CN116916947A - 包含磺基葡糖胺磺基水解酶的融合蛋白和其方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了能够转运跨过血脑屏障(BBB)并包含磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)酶‑Fc融合多肽的蛋白质。某些实施方案还提供了使用这类蛋白质治疗A型圣菲利波综合征的方法。

Description

包含磺基葡糖胺磺基水解酶的融合蛋白和其方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年10月14日提出的美国临时申请序列号63/091,800的优先权。以上提及的申请的全部内含以引用的方式并入本文中。

背景技术

圣菲利波综合征(Sanfilippo syndrome)或MPS III是一种罕见的神经退行性病症，由溶酶体功能的某些缺陷引起。圣菲利波综合征最常见的类型是A型，由SGSH基因的基因突变引起。N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)的活性不足会导致硫酸乙酰肝素衍生的寡糖积聚，并导致多个器官和组织，尤其是脑和脊髓中的溶酶体功能障碍。圣菲利波综合征的治疗仍然主要是支持性的；虽然缺乏的酶可以经静脉内注射，但由于重组酶难以穿过血脑屏障(BBB)，因此它对大脑的影响很小。因此，需要更有效的疗法来治疗A型圣菲利波综合征的周围和中枢神经系统(CNS)症状。

发明内容

因此，本文提供了一种特定酶替代疗法，所述疗法能够跨过BBB并治疗A型圣菲利波综合征的周围与CNS表现。具体地说，某些实施方案提供了一种蛋白质，所述蛋白质包含：(a)第一Fc多肽，所述第一Fc多肽连接于第一N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段；和(b)第二Fc多肽，所述第二Fc多肽连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段，其中所述第二Fc多肽包含与SEQID NO:37具有至少80％同一性并具有根据EU编号在位置389处的Ala的序列。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽在以下位置处包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽在以下位置处包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe。在某些实施方案中，第二Fc多肽特异性结合于运铁蛋白受体(TfR)或能够特异性结合于TfR。在某些实施方案中，第二Fc多肽结合于TfR的顶端结构域。在某些实施方案中，蛋白质与TfR的结合基本上不抑制运铁蛋白与TfR的结合。在某些实施方案中，蛋白质以约100nM至约500nM或任选地约150nM至约400nM的亲和力结合于TfR。在某些实施方案中，蛋白质能够转运跨过受试者的血脑屏障。

在某些实施方案中，第一SGSH氨基酸序列包含与SEQ ID NO:58-60中的任一者具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一SGSH氨基酸序列包含SEQ ID NO:58-60中的任一者的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第二SGSH氨基酸序列包含与SEQ ID NO:58-60中的任一者具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二SGSH氨基酸序列包含SEQ ID NO:58-60中的任一者的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一Fc多肽通过肽键或通过多肽接头连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，第二Fc多肽通过肽键或通过多肽接头连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，多肽接头是柔性多肽接头。在某些实施方案中，柔性多肽接头是富甘氨酸接头。在某些实施方案中，多肽接头是GS(SEQ ID NO:7)、G₄S(SEQ ID NO:8)或(G₄S)₂(SEQ IDNO:9)。

在某些实施方案中，第一Fc多肽的N端连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，第一Fc多肽的C端连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，第二Fc多肽的N端连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，第二Fc多肽的C端连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，第一Fc多肽的N端连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段；并且第二Fc多肽的N端连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，第一Fc多肽的C端连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段；并且第二Fc多肽的C端连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽各自含有促进异二聚合的修饰。在某些实施方案中，根据EU编号，Fc多肽中的一者具有T366W取代并且另一Fc多肽具有T366S、L368A和Y407V取代。

在某些实施方案中，第一Fc多肽含有T366S、L368A和Y407V取代并且第二Fc多肽含有T366W取代。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:12-19和28-31中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；并且第二Fc多肽包含与SEQID NO:34-41和54-57中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一Fc多肽含有T366W取代并且第二Fc多肽含有T366S、L368A和Y407V取代。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:24-27中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；并且第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:48-53中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含天然FcRn结合位点。

在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽不具有效应功能。在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包括降低效应功能的修饰。在某些实施方案中，降低效应功能的修饰是根据EU编号，在位置234处的Ala和在位置235处的Ala的取代。

在某些实施方案中，第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:14-19和26-31中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:14、15、28和29中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:18、19、30和31中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，连接于第一SGSH氨基酸序列的第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:61-88和117-118中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，连接于第一SGSH氨基酸序列的第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:61-68、73-76、81-84和117-118中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:36-41和50-57中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:36、37、54和55中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含与SEQ IDNO:40、41、56和57中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，连接于第二SGSH氨基酸序列的第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:89-116和119-120中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，连接于第二SGSH氨基酸序列的第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:89-96、101-104、109-112和119-120中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，相对于天然Fc序列，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含延长血清半衰期的氨基酸变化。在某些实施方案中，氨基酸变化包含根据EU编号在位置252处的Tyr、在位置254处的Thr和在位置256处的Glu的取代。在某些实施方案中，氨基酸变化包含根据EU编号在位置428处的Leu和在位置434处的Ser的取代。在某些实施方案中，氨基酸变化包含根据EU编号在位置434处的Ser或Ala的取代。

在某些实施方案中，连接于第一SGSH氨基酸序列的第一Fc多肽包含SEQ ID NO:61-68、73-76和81-84中的任一者的氨基酸序列；并且连接于第二SGSH氨基酸序列的第二Fc多肽包含SEQ ID NO:89-96、101-104和109-112中的任一者的氨基酸序列。

在某些实施方案中，连接于第一SGSH氨基酸序列的第一Fc多肽包含SEQ ID NO:61-64中的任一者的氨基酸序列；并且连接于第二SGSH氨基酸序列的第二Fc多肽包含SEQID NO:89-92中的任一者的氨基酸序列。在某些实施方案中，连接于第一SGSH氨基酸序列的第一Fc多肽包含SEQ ID NO:63或64的氨基酸序列；并且连接于第二SGSH氨基酸序列的第二Fc多肽包含SEQ ID NO:91或92的氨基酸序列。

在某些实施方案中，连接于第一SGSH氨基酸序列的第一Fc多肽包含SEQ ID NO:75或76的氨基酸序列；并且连接于第二SGSH氨基酸序列的第二Fc多肽包含SEQ ID NO:103或104的氨基酸序列。

在某些实施方案中，连接于第一SGSH氨基酸序列的第一Fc多肽包含SEQ ID NO:83或84的氨基酸序列；并且连接于第二SGSH氨基酸序列的第二Fc多肽包含SEQ ID NO:111或112的氨基酸序列。

在某些实施方案中，连接于第一SGSH氨基酸序列的第一Fc多肽包含SEQ ID NO:65-68中的任一者的氨基酸序列；并且连接于第二SGSH氨基酸序列的第二Fc多肽包含SEQID NO:93-96中的任一者的氨基酸序列。在某些实施方案中，连接于第一SGSH氨基酸序列的第一Fc多肽包含SEQ ID NO:67或68的氨基酸序列；并且连接于第二SGSH氨基酸序列的第二Fc多肽包含SEQ ID NO:95或96的氨基酸序列。

在某些实施方案中，连接于第一SGSH氨基酸序列的第一Fc多肽包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列；并且连接于第二SGSH氨基酸序列的第二Fc多肽包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。

在某些实施方案中，与在缺乏第一Fc多肽和第二Fc多肽的情况下SGSH氨基酸序列的吸收相比或与未对第二Fc多肽进行促成TfR结合的修饰的情况下SGSH酶的吸收相比，SGSH氨基酸序列在脑中的吸收大至少十倍。

在某些实施方案中，第一Fc多肽未被修饰成结合于血脑屏障(BBB)受体并且第二Fc多肽被修饰成特异性结合于TfR。

在某些实施方案中，蛋白质不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。

某些实施方案还提供了一种多肽，所述多肽包含连接于SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段的Fc多肽，其中所述Fc多肽：i)包含与SEQ ID NO:37具有至少90％同一性的序列；ii)具有一个或多个促进其与另一种Fc多肽进行异二聚合的修饰；并且iii)具有根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，根据EU编号，Fc多肽在以下位置处还包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，根据EU编号，Fc多肽在以下位置处还包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe。在某些实施方案中，Fc多肽特异性结合于运铁蛋白受体(TfR)或能够特异性结合于TfR。在某些实施方案中，Fc多肽通过肽键或通过多肽接头连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，多肽是从N端到C端包含以下的融合多肽：SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或催化活性片段；多肽接头；和Fc多肽。在某些实施方案中，多肽是从N端到C端包含以下的融合多肽：Fc多肽；多肽接头；和SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或催化活性片段。

在某些实施方案中，根据EU编号，Fc多肽含有T366S、L368A和Y407V取代。在某些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:97-100、105-108和113-116中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，Fc多肽含有T366W取代。在某些实施方案中，多肽包含与SEQID NO:89-96、101-104、109-112和119-120中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，蛋白质包含Fc多肽，其中所述Fc多肽与另一Fc多肽二聚。因此，某些实施方案提供了一种蛋白质，所述蛋白质包含如本文所述的Fc多肽和另一Fc多肽。

某些实施方案提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如本文所述的多肽的核酸序列。某些实施方案还提供了一种载体，所述载体包含如本文所述的多核苷酸。某些实施方案提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所述的多核苷酸或如本文所述的载体。在某些实施方案中，这类宿主细胞还包括包含编码另一Fc多肽的核酸序列的多核苷酸。

本文提供了一种制造如本文所述的蛋白质或多肽的方法。

某些实施方案提供了一种用于产生多肽的方法，所述多肽包含连接于SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或催化活性片段的Fc多肽，所述方法包括在表达由如本文所述的多核苷酸编码的多肽的条件下培养宿主细胞。

某些实施方案提供了一种多核苷酸对，所述多核苷酸对包含编码连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段的第一Fc多肽的第一核酸序列；和编码连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段的第二Fc多肽的第二核酸序列。某些实施方案还提供了一种或多种载体，所述载体包含如本文所述的多核苷酸对。某些实施方案提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所述的多核苷酸对或一种或多种如本文所述的载体。

某些实施方案还提供了一种用于产生蛋白质的方法，所述蛋白质包含连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段的第一Fc多肽和连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段的第二Fc多肽，所述方法包括在表达如本文所述的多核苷酸对的条件下培养宿主细胞。

某些实施方案提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的蛋白质或多肽和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

某些实施方案提供了一种治疗A型圣菲利波综合征的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如本文所述的蛋白质或如本文所述的多肽。

某些实施方案提供了如本文所述的蛋白质或如本文所述的多肽，所述蛋白质或所述多肽用于治疗有需要的患者的A型圣菲利波综合征。

某些实施方案提供了如本文所述的蛋白质或如本文所述的多肽的用途，所述蛋白质或所述多肽用于制备供治疗有需要的患者的A型圣菲利波综合征用的药物。

某些实施方案提供了一种减少患有A型圣菲利波综合征的患者中的毒性代谢产物积聚的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文所述的蛋白质或如本文所述的多肽。

某些实施方案提供了如本文所述的蛋白质或如本文所述的多肽，所述蛋白质或所述多肽用于减少患有A型圣菲利波综合征的患者中的毒性代谢产物积聚。

某些实施方案提供了如本文所述的蛋白质或如本文所述的多肽的用途，所述蛋白质或所述多肽用于制备供减少患有A型圣菲利波综合征的患者中的毒性代谢产物积聚的药物。

在某些实施方案中，毒性代谢产物包含硫酸乙酰肝素衍生的寡糖。

附图说明

图1A-1C.示出了在SGSH酶与Fc多肽铰链区之间具有变化的接头长度的示例性ETV:SGSH融合蛋白。

图2.通过LCMS确定的SGSH-Fc和ETV:SGSH融合蛋白的fGly含量。

图3.对SGSH-Fc和ETV:SGSH融合蛋白的酶活性的体外评估。

图4.使用³⁵S脉冲追踪测定评估SGSH-Fc融合蛋白在来自MPSIIIA患者和健康对照的纤维母细胞中的细胞活性。

图5.SGSH-Fc和ETV:SGSH融合蛋白的血清浓度。

图6A-6B.在2小时(图6A)和8小时(图6B)SGSH-Fc和ETV:SGSH融合蛋白的肝脏浓度。

图7.SGSH-Fc和ETV:SGSH融合蛋白的脑浓度。

图8.肝脏中的总硫酸乙酰肝素水平。

图9.脑中的总硫酸乙酰肝素水平。

图10.CSF中的总硫酸乙酰肝素水平。

图11.在施用两种不同ETV:SGSH融合蛋白之后脑中的总硫酸乙酰肝素水平。

具体实施方式

当前需要治疗A型圣菲利波综合征的新治疗剂，特别是治疗神经认知表型的治疗剂。本文描述了一种特定酶替代疗法，称为ETV:SGSH，所述疗法能够跨过BBB并治疗A型圣菲利波综合征的周围与CNS表达。如本文所用，术语“ETV:SGSH”是指能够转运跨过BBB并包含各自连接(例如稠合)到SGSH酶、SGSH酶变体或其催化活性片段的第一Fc多肽和第二Fc多肽的二聚蛋白。如实施例中所论述，A型圣菲利波综合征的鼠类小鼠模型展示在单一静脉内ETV:SGSH剂量之后脑糖胺聚糖(GAG)减少超过50％并且CSF GAG减少超过80％。

包含SGSH酶-FC融合多肽的蛋白质分子

如本文所述，某些实施方案提供了一种蛋白质分子，所述蛋白质分子包含SGSH酶-Fc融合多肽。掺入蛋白质中的SGSH酶是催化活性的，即其保持酶活性。在一些方面，本文所述的蛋白质包含：(i)Fc多肽，所述Fc多肽可含有修饰(例如一个或多个促进异二聚合的修饰)或可以是野生型Fc多肽；和SGSH酶；以及(ii)Fc多肽，所述Fc多肽含有引起结合于血脑屏障(BBB)受体、例如运铁蛋白受体(TfR)的修饰，和任选地一个或多个额外的修饰(例如一个或多个促进异二聚合的修饰)；和SGSH酶。

在一些实施方案中，如本文所述的蛋白质包含野生型SGSH的催化活性片段或变体。在一些实施方案中，SGSH酶是包含SEQ ID NO:58、59和60中的任一者的氨基酸序列的SGSH蛋白的变体或催化活性片段。在一些实施方案中，SGSH酶的催化活性变体或片段具有野生型SGSH酶的活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更大。

