thr Ala Ala Leu Lys Ser Ser Gly

275 280 285

Leu Trp Asn Asn Thr Val Phe Ile Phe Ser Thr Asp Asn Gly Gly Gln

290 295 300

Thr Leu Ala Gly Gly Asn Asn Trp Pro Leu Arg Gly Arg Lys Trp Ser

305 310 315 320

Leu Trp Glu Gly Gly Val Arg Gly Val Gly Phe Val Ala Ser Pro Leu

325 330 335

Leu Lys Gln Lys Gly Val Lys Asn Arg Glu Leu Ile His Ile Ser Asp

340 345 350

Trp Leu Pro Thr Leu Val Lys Leu Ala Arg Gly His Thr Asn Gly Thr

355 360 365

Lys Pro Leu Asp Gly Phe Asp Val Trp Lys Thr Ile Ser Glu Gly Ser

370 375 380

Pro Ser Pro Arg Ile Glu Leu Leu His Asn Ile Asp Pro Asn Phe Val

385 390 395 400

Asp Ser Ser Pro Cys Pro Arg Asn Ser Met Ala Pro Ala Lys Asp Asp

405 410 415

Ser Ser Leu Pro Glu Tyr Ser Ala Phe Asn Thr Ser Val His Ala Ala

420 425 430

Ile Arg His Gly Asn Trp Lys Leu Leu Thr Gly Tyr Pro Gly Cys Gly

435 440 445

Tyr Trp Phe Pro Pro Pro Ser Gln Tyr Asn Val Ser Glu Ile Pro Ser

450 455 460

Ser Asp Pro Pro Thr Lys Thr Leu Trp Leu Phe Asp Ile Asp Arg Asp

465 470 475 480

Pro Glu Glu Arg His Asp Leu Ser Arg Glu Tyr Pro His Ile Val Thr

485 490 495

Lys Leu Leu Ser Arg Leu Gln Phe Tyr His Lys His Ser Val Pro Val

500 505 510

Tyr Phe Pro Ala Gln Asp Pro Arg Cys Asp Pro Lys Ala Thr Gly Val

515 520 525

Trp Gly Pro Trp Met

530

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 5

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白Fc变体

<400> 7

ccatcatgcc cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 60

cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 120

agccaggaag accctgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 180

gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 240

accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 300

ggcctcccat cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 360

caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 420

tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 480

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 540

tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaacgtctt ctcatgctcc 600

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctctgggt 660

aaatga 666

<210> 8

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4 Fc

<400> 8

Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

65 70 75 80

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

85 90 95

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

115 120 125

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

195 200 205

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 9

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白Fc变体

<400> 9

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

65 70 75 80

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

85 90 95

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

115 120 125

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

195 200 205

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IDS-F (KpnI)

<400> 10

caggtaccat gccgccaccc cggacc 26

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IDS-R (重叠)

<400> 11

tgaaccgcct ccaccaggca tcaacaactg gaaaagatct ccac 44

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L15Fc(IDS)-F

<400> 12

cagttgttga tgcctggtgg aggcggttca ggcg 34

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L15Fc-R (XhoI)

<400> 13

gactcgagtc atttacccag agacagggag agg 33

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ARSB-F (KpnI)

<400> 14

caggtaccat gggtccgcgc ggcgcg 26

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ARSB-R (重叠)

<400> 15

tgaaccgcct ccacccatcc aagggcccca caccc 35

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L15Fc(ARSB)-F

<400> 16

tggggccctt ggatgggtgg aggcggttca ggcg 34

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L15Fc-R (XhoI)

<400> 17

gactcgagtc atttacccag agacagggag agg 33

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc(S2P)_F

<400> 18

ctggcggtgg cggatcgcca ccatgcccag cacctgagtt cct 43

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc(S2P)_R

<400> 19

aggaactcag gtgctgggca tggtggcgat ccgccaccgc cag 43

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc(N71Q)_F

<400> 20

agccgcggga ggagcagttc caaagcacgt accgtgtggt cag 43

<210> 21

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc(N71Q)_R

<400> 21

ctgaccacac ggtacgtgct ttggaactgc tcctcccgcg gct 43

<210> 22

<211> 2361

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IDS-Fc

<400> 22

atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60

tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120

ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180

tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240

caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300

cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360

cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420

atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480

tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540

aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600

agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660

ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720

ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780

cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840

atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900

tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960

cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020

gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080

ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140

ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200

gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260

cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320

cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380

attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440

agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500

gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560

gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620

ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct 1680

ggcggtggcg gatcgccatc atgcccagca cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc 1740

ctgttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1800

gtggtggtgg acgtgagcca ggaagaccct gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 1860

