JP2023507846A - プログラニュリン変異体 - Google Patents
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Abstract
プログラニュリン変異体、及びプログラニュリン変異体とＦｃポリペプチドとを含む融合タンパク質を本明細書において提供する。プログラニュリン関連障害（例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの神経変性疾患）を処置するために、そのようなタンパク質を使用する方法も、本明細書において提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月２３日出願の米国特許仮出願第６２／９５３，０９９号、及び２０２０年１０月１４日出願の米国特許仮出願第６３／０９１，８１９号の優先権を主張し、それらの開示は、あらゆる目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１２月２３日出願の米国特許仮出願第６２／９５３，０９９号、及び２０２０年１０月１４日出願の米国特許仮出願第６３／０９１，８１９号の優先権を主張し、それらの開示は、あらゆる目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１２月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１０２３４２－００３９２０ＰＣ－１２１９１８８＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、サイズは５４３，７５６バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１２月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１０２３４２－００３９２０ＰＣ－１２１９１８８＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、サイズは５４３，７５６バイトである。
背景
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、認知症を有する全患者の５～１０％を占めかつ６５歳未満で認知症を発症した患者の１０～２０％を占める、進行性の神経変性障害である（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．８（８）：４２３－３４，２０１２（非特許文献１））。いくつかの遺伝子がＦＴＤに関連付けられているが、ＦＴＤにおいて最も頻繁に変異する遺伝子のうちの１つがＧＲＮであり、これは、ヒト染色体１７ｑ２１に位置し、システインリッチなタンパク質であるプログラニュリン（ＰＧＲＮ）（プロエピセリン及びアクログラニンとしても公知）をコードする。ＧＲＮにおける浸透性の高い変異は、家族性ＦＴＤの常染色体優性形態の原因として、２００６年に最初に報告された（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４４２（７１０５）：９１６－９，２００６（非特許文献２）；Ｃｒｕｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ Ａｕｇ ２４；４４２（７１０５）：９２０－４（非特許文献３）；Ｇａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１５（２０）：２９８８－３００１，２００６（非特許文献４））。最近の推定では、ＧＲＮ変異は、家族歴が陽性であるＦＴＤ患者の５～２０％、及び孤発性症例の１～５％を占めると示唆されている（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、前出）。
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、認知症を有する全患者の５～１０％を占めかつ６５歳未満で認知症を発症した患者の１０～２０％を占める、進行性の神経変性障害である（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．８（８）：４２３－３４，２０１２（非特許文献１））。いくつかの遺伝子がＦＴＤに関連付けられているが、ＦＴＤにおいて最も頻繁に変異する遺伝子のうちの１つがＧＲＮであり、これは、ヒト染色体１７ｑ２１に位置し、システインリッチなタンパク質であるプログラニュリン（ＰＧＲＮ）（プロエピセリン及びアクログラニンとしても公知）をコードする。ＧＲＮにおける浸透性の高い変異は、家族性ＦＴＤの常染色体優性形態の原因として、２００６年に最初に報告された（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４４２（７１０５）：９１６－９，２００６（非特許文献２）；Ｃｒｕｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ Ａｕｇ ２４；４４２（７１０５）：９２０－４（非特許文献３）；Ｇａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１５（２０）：２９８８－３００１，２００６（非特許文献４））。最近の推定では、ＧＲＮ変異は、家族歴が陽性であるＦＴＤ患者の５～２０％、及び孤発性症例の１～５％を占めると示唆されている（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、前出）。
ＦＴＤの原因としてＧＲＮ変異が同定された後に、プログラニュリンのレベルの低下及びプログラニュリン機能喪失が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びリソソーム蓄積症が原因である神経変性障害を含む複数の神経変性疾患及び障害に関連付けられている（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ．２０１４．Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３７（７）：３８８－３９８（非特許文献５））。したがって、プログラニュリン機能の喪失もしくはプログラニュリンのレベルの低下が原因である障害、またはプログラニュリンのレベルの上昇が有益である障害に対処することができる治療を開発する必要がある。
Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．８（８）：４２３－３４，２０１２
Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４４２（７１０５）：９１６－９，２００６
Ｃｒｕｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ Ａｕｇ ２４；４４２（７１０５）：９２０－４
Ｇａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１５（２０）：２９８８－３００１，２００６
Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ．２０１４．Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３７（７）：３８８－３９８
概要
プログラニュリン変異体、ならびにプログラニュリンまたはその変異体を含む融合タンパク質、ならびに神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ）、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、またはプログラニュリン関連障害を含む、プログラニュリンのレベルの上昇が有益である任意の疾患を処置するためにそのような変異体または融合タンパク質を使用する方法を、本明細書において提供する。本明細書において提供されるプログラニュリン変異体は、野生型プログラニュリンのＣ末端に改変または付加を有する。本明細書に記載のとおり、プログラニュリン変異体を含有する融合タンパク質は、そのタンパク質がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から組み換え発現され、かつ精製されるときに、野生型プログラニュリンを含有する融合タンパク質と比較して、そのタンパク質のプログラニュリン部分においてＣ末端切断を受けにくい。
プログラニュリン変異体、ならびにプログラニュリンまたはその変異体を含む融合タンパク質、ならびに神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ）、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、またはプログラニュリン関連障害を含む、プログラニュリンのレベルの上昇が有益である任意の疾患を処置するためにそのような変異体または融合タンパク質を使用する方法を、本明細書において提供する。本明細書において提供されるプログラニュリン変異体は、野生型プログラニュリンのＣ末端に改変または付加を有する。本明細書に記載のとおり、プログラニュリン変異体を含有する融合タンパク質は、そのタンパク質がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から組み換え発現され、かつ精製されるときに、野生型プログラニュリンを含有する融合タンパク質と比較して、そのタンパク質のプログラニュリン部分においてＣ末端切断を受けにくい。
一態様では、本開示は、配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列、及び配列番号２の残基５７４から５７６に対応する位置におけるＸ１Ｘ２Ｘ３により定義される配列（ここで、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、それぞれ独立にアミノ酸であり、合わさってＱＬＬではない）を含むプログラニュリン変異体を特徴とする。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号２に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性（例えば、少なくとも９９％）を有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号２に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性（例えば、少なくとも９９％）を有する配列を含む。
この態様の一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列：
を含み、ここで、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は合わさってＱＬＬではない。
一部の実施形態では、Ｘ１は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、またはＶである。一部の実施形態では、Ｘ２は、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、またはＲである。一部の実施形態では、Ｘ３は、Ｌ、Ｙ、またはＰである。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、Ｘ１ＩＬ、Ｘ１ＦＬ、Ｘ１ＱＬ、ＰＸ２Ｌ、ＱＸ２Ｌ、またはＶＸ２Ｌである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、Ｘ１Ｘ２Ｌであり、一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｌ中のＸ２は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、またはＶである。
特定の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＰＩＬ、ＰＦＬ、ＱＱＬ、ＶＶＬ、またはＶＴＬである。特定の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＰＰＬ、ＰＹＬ、ＱＱＬ、ＱＨＬ、またはＱＲＬである。
別の態様では、本開示は、配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列、及び配列番号２の残基５７６に対応する位置に隣接しかつそのＣ末端側にあるＹ１Ｙ２ＱＬＬ（配列番号１３７）により定義される配列（ここで、Ｙ１は、Ｌであるか、または存在せず、かつＹ２は、Ｒであるか、または存在しない）を含むプログラニュリン変異体を特徴とする。
一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列：
を含む。
一部の実施形態では、Ｙ１はＬである。一部の実施形態では、Ｙ２はＲである。一部の実施形態では、Ｙ１及びＹ２は両方とも存在しない。
別の態様では、本開示は、配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列、及び配列番号２の残基５７４から５７６に対応する位置におけるＸ１Ｘ２Ｘ３により定義される配列（ここで、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、それぞれ独立にアミノ酸であり、合わさってＱＬＬではない）を含むプログラニュリン変異体を含むポリペプチドを特徴とする。一部の実施形態では、ポリペプチド中のプログラニュリン変異体は、配列番号２に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性を有する。一部の実施形態では、ポリペプチド中のプログラニュリン変異体は、配列番号２に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性を有する配列を含む。
この態様の一部の実施形態では、ポリペプチド中のプログラニュリン変異体は、配列：
を含み、ここで、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＱＱＬではない。
この態様の一部の実施形態では、Ｘ１は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、またはＶである。一部の実施形態では、Ｘ２は、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、またはＲである。一部の実施形態では、Ｘ３は、Ｌ、Ｙ、またはＰである。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＸ１ＩＬである。ある特定の実施形態では、Ｘ１ＩＬ中のＸ１は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｐ、Ｎ、Ｆ、またはＹ（例えば、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、またはＰ）であってよい。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＸ１ＦＬである。ある特定の実施形態では、Ｘ１ＦＬ中のＸ１は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、またはＰであってよい。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＸ１ＱＬである。ある特定の実施形態では、Ｘ１ＱＬ中のＸ１は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、またはＱであってよい。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＰＸ２Ｌである。ある特定の実施形態では、ＰＸ２Ｌ中のＸ２は、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、またはＲ（例えば、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、またはＦ）であってよい。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＱＸ２Ｌである。ある特定の実施形態では、ＱＸ２Ｌ中のＸ２は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｐ、Ｙ、またはＱであってよい。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＶＸ２Ｌである。ある特定の実施形態では、ＶＸ２Ｌ中のＸ２は、ＶまたはＴであってよい。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＸ１Ｘ２Ｌである。ある特定の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｌ中のＸ２は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、またはＶである。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＰＩＬである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＰＦＬである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＱＱＬである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＶＶＬである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＶＴＬである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＰＰＬである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＰＹＬである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＱＲＬである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＱＨＬである。
別の態様では、本開示は、プログラニュリン変異体を含むポリペプチドを特徴とし、ここで、プログラニュリン変異体は、配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性、及び配列番号２の残基５７６に対応する位置に隣接しかつそのＣ末端側にあるＹ１Ｙ２ＱＬＬ（配列番号１３７）により定義される配列を含み、ここで、Ｙ１は、Ｌであるか、または存在せず、かつＹ２は、Ｒであるか、または存在しない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列：
を有するプログラニュリン変異体を含む。
一部の実施形態では、Ｙ１はＬである。一部の実施形態では、Ｙ２はＲである。一部の実施形態では、Ｙ１及びＹ２は両方とも存在しない。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドはさらに、プログラニュリン変異体に連結しているＦｃポリペプチドを含む。ＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端が、プログラニュリン変異体に連結していてよい。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合により、またはポリペプチドリンカーによりプログラニュリン変異体に連結している。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、１～５０（例えば、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、５～５０、１０～５０、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５）アミノ酸長である。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、柔軟なポリペプチドリンカー、例えば、グリシンリッチなリンカーである。ある特定の実施形態では、グリシンリッチなリンカーは、Ｇ４Ｓ（配列番号９０）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号９１）である。
ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、配列番号６４～６７からなる群から選択される配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ；すなわち、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）に特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチド（例えば、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）は、配列番号６８～８７及び１２９～１３２（例えば、配列番号７０、７５、８０、８５、及び１２９～１３２）からなる群から選択される配列を含む。
特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチド（例えば、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）は、配列番号７０、７５、８０、８５、及び１２９～１３２から選択される配列を含む。
別の態様では、本開示は、（ａ）本明細書に記載のプログラニュリン変異体；（ｂ）（ａ）のプログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチド；及び（ｃ）第１のＦｃポリペプチドと共にＦｃポリペプチド二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドを含む融合タンパク質を特徴とする。この態様の一部の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドはまた、野生型プログラニュリンまたは本明細書に記載のプログラニュリン変異体（すなわち、第２のプログラニュリンポリペプチド）に連結している。第１のＦｃポリペプチドに連結しているプログラニュリン変異体及び第２のＦｃポリペプチドに連結しているプログラニュリン変異体は、同じであっても、または異なってもよい。
一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合により、またはポリペプチドリンカーにより、プログラニュリン変異体に連結しており、かつ／または第２のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合により、またはポリペプチドリンカーにより、プログラニュリン変異体に連結している。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、１～５０（例えば、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、５～５０、１０～５０、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５）アミノ酸長である。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、柔軟なポリペプチドリンカー、例えば、グリシンリッチなリンカーである。ある特定の実施形態では、グリシンリッチなリンカーは、Ｇ４Ｓ（配列番号９０）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号９１）である。
この態様の一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、プログラニュリンのＮ末端に連結しており、かつ／または第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は、プログラニュリン変異体のＮ末端に連結している。
一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドまたは第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドまたは第２のＦｃポリペプチドは独立に、配列番号６８～８７及び１２９～１３２からなる群から選択される配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドまたは第２のＦｃポリペプチドは独立に、配列番号７０、７５、８０、８５、及び１２９～１３２から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドはそれぞれ、ヘテロ二量体化を促進する改変を含む。例えば、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによる、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む。一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによる、Ｔ３６６Ｗ置換を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含む。
一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは独立に、エフェクター機能を低下させる改変を含む。ある特定の実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵナンバリングによる、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換である。
一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６４～６７からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６８～８７及び１２９～１３２からなる群から選択される配列（例えば、配列番号７０、７５、８０、８５、及び１２９～１３２）を含む。
この態様の一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによる、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含む。一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングによる、Ｔ３６６Ｗ置換ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含む。
この態様の一部の実施形態では、ヒンジ領域またはその一部が、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドに連結している。
一部の実施形態では、融合タンパク質のソルチリン結合についてのＫＤは、約１００ｎＭ未満（例えば、約９５ｎＭ、９０ｎＭ、８５ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、または４０ｎＭ未満）である。一部の実施形態では、融合タンパク質のソルチリン結合についてのＫＤは、第１のポリペプチド中に配列番号２を含む融合タンパク質と比べて、ソルチリン結合の１０倍未満の低下を示す。一部の実施形態では、融合タンパク質のソルチリン結合についてのＫＤは、第１のポリペプチドにおいて配列番号２を含む融合タンパク質と比べて、ソルチリン結合の５倍未満の低下を示す。
一部の実施形態では、融合タンパク質のソルチリン結合についてのＥＣ５０は、約２５ｎＭ未満（例えば、約２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、または１ｎＭ未満）である。特定の実施形態では、融合タンパク質のソルチリン結合についてのＥＣ５０は、第１のポリペプチド中に配列番号２を含む融合タンパク質と比べて、ソルチリン結合の１０倍未満の低下を示す。ある特定の実施形態では、ＥＣ５０は、本明細書に記載のとおりの（例えば、実施例４に記載のとおりの）ＥＬＩＳＡにより測定される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質ソルチリン結合についてのＥＣ５０は、基準融合タンパク質と比べて、ソルチリン結合の１０倍未満の低下を示し、ここで、基準融合タンパク質は、（ｉ）配列番号２を含む第１のポリペプチド及び（ｉｉ）第１のＦｃポリペプチドと共にＦｃポリペプチド二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質のソルチリン結合についてのＥＣ５０は、基準融合タンパク質と比べて、ソルチリン結合の１０倍未満の低下を示し、ここで、基準融合タンパク質は、（ｉ）配列番号１０８を含む第１のポリペプチド及び（ｉｉ）第１のＦｃポリペプチドと共にＦｃポリペプチド二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、基準融合タンパク質をＨＥＫ細胞において生成する。一部の実施形態では、基準融合タンパク質を、実質的に本明細書に記載のとおりに（例えば、実施例１に記載のとおりに）精製する。
一部の実施形態では、融合タンパク質をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において生成する。特定の実施形態では、融合タンパク質の５０％超（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％超）は、融合タンパク質のプログラニュリン変異体部分のＣ末端で切断されない。一部の実施形態では、融合タンパク質を、プロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、及び透析からなる群から選択される１つまたは複数の方法により、融合タンパク質発現細胞を含む細胞培養培地から精製する。一部の実施形態では、融合タンパク質を、実質的に本明細書に記載とおりに（例えば、実施例１に記載のとおりに）精製する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のプログラニュリン変異体または融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。
別の態様では、本開示は、複数の本明細書に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。一部の実施形態では、複数の融合タンパク質のうちの５０％超（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％超）が、融合タンパク質のプログラニュリン変異体におけるインタクトなＣ末端を含む。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、ＡＭＤ、またはプログラニュリン関連障害を有する対象を処置する方法であって、本明細書に記載のプログラニュリン変異体、本明細書に記載の融合タンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む前記方法を特徴とする。特定の実施形態では、対象は神経変性疾患を有する。
別の態様では、本開示は、対象においてプログラニュリンまたはその変異体の量を増加させる方法であって、本明細書に記載のプログラニュリン変異体、本明細書に記載の融合タンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む前記方法を特徴とする。ある特定の実施形態では、対象は、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、ＡＭＤ、またはプログラニュリン関連障害を有する。特定の実施形態では、対象は神経変性疾患を有する。
別の態様では、本開示は、対象においてカテプシンＤ活性を低下させる方法であって、本明細書に記載のプログラニュリン変異体、本明細書に記載の融合タンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む前記方法を特徴とする。ある特定の実施形態では、対象は、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、ＡＭＤ、またはプログラニュリン関連障害を有する。特定の実施形態では、対象は神経変性疾患を有する。
別の態様では、本開示は、対象においてリソソーム分解を増加させるか、またはリソソーム機能を改善する方法であって、本明細書に記載のプログラニュリン変異体、本明細書に記載の融合タンパク質、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む前記方法を特徴とする。ある特定の実施形態では、対象は、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、ＡＭＤ、またはプログラニュリン関連障害を有する。特定の実施形態では、対象は神経変性疾患を有する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、神経変性疾患は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ニーマン・ピック病Ａ型（ＮＰＡ）、ニーマン・ピック病Ｂ型（ＮＰＢ）、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）、Ｃ９ＯＲＦ７２関連筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）／ＦＴＤ、孤発性ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、ゴーシェ病、またはパーキンソン病である。ある特定の実施形態では、神経変性疾患はＦＴＤである。
実施形態は、ＦＴＤの処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書に記載のプログラニュリン変異体または融合タンパク質を対象に投与することを含む前記方法にも関する。一部の実施形態では、ＦＴＤはＣ９ＯＲＦ７２関連ＦＴＤである。
前述の方法のいずれかの一部の実施形態では、対象は、プログラニュリンをコードする遺伝子に変異を有する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のプログラニュリン変異体またはポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを特徴とする。別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを特徴とする。別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を特徴とする。一部の実施形態では、宿主細胞はさらに、第２のＦｃポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６１及び６４～８７のいずれか１つから選択される配列を有する。別の態様では、本開示は、ポリペプチドを生成するための方法であって、宿主細胞を、本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが発現される条件下で培養することを含む前記方法を特徴とする。
別の態様では、本明細書に記載の疾患または障害を処置するために、化合物を評価する、または本明細書に記載のプログラニュリン変異体もしくは融合タンパク質、またはその医薬組成物もしくは投薬レジメンに対する対象の応答をモニタリングするための方法であって、（ａ）プログラニュリン関連障害を有する対象からの試験試料における１種または複数のビス（モノアシルグリセロ）ホスファート（ＢＭＰ）種及び／またはグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）の存在量を測定することであって、その際、試験試料または対象が、化合物またはその医薬組成物で処置されている（例えば、本明細書に記載の融合タンパク質で処置されている）、前記測定すること；（ｂ）（ａ）において測定された１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈと、１種または複数の基準値との間の存在量の差異を比較すること；ならびに（ｃ）比較から、化合物、その医薬組成物、または投薬レジメン（例えば、本明細書に記載の融合タンパク質）が疾患または障害を処置するために１種または複数のＢＭＰ種レベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルを改善するか否かを決定することを含む前記方法を提供する。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法はさらに、別の試験試料または対象を別の化合物で処置すること、及び１種または複数のＢＭＰ種レベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルを改善する候補化合物を選択することを含む。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法はさらに、（ｄ）試験試料または対象に対する化合物（例えば、本明細書に記載の融合タンパク質）の投与の量または頻度を維持する、または調節すること；及び（ｅ）化合物を試験試料または対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法はさらに、プログラニュリン関連障害を処置するために、対象に、本明細書に記載のプログラニュリン変異体を投与して、１種または複数のＢＭＰ種レベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルを改善することを含む。一部の実施形態では、プログラニュリン関連障害の１つまたは複数の徴候または症状のうちの少なくとも１つが、処置後に寛解される。
一部の実施形態では、処置は、本明細書に記載の融合タンパク質を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、処置は、化合物のライブラリを複数の対象または試験試料に投与することを含む。
一部の実施形態では、１種または複数のＢＭＰ種の存在量及びＧｌｃＳｐｈの存在量の両方を対象からの同じ試験試料から測定することができる。他の実施形態では、２つの試験試料（例えば、同じ時間に、または異なる時間に採取）を対象から採取することができ、その際、一方の試験試料は、１種または複数のＢＭＰ種の存在量を測定するために使用することでき、他方の試験試料は、ＧｌｃＳｐｈの存在量を測定するために使用することができる。２つの試験試料は、対象の同じ体液、細胞、または組織（例えば、全血、血漿、細胞、組織、血清、脳脊髄液、間質液、痰、尿、またはリンパ液）から採取することができる。他の実施形態では、２つの試験試料は、対象の異なる体液、細胞、または組織から採取することができ、例えば、一方の試料は血漿であってよく、他方の試料は脳組織であってよい。
一部の実施形態では、基準値は、基準対象または基準対象の集団（例えば、平均値）から得られた基準試料において測定される。一部の実施形態では、基準値は、基準試料で測定された１種または複数のＢＭＰ種の存在量である。一部の実施形態では、基準値は、基準試料において測定されたＧｌｃＳｐｈの存在量である。一部の実施形態では、基準試料は、試験試料と同じ種類の細胞、組織、または体液である。一部の実施形態では、異なる種類の細胞、組織、または体液からの少なくとも２つの基準値を測定する。
一部の実施形態では、基準試料は、健康な対照である。一部の実施形態では、基準対象または基準対象の集団は、プログラニュリン関連障害またはプログラニュリンのレベルの低下を有さない。特定の実施形態では、基準対象または基準対象の集団は、そのようないずれの徴候または症状も有さない。
一部の実施形態では、ＢＭＰ種レベルが、健康な対照またはプログラニュリン関連障害に関連しない対照と比較して、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象の骨髄細胞からインビトロで得られた骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）では上昇している。
一部の実施形態では、ＢＭＰ種レベルが、健康な対照またはプログラニュリン関連障害に関連しない対照と比較して、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象の肝臓、脳、脳脊髄液、血漿、または尿では低下している。
一部の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルが、健康な対照またはプログラニュリン関連障害に関連しない対照と比較して、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象の例えば、全血、血漿、細胞、組織、血清、脳脊髄液、間質液、痰、尿、リンパ液、またはそれらの組合せでは上昇している。特定の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルの上昇を、対象の血漿において見い出すことができる。
一部の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルが、健康な対照またはプログラニュリン関連障害に関連しない対照と比較して、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象の脳では、例えば、脳の前頭葉及び／または側頭葉では上昇している。特定の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルの上昇を、前頭葉、例えば、上前頭回、中前頭回、下前頭回、及び／または中心前回の１つまたは複数の領域において見い出すことができる。
一部の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルが、健康な対照またはプログラニュリン関連障害に関連しない対照と比較して、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象の血液細胞、脳細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、赤血球、白血球、神経細胞、ミクログリア細胞、大脳皮質細胞、脊髄細胞、骨髄細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脾細胞、肺細胞、眼細胞、絨毛膜絨毛細胞、筋細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、心臓細胞、リンパ節細胞、またはそれらの組合せなどの細胞では上昇している。一部の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルの上昇が、血液細胞において見い出され得る。一部の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルの上昇が、脳細胞において見い出され得る。
一部の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルが、健康な対照またはプログラニュリン関連障害に関連しない対照と比較して、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象の脳組織、大脳皮質組織、脊髄組織、肝臓組織、腎臓組織、筋肉組織、心臓組織、眼組織、網膜組織、リンパ節、骨髄、皮膚組織、血管組織、肺組織、脾臓組織、心臓弁組織、またはそれらの組合せなどの組織では上昇している。一部の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルの上昇が、対象の脳の前頭葉または側頭葉からの脳組織などの脳組織において見い出され得る。特定の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルの上昇が、前頭葉の上前頭回、中前頭回、下前頭回、及び／または中心前回において見い出され得る。
さらなる実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルが、健康な対照またはプログラニュリン関連障害に関連しない対照と比較して、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象のエンドソーム、リソソーム、細胞外小胞、エキソソーム、マイクロベシクル、またはそれらの組合せでは上昇している。
一部の実施形態では、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象の試験試料におけるＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量は、健康な対照またはプログラニュリン関連障害に関連しない対照などの対照の基準値と比較して、少なくとも約１．２倍、１．５倍、または２倍の差を有する。他の実施形態では、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象の試験試料におけるＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量は、健康な対照またはプログラニュリン関連障害に関連しない対照などの対照の基準値と比較して、約１．２倍から約５倍（例えば、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍）の差を有する。一部の実施形態では、基準値と比較しての差は、約２倍から約３倍（例えば、約２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、または３倍）である。一部の実施形態では、対象は、プログラニュリンのレベルの低下に関連する障害及び／またはプログラニュリンのレベルの低下に関連する障害の１つもしくは複数の徴候もしくは症状を有する。
一部の実施形態では、基準値は、処置前のＢＭＰ種値及び／またはＧｌｃＳｐｈ値である。一部の実施形態では、対象を、プログラニュリンのレベルの低下またはプログラニュリン関連障害について処置し、かつ試験試料は、処置を開始する前に対象から得られた１つまたは複数の処置前試験試料、及び処置を開始した後に対象から得られた１つまたは複数の処置後試験試料を含む。一部の実施形態では、前記方法はさらに、処置後の１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈのうちの少なくとも１つの存在量が、健康な対照と比べて、処置前の１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈよりも改善を示すときに、対象が処置に応答していると決定することを含む。
一部の実施形態では、前記方法は、（ａ）対象から得られた試験試料において１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量を測定すること；（ｂ）試験試料または対象を化合物、医薬組成物、またはその投薬レジメンで処置すること（例えば、試験試料または対象を本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質で処置すること）；（ｃ）処置された対象から得られた試験試料において１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量を測定すること、ならびに（ｄ）ステップ（ａ）及び（ｃ）において測定された１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量を比較すること；ならびに（ｅ）化合物または投薬レジメンが、プログラニュリン関連障害を処置するためにＢＭＰレベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルを改善するか否かを決定することを含む。
一部の実施形態では、２つ以上の処置後試験試料を、処置を開始した後の異なる時点で得て、前記方法はさらに、処置後試料において測定された１種または複数のＢＭＰ種のうちの少なくとも１つの存在量が、処置前試料において測定された対応する１種または複数のＢＭＰ種の存在量よりも、ａ）ＢＭＤＭでは低いか、またはｂ）肝臓、脳、脳脊髄液、血漿、または尿では高いときに、対象が処置に応答していると決定することを含む。一部の実施形態では、処置後試料において測定された１種または複数のＢＭＰ種のうちの少なくとも１つの存在量が、処置前試料において測定された対応する１種または複数のＢＭＰ種の存在量よりも、ａ）ＢＭＤＭでは少なくとも約１．２倍低いか、またはｂ）肝臓、脳、脳脊髄液、血漿、または尿では少なくとも約１．２倍高いときに、対象が処置に応答していると決定する。