在一些实施方案中，存在于本文所述的蛋白质中的SGSH酶或其催化活性变体或片段与其在未接合于Fc多肽或结合TfR的Fc多肽时的活性相比保持其活性的至少25％。在一些实施方案中，SGSH酶或其催化活性变体或片段与其在未接合于Fc多肽或结合TfR的Fc多肽时的活性相比保持其活性的至少10％或至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，SGSH酶或其催化活性变体或片段与其在未接合于Fc多肽或结合TfR的Fc多肽时的活性相比保持其活性的至少80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，与Fc多肽的融合不会降低SGSH酶或其催化活性变体或片段的活性。在一些实施方案中，与结合TfR的Fc多肽的融合不会降低SGSH酶的活性。

Fc多肽修饰

并入本文所述的融合蛋白中的Fc多肽可包含某些修饰。举例来说，Fc多肽可包含引起结合于血脑屏障(BBB)受体、例如运铁蛋白受体(TfR)的修饰。另外，Fc多肽可包含其它修饰，例如促进异二聚合、增加血清稳定性或血清半衰期、调节效应功能、影响糖基化和/或降低在人中的免疫原性的修饰。因此，在某些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含两种Fc多肽，其中一种Fc是野生型Fc多肽，例如人IgG1 Fc多肽；并且另一种Fc被修饰成结合于血脑屏障(BBB)受体、例如运铁蛋白受体(TfR)，并且任选地还包含一个或多个额外的修饰。在某些其它实施方案中，两种Fc多肽各包含独立选择的修饰(例如本文所述的修饰)。

本文中使用EU索引编号对多种Fc修饰，包括在结合于BBB受体、例如TfR的经修饰的Fc多肽中引入的修饰中所指定的氨基酸残基进行编号。任何Fc多肽，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽，可在如本文所述的一个或多个位置处具有修饰，例如氨基酸取代。

本文所述的融合蛋白中存在的经修饰(例如增强异二聚合和/或BBB受体结合)的Fc多肽可与天然Fc区序列或其片段，例如至少50个氨基酸或至少100个氨基酸或长度更长的片段具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，天然Fc氨基酸序列是SEQ ID NO:1的Fc区序列。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸1-110、或SEQ ID NO:1的氨基酸111-217或其片段，例如至少50个氨基酸或至少100个氨基酸或长度更长的片段具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

在一些实施方案中，经修饰(例如增强异二聚合和/或BBB受体结合)的Fc多肽包含与天然Fc区氨基酸序列对应的至少50个氨基酸，或至少60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个或95个或更多个、或至少100个氨基酸或更多个。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含与例如SEQ ID NO:1的天然Fc区氨基酸序列对应的至少25个相连氨基酸，或至少30个、35个、40个或45个相连氨基酸，或50个相连氨基酸，或至少60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个或95个或更多个相连氨基酸，或100个或更多个相连氨基酸。

用于血脑屏障(BBB)受体结合的修饰

在一些方面，本文提供了能够转运跨过血脑屏障(BBB)的融合蛋白。这类蛋白质包含结合于BBB受体的经修饰的Fc多肽。BBB受体在BBB内皮以及其它细胞和组织类型上表达。在一些实施方案中，BBB受体是运铁蛋白受体(TfR)。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白特异性结合于TfR。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白以约50nM至约500nM的亲和力特异性结合于TfR。在一些实施方案中，蛋白质以约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500nM的亲和力结合(例如特异性结合)于TfR。在一些实施方案中，蛋白质以约100nM至约500nM的亲和力结合于TfR。在一些实施方案中，蛋白质以约100nM至约300nM、或约150nM至约250nM、或约200nM至约250nM的亲和力结合于TfR。在一些实施方案中，蛋白质以约230nM的亲和力结合于TfR。在一些实施方案中，蛋白质以约150nM至约400nM、或约200nM至约400nM、或约250nM至约350nM、或约300nM至约350nM的亲和力结合于TfR。

在一些实施方案中，特异性结合于TfR的经修饰的Fc多肽在CH3结构域中包含取代。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含针对TfR结合活性进行修饰的人Ig CH3结构域，例如IgG CH3结构域。CH3结构域可能属于任何IgG亚型，即来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG抗体的上下文中，CH3结构域是指如根据EU编号方案编号，从约位置341至约位置447的氨基酸区段。

在一些实施方案中，特异性结合于TfR的经修饰的Fc多肽结合于TfR的顶端结构域并且可在不阻断或以其它方式抑制运铁蛋白与TfR的结合的情况下结合于TfR。在一些实施方案中，运铁蛋白与TfR的结合基本上不受抑制。在一些实施方案中，运铁蛋白与TfR的结合被抑制不到约50％(例如不到约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)。在一些实施方案中，运铁蛋白与TfR的结合被抑制不到约20％(例如不到约15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的经修饰(例如结合BBB受体)的Fc多肽包含根据EU编号方案在氨基酸位置384、386、387、388、389、413、415、416和421处的取代。

在一些实施方案中，特异性结合于TfR的经修饰的Fc多肽包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，根据EU编号，特异性结合于TfR的经修饰的Fc多肽在以下位置处包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，根据EU编号，特异性结合于TfR的经修饰的Fc多肽在以下位置处包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe。

在额外实施方案中，经修饰的Fc多肽还在根据EU编号方案包含414、424和426的位置处包含一个、两个或三个取代。在一些实施方案中，位置414是Lys、Arg、Gly或Pro；位置424是Ser、Thr、Glu或Lys；和/或位置426是Ser、Trp或Gly。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:32的氨基酸111-217具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性；并且在SEQ ID NO:32的EU索引位置380、384-390和/或413-421处包含所述氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:33的氨基酸111-216具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性；并且在SEQ ID NO:32或33的EU索引位置380、384-390和/或413-421处包含所述氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:32或33具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性；并且在SEQ ID NO:32或33的EU索引位置380、384-390和/或413-421处包含所述氨基酸。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:32或33具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且具有根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:32或33具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置处包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:32或33具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置处包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列。

额外的Fc多肽突变

在一些方面，本文所述的融合蛋白包含两种Fc多肽，其中一种或两种Fc多肽各自包含独立选择的修饰(例如本文所述的修饰)。可引入一种或两种Fc多肽中的其它突变的非限制性实例包括例如增加血清稳定性或血清半衰期、调节效应功能、影响糖基化、降低在人中的免疫原性和/或提供Fc多肽的杵臼异二聚合的突变。

在一些实施方案中，融合蛋白中存在的Fc多肽独立地与相应野生型Fc多肽(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，融合蛋白中存在的Fc多肽包括杵和臼突变以促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。一般地，修饰在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应腔(“臼”)，使得突起可位于腔中以便促进异二聚体的形成，因此阻碍同二聚体的形成。突起通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链来构建。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起相同或类似尺寸的补偿腔。在一些实施方案中，这类额外突变处于Fc多肽中对多肽与BBB受体、例如TfR的结合无负面影响的位置处。

在用于二聚的杵臼方法的一个示意性实施方案中，融合蛋白中存在的Fc多肽中的一者的位置366(根据EU编号方案编号)包含色氨酸，代替天然苏氨酸。二聚体中的另一种Fc多肽在位置407处(根据EU编号方案编号)具有缬氨酸，代替天然酪氨酸。另一种Fc多肽还可包含取代，其中在位置366处(根据EU编号方案编号)的天然苏氨酸经丝氨酸取代并且在位置368处(根据EU编号方案编号)的天然亮氨酸经丙氨酸取代。因此，本文所述的融合蛋白的一种Fc多肽具有T366W杵突变并且另一种Fc多肽具有Y407V突变，通常还伴有T366S和L368A臼突变。在某些实施方案中，第一Fc多肽含有T366S、L368A和Y407V取代并且第二Fc多肽含有T366W取代。在某些其它实施方案中，第一Fc多肽含有T366W取代并且第二Fc多肽含有T366S、L368A和Y407V取代。

在一些实施方案中，可引入增强血清半衰期的修饰。举例来说，在一些实施方案中，如根据EU编号方案编号，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽可包含在位置252处的酪氨酸、在位置254处的苏氨酸和在位置256处的谷氨酸。因此，一种或两种Fc多肽可具有M252Y、S254T和T256E取代。可替代地，如根据EU编号方案编号，一种或两种Fc多肽可具有M428L和N434S取代。可替代地，一种或两种Fc多肽可具有N434S或N434A取代。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽可包含降低效应功能，即令在结合于在介导效应功能的效应细胞上表达的Fc受体后诱导某些生物功能的能力降低的修饰。抗体效应功能的实例包括(但不限于)C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。效应功能可随抗体类别而变。举例来说，在结合于在免疫系统细胞上存在的适当Fc受体后，天然人IgG1和IgG3抗体可引起ADCC和CDC活性，并且在结合于在免疫细胞上存在的适当Fc受体后，天然人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4可引起ADCP功能。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽还可以被工程化成含有用于异二聚合的其它修饰，例如CH3-CH3界面内接触残基的静电工程化，所述修饰是天然带电的或疏水性补丁修饰。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽可包括调节效应功能的额外的修饰。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽可包含降低或消除效应功能的修饰。降低效应功能的例示性Fc多肽突变包括(但不限于)CH2结构域中例如在根据EU编号方案的位置234和235处的取代。举例来说，在一些实施方案中，一种或两种Fc多肽可在位置234和235处包含丙氨酸残基。因此，一种或两种Fc多肽可具有L234A和L235A(LALA)取代。

调节效应功能的额外的Fc多肽突变包括(但不限于)以下：位置329可具有如下突变，其中脯氨酸经甘氨酸或精氨酸或大到足以破坏在Fc的脯氨酸329与FcγRIII的色氨酸残基Trp 87和Trp 110之间形成的Fc/Fcγ受体界面的氨基酸残基取代。额外的例示性取代包括根据EU编号方案的S228P、E233P、L235E、N297A、N297D和P331S。还可以存在多个取代，例如根据EU编号方案，人IgG1 Fc区的L234A和L235A；人IgG1 Fc区的L234A、L235A和P329G；人IgG1 Fc区的L234A、L235A和P329S；人IgG4 Fc区的S228P和L235E；人IgG1Fc区的L234A和G237A；人IgG1 Fc区的L234A、L235A和G237A；人IgG2 Fc区的V234A和G237A；人IgG4 Fc区的L235A、G237A和E318A；以及人IgG4 Fc区的S228P和L236E。在一些实施方案中，一种或两种Fc多肽可具有一个或多个调节ADCC的氨基酸取代，例如在根据EU编号方案的位置298、333和/或334处的取代。

在一些实施方案中，在本文所述的Fc多肽中去除C端Lys残基(即，根据EU编号方案，在位置447处的Lys残基)。

包含额外的突变的例示性Fc多肽

如本文所述，并且借助于非限制性实例，本文所述的融合蛋白中存在的一种或两种Fc多肽可包含额外突变，包括杵突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366W)、臼突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366S、L368A和Y407V)、调节效应功能的突变(例如，如根据EU编号方案编号的L234A、L235A和/或P329G或P329S(例如L234A和L235A；L234A、L235A和P329G；或L234A、L235A和P329S))和/或增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T和T256E，或(ii)如根据EU编号方案编号的N434S，有或无M428L)。作为例证，SEQ ID NO:12-19、24-31、34-41和48-57提供了包含这些额外的突变中的一者或多者的经修饰的Fc多肽的非限制性实例。

在一些实施方案中，Fc多肽可具有杵突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366W)并与SEQ ID NO:1、2、32和33中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、2、32和33中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰成具有杵突变。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含杵突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366W)，并且与SEQ ID NO:24和25中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:24和25中的任一者的序列。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含杵突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366W)，并且与SEQ ID NO:34和35中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ IDNO:34或35具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置处包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:34或35具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置处包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:34和35中的任一者的序列。

在一些实施方案中，Fc多肽可具有杵突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366W)、调节效应功能的突变(例如，如根据EU编号方案编号的L234A、L235A和/或P329G或P329S(例如L234A和L235A；L234A、L235A和P329G；或L234A、L235A和P329S))，并且与SEQ IDNO:1、2、32和33中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、2、32和33中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰成具有杵突变和调节效应功能的突变。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含杵突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366W)和调节效应功能的突变(例如，如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G或P329S(例如L234A和L235A；L234A、L235A和P329G；或L234A、L235A和P329S))，并且与SEQ IDNO:26和27中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:26和27中的任一者的序列。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含杵突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366W)和调节效应功能的突变(例如，如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G或P329S(例如L234A和L235A；L234A、L235A和P329G；或L234A、L235A和P329S))，与SEQ ID NO:36-41和54-57中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:36-41和54-57中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:36-41和54-57中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:36-41和54-57中的任一者的序列。

在一些实施方案中，Fc多肽可具有臼突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366S、L368A和Y407V)，并且与SEQ ID NO:1、2、32和33具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、2、32和33中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰成具有臼突变。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含臼突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366S、L368A和Y407V)，并且与SEQ ID NO:12和13具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:12和13中的任一者的序列。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含臼突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366S、L368A和Y407V)，并且与SEQ ID NO:48和49具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ IDNO:48和49中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:48和49中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:48和49中的任一者的序列。

在一些实施方案中，Fc多肽可具有臼突变(例如，如根据EU编号方案编号的T366S、L368A和Y407V)、调节效应功能的突变(例如L234A、L235A和/或P329G或P329S(例如，如根据EU编号方案编号的L234A和L235A；L234A、L235A和P329G；或L234A、L235A和P329S))，并且与SEQ ID NO:1、2、32和33中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、2、32和33中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰成具有臼突变和调节效应功能的突变。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含臼突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366S、L368A和Y407V)和调节效应功能的突变(例如，如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G或P329S(例如，L234A和L235A；L234A、L235A和P329G；或L234A、L235A和P329S))，并且与SEQ ID NO:14-19和28-31中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:14-19和28-31中的任一者的序列。

在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含臼突变(例如，如参考EU编号进行编号的T366S、L368A和Y407V)和调节效应功能的突变(例如，如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G或P329S(例如L234A和L235A；L234A、L235A和P329G；或L234A、L235A和P329S))，并且与SEQ ID NO:50-53中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ IDNO:50-53中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:50-53中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:50-53中的任一者的序列。

FcRn结合位点

在某些方面，经修饰(例如结合BBB受体)的Fc多肽或本文所述的融合蛋白中存在的不特异性结合于BBB受体的Fc多肽可包含FcRn结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点在Fc多肽或其片段内。

在一些实施方案中，FcRn结合位点包含天然FcRn结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点不包含相对于天然FcRn结合位点的氨基酸序列的氨基酸变化。在一些实施方案中，天然FcRn结合位点是IgG结合位点，例如人IgG结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点包含改变FcRn结合的修饰。

