CN116121306A - 一种human TfR1高表达的稳转细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于分子生物学技术领域，具体提供一种humanTfR1表达的CHO‑K1稳转细胞株的构建方法，包括以下步骤：S1.构建含humanTfR1编码基因的载体；S2.获得含humanTfR1编码基因的重组慢病毒；S3.CHO‑K1细胞的复苏、培养和感染；S4.阳性细胞筛选；S5.制备、筛选高表达TfR1稳转单细胞克隆；S6.多次验证。并使用本发明提供的构建方法，得到了humanTfR1高表达稳转CHO‑K1细胞株，可在筛选/制备靶向TfR1的药物或Tf/TfR1介导的药物的筛选中起到重要作用，可为上述筛选过程提供高效的细胞筛选模型和体外药效评价的方法，从而能够促进和帮助上述药物的研究开发，从而帮助患有相关疾病的患者的治疗。

Description

一种human TfR1高表达的稳转细胞株及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种human TfR1稳转细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
转铁蛋白又名运铁蛋白(Transferrin，Tf)，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。以三价铁复合物(Tf-Fe3+)的形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成。转铁蛋白主要存在于血浆中，血浆中的转铁蛋白供应机体绝大部分组织的铁。人转铁蛋白(Human Transferrin)主要在肝脏合成，是由位于同源N-端和C-端的两个叶片(Lobe)组成的一种单链糖蛋白。人转铁蛋白共含678个氨基酸残基，等电点为5.9，分子量为76kD。每分子的转铁蛋白能携带2个三价铁离子(Fe3+)。转铁蛋白与Fe3+的相互作用取决于pH，pH为7.4时，转铁蛋白与Fe3+高效结合，在酸性pH下两者分离。
转铁蛋白(Tf)结合铁是通过与其受体，即Transferrin Receptor 1(TfR1)相互作用而实现的。TfR1是一种表达于细胞表面的糖蛋白，由两个同源二聚体的亚基通过二硫键连接而成。在细胞表面，Tf与Fe3+相互作用形成全铁-Tf，并与TfR1受体结合，在细胞内吞作用下进入核内体。在偏酸性核内体的环境中，Fe3+与Tf分离，同时金属还原酶3(Six-Transmembrane Epithelial Antigen ofthe Prostate 3，STEAP3)将Fe3+还原为Fe2+，并被二价金属离子转运蛋白1(Divalent Metal Transporter 1，DMT1)转运到细胞质中，然后释放了Fe3+的Tf与TfR1组成Tf-TfR1复合物，通过胞吐作用回游到细胞表面。在细胞表面，转铁蛋白(Tf)与受体TfR1分离，成为脱铁-Tf，然后再与Fe3+重新结合参与铁循环。整个过程完成后Tf和TfR1被循环利用，进入细胞摄取铁的下一个周期中。
TfR1作为转铁蛋白的受体不仅在多种细胞中表达，而且在多种肿瘤中高表达，其作用主要是参与铁离子的吸收，而铁离子对细胞的生产和代谢至关重要，因此通过抗体结合TfR1可以阻止细胞对铁离子的吸收，进而导致细胞的死亡。目前，已有研究利用抗体靶向TfR1用于治疗TfR1高表达的肿瘤。此外，在药物递送方面，TfR1可以结合抗体后将抗体或药物运输通过血脑屏障，进而治疗与神经系统相关的肿瘤或者其它疾病。