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 1920

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1980

aaggtctcca acaaaggcct cccatcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 2040

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 2100

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 2160

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 2220

ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaac 2280

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 2340

tccctgtctc tgggtaaatg a 2361

<210> 23

<211> 786

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IDS-Fc

<400> 23

Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val

1 5 10 15

Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser

20 25 30

Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg

35 40 45

Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile

50 55 60

Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln

65 70 75 80

Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg

85 90 95

Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His

100 105 110

Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr

115 120 125

Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn

130 135 140

His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro

145 150 155 160

Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly

165 170 175

Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro

180 185 190

Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu

195 200 205

Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly

210 215 220

Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys

225 230 235 240

Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro

245 250 255

Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln

260 265 270

Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile

275 280 285

Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val

290 295 300

Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp

305 310 315 320

Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly

325 330 335

Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp

340 345 350

Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala

355 360 365

Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe

370 375 380

Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu

385 390 395 400

Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu

405 410 415

Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys

420 425 430

Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu

435 440 445

Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser

450 455 460

Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro

465 470 475 480

Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp

485 490 495

Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala

500 505 510

Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp

515 520 525

Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu

530 535 540

Phe Gln Leu Leu Met Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

545 550 555 560

Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

565 570 575

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

580 585 590

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

595 600 605

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

610 615 620

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg

625 630 635 640

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

645 650 655

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

660 665 670

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

675 680 685

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

690 695 700

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

705 710 715 720

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

725 730 735

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

740 745 750

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

755 760 765

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

770 775 780

Gly Lys

785

<210> 24

<211> 2310

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ARSB-Fc

<400> 24

atgggtccgc gcggcgcggc gagcttgccc cgaggccccg gtcctcggcg gctgcttctc 60

cccgtcgtcc tcccgctgct gctgctgctg ttgttggcgc cgccgggctc gggcgccggg 120

gccagccggc cgccccacct ggtcttcttg ctggcagacg acctaggctg gaacgacgtc 180

ggcttccacg gctcccgcat ccgcacgccg cacctggacg cgctggcggc cggcggggtg 240

ctcctggaca actactacac gcagccgctg tgcacgccgt cgcggagcca gctgctcact 300

ggccgctacc agatccgtac aggtttacag caccaaataa tctggccctg tcagcccagc 360

tgtgttcctc tggatgaaaa actcctgccc cagctcctaa aagaagcagg ttatactacc 420

catatggtcg gaaaatggca cctgggaatg taccggaaag aatgccttcc aacccgccga 480

ggatttgata cctactttgg atatctcctg ggtagtgaag attattattc ccatgaacgc 540

tgtacattaa ttgacgctct gaatgtcaca cgatgtgctc ttgattttcg agatggcgaa 600

gaagttgcaa caggatataa aaatatgtat tcaacaaaca tattcaccaa aagggctata 660

gccctcataa ctaaccatcc accagagaag cctctgtttc tctaccttgc tctccagtct 720

gtgcatgagc cccttcaggt ccctgaggaa tacttgaagc catatgactt tatccaagac 780

aagaacaggc atcactatgc aggaatggtg tcccttatgg atgaagcagt aggaaatgtc 840

actgcagctt taaaaagcag tgggctctgg aacaacacgg tgttcatctt ttctacagat 900

aacggagggc agactttggc agggggtaat aactggcccc ttcgaggaag aaaatggagc 960

ctgtgggaag gaggcgtccg aggggtgggc tttgtggcaa gccccttgct gaagcagaag 1020

ggcgtgaaga accgggagct catccacatc tctgactggc tgccaacact cgtgaagctg 1080

gccaggggac acaccaatgg cacaaagcct ctggatggct tcgacgtgtg gaaaaccatc 1140

agtgaaggaa gcccatcccc cagaattgag ctactgcata atattgaccc gaacttcgtg 1200

gactcttcac cgtgtcccag gaacagcatg gctccagcaa aggatgactc ttctcttcca 1260

gaatattcag cctttaacac atctgtccat gctgcaatta gacatggaaa ttggaaactc 1320

ctcacgggct acccaggctg tggttactgg ttccctccac cgtctcaata caatgtttct 1380

gagataccct catcagaccc accaaccaag accctctggc tctttgatat tgatcgggac 1440

cctgaagaaa gacatgacct gtccagagaa tatcctcaca tcgtcacaaa gctcctgtcc 1500

cgcctacagt tctaccataa acactcagtc cccgtgtact tccctgcaca ggacccccgc 1560

tgtgatccca aggccactgg ggtgtggggc ccttggatgg gtggaggcgg ttcaggcgga 1620

ggtggctctg gcggtggcgg atcgccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 1680

tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1740

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccctg aggtccagtt caactggtac 1800

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 1860

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1920

tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccatcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1980

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 2040

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 2100

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 2160

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 2220

gaggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2280

aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 2310

<210> 25

<211> 769

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ARSB-Fc

<400> 25

Met Gly Pro Arg Gly Ala Ala Ser Leu Pro Arg Gly Pro Gly Pro Arg

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Pro Val Val Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

20 25 30

Ala Pro Pro Gly Ser Gly Ala Gly Ala Ser Arg Pro Pro His Leu Val

35 40 45

Phe Leu Leu Ala Asp Asp Leu Gly Trp Asn Asp Val Gly Phe His Gly

50 55 60

Ser Arg Ile Arg Thr Pro His Leu Asp Ala Leu Ala Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Leu Leu Asp Asn Tyr Tyr Thr Gln Pro Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ser

85 90 95

Gln Leu Leu Thr Gly Arg Tyr Gln Ile Arg Thr Gly Leu Gln His Gln

100 105 110

Ile Ile Trp Pro Cys Gln Pro Ser Cys Val Pro Leu Asp Glu Lys Leu

115 120 125

Leu Pro Gln Leu Leu Lys Glu Ala Gly Tyr Thr Thr His Met Val Gly

130 135 140

Lys Trp His Leu Gly Met Tyr Arg Lys Glu Cys Leu Pro Thr Arg Arg

145 150 155 160

Gly Phe Asp Thr Tyr Phe Gly Tyr Leu Leu Gly Ser Glu Asp Tyr Tyr

165 170 175

Ser His Glu Arg Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Asn Val Thr Arg Cys