在一些实施方案中，FcRn结合位点具有一个或多个发生突变，例如被取代的氨基酸残基，其中所述突变增加血清半衰期或基本上不减少血清半衰期(即，当在相同条件下测定时，与在突变位置处具有野生型残基的对应经修饰的Fc多肽相比血清半衰期减少至多25％)。在一些实施方案中，FcRn结合位点具有一个或多个在根据EU编号方案的位置250-256、307、380、428和433-436处被取代的氨基酸残基。

在一些实施方案中，在FcRn结合位点上或其附近的一个或多个残基相对于天然人IgG序列发生突变，以延长经修饰的多肽的血清半衰期。在一些实施方案中，突变引入位置252、254和256中的一个、两个或三个中。在一些实施方案中，突变是M252Y、S254T和T256E。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽还包含突变M252Y、S254T和T256E。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽在根据EU编号方案的位置T307、E380和N434中的一个、两个或全部三个处包含取代。在一些实施方案中，突变是T307Q和N434A。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含突变T307A、E380A和N434A。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽在根据EU编号方案的位置T250和M428处包含取代。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含突变T250Q和/或M428L。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽在根据EU编号方案的位置M428和N434处包含取代。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含突变M428L和N434S。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽包含N434S或N434A突变。

连接于Fc多肽的SGSH酶

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含两种如本文所述的Fc多肽并且所述Fc多肽中的一种或两种还可包含部分或完全铰链区。铰链区可来自于任何免疫球蛋白亚类或同种型。例示性免疫球蛋白铰链是IgG铰链区，例如IgG1铰链区，例如人IgG1铰链氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5)或其一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，铰链区在Fc多肽的N端区。

在某些实施方案中，第一Fc多肽的N端连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，第一Fc多肽的C端连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，第二Fc多肽的N端连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。在某些实施方案中，第二Fc多肽的C端连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

在某些实施方案中，第一Fc多肽的N端连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段；并且第二Fc多肽的N端连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

在某些实施方案中，第一Fc多肽的C端连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段；并且第二Fc多肽的C端连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

在一些实施方案中，Fc多肽通过接头，例如肽接头接合于SGSH酶。在一些实施方案中，Fc多肽通过肽键或通过肽接头接合于SGSH酶，例如为融合多肽。肽接头可被配置成使得其允许SGSH酶相对于其所接合的Fc多肽旋转；和/或抵抗蛋白酶消化。肽接头可含有天然氨基酸、非天然氨基酸或它们的组合。在一些实施方案中，肽接头可以是柔性接头，例如含有氨基酸，例如Gly、Asn、Ser、Thr、Ala等(例如富甘氨酸接头)。这类接头使用已知的参数设计，并且可以是任何长度，并含有任何长度的任何数目的重复单元(例如Gly和Ser残基的重复单元)。举例来说，接头可具有重复单元，例如两个、三个、四个、五个或更多个Gly₄-Ser(SEQ ID NO:8)重复单元或单一Gly₄-Ser(SEQ ID NO:8)。在其它方面，接头可以是Gly-Ser(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，肽接头可包括蛋白酶裂解位点，例如可由中枢神经系统中存在的酶裂解。

在一些实施方案中，SGSH酶例如通过Gly-Ser接头(SEQ ID NO:7)、Gly₄-Ser接头(SEQ ID NO:8)或(Gly₄-Ser)₂接头(SEQ ID NO:9)接合于Fc多肽的N端。在一些实施方案中，Fc多肽可在N端包含接合于接头或直接接合于SGSH酶的铰链序列或部分铰链序列。

在一些实施方案中，SGSH酶例如通过Gly-Ser接头(SEQ ID NO:7)、Gly₄-Ser接头(SEQ ID NO:8)或(Gly₄-Ser)₂接头(SEQ ID NO:9)接合于Fc多肽的C端。在一些实施方案中，Fc多肽的C端直接接合于SGSH酶。

在一些实施方案中，SGSH酶通过化学交联剂接合于Fc多肽。这类结合物可使用众所周知的化学交联试剂和方案产生。举例来说，存在所属领域的技术人员已知并且可用于使多肽与所关注试剂交联的大量化学交联剂。举例来说，交联剂是异双官能交联剂，其可用于以逐步方式连接分子。异双官能交联剂能够为了偶联蛋白质设计出更特定的偶合方法，从而减少例如同型蛋白质聚合物的不必要副反应的发生。所属领域中已知多种异双官能交联剂，包括N-羟基丁二酰亚胺(NHS)或其水溶性类似物N-羟基磺基丁二酰亚胺(磺基-NHS)、丁二酰亚胺基4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯(MBS)；N-丁二酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、丁二酰亚胺基4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)；4-丁二酰亚胺基氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、N-丁二酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)和丁二酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯]己酸酯(LC-SPDP)。那些具有N-羟基丁二酰亚胺部分的交联剂可作为N-羟基磺基丁二酰亚胺类似物获得，其通常具有更大水溶性。另外，那些在连接链内具有二硫键的交联剂可代之以合成为烷基衍生物，以便降低体内接头裂解的量。除了异双官能交联剂以外，还存在许多其它交联剂，包括同双官能交联剂和光反应性交联剂。二丁二酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双顺丁烯二酰亚胺己烷(BMH)和庚二亚氨酸二甲酯2HCl(DMP)是有用的同双官能交联剂的实例，并且双-[B-(4-叠氮基水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)和N-丁二酰亚胺基-6(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)是有用的光反应性交联剂的实例。

包含SGSH酶-Fc融合多肽的例示性蛋白质分子

在一些方面，本文所述的融合蛋白包含：第一Fc多肽，所述第一Fc多肽连接于第一SGSH酶、SGSH酶变体或其催化活性片段；和第二Fc多肽，所述第二Fc多肽连接于第二SGSH酶、SGSH酶变体或其催化活性片段，其中所述第二Fc多肽包含根据EU编号在位置389处的Ala；并且其中所述第二Fc多肽与所述第一Fc多肽形成Fc二聚体。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽在以下位置处包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽在以下位置处包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe。在某些实施方案中，第二Fc多肽特异性结合于TfR。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。在一些实施方案中，第一Fc多肽是经修饰的Fc多肽。在某些实施方案中，第二Fc多肽(即经修饰的Fc多肽)包含一个或多个额外的修饰。在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的Fc多肽含有一个或多个促进其与另一Fc多肽的异二聚合的修饰。在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的Fc多肽含有一个或多个降低效应功能的修饰。在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的Fc多肽含有一个或多个延长血清半衰期的修饰。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包括包含T366S、L368A和Y407V(臼)取代的第一Fc多肽；和第二多肽链，所述第二多肽链包含结合于TfR并包含T366W(杵)取代的第二Fc多肽。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含L234A和L235A(LALA)取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含L234A、L235A和P329G(LALAPG)取代或包含L234A、L235A和P329S(LALAPS)取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含M252Y、S254T和T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含：1)L234A和L235A(LALA)取代；L234A、L235A和P329G(LALAPG)取代；或L234A、L235A和P329S(LALAPS)取代；和2)M252Y、S254T和T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽在位置234、235、252、254、256和366处包含人IgG1野生型残基。

在一些实施方案中，第二Fc多肽包含杵、LALA/LALAPG/LALAPS和/或YTE突变，与SEQ ID NO:34-41中的任一者具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:34-41中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ IDNO:34-41中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe；或包含SEQ ID NO:34-41中的任一者的序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽包含臼、LALA/LALAPG/LALAPS和/或YTE突变，并且与SEQ ID NO:12-19中的任一者具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性；或包含SEQID NO:12-19中的任一者的序列。在一些实施方案中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO:34-41中的任一者，并且第一Fc多肽包含SEQ ID NO:12-19中的任一者。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:54-57中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:54-57中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:54-57中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe，或包含SEQID NO:54-57中的任一者的序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽与SEQ ID NO:28-31中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，或包含SEQ ID NO:28-31中的任一者的序列。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包括包含T366W(杵)取代的第一Fc多肽；和第二多肽链，所述第二多肽链包含结合于TfR并包含T366S、L368A和Y407V(臼)取代的第二Fc多肽。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含L234A和L235A(LALA)取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含L234A、L235A和P329G(LALAPG)取代或包含L234A、L235A和P329S(LALAPS)取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含M252Y、S254T和T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含：1)L234A和L235A(LALA)取代；L234A、L235A和P329G(LALAPG)取代；或L234A、L235A和P329S(LALAPS)取代；和2)M252Y、S254T和T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽在位置234、235、252、254、256和366处包含人IgG1野生型残基。

在一些实施方案中，第二Fc多肽包含臼、LALA/LALAPG/LALAPS和/或YTE突变，与SEQ ID NO:48-53中的任一者具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:48-53中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ IDNO:48-53中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe；或包含SEQ ID NO:48-53中的任一者的序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽包含杵、LALA/LALAPG/LALAPS和/或YTE突变，并且与SEQ ID NO:24-27中的任一者具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性；或包含SEQID NO:24-27中的任一者的序列。在一些实施方案中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO:48-53中的任一者，并且第一Fc多肽包含SEQ ID NO:24-27中的任一者。在一些实施方案中，经修饰的Fc多肽和/或Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的第一SGSH酶连接于第一多肽链(例如呈融合多肽)，所述第一多肽链包含与SEQ ID NO:12-19中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性或包含SEQ ID NO:12-19中的任一者的序列的第一Fc多肽。在一些实施方案中，第一SGSH酶通过接头，例如柔性接头，和/或铰链区或其一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)连接于第一Fc多肽。在一些实施方案中，第一Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，第一Fc多肽与SEQ ID NO:28-31中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，或包含SEQ ID NO:28-31中的任一者的序列。在一些实施方案中，第一SGSH酶包含与SEQ ID NO:58-60中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的SGSH序列，或包含SEQ ID NO:58-60中的任一者的序列。在一些实施方案中，连接于Fc多肽的第一SGSH序列与SEQ ID NO:61-68、73-76、81-84和117-118中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，或包含SEQ ID NO:61-68、73-76、81-84和117-118中的任一者的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:34-41中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性并包含根据EU编号在位置389处的Ala的第二Fc多肽。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:34-41中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，第二多肽与SEQ ID NO:34-41中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe，或包含SEQ ID NO:34-41中的任一者的序列。在一些实施方案中，第二SGSH酶通过接头，例如柔性接头，和/或铰链区或其一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)连接于第二Fc多肽。在一些实施方案中，第二Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:54-57中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:54-57中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:54-57中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe，或包含SEQ IDNO:54-57中的任一者的序列。在一些实施方案中，第二SGSH酶包含与SEQ ID NO:58-60中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的SGSH序列，或包含SEQ ID NO:58-60中的任一者的序列。在一些实施方案中，连接于第二Fc多肽的第二SGSH序列与SEQ ID NO:89-96、101-104、109-112和119-120中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:89-96、101-104、109-112和119-120中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:89-96、101-104、109-112和119-120中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe，或包含SEQ ID NO:89-96、101-104、109-112和119-120中的任一者的序列。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:61-64中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:89-92中的任一者的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:65-68中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:93-96中的任一者的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:73-76中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:101-104中的任一者的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:81-84中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:109-112中的任一者的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:117-118中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:119-120中的任一者的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:61或62的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:89或90的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:65或66的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:93或94的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:63或64的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:91或92的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:64的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:92的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:67或68的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:95或96的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:68的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:96的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:73或74的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:101或102的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:75或76的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:103或104的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:76的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:104的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:81或82的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:109或110的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:83或84的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:111或112的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:84的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:112的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:117的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:119的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:118的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:120的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中存在的第一SGSH酶连接于第一多肽链(例如呈融合多肽)，所述第一多肽链包含与SEQ ID NO:24-27中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性或包含SEQ ID NO:24-27中的任一者的序列的第一Fc多肽。在一些实施方案中，第一SGSH酶通过接头，例如柔性接头，和/或铰链区或其一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)连接于第一Fc多肽。在一些实施方案中，第一Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，第一SGSH酶包含与SEQ ID NO:58-60中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的SGSH序列，或包含SEQ ID NO:58-60中的任一者的序列。在一些实施方案中，连接于Fc多肽的第一SGSH序列与SEQ ID NO:69-72、77-80和85-88中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，或包含SEQ ID NO:69-72、77-80和85-88中的任一者的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:48-53中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性并包含根据EU编号在位置389处的Ala的第二Fc多肽。在一些实施方案中，第二多肽与SEQ ID NO:48-53中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:48-53中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe，或包含SEQ ID NO:48-53中的任一者的序列。在一些实施方案中，第二SGSH酶通过接头，例如柔性接头，和/或铰链区或其一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)连接于第二Fc多肽。在一些实施方案中，第二Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，第二SGSH酶包含与SEQ ID NO:58-60中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的SGSH序列，或包含SEQ ID NO:58-60中的任一者的序列。在一些实施方案中，连接于第二Fc多肽的第二SGSH序列与SEQ ID NO:97-100、105-108和113-116中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且包含根据EU编号在位置389处的Ala。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:97-100、105-108和113-116中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置389处的Ala；以及在位置390处的Asn。在一些实施方案中，第二Fc多肽与SEQ ID NO:97-100、105-108和113-116中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，并且根据EU编号，在以下位置包含：在位置380处的Glu；在位置384处的Tyr；在位置386处的Thr；在位置387处的Glu；在位置388处的Trp；在位置389处的Ala；在位置390处的Asn；在位置413处的Thr；在位置415处的Glu；在位置416处的Glu；以及在位置421处的Phe，或包含SEQ ID NO:97-100、105-108和113-116中的任一者的序列。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:69或70的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:97或98的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:71或72的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:99或100的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:77或78的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:105或106的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:79或80的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:107或108的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:85或86的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:113-114的序列的第二SGSH-Fc多肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包括包含SEQ ID NO:87或88的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和包含SEQ ID NO:115-116的序列的第二SGSH-Fc多肽。

本文所述的融合蛋白和其它组合物可具有一系列结合亲和力。举例来说，在一些实施方案中，蛋白质对运铁蛋白受体(TfR)具有亲和力，在1pM至10μM范围内的任何数值。在一些实施方案中，对TfR的亲和力在1nM至5μM或10nM至1μM范围内。在一些实施方案中，对TfR的亲和力在约50mM至约500nM或约100nM至约500nM范围内。在一些实施方案中，对TfR的亲和力在约50nM至约300nM范围内。在一些实施方案中，对TfR的亲和力在约100nM至约350nM范围内。在一些实施方案中，对TfR的亲和力在约150nM至约400nM范围内。在一些实施方案中，对TfR的亲和力在约200nM至约450nM范围内。在一些实施方案中，对TfR的亲和力是单价亲和力。