在高通量筛选、评估与转铁蛋白(Tf)结合或者靶向TfR1的药物(包括小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗体等)能否有效结合TfR1的过程中，需要使用一种快捷的Tf-TfR1或药物-TfR1结合的体外细胞模型，这需要能够高水平、持续稳定表达TfR1的细胞株，而现有技术中则未建立符合要求的细胞株，这限制了上述过程的进行。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种human TfR1表达的CHO-K1稳转细胞株的构建方法，并提供使用该构建方法构建得到的human TfR1表达的CHO-K1稳转细胞株。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种human TfR1表达的CHO-K1稳转细胞株的构建方法，包括以下步骤：
S1.构建含human TfR1编码基因的载体：合成human TfR1基因序列，将合成的所述human TfR1基因序列转入慢病毒载体得到所述含human TfR1编码基因的载体，转化、提取所述含human TfR1编码基因的载体；
S2.获得含human TfR1编码基因的重组慢病毒：将S1提取的所述含human TfR1编码基因的载体和辅助质粒共转染HEK293T细胞，培养转染后的HEK293T细胞，收集并合并上清液，过滤、离心获得所述含human TfR1编码基因的重组慢病毒；
S3.CHO-K1细胞的复苏、培养和感染；
S4.阳性细胞筛选：使用嘌呤霉素筛选S3感染得到的CHO-K1细胞，筛选出嘌呤霉素阳性细胞，采用流式细胞术从嘌呤霉素阳性细胞中筛选出human TfR1表达的CHO-K1细胞，建立细胞池；
S5.制备、筛选高表达TfR1稳转单细胞克隆；
S8.多次验证：将S5筛选的高表达TfR1稳转单细胞克隆回收并冻存，细胞复苏后进行二次验证；将二次验证中确认优选的高表达TfR1单细胞克隆回收并冻存，将细胞复苏后进行第三次验证确定最终克隆。
进一步的，所述S3.CHO-K1细胞的复苏、培养和感染包括以下步骤：
1)将CHO-K1细胞于37℃水浴中迅速解冻后，离心弃去上清液，并用完全培养基重悬CHO-K1细胞，对其计数后根据计数结果来调节细胞密度并培养；
2)对1)培养至合适的生长密度的CHO-K1细胞消化后中和，离心弃去上清液，并用完全培养基重悬CHO-K1细胞，之后将其接种至培养皿中培养；
3)将培养皿中的CHO-K1细胞接种至6孔板培养，并加入S2中获得的含human TfR1编码基因的重组慢病毒感染。
进一步的，所述S5.制备、筛选高表达TfR1稳转单细胞克隆包括以下步骤：
a.单细胞克隆的制备：将细胞池中human TfR1表达的CHO-K1细胞稀释至96孔板内扩大培养，然后在显微镜下观察克隆状态，并标记含有阳性的单细胞克隆的孔；
b.单细胞克隆筛选：从a中标记含有阳性的单细胞克隆的孔中收集20个阳性的单细胞克隆，转移至培养皿中进行扩大培养，采用FACS技术评价20个阳性单细胞克隆TfR1表达水平，根据表达水平的高低筛选出高表达TfR1稳转单细胞克隆。
进一步的，所述human TfR1基因序列的序列组成如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种使用如上述的构建方法得到的human TfR1表达的CHO-K1稳转细胞株。
本发明还提供一种如上述的human TfR1表达的CHO-K1稳转细胞株在靶向TfR1的药物或Tf/TfR1介导的药物筛选中的应用。
进一步的，所述靶向TfR1的药物为小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗体。
进一步的，所述靶向TfR1的药物为治疗TfR1高表达的肿瘤或肌肉相关疾病或为通过TfR1递送所述靶向TfR1的药物来治疗的神经系统相关的肿瘤的药物。
进一步的，所述Tf/TfR1介导的药物为治疗由Tf或TfR1引起铁离子缺失而导致的细胞和代谢相关疾病的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、使用本发明提供的构建方法，成功地将human TfR1蛋白在CHO-K1细胞上表达，建立了human TfR1高表达稳转CHO-K1细胞株，该细胞株可以弥补瞬时转染所具有的外源基因表达时间短的缺陷，故便于长期观察药物对于细胞功能的影响，可在筛选/制备靶向TfR1的药物或Tf/TfR1介导的药物的筛选中起到重要作用(其中，靶向TfR1的药物可通过TfR1结合抑制阻止细胞对铁离子的吸收来治疗TfR1高表达的肿瘤或肌肉相关疾病，也通过TfR1递送药物来治疗神经系统相关的肿瘤或其他疾病，Tf/TfR1介导的药物可用于治疗由Tf或TfR1引起铁离子缺失而导致的细胞和代谢相关疾病)，可为上述筛选过程提供高效的细胞筛选模型和体外药效评价的方法，从而能够促进和帮助上述药物的研究开发，从而帮助患有上述疾病的患者的治疗；
