TW201333040A - 抗-輸鐵蛋白受器之抗體及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於數種抗體,該等抗體能辨識非造血性腫瘤或非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器上的碳水化合物,且本發明關於該等抗體之用途。
Description
此申請案主張享有2012年1月6號申請之美國專利臨時申請案第61/584,125號的優先權,且該案內容以引用方式全文併入本案。
本發明係關於數種抗體,該等抗體能辨識非造血性腫瘤或非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器上的碳水化合物(carbohydrate),且本發明關於該等抗體之用途。
轉譯後修飾是在蛋白質轉譯之後的蛋白質化學修飾作用,並且是許多蛋白質之基因表現過程中的晚期步驟之一。已知有超過100種不同類型的轉譯後修飾,例如在蛋白質上附接生化性官能基(例如,乙酸、磷酸、各種脂類及碳水化合物)、改變胺基酸的化學本性(例如,精胺酸瓜化反應,
citrullination)或製造結構變化(例如,形成雙硫鍵)。此等轉譯後修飾可擴大蛋白質的功能範圍(參閱Alberts等人於2002年出版之書籍Molecular Biology of the Cell第4版第355頁;Smith等人於2005年出版之書籍Marks’Basic Medical Biochemistry:a clinical approach第2版第85頁)。
轉譯後修飾不僅發生在正常細胞內,也在細胞的癌化轉形(neoplastic transformation)過程中扮演重要角色。細胞的癌化轉形伴隨發生細胞訊息傳遞過程的動態變化,導致基因表現改變、活化某些細胞訊息傳遞路徑、增強細胞增生及使細胞的分裂和死亡失調,等等。由於轉譯後修飾是重要調節性或結構性蛋白質的化學修飾作用,而此等蛋白質控制細胞內大多數的生理活動,因此轉譯後修飾在此等活動中皆扮演著關鍵性角色(參閱Krueger等人於2006年發表在Molecular & cellular Proteomics第5卷第1779~1810頁之論文)。
在轉譯後修飾的各種不同領域中,細胞表面上的碳水化合物分佈模式(carbohydrate profile)改變顯然是所有腫瘤的共通特性。發現上皮細胞和間葉細胞上的外層醣披(glycocalyx)在細胞微環境中的細胞交互作用裡扮演著多重角色,該等細胞交互作用例如吸濕保護作用(hygroscopic protection)、外在分子緩衝作用(external molecular buffering)、附著至胞外基質的作用及細胞間的附著作用(intercellular adhesion)。此等交互作用決定胞內訊息傳遞活動的許多方向且從而決定細胞行為。醣類分佈模式的顯著改變
顯然會影響對於細胞脫離正常組織位置的能力且可能附著於其他器官位置的行為(侵入和轉移行為)。例如,在腫瘤中常可發現唾液酸路易絲結構(sialy Lewis structure),且唾液酸路易絲結構趨向與選擇素(selectin)結合並可能授予此等細胞轉移特性(參閱Fuster等人於2003年發表於Cancer Res.第63期2775~2781頁之論文)。
轉鐵蛋白受器(transferring receptor,TfR)又稱為CD71,其是一種與細胞膜有關的醣蛋白並且在細胞的鐵攝取和細胞生長調節作用中佔著致關重要的地位(參閱Daniels等人於2006年在期刊Clin Immunol.第121期144~158頁所發表之論文)。雙鐵轉鐵蛋白(diferric Transferrin)與轉鐵蛋白受器結合並藉由受器介導的內吞作用(endocytosis)被內化而進入包含素包覆小窩中(clathrin-coated pit)。核內體(endosome)中的pH值降低有利於轉鐵蛋白構形變化,且隨後使轉鐵蛋白釋出鐵(參閱Cheng等人於2004年發表在Cell第116期565~576頁之論文)。脫鐵-轉鐵蛋白/TfR複合體回到細胞表面並釋出脫鐵-轉鐵蛋白(apo-transferrin)。不同於該些僅在與配體(ligand)作用之後才會被內化(配體介導內化作用)的受器(例如EGFR),轉鐵蛋白受器會持續地被內化而與配體結合作用無關(Watts於1985年發表於J Cell Biol第100期633~637頁之論文;Taetle於1990年發表於Exp.Hematol.第18期360~365頁之論文;Trowbridge等人於1993年發表於Annu.Rev.Cell Biol.第9期129~161頁之論文;Kurten於2003年發表於Adv.Drug Delivery Rev.第55期1405~1419頁之論文)。