评估蛋白质活性

可使用各种测定法，包括使用人工底物测量体外活性的测定法，例如实施例部分中所述的那些测定法，评定包含SGSH酶的本文所述的融合蛋白的活性。用于测量体外SGSH活性的其它例示性方案提供于例如WO2019/070577中。

在一些实施方案中，评估组织样品。可使用如上所述的测定法评估组织样品，除了在超声处理步骤之前通常包括多次冻融循环，例如2次、3次、4次、5次或更多次，以保证微泡破开。

可通过本文所述的测定法评估的样品包括脑、肝脏、肾、肺、脾、血浆、血清、脑脊髓液(CSF)和尿液。在一些实施方案中，可评估来自接受本文所述的酶-Fc融合蛋白(例如SGSH-Fc融合蛋白)的患者的CSF样品。

核酸、载体和宿主细胞

通常使用重组方法制备如本文所述的融合蛋白中所含的多肽链。因此，在一些方面，本公开提供了分离的核酸，所述分离的核酸包含编码包含如本文所述的Fc多肽的任一多肽链的核酸序列；和宿主细胞，其中引入核酸，用于复制编码多肽的核酸和/或表达所述多肽。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如人类细胞。

在另一方面，提供了多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所述的多肽链中的一者或多者的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码本文所述的多肽序列中的一者。在一些实施方案中，多核苷酸编码本文所述的多肽序列中的两者。多核苷酸可以是单链或双链的。在一些实施方案中，多核苷酸是DNA。在特定实施方案中，多核苷酸是cDNA。在一些实施方案中，多核苷酸是RNA。

一些实施方案还提供了一种核酸序列对，其中每个核酸序列编码本文所述的多肽。举例来说，某些实施方案提供了一种核酸序列对，其中所述对中的第一核酸序列编码连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段的第一Fc多肽；并且所述对中的第二核酸序列编码连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段的第二Fc多肽。

在一些实施方案中，多核苷酸包括在核酸构建体内或多核苷酸对包括在一个或多个核酸构建体内。在一些实施方案中，构建体是可复制载体。在一些实施方案中，载体选自质粒、病毒载体、噬粒、酵母染色体载体和非游离型哺乳动物载体。

在一些实施方案中，在表达构建体中多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控核苷酸序列。在一系列实施方案中，核酸表达构建体适宜用作表面表达文库。在一些实施方案中，文库适宜在酵母中进行表面表达。在一些实施方案中，文库适宜在噬菌体中进行表面表达。在另一系列实施方案中，核酸表达构建体适宜在允许以毫克或克的量分离多肽的系统中表达多肽。在一些实施方案中，系统是哺乳动物细胞表达系统。在一些实施方案中，系统是酵母细胞表达系统。

用于产生重组多肽的表达媒剂包括质粒和其它载体。举例来说，合适载体包括以下类型的质粒：pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pUC衍生的质粒，用于在例如大肠杆菌的原核细胞中表达。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适合于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。可替代地，例如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(pHEBo、pREP衍生和p205)的病毒衍生物可用于在真核细胞中短暂表达多肽。在一些实施方案中，可能需要通过使用杆状病毒表达系统表达重组多肽。这类杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生的载体(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的载体(例如pAcUW1)和pBlueBac衍生的载体。额外的表达系统包括腺病毒、腺相关病毒和其它病毒表达系统。

载体可转化到任何合适的宿主细胞中。在一些实施方案中，例如细菌或酵母细胞的宿主细胞可适合用作表面表达文库。在一些细胞中，载体在宿主细胞中表达以表达相对大量的多肽。这类宿主细胞包括哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和原核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、NS0细胞、Y0细胞、HEK293细胞、COS细胞、Vero细胞或HeLa细胞。

可在允许表达一种或多种多肽的适当条件下培养经编码如本文所述的一个或多个Fc多肽链的表达载体转染的宿主细胞。多肽可分泌并从细胞与含有多肽的培养基的混合物中分离。可替代地，多肽可保持在细胞质中或保持在膜部分中，并且使用期望的方法收获细胞，溶解，并分离多肽。

治疗方法

如本文所述的融合蛋白可在治疗上用于治疗A型圣菲利波综合征。

因此，某些实施方案提供了一种减少患有A型圣菲利波综合征的受试者中毒性代谢产物(例如硫酸乙酰肝素衍生的寡糖)积聚的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的蛋白质。

某些实施方案提供了如本文所述的蛋白质，所述蛋白质用于减少患有A型圣菲利波综合征的受试者中的毒性代谢产物(例如硫酸乙酰肝素衍生的寡糖)积聚。

某些实施方案提供了如本文所述的蛋白质的用途，所述蛋白质用于制备供减少患有A型圣菲利波综合征的受试者中的毒性代谢产物(例如硫酸乙酰肝素衍生的寡糖)积聚的药物。

某些实施方案还提供了一种治疗A型圣菲利波综合征的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的蛋白质。

某些实施方案提供了如本文所述的蛋白质，所述蛋白质用于治疗有需要的受试者的A型圣菲利波综合征。

某些实施方案提供了如本文所述的蛋白质的用途，所述蛋白质用于制备供治疗有需要的受试者的A型圣菲利波综合征用的药物。

在一些实施方案中，与在缺乏与本文所述的融合蛋白连接的情况下SGSH的吸收相比或与连接于参考蛋白(例如，未对第二Fc多肽进行促成TfR结合的修饰的如本文所述的融合蛋白)的SGSH的吸收相比，施用蛋白质(例如连接于SGSH酶)提高(例如增加)脑中SGSH的C_max。

在一些实施方案中，与在缺乏与本文所述的融合蛋白连接的情况下SGSH的吸收相比或与连接于参考蛋白(例如，未对第二Fc多肽进行促成TfR结合的修饰的如本文所述的融合蛋白)的SGSH的吸收相比，脑中SGSH的C_max提高(例如增加)至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.2倍、2.4倍、2.6倍、2.8倍、3倍、4倍、5倍、6倍或更多。

本文所述的融合蛋白以治疗有效量或剂量施用于受试者。

在多个实施方案中，本文所述的融合蛋白还可在肠胃外施用。在一些实施方案中，蛋白质经静脉内施用。

在一些肠胃外实施方案中，如本文所述的融合蛋白经腹膜内、皮下、皮内或肌肉内施用。在一些实施方案中，如本文所述的融合蛋白经皮内或肌肉内施用。在一些实施方案中，如本文所述的融合蛋白经鞘内施用，例如通过硬膜外施用，或经脑室内施用。

在其它实施方案中，如本文所述的融合蛋白可经口施用，通过肺部施用，鼻内施用，眼内施用，或通过局部施用。还可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或雾化器，以及与雾化剂一起配制。

药物组合物和试剂盒

在其它方面，提供包含本文所述的融合蛋白的药物组合物和试剂盒。

药物组合物

关于制备用于本公开中的制剂的指导可见于所属领域的技术人员已知的许多药物制备与配制手册中。

在一些实施方案中，药物组合物包含如本文所述的融合蛋白并且还包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。药学上可接受的载体包括生理学上相容并且不干扰或以其它方式抑制活性剂活性的任何溶剂、分散介质或包衣。

本文所述的药物组合物的剂量和期望的药物浓度可视所设想的具体用途而变化。本文描述了示例性剂量。

试剂盒

在一些实施方案中，提供了一种用于治疗A型圣菲利波综合征的试剂盒，所述试剂盒包含如本文所述的融合蛋白。

在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种额外治疗剂。举例来说，在一些实施方案中，试剂盒包含如本文所述的融合蛋白并且还包含一种或多种用于治疗A型圣菲利波综合征的神经症状的额外治疗剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含含有关于实行本文所述的方法的指导(即方案)的说明材料(例如使用试剂盒施用包含跨过血脑屏障的SGSH酶的融合蛋白的说明书)。虽然说明材料通常包含书面或打印材料，但其不局限于此。本公开涵盖能够存储这类说明书和将其传递到最终使用者的任何媒体。这类媒体包括(但不限于)电子存储媒体(例如磁盘、磁带、盒式磁盘、芯片)、光学媒体(例如CD-ROM)等。这类媒体可包括提供这类说明材料的互联网网站的地址。

某些定义

如本文所用，除非内容另外清楚规定，否则单数形式“一种(a/an)”和“所述”包括多个指示物。因此，举例来说，提及“多肽”可包括两种或更多种这类分子等。

如本文所用，术语“约”和“大约”在用于修饰以数值或范围指定的量时，指示数值以及所属领域的技术人员已知的与所述数值的合理偏差，例如±20％、±10％或±5％，在所列举数值的预期含义内。

如本文中可互换使用的术语“受试者”、“个体”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人、非人类灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠、小鼠和豚鼠)、兔、母牛、马和其它哺乳动物物种。在一个实施方案中，患者是人。在一些实施方案中，人是需要治疗A型圣菲利波综合征的患者。在一些实施方案中，患者具有A型圣菲利波综合征的一种或多种征象或症状。

术语“药学上可接受的赋形剂”是指生物学上或药理学上适合用于人或动物的非活性药物成分，例如(但不限于)缓冲剂、载体或防腐剂。

术语“施用”是指递送药剂(例如A型圣菲利波综合征治疗剂，例如本文所述的ETV:SGSH疗法)、化合物或组合物(例如药物组合物)到期望的生物作用部位的方法。这些方法包括(但不限于)口服、局部递送、肠胃外递送、静脉内递送、皮内递送、肌肉内递送、鞘内递送或腹膜内递送。在一个实施方案中，本文所述的多肽经静脉内施用。

如本文所用，“治疗(treatment)”(和其语法变体，例如“治疗(treat或treating)”)是指改变所治疗的受试者的天然病程的临床介入，并且可以是预防临床病理而进行或在临床病理的过程中进行。所需治疗作用包括(但不限于)预防疾病发生或复发、缓和症状、减少疾病的任何直接或间接病理性结果、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病病况和症状缓解或改善预后。

短语“有效量”意指本文所述的化合物实现以下的量：(i)治疗或预防本文所述的具体疾病、疾患或病症，(ii)减弱、改善或消除具体疾病、疾患或病症的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟具体疾病、疾患或病症的一种或多种症状的发作。

本文公开的物质/分子的“治疗有效量”可根据例如受试者的疾病病况、年龄、性别和体重以及物质/分子在受试者中引起所需反应的能力的因素而变化。治疗有效量涵盖使物质/分子的治疗有益作用胜过任何有毒或不利影响的量。“预防有效量”是指在必需的剂量和时段下有效实现所需预防结果的量。通常但不一定，因为预防剂量在发病前或在疾病早期用于受试者，所以预防有效量将小于治疗有效量。

如本文所用，“磺基葡糖胺磺基水解酶”、“N-磺基葡糖胺磺基水解酶”或“SGSH”是指N-磺基葡糖胺磺基水解酶(EC 3.10.1.1)，它是与硫酸乙酰肝素的溶酶体降解相关的酶。该基因的突变引起A型圣菲利波综合征，它是一种类型溶酶体贮积症，III型粘多糖贮积症，是由硫酸乙酰肝素的降解削弱引起。如本文所用，术语“SGSH”作为包含Fc多肽的蛋白质的组分，具有催化活性，并且涵盖野生型SGSH或其片段的功能变体，包括等位基因和剪接变体。人SGSH的序列在UniProt登录号P51688下可获得，并且由17q25.3的人SGSH基因编码。全长序列提供为SEQ ID NO:58。如本文所用，“成熟”SGSH序列是指缺乏天然存在的全长多肽链的信号序列的一种形式多肽链。成熟人SGSH多肽的氨基酸序列提供为SEQ ID NO:59，其与全长人类序列的氨基酸21-502对应。如本文所用，“截短”SGSH序列是指天然存在的全长多肽链的催化活性片段。已经充分表征人SGSH的结构。一种例示性结构在PDB入藏码4MHX下可获得。还描述了非人类灵长类动物SGSH序列，包括黑猩猩(UniProt登录号K7C218)。小鼠SGSH序列在Uniprot登录号Q9EQ08下可获得。例如当在相同条件下测定时，SGSH变体具有相应野生型SGSH或其片段的活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。例如当在相同条件下测定时，催化活性SGSH片段具有相应全长SGSH或其变体的活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

如本文所用，“运铁蛋白受体”或“TfR”是指运铁蛋白受体蛋白1。人运铁蛋白受体1多肽序列阐述于SEQ ID NO:10中。还已知来自其它物种的运铁蛋白受体蛋白1序列(例如黑猩猩，入藏号XP_003310238.1；恒河猴，NP_001244232.1；犬，NP_001003111.1；牛，NP_001193506.1；小鼠，NP_035768.1；大鼠，NP_073203.1；和鸡，NP_990587.1)。术语“运铁蛋白受体”还涵盖由运铁蛋白受体蛋白1染色体基因座的基因编码的示例性参考序列，例如人类序列的等位基因变体。全长运铁蛋白受体蛋白包括短的N端细胞内区、跨膜区和大的胞外结构域。胞外结构域的特征在于三个结构域：蛋白酶样结构域、螺旋状结构域和顶端结构域。人运铁蛋白受体1的顶端结构域序列阐述于SEQ ID NO:11中。

如本文所用，“融合蛋白”或“[SGSH酶]-Fc融合蛋白”是指一种二聚蛋白质，所述蛋白质包含第一Fc多肽，所述第一Fc多肽与SGSH酶、SGSH酶变体或其催化活性片段连接(例如融合)(即“[SGSH]-Fc融合多肽”)；和第二Fc多肽，所述第二Fc多肽与第一Fc多肽形成Fc二聚体。第二Fc多肽还可与SGSH酶、SGSH酶变体或其催化活性片段连接(例如融合)。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可通过肽键或通过多肽接头连接于SGSH酶、SGSH酶变体或其催化活性片段。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可以是经修饰的Fc多肽，所述Fc多肽含有一个或多个促进其与另一Fc多肽的异二聚合的修饰。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可以是经修饰的Fc多肽，所述Fc多肽含有一个或多个赋予与运铁蛋白受体的结合能力的修饰。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可以是经修饰的Fc多肽，所述Fc多肽含有一个或多个降低效应功能的修饰。在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽不具有效应功能。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可以是经修饰的Fc多肽，所述Fc多肽含有一个或多个延长血清半衰期的修饰。在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。