一部の実施形態では、２つ以上の処置後試験試料を、処置を開始した後の異なる時点で得て、前記方法はさらに、処置後試料において測定されたＧｌｃＳｐｈの存在量が、処置前試料において測定されたＧｌｃＳｐｈの存在量よりも、例えば、全血、血漿、細胞、組織、血清、脳脊髄液、間質液、痰、尿、またはリンパ液では低いときに、対象が処置に応答していると決定することを含む。一部の実施形態では、処置後試料において測定されたＧｌｃＳｐｈの存在量が、処置前試料において測定されたＧｌｃＳｐｈの存在量よりも、例えば、全血、血漿、細胞、組織、血清、脳脊髄液、間質液、痰、尿、またはリンパ液では少なくとも約１．２倍（例えば、少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または１０倍）低いときに、対象は、処置に応答していると決定する。
一部の実施形態では、ＢＭＰ種レベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルの改善は、健康な対照またはプログラニュリン関連障害と関連しない対照などの対照の基準値と比べて、処置前のＢＭＰ種レベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルを上回る改善である。一部の実施形態では、改善されたＢＭＰ種レベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルは、値において、処置前ＢＭＰ種レベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルが対照に対するよりも、対照に近い。一部の実施形態では、改善されたＢＭＰ種レベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルは、対照と比較して、２０％、１５％、１０％、または５％未満の差を有する。一部の実施形態では、改善されたＢＭＰ種レベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルは、健康な対照と比較して、１０％または５％未満の差を有する。一部の実施形態では、改善されたＢＭＰ種レベル及び／またはＧｌｃＳｐｈレベルは、健康な対照と比較して、５％未満の差を有する。
一部の実施形態では、前記方法はさらに、１つまたは複数の処置後試験試料のうちの少なくとも１つにおいて測定された１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈのうちの少なくとも１つの存在量が、健康な対照の対応する基準値とおよそ同じであるときに、対象が処置に応答していると決定することを含む。
一部の実施形態では、試験もしくは基準試料または１つもしくは複数の基準値は、細胞、組織、全血、血漿、血清、脳脊髄液、間質液、痰、尿、大便、気管支肺胞上皮洗浄液、リンパ液、精液、母液、羊水、またはそれらの組合せを含むか、またはそれに関する。一部の実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＢＭＤＭ、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、血液細胞、赤血球、白血球、神経細胞、ミクログリア細胞、脳細胞、大脳皮質細胞、脊髄細胞、骨髄細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脾細胞、肺細胞、眼細胞、絨毛膜絨毛細胞、筋細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、心臓細胞、リンパ節細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、細胞は培養細胞である。一部の実施形態では、培養細胞は、ＢＭＤＭまたはＲＰＥ細胞である。
一部の実施形態では、組織は、脳組織、大脳皮質組織、脊髄組織、肝臓組織、腎臓組織、筋肉組織、心臓組織、眼組織、網膜組織、リンパ節、骨髄、皮膚組織、血管組織、肺組織、脾臓組織、心臓弁組織、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、試験及び／または基準試料を細胞及び／または組織から精製し、これは、エンドソーム、リソソーム、細胞外小胞、エキソソーム、マイクロベシクル、またはそれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、１種または複数のＢＭＰ種は、２種以上のＢＭＰ種を含む。一部の実施形態では、１種または複数のＢＭＰ種は、ＢＭＰ（１６：０＿１８：１）、ＢＭＰ（１６：０＿１８：２）、ＢＭＰ（１８：０＿１８：０）、ＢＭＰ（１８：０＿１８：１）、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１）、ＢＭＰ（１６：０＿２０：３）、ＢＭＰ（１８：１＿２０：２）、ＢＭＰ（１８：０＿２０：４）、ＢＭＰ（１６：０＿２２：５）、ＢＭＰ（２０：４＿２０：４）、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）、ＢＭＰ（２０：４＿２０：５）、ＢＭＰ（１８：２＿１８：２）、ＢＭＰ（１６：０＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：０＿１８：２）、ＢＭＰ（１８：０ｅ＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１ｅ＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：３＿２２：５）、ＢＭＰ（２０：４＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：０ｅ＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：２＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：１＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：０＿２２：６）、またはそれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、１種または複数のＢＭＰ種は、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１）、ＢＭＰ（１８：０＿２０：４）、ＢＭＰ（２０：４＿２０：４）、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）、ＢＭＰ（２０：４＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：０＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：３＿２２：５）、またはそれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、試験試料は培養細胞を含み、かつ１種または複数のＢＭＰ種はＢＭＰ（１８：１＿１８：１）を含む。一部の実施形態では、試験試料は、血漿、組織、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び／または脳もしくは肝臓組織を含み、かつ１種または複数のＢＭＰ種はＢＭＰ（２２：６＿２２：６）を含む。一部の実施形態では、試験試料は肝臓組織を含み、かつ１種または複数のＢＭＰ種は、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：３＿２２：５）、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、試験試料はＣＳＦまたは尿を含み、かつ１種または複数のＢＭＰ種はＢＭＰ（２２：６＿２２：６）を含む。一部の実施形態では、試験試料はミクログリアを含み、かつ１種または複数のＢＭＰ種はＢＭＰ（１８：３＿２２：５）を含む。
一部の実施形態では、１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量を、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して測定する。一部の実施形態では、内部ＢＭＰ及び／またはＧｌｃＳｐｈ標準を、ステップ（ａ）において１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量を測定するために、及び／または対応する基準値を決定するために使用する。一部の実施形態では、内部ＢＭＰ及び／またはＧｌｃＳｐｈ標準は、対象及び／または基準対象または基準対象の集団には天然には存在しないＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈを含む。一部の実施形態では、内部ＢＭＰ標準は、ＢＭＰ（１４：０＿１４：０）を含む。一部の実施形態では、内部ＧｌｃＳｐｈ標準は、ジュウテリウム標識ＧｌｃＳｐｈを含む。
一部の実施形態では、対象は、プログラニュリン発現、プロセシング、グリコシル化、細胞取り込み、輸送、及び／または機能に関連する障害を有するか、またはそれを発症するリスクがある。一部の実施形態では、対象及び／または基準対象もしくは基準対象の集団は、プログラニュリンのレベルの低下及び／またはプログラニュリンのレベルの低下に関連する障害を有し、かつ試験試料は候補化合物（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質）と接触している。一部の実施形態では、対象及び／または基準対象もしくは基準対象の集団は、プログラニュリンのレベルの低下に関連する障害の１つまたは複数の徴候または症状を有する。一部の実施形態では、対象及び／または基準対象もしくは基準対象の集団は、グラニュリン（ＧＲＮ）遺伝子において変異を有する。一部の実施形態では、ＧＲＮ遺伝子における変異は、プログラニュリン発現及び／または活性を低下させる。一部の実施形態では、対象は、アテローム性動脈硬化症、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病１、２、または３型）、またはＡＭＤを有するか、またはそれを発症するリスクがある。一部の実施形態では、対象は、ＴＤＰ－４３に関連する障害（例えば、ＡＤまたはＡＬＳ）を有するか、またはそれを発症するリスクがある。
一部の実施形態では、対象及び／または基準対象は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、またはブタである。
別の態様では、本開示は、対象においてプログラニュリン変異体レベルをモニタリングするためのキットを提供する。一部の実施形態では、前記キットは、対象から得られた試験試料及び／または基準対象もしくは基準対象の集団から得られた基準試料において１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量を測定するためのＢＭＰ及び／またはＧｌｃＳｐｈ標準を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ及び／またはＧｌｃＳｐｈ標準は、対象及び／または基準対象に天然には存在しないＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ標準は、ＢＭＰ（１４：０＿１４：０）を含む。一部の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈ標準は、ジュウテリウム標識ＧｌｃＳｐｈである。
一部の実施形態では、キットはさらに、対象及び／または基準対象から試料を得る、試料をプロセシングする、１種または複数のＢＭＰ種の存在量を測定する、ＧｌｃＳｐｈの存在量を測定する、またはそれらの組合せのための試薬を含む。一部の実施形態では、キットはさらに、取扱説明書を含む。
詳細な説明
Ｉ．序文
プログラニュリンのレベルを上昇させることは、特に対象のプログラニュリンレベルが低下している場合に、多くの疾患を処置するために有用であり得る。本発明者らは、野生型プログラニュリンのＣ末端が、ＣＨＯ細胞で発現される場合に切断されていて、そのことがソルチリン結合の障害をもたらすことを発見した。ソルチリンはプログラニュリンに直接的に結合して、細胞リソソームへのプログラニュリンの取り込み及び輸送に関係する。この切断を減少させるために、本発明者らは、Ｃ末端にアミノ酸改変を有するプログラニュリン変異体、さらには、Ｆｃポリペプチドに連結した１つまたは複数のプログラニュリン変異体を含む融合タンパク質を開発した。具体的には、本明細書に記載のある特定の変異体は、野生型プログラニュリンと比較して、野生型プログラニュリンのＣ末端のＱＬＬ配列中に１つまたは複数のアミノ酸置換を有するか、またはＣ末端に付加された追加のアミノ酸を有する。重要なことに、これらのプログラニュリン変異体は、ソルチリン結合を維持し得る。したがって、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質は、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ）、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、ＡＭＤ、またはプログラニュリン関連障害を含む、そのような疾患を処置するために適切である。
Ｉ．序文
プログラニュリンのレベルを上昇させることは、特に対象のプログラニュリンレベルが低下している場合に、多くの疾患を処置するために有用であり得る。本発明者らは、野生型プログラニュリンのＣ末端が、ＣＨＯ細胞で発現される場合に切断されていて、そのことがソルチリン結合の障害をもたらすことを発見した。ソルチリンはプログラニュリンに直接的に結合して、細胞リソソームへのプログラニュリンの取り込み及び輸送に関係する。この切断を減少させるために、本発明者らは、Ｃ末端にアミノ酸改変を有するプログラニュリン変異体、さらには、Ｆｃポリペプチドに連結した１つまたは複数のプログラニュリン変異体を含む融合タンパク質を開発した。具体的には、本明細書に記載のある特定の変異体は、野生型プログラニュリンと比較して、野生型プログラニュリンのＣ末端のＱＬＬ配列中に１つまたは複数のアミノ酸置換を有するか、またはＣ末端に付加された追加のアミノ酸を有する。重要なことに、これらのプログラニュリン変異体は、ソルチリン結合を維持し得る。したがって、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質は、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ）、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、ＡＭＤ、またはプログラニュリン関連障害を含む、そのような疾患を処置するために適切である。
これらのプログラニュリン変異体の開発に加えて、本発明者らは、Ｆｃ分子に融合したプログラニュリン変異体を含有する融合タンパク質も開発した。場合によっては、融合タンパク質は、二量体Ｆｃポリペプチドを含み、その際、Ｆｃポリペプチドモノマーの少なくとも一方は、プログラニュリン変異体に連結している。Ｆｃポリペプチドは、プログラニュリンレベルを上昇させることができ、場合によっては、追加の機能特性をタンパク質に付与するように改変することができる。
本発明者らは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過してのプログラニュリンまたはその変異体の送達を促進する融合タンパク質も開発した。これらのタンパク質は、二量体を形成するＦｃポリペプチド及び改変Ｆｃポリペプチドと、Ｆｃ領域及び／または改変Ｆｃ領域に連結しているプログラニュリンまたはその変異体とを含む。改変Ｆｃ領域は、ＴｆＲなどのＢＢＢ受容体に特異的に結合し得る。対象に投与されると、融合タンパク質は、ＢＢＢを形成する内皮上に存在するＴｆＲ受容体に結合する。融合タンパク質は、ＢＢＢを通過して経細胞輸送され得、したがって、脳におけるその濃度を、例えば、と比較して上昇させる。
プログラニュリン（ＰＧＲＮ）（プロエピセリン及びアクログラニンとしても公知）は、遺伝子ＧＲＮによりコードされるシステインリッチなタンパク質であり、ヒト染色体１７ｑ２１に位置する。プログラニュリンは、リソソームタンパク質、さらには、それぞれ約６０アミノ酸長である保存グラニュリンペプチドの７．５回タンデムリピートからなる分泌タンパク質であり、かつ様々な細胞外プロテアーゼ（例えば、エラスターゼ）及びリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシンＬ）による切断により放出され得る（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（６）：３２５－３３３，２０１７）。概して、プログラニュリンは、先天免疫の制御における細胞自律的及び非細胞自律的役割の両方、さらには、リソソームの機能の役割を果たすと考えられ、その際、様々なカテプシン及び他のヒドロラーゼの活性及びレベルを調節する（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．、前出）。プログラニュリンは、神経栄養機能も有し、神経突起伸展及びニューロン生存を促進する（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．、前出）。
ＩＩ．定義
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、内容が明らかに別段に指定していない限り、複数の言及も含む。したがって、例えば、「１つのポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、２つ以上のそのような分子を含み得る、などである。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、内容が明らかに別段に指定していない限り、複数の言及も含む。したがって、例えば、「１つのポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、２つ以上のそのような分子を含み得る、などである。
本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、数値または範囲において指定された量を修飾するために使用される場合、その数値、さらには、当業者に公知の値から合理的な偏差、例えば±２０％、±１０％、または±５％が、挙げられている値の意図されている意味の範囲内であることを示す。
「プログラニュリン」または「ＰＲＧＮ」は、遺伝子ＧＲＮによりコードされるシステインリッチなリソソームタンパク質を指す。プログラニュリンは、ヒトプログラニュリン配列、例えば、配列番号１または２の配列を含んでよい。プログラニュリンは、配列番号１の配列を含んでよく、その際、最初の１７のアミノ酸はシグナルペプチドを示す。プログラニュリンは、成熟プログラニュリンを含んでよく、その際、１７アミノ酸シグナルペプチドは切断されている。成熟プログラニュリンは、配列番号２の配列を含んでよい。プログラニュリンは、シグナルペプチドを含む形態か、または成熟形態かのいずれかでの非ヒト種、例えば、マウス（アクセッション番号ＮＰ＿０３２２０１．２）、ラット（ＮＰ＿０５８８０９．２またはＮＰ＿００１１３９３１４．１）、及びチンパンジー（ＸＰ＿０１６７８７１４４．１またはＸＰ＿０１６７８７１４５．１）からの配列を含んでよい。
「プログラニュリン変異体」または「ＰＲＧＮ変異体」は、野生型プログラニュリンの配列変異体を指す。プログラニュリン変異体は、野生型プログラニュリンの機能と同様か、または実質的に同じ機能を有することができ、例えば、プログラニュリン変異体も、ソルチリンまたはプロサポシンに結合し、様々なリソソームタンパク質（例えば、カテプシン）の活性及びレベルを調節し、神経突起伸展及びニューロン生存、及び／または本明細書に記載の任意の他の機能を促進する。
「プログラニュリン関連障害」という用語は、発現、プロセシング、グリコシル化、細胞取り込み、輸送、及び／または機能を含む、プログラニュリンに関する任意の病的状態を指す。「プログラニュリンのレベルの低下に関連する障害」という用語は、細胞、組織、及び／または対象内での正常な生理学的機能を可能にするには不十分である（すなわち、可能にするには低すぎる）プログラニュリンのレベルから直接的または間接的に生じる任意の病的状態、さらには、そのような状態の前兆を指す。例えば、プログラニュリン関連障害は、プログラニュリン遺伝子（ＧＲＮ）における変異が原因であり得るか、またはそれと関連し得る。一部の実施形態では、プログラニュリン関連障害は、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ）またはリソソーム貯蔵障害である。
「プログラニュリンレベル」という用語は、対象か、または試料（例えば、対象から得られた試料）のいずれかに存在するプログラニュリンの量、濃度、及び／または活性レベルを指す。プログラニュリンレベルは、存在するプログラニュリンの絶対的な量、濃度、及び／または活性レベルを指し得るか、または相対的な量、濃度、及び／または活性レベルを指し得る。この用語はまた、存在するプログラニュリン及び／またはプログラニュリンｍＲＮＡ（例えば、ＧＲＮ遺伝子から発現される）の量または濃度を指す。
「骨髄由来マクロファージ」または「ＢＭＤＭ」という用語は、哺乳類骨髄（例えば、対象から得られた骨髄）からインビトロで生成されるか、または誘導されるマクロファージ細胞を指す。非限定的例として、ＢＭＤＭは、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）などのサイトカインの存在下で未分化骨髄細胞を培養することにより生成することができる。
「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」は、本開示の文脈で使用される場合、トランスフェリン受容体タンパク質１を指す。ヒトトランスフェリン受容体１ポリペプチド配列は、配列番号１０９において記述される。他の種からのトランスフェリン受容体タンパク質１配列も公知である（例えば、チンパンジー、アクセッション番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１；アカゲザル、ＮＰ＿００１２４４２３２．１；イヌ、ＮＰ＿００１００３１１１．１；ウシ、ＮＰ＿００１１９３５０６．１；マウス、ＮＰ＿０３５７６８．１；ラット、ＮＰ＿０７３２０３．１；及びニワトリ、ＮＰ＿９９０５８７．１）。「トランスフェリン受容体」という用語は、トランスフェリン受容体タンパク質１染色体遺伝子座にある遺伝子によりコードされる例示的な基準配列、例えば、ヒト配列の対立遺伝子変異型も包含する。全長トランスフェリン受容体タンパク質は、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域、及び大きい細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、３つのドメイン：プロテアーゼ様ドメイン、らせんドメイン、及び頂端ドメインにより特徴づけられる。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、構造ドメインとしてＩｇフォールドにより特徴づけられる天然に存在する免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのＣ末端領域を指す。Ｆｃポリペプチドは、少なくともＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインを含む定常領域配列を含み、かつヒンジ領域の少なくとも一部を含んでよい。一般に、Ｆｃポリペプチドは可変領域を含まない。
「改変Ｆｃポリペプチド」は、野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較した場合に少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失、または挿入を有するが、天然ＦｃポリペプチドのＩｇフォールドまたは構造全体を維持しているＦｃポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃポリペプチド二量体」という用語は、２つのＦｃポリペプチドの二量体を指す。一部の実施形態では、２つのＦｃポリペプチドは、２つのＣＨ３ドメインの間での相互作用により二量体化する。ヒンジ領域またはヒンジ領域の一部が２つのＦｃポリペプチド中に存在するならば、１つまたは複数のジスルフィド結合が、２つの二量体化Ｆｃポリペプチドのヒンジ領域間でも形成し得る。
「改変Ｆｃポリペプチド二量体」は、少なくとも１つのＦｃポリペプチドが、野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較した場合に少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失、または挿入を有する改変Ｆｃポリペプチドである、２つのＦｃポリペプチドの二量体を指す。例えば、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＴｆＲに特異的に結合し、かつ野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較した場合に少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失、または挿入を有する少なくとも１つの改変Ｆｃポリペプチドを有するものであってよい。
「ＣＨ３ドメイン」及び「ＣＨ２ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン定常領域ドメインポリペプチドを指す。本出願の目的では、ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによりナンバリングされた場合に、およそ３４１位からおよそ４４７位のアミノ酸のセグメントを指し、かつＣＨ２ドメインポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによりナンバリングされた場合に、およそ２３１位からおよそ３４０位のアミノ酸のセグメントを指し、かつヒンジ領域配列を含まない。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）ナンバリングスキームによりナンバリングされてもよく、その際、ＩＭＧＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃチャートナンバリング（ＩＭＧＴウェブサイト）によれば、ＣＨ２ドメインナンバリングは１～１１０であり、かつＣＨ３ドメインナンバリングは１～１０７である。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部である。Ｆｃ領域は、ＥＵナンバリングスキームによりナンバリングされた場合に、およそ２３１位からおよそ４４７位のアミノ酸のセグメントを指すが、本明細書で使用される場合、抗体のヒンジ領域の少なくとも一部を含んでよい。例示的なヒンジ領域配列は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号８８）である。
ＣＨ３またはＣＨ２ドメインに関する「野生型」、「天然」、及び「天然に存在する」という用語は、天然に生じる配列を有するドメインを指すために本明細書において使用される。
本開示の文脈では、ミュータントポリペプチドまたはミュータントポリヌクレオチドに関する「ミュータント」という用語は、「変異体」と互換的に使用される。所与の野生型ＣＨ３またはＣＨ２ドメイン基準配列に対する変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異型を含んでよい。「非天然に」生じるＣＨ３またはＣＨ２ドメインは、細胞中に天然に存在せず、かつ遺伝子改変により、例えば、天然ＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインポリヌクレオチドまたはポリペプチドの遺伝子工学技術または変異誘発技術を使用して生成される変異体またはミュータントドメインを指す。「変異体」は、野生型に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含む任意のドメインを含む。変異には、置換、挿入、及び欠失が含まれ得る。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、さらには天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。
天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされるもの、さらには、後で改変されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタマート及びＯ－ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を維持している。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
天然に存在するα－アミノ酸には、限定ではないが、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びそれらの組合せが含まれる。天然に存在するα－アミノ酸の立体異性体には、限定ではないが、Ｄ－アラニン（Ｄ－Ａｌａ）、Ｄ－システイン（Ｄ－Ｃｙｓ）、Ｄ－アスパラギン酸（Ｄ－Ａｓｐ）、Ｄ－グルタミン酸（Ｄ－Ｇｌｕ）、Ｄ－フェニルアラニン（Ｄ－Ｐｈｅ）、Ｄ－ヒスチジン（Ｄ－Ｈｉｓ）、Ｄ－イソロイシン（Ｄ－Ｉｌｅ）、Ｄ－アルギニン（Ｄ－Ａｒｇ）、Ｄ－リシン（Ｄ－Ｌｙｓ）、Ｄ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）、Ｄ－メチオニン（Ｄ－Ｍｅｔ）、Ｄ－アスパラギン（Ｄ－Ａｓｎ）、Ｄ－プロリン（Ｄ－Ｐｒｏ）、Ｄ－グルタミン（Ｄ－Ｇｌｎ）、Ｄ－セリン（Ｄ－Ｓｅｒ）、Ｄ－トレオニン（Ｄ－Ｔｈｒ）、Ｄ－バリン（Ｄ－Ｖａｌ）、Ｄ－トリプトファン（Ｄ－Ｔｒｐ）、Ｄ－チロシン（Ｄ－Ｔｙｒ）、及びそれらの組合せが含まれる。
アミノ酸は本明細書において、それらの一般に公知の３文字記号によっても、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号によっても言及され得る。
「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は本明細書において、一本鎖中のアミノ酸残基のポリマーに言及するために互換的に使用される。この用語は、１個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、さらには、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。アミノ酸ポリマーは、もっぱらＬ－アミノ酸、もっぱらＤ－アミノ酸、またはＬ及びＤアミノ酸の混合物を含んでよい。
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、一本鎖ポリペプチドのポリペプチドまたは二量体（すなわち、２つ）または多量体（すなわち、３つ以上）のいずれかを指す。タンパク質の一本鎖ポリペプチドは、共有結合、例えば、ジスルフィド結合により、または非共有結合性相互作用により接続していてよい。
「保存的置換」、「保存的変異」、または「保存的改変変異体」という用語は、同様の特徴を有すると分類され得る別のアミノ酸でのアミノ酸置換をもたらす改変形態を指す。この手法で定義される保存的アミノ酸基のカテゴリーの例には、Ｇｌｕ（グルタミン酸またはＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸またはＤ）、Ａｓｎ（アスパラギンまたはＮ）、Ｇｌｎ（グルタミンまたはＱ）、Ｌｙｓ（リシンまたはＫ）、Ａｒｇ（アルギニンまたはＲ）、及びＨｉｓ（ヒスチジンまたはＨ）を含む「荷電／極性基」；Ｐｈｅ（フェニルアラニンまたはＦ）、Ｔｙｒ（チロシンまたはＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファンまたはＷ）、及び（ヒスチジンまたはＨ）を含む「芳香族基」；ならびにＧｌｙ（グリシンまたはＧ）、Ａｌａ（アラニンまたはＡ）、Ｖａｌ（バリンまたはＶ）、Ｌｅｕ（ロイシンまたはＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシンまたはＩ）、Ｍｅｔ（メチオニンまたはＭ）、Ｓｅｒ（セリンまたはＳ）、Ｔｈｒ（トレオニンまたはＴ）、及びＣｙｓ（システインまたはＣ）を含む「脂肪族基」が含まれ得る。各グループの中で、サブグループも同定することができる。例えば、荷電または極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓを含む「正に荷電したサブグループ」；Ｇｌｕ及びＡｓｐを含む「負に荷電したサブグループ」；ならびにＡｓｎ及びＧｌｎを含む「極性サブグループ」を含むサブグループに細分することができる。別の例では、芳香族または環式基は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ及びＴｒｐを含む「窒素環サブグループ」；ならびにＰｈｅ及びＴｙｒを含む「フェニルサブグループ」を含むサブグループに細分することができる。さらに別の例では、脂肪族基は、サブグループ、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、及びＡｌａを含む「脂肪族非極性サブグループ」；ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＣｙｓを含む「脂肪族弱極性サブグループ」に細分することができる。保存的変異のカテゴリーの例には、これらに限定されないが：正電荷が維持され得るように、ＡｒｇからＬｙｓ、またはその逆；負電荷が維持され得るように、ＡｓｐからＧｌｕ、またはその逆；遊離－ＯＨが維持され得るように、ＴｈｒからＳｅｒ、またはその逆；及び遊離－ＮＨ２が維持され得るように、ＡｓｎからＧｌｎ、またはその逆など、上のサブグループ内でのアミノ酸のアミノ酸置換が含まれる。一部の実施形態では、天然に存在する疎水性アミノ酸は、疎水性を保存するために、例えば、活性部位において、疎水性アミノ酸で置換される。
２つ以上のポリペプチド配列の文脈における「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、配列比較アルゴリズムを使用して、または手動のアラインメント及び外観検査により測定された場合に、比較ウィンドウ、または指名領域にわたる最大対応のために比較し、アラインさせた場合に、同じであるか、または特定の領域にわたって同一であるアミノ酸残基の特定のパーセンテージ、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％またはそれ以上を有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。
ポリペプチドの配列比較では、典型的には、１つのアミノ酸配列が、基準配列としての役割を果たし、それに対して、候補配列が比較される。アラインメントは、当業者が利用可能な様々な方法、例えば、目視によるアラインメントを使用して、または公知のアルゴリズムを使用する公共利用可能なソフトウェアを使用して最大アラインメントを達成することにより実行することができる。そのようなプログラムには、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が含まれる。最大アラインメントを達成するためにアラインメントで使用されるパラメーターは、当業者により決定され得る。本出願の目的でのポリペプチド配列の配列比較では、２つのタンパク質配列をデフォルトのパラメーターでアラインさせるためにＢＬＡＳＴＰアルゴリズム標準タンパク質ＢＬＡＳＴを使用する。
「に対応する」、「を参照して決定された」、または「を参照してナンバリングされた」という用語は、ポリペプチド配列中の所与のアミノ酸残基を同定する文脈において使用される場合、所与のアミノ酸配列が基準配列と最大にアラインされて比較された場合の特定の基準配列の残基の位置を指す。したがって、例えば、改変Ｆｃポリペプチド中のアミノ酸残基が、配列番号６１中のアミノ酸「に対応する」のは、その残基が、配列番号６１と最適にアラインさせた場合に配列番号６１中のアミノ酸とアラインするときである。基準配列とアラインさせるポリペプチドは、基準配列と同じ長さである必要はない。
「結合親和性」は、本明細書で使用される場合、２つの分子、例えば、ポリペプチド上の単一の結合部位と、それが結合する標的、例えば、トランスフェリン受容体との間の非共有結合性相互作用の強度を指す。したがって、例えば、この用語は、別段に示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、ポリペプチドとその標的との間の１：１相互作用を指し得る。結合親和性は、会合速度定数（ｋａ、ｔｉｍｅ－１Ｍ－１）で割った解離速度定数（ｋｄ、ｔｉｍｅ－１）を指す平衡解離定数（ＫＤ）を測定することにより定量化することができる。ＫＤは、例えば、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム；ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）などの結合平衡除外アッセイ；及びバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームを使用）を使用して、複合体形成及び解離のキネティクスを測定することにより決定することができる。本明細書で使用される場合、「結合親和性」には、ポリペプチドとその標的との間の１：１相互作用を反映するものなどの正規の結合親和性だけではなく、ＫＤがそのために計算されてアビド結合（ａｖｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）を反映し得る見掛けの親和性も含まれる。
標的、例えば、トランスフェリン受容体に「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という語句は、本明細書に記載のとおりのトランスフェリン受容体結合改変Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドに関する場合、構造的に異なる標的、例えば、トランスフェリン受容体ファミリーではない標的に結合するよりも高い親和性、高い結合活性、及び／または長い期間で、そのポリペプチドが標的に結合する結合反応を指す。典型的な実施形態では、ポリペプチドは、同じ親和性アッセイ条件下でアッセイされた場合に、関連しない標的と比較して、トランスフェリン受容体について少なくとも５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、またはそれよりも高い親和性を有する。特定の標的（例えば、ＴｆＲ）「に特異的に結合すること」、「に特異的に結合する」、または「について特異的である」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、結合する標的について、例えば、１０－４Ｍまたはそれ以下、例えば、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍの平衡解離定数ＫＤを有する分子により示され得る。一部の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、複数の種のうちで保存されている（例えば、複数の種のうちで構造的に保存されている）、例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で保存されている（例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で構造的に保存されている）トランスフェリン受容体上のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ヒトトランスフェリン受容体に排他的に結合し得る。
「処置」、「処置すること」などという用語は本明細書において、所望の薬理学的及び／または生理的作用を得ることを一般に意味するために使用される。「処置すること」または「処置」は、減退、寛解、患者の生存の向上、生存時間もしくは率の上昇、症状の減少もしくは障害を患者にとってより許容可能なものとすること、変性もしくは衰退の速度を減速させること、または患者の身体的もしくは心理的健康を改善することなどの任意の客観的または主観的パラメーターを含めて、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ、ＮＣＬ、ＮＰＡ、ＮＰＢ、ＮＰＣ、Ｃ９ＯＲＦ７２関連ＡＬＳ／ＦＴＤ、孤発性ＡＬＳ、ＡＤ、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病１、２、または３型）、及びパーキンソン病）、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、ＡＭＤ、及びプログラニュリン関連障害を含む疾患の処置または寛解の成功の任意の兆候を指す。症状の処置または寛解は、客観的または主観的パラメーターに基づき得る。処置の作用は、処置を受けていない個体もしくは個体のプールと、または処置前もしくは処置中の異なる時点での同じ患者と比較することができる。
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用される場合、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、及びモルモット）、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、及び他の哺乳類種を含む哺乳類を指す。一実施形態では、患者はヒトである。
「薬学的に許容される添加剤」という用語は、これらに限定されないが、緩衝剤、担体、または防腐剤など、ヒトまたは動物において使用するために生物学的または薬理学的に適合性である非医薬品活性成分を指す。
本明細書で使用される場合、作用物質の「治療量」または「治療有効量」は、対象において疾患の症状を処置する作用物質の量である。
「投与する」という用語は、作用物質、化合物、または組成物を生物学的作用の所望の部位に送達する方法を指す。これらの方法には、これらに限定されないが、局所送達、非経口送達、静脈内送達、皮内送達、筋肉内送達、髄腔内送達、結腸送達、直腸送達、または腹腔内送達が含まれる。一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドを静脈内投与する。
ＩＩＩ．プログラニュリン補充療法
一部の態様では、プログラニュリン変異体及びそれを含む融合タンパク質を、本明細書において記載する。本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｆｃポリペプチド二量体及びプログラニュリン変異体を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質はさらに、第２のプログラニュリンまたはその変異体（例えば、野生型プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体）を含む。Ｆｃポリペプチド二量体中のＦｃポリペプチドは、改変（例えば、ヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変）を含んでもよいし、または野生型Ｆｃポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチド二量体中の一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲへの結合をもたらす改変を含んでもよい。Ｆｃポリペプチド二量体中の一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドであってもよい。プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、Ｎ末端またはＣ末端でＦｃポリペプチド（例えば、野生型ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）に接続していてよい。一部の実施形態では、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、直接的に（例えば、ペプチド結合を介して）、またはリンカーにより、Ｆｃポリペプチド（例えば、野生型ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）に接続していてよい。さらなる実施形態では、ヒンジ領域またはその一部が、Ｆｃポリペプチド（例えば、野生型ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）のＮ末端に存在してもよい。ヒンジ領域またはその一部が存在する場合、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、直接的に、またはリンカーによりヒンジ領域またはその一部のＮ末端に接続していてよい。
一部の態様では、プログラニュリン変異体及びそれを含む融合タンパク質を、本明細書において記載する。本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｆｃポリペプチド二量体及びプログラニュリン変異体を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質はさらに、第２のプログラニュリンまたはその変異体（例えば、野生型プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体）を含む。Ｆｃポリペプチド二量体中のＦｃポリペプチドは、改変（例えば、ヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変）を含んでもよいし、または野生型Ｆｃポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチド二量体中の一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲへの結合をもたらす改変を含んでもよい。Ｆｃポリペプチド二量体中の一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドであってもよい。プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、Ｎ末端またはＣ末端でＦｃポリペプチド（例えば、野生型ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）に接続していてよい。一部の実施形態では、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、直接的に（例えば、ペプチド結合を介して）、またはリンカーにより、Ｆｃポリペプチド（例えば、野生型ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）に接続していてよい。さらなる実施形態では、ヒンジ領域またはその一部が、Ｆｃポリペプチド（例えば、野生型ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）のＮ末端に存在してもよい。ヒンジ領域またはその一部が存在する場合、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、直接的に、またはリンカーによりヒンジ領域またはその一部のＮ末端に接続していてよい。