正常細胞上廣泛地表現轉鐵蛋白受器,且在細胞增殖率高的細胞(例如,基底表皮細胞及腸上皮細胞)上或在需要大量鐵的細胞(例如,用於輸送鐵給胎兒的胎盤滋胚層或用於合成血紅素的成熟類紅血球)上,轉鐵蛋白受器的表現隨之提高(參閱Gatter等人於1983年發表於J Clin Pathol第36期539~545頁之論文;Omary等人於1980年發表於Nature第286期888~891頁之論文;Sutherland等人於1981年發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87期4515~4519頁之論文;Shindelman等人於1981年發表於Int.J.Cancer第27期329~334頁之論文)。在諸如乳癌、肺腺癌、神經膠質瘤、膀胱移行細胞癌、慢性淋巴性白血病、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)及多發性骨髓瘤等各種不同惡性細胞中的TfR明顯升高(高達100倍),參閱Daniels等人於2006年發表於Clin Immunol第121期144~158頁之論文;Omary等人於1980年發表於Nature第286期888~891頁之論文;Sutherland等人於1981年發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87期4515~4519頁之論文;Shindelman等人於1981年發表於Int.J.Cancer第27期329~334頁之論文;Daniels等人於2006年發表於Clin Immunol第121期159~176頁之論文;Gomme等人於2005年發表於Drug Discov.Today第10期267~273頁之論文;Prost等人於1998年發表於Int.J.Oncol第13期871~875頁之論文;Shinohara等人於2000年發表於Int.J.Oncol第17期643~651頁之論文。此現象可能歸因於正進行快速分裂之細胞對鐵的需求提高,以作為DNA合成反應中
之核糖核苷酸還原酶的輔因子之故。再者,在許多情況下,轉鐵蛋白受器表現增高與腫瘤分期和不良的預後有關。
以結構而言,人類TfR是一種分子量180 kD的第二型跨膜蛋白同源二聚體。分子量90 kD的子單元(760個胺基酸)具有短的且含有內化基序(internalization motif)「YTFR」的NH2-端胞質區(第1~61個胺基酸殘基)、單通跨膜單元(single transmembrane pass,第62~88個胺基酸殘基)及大的胞外部分(胞外域,第89~760個胺基酸殘基),該胞外部分包含用於與80 kD之轉鐵蛋白分子結合的結合位置(參閱Daniels等人於2006年發表於Clin Immunol第121期144~158頁之論文;Cheng等人於2004年發表於Cell第116期565~576頁之論文;Lawrence等人於1999年發表於Science第286期779~782頁之論文)。該胞外域含有3個N-連接醣化位置及一個O-連接醣化位置。需在該受器的此等位置處進行醣化反應方具有適當功能(參閱Daniels等人於2006年發表於Clin Immunol第121期144~158頁之論文;Enns等人於1981年發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA第778期4222~4225頁之論文;Hayes等人於1994年發表於Glycobiology第5期227~232頁之論文)。
由於TfR在惡性細胞上的表現增高(比正常細胞的平均表現量高100倍以上)、在細胞表面上可與TfR接觸且持續進行內吞作用,因此TfR已成為用於將治療藥物送入癌細胞中的研究目標(參閱Daniels等人於2006年發表於Clin Immunol第121期144~158頁之論文)。藉著與TfR的配體輸