2、本发明提供的构建方法使用慢病毒载体，相较于重组质粒载体、腺病毒等载体，慢病毒载体具有以下优势：1)可将外源基因或外源的RNA有效的整合到宿主染色体上，从而达到持久表达目的基因的效果，且不会随着细胞传代而丢失；2)对于难以转染的原代细胞，慢病毒载体可提高原代细胞的转染效率；3)慢病毒载体具有较高的安全性，不会造成免疫原性；
3、本发明提供的构建方法使用CHO-K1细胞系，相较于传统细菌表达系统，具有表达量高、容易处理和操作以及法规接受程度高等特性；
4、使用本发明提供的构建方法构建出的细胞株其TfR1表达水平较高，能达到空白的1285倍，且构建出的稳转细胞株能够长期持续稳定的表达human TfR1。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例4中采用FACS技术从嘌呤霉素阳性细胞中筛选出TfR1表达的细胞的结果；
图2为实施例5中采用FACS技术评价20个阳性单细胞克隆TfR1表达水平的结果；
图3为实施例6中的二次验证结果；
图4为实施例7中的第三次验证结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中的实验方法如无特殊说明均为常规方法，下述实施例中的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径获取。
本发明实施例一种human TfR1表达的CHO-K1稳转细胞株的构建方法，包括以下步骤：
S1.构建含human TfR1编码基因的载体：合成human TfR1基因序列，将合成的所述human TfR1基因序列转入慢病毒载体得到所述含human TfR1编码基因的载体，转化、提取所述含human TfR1编码基因的载体；
S2.获得含human TfR1编码基因的重组慢病毒：将S1提取的所述含human TfR1编码基因的载体和辅助质粒共转染HEK293T细胞，培养转染后的HEK293T细胞，收集并合并上清液，过滤、离心获得所述含human TfR1编码基因的重组慢病毒；
S3.CHO-K1细胞的复苏、培养和感染；
S4.阳性细胞筛选：使用嘌呤霉素筛选S3感染得到的CHO-K1细胞，筛选出嘌呤霉素阳性细胞，采用流式细胞术从嘌呤霉素阳性细胞中筛选出human TfR1表达的CHO-K1细胞，建立细胞池；
S5.制备、筛选高表达TfR1稳转单细胞克隆；
S8.多次验证：将S5筛选的高表达TfR1稳转单细胞克隆回收并冻存，细胞复苏后进行二次验证；将二次验证中确认优选的高表达TfR1单细胞克隆回收并冻存，将细胞复苏后进行第三次验证确定最终克隆。
其中，S1使用的慢病毒载体可将外源基因或外援的RNA有效的整合到宿主染色体上，从而达到持久表达目的基因的效果。
其中，HEK293细胞又称人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高，易于培养等特点，是常见的表达研究外源基因的细胞株。S2中使用的HEK293T细胞是由HEK293细胞通过基因技术派生出的细胞系，具有较高外源基因的表达水平，同时HEK293T细胞是较HEK293细胞转染效率更高的衍生株，因此HEK293T细胞广泛应用于病毒包装。
其中，S3中使用的CHO细胞在生物药生产中应用早、表达量高、容易处理和操作以及法规接受程度高，CHO细胞还具有较高的基因和表型不稳定性，有着较多的细胞谱系(如CHO-K1)，致病性的病毒在CHO细胞中无法复制，因此CHO细胞被认为是非常安全的表达体系。本发明使用CHO-K1作为靶细胞。