如本文所用，“融合多肽”或“[SGSH酶]-Fc融合多肽”是指与SGSH酶、SGSH酶变体或其催化活性片段连接(例如融合)的Fc多肽。Fc多肽可通过肽键或通过多肽接头连接于SGSH酶、SGSH酶变体或其催化活性片段。Fc多肽可以是经修饰的Fc多肽，所述Fc多肽含有一个或多个促进其与另一Fc多肽的异二聚合的修饰。Fc多肽可以是经修饰的Fc多肽，所述Fc多肽含有一个或多个赋予与运铁蛋白受体的结合能力的修饰。Fc多肽可以是经修饰的Fc多肽，所述Fc多肽含有一个或多个降低效应功能的修饰。Fc多肽可以是经修饰的Fc多肽，所述Fc多肽含有一个或多个延长血清半衰期的修饰。

如本文所用，术语“Fc多肽”是指天然存在的免疫球蛋白重链多肽的C端区，其特征在于Ig折叠作为结构域。Fc多肽含有至少包括CH2结构域和/或CH3结构域的恒定区序列并且可含有铰链区的至少一部分。一般来说，Fc多肽不含可变区。

“经修饰的Fc多肽”是指与野生型免疫球蛋白重链Fc多肽序列相比，具有至少一个突变，例如取代、缺失或插入，但保持天然Fc多肽的总体Ig折叠或结构的Fc多肽。

术语“FcRn”是指新生儿Fc受体。Fc多肽与FcRn的结合降低Fc多肽的清除率并增加其血清半衰期。人FcRn蛋白是一种异二聚体，它由类似于主要组织相容性(MHC)I类蛋白的尺寸约50kDa的蛋白质和尺寸约15kDa的β2-微球蛋白构成。

如本文所用，“FcRn结合位点”是指结合于FcRn的Fc多肽的区域。在人IgG中，如使用EU索引编号的FcRn结合位点包括T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、T307、E380、M428、H433、N434、H435和Y436。这些位置对应于SEQ ID NO:1的位置20至26、77、150、198和203至206。

如本文所用，“天然FcRn结合位点”是指结合于FcRn并具有与结合于FcRn的天然存在的Fc多肽的区域相同的氨基酸序列的Fc多肽的区域。

如本文所用，术语“CH3结构域”和“CH2结构域”是指免疫球蛋白恒定区结构域多肽。出于本申请的目的，CH3结构域多肽是指如根据EU编号从约位置341至约位置447的氨基酸区段，并且CH2结构域多肽是指如根据EU编号方案编号从约位置231至约位置340的氨基酸区段并且不包括铰链区序列。CH2和CH3结构域多肽还可通过IMGT(ImMunoGeneTics)编号方案编号，其中根据IMGT Scientific chart编号(IMGT网址)，CH2结构域编号是1-110且CH3结构域编号是1-107。CH2和CH3结构域是免疫球蛋白的Fc区的一部分。Fc区是指如根据EU编号方案编号从约位置231至约位置447的氨基酸区段，但如本文所用，可包括抗体铰链区的至少一部分。例示性铰链区序列是人IgG1铰链序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5)。

“天然存在”、“天然”或“野生型”用于描述可发现性质与人工产生的物体不同的物体。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从天然来源分离并且未经实验室有意修饰的核苷酸序列是天然存在的。此外，“野生型”是指在自然界中发现并且无任何已知的突变的正常基因或生物体。例如，关于CH3或CH2结构域的术语“野生型”、“天然”和“天然存在”在本文中用以指具有在自然界中存在的序列的结构域。

如本文所用，关于突变多肽或突变多核苷酸的术语“突变体”与“变体”可互换使用。关于给定的野生型CH3或CH2结构域参考序列的变体可包括天然存在的等位基因变体。“非天然”存在的CH3或CH2结构域是指在自然界中不存在于细胞中并且通过例如使用基因工程技术或诱变技术对天然CH3结构域或CH2结构域多核苷酸或多肽进行遗传修饰所产生的变异或突变结构域。“变异”包括相对于野生型包含至少一个氨基酸突变的任何结构域。突变可包括取代、插入和缺失。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及随后进行修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构，即α碳结合于氢、羧基、氨基和R基团的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保持与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的通用化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。

天然存在的α-氨基酸包括不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺酸(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和它们的组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺酸(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)和它们的组合。

在本文中氨基酸可通过其通常已知的三字母符号提及，或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号提及。

在本文中术语“多肽”和“肽”可互换使用，是指呈单链的氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可包含完全L-氨基酸、完全D-氨基酸或L-氨基酸与D-氨基酸的混合物。

如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽，或单链多肽的二聚体(即，两种)或多聚体(即三种或更多种)。蛋白质的单链多肽可通过共价键，例如二硫键，或非共价相互作用接合。

术语“保守取代”、“保守突变”或“经保守修饰的变体”是指引起氨基酸经可分类为具有类似特征的另一氨基酸取代的改变。以此方式定义的保守氨基酸组的类别的实例可包括：“带电/极性组”，包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺酸或N)、Gln(谷氨酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)和His(组氨酸或H)；“芳族组”，包括Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)、Trp(色氨酸或W)和(组氨酸或H)；和“脂族组”，包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(甲硫氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)和Cys(半胱氨酸或C)。在各组内，还可鉴定子组。例如，带电或极性氨基酸组可再分成子组，包括：“带正电荷的子组”，包含Lys、Arg和His；“带负电荷的子组”，包含Glu和Asp；和“极性子组”，包含Asn和Gln。在另一个实例中，芳族或环状组可再分成子组，包括：“氮环子组”，包含Pro、His和Trp；和“苯基子组”，包含Phe和Tyr。在另一进一步实例中，脂族组可再分成子组，例如“脂族非极性子组”，包含Val、Leu、Gly和Ala；和“脂族微极性子组”，包含Met、Ser、Thr和Cys。保守突变的类别的实例包括以上子组内的氨基酸的氨基酸取代，例如但不限于：Lys取代Arg或反之亦然，以便可维持正电荷；Glu取代Asp或反之亦然，以便可维持负电荷；Ser取代Thr或反之亦然，以便可维持游离-OH；和Gln取代Asn或反之亦然，以便可维持游离-NH₂。在一些实施方案中，疏水性氨基酸取代例如活性位点中的天然存在的疏水性氨基酸，以维持疏水性。

在两种或更多种多肽序列的情况下，术语“相同”或“同一性”百分比是指当在比较窗或指定区域上为求最大对应进行比较和比对时，如使用序列比较算法或通过手动比对和目测检查所测量，相同或在指定区域上具有指定百分比，例如至少60％同一性、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更大百分比的氨基酸残基相同的两种或更多种序列或子序列。在一些实施方案中，相对于参考序列具有指定同一性百分比的序列与参考序列的不同之处在于一个或多个保守取代。

为了进行多肽序列比较，通常一个氨基酸序列用作候选序列进行比较的参考序列。可使用所属领域的技术人员可利用的各种方法进行，例如目视比对或使用公众可获得的软件使用已知的算法实现最大比对。这类程序包括BLAST程序、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。用于进行比对以实现最大比对的参数可由所属领域的技术人员测定。为出于本申请的目的对多肽序列进行序列比较，使用用于利用默认参数比对两种蛋白质序列的BLASTP算法标准蛋白质BLAST。

当在鉴定多肽序列中所给定的氨基酸残基的情况下使用时术语“对应于……”、“参考……确定”或“参考……编号”是指当所给定的氨基酸序列最大限度地与参考序列进行比对和比较时指定参考序列的残基的位置。因此，举例来说，当残基与SEQ ID NO:1中的氨基酸比对时，当最佳地与SEQ ID NO:1进行比对时，经修饰的Fc多肽中的氨基酸残基“对应于”SEQ ID NO:1中的氨基酸。与参考序列进行比对的多肽不需要长度与参考序列相同。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换地指具有任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶并入链中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和它们的类似物。本文中涵盖的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA和具有单链和双链DNA与RNA的混合物的杂合分子。

如本文所用，“结合亲和力”是指两种分子，例如多肽上的单个结合位点与其结合的靶标(例如运铁蛋白受体)之间的非共价相互作用的强度。因此，举例来说，除非另外指示或上下文清楚可见，否则所述术语可指多肽与其靶标之间的1:1相互作用。结合亲和力可通过测量平衡解离常数(K_D)来定量，平衡解离常数是指解离速率常数(k_d，时间^-1)除以缔合速率常数(k_a，时间^-1M^-1)。K_D可通过例如使用以下测量复合物形成和解离的动力学来确定：表面等离子体共振(SPR)法，例如Biacore^TM系统；动力学排除测定法，例如和BioLayer干涉测量法(例如使用平台)。如本文所用，“结合亲和力”不仅包括形式结合亲和力，例如反映多肽与其靶标之间的1:1相互作用的结合亲和力，并且还包括计算K_D的可反映亲合结合的表观亲和力。

如本文所用，当提及如本文所述的工程化的结合TfR的多肽、结合TfR的肽或结合TfR的抗体时术语“特异性结合”或“选择性结合”于靶标如TfR是指工程化的结合TfR的多肽、结合TfR的肽或结合TfR的抗体以比其结合于结构上不同的靶标更大的亲和力、更大的亲合力和/或更长的持续时间结合于靶标的结合反应。在典型的实施方案中，当在相同亲和力测定条件下测定时，工程化的结合TfR的多肽、结合TfR的肽或结合TfR的抗体对例如TfR的特定靶标的亲和力与无关靶标相比大至少5倍、10倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更大。如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性结合于”具体靶标(例如TfR)或对具体靶标(例如TfR)“具有特异性”可展现在例如分子对其结合的靶标的平衡解离常数K_D为例如10^-4M或更小，例如10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M。在一些实施方案中，工程化的结合TfR的多肽、结合TfR的肽或结合TfR的抗体特异性结合于TfR上在物种当中保守(例如在物种当中在结构上保守)，例如在非人类灵长类动物与人类物种之间保守(在非人类灵长类动物与人类物种之间在结构上保守)的表位。在一些实施方案中，工程化的结合TfR的多肽、结合TfR的肽或结合TfR的抗体只能结合于人TfR。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中源自于种系可变(V)基因、多样性(D)基因或接合(J)基因(并且不源自于恒定(Cμ和Cδ)基因区段)并且赋予抗体结合于抗原的特异性的结构域。通常，抗体可变区包含四个保守“框架”区，中间散布有三个高变“互补决定区”。

术语“抗原结合部分”和“抗原结合片段”在本文中可互换使用并且是指保留经由可变区特异性结合于抗原的能力的抗体的一个或多个片段。抗原结合片段的实例包括(但不限于)Fab片段(单价片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成)、F(ab’)₂片段(二价片段，包含两个由铰链区的二硫键连接的Fab片段)、单链Fv(scFv)、二硫化物连接的Fv(dsFv)、互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)和VH(重链可变区)。

以下实施例意图为非限制性的。

实施例1：包含N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)的融合蛋白的构建

设计和克隆

设计含有以下的SGSH-Fc融合蛋白：(i)第一融合多肽，其中成熟人SGSH酶与包括Fc区的人IgG1片段融合(“SGSH-Fc融合多肽”)；和(ii)第二融合多肽，其中成熟人SGSH酶与在Fc区中含有赋予运铁蛋白受体(TfR)结合能力的突变的经修饰的人IgG1片段融合(“经修饰的Fc多肽”)。具体地说，产生SGSH-Fc融合多肽，其中SGSH片段与人IgG1 Fc区的N端融合。在一些情况下，接头置于SGSH与IgG1片段之间以减轻两个片段之间的任何位阻。在所有构建体中，信号肽MGWSCIILFLVATATGAYA(SEQ ID NO:121)插入融合物上游以促进分泌，并且对SGSH进行截短以由氨基酸R21-L502组成(UniProtKB ID-P51688)。所用的人IgG1 Fc区的片段对应于UniProtKB ID P01857中的序列的氨基酸D104-K330(EU编号的位置221-447，其包括铰链的10个氨基酸(位置221-230))。将含有与经修饰的Fc多肽融合的SGSH的第二融合多肽与SGSH-Fc融合多肽共转染以产生具有两个SGSH酶(“双酶”)的异二聚体融合蛋白。在一些构建体中，IgG1片段含有促进两个Fc区的异二聚合的额外突变。因此，实施例中所用的包含TfR结合的SGSH-Fc融合蛋白是由以下形成的二聚体：i)SGSH-Fc融合多肽；和ii)包含与第二SGSH分子融合的经修饰的Fc多肽的结合TfR的SGSH-Fc融合多肽(“双酶”)。

类似地设计并构建缺乏赋予TfR结合能力的突变的对照SGSH-Fc融合蛋白。产生一种示例性对照SGSH-Fc融合蛋白，其包含具有SEQ ID NO:61和63中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽和具有SEQ ID NO:69和71中的任一者的序列的第二SGSH-Fc融合多肽。在细胞培养物产生期间还可进一步加工SGSH-Fc融合蛋白，使得第一SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:62或64的序列和/或第二SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:70或72的序列。因此，如本文所用，术语SGSH-Fc融合蛋白可用于指具有未加工的序列(即SEQ ID NO:61、63、69和71)的蛋白质分子；包含一个或多个被加工的序列(即选自SEQ ID NO:62、64、70和72)的蛋白质分子；或包含被加工和未加工的蛋白质分子的混合物。

包含与具有臼和LALA突变的IgG1 Fc多肽序列的N端融合的成熟人SGSH序列的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:61-64中的任一者的序列。SGSH酶通过GGGGS接头(SEQ IDNO:8)接合于Fc多肽，并且Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

包含与具有臼和LALA突变的IgG1 Fc多肽序列的N端融合的成熟人SGSH序列的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:73-76中的任一者的序列。SGSH酶通过GS接头(SEQ IDNO:7)接合于Fc多肽，并且Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

包含与具有臼和LALA突变的IgG1 Fc多肽序列的N端融合的成熟人SGSH序列的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:81-84中的任一者的序列。SGSH酶通过(GGGGSGGGGS)接头(SEQ ID NO:9)接合于Fc多肽，并且Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

包含与具有臼和LALAPS突变的IgG1 Fc多肽序列的N端融合的成熟人SGSH序列的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:65-68中的任一者的序列。SGSH酶通过GGGGS接头(SEQ IDNO:8)接合于Fc多肽，并且Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

包含与具有臼和LALA突变的IgG1 Fc多肽序列的C端融合的成熟人SGSH序列的Fc-SGSH融合多肽具有SEQ ID NO:117-118中的任一者的序列。SGSH酶通过GGGGS接头(SEQ IDNO:8)接合于Fc多肽，并且Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

包含与具有杵和LALA突变的结合TfR的经修饰的Fc多肽的序列的N端融合的成熟人SGSH序列的结合TfR的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:89-92中的任一者的序列。SGSH酶通过GGGGS接头(SEQ ID NO:8)接合于经修饰的Fc多肽，并且经修饰的Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