鐵蛋白(Tf)結合或藉由可專一辨識TfR的單株抗體而與TfR直接相互作用。諸如多柔比星(doxorubicin)、順鉑(cisplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、絲裂黴素(mytomycin)、吉西它賓(音譯gemcitabine)和柔紅比星(daunorubicin)之化療藥物、諸如蓖麻毒素(ricin)、皂草素(Saporin)、白喉桿菌外毒素(diphtheria exotoxin)、CRM 107及牛核糖核酸酶(bovine RNase)之毒性蛋白質、聚合物/多聚物(polymer/polyplex)、微脂體及奈米粒子已可直接與Tf連接以針對TfR作用。亦已研發出抗-TfR單株抗體作為標靶藥劑以用於將諸如多柔比星之化療藥物、諸如蓖麻毒素、皂草素、白樹毒素、商陸毒素(pokeweed)、絲瓜毒素之植物毒素、真菌毒素、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、白喉桿菌外毒素、血管生成素(angiogenin)、核糖核酸酶及小干擾RNA(siRNA)送入細胞內,這些藥物在體外和體內試驗(包括在病患體內)中展現細胞毒性作用,包括抑制生長及/或誘發各種惡性腫瘤的細胞凋亡作用(參閱Daniels等人於2006年發表於Clin Immunol第121期159~176頁之論文;Qian等人於2002年發表於Pharmacol Rev.第64期561~587頁之論文)。
輸鐵蛋白受器是引人關注的標靶分子,其已用於治療各種各種惡性腫瘤。然而,由於在正常細胞中廣泛表現輸鐵蛋白受器,因此在病患治療上需考慮安全性問題。因此,需要研發出以輸鐵蛋白受器為標靶的安全癌症治療法。
文中所載之所有參考文獻,包括專利申請案及公開文獻在內,皆以引用方式全文併入本案。
本發明係以僅發生在惡性轉形細胞中之輸鐵蛋白受器上的癌症特異性修飾作用作為識別目標。相較於以輸鐵蛋白受器本身作為識別目標的方式而言,由於以輸鐵蛋白受器上的癌症特異性修飾作為識別目標僅將惡性細胞視為標靶,故可提供另一層的安全防護。本發明提供能專一性辨識輸鐵蛋白受器上之修飾物的抗體,該抗體能與哺乳動物癌細胞所表現的輸鐵蛋白受器結合,但不與大腸桿菌(E.coli)所表現的輸鐵蛋白受器結合。此等抗體之抗原決定位(epitope)具有癌症專一性,因此此等抗體能與諸如胰臟癌細胞、胃癌細胞、大腸直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、攝護腺癌細胞、子宮內膜癌細胞、乳癌細胞及肝癌細胞之癌細胞結合,但不會與包括表現高量輸鐵蛋白受器的活化T細胞、紅血球(RBC)、血小板、多形核白血球(PMN)、周邊血液單核球(PBMC)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在內的正常細胞結合。此外,本發明所述之抗-TfR抗體具有細胞毒性功能,且當該抗-TfR抗體與表現標靶分子的細胞反應時能誘發細胞凋亡作用或補體依賴性細胞毒性(CDC)。本發明中所提供之該等抗體可用於抗-癌症治療。
本文中提供數種抗體(諸如分離的抗體),該等抗體能與癌細胞(例如,非造血性癌細胞)所表現之輸鐵蛋白受器(如,人類輸鐵蛋白受器)上的修飾物(例如,碳水化合物)專一性結合,且該等抗體不與活化T細胞或Jurkat細胞所表現的
輸鐵蛋白受器專一性結合。在某些實施例中,該抗體與輸鐵蛋白受器的結合作用不會被包含Lea結構的碳水化合物所抑制。在某些實施例中,該抗體為單株抗體。在某些實施例中,該抗體與包含岩藻糖基團(fucose moiety)的抗原決定位結合。在某些實施例中,該抗體與包含唾液酸基團(sialyl moiety)的抗原決定位結合。在某些實施例中,該抗體與不含唾液酸基團的抗原決定位結合。在某些實施例中,該抗體與輸鐵蛋白受器的結合作用不會被包含Leb、Ley或Lex結構的碳水化合物所抑制。
在某些實施例中,該抗體和一包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區的抗體競爭與輸鐵蛋白受器結合的機會,且其中該重鏈可變區包括源自序列編號:1(或序列編號:1)的三個互補決定區(CDR),及該輕鏈可變區包括源自序列編號:3(或序列編號:3)的三個CDR。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包括源自序列編號:1(或序列編號:1)的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:3(或序列編號:3)的該三個CDR。在某些實施例中,該抗體包含:(i)重鏈可變區,且該重鏈可變區包括與序列編號:1之第20~138個胺基酸有至少約95%相似度的序列;及/或(ii)輕鏈可變區,且該輕鏈可變區包括與序列編號:3之第20~132個胺基酸有至少約95%相似度的序列。在某些實施例中,該抗體包含:重鏈可變區且該重鏈可變區包括序列編號:1的第20~138個胺基酸,及/或輕鏈可變區且該輕鏈可變區包括序列編號:3的第20~132個胺基酸。