其中，慢病毒载体携带可表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶的基因，被慢病毒感染的靶细胞能够稳定表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶，而未感染和整合慢病毒基因的靶细胞不能产生嘌呤霉素N-乙酰转移酶，嘌呤霉素的存在能够快速的杀死此类细胞，因此S4中通过培养基中添加一定量的嘌呤霉素可快速筛选出被慢病毒感染的靶细胞。
具体的，所述S3.CHO-K1细胞的复苏、培养和感染包括以下步骤：
1)将CHO-K1细胞于37℃水浴中迅速解冻后，离心弃去上清液，并用完全培养基重悬CHO-K1细胞，对其计数后根据计数结果来调节细胞密度并培养；
2)对1)培养至合适的生长密度的CHO-K1细胞消化后中和，离心弃去上清液，并用完全培养基重悬CHO-K1细胞，之后将其接种至培养皿中培养；
3)将培养皿中的CHO-K1细胞接种至6孔板培养，并加入S2中获得的含human TfR1编码基因的重组慢病毒感染。
具体的，所述S5.制备、筛选高表达TfR1稳转单细胞克隆包括以下步骤：
a.单细胞克隆的制备：将细胞池中human TfR1表达的CHO-K1细胞稀释至96孔板内扩大培养，然后在显微镜下观察克隆状态，并标记含有阳性的单细胞克隆的孔；
b.单细胞克隆筛选：从a中标记含有阳性的单细胞克隆的孔中收集20个阳性的单细胞克隆，转移至培养皿中进行扩大培养，采用FACS技术评价20个阳性单细胞克隆TfR1表达水平，根据表达水平的高低筛选出高表达TfR1稳转单细胞克隆。
具体的，所述human TfR1基因序列的序列组成如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ IDNO.1的序列信息如下：
AGAGCGTCGGGATATCGGGTGGCGGCTCGGGACGGAGGACGCGCTA
GTGTGAGTGCGGGCTTCTAGAACTACACCGACCCTCGTGTCCTCCCTT
CATCCTGCGGGGCTGGCTGGAGCGGCCGCTCCGGTGCTGTCCAGCA
GCCATAGGGAGCCGCACGGGGAGCGGGAAAGCGGTCGCGGCCCCAG
GCGGGGCGGCCGGGATGGAGCGGGGCCGCGAGCCTGTGGGGAAGGG
GCTGTGGCGGCGCCTCGAGCGGCTGCAGGTTCTTCTGTGTGGCAGTTC
AGAATGATGGATCAAGCTAGATCAGCATTCTCTAACTTGTTTGGTGG
AGAACCATTGTCATATACCCGGTTCAGCCTGGCTCGGCAAGTAGATG
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GGTTATGTGGCGTATAGTAAGGCTGCAACAGTTACTGGTAAACTGG
TCCATGCTAATTTTGGTACTAAAAAAGATTTTGAGGATTTATACACTC
CTGTGAATGGATCTATAGTGATTGTCAGAGCAGGGAAAATCACCTTT
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TCATTCTTTGGACATGCTCATCTGGGGACAGGTGACCCTTACACACCT
GGATTCCCTTCCTTCAATCACACTCAGTTTCCACCATCTCGGTC
ATCAGGATTGCCTAATATACCTGTCCAGACAATCTCCAGAGCTGCTGC
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AGTTTACAGTGGCTGTATTCTGCTCGTGGAGACTTCTTCCGTGCTA
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本发明实施例还提供一种使用如上述的构建方法得到的human TfR1表达的CHO-K1稳转细胞株。