神経変性疾患では、プログラニュリンが不足していることがある。ＦＴＤで、さらには、ゴーシェ病及びＡＤなどの他の疾患では、プログラニュリンが不足していることがある。融合タンパク質に組み込まれたプログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、ソルチリンまたはプロサポシンに結合し得る（例えば、ソルチリンに結合し得る）。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在するプログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドと接続していない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも２５％を維持する。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在するプログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドと接続していない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも１０％、または少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％）を維持する。
一部の実施形態では、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドとの融合は、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体の発現及び／または活性を低下させない。
ＩＶ．プログラニュリン変異体
野生型プログラニュリンのＣ末端にアミノ酸改変または付加を有するプログラニュリン変異体を、本明細書において提供する。プログラニュリン変異体は、成熟野生型プログラニュリン（例えば、配列番号２）に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）、ならびに野生型プログラニュリンのＣ末端にアミノ酸改変または付加を有する野生型プログラニュリンの機能性変異体である。
野生型プログラニュリンのＣ末端にアミノ酸改変または付加を有するプログラニュリン変異体を、本明細書において提供する。プログラニュリン変異体は、成熟野生型プログラニュリン（例えば、配列番号２）に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）、ならびに野生型プログラニュリンのＣ末端にアミノ酸改変または付加を有する野生型プログラニュリンの機能性変異体である。
一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、プログラニュリン変異体のＣ末端の最後の３つのアミノ酸がＱＬＬではないように、野生型プログラニュリンのＣ末端に改変を含む。例えば、プログラニュリン変異体は、配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有し得、その際、配列番号２の残基５７４～５７６に対応する位置は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３により定義されるアミノ酸配列を有し、ただし、Ｘ１Ｘ２Ｘ３が合わさってＱＬＬではないことを条件とする。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は配列：
を有し、ここで、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のそれぞれは独立にアミノ酸であり、かつＸ１Ｘ２Ｘ３は合わさってＱＬＬではない。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、またはＶである。ある特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、またはＲである。ある特定の実施形態では、Ｘ３は、Ｌ、Ｙ、またはＰである。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＰＸ２Ｌである。ある特定の実施形態では、ＰＸ２Ｌ中のＸ２は、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、またはＲ（例えば、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、またはＦ）であってよい。例えば、プログラニュリン変異体は、配列番号４～１８のいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＰＨＬ、ＰＫＬ、ＰＤＬ、ＰＥＬ、ＰＳＬ、ＰＴＬ、ＰＮＬ、ＰＱＬ、ＰＧＬ、ＰＰＬ、ＰＡＬ、ＰＹＬ、ＰＶＬ、ＰＩＬ、またはＰＦＬを有する。特に、プログラニュリン変異体は、配列番号１３の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＰＰＬを有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号１３の配列を有する。特に、プログラニュリン変異体は、配列番号１５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＰＹＬを有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号１５の配列を有する。特に、プログラニュリン変異体は、配列番号１７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＰＩＬを有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号１７の配列を有する。特に、プログラニュリン変異体は、配列番号１８の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体はＣ末端にＰＦＬを有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号１８の配列を有する。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３はＱＸ２Ｌである。ある特定の実施形態では、ＱＸ２Ｌ中のＸ２は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｐ、Ｙ、またはＱであり得る。例えば、プログラニュリン変異体は、配列番号１９～２７のいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＱＲＬ、ＱＨＬ、ＱＫＬ、ＱＤＬ、ＱＥＬ、ＱＮＬ、ＱＰＬ、ＱＹＬ、またはＱＱＬを有する。特に、プログラニュリン変異体は、配列番号１９の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＱＲＬを有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号１９の配列を有する。特に、プログラニュリン変異体は、配列番号２０の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＱＨＬを有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号２０の配列を有する。特に、プログラニュリン変異体は、配列番号２７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体はＣ末端にＱＱＬを有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号２７の配列を有する。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＶＸ２Ｌである。ある特定の実施形態では、ＶＸ２Ｌ中のＸ２は、ＶまたはＴであってよい。例えば、プログラニュリン変異体は、配列番号２８及び２９のいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＶＶＬまたはＶＴＬを有する。特に、プログラニュリン変異体は、配列番号２８の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＶＶＬを有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号２８の配列を有する。特に、プログラニュリン変異体は、配列番号２９の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＶＴＬを有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号２９の配列を有する。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、Ｘ１ＩＬである。ある特定の実施形態では、Ｘ１ＩＬ中のＸ１は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｐ、Ｎ、Ｆ、またはＹ（例えば、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、またはＰ）であってよい。例えば、プログラニュリン変異体は、配列番号３０～３３及び１７のいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＲＩＬ、ＨＩＬ、ＫＩＬ、ＥＩＬ、またはＰＩＬを有する。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、Ｘ１ＦＬである。ある特定の実施形態では、Ｘ１ＦＬ中のＸ１は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、またはＰであってよい。例えば、プログラニュリン変異体は、配列番号３４～４５及び１８のいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＲＦＬ、ＨＦＬ、ＫＦＬ、ＤＦＬ、ＥＦＬ、ＳＦＬ、ＴＦＬ、ＮＦＬ、ＱＦＬ、ＬＦＬ、ＦＦＬ、ＹＦＬ、またはＰＦＬを有する。
一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、Ｘ１ＱＬである。ある特定の実施形態では、Ｘ１ＱＬ中のＸ１は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、またはＱであってよい。例えば、プログラニュリン変異体は、配列番号４６～５４及び２７のいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にＲＱＬ、ＨＱＬ、ＫＱＬ、ＤＱＬ、ＥＱＬ、ＮＱＬ、ＬＱＬ、ＦＱＬ、ＹＱＬ、またはＱＱＬを有する。
さらなる実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、Ｘ１Ｘ２Ｌであり、その際、Ｘ２は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、またはＶである。
他の実施形態では、プログラニュリン変異体は、野生型プログラニュリンと比較して、Ｃ末端に追加のアミノ酸を含む。例えば、プログラニュリン変異体は、野生型プログラニュリンのＣ末端に付加されたアミノ酸ＱＬＬまたはＬＲＱＬＬ（配列番号５８）を含んでよい。例えば、プログラニュリン変異体は、配列番号２の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列及び配列番号２の残基５７６に対応する位置に隣接しかつそのＣ末端側にあるＹ１Ｙ２ＱＬＬ（配列番号１３７）により定義される配列を含んでよく、その際、Ｙ１は、Ｌであるか、または存在せず、かつＹ２は、Ｒであるか、または存在しない。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列：
を含む。
一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号５６の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にアミノ酸ＱＬＬＱＬＬ（配列番号５９）を有する。特定の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号５６の配列を有する。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号５７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有してよく、その際、プログラニュリン変異体は、Ｃ末端にアミノ酸ＱＬＬＬＲＱＬＬ（配列番号６０）を有する。特定の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号５７の配列を有する。
本明細書に記載のプログラニュリン変異体（例えば、配列番号３～５７、１１１～１２１、１２７、及び１２８のいずれか１つの配列を有するプログラニュリン変異体は、Ｎ末端またはＣ末端でＦｃポリペプチド（例えば、野生型Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド）に接続していてよい。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドに連結しているプログラニュリン変異体は、配列番号１３、１５、１７、１８、１９、２０、及び２７～２９のいずれか１つから選択される配列を有してよい）。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、直接的に（例えば、ペプチド結合を介して）、またはリンカーによりＦｃポリペプチド（例えば、野生型Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド）に接続していてよい。ヒンジ領域またはその一部がＦｃポリペプチド（例えば、野生型Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド）のＮ末端に存在するならば、プログラニュリン変異体は、直接的に、またはリンカーによりヒンジ領域またはその一部のＮ末端に接続していてよい。
さらに、本明細書に記載のプログラニュリン変異体は、ＣＨＯ細胞から生成することができる。特定の実施形態では、生成されるプログラニュリン変異体のうちの５０％超（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％超）は、Ｃ末端で短縮されていない（例えば、インタクトなまま）。特定の実施形態では、プログラニュリン変異体のうちの５０％超（例えば、５５％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％超）は、野生型プログラニュリン（例えば、ＨＥＫ細胞から生成される野生型プログラニュリン）と比べて１０倍未満（例えば、９倍、８倍、７倍、６倍、または５倍未満）低下したＫＤ値で、ソルチリンに結合し得る。例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、及び／または透析を含む精製スキームにより、プログラニュリン変異体を、プログラニュリン変異体発現細胞を含有する細胞培養培地から精製することができる。
Ｖ．Ｆｃポリペプチド及びその改変
一部の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、プログラニュリン変異体と、二量体中のいずれか一方または両方のＦｃポリペプチドが野生型Ｆｃポリペプチドと比べてアミノ酸改変を含有するＦｃポリペプチド二量体とを含んでよい。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチド（例えば、改変Ｆｃポリペプチド）中のアミノ酸改変は、ＢＢＢ受容体（例えば、ＴｆＲ）へのＦｃポリペプチド二量体の結合をもたらし、二量体中の２つのＦｃポリペプチドのヘテロ二量体化を促進し、エフェクター機能を調節し、血清半減期を延長し、グリコシル化に影響を及ぼし、及び／またはヒトにおける免疫原性を低下させることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質中に存在するＦｃポリペプチドは独立に、対応する野生型Ｆｃポリペプチド（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｆｃポリペプチド）に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。改変Ｆｃポリペプチド（例えば、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）の例及び説明は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開ＷＯ２０１８／１５２３２６において見い出すことができる。
一部の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、プログラニュリン変異体と、二量体中のいずれか一方または両方のＦｃポリペプチドが野生型Ｆｃポリペプチドと比べてアミノ酸改変を含有するＦｃポリペプチド二量体とを含んでよい。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチド（例えば、改変Ｆｃポリペプチド）中のアミノ酸改変は、ＢＢＢ受容体（例えば、ＴｆＲ）へのＦｃポリペプチド二量体の結合をもたらし、二量体中の２つのＦｃポリペプチドのヘテロ二量体化を促進し、エフェクター機能を調節し、血清半減期を延長し、グリコシル化に影響を及ぼし、及び／またはヒトにおける免疫原性を低下させることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質中に存在するＦｃポリペプチドは独立に、対応する野生型Ｆｃポリペプチド（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｆｃポリペプチド）に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。改変Ｆｃポリペプチド（例えば、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド）の例及び説明は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開ＷＯ２０１８／１５２３２６において見い出すことができる。
ＢＢＢ受容体結合のためのＦｃポリペプチド改変
ＢＢＢを通過して輸送され得るプログラニュリン変異体を含む融合タンパク質を、本明細書において提供する。そのようなタンパク質は、ＢＢＢ受容体に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含む。ＢＢＢ受容体は、ＢＢＢ内皮、さらには他の細胞及び組織種上に発現される。一部の実施形態では、ＢＢＢ受容体はＴｆＲである。
ＢＢＢを通過して輸送され得るプログラニュリン変異体を含む融合タンパク質を、本明細書において提供する。そのようなタンパク質は、ＢＢＢ受容体に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含む。ＢＢＢ受容体は、ＢＢＢ内皮、さらには他の細胞及び組織種上に発現される。一部の実施形態では、ＢＢＢ受容体はＴｆＲである。
ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチドに導入されるものを含めて、様々なＦｃ改変において指定されるアミノ酸残基は本明細書では、ＥＵインデックスナンバリングを使用してナンバリングされる。任意のＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドは、本明細書に記載のとおりの１つまたは複数の位置において改変、例えば、アミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、ＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合活性のために改変されるドメインは、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインなどのヒトＩｇ ＣＨ３ドメインである。ＣＨ３ドメインは、任意のＩｇＧサブタイプのもの、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からのものであってもよい。ＩｇＧ１抗体の文脈では、ＣＨ３ドメインは、ＥＵナンバリングスキームによりナンバリングされた場合におよそ３４１位からおよそ４４７位のアミノ酸のセグメントを指す。
一部の実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲの頂端ドメインに結合し、かつＴｆＲへのトランスフェリンの結合を遮断する、または別段に阻害することなくＴｆＲに結合し得る。一部の実施形態では、ＴｆＲへのトランスフェリンの結合は、実質的に阻害されない。一部の実施形態では、ＴｆＲへのトランスフェリンの結合は、約５０％未満（例えば、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）阻害される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在するＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドは、１つもしくは複数、少なくとも１、２、または３つの置換；及び一部の実施形態では、少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０の置換を、ＥＵナンバリングスキームによる２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２９５、２９７、２９８、及び２９９を含むアミノ酸位置に含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在するＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１、２、または３つの置換；及び一部の実施形態では、少なくとも４、５、６、７、８、または９つの置換を、ＥＵナンバリングスキームによる２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、及び２９０を含むアミノ酸位置に含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在するＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１、２、または３つの置換；及び一部の実施形態では、少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０の置換を、ＥＵナンバリングスキームによる２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２９２、２９３、２９４、２９６、及び３００を含むアミノ酸位置に含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在するＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１、２、または３つの置換；及び一部の実施形態では、少なくとも４、５、６、７、８、または９つの置換を、ＥＵナンバリングスキームによる２７２、２７４、２７６、３２２、３２４、３２６、３２９、３３０、及び３３１を含むアミノ酸位置に含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在するＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１、２、または３つの置換；及び一部の実施形態では、少なくとも４、５、６、または７つの置換を、ＥＵナンバリングスキームによる３４５、３４６、３４７、３４９、４３７、４３８、４３９、及び４４０を含むアミノ酸位置に含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在するＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１、２、または３つの置換；及び一部の実施形態では、少なくとも４、５、６、７、８、または９つの置換を、ＥＵナンバリングスキームによるアミノ酸位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１に含む。一部の実施形態では、３８８及び／または４２１位のアミノ酸は、芳香族アミノ酸、例えば、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒである。一部の実施形態では、３８８位のアミノ酸はＴｒｐである。一部の実施形態では、４２１位の芳香族アミノ酸は、ＴｒｐまたはＰｈｅである。追加の実施形態では、ＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドはさらに、１つまたは複数の置換を、ＥＵナンバリングスキームによる３９１、３９２、４１４、４１５、４２４、及び４２６位を含む位置に含む。一部の実施形態では、４１４位は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり；４２４位は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓであり；及び／または４２６位は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙである。追加の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドはさらに、１、２、または３つの置換を、ＥＵナンバリングスキームによる４１４、４２４、及び４２６を含む位置に含む。一部の実施形態では、４１４位は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり；４２４位は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓであり；及び／または４２６位は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙである。
一部の実施形態では、ＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドは、配列番号６８の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、かつ一部の実施形態では、１５０位にＧｌｕ、１５４位にＴｙｒ、１５６位にＴｈｒ、１５７位にＧｌｕ、１５８位にＴｒｐ、１５９位にＡｌａ、１６０位にＡｓｎ、１８３位にＴｈｒ、１８５位にＧｌｕ、１８６位にＧｌｕ、及び１９１位にＰｈｅを有し、その際、各位は配列番号６８を参照してナンバリングされている。特定の実施形態では、ＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドは、配列番号６８の配列を有する。本明細書に記載の融合タンパク質の一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチド二量体中の２つのＦｃポリペプチドの一方は、配列番号６８の配列を有するＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドであってよく、Ｆｃポリペプチド二量体中の他方のＦｃポリペプチドは、野生型Ｆｃポリペプチドの配列（例えば、配列番号６１）を有する。本明細書に記載の融合タンパク質の他の実施形態では、Ｆｃポリペプチド二量体中のＦｃポリペプチドは両方とも、配列番号６８の配列を有するＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドであってよい。
一部の実施形態では、ＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドは、配列番号７８の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、かつ一部の実施形態では、１５０位にＬｅｕ、１５４位にＴｙｒ、１５６位にＴｈｒ、１５７位にＧｌｕ、１５８位にＴｒｐ、１５９位にＳｅｒ、１６０位にＳｅｒ、１８３位にＴｈｒ、１８５位にＧｌｕ、１８６位にＧｌｕ、及び１９１位にＰｈｅを有し、その際、各位は配列番号７８を参照してナンバリングされている。特定の実施形態では、ＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドは、配列番号７８の配列を有する。本明細書に記載の融合タンパク質の一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチド二量体中の２つのＦｃポリペプチドの一方は、配列番号７８の配列を有するＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドであってよく、Ｆｃポリペプチド二量体中の他方のＦｃポリペプチドは、野生型Ｆｃポリペプチド（例えば、配列番号６１）の配列を有してよい。本明細書に記載の融合タンパク質の他の実施形態では、Ｆｃポリペプチド二量体中のＦｃポリペプチドは両方とも、配列番号７８の配列を有するＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体結合Ｆｃポリペプチドであってよい。
ヘテロ二量体化のためのＦｃポリペプチド改変
一部の実施形態では、融合タンパク質中に存在するＦｃポリペプチドは、ヘテロ二量体形成を促進し、かつホモ二量体形成を妨害するノブ及びホール変異を含む。一般に、それらの改変は、突起がキャビティに配置され得、ヘテロ二量体形成を促進し、したがってホモ二量体形成を妨害するように、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの界面に対応するキャビティ（「ホール」）を導入する。第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることにより、突起は構築される。大きなアミノ酸側鎖を、より小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることにより、突起と同一または同様のサイズの補償キャビティを第２のポリペプチドの界面に作製する。一部の実施形態では、そのような追加の変異は、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲへのポリペプチドの結合に対してマイナスの作用を有さない、Ｆｃポリペプチド中の位置にある。
一部の実施形態では、融合タンパク質中に存在するＦｃポリペプチドは、ヘテロ二量体形成を促進し、かつホモ二量体形成を妨害するノブ及びホール変異を含む。一般に、それらの改変は、突起がキャビティに配置され得、ヘテロ二量体形成を促進し、したがってホモ二量体形成を妨害するように、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの界面に対応するキャビティ（「ホール」）を導入する。第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることにより、突起は構築される。大きなアミノ酸側鎖を、より小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることにより、突起と同一または同様のサイズの補償キャビティを第２のポリペプチドの界面に作製する。一部の実施形態では、そのような追加の変異は、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲへのポリペプチドの結合に対してマイナスの作用を有さない、Ｆｃポリペプチド中の位置にある。
二量体化のためのノブ及びホールアプローチの一例示的実施形態では、融合タンパク質中に存在するＦｃポリペプチドの一方の３６６位（ＥＵナンバリングスキームによりナンバリング）が、天然トレオニンの代わりにトリプトファンを含む。二量体中の他方のＦｃポリペプチドは、天然チロシンの代わりに、４０７位（ＥＵナンバリングスキームによりナンバリング）にバリンを有する。他方のＦｃポリペプチドはさらに、３６６位（ＥＵナンバリングスキームによりナンバリング）の天然トレオニンがセリンで置き換えられていて、かつ３６８位（ＥＵナンバリングスキームによりナンバリング）の天然ロイシンがアラニンで置き換えられている置換を含んでよい。したがって、本明細書に記載の融合タンパク質のＦｃポリペプチドの一方は、Ｔ３６６Ｗノブ変異を有し、かつ他方のＦｃポリペプチドは、典型的にはＴ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａホール変異を伴うＹ４０７Ｖ変異を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドを、ヘテロ二量体化のための他の改変、例えば、天然に荷電されているＣＨ３－ＣＨ３界面内の接触残基の静電操作または疎水性パッチ改変を含むように操作することもできる。
例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｔ３６６Ｗノブ変異及び配列番号６４の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する一方のＦｃポリペプチドと、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖホール変異及び配列番号６６の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する他方のＦｃポリペプチドとを有する、Ｆｃポリペプチド二量体を含有し得る。ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチド二量体中の一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドであってよい。特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ｉ）配列番号６６の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号６６を参照してナンバリングされる位置で、１３６位にＳｅｒ、１３８位にＡｌａ、及び１７７位にＶａｌを含む第１のＦｃポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号６９の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号６９を参照してナンバリングされる位置で、１３６位にＴｒｐを含み、かつ一部の実施形態では１５０位にＧｌｕ、１５４位にＴｙｒ、１５６位にＴｈｒ、１５７位にＧｌｕ、１５８位にＴｒｐ、１５９位にＡｌａ、１６０位にＡｓｎ、１８３位にＴｈｒ、１８５位にＧｌｕ、１８６位にＧｌｕ、及び１９１位にＰｈｅを有する第２のＦｃポリペプチドとを有するＦｃポリペプチド二量体を含んでよい。特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ｉ）配列番号６６の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号６６を参照してナンバリングされる位置で、１３６位にＳｅｒ、１３８位にＡｌａ、及び１７７位にＶａｌを含む第１のＦｃポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号７９の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号７９を参照してナンバリングされる位置で、１３６位にＴｒｐを含み、かつ一部の実施形態では、１５０位にＬｅｕ、１５４位にＴｙｒ、１５６位にＴｈｒ、１５７位にＧｌｕ、１５８位にＴｒｐ、１５９位にＳｅｒ、１６０位にＳｅｒ、１８３位にＴｈｒ、１８５位にＧｌｕ、１８６位にＧｌｕ、及び１９１位にＰｈｅを有する第２のＦｃポリペプチドとを有するＦｃポリペプチド二量体を含んでよい。
特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ｉ）配列番号６４の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号６４を参照してナンバリングされる位置で、１３６位にＴｒｐを含む第１のＦｃポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号７１の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号７１を参照してナンバリングされる位置で、１３６位にＳｅｒ、１３８位にＡｌａ、及び１７７位にＶａｌを含み、かつ一部の実施形態では、１５０位にＧｌｕ、１５４位にＴｙｒ、１５６位にＴｈｒ、１５７位にＧｌｕ、１５８位にＴｒｐ、１５９位にＡｌａ、１６０位にＡｓｎ、１８３位にＴｈｒ、１８５位にＧｌｕ、１８６位にＧｌｕ、及び１９１位にＰｈｅを有する第２のＦｃポリペプチドとを含んでよい。特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ｉ）配列番号６４の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号６４を参照してナンバリングされる位置で、１３６位にＴｒｐを含む第１のＦｃポリペプチド二量体と、（ｉｉ）配列番号８１の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号８１を参照してナンバリングされる位置で、１３６位にＳｅｒ、１３８位にＡｌａ、及び１７７位にＶａｌを含み、かつ一部の実施形態では、１５０位にＬｅｕ、１５４位にＴｙｒ、１５６位にＴｈｒ、１５７位にＧｌｕ、１５８位にＴｒｐ、１５９位にＳｅｒ、１６０位にＳｅｒ、１８３位にＴｈｒ、１８５位にＧｌｕ、１８６位にＧｌｕ、及び１９１位にＰｈｅを有する第２のＦｃポリペプチドとを含んでよい。
エフェクター機能を調節するためのＦｃポリペプチド改変
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変を含んでよく、すなわち、エフェクター機能を媒介するエフェクター細胞上に発現されるＦｃ受容体に結合したときに、ある特定の生物学的機能を誘導する能力が低下している。抗体エフェクター機能の例には、これらに限定されないが、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、及びＢ細胞活性化が含まれる。エフェクター機能は、抗体クラスで変化し得る。例えば、天然ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体は、免疫系細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を誘発し得；かつ天然ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４は、免疫細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＰ機能を誘発し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変を含んでよく、すなわち、エフェクター機能を媒介するエフェクター細胞上に発現されるＦｃ受容体に結合したときに、ある特定の生物学的機能を誘導する能力が低下している。抗体エフェクター機能の例には、これらに限定されないが、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、及びＢ細胞活性化が含まれる。エフェクター機能は、抗体クラスで変化し得る。例えば、天然ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体は、免疫系細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を誘発し得；かつ天然ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４は、免疫細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＰ機能を誘発し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる、または除去する改変を含んでよい。エフェクター機能を低下させる例示的なＦｃポリペプチド変異は、これらに限定されないが、ＣＨ２ドメインにおける、例えば、ＥＵナンバリングスキームによる２３４及び２３５位における置換を含む。例えば、一部の実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドが、２３４及び２３５位にアラニン残基を含んでよい。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドがＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換を有してよい。
エフェクター機能を調節する追加のＦｃポリペプチド変異には、これに限定されないが、次が含まれる：３２９位は、プロリンがグリシンもしくはアルギニン、またはＦｃのプロリン３２９とＦｃγ ＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間で形成されるＦｃ／Ｆｃγ受容体界面を破壊するために十分に大きなアミノ酸残基で置換されている変異を有する。追加の例示的な置換には、ＥＵナンバリングスキームによるＳ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＰ３３１Ｓが含まれる。複数の置換、例えば、ＥＵナンバリングスキームによる、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ；ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域のＶ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＥ３１８Ａ；ならびにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３６Ｅが存在してもよい。一部の実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＡＤＣＣを調節する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、ＥＵナンバリングスキームによる２９８、３３３、及び／または３３４位に置換を有してよい。
例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ｉ）配列番号６７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が配列番号６７を参照してナンバリングされる位置で、４位にＡｌａ、５位にＡｌａ、１３６位にＳｅｒ、１３８位にＡｌａ、及び１７７位にＶａｌを含む第１のＦｃポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号７０の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が配列番号７０を参照してナンバリングされる位置で、４位にＡｌａ、５位にＡｌａ、１３６位にＴｒｐを含み、かつ一部の実施形態では、１５０位にＧｌｕ、１５４位にＴｙｒ、１５６位にＴｈｒ、１５７位にＧｌｕ、１５８位にＴｒｐ、１５９位にＡｌａ、１６０位にＡｓｎ、１８３位にＴｈｒ、１８５位にＧｌｕ、１８６位にＧｌｕ、及び１９１位にＰｈｅを有する第２のＦｃポリペプチドとを有するＦｃポリペプチド二量体を含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ｉ）配列番号６７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号６７を参照してナンバリングされる位置で、４位にＡｌａ、５位にＡｌａ、１３６位にＳｅｒ、１３８位にＡｌａ、及び１７７位にＶａｌを含む第１のＦｃポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号８０の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号８０を参照してナンバリングされる位置で、４位にＡｌａ、５位にＡｌａ、１３６位にＴｒｐを含み、かつ一部の実施形態では、１５０位にＬｅｕ、１５４位にＴｙｒ、１５６位にＴｈｒ、１５７位にＧｌｕ、１５８位にＴｒｐ、１５９位にＳｅｒ、１６０位にＳｅｒ、１８３位にＴｈｒ、１８５位にＧｌｕ、１８６位にＧｌｕ、及び１９１位にＰｈｅを有する第２のＦｃポリペプチドとを有するＦｃポリペプチド二量体を含有し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ｉ）配列番号６５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号６５を参照してナンバリングされる位置で、４位にＡｌａ、５位にＡｌａ、及び１３６位にＴｒｐを含む第１のＦｃポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号７２の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号７２を参照してナンバリングされる位置で、４位にＡｌａ、５位にＡｌａ、１３６位にＳｅｒ、１３８位にＡｌａ、及び１７７位にＶａｌを含み、かつ一部の実施形態では、１５０位にＧｌｕ、１５４位にＴｙｒ、１５６位にＴｈｒ、１５７位にＧｌｕ、１５８位にＴｒｐ、１５９位にＡｌａ、１６０位にＡｓｎ、１８３位にＴｈｒ、１８５位にＧｌｕ、１８６位にＧｌｕ、及び１９１位にＰｈｅを有する第２のＦｃポリペプチドとを有するＦｃポリペプチド二量体を含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ｉ）配列番号６５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が配列番号６５を参照してナンバリングされる位置で、４位にＡｌａ、５位にＡｌａ、及び１３６位にＴｒｐを含む第１のＦｃポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号８２の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、その配列が、配列番号８２を参照してナンバリングされる位置で、４位にＡｌａ、５位にＡｌａ、１３６位にＳｅｒ、１３８位にＡｌａ、及び１７７位にＶａｌを含み、かつ一部の実施形態では、１５０位にＬｅｕ、１５４位にＴｙｒ、１５６位にＴｈｒ、１５７位にＧｌｕ、１５８位にＴｒｐ、１５９位にＳｅｒ、１６０位にＳｅｒ、１８３位にＴｈｒ、１８５位にＧｌｕ、１８６位にＧｌｕ、及び１９１位にＰｈｅを含む第２のＦｃポリペプチドとを有するＦｃポリペプチド二量体を含有し得る。
血清半減期を延長するためのＦｃポリペプチド改変
一部の実施形態では、血清半減期を増強する改変を導入してよい。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによりナンバリングされた場合に、２５２位にチロシン、２５４位にトレオニン、及び２５６位にグルタミン酸を含んでよい。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ置換を有してよい。別法では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによりナンバリングされた場合に、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ置換を有してよい。別法では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａ置換を有してよい。
一部の実施形態では、血清半減期を増強する改変を導入してよい。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質中に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによりナンバリングされた場合に、２５２位にチロシン、２５４位にトレオニン、及び２５６位にグルタミン酸を含んでよい。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ置換を有してよい。別法では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵナンバリングスキームによりナンバリングされた場合に、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ置換を有してよい。別法では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａ置換を有してよい。