包含与具有杵和LALA突变的结合TfR的经修饰的Fc多肽的序列的N端融合的成熟人SGSH序列的结合TfR的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:101-104中的任一者的序列。SGSH酶通过GS接头(SEQ ID NO:7)接合于经修饰的Fc多肽，并且经修饰的Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

包含与具有杵和LALA突变的结合TfR的经修饰的Fc多肽的序列的N端融合的成熟人SGSH序列的结合TfR的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:109-112中的任一者的序列。SGSH酶通过GGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO:9)接合于经修饰的Fc多肽，并且经修饰的Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

包含与具有杵和LALAPS突变的结合TfR的经修饰的Fc多肽的序列的N端融合的成熟人SGSH序列的结合TfR的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:93-96中的任一者的序列。SGSH酶通过GGGGS接头(SEQ ID NO:8)接合于经修饰的Fc多肽，并且经修饰的Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

包含与具有杵和LALA突变的结合TfR的经修饰的Fc多肽的序列的C端融合的成熟人SGSH序列的结合TfR的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:119-120中的任一者的序列。SGSH酶通过GGGGS接头(SEQ ID NO:8)接合于经修饰的Fc多肽，并且经修饰的Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:6)。

产生第一“N端双酶”SGSH-Fc融合多肽(“ETV:SGSH双酶结构1”)，其包含具有SEQID NO:61和63中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和具有SEQ ID NO:89和91中的任一者的序列的结合TfR的第二SGSH-Fc融合多肽。在细胞培养物产生期间还可进一步加工SGSH-Fc融合蛋白，使得第一SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:62或64的序列和/或结合TfR的第二SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:90或92的序列。因此，如本文所用，术语ETV:SGSH双酶结构1可用于指具有未加工的序列(即SEQ ID NO:61、63、89和91)的蛋白质分子；包含一个或多个被加工的序列(即选自SEQ ID NO:62、64、90和92)的蛋白质分子；或包含被加工和未加工的蛋白质分子的混合物。

产生第二“N端双酶”SGSH-Fc融合多肽(“ETV:SGSH双酶结构2”)，其包含具有SEQID NO:73和75中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和具有SEQ ID NO:101和103中的任一者的序列的结合TfR的第二SGSH-Fc融合多肽。在细胞培养物产生期间还可进一步加工SGSH-Fc融合蛋白，使得第一SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:74或76的序列和/或结合TfR的第二SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:102或104的序列。因此，如本文所用，术语ETV:SGSH双酶结构2可用于指具有未加工的序列(即SEQ ID NO:73、75、101和103)的蛋白质分子；包含一个或多个被加工的序列(即选自SEQ ID NO:74、76、102和104)的蛋白质分子；或包含被加工和未加工的蛋白质分子的混合物。

产生第三“N端双酶”SGSH-Fc融合多肽(“ETV:SGSH双酶结构3”)，其包含具有SEQID NO:81和83中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和具有SEQ ID NO:109和111中的任一者的序列的结合TfR的第二SGSH-Fc融合多肽。在细胞培养物产生期间还可进一步加工SGSH-Fc融合蛋白，使得第一SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:82或84的序列和/或结合TfR的第二SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:110或112的序列。因此，如本文所用，术语ETV:SGSH双酶结构3可用于指具有未加工的序列(即SEQ ID NO:81、83、109和111)的蛋白质分子；包含一个或多个被加工的序列(即选自SEQ ID NO:82、84、110和112)的蛋白质分子；或包含被加工和未加工的蛋白质分子的混合物。

产生第四“N端双酶”SGSH-Fc融合多肽(“ETV:SGSH双酶结构4”)，其包含具有SEQID NO:65和67中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和具有SEQ ID NO:93和95中的任一者的序列的结合TfR的第二SGSH-Fc融合多肽。在细胞培养物产生期间还可进一步加工SGSH-Fc融合蛋白，使得第一SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:66或68的序列和/或结合TfR的第二SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:94或96的序列。因此，如本文所用，术语ETV:SGSH双酶结构4可用于指具有未加工的序列(即SEQ ID NO:65、67、93和95)的蛋白质分子；包含一个或多个被加工的序列(即选自SEQ ID NO:66、68、94和96)的蛋白质分子；或包含被加工和未加工的蛋白质分子的混合物。

产生“C端双酶”SGSH-Fc融合多肽(“ETV:SGSH双酶结构5”)，其包含具有SEQ IDNO:117和118中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和具有SEQ ID NO:119和120中的任一者的序列的结合TfR的第二经修饰的SGSH-Fc多肽。因此，如本文所用，术语ETV:SGSH双酶结构5可用于指包含SEQ ID NO:117和119的蛋白质分子；包含SEQ ID NO:118和120的蛋白质分子；或包含SEQ ID NO:117和/或118与SEQ ID NO:119和/或120组合的混合物。

包含ETV:SGSH(例如上述结构)的组合物可用于指包含以下的组合物：具有未加工的序列的蛋白质分子；包含一个或多个被加工的序列的蛋白质分子；或包含未加工与被加工的蛋白质分子的混合物。

重组蛋白的表达和纯化

为了表达与Fc区融合的重组SGSH酶，使用Expifectamine^TMCHO转染试剂盒，根据制造商说明书(Thermo Fisher Scientific)，将ExpiCHO细胞(Thermo Fisher Scientific)用相关的DNA构建体转染。在回旋振荡器(Infors HT Multitron)中，细胞在补充有如制造商的方案所描述的馈料的ExpiCHO^TM表达培养基中在37℃、5％ CO₂和125rpm下生长。简单地说，将对数生长的ExpiCHO^TM细胞以6×10⁶个细胞/毫升的密度用每毫升培养物体积0.8μg总DNA质粒进行转染。将表达SGSH融合物的培养物与表达辅因子SUMF1的质粒以5:1的质粒比率(SGSH:SUMF1)共转染。所编码的SUMF1序列描述于Genbank NM_182760中。在转染之后，使细胞恢复到37℃并在转染后18-22小时，转染的培养物补充所指示的馈料。在转染后120小时，通过在3,500rpm下离心20分钟，收获所转染的细胞培养物上清液。过滤(0.22μM膜)澄清上清液并存储在4℃下。

使用蛋白A亲和色谱法从细胞培养物上清液纯化具有(或不具有)赋予TfR结合能力的工程化的Fc区的SGSH-Fc融合蛋白。将上清液负载到HiTrap MabSelect SuRe蛋白A亲和柱(GE Healthcare Life Sciences，使用Akta Pure系统)上。然后用10柱体积(CV)PBS洗涤柱。使用含有150mM NaCl的50mM柠檬酸盐/NaOH缓冲液pH 3.6洗提结合的蛋白。在洗提之后立即使用1M Tris pH8(以1:7稀释)中和洗提份。通过多种技术，包括还原和非还原SDS-PAGE和HPLC-SEC评定洗提份中SGSH-Fc融合物的均质性。

实施例2：SGSH融合蛋白的表征

融合蛋白的甲酰甘氨酸和M6P含量

为了表征影响SGSH的酶活性和融合蛋白的运输的SGSH-Fc融合蛋白的某些特性，评估SGSH-Fc融合蛋白的甲酰甘氨酸(fGly)含量和甘露糖-6-磷酸(M6P)含量。如实施例1中所述的ETV:SGSH N端双酶(双酶结构1)和对照SGSH-Fc融合蛋白(缺乏TfR结合)用于所述分析。

fGly含量的测量.通过LC-MS/MS同时评定含Cys和FGly的肽的身分和量。简单地说，用Tris(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl)还原约20μg SGSH融合蛋白并用碘乙酰胺烷基化，然后用胰蛋白酶以蛋白水解方式消化(70℃下2小时)。通过LC-MS/MS分析甲酸淬灭反应。通过UHPLC Vanquish(Thermo Scientific,CA,USA)上液相色谱法联合UV/Vis和QExactive Orbitrap电喷雾电离质谱仪(Thermo Scientific,CA,USA)，进行肽定量分析。对于分析，将样品注射在CSH C18柱(Waters公司,Milford,Massachusetts,USA)上于40℃下，其中具有0.1％甲酸的水为流动相。然后样品分别经受含有1％ B至70％ B的具有0.1％甲酸的水(A)和具有0.1％甲酸的乙腈(B)的线性45分钟梯度。质谱仪在全扫描下以正离子模式操作。Thermo Scientific Freestyle软件用于整合峰面积或所谓的曲线下面积(AUC)。整合如下在位置70(CXPXR基序(SEQ ID NO:126))处含有SGSH半胱氨酸的三种主要胰蛋白酶肽：(1)游离Cys，NAFTSVSSCSPSR(SEQ ID NO:127)(2+，m/z 671.806)；(2)烷基化脲基甲基Cys：NAFTSVSSC(CAM)SPSR(SEQ ID NO:128)(2+，m/z 700.317)和(3)FGly肽：NAFTSVSS(Fgly)SPSR(SEQ ID NO:129)(2+，m/z 663.810)。计算的FGly％基于三种FGly肽的AUC除以FGly与游离和烷基化Cys肽的AUC和并乘以100。发现SGSH-Fc和ETV:SGSH的fGly含量彼此类似(图2)。

甘露糖-6-磷酸(M6P)含量的测量.通过液相色谱-质谱分析测量SGSH-Fc融合蛋白中的M6P含量。重组纯化蛋白(20μg)经缓冲液交换成50mM乙酸铵pH 7.0。取五(5)μg蛋白质并外加稳定的同位素标记(SIL)的¹³C₆甘露糖-6-磷酸(M6P-IS，Omicronbio公司，目录号MAN-05，每个样品125ng)作为内标。向蛋白质样品添加120μL 6.6M三氟乙酸溶液并在震荡的同时在95℃下使用加热块水解105分钟。然后用乙腈(ACN)洗涤通过氮气流干燥的样品并再次干燥。通过LC-MS/MS分析再悬浮于50μL ACN:水(20:80，v:v)中的最终团粒。通过UHPLCVanquish(Thermo Scientific,CA,USA)上液相色谱法联合UV/Vis和Q Exactive Orbitrap电喷雾电离质谱仪(Thermo Scientific,CA,USA)，进行M6P分析。将样品注射在1.9μm 2.1×150mm的BEH Amide柱(Waters)上，在60℃下在负离子电离模式下于具有0.1％甲酸的水的流动相中，并且用具有0.1％甲酸的乙腈的梯度洗提。使用平行反应监测(PRM)采集，在负离子模式下收集数据，包括M6P和M6P内标(IS)，包括时间1.6至2.2分钟，前驱物是259.0224(M6P)和265.0426(M6P-IS)。M6P/M6P-IS的AUC比率用于计算从蛋白质释放的M6P的分子量并获得每摩尔蛋白质的M6P摩尔数。表1中提供了SGSH-Fc和ETV:SGSH的M6P含量。

表1.融合蛋白的甘露糖-6-磷酸含量

分子	M6P(Mol/Mol)
		ETV:SGSH	1.4
SGSH-Fc	1.2

具有工程化的TfR结合位点的SGSH-Fc融合蛋白结合于人TfR

为了确定具有工程化的TfR结合的SGSH-Fc融合蛋白是否影响经修饰的Fc结构域与人TfR相互作用的能力，使用Biacore^TM表面等离子体共振分析评定ETV:SGSH双酶结构1(实施例1)对人TfR的亲和力。用抗人Fab(来自GE Healthcare的人Fab捕获试剂盒)固定Biacore^TM系列S CM5传感器芯片。在每个流动池上捕获5μg/mL SGSH-Fc融合蛋白1分钟并将连续稀释3倍的人顶端结构域TfR以30μL/min的流速注射。利用3分钟缔合和3分钟解离来分析每个样品。在每次注射之后，使用10mM甘氨酸-HCl(pH 2.1)使芯片再生。通过减去来自捕获类似密度的不相关IgG的流动池的RU来校正结合反应。通过使用Biacore^TMT200评估软件3.1版针对浓度拟合平衡下的反应来获得稳态亲和力。Biacore^TM分析确定，具有工程化到Fc区中的TfR结合位点的SGSH-Fc融合蛋白结合于人TfR。具体地说，测得ETV:SGSH双酶结构1对人TfR的结合亲和力为约230nM。

具有工程化的TfR结合位点的SGSH-Fc融合蛋白在体外和细胞中具有活性

评定工程化的结合TfR的SGSH-Fc融合蛋白的体外和细胞活性以证明SGSH在与人IgG片段融合时维持其酶活性。使用两步荧光酶测定，使用人工底物测量重组SGSH的体外活性。具体来说，将在测定缓冲液(0.03M乙酸钠、0.12M NaCl，pH 6.5)中稀释的20μL 1mM4-甲基伞形酮基2-脱氧-2-磺胺基-a-D-吡喃葡萄糖苷钠盐底物(Carbosynth Limited，#EM06602)与10-20μL 140nM SGSH混合。将第一反应在37℃下孵育17小时，然后用10μL 0.2M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH 6.7终止。然后，通过添加10μL(0.5U)酵母α-葡糖苷酶(Sigma，#G0660-750UN)起始第二反应，在37℃下孵育24小时，并且通过添加100μL 0.5M碳酸钠缓冲液pH 10.3而停止。然后测量反应溶液的荧光(在365nm下激发和在450nm下发射)。通过线性回归拟合4-甲基伞形酮标准曲线以计算产物的量并证实总底物少于10％裂解。通过产物的量除以反应时间和SGSH摩尔量计算比活性(fmol产物/min/pmol SGSH)。

体外酶活性测定证明，SGSH-Fc融合蛋白具有活性并且在Fc-SGSH(对照；实施例1)与ETV:SGSH(双酶结构1；实施例1)之间相似(图3)。

还在来自MPS IIIA患者和健康对照的纤维母细胞中，使用³⁵S脉冲追踪测定，检验SGSH-Fc融合蛋白的细胞活性，在所述测定中³⁵S整合到新合成的GAG中，如前所述(Boado等人,Mol.Pharm.11(8):2928-2934[2014])。MPS IIIA患者的纤维母细胞缺乏SGSH活性，引起³⁵S信号的积聚增加。包括ETV:SGSH(双酶结构1)的SGSH-Fc融合蛋白在MPS IIIA患者来源的细胞中高度有效，其显示减少S³⁵标记物质的积聚的低皮摩尔细胞EC₅₀(图4)。