本发明实施例还提供一种如上述的human TfR1表达的CHO-K1稳转细胞株在靶向TfR1的药物或Tf/TfR1介导的药物筛选中的应用。
具体的，所述靶向TfR1的药物为小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗体。
具体的，所述靶向TfR1的药物为治疗TfR1高表达的肿瘤或肌肉相关疾病或为通过TfR1递送所述靶向TfR1的药物来治疗的神经系统相关的肿瘤的药物。
具体的，所述Tf/TfR1介导的药物为治疗由Tf或TfR1引起铁离子缺失而导致的细胞和代谢相关疾病的药物。
下面结合具体实施例说明：
实施例1构建含human TfR1编码基因的载体
1.查询并确认human TfR1基因序列(NM_003234.4)，Human TfR1基因序列的序列组成如SEQ ID NO.1所示，使用本领域常规的固相合成操作来合成human TfR1基因序列。
2.按本领域常规的技术操作，将合成的human TfR1序列转入慢病毒载体质粒，使用限制内切酶XhoI和BstBI。
3.慢病毒载体质粒的转化：取一定量新鲜的JM108感受态细胞，加入少量上述构建的质粒，冰浴30分钟；随后42℃水浴锅中保温90秒，再次冰浴1～2分钟；加入新鲜的LB培养基，37℃培养1h，随后取适当体积的复苏细胞，涂布在含抗生素的LB固体培养基上，倒置培养16小时。
4.提取慢病毒载体质粒：挑取LB固体培养基上的单菌落，接种于2mL液体培养基中，过夜培养，取一定量的培养物，离心后弃去培养液，使用市售的质粒提取试剂盒(碧云天#D0018)按说明书提取慢病毒载体质粒。
实施例2含human TfR1编码基因的重组慢病毒的获得
1.将约1～4百万HEK293T细胞接种于10cm2培养皿中，过夜培养。
2.用慢病毒载体和辅助质粒(包装质粒和包膜质粒)转染HEK293T细胞，转染6小时后去除培养基，更换为新鲜的DMEM完全培养基，过夜培养。
3.将培养皿上清液收集至无菌50mL离心管中，然后加入10mL新鲜的DMEM完全培养基，过夜培养。
4.将培养皿上清液收集至无菌50mL离心管中。
5.合并上清液，过滤、离心获取重组慢病毒。
实施例3CHO-K1细胞的复苏、培养和感染
1.CHO-K1细胞复苏
(1)准备培养基(F-12K完全培养基)，在15mL离心管中加入5mL新鲜的F-12K完全培养基。
(2)将细胞于37℃水浴中迅速解冻后移入15mL离心管中，吹匀后800rpm离心4分钟。
(2)弃去上清液，用1mL新鲜F-12K完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色后，用全自动细胞计数仪计算细胞数目和细胞活率。
(3)根据计数结果，取1000μL细胞悬液移入6cm2培养皿中，添加3mL F-12K完全培养基调节细胞密度至合适的生长密度，摇匀，标记细胞名称、代次、日期及培养液等信息。
(4)显微镜下观察后放入细胞培养箱中过夜培养(37℃，5％CO2)。
2.CHO-K1细胞培养
(1)向6cm2培养皿中添加1mL 0.25％消化液，37℃消化3分钟，加入2mL F-12K完全培养基进行中和。
(2)800rpm离心4分钟，弃去上清液，加入1mL F-12K完全培养基重悬细胞团块。
(3)将细胞接种于6cm2培养皿中，加入5mL F-12K完全培养基，置于细胞培养箱中继续培养(37℃，5％CO2)，标记细胞名称、代次、日期及培养液等信息。
(4)重复上述步骤培养至达到实验条件。
3.CHO-K1细胞感染
(1)将CHO-K1细胞接种于6孔板中，265细胞/孔，加入2mL F-12K完全培养基，过夜培养(37℃、5％CO2)。
(2)每孔更换1mL包含8μg/mL聚凝胺的新鲜F-12K完全培养基，将6孔板置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育0.5小时。