一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドの一方または両方は、その露出Ｃ末端リシン（例えば、ＥＵナンバリングによる、Ｆｃポリペプチドの４４７位のＬｙｓ残基）を除去されている。Ｃ末端リシン残基は、Ｆｃドメインにおいて高度に保存されていて、タンパク質産生の間に、細胞機構により完全に、または部分的に除去され得る。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチド中のＣ末端リシンの除去は、融合タンパク質の安定性を向上させ得る。
一部の実施形態では、ヒンジ領域（例えば、配列番号８８）またはその一部（例えば、配列番号８９）を、Ｆｃポリペプチドまたは本明細書に記載の改変Ｆｃポリペプチドに接続させることができる。ヒンジ領域は、任意の免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプからのものであってよい。例示的な免疫グロブリンヒンジは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号８８）またはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号８９）などのＩｇＧヒンジ領域である。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＦｃポリペプチドのＮ末端の領域にある。
ＶＩ．プログラニュリンとＦＣポリペプチドとの間の連結
一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーにより、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体に接続している。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合により、またはポリペプチドリンカーによりプログラニュリンまたはプログラニュリン変異体に接続しており、例えば、融合ポリペプチドである。ポリペプチドリンカーは、接続するＦｃポリペプチドに対してプログラニュリンまたはプログラニュリン変異体の回転を許す；及び／またはプロテアーゼによる消化に対する耐性を示すように構成されてよい。ポリペプチドリンカーは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはそれらの組合せを含んでよい。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのアミノ酸を含有する柔軟なリンカーであってよい。そのようなリンカーは、既知のパラメーターを使用して設計され、かつ任意の長さであってよく、かつ任意の長さのリピート単位（例えば、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基のリピート単位）を任意の数で含有してよい。例えば、リンカーは、２、３、４、５、またはそれ以上のＧｌｙ４－Ｓｅｒ（配列番号９０）リピートなどのリピートまたは単一のＧｌｙ４－Ｓｅｒ（配列番号９０）を有してよい。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、例えば、中枢神経系中に存在する酵素により切断可能なプロテアーゼ切断部位を含んでよい。一部の実施形態では、ヒンジ領域（例えば、配列番号８８）またはその一部（例えば、配列番号８９）がＦｃポリペプチドのＮ末端と接続している場合、プログラニュリンまたはその変異体のＣ末端は、ヒンジ領域またはその一部のＮ末端に、ペプチド結合により、またはポリペプチドリンカー（例えば、Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ（配列番号９０）リピートまたは単一のＧｌｙ４－Ｓｅｒ（配列番号９０））により接続していてよい。
一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーにより、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体に接続している。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合により、またはポリペプチドリンカーによりプログラニュリンまたはプログラニュリン変異体に接続しており、例えば、融合ポリペプチドである。ポリペプチドリンカーは、接続するＦｃポリペプチドに対してプログラニュリンまたはプログラニュリン変異体の回転を許す；及び／またはプロテアーゼによる消化に対する耐性を示すように構成されてよい。ポリペプチドリンカーは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはそれらの組合せを含んでよい。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのアミノ酸を含有する柔軟なリンカーであってよい。そのようなリンカーは、既知のパラメーターを使用して設計され、かつ任意の長さであってよく、かつ任意の長さのリピート単位（例えば、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基のリピート単位）を任意の数で含有してよい。例えば、リンカーは、２、３、４、５、またはそれ以上のＧｌｙ４－Ｓｅｒ（配列番号９０）リピートなどのリピートまたは単一のＧｌｙ４－Ｓｅｒ（配列番号９０）を有してよい。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、例えば、中枢神経系中に存在する酵素により切断可能なプロテアーゼ切断部位を含んでよい。一部の実施形態では、ヒンジ領域（例えば、配列番号８８）またはその一部（例えば、配列番号８９）がＦｃポリペプチドのＮ末端と接続している場合、プログラニュリンまたはその変異体のＣ末端は、ヒンジ領域またはその一部のＮ末端に、ペプチド結合により、またはポリペプチドリンカー（例えば、Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ（配列番号９０）リピートまたは単一のＧｌｙ４－Ｓｅｒ（配列番号９０））により接続していてよい。
一部の実施形態では、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、例えば、Ｇｌｙ４－Ｓｅｒリンカー（配列番号９０）または（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）２リンカー（配列番号９１）により、ＦｃポリペプチドのＮ末端に接続している。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ヒンジ配列または一部のヒンジ配列を、リンカーに接続しているか、またはプログラニュリンに直接接続しているＮ末端に含んでよい。
一部の実施形態では、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、例えば、Ｇｌｙ４－Ｓｅｒリンカー（配列番号９０）または（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）２リンカー（配列番号９１）により、ＦｃポリペプチドのＣ末端に接続している。一部の実施形態では、ＦｃポリペプチドのＣ末端は、プログラニュリンに直接接続している。
一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドとプログラニュリンまたはプログラニュリン変異体との間のポリペプチドリンカーは、３～５０、３～２５、３～１０、３～５、３、５、７、１０、２５、または５０）アミノ酸を有し得る。適切なポリペプチドリンカーは当技術分野で公知であり（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９，２０１３に記載のとおり）、例えば、グリシン及びセリンなどの柔軟なアミノ酸残基を含有するポリペプチドリンカーを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ポリグリシンリンカー、例えば、（Ｇｌｙ）ｎ（配列番号１３８）であってよく、ここで、ｎは、１から１０の間の整数である。ある特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、（ＧＳ）ｎ（配列番号１３９）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号１４０）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１３３），（ＧＧＳＧ）ｎ（配列番号１３４）、または（ＳＧＧＧ）ｎ（配列番号１３５）のモチーフ、例えば、複数またはリピートモチーフを含み得、ここで、ｎは、１から１０の間の整数である。他の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、グリシン及びセリン以外のアミノ酸、例えば、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号９４）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号９５）、及びＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号９６）も含有し得る。他の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、硬いポリペプチドリンカーであってもよい。一部の実施形態では、硬いポリペプチドリンカーは、セグメント内（ｉｎｔｒａ－ｓｅｇｍｅｎｔ）水素結合及び／またはセグメント内塩橋により安定化され得るαヘリックス構造を取り入れることができる。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９，２０１３に記載されているとおり、硬いポリペプチドリンカーの例には、これらに限定されないが、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（配列番号１３６）（ここで、ｎは、１から５の間の整数である）、及び（ＸＰ）ｎ（配列番号１４１）（ここで、Ｘは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕであり、かつｎは、１から１０の間の整数である）が含まれる。
一部の実施形態では、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体は、化学的架橋作用物質によりＦｃポリペプチドに接続している。そのようなコンジュゲートは、周知の化学的架橋試薬及びプロトコルを用いて生成することができる。例えば、当業者に公知であり、かつポリペプチドを目的の作用物質と架橋するために有用である多数の化学的架橋作用物質がある。例えば、架橋作用物質は、段階的に分子を連結するために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質をコンジュゲートするために、より特異的なカップリング方法を設計し、それにより、ホモ－タンパク質ポリマーなどの望ましくない副反応の発生を減少させる能力を提供する。広範囲の様々なヘテロ二官能性架橋剤が、当技術分野で公知であり、それには、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはその水溶性類似体Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４－スクシンイミジルオキシカルボニル－ａ－メチル－ａ－（２－ピリジルジチオ）－トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、及びスクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート］ヘキサノアート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）が含まれる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド部分を有する架橋剤は、一般に高い水溶性を有するＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として入手することができる。加えて、連結鎖内にジスルフィド架橋を有する架橋剤を、インビボでのリンカー切断の量を減少させるように、代わりにアルキル誘導体として合成することができる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性及び光反応性架橋剤を含む多くの他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベラート（Ｄｉｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｃｒａｔｅ）（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）及びジメチルピメルイミダート．２ＨＣｌ（ＤＭＰ）が、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、かつビス－［Ｂ－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）及びＮ－スクシンイミジル－６（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート（ＳＡＮＰＡＨ）が、有用な光反応性架橋剤の例である。
ＶＩＩ．例示的な融合タンパク質
一部の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドと；第１のＦｃポリペプチドとＦｃポリペプチド二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質はさらに、第２のプログラニュリンまたはその変異体（例えば、野生型プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体）を含む。一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドであり、かつ／または第２のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドである。一部の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、他方のＦｃポリペプチドとのそのヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、血清半減期を延長する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲへの結合を付与する１つまたは複数の改変を含む。
一部の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドと；第１のＦｃポリペプチドとＦｃポリペプチド二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質はさらに、第２のプログラニュリンまたはその変異体（例えば、野生型プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体）を含む。一部の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドであり、かつ／または第２のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドである。一部の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、他方のＦｃポリペプチドとのそのヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、血清半減期を延長する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲへの結合を付与する１つまたは複数の改変を含む。
他の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖と、ＢＢＢ（例えば、ＴｆＲ）受容体に特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチド、例えば、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含み、第１のポリペプチド鎖中のＦｃポリペプチドと二量体化してＦｃポリペプチド二量体を形成する第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかに接続していてよいプログラニュリン変異体を含む。ある特定の実施形態では、プログラニュリン変異体は、ポリペプチドリンカーにより、第１のポリペプチド鎖のＮ末端またはＣ末端に接続している。ある特定の実施形態では、プログラニュリン変異体は、ポリペプチドリンカーにより第２のポリペプチド鎖のＮ末端またはＣ末端に接続している。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、２つのプログラニュリン変異体を含む。ある特定の実施形態では、第１のプログラニュリン変異体は、第１のポリペプチド鎖のＮ末端に接続しており、かつ第２のプログラニュリン変異体は、第２のポリペプチド鎖のＮ末端に接続している。ある特定の実施形態では、第１のプログラニュリン変異体は、第１のポリペプチド鎖のＮ末端に接続しており、かつ第２のプログラニュリン変異体は、第２のポリペプチド鎖のＣ末端に接続している。ある特定の実施形態では、第１のプログラニュリン変異体は、第１のポリペプチド鎖のＣ末端に接続しており、かつ第２のプログラニュリン変異体は、第２のポリペプチド鎖のＮ末端に接続している。ある特定の実施形態では、第１のプログラニュリン変異体は、第１のポリペプチド鎖のＣ末端に接続しており、かつ第２のプログラニュリン変異体は、第２のポリペプチド鎖のＣ末端に接続している。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、プログラニュリン変異体及び野生型プログラニュリンを含む。ある特定の実施形態では、プログラニュリン変異体は、第１のポリペプチド鎖のＮ末端に接続しており、かつ野生型プログラニュリンは、第２のポリペプチド鎖のＮ末端に接続している。ある特定の実施形態では、プログラニュリン変異体は、第１のポリペプチド鎖のＮ末端に接続しており、かつ野生型プログラニュリンは、第２のポリペプチド鎖のＣ末端に接続している。ある特定の実施形態では、プログラニュリン変異体は、第１のポリペプチド鎖のＣ末端に接続しており、かつ野生型プログラニュリンは、第２のポリペプチド鎖のＮ末端に接続している。ある特定の実施形態では、プログラニュリン変異体は、第１のポリペプチド鎖のＣ末端に接続しており、かつ野生型プログラニュリンは、第２のポリペプチド鎖のＣ末端に接続している。ある特定の実施形態では、野生型プログラニュリンは、第１のポリペプチド鎖のＮ末端に接続しており、かつプログラニュリン変異体は、第２のポリペプチド鎖のＮ末端に接続している。ある特定の実施形態では、野生型プログラニュリンは、第１のポリペプチド鎖のＮ末端に接続しており、かつプログラニュリン変異体は、第２のポリペプチド鎖のＣ末端に接続している。ある特定の実施形態では、野生型プログラニュリンは、第１のポリペプチド鎖のＣ末端に接続しており、かつプログラニュリン変異体は、第２のポリペプチド鎖のＮ末端に接続している。ある特定の実施形態では、野生型プログラニュリンは、第１のポリペプチド鎖のＣ末端に接続しており、かつプログラニュリン変異体は、第２のポリペプチド鎖のＣ末端に接続している。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のソルチリン結合についてのＫＤは、約１００ｎＭ未満（例えば、約９５ｎＭ、９０ｎＭ、８５ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、または４０ｎＭ未満）である。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のソルチリン結合についてのＥＣ５０は、約２５ｎＭ未満（例えば、約２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、または１ｎＭ未満）である。特定の実施形態では、融合タンパク質のソルチリン結合についてのＥＣ５０は、ソルチリン結合において、第１のポリペプチド中に配列番号２を含む融合タンパク質と比べて、約１０倍未満（例えば、約９倍、８倍、７倍、６倍、または５倍未満）の低下を示す。一部の実施形態では、融合タンパク質のソルチリン結合についてのＥＣ５０は、ソルチリン結合において、第１のポリペプチド中に配列番号１０８を含む融合タンパク質と比べて、約１０倍未満（例えば、約９倍、８倍、７倍、６倍、または５倍未満）の低下を示す。ある特定の実施形態では、ＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡにより測定される。ＥＬＩＳＡによりソルチリン結合についてのＥＣ５０を測定するための例示的な方法を、本明細書において記載する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質をＣＨＯ細胞において生成する。特定の実施形態では、融合タンパク質（例えば、ＣＨＯ細胞から生成された融合タンパク質）の５０％超（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％超）は、融合タンパク質のプログラニュリン変異体部分のＣ末端で切断されない。
特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ホール）置換ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換を含む改変Ｆｃポリペプチドに接続しているプログラニュリン変異体を含む第１のポリペプチド鎖と；（ｂ）ＴｆＲに結合し、かつＴ３６６Ｗ（ノブ）置換ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。プログラニュリン変異体は、配列番号４～５４、１１１～１２１、及び１２７～１２８のいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、プログラニュリン変異体の５７４～５７６位が、配列番号４～５４、１１１～１２１、及び１２７～１２８において定義されるとおりである配列を含み得る。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号５６に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、プログラニュリン変異体の５７４～５７９位が配列番号５６において定義されているとおりである配列を含み得る。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、配列番号５７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有し、その際、プログラニュリン変異体の５７４～５８１位が配列番号５７において定義されているとおりである配列を含み得る。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、改変ＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端（例えば、Ｃ末端）に接続していてよい。特定の実施形態では、ヒンジ領域またはその一部は、第１及び第２のポリペプチド鎖中の改変ＦｃポリペプチドのそれぞれのＮ末端に接続している。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号９０）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９１））は、第１のポリペプチド鎖中のプログラニュリン変異体と改変Ｆｃポリペプチドとの間に存在する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号９８の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号９８を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＰｒｏ、８１２位にＩｌｅ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号７５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は配列番号９８の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は配列番号７５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は配列番号９８の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は配列番号１３０の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号９９の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号９９を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＰｒｏ、８１２位にＰｈｅ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号７５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は配列番号９９の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は配列番号７５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は配列番号９９の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は配列番号１３０の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１００の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１００を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＧｌｎ、８１２位にＧｌｎ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号７５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１００の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号７５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１００の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３０の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０１を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＶａｌ、８１２位にＶａｌ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号７５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１０１の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号７５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１０１の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３０の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０２の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０２を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＶａｌ、８１２位にＴｈｒ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号７５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１０２の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号７５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１０２の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３０の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１２３の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１２３を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＰｒｏ、８１２位にＰｒｏ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号７５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２３の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号７５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２３の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３０の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１２４の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１２４を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＰｒｏ、８１２位にＴｙｒ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号７５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２４の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号７５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２４の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３０の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１２５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１２５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＧｌｎ、８１２位にＡｒｇ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号７５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２５の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号７５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２５の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３０の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１２６の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１２６を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＧｌｎ、８１２位にＨｉｓ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号７５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２６の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号７５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２６の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３０の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号９８の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号９８を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＰｒｏ、８１２位にＩｌｅ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号８５の配列に対して少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％の同一性）を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号８５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＬｅｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＳｅｒ、１７０位にＳｅｒ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号９８の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号８５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号９８の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３２の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号９９の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号９９を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＰｒｏ、８１２位にＰｈｅ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号８５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号８５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＬｅｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＳｅｒ、１７０位にＳｅｒ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号９９の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号８５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号９９の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３２の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１００の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１００を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＧｌｎ、８１２位にＧｌｎ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号８５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号８５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＬｅｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＳｅｒ、１７０位にＳｅｒ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１００の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号８５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１００の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３２の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０１の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０１を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＶａｌ、８１２位にＶａｌ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号８５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号８５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＬｅｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＳｅｒ、１７０位にＳｅｒ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１０１の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号８５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１０１の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３２の配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０２の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０２を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１８７位にＶａｌ、８１１位にＶａｌ、８１２位にＴｈｒ、及び８１３位にＬｅｕを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）配列番号８５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号８５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、１６０位にＬｅｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＳｅｒ、１７０位にＳｅｒ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１０２の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号８５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１０２の配列を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３２の配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）ＴｆＲに結合し、かつＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ホール）置換ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖と；（ｂ）Ｔ３６６Ｗ（ノブ）置換ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換を含む改変Ｆｃポリペプチドに接続しているプログラニュリン変異体を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。プログラニュリン変異体は、配列番号３～５７、１１１～１２１、及び１２７～１２８のいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を有し得る。一部の実施形態では、プログラニュリン変異体は、改変ＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端（例えば、Ｃ末端）に接続していてよい。特定の実施形態では、ヒンジ領域またはその一部は、第１及び第２のポリペプチド鎖中の改変ＦｃポリペプチドのそれぞれのＮ末端に接続している。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号９０）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９１））が、第２のポリペプチド鎖中のプログラニュリン変異体と改変Ｆｃポリペプチドとの間に存在する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）配列番号７７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１８７位にＶａｌ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０３の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０３を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、８１１位にＰｒｏ、８１２位にＩｌｅ、及び８１３位にＬｅｕを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）配列番号７７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１８７位にＶａｌ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０４の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０４を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、８１１位にＰｒｏ、８１２位にＰｈｅ、及び８１３位にＬｅｕを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）配列番号７７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１８７位にＶａｌ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、８１１位にＧｌｎ、８１２位にＧｌｎ、及び８１３位にＬｅｕを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）配列番号７７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１８７位にＶａｌ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０６の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０６を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、８１１位にＶａｌ、８１２位にＶａｌ、及び８１３位にＬｅｕを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）配列番号７７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号７７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１６０位にＧｌｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＡｌａ、１７０位にＡｓｎ、１８７位にＶａｌ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、８１１位にＶａｌ、８１２位にＴｈｒ、及び８１３位にＬｅｕを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）配列番号８７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号８７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１６０位にＬｅｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＳｅｒ、１７０位にＳｅｒ、１８７位にＶａｌ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０３の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０３を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、８１１位にＰｒｏ、８１２位にＩｌｅ、及び８１３位にＬｅｕを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）配列番号８７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号８７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１６０位にＬｅｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＳｅｒ、１７０位にＳｅｒ、１８７位にＶａｌ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０４の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０４を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、８１１位にＰｒｏ、８１２位にＰｈｅ、及び８１３位にＬｅｕを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）配列番号８７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号８７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１６０位にＬｅｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＳｅｒ、１７０位にＳｅｒ、１８７位にＶａｌ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０５の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０５を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、８１１位にＧｌｎ、８１２位にＧｌｎ、及び８１３位にＬｅｕを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）配列番号８７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号８７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１６０位にＬｅｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＳｅｒ、１７０位にＳｅｒ、１８７位にＶａｌ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０６の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０６を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、８１１位にＶａｌ、８１２位にＶａｌ、及び８１３位にＬｅｕを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）配列番号８７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その際、その配列が、配列番号８７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＳｅｒ、１４８位にＡｌａ、１６０位にＬｅｕ、１６４位にＴｙｒ、１６６位にＴｈｒ、１６７位にＧｌｕ、１６８位にＴｒｐ、１６９位にＳｅｒ、１７０位にＳｅｒ、１８７位にＶａｌ、１９３位にＴｈｒ、１９５位にＧｌｕ、１９６位にＧｌｕ、及び２０１位にＰｈｅを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）プログラニュリン変異体及び改変Ｆｃポリペプチドを含み、その際、配列番号１０７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％）の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、その配列が、配列番号１０７を参照してナンバリングされる位置で、１４位にＡｌａ、１５位にＡｌａ、１４６位にＴｒｐ、８１１位にＶａｌ、８１２位にＴｈｒ、及び８１３位にＬｅｕを含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