工程化的TfR结合位点的SGSH-Fc融合蛋白在MPSIII小鼠模型中展示改善的脑递送

为了确定结合TfR的SGSH-Fc融合蛋白与对照SGSH-Fc融合蛋白相比是否显示改善的脑递送，向敲入人TfR(TfR^mu/hu KI)的小鼠给与40mg/kg结合TfR的SGSH-Fc融合蛋白ETV:SGSH(双酶结构1)或缺乏赋予TfR结合的突变的对照SGSH-Fc融合蛋白(“SGSH:Fc”)(参见实施例1)，并且在给药后2小时和8小时，使用基于夹心式ELISA的测定测量肝脏和脑中的SGSH-Fc融合蛋白的浓度。用于分析中的SGSH-Fc融合蛋白在上文描述并根据实施例1制备(本文中称为ETV:SGSH(双酶结构1)和对照SGSH-Fc)。对Fc片段具有特异性的多克隆驴抗人IgG捕获抗体(Jackson ImmunoResearch，#709-006-098)包被到384孔MaxiSorp^TM板(ThermoScientific#464718)上过夜。将平板用5％ BSA封闭，然后与稀释的血清、脑和肝脏溶解产物一起孵育。然后，添加对Fc片段具有特异性的结合HRP的多克隆山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch，#109-036-098)，用于检测。使用TMB底物使平板显影，用硫酸停止，并在BioTek板式读数器上测量450nm吸光度。标准曲线为进行3倍连续稀释的2000-2.74pM的个别构建体，并使用五参数逻辑曲线拟合而成。如国际专利公布第WO 2018/152285号中所述，使用CRISPR/Cas9技术表达鼠Tfrc基因内的人Tfrc顶端结构域，产生TfR^mu/hu KI小鼠；在内源启动子控制下表达所得到的嵌合TfR。结果在图5-7中示出。

施用结合TfR的SGSH-Fc融合蛋白引起在给药后2小时脑吸收相对于对照SGSH-Fc融合蛋白增加大约6倍，并且在给药后8小时脑浓度增加大约4倍(图7)。在给药后2小时，对于ETV:SGSH与SGSH:Fc来说，肝脏中融合蛋白的积聚是同等的，但在给药后8小时显著降低(大约30倍)，其中ETV:SGSH展现与SGSH:Fc相比较低的水平(图6)。如上所述使用基于夹心式ELISA的测定，在给药后0.5小时、1小时、2小时、4小时和8小时测量血清中的融合蛋白的浓度。在给药后2小时ETV:SGSH与SGSH:Fc的血清PK是同等的，但在给药后2小时与8小时之间ETV:SGSH展现与SGSH:Fc相比较低的水平(图5)。虽然与对照SGSH:Fc融合蛋白相比，结合TfR的SGSH-Fc融合蛋白的脑水平保持升高8小时，但更快的周围清除可解释在给药后2小时至8小时脑和肝脏浓度的下降。总体来说，这些数据证明，结合TfR的SGSH-Fc融合蛋白与TfR的相互作用一般维持周围分布，同时显著改善脑暴露。

ETV:SGSH的静脉内施用减少脑中的GAG

为了检验在上文所述并且根据实施例1制备的结合TfR的SGSH-Fc融合蛋白(本文中称为ETV:SGSH)下观察到的提高的脑暴露是否引起脑中积聚的底物相应减少，产生含有具有敲入鼠类TfR的人TfR顶端结构域的磺酰胺酶突变的小鼠模型(本文中称为Sgsh^mps3a×TfR^mu/hu KI小鼠或可替代地称为SGSH^D31N；TfR^mu/hu KI小鼠)。从The Jackson Laboratories(JAX原料号003780)获得含有新颖磺酰胺酶突变D31N的Sgsh^mps3a小鼠。简单地说，使TfR^mu/huKI雄性小鼠与雌性Sgsh^mps3a异型接合小鼠交配，产生在TfR^mu/hu KI同型接合背景下对Sgsh^mps3a突变是同型接合的小鼠。将用于这一研究的小鼠性别混合并圈养在12小时光-暗循环下，随意取用食物(LabDiet JL辐照6F)和水。

经由静脉内注射向Sgsh^mps3a×TfR^mu/hu KI小鼠施用单剂量40mg/kg体重的ETV:SGSH(双酶结构1)或SGSH-Fc并评定药效反应(融合蛋白参见实施例1)。具体地说，使用静脉内(i.v.)注射盐水、SGSH-Fc(40mg/kg体重)或ETV:SGSH(40mg/kg体重)的3月龄Sgsh^mps3a×TfR^mu/hu KI小鼠(n＝8/组)测定Sgsh^mps3a×TfR^mu/hu KI小鼠中ETV:SGSH的周围施用对肝脏、脑和CSF HS水平的作用。3月龄同窝出生的i.v.注射盐水的TfR^mu/hu KI小鼠用作对照。除注射ETV:SGSH的Sgsh^mps3a×TfR^mu/hu KI小鼠子集(n＝4)在单剂量后3天处死外，在单剂量后7天处死所有动物。收集血清、CSF、肝脏和脑并在干冰上速冻。

如下所述使用基于LC-MS/MS的方法在体内测量硫酸乙酰肝素衍生的二糖。简单地说，收集所有组织和流体，然后立即冷冻和存储在-80℃下。使用Qiagen TissueLyzer II在30Hz下将组织等分试样(50mg)在水(750μL)中均质化3分钟。将组织匀浆转移到96孔深板并使用96尖端超生波仪(Q Sonica)进行超声处理10×1秒脉冲。将进行超声处理的组织匀浆在4℃下在2,500×g下旋转30分钟以使细胞碎片形成团粒。将所得到的溶解产物转移到干净的96孔深板，并进行BCA以定量总蛋白。在LC-MS/MS分析之前将样品中的硫酸乙酰肝素(HS)消化成其相应的二糖。在PCR板中在震荡下在30℃下将10μg总蛋白溶解产物或3μl CSF与肝素酶I、II和III在消化缓冲液[111mM NH4OAc、0.11mM CaOAc、2mM DTT，pH 7.0]中孵育3小时。在3小时之后，将EDTA和20ng内标D4UA-2S-GlcNCOEt-6S(HD009，Iduron有限公司,Manchester,UK)添加到每个样品中并使混合物在95℃下沸腾10分钟以使酶失活。将消化的样品在3,364×g下旋转5分钟并将上清液转移到乙酸纤维素滤板(Millipore，MSUN03010)并在3,364×g下旋转5分钟。在玻璃小瓶中将所得到的洗提液与同等份的乙腈混合并通过质谱法如下分析。

通过液相色谱(Shimadzu Nexera X2系统,Shimadzu Scientific Instrument,Columbia,MD,USA)联合电喷雾质谱法(Sciex 6500+QTRAP,Sciex,Framingham,MA,USA)对流体和组织中的HS衍生的二糖进行定量。对于每次分析，使用0.4毫升/分钟的流速将样品注射在ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7mm，2.1×150mm柱(Waters公司,Milford,MA,USA)上，柱温为50℃。流动相A由具有10mM甲酸铵和0.1％甲酸的水组成，并且流动相B由具有0.1％甲酸的乙腈组成。梯度程序如下：85％ B下0.0-1.0分钟，85％ B至50％ B 1.0-5.0分钟，50％ B至85％ B 5.0-6.0分钟，6-8.0分钟保持在85％ B下。应用以下设定，以负离子电离模式进行电喷雾电离：气帘气为30；碰撞气中等；离子喷雾电压在-4500下；温度在450℃下；离子源气体1为50；和离子源气体2为60。使用Analyst 1.6.3(Sciex)，以多反应监测模式(MRM)，利用以下设定来获取数据：停留时间为30毫秒；碰撞能量为-30；去簇电压为-80；入口电位为-10；碰撞出口电压为-10。使用市售参考标准(Iduron公司)，个别二糖物种基于其保留时间和MRM转变来鉴定。监测以下二糖转变：D0A0(HS)，m/z 378.1>87.0；D0S0(HS)，m/z416.1>138.0；D4UA-2S-GlcNCOEt-6S(内标)m/z 472.0>97.0。二糖量相对于通过BCA测定测量的总蛋白水平归一化，或相对于每个样品使用的体液体积归一化。

为了确定ETV:SGSH是否减少脑中的底物水平，评定在单剂量酶之后Sgsh^mps3a×TfR^mu/hu KI小鼠中的HS水平。在单剂量之后，SGSH-Fc无法降低脑HS水平(图9)。然而，在单剂量之后3天和7天ETV:SGSH使脑HS水平分别减少大约50％和57％(图9)。这引起CSF HS水平伴随着减少，在单剂量之后3天和7天分别减少大约70％和80％(图10)。在一周之后两种分子有效降低肝脏中的HS水平(图8)，这证明TfR结合不负面影响这些组织中的药效反应。图8-10中的数据由平均值+/-平均值标准误差表示(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns＝不显著)。总体来说，这些数据证明ETV:SGSH显著地增加酶的脑暴露并使周围和CNS中的底物积聚大大减少。

实施例3：ETV:SGSH双酶结构的产品质量属性

根据产品质量评估ETV:SGSH融合蛋白的不同双酶结构。对于这一研究，将ETV:SGSH双酶结构1(实施例1)与具有不同的结合TfR的Fc区的结构(ETV:SGSH双酶结构6，以下描述)进行比较。两种结构如实施例1中所述制备，额外的纯化步骤如下所述。

结果

所测量的对双酶结构1和双酶结构6的人TfR亲和力是可比较的(K_D分别是约290nM对比约245nM)。

测得双酶结构1的表达滴度为约30-40mg/L，而测得双酶结构6的表达滴度略微较少(约12-23mg/L)。

评估双酶结构1与双酶结构6的蛋白A色谱纯化后的回收率。对双酶结构1与双酶结构6的蛋白A后池的分析说明约50-60％纯度(通过HPLC-SEC测量)，完整ETV结构(维持包含杵和臼对的经修饰的Fc二聚体)为至少约80％。双酶结构的蛋白A后池进行疏水性相互作用色谱法(HIC)以进一步精制(以下描述)。双酶结构1的HIC后池实现纯度水平>95％(通过HPLC-SEC测量)，完整ETV结构>90％，而双酶结构6的HIC后池实现纯度水平为约85％(通过HPLC-SEC测量)，完整ETV结构>90％。为了实现双酶结构6较高的纯度水平(>90％)，需要额外的纯化步骤，这会降低纯化后蛋白质的产率和回收率。

因此，鉴定出双酶结构1和其P329S变体(双酶结构4)是移到大规模生产的优选结构。

实验方法

产生第六“N端双酶”SGSH-Fc融合多肽(“ETV:SGSH双酶结构6”)，其包含具有SEQID NO:61和63中的任一者的序列的第一SGSH-Fc融合多肽，和具有SEQ ID NO:122和124中的任一者的序列的结合TfR的第二SGSH-Fc融合多肽。在细胞培养物产生期间还可进一步加工SGSH-Fc融合蛋白，使得第一SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:62或64的序列和/或结合TfR的第二SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:123或125的序列。因此，如本文所用，术语ETV:SGSH双酶结构6可用于指具有未加工的序列(即SEQ ID NO:61、63、122和124)的蛋白质分子；包含一个或多个被加工的序列(即选自SEQ ID NO:62、64、123和125)的蛋白质分子；或包含被加工和未加工的蛋白质分子的混合物。

ETV:SGSH双酶结构1和ETV:SGSH双酶结构6如实施例1中所述表达和纯化，修改如下：用1M Tris pH 8.0中和从蛋白A亲和柱洗提的所汇集的蛋白质洗提份到目标pH 6.0。然后将中和的蛋白A池用1M柠檬酸钠调节到0.6M柠檬酸钠的最终浓度。将所汇集的洗提份装载到ButylHP疏水性相互作用色谱(HIC)柱上，用0.6M柠檬酸钠(pH 6.0)洗涤，并经由以下来洗提：(i)历经10CV，0.6M柠檬酸钠(pH 6.0)至WFI的50％步骤梯度，然后(ii)历经5CV，0.6M柠檬酸钠(pH 6.0)至WFI的100％步骤梯度。

通过多种技术，包括还原和非还原SDS-PAGE和HPLC-SEC评定洗提份中ETV:SGSH融合蛋白的均质性。人TfR的亲和力如实施例2中所述测量。

实施例4：静脉内施用ETV:SGSH的不同双酶结构实现可比的脑中的GAG的减少

根据对MPS III的小鼠模型中的脑GAG水平的作用评估ETV:SGSH融合蛋白的不同双酶结构。对于这一研究，将ETV:SGSH双酶结构1与在Fc区中含有P329S突变的相应结构(ETV:SGSH双酶结构4)进行比较。

结果

使用实施例2中所述的方法分析双酶结构的甲酰甘氨酸(fGly)含量、甘露糖-6-磷酸(M6P)含量和人TfR亲和力。表2提供了每种双酶结构的分析结果。双酶结构1和双酶结构4的HIC后汇集洗提份实现纯度水平>95％(通过HPLC-SEC测量)，完整ETV结构>90％。

表2.ETV:SGSH蛋白特征

分子	fGly	M6P(mol/mol)	TfR亲和力(KD)
				双酶结构1	98％	4.05	290nM
双酶结构4	99％	2.93	340nM

为了确定ETV:SGSH结构是否减少脑中的底物水平，评定在单剂量ETV:SGSH蛋白质之后Sgsh^mps3a×TfR^mu/hu KI小鼠中的HS水平。在单剂量之后7天，ETV:SGSH双酶结构1与ETV:SGSH双酶结构4分别减少脑HS水平大约63％和59％(图11)。图11中的数据由平均值+/-平均标准误差表示。该数据证明ETV:SGSH的两种双酶结构大大地减少脑中的底物积聚。在来自每个队列的脑组织样品中，给药后7天的两种双酶结构的脑吸收是可检测的，并且定量为超过0.5nM。

实验方法

ETV:SGSH双酶结构1如实施例3中所述表达和纯化。

从经相关的DNA构建体转染的稳定CHO细胞系表达ETV:SGSH双酶结构4并通过评估所表达和纯化的蛋白质的表达滴度、稳定性和活性进行选择。简单地说，CHO-K1 GS敲除细胞系(Horizon Discovery)经相关的DNA构建体转染(编码融合蛋白和SUMF1的质粒共转染)，然后进行选择，以产生表达所关注基因的稳定细胞系。然后细胞系经受馈料分批生产，利用商业CHO细胞培养基(例如BalanCD CHO培养基(Irvine Scientific)，任选地补充有BalanCD CHO馈料4(Irvine Scientific))。将培养物维持在37℃下5天，然后温度变成32℃。在第12天收获时，将细胞培养物离心，并且经商业(0.8μm/0.2μm膜式过滤器)无菌过滤上清液并存储在4℃下。使用蛋白A亲和力和疏水性相互作用色谱法从细胞培养物上清液纯化融合蛋白。将上清液装载到制备规模的MabSelect SuRe LX蛋白A亲和柱(GE HealthcareLife Sciences，使用Akta Pure系统)上。然后将柱用2柱体积(CV)PBS洗涤，然后4CV 0.4M磷酸钾pH 7.0，然后3CV PBS洗涤。使用50mM柠檬酸盐/NaOH缓冲液pH 3.7洗提结合的蛋白质。在洗提之后立即使用1.5M Tris pH 11中和洗提份到目标pH 6.0。在疏水性相互作用色谱法之前，将中和的蛋白A以1:1.3的比率用1M柠檬酸钠pH 6.0调整。将经调整的蛋白A池装载到ButylHP疏水性相互作用色谱(HIC)柱上，用0.6M柠檬酸钠pH 6.0洗涤，然后经由历经25CV从0.6M柠檬酸钠至WFI的20-55％梯度洗提。通过多种技术，包括还原和非还原SDS-PAGE和HPLC-SEC评定洗提份中融合蛋白的均质性。