(3)向6孔板中加入200μL浓缩的重组慢病毒，轻轻混匀；将6孔板置于离心机内800rpm离心30分钟，然后将6孔板置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24小时。
(4)去除培养基，加入新鲜的F-12K完全培养基，37℃、5％CO2细胞培养箱中过夜培养。
实施例4加压培养(阳性细胞筛选)
1.向重组慢病毒感染后的细胞孔板内加入0.5mL 0.25％消化液，37℃消化3分钟，加入1mL新鲜F-12K完全培养基进行中和。
2.800rpm离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基重悬细胞团块。
3.将细胞接种于6cm2培养皿中，加入5mL含8μg/mL嘌呤霉素的F-12K完全培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中加压培养，标记细胞名称、代次、日期及培养液等信息。
4.重复上述步骤，将细胞培养达到实验条件和细胞密度。
5.采用FACS技术从嘌呤霉素阳性细胞中筛选出TfR1表达的细胞，建立细胞池，结果见图1，图1结果表明，经过含human TfR1慢病毒感染和嘌呤霉素筛选，细胞池中存在human TfR1高表达的细胞。
实施例5TfR1高表达稳转单细胞克隆筛选
1.单细胞克隆制备：将细胞池中human TfR2表达的细胞，稀释至96孔板内扩大培养，然后在显微镜下观察克隆状态，并标记含有单细胞克隆的孔。具体按照下述步骤：
(1)吸弃旧培养基，加入1mL DPBS缓冲液洗一遍，吸弃DPBS缓冲液。
(2)加入1mL 0.25％胰酶37℃，消化3分钟(温度37℃)。
(3)吸弃胰酶，加入2mL新鲜F-12K完全培养基终止消化，并用移液器吹打下细胞。
(4)将细胞收集至15mL离心管中离心800rpm，4分钟，弃掉上清，用1mL新鲜F-12K完全培养基重悬细胞，吹匀并计数约4×l06细胞/mL。
(5)稀释细胞至l×l03细胞/mL，取10μL细胞悬液平铺于玻片上，显微镜下计数10个细胞。
(6)取100μL密度为l×l03细胞/mL的细胞悬液至加样槽并添加50mL含8μg/mL嘌呤霉素的F-12K完全培养基，充分混合均匀。
(7)用8道排枪将混合均匀的细胞悬液按照100μL/孔加入5个96孔板中。
(8)向96孔板所有孔中再补加100μL含8μg/mL嘌呤霉素F-12K完全培养基，并置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，直到单克隆出现。
(9)在显微镜下观察克隆状态，并标记含有阳性的单细胞克隆的孔。
2.单细胞克隆筛选：从标记含有阳性的单细胞克隆的孔中收集20个阳性的单细胞克隆，转移至培养皿中进行扩大培养，采用FACS技术评价20个阳性单细胞克隆TfR1表达水平，结果见图2和表1，从图2和表1中均可看出，预选的20个单细胞克隆表现出不同的TfR1表达水平，其中克隆4-7、克隆9、克隆11和克隆19与CHO-K1细胞相比TfR1表达均大于800倍，说明该单细胞克隆具有较高的TfR1表达水平，其中克隆7、克隆9、克隆11具有TfR1高表达的细胞分布较优，同源程度高，将作为优选单细胞克隆进行进一步冻存稳定性和表达水平确认。
表1单细胞克隆TfR1表达水平
Figure BDA0004147348330000151
实施例6TfR1高表达稳转单细胞克隆的验证
二次验证：将高表达的TfR1优选单细胞克隆(克隆7、克隆9、克隆11)回收并冻存，细胞复苏后进行二次验证，结果见图3和表2，图3和表2表明克隆7、克隆9、克隆11冻存并复苏后，传代培养均表现为TfR1高表达，TfR1表达水平克隆9＞克隆7＞克隆11；克隆7、克隆9冻存和进一步加压传代培养后，TfR1表达水平明显提高，表现出良好的稳定性；克隆11冻存和加压传代培养后，TfR1表达水平减弱，具有TfR1高表达的细胞分布变宽，同源性较弱；因此选择克隆7和克隆9作为优选单细胞克隆进行冻存/传代稳定性和表达水平确认，确认最优克隆。
表2 TfR1高表达稳转单细胞克隆的二次验证结果
Figure BDA0004147348330000161