ＶＩＩＩ．結合特性
本明細書に記載の融合タンパク質は、幅広い結合親和性を有し得る。例えば、一部の実施形態では、タンパク質は、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲについて、１ｐＭ～１０μＭ程度の範囲の親和性を有する。一部の実施形態では、ＴｆＲについての親和性は、１ｎＭ～５μＭ、または１０ｎＭ～１μＭの範囲である。
本明細書に記載の融合タンパク質は、幅広い結合親和性を有し得る。例えば、一部の実施形態では、タンパク質は、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲについて、１ｐＭ～１０μＭ程度の範囲の親和性を有する。一部の実施形態では、ＴｆＲについての親和性は、１ｎＭ～５μＭ、または１０ｎＭ～１μＭの範囲である。
ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲへの結合を分析するために結合親和性、結合キネティクス、及び交差反応性を分析するための方法は、当技術分野で公知である。これらの方法には、これらに限定されないが、固相結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）、免疫沈降、表面プラスモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））、結合平衡除外アッセイ（例えば、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ））、及びウェスタンブロット分析が含まれる。一部の実施形態では、ＥＬＩＳＡを使用して、結合親和性及び／または交差反応性を決定する。ＥＬＩＳＡアッセイを実行するための方法は当技術分野で公知であり、下の実施例セクションにおいても記載する。一部の実施形態では、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、結合親和性、結合キネティクス、及び／または交差反応性を決定する。一部の実施形態では、結合平衡除外アッセイを使用して、結合親和性、結合キネティクス、及び／または交差反応性を決定する。一部の実施形態では、バイオレイヤー干渉アッセイを使用して、結合親和性、結合キネティクス、及び／または交差反応性を決定する。
融合タンパク質の作用の評価
インビトロまたはインビボで活性を測定するアッセイを含む様々なアッセイを使用して、プログラニュリンまたはその変異体を含む本明細書に記載の融合タンパク質の活性を評価することができる。実施例において記載されているとおり、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を使用し、かつヒトプログラニュリン及びヒトＦｃに対する抗体を用いて免疫染色して、本明細書に記載の融合タンパク質の細胞取り込みをアッセイすることができる。細胞を本明細書に記載の融合タンパク質（実施例６及び７）で処理した後に、ＧＲＮ変異が原因である細胞作用（例えば、カテプシンＤ活性の増大ならびにＣｔｓｌ、Ｔｍｅｍ１０６ｂ、及びＰｓａｐなどのリソソーム遺伝子のｍＲＮＡレベルの上昇）を再び評価することができる。蛍光プローブ及びｑＰＣＲ技術をこれらのアッセイにおいて使用することができる。最後に、実施例９及び１０に示されているとおり、野生型及び／または遺伝子導入マウスを使用して、本明細書に記載の融合タンパク質の薬物動態特性及び脳取り込みを決定することができる。
インビトロまたはインビボで活性を測定するアッセイを含む様々なアッセイを使用して、プログラニュリンまたはその変異体を含む本明細書に記載の融合タンパク質の活性を評価することができる。実施例において記載されているとおり、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を使用し、かつヒトプログラニュリン及びヒトＦｃに対する抗体を用いて免疫染色して、本明細書に記載の融合タンパク質の細胞取り込みをアッセイすることができる。細胞を本明細書に記載の融合タンパク質（実施例６及び７）で処理した後に、ＧＲＮ変異が原因である細胞作用（例えば、カテプシンＤ活性の増大ならびにＣｔｓｌ、Ｔｍｅｍ１０６ｂ、及びＰｓａｐなどのリソソーム遺伝子のｍＲＮＡレベルの上昇）を再び評価することができる。蛍光プローブ及びｑＰＣＲ技術をこれらのアッセイにおいて使用することができる。最後に、実施例９及び１０に示されているとおり、野生型及び／または遺伝子導入マウスを使用して、本明細書に記載の融合タンパク質の薬物動態特性及び脳取り込みを決定することができる。
細胞試料では、アッセイは、細胞を崩壊させ、オープンなマイクロベシクルを破壊することを含み得る。細胞の崩壊は、凍結解凍及び／または音波処理を使用することにより達成することができる。一部の実施形態では、組織試料を評価する。マイクロベシクルが確実に分解されてオープンになるように、音波処理ステップ前に実行される複数回、例えば、２、３、４、５、またはそれ以上の凍結解凍サイクルを使用して、組織試料を評価することができる。
本明細書に記載のアッセイにより評価することができる試料には、例えば、脳、肝臓、腎臓、肺、脾臓、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び尿が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載のとおりのプログラニュリンまたはその変異体を含む融合タンパク質を与えられた患者からのＣＳＦ試料を評価することができる。
ＩＸ．ビス（モノアシルグリセロ）ホスファート（ＢＭＰ）
（例えば、試料における、細胞における、組織における、及び／または対象における）プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体のレベルをモニタリングする方法であって、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体レベルの決定が、（例えば、試料における、細胞における、組織における、及び／または対象における）ＢＭＰの存在量を測定することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
（例えば、試料における、細胞における、組織における、及び／または対象における）プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体のレベルをモニタリングする方法であって、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体レベルの決定が、（例えば、試料における、細胞における、組織における、及び／または対象における）ＢＭＰの存在量を測定することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
ＢＭＰは、式Ｉ：
で図示される構造を有する、負の電荷をもつ（例えば、後期エンドソーム及びリソソーム内で通常は存在するｐＨで）グリセロリン脂質である。ＢＭＰ分子は、２つの脂肪酸側鎖を含む。式Ｉ中のＲ及びＲ’は、典型的には１４、１６、１８、２０、または２２個の炭素原子をそれぞれ含有する、独立に選択される飽和または不飽和脂肪族鎖を表す。脂肪酸側鎖が不飽和である場合、これは、１、２、３、４、５、６つ、またはそれよりも多い炭素－炭素二重結合を含有し得る。さらに、ＢＭＰ分子は、１個または２個のアルキルエーテル置換基を含有してよく、その際、一方または両方の脂肪酸側鎖のカルボニル酸素が、２個の水素原子で置き換えられる。特定のＢＭＰ種を記載するために本明細書において使用されている命名法は、２つの脂肪酸側鎖を有する種に関し、その際、脂肪酸側鎖の構造が、ＢＭＰフォーマットの括弧内に示される（例えば、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１））。数字は、「脂肪酸炭素原子：二重結合の数」の数の標準的な脂肪酸表記フォーマットに従っている。接頭辞「ｅ－」は、アルキルエーテル置換基の存在を示すために使用され、その際、脂肪酸側鎖のカルボニル酸素は２個の水素原子で置き換えられている。例えば、「ＢＭＰ（１６：０ｅ＿１８：０）」中の「ｅ」は、１６個の炭素原子を有する側鎖がアルキルエーテル置換基であることを示している。
本開示の方法の一部の実施形態では、１種のＢＭＰ種の存在量を測定する。一部の実施形態では、２種以上のＢＭＰ種の存在量を測定する。一部の実施形態では、表１中のＢＭＰ種の少なくとも２、３、４、５種、またはそれ以上の存在量を測定する。２種以上のＢＭＰ種の存在量を測定する場合、異なるＢＭＰ種の任意の組合せを使用することができる。
一部の実施形態では、１種よりも多いＢＭＰ種の存在量を合計することができ、総存在量を、基準値と比較する。例えば、１種または複数のＢＭＰ種（例えば、表１に列挙されているＢＭＰ種）の存在量を合計し、次いで、総存在量を基準値と比較することができる。
（表１）ＢＭＰ種
場合によっては、１種または複数のＢＭＰ種が、他と比較した場合に、ある種類の試料で、例えば、細胞ベースの試料（例えば、培養細胞）と組織ベースまたは血液試料などで示差的に発現されることがある（例えば、より豊富に、またはより少なく）。したがって、一部の実施形態では、１種または複数のＢＭＰ種の選択（すなわち、存在量を測定するための）は、試料の種類に依存する。一部の実施形態では、例えば、試料（例えば、試験試料及び／または基準試料）がＢＭＤＭを含む場合には、１種または複数のＢＭＰ種は、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１）を含む。他の実施形態では、例えば、試料が組織（例えば、脳組織、肝臓組織）または血漿、尿、もしくはＣＳＦを含む場合、１種または複数のＢＭＰ種は、ＢＭＰ（２０：４＿２０：４）を含む。他の実施形態では、例えば、試料が組織（例えば、脳組織、肝臓組織）または血漿、尿、もしくはＣＳＦを含む場合、１種または複数のＢＭＰ種は、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）を含む。
一部の実施形態では、内部ＢＭＰ標準（例えば、ＢＭＰ（１４：０＿１４：０））を使用して、試料中の１種または複数のＢＭＰ種の存在量を測定する、及び／または基準値を決定する（例えば、基準試料中の１種または複数のＢＭＰ種の存在量を測定する）。例えば、試料中に存在する１種または複数のＢＭＰ種の量を決定することができるように、既知の量の内部ＢＭＰ標準を試料（例えば、試験試料及び／または基準試料）に添加して、校正点として役立てることができる。一部の実施形態では、試料からＢＭＰを抽出または単離する際に使用される試薬（例えば、メタノール）を、内部ＢＭＰ標準で「スパイクする」。典型的には、内部ＢＭＰ標準は、対象において天然には生じないものである。
Ｘ．グルコシルスフィンゴシン（ＧＬＣＳＰＨ）
（例えば、試料における、細胞における、組織における、及び／または対象における）プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体のレベルをモニタリングする方法であって、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体のレベルの決定が、（例えば、試料における、細胞における、組織における、及び／または対象における）グルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）の存在量を測定することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
（例えば、試料における、細胞における、組織における、及び／または対象における）プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体のレベルをモニタリングする方法であって、プログラニュリンまたはプログラニュリン変異体のレベルの決定が、（例えば、試料における、細胞における、組織における、及び／または対象における）グルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）の存在量を測定することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
ＧｌｃＳｐｈは、式Ｉ：
で図示される構造を有するリソグリコスフィンゴ脂質である。
ＧｌｃＳｐｈは、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）の基質であり、ＧＣアーゼ活性の低下を示すヒトゴーシェ病患者及びマウスモデルの細胞及び組織において蓄積することが見い出されている。ＧｌｃＳｐｈの蓄積は、ゴーシェ病において観察される内臓及びニューロン病変に関係している。
一部の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈの存在量を基準値と比較することができる。一部の実施形態では、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象は、基準値と比較してＧｌｃＳｐｈレベルが上昇しており、例えば、対象の試験試料におけるＧｌｃＳｐｈの存在量は、基準値の少なくとも約１．２倍（例えば、約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、またはそれ以上）であり得る。一部の実施形態では、基準値は、対象が処置を受ける前の、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象の試験試料におけるＧｌｃＳｐｈレベルである。
前記方法の一部の実施形態では、基準値を、基準対象または基準対象の集団から得られた基準試料において測定する。基準対象または基準対象の集団は、健康な対照対象または健康な対照対象の集団であり得る。基準対象または基準対象の集団は、プログラニュリン関連障害またはプログラニュリンのレベルの低下を有さない対象または対象集団であり得る。一部の実施形態では、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象が処置を受けた後に、対象からの試験試料におけるＧｌｃＳｐｈレベルは、対象が任意の処置を受ける前の対象からの試験試料におけるＧｌｃＳｐｈレベルを超えて改善し得る。一部の実施形態では、改善されたＧｌｃＳｐｈレベルは、対象が処置を受ける前の、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象におけるＧｌｃＳｐｈレベルよりも、基準値（例えば、健康な対照対象または健康な対照対象の集団から得られた基準試料で測定された基準値）に近く、例えば、改善されたＧｌｃＳｐｈレベルは、基準レベルの約２０％、１５％、１０％、または５％以内である。一部の実施形態では、改善されたＧｌｃＳｐｈレベルは、基準レベルと実質的に同じである。
場合によっては、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象では、基準値と比較してのＧｌｃＳｐｈレベルの上昇が、例えば、対象の全血、血漿、細胞、組織、血清、脳脊髄液、間質液、痰、尿、リンパ液、またはそれらの組合せにおいて見い出され得る。特定の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈレベルの上昇が、対象の血漿において見い出され得る。本開示の方法の一部の実施形態では、プログラニュリン関連障害を有するか、もしくは有するリスクがある対象から採取された試験試料または１つもしくは複数の基準値は、血漿を含むか、それに関してよい。
さらに、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象では、基準値と比較してのＧｌｃＳｐｈレベルの上昇が、対象の脳、例えば、脳の前頭葉及び／または側頭葉において見い出され得る。特定の実施形態では、ＧｌｃＳｐｈの増加が、前頭葉の１つまたは複数の領域、例えば、上前頭回、中前頭回、下前頭回、及び／または中心前回において見い出され得る。
本明細書に記載の方法において使用されるプログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象から採取された試験試料は、血液細胞、脳細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、赤血球、白血球、神経細胞、ミクログリア細胞、大脳皮質細胞、脊髄細胞、骨髄細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脾臓細胞、肺細胞、眼細胞、絨毛膜絨毛細胞、筋細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、心臓細胞、リンパ節細胞、またはそれらの組合せなどの細胞を含み得る。一部の実施形態では、試験試料は血液細胞を含む。一部の実施形態では、試験試料は脳細胞を含む。
本明細書に記載の方法において使用されるプログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象から採取された試験試料は、脳組織、大脳皮質組織、脊髄組織、肝臓組織、腎臓組織、筋肉組織、心臓組織、眼組織、網膜組織、リンパ節、骨髄、皮膚組織、血管組織、肺組織、脾臓組織、心臓弁組織、またはそれらの組合せなどの組織を含み得る。一部の実施形態では、試験試料は、対象の脳の前頭葉または側頭葉からの脳組織などの脳組織を含む。特定の実施形態では、試験試料において使用される脳組織は、上前頭回、中前頭回、下前頭回、及び／または中心前回からのものであり得る。
プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象から採取された試験試料は、エンドソーム、リソソーム、細胞外小胞、エキソソーム、マイクロベシクル、またはそれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、内部ＧｌｃＳｐｈ標準を使用して、プログラニュリン関連障害を有するか、または有するリスクがある対象からの試験試料におけるＧｌｃＳｐｈの存在量を測定する、及び／または基準値を決定する（例えば、基準試料におけるＧｌｃＳｐｈの存在量を測定する）。例えば、試料中に存在するＧｌｃＳｐｈの量を決定することができるように、既知の量の内部ＧｌｃＳｐｈ標準を試料（例えば、試験試料及び／または基準試料）に添加して、校正点として役立てることができる。一部の実施形態では、試料からＧｌｃＳｐｈを抽出または単離する際に使用される試薬（例えば、メタノール）を、内部ＧｌｃＳｐｈ標準で「スパイクする」。典型的には、内部ＧｌｃＳｐｈ標準は、対象において天然には生じないものである。一部の実施形態では、内部ＧｌｃＳｐｈは、実施例において使用されるＧｌｃＳｐｈ（ｄ５）など、ジュウテリウム標識ＧｌｃＳｐｈである。
ＸＩ．処置に対する応答のモニタリング
一態様では、本開示は、対象（例えば、標的対象）においてプログラニュリンレベルまたはプログラニュリン変異体レベルをモニタリングする方法を提供する。別の態様では、疾患または障害（例えば、本明細書に記載のいずれか）を処置するための本明細書に記載のプログラニュリン変異体もしくは融合タンパク質、またはその医薬組成物もしくは投薬レジメンに対する、対象の応答をモニタリングする方法を提供する。
一態様では、本開示は、対象（例えば、標的対象）においてプログラニュリンレベルまたはプログラニュリン変異体レベルをモニタリングする方法を提供する。別の態様では、疾患または障害（例えば、本明細書に記載のいずれか）を処置するための本明細書に記載のプログラニュリン変異体もしくは融合タンパク質、またはその医薬組成物もしくは投薬レジメンに対する、対象の応答をモニタリングする方法を提供する。
典型的には、試験試料における１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈのそれぞれの存在量を、１つまたは複数の基準値（例えば、対応する基準値）と比較する。一部の実施形態では、ＢＭＰ値及び／またはＧｌｃＳｐｈ値を処置前、及び処置後の１つまたは複数の時点で測定する。後の時点で得られた存在量の値を、処置前の値と、さらには、健康な、または罹患対照のものなどの対照値と比較して、対象が治療に対してどのように応答しているかを決定することができる。１つまたは複数の基準値は、試験試料の細胞、組織、または体液に対応する異なる細胞、組織、または体液からであってよい。
一部の実施形態では、基準値は、基準試料において測定される１種または複数のＢＭＰ種の存在量である。一部の実施形態では、基準値は、基準試料において測定されるＧｌｃＳｐｈの存在量である。基準値は、測定された存在量の値（例えば、基準試料において測定された存在量の値）であってもよいし、または測定された存在量の値に由来するか、もしくはそれから外挿されてもよい。一部の実施形態では、例えば、基準値が複数の試料または対象の集団から得られる場合には、基準値は、ある範囲の値である。さらに、基準値は、単一の値（例えば、測定された存在量の値、平均値、または中央値）、またはある範囲の値として、標準偏差または標準誤差を伴って、または伴わずに表され得る。
２つ以上の試験試料を（例えば、対象から）得る場合、それらを得る時点は、約１、１２、２４時間、もしくはそれ以上；約１、２、３、４、５、６、７日、もしくはそれ以上；約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間、もしくはそれ以上；またはさらに長く、離れていてよい。３つ以上の試験試料を得る場合、各試験試料を得る時間の間の時間間隔はすべて、同じであってもよいし、間隔はすべて異なってもよいし、またはそれらの組合せであってもよい。
一部の実施形態では、第１の試験試料及び第２の試験試料を両方とも、対象を処置した後に対象（例えば、標的対象）から得る、すなわち、第１の試験試料を処置中に、第２の試験試料よりも早い時点で対象から得る。一部の実施形態では、第１の試験試料を、対象をプログラニュリンのレベルの低下に関連する障害について処置する前に得て（すなわち、処置前試験試料）、かつ第２の試験試料を、対象をプログラニュリンのレベルの低下に関連する障害について処置した後に得る（すなわち、処置後試験試料）。一部の実施形態では、１つより多い（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の）処置前及び／または処置後試験試料を対象から得る。さらに、得られる処置前及び処置後試験試料の数は、同じである必要はない。
一部の実施形態では、測定されるＢＭＰ種の存在量が、対象が何らかの処置を受ける前に対象からの基準試料において得られた基準値の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％以内である場合に、対象が処置に応答していないと決定することができる。
一部の実施形態では、測定されるＢＭＰ種の存在量が、健康な対照対象からの基準試料において得られた基準値の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％以内である場合に、対象が処置に応答していると決定することができる。
一部の実施形態では、測定されるＧｌｃＳｐｈの存在量が、対象が何らかの処置を受ける前に対象からの基準試料において得られた基準値の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％以内である場合に、対象が処置に応答していないと決定することができる。
一部の実施形態では、測定されるＧｌｃＳｐｈの存在量が、健康な対照対象からの基準試料において得られた基準値の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％以内である場合に、対象が処置に応答していると決定することができる。
対象（例えば、標的対象）が、（例えば、プログラニュリンのレベルの低下に関連する障害についての）処置に応答していない場合、一部の実施形態では、１種または複数の治療薬（例えば、プログラニュリン）の投薬量を変更する（例えば、増加させる）、及び／または投薬間隔を変更する（例えば、投与の間の時間を短縮する）。一部の実施形態では、対象が処置に応答していない場合、別の治療薬を選択する。一部の実施形態では、対象が処置に応答していない場合、１種または複数の治療薬を中止する。
ＸＩＩ．ＢＭＰ及びＧｌｃＳｐｈ検出技術
一部の実施形態では、抗体を使用して、１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量を検出する、及び／または測定することができる。一部の実施形態では、抗体に結合したＢＭＰ種を、顕微鏡法またはＥＬＩＳＡなどにより検出することができる。一部の実施形態では、抗体に結合したＧｌｃＳｐｈを、顕微鏡法またはＥＬＩＳＡなどにより検出することができる。
一部の実施形態では、抗体を使用して、１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量を検出する、及び／または測定することができる。一部の実施形態では、抗体に結合したＢＭＰ種を、顕微鏡法またはＥＬＩＳＡなどにより検出することができる。一部の実施形態では、抗体に結合したＧｌｃＳｐｈを、顕微鏡法またはＥＬＩＳＡなどにより検出することができる。
他の実施形態では、質量分析法（ＭＳ）を使用して、本開示の方法により１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量を検出する、及び／または測定する。質量分析法は、化合物をイオン化して、生じたイオンをそれらの質量電荷比（ｍ／Ｑ、ｍ／ｑ、ｍ／Ｚ、またはｍ／ｚと省略）により選別する技術である。気体、液体、または固体で存在し得る試料（例えば、ＢＭＰ分子及び／またはＧｌｃＳｐｈ分子を含む）をイオン化し、次いで、生じたイオンを電場及び／または磁場を介して加速して、それらが、それらの質量電荷比により分離するようにする。イオンは最終的に、イオン検出器に衝突して、質量スペクトログラムを生成する。検出イオンの質量電荷比をそれらの相対存在度と一緒に使用して、時には既知の質量（例えば、全体か、またはインタクトな分子の質量）を検出されたイオンの質量に対して補正することにより、及び／または質量スペクトログラムにおいて検出されるパターンを認識することにより、親化合物（複数可）を同定することができる。
一部の実施形態では、１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈを、単一の質量分析器（例えば、四重極型）を使用する単一のＭＳにより検出することができる。一部の実施形態では、典型的には合間に分子断片化ステップを有する複数のラウンドの質量分析法を実行するために一連の質量分析器（例えば、３つの質量分析器）を使用するタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）により、１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈを検出することができる。
断片化のために、これらに限定されないが、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ）、電子脱離解離（ＥＤＤ）、及び表面誘起解離（ＳＩＤ）を含むいくつかの方法を使用することができる。
タンデム質量分析計を使用して、フルスキャン、プロダクトイオンスキャン、プリカーサーイオンスキャン、ニュートラルロススキャン、及び選択（または複数）反応モニタリング（ＳＲＭまたはＭＲＭ）スキャンを含む異なる種類の実験を実行することができる。フルスキャン実験では、両方の質量分析計（例えば、Ｑ１及びＱ３）の全体の質量範囲（またはその一部）をスキャンし、第２の質量分析計（例えば、Ｑ２）はいかなる衝突ガスも含有しない。これにより、試料中に含有されるすべてのイオンを検出することができる。プロダクトイオンスキャン実験では、特定の質量電荷比を第１の質量分析計（例えば、Ｑ１）用に選択し、第２の質量分析計（例えば、Ｑ２）を衝突ガスで充満させて、選択した質量電荷比を有するイオンを断片化し、次いで、第３の質量分析計（例えば、Ｑ３）の全体の質量範囲（またはその一部）をスキャンする。これにより、選択したプリカーサーイオンのすべての断片イオンを検出することができる。プリカーサーイオンスキャン実験では、第１の質量分析（例えば、Ｑ１）の全体の質量範囲（またはその一部）をスキャンし、第２の質量分析計（例えば、Ｑ２）を衝突ガスで充満させて、スキャン範囲内のイオンを断片化し、特定の質量電荷比を第３の質量分析計（例えば、Ｑ３）用に選択する。プロダクトイオンの検出の間の時間と、その検出の直前に選択した特定の質量電荷比とを相関させることにより、この種類の実験により、ユーザーは、どのプリカーサーイオン（複数可）が目的のプロダクトイオンを生成させた可能性があるのかを決定することができる。ニュートラルロススキャン実験では、第１の質量分析計（例えば、Ｑ１）の全体の質量範囲（またはその一部）をスキャンし、第２の質量分析計（例えば、Ｑ２）を衝突ガスで充満させて、スキャン範囲内のすべてのイオンを断片化し、第３の質量分析計（例えば、Ｑ３）を、プリカーサースキャン範囲内のすべての潜在的なイオンに生じた単一の特定の質量の断片化誘起喪失に対応する特定の範囲にわたってスキャンする。この種類の実験により、目的の特定の化学基（例えば、メチル基）を共通して喪失したすべてのプリカーサーの同定が可能となる。ＭＲＭ実験では、ある特定の質量電荷比を第１の質量分析計（例えば、Ｑ１）用に選択し、第２の質量分析計（例えば、Ｑ２）を衝突ガスで充満させ、第３の質量分析計（例えば、Ｑ３）を別の特定の質量電荷比用に設定する。この種類の実験により、第３の質量分析計において選択された生成物に断片化されることが既知である分子の高度に特異的な検出が可能となる。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ方法は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（２０１１）３２：５－３１においてさらに記載されている。
さらに、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ技術を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）技術と連結することができる。そのような液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー－質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）、及びガスクロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ）方法は、典型的にはＭＳまたはＭＳ／ＭＳ単独で可能であるものを超えて強化された質量分解及び質量決定を可能にする。
液体クロマトグラフィーは、流体が均一に微細物質のカラムを通って、またはキャピラリー通路を通って浸透する際に、流体溶液の１つ以上の構成成分を選択的に遅延させるプロセスを指す。その遅延は、１つまたは複数の固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間において、流体が固定相（複数可）に対して動く際の、混合物の構成成分の分布から生じる。ときには「高圧液体クロマトグラフィー」としても公知の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、移動相を圧力下で固定相、典型的には、密に充填されたカラムに押し入れることにより分離度が向上しているＬＣの変形である。
さらに、「超高圧液体クロマトグラフィー」、または「超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）」としても公知の超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）は、慣用のＨＰＬＣ技術よりもかなり高い圧力を使用して実行されるＨＰＬＣの変形である。
ガスクロマトグラフィーは、分解せずに気化させ得る化合物を分離及び／または分析するための方法を指す。移動相は典型的には、不活性なガス（例えば、ヘリウム）または非反応性ガス（例えば、窒素）であるキャリアガスであり、固定相は典型的には、「カラム」として役立つガラス製または金属製管内部の不活性な固体支持体に配置された微視的液体またはポリマー層である。目的のガス状化合物がカラム内の固定相と相互作用するにつれて、それらは示差的に遅延して、異なる時間にカラムから溶出する。次いで、分離化合物を質量分析計に導入することができる。
一部の実施形態では、抗体ベースの方法を使用して、１種または複数のＢＭＰ種及び／またはＧｌｃＳｐｈの存在量を検出する、及び／または測定する。適切な方法の非限定的例には、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術が含まれる。ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、及びＲＩＡ技術を実行するための方法は、当技術分野で公知である。
試料が、検出のために十分な量でＢＭＰ及び／またはＧｌｃＳｐｈを含んでいて、その存在量を測定することができる限り、任意の数の試料の種類を試験試料及び／または基準試料として、本開示の方法において使用することができる。非限定的例には、細胞、組織、血液（例えば、全血、血漿、血清）、体液（例えば、脳脊髄液、尿、気管支肺胞上皮洗浄液、リンパ液、精液、母液、羊水）、糞便、痰、またはそれらの任意の組合せが含まれる。適切な細胞型の非限定的例には、ＢＭＤＭ、血液細胞（例えば、ＰＢＭＣ、赤血球、白血球）、神経細胞（例えば、脳細胞、大脳皮質細胞、脊髄細胞）、骨髄細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脾臓細胞、肺細胞、眼細胞（例えば、ＲＰＥ細胞などの網膜細胞）、絨毛膜絨毛細胞、筋細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、心臓細胞、リンパ節細胞、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、試料は、細胞の一部を含む。一部の実施形態では、試料を細胞または組織から精製する。精製試料の非限定的例には、エンドソーム、リソソーム、細胞外小胞（例えば、エキソソーム、マイクロベシクル）、及びそれらの組合せが含まれる。
一部の実施形態では、試料（例えば、試験試料及び／または基準試料）は、培養細胞である細胞を含む。非限定的例には、ＢＭＤＭ及びＲＰＥ細胞が含まれる。例えば、ＰＢＭＣを含む試料を調達して、そこに含まれる単球を培養することにより、ＢＭＤＭを得ることができる。
適切な組織試料種の非限定的例には、神経組織（例えば、脳組織、大脳皮質組織、脊髄組織）、肝臓組織、腎臓組織、筋肉組織、心臓組織、眼組織（例えば、網膜組織）、リンパ節、骨髄、皮膚組織、血管組織、肺組織、脾臓組織、心臓弁組織、及びそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、試験試料及び／または基準試料は、脳組織または肝臓組織を含む。一部の実施形態では、試験及び／または基準試料は血漿を含む。
ＸＩＩＩ．核酸、ベクター、及び宿主細胞
本明細書に記載のとおりの融合タンパク質中に含有されるポリペプチド鎖を典型的には、組み換え方法を使用して調製する。したがって、一部の態様では、本開示は、本明細書に記載のとおりのプログラニュリン変異体、ポリペプチド、または融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む単離核酸、及びその核酸が導入されていて、ポリペプチドをコードする核酸を複製する、及び／またはポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は真核、例えば、ヒト細胞である。
本明細書に記載のとおりの融合タンパク質中に含有されるポリペプチド鎖を典型的には、組み換え方法を使用して調製する。したがって、一部の態様では、本開示は、本明細書に記載のとおりのプログラニュリン変異体、ポリペプチド、または融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む単離核酸、及びその核酸が導入されていて、ポリペプチドをコードする核酸を複製する、及び／またはポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は真核、例えば、ヒト細胞である。
別の態様では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及びポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
本開示は、配列番号９８～１０８及び１２３～１２６のいずれか１つの配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸を提供する。配列番号３～５７、１１１～１２１、１２７、及び１２８のいずれか１つの配列を有するプログラニュリン変異体をコードする核酸配列を含む単離核酸も本明細書において提供する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、核酸コンストラクト内に含まれる。一部の実施形態では、コンストラクトは、複製可能なベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルス性ベクター、ファージミド、酵母染色体ベクター、及び非エピソーム哺乳類ベクターから選択される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現コンストラクト中の１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結している。一連の実施形態では、核酸発現コンストラクトを、表面発現ライブラリとして使用するために適応させる。一部の実施形態では、ライブラリを、酵母における表面発現のために適応させる。一部の実施形態では、ライブラリを、ファージにおける表面発現のために適応させる。別の一連の実施形態では、核酸発現コンストラクトを、ミリグラムまたはグラム量でのポリペプチドの単離を可能にするシステムにおけるポリペプチドの発現のために適応させる。一部の実施形態では、システムは、哺乳類細胞発現系である。一部の実施形態では、システムは酵母細胞発現系である。
組み換えポリペプチドを生成するための発現ビヒクルには、プラスミド及び他のベクターが含まれる。例えば、適切なベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現では、次の種類のプラスミドが含まれる：ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、及びｐＵＣ由来プラスミド。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏ、及びｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適切な哺乳類発現ベクターの例である。別法では、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）、またはエプスタイン－バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、及びｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、真核細胞におけるポリペプチドの一過性発現のために使用することができる。一部の実施形態では、バキュロウイルス発現系の使用により組み換えポリペプチドを発現させることが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、及びｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクターが含まれる。追加の発現系には、アデノウイルス性、アデノ随伴ウイルス、及び他のウイルス発現系が含まれる。
ベクターを任意の適切な宿主細胞に形質転換することができる。一部の実施形態では、宿主細胞、例えば、細菌または酵母細胞を、表面発現ライブラリとして使用するために適合させることができる。一部の細胞では、比較的大量のポリペプチドを発現させるために、ベクターを宿主細胞で発現させる。そのような宿主細胞には、哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び原核細胞が含まれる。一部の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０細胞、Ｙ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨｅＬａ細胞などの哺乳類細胞である。特定の実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。
本明細書に記載の融合タンパク質のための１つまたは複数のプログラニュリン変異体をコードする発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞は、１つまたは複数のポリペプチドの発現が生じることを可能にする適切な条件下で培養することができる。ポリペプチド（複数可）が分泌されて、細胞とポリペプチド（複数可）を含有する培地との混合物から単離され得る。別法では、ポリペプチド（複数可）は、細胞質中に、または膜分画中に保持され、所望の方法を使用して、細胞を採取し、溶解し、単離されたポリペプチド（複数可）を単離することができる。
ＸＩＶ．医薬組成物及びキット
他の態様では、本開示によるプログラニュリン変異体または融合タンパク質を含む医薬組成物及びキットを提供する。
他の態様では、本開示によるプログラニュリン変異体または融合タンパク質を含む医薬組成物及びキットを提供する。
医薬組成物
本開示において使用するための製剤を調製するためのガイダンスは、当業者に知られている医薬調製及び処方のための任意の数のハンドブックにおいて見い出すことができる。
本開示において使用するための製剤を調製するためのガイダンスは、当業者に知られている医薬調製及び処方のための任意の数のハンドブックにおいて見い出すことができる。
一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のとおりのプログラニュリン変異体または融合タンパク質を含み、かつさらに、１種または複数の薬学的に許容される担体及び／または添加剤を含む。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合性であり、かつ活性薬剤の活性を妨害しないか、または別段に阻害しない任意の溶媒、分散媒体、またはコーティングが含まれる。
プログラニュリン変異体または融合タンパク質は、注射による非経口投与のために製剤化することができる。典型的には、インビボ投与において使用するための医薬組成物は無菌であり、例えば、熱減菌、蒸気減菌、滅菌濾過、または照射されている。
本明細書に記載の医薬組成物の投薬量及び所望の薬物濃度は、構想されている特定の使用に応じて変化し得る。
キット
一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体または融合タンパク質を含む、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ、ＮＣＬ、ＮＰＡ、ＮＰＢ、ＮＰＣ、Ｃ９ＯＲＦ７２関連ＡＬＳ／ＦＴＤ、孤発性ＡＬＳ、ＡＤ、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病２及び３型）、及びパーキンソン病）、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、及びＡＭＤ、及びプログラニュリン関連障害）を処置する際に使用するためのキットを提供する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体または融合タンパク質を含む、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ、ＮＣＬ、ＮＰＡ、ＮＰＢ、ＮＰＣ、Ｃ９ＯＲＦ７２関連ＡＬＳ／ＦＴＤ、孤発性ＡＬＳ、ＡＤ、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病２及び３型）、及びパーキンソン病）、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、及びＡＭＤ、及びプログラニュリン関連障害）を処置する際に使用するためのキットを提供する。
一部の実施形態では、キットはさらに、１種または複数の追加の治療薬を含む。例えば、一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載のとおりのプログラニュリン変異体または融合タンパク質を含み、さらに、本明細書に記載のいずれかの疾患または障害（例えば、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ））の処置において使用するための１種または複数の追加の治療薬を含む。一部の実施形態では、キットはさらに、本明細書に記載の方法を実行するための用法（すなわち、プロトコル）を含む指示用資料（例えば、プログラニュリン変異体を含む融合タンパク質を投与するためにキットを使用するための指示書）を含む。指示用資料は典型的には、文書によるか、または印刷された資料を含むが、それらは、そのようなものに限定されない。そのような指示を保存し、かつ、それらをエンドユーザーに伝達することができる任意の媒体を本開示は企図している。そのような媒体には、これらに限定されないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ）などが含まれる。そのような媒体には、そのような指示用資料を提供するインターネットサイトのアドレスも含まれ得る。
ＸＶ．適応症