180 185 190

Ala Leu Asp Phe Arg Asp Gly Glu Glu Val Ala Thr Gly Tyr Lys Asn

195 200 205

Met Tyr Ser Thr Asn Ile Phe Thr Lys Arg Ala Ile Ala Leu Ile Thr

210 215 220

Asn His Pro Pro Glu Lys Pro Leu Phe Leu Tyr Leu Ala Leu Gln Ser

225 230 235 240

Val His Glu Pro Leu Gln Val Pro Glu Glu Tyr Leu Lys Pro Tyr Asp

245 250 255

Phe Ile Gln Asp Lys Asn Arg His His Tyr Ala Gly Met Val Ser Leu

260 265 270

Met Asp Glu Ala Val Gly Asn Val Thr Ala Ala Leu Lys Ser Ser Gly

275 280 285

Leu Trp Asn Asn Thr Val Phe Ile Phe Ser Thr Asp Asn Gly Gly Gln

290 295 300

Thr Leu Ala Gly Gly Asn Asn Trp Pro Leu Arg Gly Arg Lys Trp Ser

305 310 315 320

Leu Trp Glu Gly Gly Val Arg Gly Val Gly Phe Val Ala Ser Pro Leu

325 330 335

Leu Lys Gln Lys Gly Val Lys Asn Arg Glu Leu Ile His Ile Ser Asp

340 345 350

Trp Leu Pro Thr Leu Val Lys Leu Ala Arg Gly His Thr Asn Gly Thr

355 360 365

Lys Pro Leu Asp Gly Phe Asp Val Trp Lys Thr Ile Ser Glu Gly Ser

370 375 380

Pro Ser Pro Arg Ile Glu Leu Leu His Asn Ile Asp Pro Asn Phe Val

385 390 395 400

Asp Ser Ser Pro Cys Pro Arg Asn Ser Met Ala Pro Ala Lys Asp Asp

405 410 415

Ser Ser Leu Pro Glu Tyr Ser Ala Phe Asn Thr Ser Val His Ala Ala

420 425 430

Ile Arg His Gly Asn Trp Lys Leu Leu Thr Gly Tyr Pro Gly Cys Gly

435 440 445

Tyr Trp Phe Pro Pro Pro Ser Gln Tyr Asn Val Ser Glu Ile Pro Ser

450 455 460

Ser Asp Pro Pro Thr Lys Thr Leu Trp Leu Phe Asp Ile Asp Arg Asp

465 470 475 480

Pro Glu Glu Arg His Asp Leu Ser Arg Glu Tyr Pro His Ile Val Thr

485 490 495

Lys Leu Leu Ser Arg Leu Gln Phe Tyr His Lys His Ser Val Pro Val

500 505 510

Tyr Phe Pro Ala Gln Asp Pro Arg Cys Asp Pro Lys Ala Thr Gly Val

515 520 525

Trp Gly Pro Trp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

530 535 540

Gly Gly Gly Ser Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro

545 550 555 560

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

565 570 575

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

580 585 590

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

595 600 605

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val

610 615 620

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

625 630 635 640

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

645 650 655

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

660 665 670

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

675 680 685

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

690 695 700

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

705 710 715 720

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

725 730 735

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

740 745 750

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

755 760 765

Lys

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

Claims (23)

1.一种酶融合蛋白，其中将免疫球蛋白Fc区与治疗酶融合，并且与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶相比，所述治疗酶具有增加的体内持续时间。

2.根据权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述治疗酶选自β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性神经鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳香基硫酸酯酶A、芳香基硫酸酯酶B、β-己糖胺酶A、β-己糖胺酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶、葡萄糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶和髓过氧化物酶。

3.根据权利要求1所述的酶融合蛋白，其中治疗酶和免疫球蛋白Fc区通过肽接头融合。

4.根据权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述酶融合蛋白是一分子免疫球蛋白Fc区与二聚治疗酶的融合。

5.根据权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区在天然免疫球蛋白Fc区的至少一个氨基酸中具有选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变异。

6.根据权利要求5所述的酶融合蛋白，其中在具有SEQ ID NO：8的氨基序列的所述免疫球蛋白Fc区中，所述第2个氨基酸被脯氨酸取代；所述第71个氨基酸被谷氨酰胺取代；或者所述第2个氨基酸被脯氨酸取代以及所述第71个氨基酸被谷氨酰胺取代。

7.根据权利要求6所述的酶融合蛋白，其中在所述免疫球蛋白Fc区中没有链交换。

8.根据权利要求1所述的酶融合蛋白，其中与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶相比，所述酶融合蛋白具有增加的稳定性和降低的与溶酶体受体的结合亲和力，从而具有高度组织分布。

9.根据权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区选自下列：

(a)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；

(b)CH1结构域和CH2结构域；

(c)CH1结构域和CH3结构域；

(d)CH2结构域和CH3结构域；

(e)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区或铰链区的部分之间的组合；和

(f)介于重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域之间的二聚体。

10.根据权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区选自：(a)去除能够形成二硫键的区域、(b)在天然Fc的所述N-末端去除某些氨基酸残基、(c)在天然Fc形式的所述N-末端添加甲硫氨酸残基、(d)去除补体结合位点或(e)缺失抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是非糖基化的。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc片段。

13.根据权利要求12所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是具有不同来源的结构域的混杂物，其衍生自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。

14.根据权利要求13所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区为IgG4 Fc区。

15.根据权利要求14所述的酶融合蛋白，其中所述IgG4 Fc区的所述铰链区被IgG1铰链区取代。

16.用于预防或治疗溶酶体贮积症(LSD)的药物组合物，其包括权利要求1至10中任一项所述的酶融合蛋白。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述溶酶体贮积症(LSD)选自粘多糖贮积症(MPS)、糖原贮积病、鞘脂类代谢障碍、尼曼-匹克病、法布里氏病、戈谢病、亨特综合征和马-拉综合征。

18.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)或芳香基硫酸酯酶B(ARSB)。

19.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述组合物降低了酶对溶酶体受体的结合亲和力。

20.多核苷酸，其编码权利要求1至10中任一项所述的酶融合蛋白。

21.表达载体，其包括权利要求20所述的多核苷酸。

22.转化体，其中导入权利要求21所述的表达载体。

23.一种用于制备酶融合蛋白的方法，其包括：

(a)培养权利要求22所述的转化体以获得培养物；和

(b)从所述培养物中回收酶融合蛋白。

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