第三次验证：将二次验证确认优选的高表达TfR1单细胞克隆(克隆7、9)，回收并冻存，将细胞复苏后进行第三次验证确定最终克隆(克隆9)，结果见图4和表3，图4和表3表明克隆7、克隆9冻存并复苏后，传代培养后均表现为TfR1高表达，且克隆9 TfR1表达水平高于克隆7。同时克隆9的TfR1高表达细胞分布优于克隆7，因此选择克隆9为最终单细胞克隆，进行扩大培养和冻存。
表3 TfR1高表达稳转单细胞克隆的第三次验证结果
克隆(CHO-K1/human TfR1) 倍数
克隆7 859.14
克隆9 1285.23
其中，上述的扩大培养和冻存参照下述步骤：
1.扩大培养
(1)向培养皿中按比例加入适量的0.25％消化液，37℃消化3分钟，加入适量新鲜F-12K完全培养基进行中和。
(2)800rpm离心4min，弃去上清，用适量新鲜F-12K完全培养基重悬细胞团块。
(3)将细胞接种于2个15cm2培养皿中，加入19mL F-12K完全培养基。
(4)将培养皿置于细胞培养箱中继续培养37℃，5％CO2。
2.细胞冻存
(1)冻存前记录细胞代次，细胞汇合度和密度。
(2)向培养皿中按比例加入适量的0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加入适量新鲜F-12K完全培养基进行中和。
(3)800rpm离心4min，弃去上清，加入适量冻存液(Optivitro无蛋白、CD细胞冻存液)，轻轻混匀后，分装至冻存管内。
(4)将冻存管放入梯度降温盒中，置于-80℃冰箱24小时，然后转移至液氮罐内保存。
上述涉及FACS技术的实施例中，FACS技术具体操作步骤如下述：
1.将待测细胞收集至离心管中，800rpm离心4分钟，弃去上清，加入1mL PBS缓冲液800rpm离心4分钟，弃去上清获取细胞。
2.用FACS缓冲液(99％杜氏磷酸盐缓冲溶液+1％胎牛血清)进行细胞重悬，调整细胞密度至10×106细胞/mL，将细胞悬液转移至检测孔板。
3.找到对应直标抗体(市售抗体，货号TFR-H8243)，按照抗体说明书加入相应体积的抗体，吹打混匀，在4℃避光孵育60分钟。
4.然后加入1000μLFACS缓冲液，800rpm离心4分钟，弃去上清。
5.加入1000μLFACS缓冲液进行细胞重悬，800rpm离心4分钟。
6.调整细胞密度至10×106细胞/mL。
7.使用40μm细胞过滤器对细胞进行过滤。
8.使用流式细胞仪进行样品检测。
实施例7humanTfR1细胞株在靶向TfR1或Tf介导的药物筛选中的应用
1.将humanTfR1高表达细胞株扩大培养至一定数量，将细胞收集至离心管中，800rpm离心4分钟，弃去上清，加入1mL PBS缓冲液800rpm离心4分钟，弃去上清获取细胞。
2.用FACS缓冲液将细胞进行重悬，调整细胞密度至10×106细胞/mL，将细胞悬液转移至检测孔板。
3.将候选分子(与TfR1蛋白特异性结合)、阳性对照、阴性对照(IgG蛋白)调整至相同浓度，取一定量加入检测孔板内，4℃孵育60分钟。然后加入1000μLFACS缓冲液，800rpm离心4分钟，弃去上清。加入1000μLFACS缓冲液进行细胞重悬，800rpm离心4分钟。
4.加入二抗(PE山羊抗小鼠IgG，货号：405307))到检测孔板上，然后在4℃的黑暗中孵育20分钟。然后加入1000μL FACS缓冲液，800rpm离心4分钟，弃去上清。
5.加入1000μLFACS缓冲液进行细胞重悬，800rpm离心4分钟。
6.调整细胞密度至10×106细胞/mL。
7.使用40μm细胞过滤器对细胞进行过滤。
8.使用流式细胞仪进行样品检测。
9.筛选结果见表4，由表可见阳性对照具有较强的信号，空白对照和阴性对照无信号。候选分子信号成多样性分布，部分候选分子信号强度与阳性对照接近。由候选分子的差异化结果可知human TfR1细胞株及其产生的TfR1蛋白能够用于靶向TfR1或Tf介导的药物筛选。
表4药物筛选结果
Figure BDA0004147348330000181
Figure BDA0004147348330000191