一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を、１つの神経変性疾患または複数の神経変性疾患を処置するために使用する。例えば、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＡＤ、原発性加齢性タウオパチー、レビー小体型認知症、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、ＦＴＤ、染色体１７番に連鎖したパーキンソン症候群を伴うＦＴＤ、嗜銀顆粒性認知症、ＡＬＳ、グアム島のＡＬＳ／パーキンソン症候群－認知症複合（ＡＬＳ－ＰＤＣ）、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、クロイツフェルト－ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症、ゲルストマン－シュトラウスラー－シャインカー病、球状グリア性タウオパチー、認知症を伴うグアドループ島パーキンソン症候群、グアドループ島ＰＳＰ、ハレルフォルデン－スパッツ病、スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症（ＨＤＬＳ）、封入体筋炎、多発性萎縮症、筋強直性ジストロフィー、那須－ハコラ病、神経原線維変化優位型認知症、ＮＰＣ、パリド－ポント－黒質変性症、パーキンソン病、ピック病、脳炎後パーキンソン症候群、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、進行性皮質下グリオーシス、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維変化型認知症からなる群から選択される１つまたは複数の神経変性疾患を処置するために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を、１つの神経変性疾患または複数の神経変性疾患を処置するために使用する。例えば、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＡＤ、原発性加齢性タウオパチー、レビー小体型認知症、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、ＦＴＤ、染色体１７番に連鎖したパーキンソン症候群を伴うＦＴＤ、嗜銀顆粒性認知症、ＡＬＳ、グアム島のＡＬＳ／パーキンソン症候群－認知症複合（ＡＬＳ－ＰＤＣ）、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、クロイツフェルト－ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症、ゲルストマン－シュトラウスラー－シャインカー病、球状グリア性タウオパチー、認知症を伴うグアドループ島パーキンソン症候群、グアドループ島ＰＳＰ、ハレルフォルデン－スパッツ病、スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症（ＨＤＬＳ）、封入体筋炎、多発性萎縮症、筋強直性ジストロフィー、那須－ハコラ病、神経原線維変化優位型認知症、ＮＰＣ、パリド－ポント－黒質変性症、パーキンソン病、ピック病、脳炎後パーキンソン症候群、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、進行性皮質下グリオーシス、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維変化型認知症からなる群から選択される１つまたは複数の神経変性疾患を処置するために使用することができる。
いくつかの神経変性疾患は、細胞及び生体機能障害、さらには臨床的異常を最終的にもたらす非消化または部分的に消化された高分子の蓄積により特徴づけられるリソソーム貯蔵障害が原因であるか、またはそれに関連し得る。リソソームの貯蔵障害は、蓄積した基質の種類により定義され、コレステロール貯蔵障害、スフィンゴ脂質蓄積症、オリゴ糖代謝異常、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、リポタンパク質貯蔵障害、神経セロイドリポフスチン症などと分類され得る。場合によっては、リソソームの貯蔵障害には、リソソーム酵素の正常な翻訳後修飾に必要なタンパク質、または適正なリソソーム輸送に重要なタンパク質などの高分子の蓄積をもたらすタンパク質の不足または欠失も含まれる。リソソーム貯蔵障害が原因であるか、またはそれに関連し得る神経変性疾患の例には、例えば、ＦＴＤ、ＮＣＬ、ＮＰＡ、ＮＰＢ、ＮＰＣ、Ｃ９ＯＲＦ７２関連ＡＬＳ／ＦＴＤ、孤発性ＡＬＳ、ＡＤ、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病２及び３型）、及びパーキンソン病が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を使用して、例えば、前述の神経変性疾患のいずれかを含むリソソーム貯蔵障害が原因であるか、またはそれに関連する神経変性疾患を処置する。
他の障害の例には、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、及びＡＭＤが含まれる。そのような障害は、本明細書に記載のプログラニュリン変異体または融合タンパク質の投与から利益を受け得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を使用して、ＦＴＤを処置する。ＦＴＤは、進行性神経変性障害である。ＦＴＤは、前頭葉及び側頭葉の選択的関与を示す幅広い臨床的、病的、及び遺伝的に不均一な疾患を含む（Ｇａｚｚｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８１７：７６－８５，２０１７）。ＦＴＤの臨床症状には、行動及び人格の変化、前頭葉実行欠損、及び言語機能障害が含まれる。臨床的表現型の相違に基づき、行動障害型ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、及び非流暢性／失文法性亜型ＰＰＡ（ａｖＰＰＡ）または意味性亜型ＰＰＡ（ｓｖＰＰＡ）のいずれかであり得る原発性進行性失語症（ＰＰＡ）などの種々の症状が同定されている。これらの臨床症状は、大脳皮質基底核症候群（ＣＢＳ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、及びＡＬＳなどの非定型パーキンソン症候群とも重複し得る（Ｇａｚｚｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８１７：７６－８５，２０１７）。ＦＴＤは、ニューロン及び星状細胞におけるタウ病変またはニューロンにおける細胞質ユビキチン封入体を含む様々な神経病理学的特徴に関連する。４３ｋＤａ（ＴＤＰ－４３）の分子量を有するトランス活性化ＤＮＡ結合タンパク質は、ＦＴＤ、さらにはＡＬＳの症例の大部分において蓄積する最も顕著なユビキチン化タンパク質病変である（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ、前出）。ＦＴＤは、早発性認知症の重大な原因であり、症例の最高８０％が４５から６４歳の間に現れる。この疾患は、有意な家族性要素も示し、症例の約３０～５０％で疾患の家族歴が報告されている（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ、前出）。
一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を使用して、ＧＲＮの変異に関連するか、またはそれに随伴する障害を処置する。いくつかの遺伝子がＦＴＤに関連しているが、ＦＴＤにおいて最も頻繁に変異している遺伝子の１つがＧＲＮであり、これは、ヒト染色体１７ｑ２１に位置し、システインリッチなタンパク質プログラニュリン（プロエピセリン及びアクログラニンとしても公知）をコードする。最近の推定では、ＧＲＮ変異は、家族歴が陽性であるＦＴＤ患者の５～２０％及び孤発性症例の１～５％を占めることが示唆されている（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、前出）。ＧＲＮ関連ＦＴＤにおける神経変性及び疾患プロセスの根底にある正確な分子及び細胞機構は未知であるが、患者の脳の組織分析と組み合わせたＧＲＮノックアウトマウスの表現型特性決定により、炎症及びリソソーム欠損の両方が疾患の中核であることが示唆されている（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（６）：３２５－３３３，２０１７）。実際に、大量のグリオーシスが患者の皮質領域に存在し（Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１６５（４）：９２１－３５，２０１６）、リソソーム障害を示すリソソーム色素であるリポフスチンが、発症前個体及び患者の両方を含む変異ＧＲＮ保因者の眼及び皮質において報告されている（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．９（３８５），２０１７）。
７０を超えるＧＲＮ疾患変異が報告されていて、遺伝子全体にマッピングされており、その結果として、それらは機能喪失（ＬＯＦ）アレルであると確認または予測されている（Ｊｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．５４：１４５－１５４，２０１７）。ＦＴＤに関連する多くのヘテロ接合変異は、主にナンセンスｍＲＮＡ崩壊の結果としてのｍＲＮＡレベルの約５０％の低下、及び匹敵するプログラニュリンタンパク質レベルの低下を引き起こす（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ，前出；Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．、前出）。低レベルのプログラニュリンは、発症前個体を含む保因者の血液（血清）及び脳脊髄液（ＣＳＦ）においても見い出される（Ｆｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（６）：３２５－３３３，２０１７；Ｇｏｏｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．１０（１）：３１，２０１８；Ｍｅｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｍｅｎｔ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃｏｇｎ Ｄｉｓ Ｅｘｔｒａ．６（２）：３３０－３４０，２０１６）。したがって、ハプロ不全がＧＲＮ関連ＦＴＤにおける主な疾患機構であると考えられ、保因者においてプログラニュリンレベルを上昇させる治療アプローチがＦＴＤの発症年齢、さらには、進行を遅延させ得ることを示唆している（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ、前出；Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．、前出）。この見解は、遺伝子ＴＭＥＭ１０６Ｂの変異体がプログラニュリンのレベルを２５％上昇させ、かつＧＲＮ関連ＦＴＤの発症時期を１３年遅延させることを示すヒト遺伝子研究により裏付けられている（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１３２（５）：６３９－６５１，２０１６）。
ホモ接合型ＧＲＮ変異も報告されているが、保因者は、リソソーム貯蔵障害であるＮＣＬ（バッテン病；生児出生１００，０００あたり発生率１～２．５；Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｐ．１３（８）：３６６，２０１３）として公知のかなり異なる臨床表現型を表す（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．９０（６）：１１０２－７，２０１２；Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．４１：２００．ｅ１－２００．ｅ５，２０１６）。ＧＲＮは実際に、ＮＣＬに関連すると報告されている１４の神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ）遺伝子のうちの１つであり、ＧＲＮは、ＣＬＮ１１としても公知である（Ｋｏｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１８３２（１１）：１８６６－８１，２０１３）。本明細書に記載のプログラニュリン変異体または融合タンパク質は、抗炎症特性及びリソソーム機能の増強を示し得、そのいずれも、ＮＣＬにおいて有利であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を使用して、ＮＣＬを処置することができる。
ＧＢＡ遺伝子にホモ接合型変異を保有するゴーシェ病の患者は、それらの血清において低レベルのプログラニュリンを有する（Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ １１：１２７－１３７，２０１６）。ＧＢＡにヘテロ接合型変異を有するパーキンソン病患者も、低レベルのプログラニュリンを有することがある。一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を使用して、ゴーシェ病またはパーキンソン病を処置することができる。
ＧＲＮにおける変異体は、ＡＤに関連しており（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｂｒｏｕｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．７１（９）：６５６－６４，２００８；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ Ｄｉｓ．８（４）：２１６－２０，２０１１；Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ｂ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｇｅｎｅｔ．１５０Ｂ（５）：７４７－５０，２００９）、かつＴＤＰ－４３病変はＡＤ患者の脳において共通している（Ｙｏｕｍａｎｓ ａｎｄ Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２３７（１）：９０－５，２０１２）。プログラニュリン遺伝子送達は、ＡＤのマウスモデルにおいてアミロイド負荷量を減少させることも示されている（ｖａｎ Ｋａｍｐｅｎ ａｎｄ Ｋａｙ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．１２（８）：ｅ０１８２８９６，２０１７）。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を使用して、ＡＤを処置することができる。
ＮＰＡ及びＮＰＢは、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）をコードする遺伝子における変異から生じる。ＮＰＣは、コレステロール輸送に関係する遺伝子、すなわち、ＮＰＣ１及びＮＰＣ２における変異から生じる（Ｋｏｌｔｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｈｏｆｆ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２１：８１－１０３，２００５；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１（２）：１１３－８，１９９９）。一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を使用して、ＮＰＡ、ＮＰＢ、及び／またはＮＰＣを処置することができる。
大部分のＡＬＳ症例が、ＴＤＰ－４３病変を示し、これは、ＧＲＮ変異を持つ患者とも共有される（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３７（７）：３８８－９８，２０１４；Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．８（８）：４２３－３４，２０１２）。すべてのＡＬＳ症例のうちでも、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内のＧＧＧＧＣＣリピート伸長が、ＡＬＳの最も共通する原因及びＦＴＤの重大な原因である。北米及び欧州の個体群において報告された平均変異頻度は、家族性ＡＬＳで３７％、孤発性ＡＬＳで６％、家族性ＦＴＤで２１％、かつ孤発性ＦＴＤ患者で６％である（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、前出）。加えて、ＧＲＮ関連ＦＴＤにおいて防護的であるＴＭＥＭ１０６Ｂ変異体は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子においてリピート伸長を保有するＦＴＤ患者においても防護的である（ｖａｎ Ｂｌｉｔｔｅｒｓｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２７（３）：３９７－４０６，２０１４）。一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を使用して、例えば、リソソーム機能を促進する、及び／または炎症を減少させることにより、Ｃ９ＯＲＦ７２関連ＡＬＳ／ＦＴＤにおけるＴＤＰ－４３病変を減少させることができる。
ＡＭＤは、変性疾患であり、先進国における失明の主原因である。これは、網膜の中心近傍の小さな点であり鮮明な中心視覚に必要な眼の一部である黄斑に、損傷を引き起こす。眼内の変性変化及び視覚の喪失は、リソソーム機能の障害及び網膜後部の有害なタンパク質の蓄積に起因し得る（Ｖｉｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．８（７）：ｅ６９５６３，２０１３）。疾患が進行するにつれて、中心視覚領域における網膜の感覚細胞が損傷し、中心視覚の喪失に至る。一部の実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体及び融合タンパク質を使用して、ＡＭＤを処置することができる。
ＸＶＩ．治療方法
本明細書に記載のプログラニュリン変異体または融合タンパク質を使用して、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ、ＮＣＬ、ＮＰＡ、ＮＰＢ、ＮＰＣ、Ｃ９ＯＲＦ７２関連ＡＬＳ／ＦＴＤ、孤発性ＡＬＳ、ＡＤ、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病２型及び３型）、及びパーキンソン病）、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、ＡＭＤ、またはプログラニュリン関連障害を治療的に処置することができる。
本明細書に記載のプログラニュリン変異体または融合タンパク質を使用して、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ、ＮＣＬ、ＮＰＡ、ＮＰＢ、ＮＰＣ、Ｃ９ＯＲＦ７２関連ＡＬＳ／ＦＴＤ、孤発性ＡＬＳ、ＡＤ、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病２型及び３型）、及びパーキンソン病）、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、ＡＭＤ、またはプログラニュリン関連障害を治療的に処置することができる。
本明細書に記載のプログラニュリン変異体または融合タンパク質を対象に、治療有効量または用量で投与することができる。投薬量は、投与頻度、選択された投与経路、組成物の処方、患者応答、状態の重症度、対象の体重、及び処方医の判断を含む複数の因子により変化し得る。投薬量は、個々の患者による必要に応じて、経時的に増加または減少させることができる。一部の実施形態では、患者は最初に低用量を与えられ、次いでこれを、患者に許容される有効な投薬量まで増加させる。
様々な実施形態では、本明細書に記載のプログラニュリン変異体または融合タンパク質を任意の経路により投与する。一部の実施形態では、前記タンパク質を非経口送達により投与する。一部の実施形態では、前記タンパク質を静脈内投与する。一部の実施形態では、前記タンパク質を腹腔内送達により投与する。
ＸＶＩＩ．実施例
本開示を、具体的な例により、さらに詳細に記載することとする。次の実施例は、例示を目的として提供するものにすぎず、本開示を何らかの手法で限定することを意図したものではない。当業者は、本質的に同じ結果を得るために変更または改変することができる様々な重大ではないパラメーターを容易に認めるであろう。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して確度を保証する努力は成されているが、多少の実験誤差及び偏差が存在し得る。本開示の実行では、別段に示されていない限り、当技術分野の技能の範囲内のタンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を用いることとする。そのような技術は、文献において完全に説明されている。加えて、ある特定のライブラリに適用されたとおりの操作方法を、本明細書に記載の他のライブラリにも適用することができることは当業者には明らかであるはずである。
本開示を、具体的な例により、さらに詳細に記載することとする。次の実施例は、例示を目的として提供するものにすぎず、本開示を何らかの手法で限定することを意図したものではない。当業者は、本質的に同じ結果を得るために変更または改変することができる様々な重大ではないパラメーターを容易に認めるであろう。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して確度を保証する努力は成されているが、多少の実験誤差及び偏差が存在し得る。本開示の実行では、別段に示されていない限り、当技術分野の技能の範囲内のタンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を用いることとする。そのような技術は、文献において完全に説明されている。加えて、ある特定のライブラリに適用されたとおりの操作方法を、本明細書に記載の他のライブラリにも適用することができることは当業者には明らかであるはずである。
実施例１．組み換えＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の発現及び精製
組み換えＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質を発現させるために、ＰＥＩＭａｘ（ＭＷ４０，０００、Ｌｉｎｅａｒ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１：４のＤＮＡ（μｇ）対ＰＥＩ（μＬ）の比で用いるＧｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳ）ノックアウトチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ１細胞（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の一過性トランスフェクションにより、コンストラクトを発現させた。細胞を初めに増殖させ、かつＢａｌａｎＣＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒｙ ＣＨＯ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３７℃でトランスフェクトした。トランスフェクション後に、細胞培養温度を３２℃にシフトさせ、培養の持続期間を５％ＣＯ２及び湿度８０％で、オービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）内で維持した。栄養素供給物であるＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ ４（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培養の１日目に、初期培養体積の２０％で添加した。７日後に、タンパク質を遠心により採取し、続いて、０．２２ｕｍ ＰＥＳフィルターを用いて濾過した。
組み換えＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質を発現させるために、ＰＥＩＭａｘ（ＭＷ４０，０００、Ｌｉｎｅａｒ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１：４のＤＮＡ（μｇ）対ＰＥＩ（μＬ）の比で用いるＧｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳ）ノックアウトチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ１細胞（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の一過性トランスフェクションにより、コンストラクトを発現させた。細胞を初めに増殖させ、かつＢａｌａｎＣＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒｙ ＣＨＯ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３７℃でトランスフェクトした。トランスフェクション後に、細胞培養温度を３２℃にシフトさせ、培養の持続期間を５％ＣＯ２及び湿度８０％で、オービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）内で維持した。栄養素供給物であるＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ ４（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培養の１日目に、初期培養体積の２０％で添加した。７日後に、タンパク質を遠心により採取し、続いて、０．２２ｕｍ ＰＥＳフィルターを用いて濾過した。
ＨＥＫ細胞で発現される融合タンパク質については、Ｅｘｐｉ２９３（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）において、製造者指示（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）に従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３／プラスミドＤＮＡ複合体を細胞に、密度２×１０６細胞／ｍＬでトランスフェクトした。トランスフェクション後に、細胞を３７℃で、ＣＯ２６～８％の加湿雰囲気で、オービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）内でインキュベートした。トランスフェクション後１日目に、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）トランスフェクション促進剤１及び２を培養物に添加した。培地上清をトランスフェクションから９６時間後に遠心により採取した。清澄化上清に、ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）を補充し、－８０℃で貯蔵した。
組み換え融合タンパク質精製のために、清澄化培地上清をＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｐｒｉｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷し、０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で洗浄した。融合タンパク質を、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３．５～３．６で溶離した。アフィニティーカラムからの溶離液を（１）１×ＰＢＳの最終緩衝液へのタンデム緩衝液交換（ｔａｎｄｅｍ ｂｕｆｆｅｒ ｅｘｃｈａｎｇｅ）のために、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷するか、または（２）溶離液のｐＨを調節するために、アルギニン－コハク酸緩衝液（１Ｍアルギニン、６８５ｍＭコハク酸、ｐＨ５．０）を添加することにより中和した。ある特定の融合タンパク質では、アフィニティーカラムからの溶離液を、カチオン交換カラム（ＳＰ ＨＰ、ＨｉＴｒａｐ（商標））に負荷して、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０でカラムを洗浄することによりさらに処理した。次いで、融合タンパク質を、２０カラム体積超のＮａＣｌ溶液の勾配（２００ｍＭ～５００ｍＭ）を適用することによりカラムから溶離した。次いで、タンパク質９５％超を含有する画分を一緒にプールした。プールした画分に、硫酸アンモニウムを約１Ｍの最終濃度まで添加し、その後、溶液を、疎水性相互作用カラム（Ｂｕｔｙｌ ＨＰ、ＨｉＴｒａｐ（商標））に負荷した。カラムを０．１Ｍクエン酸緩衝液中１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．０で洗浄し、２０カラム体積超の硫酸アンモニウムの勾配（１Ｍから０へ）を適用することにより、タンパク質を溶離した。タンパク質９５％超を含有するプールした画分を合わせ、スクロース６％を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で透析した。精製タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウム、スクロース６％、ｐＨ６．５で得た。下の表２及び３は、例示的な融合タンパク質の配列を示している。
図１Ａ及びＢは、融合タンパク質が純度９８％超まで精製されたことを示す代表的なデータを含む。
（表２）Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の配列
（表３）Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の追加の配列
実施例２．Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質のＣ末端切断のトップダウン質量分析
Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｐｌｕｓ ＥＭＲ質量分析計に連結されたＴｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣを使用して、ペプチドマッピングにより、またはトップダウン質量分析法により、ＣＨＯ細胞から発現されて精製されたインタクトなＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質を測定した。比較のために、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞で発現された野生型ＰＧＲＮ配列を含有する融合タンパク質（融合体１１）も評価した。
Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｐｌｕｓ ＥＭＲ質量分析計に連結されたＴｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣを使用して、ペプチドマッピングにより、またはトップダウン質量分析法により、ＣＨＯ細胞から発現されて精製されたインタクトなＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質を測定した。比較のために、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞で発現された野生型ＰＧＲＮ配列を含有する融合タンパク質（融合体１１）も評価した。
トップダウン質量分析
ＰＢＳ緩衝液または配合緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５、６％スクロース）中のおよそ１０μｇの試料を分析のために注入した。Ｔｈｅｒｍｏ ＭａｂＰＡＣ ＲＰカラム（４μｍ、２．１×５０ｍｍ、Ｐ／Ｎ８８６４８）を用いて、５５℃のカラム温度で、Ｈ２Ｏ中の０．１トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の移動相（Ａ）及びアセトニトリルの移動相（Ｂ）を０．３ｍＬ／分の流速で用いて、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を実行した。勾配を（Ｂ）２０％で開始し、（Ｂ）７０％まで増加させ、その後、（Ｂ）２０％に戻した。２１４ｎｍ及び２８０ｎｍでＵＶ／Ｖｉｓを用いて、検出を実施した。ＥＭＲ質量分析計を２つのＡｌｌ Ｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＩＦ）スキャンで操作した。
ＰＢＳ緩衝液または配合緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５、６％スクロース）中のおよそ１０μｇの試料を分析のために注入した。Ｔｈｅｒｍｏ ＭａｂＰＡＣ ＲＰカラム（４μｍ、２．１×５０ｍｍ、Ｐ／Ｎ８８６４８）を用いて、５５℃のカラム温度で、Ｈ２Ｏ中の０．１トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の移動相（Ａ）及びアセトニトリルの移動相（Ｂ）を０．３ｍＬ／分の流速で用いて、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を実行した。勾配を（Ｂ）２０％で開始し、（Ｂ）７０％まで増加させ、その後、（Ｂ）２０％に戻した。２１４ｎｍ及び２８０ｎｍでＵＶ／Ｖｉｓを用いて、検出を実施した。ＥＭＲ質量分析計を２つのＡｌｌ Ｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＩＦ）スキャンで操作した。
第１のＡＩＦ設定：スキャン範囲３５０～５０００ｍ／ｚ。ＣＥ：２５。インソースＣＩＤ ９０ｅｖ。解像度設定：１７，５００及びＡＧＣターゲット３ｅ６、最大ＩＴ：２００ｍｓ。マイクロスキャン：１。
第２のＡＩＦ設定：スキャン範囲３５０～５０００ｍ／ｚ。ＣＥ：２００。インソースＣＩＤ ９０ｅｖ。解像度設定：３５，０００及びＡＧＣターゲット１ｅ６、最大ＩＴ：２００ｍｓ。マイクロスキャン：５。
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源条件：シースガス流速：２５、Ａｕｘガス速度：４。スプレー電圧３ｋＶ、キャピラリー温度３２５℃、ＳレンズＲＦレベル１２５。Ａｕｘガスヒーター温度３００℃。ＥＭＲモード、オン。捕捉ガス圧設定２．０。
トップダウン気相反応は、ＰＧＲＮのＣ末端の切断を、アスパラギン酸（Ｄ）及びプロリン（Ｐ）（これらは、配列番号２の５６９位及び５７０位に対応する）のアミノ酸の間で誘導して、異なるプログラニュリン変異体の別個のＣ末端配列に対応する配列を有する７アミノ酸長のインタクトなペプチドを生成した。切断されたペプチドは、Ｃ末端からの連続喪失を呈した。ペプチドＸＩＣピークを、２０ｐｐｍ（百万分率）を使用して抽出し、曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、全タンパク質に対するインタクトなタンパク質のパーセンテージを計算した。
ペプチドマッピング分析
試料を調製するために、５０ｍＭ炭酸水素塩（ｐＨ７．８）中のおよそ４０μｇの試料をＡｓｐＮ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ．Ｐ８０１４Ｓ）と共に、１：４０（ｗ／ｗ）の酵素：タンパク質比で、３０分間にわたって３７℃でインキュベートした。ギ酸（１％）を添加して反応をクエンチし、試料を分析のためにＬＣＭＳバイアルに移した。ＵＶ／Ｖｉｓ及びＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐエレクトロスプレーイオン化質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ，ＵＳＡ）に連結されたＵＨＰＬＣ Ｖａｎｑｕｉｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ，ＵＳＡ）での液体クロマトグラフィーにより、ペプチドマッピング分析を実行した。各分析のために、０．２０ｍＬ／分の流速を用いて、４０℃で、陽イオン化モード下で、試料２５μＬをＣＳＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に注入した。移動相Ａは、０．１％ギ酸を含む水からなり、移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルからなった。勾配を（Ｂ）１％で開始し、５０分かけて３ステップで（Ｂ）１％から１０％、（Ｂ）１０％から４０％まで、及び（Ｂ）４０％から７０％まで増加させ、その後、（Ｂ）１％に戻した。ＵＶ／Ｖｉｓトレースを２８０及び２１４ｎｍの波長で記録し、ポジティブモード下でのＦｕｌｌ ＭＳ－ｄｄＭＳ２捕捉を使用して、データを収集した。ピーク面積を使用して、インタクトなペプチド及び切断されたペプチドのパーセンテージを計算した。
試料を調製するために、５０ｍＭ炭酸水素塩（ｐＨ７．８）中のおよそ４０μｇの試料をＡｓｐＮ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ．Ｐ８０１４Ｓ）と共に、１：４０（ｗ／ｗ）の酵素：タンパク質比で、３０分間にわたって３７℃でインキュベートした。ギ酸（１％）を添加して反応をクエンチし、試料を分析のためにＬＣＭＳバイアルに移した。ＵＶ／Ｖｉｓ及びＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐエレクトロスプレーイオン化質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ，ＵＳＡ）に連結されたＵＨＰＬＣ Ｖａｎｑｕｉｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ，ＵＳＡ）での液体クロマトグラフィーにより、ペプチドマッピング分析を実行した。各分析のために、０．２０ｍＬ／分の流速を用いて、４０℃で、陽イオン化モード下で、試料２５μＬをＣＳＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に注入した。移動相Ａは、０．１％ギ酸を含む水からなり、移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルからなった。勾配を（Ｂ）１％で開始し、５０分かけて３ステップで（Ｂ）１％から１０％、（Ｂ）１０％から４０％まで、及び（Ｂ）４０％から７０％まで増加させ、その後、（Ｂ）１％に戻した。ＵＶ／Ｖｉｓトレースを２８０及び２１４ｎｍの波長で記録し、ポジティブモード下でのＦｕｌｌ ＭＳ－ｄｄＭＳ２捕捉を使用して、データを収集した。ピーク面積を使用して、インタクトなペプチド及び切断されたペプチドのパーセンテージを計算した。
下の表４は、融合体１の９５％超が、インタクトなＣ末端を有し、かつ融合体２の８０％超が、インタクトなＣ末端を有することを示している。短縮型融合タンパク質（例えば、Ｃ末端で１～３個のアミノ酸を失っている融合タンパク質）の存在は、５％未満（融合体１）及び２０％未満（融合体２）であった。表４において、「－Ｌ」、「－ＩＬ」、「－ＰＩＬ」、「－ＦＬ」、及び「－ＰＦＬ」は、融合タンパク質から切断された末端アミノ酸を指す。追加の融合タンパク質でのデータは、表８Ａ及び８Ｂにおいて見い出すことができる。基準点として、ＨＥＫ細胞で発現された場合、野生型ＰＧＲＮを含有する融合タンパク質（融合体１１）の約９５％がインタクトなままであった一方で、ＣＨＯ細胞で発現された場合、融合体１１の７％がインタクトなままであった。
（表４）
実施例３．熱安定性及び凍結解凍安定性
融合タンパク質の熱安定性をＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ機器（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）により測定した。溶融プロファイル（Ｔｍ、Ｔｏｎｓｅｔ）を作成するために、内部蛍光を使用して、温度上昇中のタンパク質をモニタリングする。融合体１及び融合体２での結果を図２に例示する。
融合タンパク質の熱安定性をＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ機器（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）により測定した。溶融プロファイル（Ｔｍ、Ｔｏｎｓｅｔ）を作成するために、内部蛍光を使用して、温度上昇中のタンパク質をモニタリングする。融合体１及び融合体２での結果を図２に例示する。
融合タンパク質に対して凍結解凍分析を行った。簡単に述べると、タンパク質試料をドライアイス上で約１０分間にわたってインキュベートし、その後、試料を室温にして、３０分間インキュベートした。その凍結解凍サイクルを５回繰り返し、その後、試料を４℃にし、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣカラム、２００Å １．７μｍ、３０ｃｍ、１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含む２×ＰＢＳの移動相を使用、流速０．２ｍＬ／分）を使用して分析した。融合体１及び融合体２の結果は図３に図示されている。
融合体１及び融合体２で得られた結果（図２及び３）は、その２つの融合タンパク質が良好な熱安定性及び良好な凍結解凍安定性を有することを示している。
実施例４．ソルチリンへの組み換えＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の結合
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器で、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５及びＨＢＳ－ＥＰ＋泳動緩衝液を用いて２５℃で、すべての表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）実験を実行した。ソルチリンについてのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の結合親和性を測定するために、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ヒトソルチリン用）またはＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（カニクイザル及びマウスソルチリン用、Ｃｙｔｉｖａ、＃２９１２７５５５）で固定化されたセンサーチップを用いて、融合タンパク質を捕捉した。マルチサイクルキネティクスを０．４ｎＭ～１００ｎＭの範囲のソルチリン分析物の３倍濃度系列で用いて、３００秒の接触時間、６００秒の解離時間、及び３０μＬ／分の流速を可能にした。１：１キネティクスモデルを使用して、ソルチリン結合の結合キネティクスを評価した。ソルチリンへのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質のＢｉａｃｏｒｅ結合データは、下の表５～７に示されている。ソルチリン分析物は次のとおり供給された：ヒトソルチリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；マウスソルチリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；カニクイザルソルチリン（社内、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａ０Ａ２Ｋ５ＶＨＧ２に基づく）。
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器で、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５及びＨＢＳ－ＥＰ＋泳動緩衝液を用いて２５℃で、すべての表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）実験を実行した。ソルチリンについてのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の結合親和性を測定するために、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ヒトソルチリン用）またはＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（カニクイザル及びマウスソルチリン用、Ｃｙｔｉｖａ、＃２９１２７５５５）で固定化されたセンサーチップを用いて、融合タンパク質を捕捉した。マルチサイクルキネティクスを０．４ｎＭ～１００ｎＭの範囲のソルチリン分析物の３倍濃度系列で用いて、３００秒の接触時間、６００秒の解離時間、及び３０μＬ／分の流速を可能にした。１：１キネティクスモデルを使用して、ソルチリン結合の結合キネティクスを評価した。ソルチリンへのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質のＢｉａｃｏｒｅ結合データは、下の表５～７に示されている。ソルチリン分析物は次のとおり供給された：ヒトソルチリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；マウスソルチリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；カニクイザルソルチリン（社内、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａ０Ａ２Ｋ５ＶＨＧ２に基づく）。
表５に示されているとおり、融合体１は、融合体２と比べてヒトソルチリンについて強い親和性を示した。ＨＥＫ細胞で発現される野生型ＰＧＲＮを含有する融合タンパク質（融合体１１）に対して、融合体１は、融合体２（およそ１４倍）よりも、ヒトソルチリンについて、結合親和性のより小さな低下（およそ３倍）を示した。ヒトソルチリン結合親和性の低下は、野生型ＰＧＲＮ融合タンパク質と比べて、融合体１及び融合体２の両方についての急速なオフレートキネティクスから生じていると考えられる。ＨＥＫ細胞で発現される野生型ＰＧＲＮ融合タンパク質（融合体１１）に対して、融合体１は、マウスソルチリンについてはほぼ同じ結合親和性、及びカニクイザルソルチリンについては約２～３倍弱い結合親和性を示した。
（表５）ヒトソルチリン結合
（表６）マウスソルチリン結合
（表７）カニクイザルソルチリン結合
追加の融合タンパク質のソルチリン結合をＳＰＲ（前出に記載）により、または固定化ソルチリンへのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の結合を測定する標準的な比色ＥＬＩＳＡアッセイにより分析した。ＥＬＩＳＡにより測定するために、組み換えＨｉｓタグ付きソルチリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．３１５４－ＳＴ－０５０）を、ニッケルコーティングされた９６ウェルプレート上に固定化した。インタクトなタンパク質及びＣ末端切断されたタンパク質の混合物を含有する融合タンパク質（表８Ａ及び８Ｂ中の「インタクト％」）を系列希釈法で３％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中で希釈して、コーティングされたウェルに添加した。融合タンパク質と共に室温で２時間にわたってインキュベートした後に、ウェルをＴＢＳＴで洗浄した。３％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中で希釈された抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ抗体、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔ．１０９－０３５－０８８）と共に、室温で１時間にわたってインキュベートすることにより、結合した融合タンパク質を検出した。検出抗体と共にインキュベートした後に、ウェルをＴＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ、Ｃａｔ．ＴＭＢＷ－１０００－０１）と共に５分間にわたってインキュベートした。顕色反応を４５０ｎＭ停止液（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ，Ｃａｔ．ＬＳＴＰ－１０００－０１）で停止し、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ Ｎｅｏ２）を使用して、吸光度を４５０ｎｍで測定した。例示的な融合タンパク質での結果を表８Ａ及び８Ｂに提示する。示されている場合を除いて、表８Ａ及び８Ｂに列挙されているすべての融合タンパク質はＣＨＯ細胞から発現させた。
（表８Ａ）
（表８Ｂ）