使用实施例2中所述的方法分析融合蛋白的甲酰甘氨酸(fGly)含量、M6P含量和TfR亲和力。

经由静脉内注射向Sgsh^mps3a×TfR^mu/hu KI小鼠(实施例2)施用单剂量ETV:SGSH双酶结构1或ETV:SGSH双酶结构4，并评定脑暴露和药效反应。使用静脉内(i.v.)注射盐水、ETV:SGSH双酶结构1(15mg/kg体重)或ETV:SGSH双酶结构4(15mg/kg体重)的9月龄Sgsh^mps3a×TfR^mu/hu KI小鼠(n＝4-5/组)测定Sgsh^mps3a×TfR^mu/hu KI小鼠中ETV:SGSH双酶结构的周围施用对脑HS水平的作用。九月龄同窝出生的i.v.注射盐水的TfR^mu/hu KI小鼠(非MPS III小鼠)用作对照。单剂量后7天处死所有动物。收集脑组织并在干冰上速冻。ETV:SGSH和硫酸乙酰肝素衍生的二糖的脑吸收如实施例2中所述测量。

非正式序列表

所有公布、专利和专利文件均以引用的方式并入本文中，如同以引用的方式个别地并入一般。本公开已经参考各种特定和优选的实施方案和技术来描述。但是，应了解在保持在本发明的精神和范围内的同时可进行许多变化和修改。

Claims (85)

1.一种蛋白质，所述蛋白质包含：

a.第一Fc多肽，所述第一Fc多肽连接于第一N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段；和

b.第二Fc多肽，所述第二Fc多肽连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段，其中所述第二Fc多肽能够特异性结合于运铁蛋白受体(TfR)；并且其中所述第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:37具有至少80％同一性的序列并具有根据EU编号在位置389处的Ala。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第二Fc多肽还包含：在位置380处的Glu；和在位置390处的Asn。

3.如权利要求2所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第二Fc多肽在以下位置处还包含：

i.在位置384处的Tyr；

ii.在位置386处的Thr；

iii.在位置387处的Glu；

iv.在位置388处的Trp；

v.在位置413处的Thr；

vi.在位置415处的Glu；

vii.在位置416处的Glu；以及

viii.在位置421处的Phe。

4.如权利要求1-3中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质能够转运跨过受试者的血脑屏障。

5.如权利要求1-4中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质以约100nM至约500nM或任选地约150nM至约400nM的亲和力结合于TfR。

6.如权利要求1-5中任一项所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽结合于所述TfR的顶端结构域。

7.如权利要求1-6中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质与所述TfR的结合基本上不抑制运铁蛋白与所述TfR的结合。

8.如权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一SGSH氨基酸序列包含与SEQID NO:58-60中的任一者具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。

9.如权利要求8所述的蛋白质，其中所述第一SGSH氨基酸序列包含SEQ ID NO:58-60中的任一者的氨基酸序列。

10.如权利要求1-9中任一项所述的蛋白质，其中所述第二SGSH氨基酸序列包含与SEQID NO:58-60中的任一者具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。

11.如权利要求10所述的蛋白质，其中所述第二SGSH氨基酸序列包含SEQ ID NO:58-60中的任一者的氨基酸序列。

12.如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽通过肽键或通过多肽接头连接于所述第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

13.如权利要求1-12中任一项所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽通过肽键或通过多肽接头连接于所述第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

14.如权利要求12或13所述的蛋白质，其中所述多肽接头是柔性多肽接头。

15.如权利要求14所述的蛋白质，其中所述柔性多肽接头是富甘氨酸接头。

16.如权利要求12-15中任一项所述的蛋白质，其中所述多肽接头是GS(SEQ ID NO:7)、G₄S(SEQ ID NO:8)或(G₄S)₂(SEQ ID NO:9)。

17.如权利要求1-16中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽的N端连接于所述第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

18.如权利要求1-16中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽的C端连接于所述第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

19.如权利要求1-18中任一项所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽的N端连接于所述第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

20.如权利要求1-18中任一项所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽的C端连接于所述第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

21.如权利要求1-16中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽的N端连接于所述第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段；并且其中所述第二Fc多肽的N端连接于所述第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

22.如权利要求1-16中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽的C端连接于所述第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段；并且其中所述第二Fc多肽的C端连接于所述第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

23.如权利要求1-22中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽各自含有促进异二聚合的修饰。

24.如权利要求23所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述Fc多肽中的一者具有T366W取代并且另一Fc多肽具有T366S、L368A和Y407V取代。

25.如权利要求24所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽含有T366S、L368A和Y407V取代并且所述第二Fc多肽含有T366W取代。

26.如权利要求25所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:12-19和28-31中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；并且所述第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:34-41和54-57中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

27.如权利要求24所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽含有T366W取代并且所述第二Fc多肽含有T366S、L368A和Y407V取代。

28.如权利要求27所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:24-27中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；并且所述第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:48-53中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

29.如权利要求1-28中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含天然FcRn结合位点。

30.如权利要求1-28中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽不具有效应功能。

31.如权利要求1-28中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包括降低效应功能的修饰。

32.如权利要求31所述的蛋白质，其中所述降低效应功能的修饰是根据EU编号在位置234处的Ala和在位置235处的Ala的取代。

33.如权利要求32所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:14-19和26-31中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

34.如权利要求33所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:14、15、28和29中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

35.如权利要求33所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:18、19、30和31中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

36.如权利要求32所述的蛋白质，其中连接于所述第一SGSH氨基酸序列的所述第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:61-88和117-118中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

37.如权利要求36所述的蛋白质，其中连接于所述第一SGSH氨基酸序列的所述第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:61-68、73-76、81-84和117-118中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

38.如权利要求32-37中任一项所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:36-41和50-57中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

39.如权利要求38所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:36、37、54和55中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

40.如权利要求38所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:40、41、56和57中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

41.如权利要求32-37中任一项所述的蛋白质，其中连接于所述第二SGSH氨基酸序列的所述第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:89-116和119-120中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

42.如权利要求41所述的蛋白质，其中连接于所述第二SGSH氨基酸序列的所述第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:89-96、101-104、109-112和119-120中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

43.如权利要求1-42中任一项所述的蛋白质，其中相对于天然Fc序列，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含延长血清半衰期的氨基酸变化。

44.如权利要求43所述的蛋白质，其中所述氨基酸变化包含根据EU编号在位置252处的Tyr、在位置254处的Thr和在位置256处的Glu的取代。

45.如权利要求43所述的蛋白质，其中所述氨基酸变化包含根据EU编号在位置428处的Leu和在位置434处的Ser的取代。

46.如权利要求43所述的蛋白质，其中所述氨基酸变化包含根据EU编号在位置434处的Ser或Ala的取代。

47.如权利要求23所述的蛋白质，其中连接于所述第一SGSH氨基酸序列的所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:61-68、73-76和81-84中的任一者的氨基酸序列；并且其中连接于所述第二SGSH氨基酸序列的所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:89-96、101-104和109-112中的任一者的氨基酸序列。

48.如权利要求47所述的蛋白质，其中连接于所述第一SGSH氨基酸序列的所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:61-64中的任一者的氨基酸序列；并且其中连接于所述第二SGSH氨基酸序列的所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:89-92中的任一者的氨基酸序列。

49.如权利要求48所述的蛋白质，其中连接于所述第一SGSH氨基酸序列的所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:63或64的氨基酸序列；并且其中连接于所述第二SGSH氨基酸序列的所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:91或92的氨基酸序列。

50.如权利要求47所述的蛋白质，其中连接于所述第一SGSH氨基酸序列的所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:75或76的氨基酸序列；并且其中连接于所述第二SGSH氨基酸序列的所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:103或104的氨基酸序列。

51.如权利要求47所述的蛋白质，其中连接于所述第一SGSH氨基酸序列的所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:83或84的氨基酸序列；并且其中连接于所述第二SGSH氨基酸序列的所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:111或112的氨基酸序列。

52.如权利要求47所述的蛋白质，其中连接于所述第一SGSH氨基酸序列的所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:65-68中的任一者的氨基酸序列；并且其中连接于所述第二SGSH氨基酸序列的所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:93-96中的任一者的氨基酸序列。

53.如权利要求52所述的蛋白质，其中连接于所述第一SGSH氨基酸序列的所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:67或68的氨基酸序列；并且其中连接于所述第二SGSH氨基酸序列的所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:95或96的氨基酸序列。

54.如权利要求23所述的蛋白质，其中连接于所述第一SGSH氨基酸序列的所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列；并且其中连接于所述第二SGSH氨基酸序列的所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。

55.如权利要求1-54中任一项所述的蛋白质，其中与在缺乏所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽的情况下所述SGSH氨基酸序列的吸收相比或与未对所述第二Fc多肽进行促成TfR结合的修饰的情况下所述SGSH酶的吸收相比，所述SGSH氨基酸序列在脑中的吸收大至少十倍。

56.如权利要求1-55中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽未被修饰成结合于血脑屏障(BBB)受体并且所述第二Fc多肽被修饰成特异性结合于TfR。

57.如权利要求1-56中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。

58.一种多肽，所述多肽包含连接于SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段的Fc多肽，其中所述Fc多肽i)能够特异性结合于运铁蛋白受体(TfR)；ii)包含与SEQID NO:37具有至少90％同一性的序列；iii)具有一个或多个促进其与另一Fc多肽进行异二聚合的修饰；并且iv)具有根据EU编号在位置389处的Ala。

59.如权利要求58所述的多肽，其中根据EU编号，所述Fc多肽还包含：在位置380处的Glu；和在位置390处的Asn。

60.如权利要求59所述的多肽，其中根据EU编号，所述Fc多肽在以下位置处还包含：

i.在位置384处的Tyr；

ii.在位置386处的Thr；

iii.在位置387处的Glu；

iv.在位置388处的Trp；

v.在位置413处的Thr；

vi.在位置415处的Glu；

vii.在位置416处的Glu；以及

viii.在位置421处的Phe。

61.如权利要求58-60中任一项所述的多肽，其中所述Fc多肽通过肽键或通过多肽接头连接于所述SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或其催化活性片段。

62.如权利要求61所述的多肽，所述多肽是从N端到C端包含以下的融合多肽：所述SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或催化活性片段；所述多肽接头；和所述Fc多肽。

63.如权利要求61所述的多肽，所述多肽是从N端到C端包含以下的融合多肽：所述Fc多肽；所述多肽接头；和所述SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或催化活性片段。

64.如权利要求58-63中任一项所述的多肽，其中根据EU编号，所述Fc多肽含有T366S、L368A和Y407V取代。

65.如权利要求64所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ IDNO:97-100、105-108和113-116中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

66.如权利要求58-63中任一项所述的多肽，其中所述Fc多肽含有T366W取代。

67.如权利要求66所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:89-96、101-104、109-112和119-120中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

68.一种蛋白质，所述蛋白质包含如权利要求58-67中任一项所述的多肽和另一Fc多肽。

69.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-57和68中任一项所述的蛋白质或如权利要求58-67中任一项所述的多肽和药学上可接受的赋形剂。

70.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如权利要求58-67中任一项所述的多肽的核酸序列。

71.一种载体，所述载体包含如权利要求70所述的多核苷酸。

72.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求70所述的多核苷酸或如权利要求71所述的载体。

73.如权利要求72所述的宿主细胞，所述宿主细胞还包括包含编码所述另一Fc多肽的核酸序列的多核苷酸。

74.一种用于产生包含连接于SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或催化活性片段的Fc多肽的多肽的方法，所述方法包括在表达由如权利要求70所述的多核苷酸编码的所述多肽的条件下培养宿主细胞。

75.一种多核苷酸对，所述多核苷酸对包含编码如权利要求1-57中的任一项中所述的连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或催化活性片段的第一Fc多肽的第一核酸序列；和编码如权利要求1-57中的任一项中所述的连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或催化活性片段的第二Fc多肽的第二核酸序列。

76.一种或多种载体，所述载体包含如权利要求75所述的多核苷酸对。

77.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求75所述的多核苷酸对或如权利要求76所述的一种或多种载体。

78.一种用于产生蛋白质的方法，所述蛋白质包含连接于第一SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或催化活性片段的第一Fc多肽和连接于第二SGSH氨基酸序列、SGSH变体氨基酸序列或催化活性片段的第二Fc多肽，所述方法包括在表达如权利要求75所述的多核苷酸对的条件下培养宿主细胞。

79.一种治疗A型圣菲利波综合征的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如权利要求1-57和68中任一项所述的蛋白质或如权利要求58-67中任一项所述的多肽。

80.如权利要求1-57和68中任一项所述的蛋白质或如权利要求58-67中任一项所述的多肽，所述蛋白质或所述多肽用于治疗有需要的患者的A型圣菲利波综合征。

81.一种如权利要求1-57和68中任一项所述的蛋白质或如权利要求58-67中任一项所述的多肽的用途，所述蛋白质或所述多肽用于制备供治疗有需要的患者的A型圣菲利波综合征用的药物。

82.一种减少患有A型圣菲利波综合征的患者中的毒性代谢产物积聚的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求1-57和68中任一项所述的蛋白质或如权利要求58-67中任一项所述的多肽。

83.如权利要求1-57和68中任一项所述的蛋白质或如权利要求58-67中任一项所述的多肽，所述蛋白质或所述多肽用于减少患有A型圣菲利波综合征的患者中的毒性代谢产物积聚。

84.一种如权利要求1-57和68中任一项所述的蛋白质或如权利要求58-67中任一项所述的多肽的用途，所述蛋白质或所述多肽用于制备供减少患有A型圣菲利波综合征的患者中的毒性代谢产物积聚用的药物。

85.如权利要求82-84中任一项所述的方法、蛋白质或用途，其中所述毒性代谢产物包含硫酸乙酰肝素衍生的寡糖。