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种humanTfR1表达的CHO-K1稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建含humanTfR1编码基因的载体：合成humanTfR1基因序列，将合成的所述humanTfR1基因序列转入慢病毒载体得到所述含humanTfR1编码基因的载体，转化、提取所述含humanTfR1编码基因的载体；
S2.获得含humanTfR1编码基因的重组慢病毒：将S1提取的所述含human TfR1编码基因的载体和辅助质粒共转染HEK293T细胞，培养转染后的HEK293T细胞，收集并合并上清液，过滤、离心获得所述含humanTfR1编码基因的重组慢病毒；
S3.CHO-K1细胞的复苏、培养和感染；
S4.阳性细胞筛选：使用嘌呤霉素筛选S3感染得到的CHO-K1细胞，筛选出嘌呤霉素阳性细胞，采用流式细胞术从嘌呤霉素阳性细胞中筛选出human TfR1表达的CHO-K1细胞，建立细胞池；
S5.制备、筛选高表达TfR1稳转单细胞克隆；
S6.多次验证：将S5筛选的高表达TfR1稳转单细胞克隆回收并冻存，细胞复苏后进行二次验证；将二次验证中确认优选的高表达TfR1单细胞克隆回收并冻存，将细胞复苏后进行第三次验证确定最终克隆。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述S3.CHO-K1细胞的复苏、培养和感染包括以下步骤：
1)将CHO-K1细胞于37℃水浴中迅速解冻后，离心弃去上清液，并用完全培养基重悬CHO-K1细胞，对其计数后根据计数结果来调节细胞密度并培养；
2)对1)培养至合适的生长密度的CHO-K1细胞消化后中和，离心弃去上清液，并用完全培养基重悬CHO-K1细胞，之后将其接种至培养皿中培养；
3)将培养皿中的CHO-K1细胞接种至6孔板培养，并加入S2中获得的含humanTfR1编码基因的重组慢病毒感染。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述S5.制备、筛选高表达TfR1稳转单细胞克隆包括以下步骤：
a.单细胞克隆的制备：将细胞池中humanTfR1表达的CHO-K1细胞稀释至96孔板内扩大培养，然后在显微镜下观察克隆状态，并标记含有阳性的单细胞克隆的孔；
b.单细胞克隆的筛选：从a中标记含有阳性的单细胞克隆的孔中收集20个阳性的单细胞克隆，转移至培养皿中进行扩大培养，采用FACS技术评价20个阳性单细胞克隆TfR1表达水平，根据表达水平的高低筛选出高表达TfR1稳转单细胞克隆。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述humanTfR1基因序列的序列组成如SEQ ID NO.1所示。
5.一种使用如权利要求1-4任一项所述的构建方法得到的humanTfR1表达的CHO-K1稳转细胞株。
6.如权利要求5所述的humanTfR1表达的CHO-K1稳转细胞株在靶向TfR1的药物或Tf/TfR1介导的药物筛选中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述靶向TfR1的药物为小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗体。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述靶向TfR1的药物为治疗TfR1高表达的肿瘤或肌肉相关疾病或为通过TfR1递送所述靶向TfR1的药物来治疗的神经系统相关的肿瘤的药物。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述Tf/TfR1介导的药物为治疗由Tf或TfR1引起铁离子缺失而导致的细胞和代谢相关疾病的药物。
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