融合体３０、３３、４０、４３～５１、５３、５５～５９、６１、６２～６７、６９、７１、及び７２は、ＳＰＲにより測定すると、ソルチリン結合をほとんど示さないか、まったく示さなかった。
融合体１及び融合体２を、ヒトＴｆＲへの結合について表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によってもアッセイした。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器で、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５及びＨＢＳ－ＥＰ＋泳動緩衝液を用いて２５℃で実行した。ｈＴｆＲについての融合タンパク質の結合親和性を測定するために、センサーチップにストレプトアビジンを固定化し、ビオチン化－ＡｖｉＴａｇ－ｈＴｆＲを捕捉した。シングルサイクルキネティクスを、２５ｎＭ～２μＭの範囲である３倍濃度系列の融合タンパク質分析物で用いて、８０秒の接触時間、１８０秒の解離時間、及び３０μＬ／分の流速を可能にした。定常状態親和性モデルを使用して、融合タンパク質が約５０ｎＭ～１５０ｎＭの親和性でｈＴｆＲに結合し得ることを実証した。
実施例５．インビトロ機能アッセイ
Ｔｒｏｕｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１３（８１）５０９６６においてと同様の方法を用いて、ＢＭＤＭを、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの骨髄からインビトロで得たが（下記）、組み換えＭ－ＣＳＦを細胞増殖培地に直接添加して、分化を誘導した。４８時間にわたって、片対数タイトレーションでの融合体１１、融合体１、及び融合体２で、ＢＭＤＭを処理した。細胞脂質を、内部標準混合物を含有するメタノールの添加により抽出し、ＢＭＰ存在量を、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によりＱ－ｔｒａｐ ６５００（ＳＣＩＥＸ）で測定した。ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩ ＢＭＤＭは、ＧＲＮ ＷＴ／ｈＴｆＲ．ＫＩ ＢＭＤＭと比べて、ＢＭＰ３６：２の約２．５倍の増加を有した。融合体１及び融合体２の両方が、同等の有効性で、用量依存的にＢＭＰ蓄積を回復させた（図５）。野生型ＰＧＲＮを含有する融合タンパク質（融合体１１）と比べて、融合体１は、非常に類似したインビトロ効力を示した。
Ｔｒｏｕｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１３（８１）５０９６６においてと同様の方法を用いて、ＢＭＤＭを、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの骨髄からインビトロで得たが（下記）、組み換えＭ－ＣＳＦを細胞増殖培地に直接添加して、分化を誘導した。４８時間にわたって、片対数タイトレーションでの融合体１１、融合体１、及び融合体２で、ＢＭＤＭを処理した。細胞脂質を、内部標準混合物を含有するメタノールの添加により抽出し、ＢＭＰ存在量を、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によりＱ－ｔｒａｐ ６５００（ＳＣＩＥＸ）で測定した。ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩ ＢＭＤＭは、ＧＲＮ ＷＴ／ｈＴｆＲ．ＫＩ ＢＭＤＭと比べて、ＢＭＰ３６：２の約２．５倍の増加を有した。融合体１及び融合体２の両方が、同等の有効性で、用量依存的にＢＭＰ蓄積を回復させた（図５）。野生型ＰＧＲＮを含有する融合タンパク質（融合体１１）と比べて、融合体１は、非常に類似したインビトロ効力を示した。
液体クロマトグラフィー－質量分析法
ＢＭＰ分析を、エレクトロスプレー質量分析法（Ｓｃｉｅｘ ６５００＋ ＱＴＲＡＰ、Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に連結された液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ、ＵＳＡ）により実行した。各分析で、試料５μＬを、０．４０ｍＬ／分の流速を使用して５５℃でＢＥＨアミド１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）上に注入した。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸を含む水からなった。移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルからなった。勾配を次のとおりにプログラムした：Ｂ９５％で０．０～１．０分；１．０～７．０分でＢ５０％に；７．０～７．１分でＢ９５％に；及びＢ９５％で７．１～１２．０分。エレクトロスプレーイオン化を、次の設定を用いて陰イオンモードで実行した：カーテンガスは２５；衝突ガスは中等度に設定；イオンスプレー電圧は－４５００；温度は６００；イオン源ガス１は５０；イオン源ガス２は６０；衝突エネルギーは－５０、ＣＸＰは－１５；ＤＰは－６０；ＥＰは－１０；滞留時間は２０ｍｓ。Ａｎａｌｙｓｔ １．６．３（Ｓｃｉｅｘ）を多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で、以前に記載されたもの（Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５４５）：ｅａａｙ１１６３）と同様の収集パラメーターで使用して、データ収集を実行した。ＭＲＭ遷移パラメーターを用いて、ＢＭＰ種を検出した。内部標準としてＢＭＰ（１４：０＿１４：０）を使用して、ＢＭＰ種を定量化した。ＢＭＰ種をそれらの保持時間及びＭＲＭ特性に基づき同定した。同位体重複について補正した後に、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ３．０２（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、定量化を実行した。ＢＭＰ種を総タンパク質量、組織重量または生物体液体積のいずれかに対して正規化した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。
ＢＭＰ分析を、エレクトロスプレー質量分析法（Ｓｃｉｅｘ ６５００＋ ＱＴＲＡＰ、Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に連結された液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ、ＵＳＡ）により実行した。各分析で、試料５μＬを、０．４０ｍＬ／分の流速を使用して５５℃でＢＥＨアミド１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）上に注入した。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸を含む水からなった。移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルからなった。勾配を次のとおりにプログラムした：Ｂ９５％で０．０～１．０分；１．０～７．０分でＢ５０％に；７．０～７．１分でＢ９５％に；及びＢ９５％で７．１～１２．０分。エレクトロスプレーイオン化を、次の設定を用いて陰イオンモードで実行した：カーテンガスは２５；衝突ガスは中等度に設定；イオンスプレー電圧は－４５００；温度は６００；イオン源ガス１は５０；イオン源ガス２は６０；衝突エネルギーは－５０、ＣＸＰは－１５；ＤＰは－６０；ＥＰは－１０；滞留時間は２０ｍｓ。Ａｎａｌｙｓｔ １．６．３（Ｓｃｉｅｘ）を多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で、以前に記載されたもの（Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５４５）：ｅａａｙ１１６３）と同様の収集パラメーターで使用して、データ収集を実行した。ＭＲＭ遷移パラメーターを用いて、ＢＭＰ種を検出した。内部標準としてＢＭＰ（１４：０＿１４：０）を使用して、ＢＭＰ種を定量化した。ＢＭＰ種をそれらの保持時間及びＭＲＭ特性に基づき同定した。同位体重複について補正した後に、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ３．０２（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、定量化を実行した。ＢＭＰ種を総タンパク質量、組織重量または生物体液体積のいずれかに対して正規化した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。
プリカーサー（Ｑ１）［Ｍ－Ｈ］－及びプロダクトイオン（Ｑ３）ｍ／ｚ遷移を使用して、ＢＭＰ種を測定した。本明細書では、略語を使用して、２つの側鎖を有する種に言及するが、その際、脂肪酸側鎖の構造を、ＢＭＰフォーマットの括弧内に示す（例えば、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１））。数字は、脂肪酸炭素原子の数：二重結合の数の標準的な脂肪酸表記フォーマットに従っている。別法では、ＢＭＰ種は、一般的に、炭素原子の総数：二重結合の総数により言及され得；同様の値を有する種は、それらのＱ１及びＱ３値により識別され得る。
実施例６．ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスにおいて融合タンパク質はＢＢＢを通過して、関連する薬力学的エンドポイントを補正する
ＢＢＢを通過するその能力を試験するために、融合体１（表２）を、ｈＴｆＲ ＫＩマウスと交雑させたＧＲＮ ＫＯマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ．０１３１７５）（ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウス）に、尾静脈を介して注射した。ｈＴｆＲ ＫＩマウスは国際特許公開ＷＯ２０１８１５２２８５に記載されている。ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスを作製するために、第１のラウンドの交配で、ＧＲＮヘテロ接合型（ＧＲＮ ＨＥＴ）マウスをＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩホモ接合型（ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭ）マウスと交雑させて、ＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＥＴ後代を作製した。次いで、ＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＥＴマウスをＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスと交雑させて、この第２のラウンドでＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭ後代を得た。第３の最終ラウンドの交配で、ＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスをＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスと交雑させて、最終のＧＲＮ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスを作製し、それをこの研究で使用した。
ＢＢＢを通過するその能力を試験するために、融合体１（表２）を、ｈＴｆＲ ＫＩマウスと交雑させたＧＲＮ ＫＯマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ．０１３１７５）（ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウス）に、尾静脈を介して注射した。ｈＴｆＲ ＫＩマウスは国際特許公開ＷＯ２０１８１５２２８５に記載されている。ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスを作製するために、第１のラウンドの交配で、ＧＲＮヘテロ接合型（ＧＲＮ ＨＥＴ）マウスをＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩホモ接合型（ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭ）マウスと交雑させて、ＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＥＴ後代を作製した。次いで、ＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＥＴマウスをＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスと交雑させて、この第２のラウンドでＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭ後代を得た。第３の最終ラウンドの交配で、ＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスをＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスと交雑させて、最終のＧＲＮ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスを作製し、それをこの研究で使用した。
２～３か月齢のＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに、単回用量の滅菌生理食塩水（ビヒクル）または０．５、１．５、５、もしくは１５ｍｇ／ｋｇの融合体１を、尾静脈を介して静脈内投与した。血漿単離のために、投与後３日目に、マウスから、顎下採血により採血した。投与後７日目に、マウスをアベルチンで鎮静させ、心臓穿刺を実行して、血漿単離のために全血を収集した。動物を、５ｍＬ／分の速度で、５～８分にわたって、または肝臓から血液が除去されるまで、冷却した１×ＰＢＳで経心的に潅流した。肝臓及び脳の左半球の一部分１００ｍｇを収集した。血液試料を４℃にて１０００×ｇで遠心し、その後、上部血漿層を取り出し、ドライアイスで瞬間凍結し、下記のとおり分析するまで－８０℃以下で貯蔵した。すべての組織試料を直ちにドライアイスで瞬間凍結し、下記のとおり分析するまで－８０℃以下で貯蔵した。
（表９）研究設計／実験群
組織試料において融合タンパク質含有率を測定するために、組織試料を秤量し、１×プロテアーゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）及び１×ホスファターゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）を補充された１０倍重量体積（ｖｏｌｕｍｅ ｂｙ ｗｅｉｇｈｔ）の細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；２０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭベータ－グリセロホスファート、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、及び１μｇ／ｍＬロイペプチン）中で均質化した。ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒを３ｍｍ金属ビーズと共に２×３分間にわたって２９Ｈｚで使用して、試料を均質化した。均質化の後に、テーブルトップ型遠心分離器で、最大速度で、２０分間にわたって４℃で試料を回転させた。上清を新たな管に移し、上清の一部をＦｃ－ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｆｃ捕捉及びＰＧＲＮ検出ＥＬＩＳＡ）及びＦｃ－Ｆｃ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｆｃ捕捉及びＦｃ検出ＥＬＩＳＡ）により分析した。
試料でのＢＭＰ分析を実施例５に記載されているとおりに実施した。
可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）レベルを次のとおりに測定した：Ｔｒｅｍ２アッセイのために、１μｇ／ｍＬビオチン化ヒツジ抗マウス抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＦ１７２９）で終夜、４℃でコーティングすることにより、ＭＳＤ ＧＯＬＤ ９６ｗスモールスポットストレプトアビジンプレート（ＭＳＤ Ｌ４５ＳＡ）を調製した。翌日、ＭＳＤプレートを、トリトンを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）ですすぎ、かつ２時間にわたって、ＴＢＳＴ中３％ウシ血清アルブミンを用いて、６００ｒｐｍで振盪しながらブロックした。ＭＳＤプレートを再び、ＴＢＳＴですすぎ、脳溶解産物を遮断溶液中で５倍希釈し、ＭＳＤプレートに添加して、１時間にわたって６００ｒｐｍでインキュベートした。次のＴＢＳＴでのすすぎの後に、スルホタグ付きヒツジ抗マウス抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ１７２９）をプレートに添加し、１時間にわたって、再び６００ｒｐｍでインキュベートし、最後のすすぎを行い、その後、水中で希釈された２×ＭＳＤ読出し緩衝液を添加した。次いで、プレートを、ＭＳＤ Ｍｅｓｏ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ６００を使用して読み取った。Ｔｒｅｍ２シグナルをタンパク質濃度に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。
図６Ａ～６Ｃは、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの血漿、脳、及び肝臓における融合体１の薬物動態を図示している。中空の円形は、ビヒクル処置ＧＲＮ ＷＴコホートを表し、四角形はビヒクル処置ＧＲＮ ＫＯコホートを表す。融合タンパク質処置ＧＲＮ ＫＯコホートは、三角形（１５ｍｇ／ｋｇ）、ひし形（５ｍｇ／ｋｇ）、アステリスク（１．５ｍｇ／ｋｇ）及び×印（０．５ｍｇ／ｋｇ）により表されている。すべての用量で、投与後７日目に、融合タンパク質が血漿、脳及び肝臓から除去され、その際、組織中で検出されるタンパク質は０．１ｎＭ未満であり、かつ血漿中で検出されるタンパク質では約１ｎＭであった。
図７Ａ及び７Ｂは、投与後７日目のＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの脳及び肝臓組織におけるＴＲＥＭ２レベルを図示している。中空の円形は、ビヒクル処置ＧＲＮ ＷＴコホートを表し、四角形はビヒクル処置ＧＲＮ ＫＯコホートを表す。融合タンパク質処置ＧＲＮ ＫＯコホートは、三角形（１５ｍｇ／ｋｇ）、ひし形（５ｍｇ／ｋｇ）、アステリスク（１．５ｍｇ／ｋｇ）及び×印（０．５ｍｇ／ｋｇ）により表されている。脳では５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの用量レベルでＴＲＥＭ２レベルを回復させることができた一方で、肝臓では１．５ｍｇ／ｋｇの低い用量レベルでもＴＲＥＭ２レベルを回復させることができた。
図８Ａ及び８Ｂは、投与後７日目のＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの脳及び肝臓組織におけるＢＭＰ（１８：１／１８：１）のレベルを図示している。中空の円形は、ビヒクル処置ＧＲＮ ＷＴコホートを表し、四角形はビヒクル処置ＧＲＮ ＫＯコホートを表す。融合タンパク質処置ＧＲＮ ＫＯコホートは、三角形（１５ｍｇ／ｋｇ）、ひし形（５ｍｇ／ｋｇ）、アステリスク（１．５ｍｇ／ｋｇ）及び×印（０．５ｍｇ／ｋｇ）により表されている。脳では１．５ｍｇ／ｋｇの低い用量レベルでもＢＭＰレベルを回復させることができた一方で、肝臓ではすべての用量でＢＭＰレベルを回復させた。同様の結果が、ＢＭＰ（２０：４／２０：４）及びＢＭＰ（２２：６／２２：６）を含む他のＢＭＰ種で観察された。
図６Ａ～６Ｃ、７Ａ及び７Ｂ、ならびに８Ａ及び８Ｂのデータは、融合体１がＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの脳においてＢＢＢを通過して、グラニュリン欠損の関連ＰＤエンドポイントを補正することができることを示している。
実施例７．ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの脳組織におけるグルコシルスフィンゴシンレベルの回復
脂質抽出及びグルコシルスフィンゴシン分析のための脳収集及び処理
融合体１（表２に記載のとおり）またはいずれのＴｆＲ結合能も有さない対応する融合タンパク質を、単回用量で、尾静脈を介して５ｍｇ／ｋｇで、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウス（図９における「Ｇｒｎ ＫＯ」）に注射した。対応する融合タンパク質は、配列番号１２２の配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１０８の配列を有する第２のポリペプチドとを含む。両方の融合タンパク質を、実施例１に記載されているとおりにＣＨＯ細胞から発現させて、精製した。融合タンパク質の投与後７日目に、マウスを屠殺して、脳、肝臓及び血漿におけるグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）レベルを検査した。致死量のトリブロモエタノールで麻酔をかけた後に、マウスを、氷冷ＰＢＳで心臓潅流した。次いで、前頭葉１８～２０ｍｇを氷上で収集し、秤量し、１．５ Ｓａｆｅ－Ｌｏｃｋエッペンドルフ管に、３ｍｍステンレス鋼床と一緒に移し、次いで、急速冷凍させた。リピドーム分析用に脳試料を調製するために、ＬＣＭＳグレードのメタノール４００μＬを内部標準と共に試料に添加した。次いで、組織を、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒを用いて３０秒間にわたって、４℃にて２５Ｈｚで均質化した。次いで、試料を２０分間にわたって４℃にて２１，０００ｘｇで遠心した。回転の後に、上清を９６ウェルＶ底ハーフディープウェルプレートに移し、－２０℃で１時間にわたって貯蔵して、タンパク質をさらに沈澱させた。このインキュベーションの後に、試料をさらに１０分間にわたって、４℃にて２１，０００ｘｇで回転させた。１００μＬの上清を、ガラスインサートを備えた９６ウェルプレート（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｌｅｓ ＆ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｒｅｆ＃ ２７３５０）に移した。次いで、試料を窒素流下で乾燥させ（約２時間）、次いで、５ｍＭギ酸アンモニウム及び０．５％ギ酸を含むアセトニトリル／イソプロパノール／水１００μＬ（９２．５／５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ）に再懸濁させた。
脂質抽出及びグルコシルスフィンゴシン分析のための脳収集及び処理
融合体１（表２に記載のとおり）またはいずれのＴｆＲ結合能も有さない対応する融合タンパク質を、単回用量で、尾静脈を介して５ｍｇ／ｋｇで、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウス（図９における「Ｇｒｎ ＫＯ」）に注射した。対応する融合タンパク質は、配列番号１２２の配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１０８の配列を有する第２のポリペプチドとを含む。両方の融合タンパク質を、実施例１に記載されているとおりにＣＨＯ細胞から発現させて、精製した。融合タンパク質の投与後７日目に、マウスを屠殺して、脳、肝臓及び血漿におけるグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）レベルを検査した。致死量のトリブロモエタノールで麻酔をかけた後に、マウスを、氷冷ＰＢＳで心臓潅流した。次いで、前頭葉１８～２０ｍｇを氷上で収集し、秤量し、１．５ Ｓａｆｅ－Ｌｏｃｋエッペンドルフ管に、３ｍｍステンレス鋼床と一緒に移し、次いで、急速冷凍させた。リピドーム分析用に脳試料を調製するために、ＬＣＭＳグレードのメタノール４００μＬを内部標準と共に試料に添加した。次いで、組織を、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒを用いて３０秒間にわたって、４℃にて２５Ｈｚで均質化した。次いで、試料を２０分間にわたって４℃にて２１，０００ｘｇで遠心した。回転の後に、上清を９６ウェルＶ底ハーフディープウェルプレートに移し、－２０℃で１時間にわたって貯蔵して、タンパク質をさらに沈澱させた。このインキュベーションの後に、試料をさらに１０分間にわたって、４℃にて２１，０００ｘｇで回転させた。１００μＬの上清を、ガラスインサートを備えた９６ウェルプレート（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｌｅｓ ＆ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｒｅｆ＃ ２７３５０）に移した。次いで、試料を窒素流下で乾燥させ（約２時間）、次いで、５ｍＭギ酸アンモニウム及び０．５％ギ酸を含むアセトニトリル／イソプロパノール／水１００μＬ（９２．５／５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ）に再懸濁させた。
グルコシルスフィンゴシンのためのＬＣＭＳアッセイ
グルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）分析を、エレクトロスプレー質量分析法（Ｓｃｉｅｘ ＱＴＲＡＰ ６５００＋ Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に連結した液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ、ＵＳＡ）により実行した。各分析のために、０．４５ｍＬ／分の流速を使用して４５℃で、試料１０μＬをＨＡＬＯ ＨＩＬＩＣ ２．０μｍ、３．０×１５０ｍｍカラム（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＮ ９１８１３－７０１）に注入した。移動相Ａは、５ｍＭギ酸アンモニウム及び０．５％ギ酸を含む９２．５／５／２．５のＡＣＮ／ＩＰＡ／Ｈ２Ｏからなった。移動相Ｂは、５ｍＭギ酸アンモニウム及び０．５％ギ酸を含む９２．５／５／２．５のＨ２Ｏ／ＩＰＡ／ＡＣＮからなった。勾配は次のとおりにプログラムした：Ｂ１００％で０．０～３．１分、Ｂ９５％で３．２分、Ｂ８５％で５．７分、Ｂ８５％で７．１分まで保持、７．２５分でＢ０％に低下、８．７５分まで保持、１０．６５分で１００％まで増加させて戻して１１分まで保持。エレクトロスプレーイオン化を、次の設定を適用して陽イオンモードで実行した：カーテンガスは２５；衝突ガスは中等度に設定；イオンスプレー電圧は５５００；温度は３５０℃；イオン源ガス１は５５；イオン源ガス２は６０。Ａｎａｌｙｓｔ １．６（Ｓｃｉｅｘ）を多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で次のパラメーターで使用して、データ収集を実行した：滞留時間（ｍｓｅｃ）及び衝突エネルギー（ＣＥ）；エントランスポテンシャル（ＥＰ）は１０；及び衝突セルイグジットポテンシャル（ＣＸＰ）は１２．５。データ収集パラメーターは、以前に記載されたもの（Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５４５）：ｅａａｙ１１６３）と同様であった。ＧｌｃＳｐｈを、同位体標識内部標準ＧｌｃＳｐｈ（ｄ５）を使用して定量化した。ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ３．０２（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、定量化を実行した。
グルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）分析を、エレクトロスプレー質量分析法（Ｓｃｉｅｘ ＱＴＲＡＰ ６５００＋ Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に連結した液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ、ＵＳＡ）により実行した。各分析のために、０．４５ｍＬ／分の流速を使用して４５℃で、試料１０μＬをＨＡＬＯ ＨＩＬＩＣ ２．０μｍ、３．０×１５０ｍｍカラム（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＮ ９１８１３－７０１）に注入した。移動相Ａは、５ｍＭギ酸アンモニウム及び０．５％ギ酸を含む９２．５／５／２．５のＡＣＮ／ＩＰＡ／Ｈ２Ｏからなった。移動相Ｂは、５ｍＭギ酸アンモニウム及び０．５％ギ酸を含む９２．５／５／２．５のＨ２Ｏ／ＩＰＡ／ＡＣＮからなった。勾配は次のとおりにプログラムした：Ｂ１００％で０．０～３．１分、Ｂ９５％で３．２分、Ｂ８５％で５．７分、Ｂ８５％で７．１分まで保持、７．２５分でＢ０％に低下、８．７５分まで保持、１０．６５分で１００％まで増加させて戻して１１分まで保持。エレクトロスプレーイオン化を、次の設定を適用して陽イオンモードで実行した：カーテンガスは２５；衝突ガスは中等度に設定；イオンスプレー電圧は５５００；温度は３５０℃；イオン源ガス１は５５；イオン源ガス２は６０。Ａｎａｌｙｓｔ １．６（Ｓｃｉｅｘ）を多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で次のパラメーターで使用して、データ収集を実行した：滞留時間（ｍｓｅｃ）及び衝突エネルギー（ＣＥ）；エントランスポテンシャル（ＥＰ）は１０；及び衝突セルイグジットポテンシャル（ＣＸＰ）は１２．５。データ収集パラメーターは、以前に記載されたもの（Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５４５）：ｅａａｙ１１６３）と同様であった。ＧｌｃＳｐｈを、同位体標識内部標準ＧｌｃＳｐｈ（ｄ５）を使用して定量化した。ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ３．０２（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、定量化を実行した。
グルコシルスフィンゴシンの脳での結果
ＧＲＮ ＫＯ及びＧＲＮ ＷＴマウス、さらには５ｍｇ／ｋｇ用量の融合体１または対応する融合タンパク質をＩＶ投与されたＧＲＮ ＫＯマウスの脳におけるＧｌｃＳｐｈレベルを評価した（図９）。ＧＲＮ ＫＯ脳のＧｌｃＳｐｈレベルは平均で、ＷＴ同腹子の４．１３倍の値であった（それぞれ２３．９１±１．９６３ｎｇ／μＬ ｖｓ．５．７８２±１．２６２ｎｇ／μＬ、ｐ＝＜０．０００１）。融合体１処置マウスでは、ＧＲＮ ＷＴマウスに対して８８％の回復があった（７．８６６±０．８２３７ｎｇ／μＬ、ｐ＝０．０００２）。逆に、非ＣＮＳ標的化の対応融合タンパク質で処置されたＧＲＮ ＫＯマウスは、ＷＴ ＧｌｃＳｐｈレベルに対して２２％の回復しか示さなかった（１９．９２±３．４８６ｎｇ／μＬ、ｐ＝０．５６１９）。
ＧＲＮ ＫＯ及びＧＲＮ ＷＴマウス、さらには５ｍｇ／ｋｇ用量の融合体１または対応する融合タンパク質をＩＶ投与されたＧＲＮ ＫＯマウスの脳におけるＧｌｃＳｐｈレベルを評価した（図９）。ＧＲＮ ＫＯ脳のＧｌｃＳｐｈレベルは平均で、ＷＴ同腹子の４．１３倍の値であった（それぞれ２３．９１±１．９６３ｎｇ／μＬ ｖｓ．５．７８２±１．２６２ｎｇ／μＬ、ｐ＝＜０．０００１）。融合体１処置マウスでは、ＧＲＮ ＷＴマウスに対して８８％の回復があった（７．８６６±０．８２３７ｎｇ／μＬ、ｐ＝０．０００２）。逆に、非ＣＮＳ標的化の対応融合タンパク質で処置されたＧＲＮ ＫＯマウスは、ＷＴ ＧｌｃＳｐｈレベルに対して２２％の回復しか示さなかった（１９．９２±３．４８６ｎｇ／μＬ、ｐ＝０．５６１９）。
実施例８． ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスにおけるＢＭＰ及びグルコシルスフィンゴシン補正の永続性
融合体１（表２に記載のとおり、実施例１に記載のとおりにＣＨＯ細胞から発現及び精製）を単回用量で尾静脈を介して、次の用量でＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに注射した：１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、及び５ｍｇ／ｋｇ。対照のために、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩ及びＧＲＮ野生型／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに生理食塩水を注射した。融合タンパク質または生理食塩水の投与後２、３及び６週間目に、マウスのコホートを屠殺して、脳におけるＢＭＰ及びグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）レベルを検査した。マウスに麻酔をかけ、それらの脳組織を実施例７に記載のとおりに調製した。ＢＭＰ及びＧｌｃＳｐｈレベルをそれぞれ、実施例５及び７に記載のとおりに測定した。結果は、図１０～１２に図示されている。
融合体１（表２に記載のとおり、実施例１に記載のとおりにＣＨＯ細胞から発現及び精製）を単回用量で尾静脈を介して、次の用量でＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに注射した：１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、及び５ｍｇ／ｋｇ。対照のために、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩ及びＧＲＮ野生型／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに生理食塩水を注射した。融合タンパク質または生理食塩水の投与後２、３及び６週間目に、マウスのコホートを屠殺して、脳におけるＢＭＰ及びグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）レベルを検査した。マウスに麻酔をかけ、それらの脳組織を実施例７に記載のとおりに調製した。ＢＭＰ及びＧｌｃＳｐｈレベルをそれぞれ、実施例５及び７に記載のとおりに測定した。結果は、図１０～１２に図示されている。
グルコシルスフィンゴシンの脳での結果
ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩ及びＧＲＮ野生型／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスにおけるグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）レベルを評価した。図１０に図示されているとおり、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩにおけるＧｌｃＳｐｈレベルは、ＧＲＮ野生型／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスと比べて約４倍上昇した。融合体１の投与はすべての用量で、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩにおけるＧｌｃＳｐｈレベルの上昇を補正し、その際、投与された最大用量（５ｍｇ／ｋｇ）は、すべての融合タンパク質処置コホートの最大の改善を示した。投与後６週間でも部分的な補正が観察されたが、投与後２週目に、融合体１の単回用量で、ほぼＧＲＮ野生型レベルへの最大補正が観察された。
ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩ及びＧＲＮ野生型／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスにおけるグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）レベルを評価した。図１０に図示されているとおり、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩにおけるＧｌｃＳｐｈレベルは、ＧＲＮ野生型／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスと比べて約４倍上昇した。融合体１の投与はすべての用量で、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩにおけるＧｌｃＳｐｈレベルの上昇を補正し、その際、投与された最大用量（５ｍｇ／ｋｇ）は、すべての融合タンパク質処置コホートの最大の改善を示した。投与後６週間でも部分的な補正が観察されたが、投与後２週目に、融合体１の単回用量で、ほぼＧＲＮ野生型レベルへの最大補正が観察された。
ＢＭＰの脳での結果
以前に報告されたとおり、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩにおけるＢＭＰレベルは、不十分なレベルのプログラニュリンにより影響を受ける。融合体１をＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩに投与することで、この影響を補正することができた。代表的なＢＭＰ種のレベルは図１１及び１２に図示されている。融合体１の投与はすべての用量で、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩにおけるＢＭＰレベルを補正した。投与された最大用量で、投与後２週目にＢＭＰレベルの最大補正が観察され、その際、投与後３週目に部分的な補正が維持された。
以前に報告されたとおり、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩにおけるＢＭＰレベルは、不十分なレベルのプログラニュリンにより影響を受ける。融合体１をＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩに投与することで、この影響を補正することができた。代表的なＢＭＰ種のレベルは図１１及び１２に図示されている。融合体１の投与はすべての用量で、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩにおけるＢＭＰレベルを補正した。投与された最大用量で、投与後２週目にＢＭＰレベルの最大補正が観察され、その際、投与後３週目に部分的な補正が維持された。
実施例９．ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスにおけるＧＣアーゼ活性の回復
融合体１（表２に記載されているとおり、実施例１に記載のとおりにＣＨＯ細胞から発現及び精製）を、尾静脈を介して、実施例８に記載の用量で、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに注射した。対照のために、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩ及びＧＲＮ野生型／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに、生理食塩水を注射した。融合タンパク質または生理食塩水の投与後２、３及び６週間目に、マウスのコホートを屠殺して、脳におけるグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）酵素活性を検査した。マウスに麻酔をかけ、それらの脳組織を実施例７に記載のとおりに調製した。ＧＣアーゼ活性を次のとおりにアッセイした。脳組織をＰＢＳ緩衝液中１％ＮＰ－４０中で溶解させた。脳溶解産物試料における総タンパク質レベルをＢＣＡアッセイにより測定し、試料をＧＣアーゼ活性の測定のために正規化した。組織試料を初めに、ＧＢＡ活性緩衝液（０．５％タウロコール酸ナトリウム及び０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むリン酸クエン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ＃ Ｐ４８０９））中で希釈し、９６ウェルプレートのウェルに添加した。続いて、４－ＭＵグルコース基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｍ３６３３－１Ｇ）を１ｍＭの最終濃度まで各試料ウェルに添加した。プレートにカバーをし、７００ＲＰＭで５分間にわたって室温で撹拌し、その後、非ＣＯ２インキュベーターに移し、３７℃で３時間にわたってインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、停止液（５００ｍＭグリシン、３００ｍＭ ＮａＯＨ、ｐＨ９．８）を試料に添加して酵素反応を停止し、ＢｉｏＴｅｋプレートリーダーで酵素活性を測定した。結果は、図１３に図示されている。
融合体１（表２に記載されているとおり、実施例１に記載のとおりにＣＨＯ細胞から発現及び精製）を、尾静脈を介して、実施例８に記載の用量で、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに注射した。対照のために、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩ及びＧＲＮ野生型／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに、生理食塩水を注射した。融合タンパク質または生理食塩水の投与後２、３及び６週間目に、マウスのコホートを屠殺して、脳におけるグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）酵素活性を検査した。マウスに麻酔をかけ、それらの脳組織を実施例７に記載のとおりに調製した。ＧＣアーゼ活性を次のとおりにアッセイした。脳組織をＰＢＳ緩衝液中１％ＮＰ－４０中で溶解させた。脳溶解産物試料における総タンパク質レベルをＢＣＡアッセイにより測定し、試料をＧＣアーゼ活性の測定のために正規化した。組織試料を初めに、ＧＢＡ活性緩衝液（０．５％タウロコール酸ナトリウム及び０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むリン酸クエン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ＃ Ｐ４８０９））中で希釈し、９６ウェルプレートのウェルに添加した。続いて、４－ＭＵグルコース基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｍ３６３３－１Ｇ）を１ｍＭの最終濃度まで各試料ウェルに添加した。プレートにカバーをし、７００ＲＰＭで５分間にわたって室温で撹拌し、その後、非ＣＯ２インキュベーターに移し、３７℃で３時間にわたってインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、停止液（５００ｍＭグリシン、３００ｍＭ ＮａＯＨ、ｐＨ９．８）を試料に添加して酵素反応を停止し、ＢｉｏＴｅｋプレートリーダーで酵素活性を測定した。結果は、図１３に図示されている。
図１３に図示されているとおり、投与後２週目に、融合体１の投与は、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの脳におけるＧＣアーゼ活性を野生型レベルまで補正した。
実施例１０．融合タンパク質の長期投薬は、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスにおいて遠位バイオマーカーを回復させる
本明細書に記載のとおりの融合タンパク質の長期投薬が遠位バイオマーカーを回復させ得るか否かを決定するために、研究を実施した。融合タンパク質を、７か月齢ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに、５ｍｇ／ｋｇで１週間に１回、８週間にわたって腹腔内送達により投与した。対照のために、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩ及びＧＲＮ野生型／ｈＴｆＲ．ＫＩマウス（「ｈＴｆＲ．ＫＩマウス」とも称される）に生理食塩水を注射した。ＣＤ４の注射を各コホートのマウスに対して、融合タンパク質の最初の投与と共に開始し、かつその後は、２週ごとに与えた。血漿単離のために、（投与後）０、２、４、６、及び８週目に、血液試料を顎下採血により採血した。融合タンパク質の８回目の最後の投与から２４時間後に、マウスのコホートを屠殺し；末端血液及びＣＳＦ試料を得、脳及び肝臓組織を収集し、既に記載したとおりに（実施例６）、保存した。実施例６に記載のＦｃ：Ｆｃ：ＥＬＩＳＡを使用して、投与された融合タンパク質の量を脳及び肝臓において測定した。ＢＭＰ、グルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）、及びＴｒｅｍ２レベルを脳、肝臓、血漿、及び／またはＣＳＦにおいて分析した。加えて、グリオーシスの特定のマーカー（ＣＤ６８、Ｉｂａ１、ＧＦＡＰ）を脳組織において分析し、ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆ－Ｌ）レベルをＣＳＦ及び血漿試料において分析した。ＢＭＰ、ＴＲＥＭ２、及びＧｌｃＳｐｈレベルをそれぞれ実施例５、６、及び７に記載のとおりに測定した。ＣＳＦ Ｎｆ－Ｌレベル及びグリオーシスマーカーの脳レベルを、下記のとおりに測定した。表１０は実験設計の概要を提示しており、結果は、図１４～２８において図示されている。
本明細書に記載のとおりの融合タンパク質の長期投薬が遠位バイオマーカーを回復させ得るか否かを決定するために、研究を実施した。融合タンパク質を、７か月齢ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに、５ｍｇ／ｋｇで１週間に１回、８週間にわたって腹腔内送達により投与した。対照のために、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩ及びＧＲＮ野生型／ｈＴｆＲ．ＫＩマウス（「ｈＴｆＲ．ＫＩマウス」とも称される）に生理食塩水を注射した。ＣＤ４の注射を各コホートのマウスに対して、融合タンパク質の最初の投与と共に開始し、かつその後は、２週ごとに与えた。血漿単離のために、（投与後）０、２、４、６、及び８週目に、血液試料を顎下採血により採血した。融合タンパク質の８回目の最後の投与から２４時間後に、マウスのコホートを屠殺し；末端血液及びＣＳＦ試料を得、脳及び肝臓組織を収集し、既に記載したとおりに（実施例６）、保存した。実施例６に記載のＦｃ：Ｆｃ：ＥＬＩＳＡを使用して、投与された融合タンパク質の量を脳及び肝臓において測定した。ＢＭＰ、グルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）、及びＴｒｅｍ２レベルを脳、肝臓、血漿、及び／またはＣＳＦにおいて分析した。加えて、グリオーシスの特定のマーカー（ＣＤ６８、Ｉｂａ１、ＧＦＡＰ）を脳組織において分析し、ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆ－Ｌ）レベルをＣＳＦ及び血漿試料において分析した。ＢＭＰ、ＴＲＥＭ２、及びＧｌｃＳｐｈレベルをそれぞれ実施例５、６、及び７に記載のとおりに測定した。ＣＳＦ Ｎｆ－Ｌレベル及びグリオーシスマーカーの脳レベルを、下記のとおりに測定した。表１０は実験設計の概要を提示しており、結果は、図１４～２８において図示されている。
（表１０）長期投薬研究のための研究設計／実験群
Ｎｆ－ＬのＣＳＦ及び血漿分析のための方法
既に記載されたとおりに、また製造者の推奨に従って（Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５４５）：ｅａａｙ１１６３）、ＣＳＦ及び血漿Ｎｆ－Ｌレベルを分析した。簡単に述べると、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ Ｓｉｍｏａ Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ Ｌｉｇｈｔ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（ＮＦＬ）キットを用いる。簡単に述べると、試料希釈剤（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ １０２２５２）で脳脊髄液を１００倍希釈し、血漿を１０倍希釈し、次いで、Ｓｉｍｏａ検出器試薬及びビーズ試薬（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ １０３１５９、１０２２４６）を添加し、試料を３０分間にわたって３０℃で、８００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。この後、Ｓｉｍｏａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｗａｓｈｅｒで、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ２ステッププロトコルに従って、試料プレートをＳｉｍｏａ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ １０３０７８）で洗浄し、ＳＢＧ試薬（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ １０２２５０）を添加し、試料を再び、３０℃、８００ｒｐｍで、さらに１０分間にわたってインキュベートした。２ステップウォッシャープロトコルを継続し、その際、緩衝液の最終吸引の前に、試料ビーズをＳｉｍｏａ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ １０３０７９）に２回再懸濁した。１０分間にわたって室温で乾燥させた後に、試料Ｎｆ－Ｌ濃度を、Ｎｆ－Ｌ分析プロトコルを用いてＱｕａｎｔｅｒｉｘ ＳＲ－Ｘ機器で測定し、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘアッセイキットに備えられている較正曲線に対して挿入した。
既に記載されたとおりに、また製造者の推奨に従って（Ｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５４５）：ｅａａｙ１１６３）、ＣＳＦ及び血漿Ｎｆ－Ｌレベルを分析した。簡単に述べると、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ Ｓｉｍｏａ Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ Ｌｉｇｈｔ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（ＮＦＬ）キットを用いる。簡単に述べると、試料希釈剤（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ １０２２５２）で脳脊髄液を１００倍希釈し、血漿を１０倍希釈し、次いで、Ｓｉｍｏａ検出器試薬及びビーズ試薬（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ １０３１５９、１０２２４６）を添加し、試料を３０分間にわたって３０℃で、８００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。この後、Ｓｉｍｏａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｗａｓｈｅｒで、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ２ステッププロトコルに従って、試料プレートをＳｉｍｏａ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ １０３０７８）で洗浄し、ＳＢＧ試薬（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ １０２２５０）を添加し、試料を再び、３０℃、８００ｒｐｍで、さらに１０分間にわたってインキュベートした。２ステップウォッシャープロトコルを継続し、その際、緩衝液の最終吸引の前に、試料ビーズをＳｉｍｏａ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ １０３０７９）に２回再懸濁した。１０分間にわたって室温で乾燥させた後に、試料Ｎｆ－Ｌ濃度を、Ｎｆ－Ｌ分析プロトコルを用いてＱｕａｎｔｅｒｉｘ ＳＲ－Ｘ機器で測定し、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘアッセイキットに備えられている較正曲線に対して挿入した。
グリオーシスマーカーのためのアッセイ
ＰＢＳ経心潅流及び４％ＰＦＡ中での後固定の後に、マウス半脳を冠状切断した。簡単に述べると、多数の脳（最高４０）をトリムし、単一のゼラチンブロックに載せ、次いで、４０μｍの厚さで環状切断した。次いで、染色まで、包埋脳切片を含むゼラチンシートを抗原保存溶液（５０％ＰＢＳ：５０％エチレングリコール＋１％ＰＶＰ）中で貯蔵した。切片をグリオーシスマーカーＧＦＡＰ（ロバ抗ニワトリ、Ｎｏｖｕｓ ＮＢＰ１－０５１９８、１：１０００）、Ｉｂａ１（ロバ抗ヤギ、Ｎｏｖｕｓ ＮＢ１００－１０２８、１：１５００）及びＣＤ６８（ロバ抗ラット、ＢｉｏＲａｄ ＭＣＡ１９５７、１：５００）について染色した。簡単に述べると、切片を、振動させながら室温で４時間にわたって、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％フィッシュゼラチン＋０．５％トリトンＸ－１００）中でインキュベートし、次いで、上に列挙した濃度で一次抗体を含む抗体希釈緩衝液に移し、振動させながら４℃で終夜貯蔵した。ＰＢＳ中で３回洗浄した後に、次いで、試料を、二次抗体を含む抗体希釈緩衝液に移し（１：５００希釈）、振動させながら室温で４時間にわたってインキュベートした。次いで、試料をＰＢＳ＋ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄ１３０６ １：１０，０００）で２０分間洗浄し、次いで、ＰＢＳでさらに２回洗浄し、その後、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｌａｓｓハードセット・マウンティング媒体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ Ｐ３６９８４）と共に２×３インチスライドに載せ、終夜、室温で乾燥させた。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１デジタルスライドスキャナを用いて、全脳半球を２０倍で画像化した。Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌｕｅ ３．２ソフトウェアを用いて、画像分析を完了した。視床ＲＯＩを抽出し、ローリングボール閾値化アプローチを使用して、総視床面積と比べて、各グリオーシスマーカーの面積を決定した。１つの脳あたり１～３個の切片を分析し、平均被覆パーセント値を画像全体で算出した。
ＰＢＳ経心潅流及び４％ＰＦＡ中での後固定の後に、マウス半脳を冠状切断した。簡単に述べると、多数の脳（最高４０）をトリムし、単一のゼラチンブロックに載せ、次いで、４０μｍの厚さで環状切断した。次いで、染色まで、包埋脳切片を含むゼラチンシートを抗原保存溶液（５０％ＰＢＳ：５０％エチレングリコール＋１％ＰＶＰ）中で貯蔵した。切片をグリオーシスマーカーＧＦＡＰ（ロバ抗ニワトリ、Ｎｏｖｕｓ ＮＢＰ１－０５１９８、１：１０００）、Ｉｂａ１（ロバ抗ヤギ、Ｎｏｖｕｓ ＮＢ１００－１０２８、１：１５００）及びＣＤ６８（ロバ抗ラット、ＢｉｏＲａｄ ＭＣＡ１９５７、１：５００）について染色した。簡単に述べると、切片を、振動させながら室温で４時間にわたって、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％フィッシュゼラチン＋０．５％トリトンＸ－１００）中でインキュベートし、次いで、上に列挙した濃度で一次抗体を含む抗体希釈緩衝液に移し、振動させながら４℃で終夜貯蔵した。ＰＢＳ中で３回洗浄した後に、次いで、試料を、二次抗体を含む抗体希釈緩衝液に移し（１：５００希釈）、振動させながら室温で４時間にわたってインキュベートした。次いで、試料をＰＢＳ＋ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄ１３０６ １：１０，０００）で２０分間洗浄し、次いで、ＰＢＳでさらに２回洗浄し、その後、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｌａｓｓハードセット・マウンティング媒体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ Ｐ３６９８４）と共に２×３インチスライドに載せ、終夜、室温で乾燥させた。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１デジタルスライドスキャナを用いて、全脳半球を２０倍で画像化した。Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌｕｅ ３．２ソフトウェアを用いて、画像分析を完了した。視床ＲＯＩを抽出し、ローリングボール閾値化アプローチを使用して、総視床面積と比べて、各グリオーシスマーカーの面積を決定した。１つの脳あたり１～３個の切片を分析し、平均被覆パーセント値を画像全体で算出した。
ＣＮＳ細胞型の単離
ＣＮＳ細胞を選別するための単一細胞懸濁液を調製するために、脳組織を解剖し、製造者プロトコルに従って成体脳解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０７－６７７）を使用して、単一細胞懸濁液に処理した。細胞をＦｃ遮断し（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１０１３２０、１：１００）、フローサイトメトリー分析のために、死細胞を除外するためのＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ ＢＶ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６４４０６、１：１００）、ＣＤ１１ｂ－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５６２６０５、１：１００）、ＡＣＳＡ２－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＃１３０－１１７－３８６、１：１００）、及びＴｈｙ１－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ＃ＦＡＢ７３３５Ｐ、１：１００）を用いて染色した。細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄し、１００μｍフィルターに通して濾過し、その後、１００μｍノズルを備えたＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、ＣＤ１１ｂ＋ミクログリア、ＡＣＳＡ２＋星状細胞、及びＴｈｙ１＋ニューロンを選別した。選別された細胞を、リピドーム及びメタボローム分析のために内部標準が添加されているＭＳグレードのメタノールに直接収集した。実施例１に記載の方法と同様の方法を使用して、ＧＡＧ、ＢＭＰ、ガングリオシド、ＧｌｃＣｅｒ、及びＧａｌＣｅｒを測定するための細胞溶解産物調製及びＬＣＭＳアッセイを実行した。
ＣＮＳ細胞を選別するための単一細胞懸濁液を調製するために、脳組織を解剖し、製造者プロトコルに従って成体脳解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０７－６７７）を使用して、単一細胞懸濁液に処理した。細胞をＦｃ遮断し（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃１０１３２０、１：１００）、フローサイトメトリー分析のために、死細胞を除外するためのＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ ＢＶ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６４４０６、１：１００）、ＣＤ１１ｂ－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５６２６０５、１：１００）、ＡＣＳＡ２－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＃１３０－１１７－３８６、１：１００）、及びＴｈｙ１－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ＃ＦＡＢ７３３５Ｐ、１：１００）を用いて染色した。細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄し、１００μｍフィルターに通して濾過し、その後、１００μｍノズルを備えたＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、ＣＤ１１ｂ＋ミクログリア、ＡＣＳＡ２＋星状細胞、及びＴｈｙ１＋ニューロンを選別した。選別された細胞を、リピドーム及びメタボローム分析のために内部標準が添加されているＭＳグレードのメタノールに直接収集した。実施例１に記載の方法と同様の方法を使用して、ＧＡＧ、ＢＭＰ、ガングリオシド、ＧｌｃＣｅｒ、及びＧａｌＣｅｒを測定するための細胞溶解産物調製及びＬＣＭＳアッセイを実行した。
結果
図１４及び１５は、処置されたＧＲＮ ＫＯマウスコホートの脳及び肝臓組織における、投与された融合タンパク質の濃度についての情報を提供している。図１４及び１５に図示されているとおり、融合体１及び１１におけるＴｆＲ結合は、非ＴｆＲ結合Ｆｃ：ＰＧＲＮタンパク質と比べて、タンパク質の脳取り込みの有意な上昇を推し進めた。加えて、融合体１での８週までの毎週の処置は、同じものの単回腹腔内用量と比べて、タンパク質の脳取り込みを減少させなかった。他方で、肝臓におけるＦｃ：ＰＧＲＮの曝露量は、おそらく末梢からのＴｆＲ媒介クリアランスの欠如により、融合体１及び融合体１１の曝露量よりも大きかった。
図１４及び１５は、処置されたＧＲＮ ＫＯマウスコホートの脳及び肝臓組織における、投与された融合タンパク質の濃度についての情報を提供している。図１４及び１５に図示されているとおり、融合体１及び１１におけるＴｆＲ結合は、非ＴｆＲ結合Ｆｃ：ＰＧＲＮタンパク質と比べて、タンパク質の脳取り込みの有意な上昇を推し進めた。加えて、融合体１での８週までの毎週の処置は、同じものの単回腹腔内用量と比べて、タンパク質の脳取り込みを減少させなかった。他方で、肝臓におけるＦｃ：ＰＧＲＮの曝露量は、おそらく末梢からのＴｆＲ媒介クリアランスの欠如により、融合体１及び融合体１１の曝露量よりも大きかった。
図１６～１９は、処置されたＧＲＮ ＫＯマウスコホートの脳、ＣＳＦ、肝臓、及び血漿における例示的なＢＭＰ（ジ－２２：６）のレベルについての情報を提供している。図１６及び１７において図示されているとおり、８週までの融合体１及び融合体１１の毎週の投与は両方とも、ビヒクル処置またはＦｃ：ＰＧＲＮでの処置と比べて、ＣＮＳコンパートメント（脳、ＣＳＦ）におけるＢＭＰレベルの回復を改善した。末梢（肝臓、血漿）では、Ｆｃ：ＰＧＲＮ、融合体１、及び融合体１１の投与は、同等の効果で、ＢＭＰレベルを回復させた。
図２０及び２１は、処置されたＧＲＮ ＫＯマウスコホートの脳及び肝臓組織におけるＧｌｃＳｐｈレベルについての情報を提供している。図２０に図示されているとおり、８週までの融合体１及び融合体１１の毎週の投与は、ビヒクル処置及びＦｃ：ＰＧＲＮでの処置と比べて、脳におけるＧｌｃＳｐｈレベルを統計学的に有意に回復させた。末梢では（図２１）、Ｆｃ：ＰＧＲＮ、融合体１及び融合体１１の毎週の投与は、同等の効果で、ＧｌｃＳｐｈレベルを回復させた。
図２２は、処置されたＧＲＮ ＫＯマウスコホートにおけるＣＳＦ Ｎｆ－Ｌレベルについての情報を提供している。図２２において図示されているとおり、ＧＲＮ ＫＯマウスにおける融合体１の毎週投与の８週後に、ＣＳＦ Ｎｆ－Ｌの減少傾向が観察された。対照的に、ＣＳＦ Ｎｆ－Ｌは、Ｆｃ：ＰＧＲＮまたは融合体１１での毎週処置により補正されないようであった。
図２３は、処置されたＧＲＮ ＫＯマウスコホートの脳における相対的ＴＲＥＭ２レベルについての情報を提供している。図２３において図示されているとおり、８週までの融合体１の毎週投与は、ビヒクル処置と比べて統計学的に有意に、脳組織におけるＴＲＥＭ２レベルを低下させた。融合体１１の毎週投与も、ＧＲＮ ＫＯマウスの脳においてＴＲＥＭ２レベルを低下させたが、効果は、融合体１の毎週投与で観察された効果ほどには大きくなかった。
図２４～２６は、処置されたＧＲＮ ＫＯマウスコホートの脳（視床）におけるグリオーシスマーカーについての情報を提供している。図２４～２６において図示されているとおり、８週までのＦｃ：ＰＧＲＮ、融合体１、及び融合体１１の毎週投与は、ビヒクル処置と比べて、ＧＲＮ ＫＯマウスの脳においてＣＤ６８、Ｉｂａ１、及びＧＦＡＰのレベルを低下させた。
図２７は、処置されたＧＲＮ ＫＯマウスコホートの脳組織から選別されたニューロン、星状細胞、及びミクログリア細胞におけるＢＭＰ及びある特定の脂質のヒートマップである。図２７に図示されているとおり、８週までの融合体１の毎週投与は、ミクログリア、星状細胞及びニューロン全体で、ＢＭＰ表現型を回復させた。この回復はミクログリア細胞において最も顕著であったが、星状細胞及びニューロンにおいても、補正がより低い程度で観察された。図２８～３０は、（ビヒクル処置されたＧＲＮ野生型（ｈＴｆＲ．ＫＩ）コホートのＣＮＳ細胞と比べて）処置されたＧＲＮ ＫＯのニューロン、星状細胞、及びミクログリア細胞の選別された集団における、融合体１の投与時の、ある特定のＢＭＰ種（ＢＭＰ １８：１／１８：１、ＢＭＰ ２２：６／２２：６、及びＢＭＰ ２０：４／２０：４）を補正する傾向を図示している。
本明細書に記載の実施例及び実施形態が例示を目的としたものに過ぎないこと、及びその観点から様々な変更または変化が当業者に示唆され、かつ本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれ得ることは理解される。本明細書において引用された配列アクセッション番号の配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
略式の配列表
Claims (123)
- 配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、及び配列番号２の残基５７４から５７６に対応する位置におけるＸ１Ｘ２Ｘ３により定義される配列を含む、プログラニュリン変異体であって、
ここで、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が、それぞれ独立にアミノ酸であり、合わさってＱＬＬではない、
プログラニュリン変異体。 - 配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載のプログラニュリン変異体。
- 配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性を有する、請求項１または２に記載のプログラニュリン変異体。
- 配列番号２に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- 配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のプログラニュリン変異体。
- 配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項１または５に記載のプログラニュリン変異体。
- 配列番号２に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１、５、及び６のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- 配列：
を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- Ｘ１が、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、またはＶである、請求項１～８のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- Ｘ２が、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、またはＲである、請求項１～９のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- Ｘ３が、Ｌ、Ｙ、またはＰである、請求項１～１０のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、Ｘ１ＩＬ、Ｘ１ＦＬ、Ｘ１ＱＬ、ＰＸ２Ｌ、ＱＸ２Ｌ、またはＶＸ２Ｌである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、Ｘ１Ｘ２Ｌである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- Ｘ２が、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、またはＶである、請求項１３に記載のプログラニュリン変異体。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、ＰＩＬ、ＰＦＬ、ＱＱＬ、ＶＶＬ、またはＶＴＬである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、ＰＰＬ、ＰＹＬ、ＱＱＬ、ＱＨＬ、またはＱＲＬである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- 配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、及び配列番号２の残基５７６に対応する位置に隣接しかつそのＣ末端側にあるＹ１Ｙ２ＱＬＬ（配列番号１３７）により定義される配列を含む、プログラニュリン変異体であって、
ここで、Ｙ１がＬであるか、または存在せず、かつＹ２がＲであるか、または存在しない、
プログラニュリン変異体。 - 前記プログラニュリン変異体が、配列：
を含み、
ここで、Ｙ１がＬであるか、または存在せず、かつＹ２がＲであるか、または存在しない、
請求項１７に記載のプログラニュリン変異体。 - Ｙ１がＬである、請求項１７または１８に記載のプログラニュリン変異体。
- Ｙ２がＲである、請求項１７～１９のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体。
- Ｙ１及びＹ２が両方とも存在しない、請求項１７または１８に記載のプログラニュリン変異体。
- 配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、及び配列番号２の残基５７４から５７６に対応する位置におけるＸ１Ｘ２Ｘ３により定義される配列を含む、プログラニュリン変異体であって、
ここで、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が、それぞれ独立にアミノ酸であり、合わさってＱＬＬではない、
プログラニュリン変異体
を含む、ポリペプチド。 - 前記プログラニュリン変異体が、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項２２に記載のポリペプチド。
- 前記プログラニュリン変異体が、配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性を有する、請求項２２または２３に記載のポリペプチド。
- 前記プログラニュリン変異体が、配列番号２に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項２２～２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記プログラニュリン変異体が、配列：
を有する、請求項２２～２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１が、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、またはＶである、請求項２２～２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ２が、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、またはＲである、請求項２２～２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ３が、Ｌ、Ｙ、またはＰである、請求項２２～２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、Ｘ１ＩＬ、Ｘ１ＦＬ、またはＸ１ＱＬである、請求項２２～２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、ＰＸ２Ｌ、ＱＸ２Ｌ、またはＶＸ２Ｌである、請求項２２～２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、Ｘ１Ｘ２Ｌである、請求項２２～２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ２が、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、またはＶである、請求項３２に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３がＰＩＬである、請求項２２～３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３がＰＦＬである、請求項２２～３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３がＱＱＬである、請求項２２～３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３がＶＶＬである、請求項２２～２９及び３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３がＶＴＬである、請求項２２～２９及び３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３がＰＰＬである、請求項２２～２９及び３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３がＰＹＬである、請求項２２～２９及び３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３がＱＲＬである、請求項２２～２９及び３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｘ１Ｘ２Ｘ３がＱＨＬである、請求項２２～２９及び３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、及び配列番号２の残基５７６に対応する位置に隣接しかつそのＣ末端側にあるＹ１Ｙ２ＱＬＬ（配列番号１３７）により定義される配列を含む、プログラニュリン変異体であって、
ここで、Ｙ１がＬであるか、または存在せず、かつＹ２がＲであるか、または存在しない、
プログラニュリン変異体
を含む、ポリペプチド。 - 前記プログラニュリン変異体が、配列：
を含み、
ここで、Ｙ１がＬであるか、または存在せず、かつＹ２がＲであるか、または存在しない、
請求項４３に記載のポリペプチド。 - Ｙ１がＬである、請求項４４に記載のポリペプチド。
- Ｙ２がＲである、請求項４３～４５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- Ｙ１及びＹ２が両方とも存在しない、請求項４３または４４に記載のポリペプチド。
- 前記プログラニュリン変異体に連結しているＦｃポリペプチドをさらに含む、請求項２２～４７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記ＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端が、前記プログラニュリン変異体に連結している、請求項４８に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃポリペプチドが、ペプチド結合により、またはポリペプチドリンカーにより前記プログラニュリン変異体に連結している、請求項４８または４９に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドリンカーが１～５０アミノ酸長である、請求項５０に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドリンカーが柔軟なポリペプチドリンカーである、請求項５０または５１に記載のポリペプチド。
- 前記柔軟なポリペプチドリンカーが、グリシンリッチなリンカーである、請求項５２に記載のポリペプチド。
- 前記グリシンリッチなリンカーが、Ｇ４Ｓ（配列番号９０）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号９１）である、請求項５３に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃポリペプチドが、配列番号６４～６７からなる群から選択される配列を含む、請求項４８～５４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃポリペプチドが、トランスフェリン受容体に特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドである、請求項４８～５４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃポリペプチドが、配列番号６８～８７及び１２９～１３２からなる群から選択される配列を含む、請求項５６に記載のポリペプチド。
- 前記Ｆｃポリペプチドが、配列番号７０、７５、８０、８５、及び１２９～１３２から選択される配列を含む、請求項５７に記載のポリペプチド。
- （ａ）請求項１～２１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体；
（ｂ）（ａ）のプログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチド；及び
（ｃ）前記第１のＦｃポリペプチドと共にＦｃポリペプチド二量体を形成する第２のＦｃポリペプチド
を含む、融合タンパク質。 - 前記第２のＦｃポリペプチドが、請求項１～２１のいずれか１項に記載の第２のプログラニュリン変異体に連結している、請求項５９に記載の融合タンパク質。
- 前記第１のＦｃポリペプチドが、ペプチド結合により、またはポリペプチドリンカーにより前記プログラニュリン変異体に連結しており、かつ／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ペプチド結合により、またはポリペプチドリンカーにより前記プログラニュリン変異体に連結している、請求項５９または６０に記載の融合タンパク質。
- 前記ポリペプチドリンカーが１～５０アミノ酸長である、請求項６１に記載の融合タンパク質。
- 前記ポリペプチドリンカーが、柔軟なポリペプチドリンカーである、請求項６１または６２に記載の融合タンパク質。
- 前記柔軟なポリペプチドリンカーが、グリシンリッチなリンカーである、請求項６３に記載の融合タンパク質。
- 前記グリシンリッチなリンカーが、Ｇ４Ｓ（配列番号９０）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号９１）である、請求項６４に記載の融合タンパク質。
- 前記第１のＦｃポリペプチドのＣ末端が、前記プログラニュリンのＮ末端に連結しており、かつ／または前記第２のＦｃポリペプチドのＣ末端が、前記プログラニュリン変異体のＮ末端に連結している、請求項５９～６５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記第１のＦｃポリペプチドまたは前記第２のＦｃポリペプチドが、トランスフェリン受容体に特異的に結合する、請求項５９～６６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドがそれぞれ、ヘテロ二量体化を促進する改変を含む、請求項５９～６７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- （ｉ）前記第１のＦｃポリペプチドが、ＥＵナンバリングによる、Ｔ３６６Ｗ置換を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含む；または
（ｉｉ）前記第１のＦｃポリペプチドが、ＥＵナンバリングによる、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｗ置換を含む、
請求項６８に記載の融合タンパク質。 - 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが独立に、エフェクター機能を低下させる改変を含む、請求項５９～６９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- エフェクター機能を低下させる改変が、ＥＵナンバリングによる、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換である、請求項７０に記載の融合タンパク質。
- 前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６４～６７からなる群から選択される配列を含む、請求項５９～７１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号６８～８７及び１２９～１３２からなる群から選択される配列を含む、請求項５９～７２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号７０、７５、８０、８５、及び１２９～１３２からなる群から選択される配列を含む、請求項７３に記載の融合タンパク質。
- ヒンジ領域またはその一部が、前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドに連結している、請求項５９～７４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号９８の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号７５の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号９８の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１３０の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号９９の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号７５の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号９９の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１３０の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１００の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号７５の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１００の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１３０の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１０１の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号７５の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１０１の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１３０の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１０２の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号７５の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１０２の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１３０の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１２３の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号７５の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１２３の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１３０の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１２４の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号７５の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１２４の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１３０の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１２５の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号７５の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１２５の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１３０の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１２６の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号７５の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記プログラニュリン変異体に連結している第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１２６の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１３０の配列を含む、請求項５９～７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において生成される、請求項５９～９３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 実質的に実施例１に記載のとおりに精製されている、請求項９４に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質の第１のポリペプチド中のプログラニュリン変異体の５０％超が、Ｃ末端で短縮されていない、請求項５９～９５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質のソルチリン結合についてのＫＤ値が、約１００ｎＭ未満である、請求項５９～９６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質のソルチリン結合についてのＥＣ５０が、約２５ｎＭ未満である、請求項５９～９７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- ＥＣ５０がＥＬＩＳＡにより測定される、請求項９８に記載の融合タンパク質。
- 前記ＥＬＩＳＡアッセイが、実質的に実施例４に記載のとおりに実施される、請求項９９に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質のソルチリン結合についてのＥＣ５０が、基準融合タンパク質と比べて、ソルチリン結合における１０倍未満の低下を示し、ここで、前記基準融合タンパク質が、（ｉ）配列番号２を含む第１のポリペプチドと、（ｉｉ）前記第１のＦｃポリペプチドと共にＦｃポリペプチド二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含む、請求項５９～１００のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質のソルチリン結合についてのＥＣ５０が、基準融合タンパク質と比べて、ソルチリン結合における１０倍未満の低下を示し、ここで、前記基準融合タンパク質が、（ｉ）配列番号１０８を含む第１のポリペプチドと、（ｉｉ）前記第１のＦｃポリペプチドと共にＦｃポリペプチド二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含む、請求項５９～１０１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記基準融合タンパク質がＨＥＫ細胞において生成される、請求項１０１または１０２に記載の融合タンパク質。
- 前記基準融合タンパク質が、実質的に実施例１に記載のとおりに精製されている、請求項１０３に記載の融合タンパク質。
- 請求項１～２１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体、請求項２２～５８のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項５９～１０４のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 複数の、請求項５９～１０４のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 前記複数の融合タンパク質の５０％超が、前記融合タンパク質のプログラニュリン変異体におけるインタクトなＣ末端を含む、請求項１０６に記載の医薬組成物。
- 神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、またはプログラニュリン関連障害を有する対象を処置する方法であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体、請求項２２～５８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項５９～１０４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項１０５～１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 対象において、プログラニュリンまたはその変異体の量を増加させる方法であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体、請求項２２～５８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項５９～１０４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項１０５～１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 対象においてカテプシンＤ活性を低下させる方法であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体、請求項２２～５８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項５９～１０４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項１０５～１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- プログラニュリン関連障害を有する対象においてリソソーム分解を増加させる方法であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体、請求項２２～５８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項５９～１０４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項１０５～１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- プログラニュリン関連障害を有する対象においてリソソーム機能を改善するまたは回復させる方法であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体、請求項２２～５８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項５９～１０４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項１０５～１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記対象が、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、ＴＤＰ－４３に関連する障害、またはＡＭＤを有する、請求項１０９～１１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が神経変性疾患を有する、請求項１０８～１１３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ニーマン・ピック病Ａ型（ＮＰＡ）、ニーマン・ピック病Ｂ型（ＮＰＢ）、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）、Ｃ９ＯＲＦ７２関連筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）／ＦＴＤ、孤発性ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、ゴーシェ病、及びパーキンソン病からなる群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
- 前記神経変性疾患がＦＴＤである、請求項１１５に記載の方法。
- 前記対象がプログラニュリンをコードする遺伝子において変異を有する、請求項１０８～１１６のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１～２１のいずれか１項に記載のプログラニュリン変異体または請求項２２～５８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 請求項１１８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項１１８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 第２のＦｃポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１２０に記載の宿主細胞。
- 前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号６１及び６４～８７のいずれか１つから選択される配列を有する、請求項１２１に記載の宿主細胞。
- ポリペプチドを生成するための方法であって、請求項１１８に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
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