在某些實施例中,該抗體和一包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區的抗體競爭與輸鐵蛋白受器結合的機會,且其中該重鏈可變區包括源自序列編號:5(或序列編號:5)的三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:7(或序列編號:7)的三個CDR。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包括源自序列編號:5(或序列編號:5)的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:7(或序列編號:7)的該三個CDR。在某些實施例中,該抗體包含:(i)重鏈可變區,且該重鏈可變區包括與序列編號:5之第20~138個胺基酸有至少約95%相似度的序列;及/或(ii)輕鏈可變區,且該輕鏈可變區包括與序列編號:7之第21~128個胺基酸有至少約95%相似度的序列。在某些實施例中,該抗體包含:重鏈可變區且該重鏈可變區包括序列編號:5的第20~138個胺基酸,及/或輕鏈可變區且該輕鏈可變區包括序列編號:7的第21~128個胺基酸。
在某些實施例中,該抗體和一包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區的抗體競爭與該輸鐵蛋白受器結合的機會,且其中該重鏈可變區包括源自序列編號:9(或序列編號:9)的三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:11(或序列編號:11)的三個CDR。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包括來自序列編號:9(或序列編號:9)的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括來自序列編號:11(或序列編號:11)的該三個CDR。在某些實施例中,該抗體包含:(i)重鏈可變區,且該重鏈可變區包括與序列編
號:9之第20~136個胺基酸有至少約95%相似度的序列;及/或(ii)輕鏈可變區,且該輕鏈可變區包括與序列編號:11之第21~134個胺基酸有至少約95%相似度的序列。在某些實施例中,該抗體包含:重鏈可變區且該重鏈可變區包括序列編號:9的第20~136個胺基酸;及/或輕鏈可變區且該輕鏈可變區包括序列編號:11的第21~134個胺基酸。
在某些實施例中,該抗體和一包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區的抗體競爭與該輸鐵蛋白受器結合的機會,且其中該重鏈可變區包括源自序列編號:13(或序列編號:13)的三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:15(或序列編號:15)的三個CDR。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包括來自序列編號:13(或序列編號:13)的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括來自序列編號:15(或序列編號:15)的該三個CDR。在某些實施例中,該抗體包含:(i)重鏈可變區,且該重鏈可變區包括與序列編號:13之第20~138個胺基酸有至少約95%相似度的序列;及/或(ii)輕鏈可變區,且該輕鏈可變區包括與序列編號:15之第23~130個胺基酸有至少約95%相似度的序列。在某些實施例中,該抗體包含:重鏈可變區且該重鏈可變區包括序列編號:13的第20~138個胺基酸;及/或輕鏈可變區且該輕鏈可變區包括序列編號:15的第23~130個胺基酸。
在某些實施例中,該抗體和一包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區的抗體競爭與該輸鐵蛋白受器結合的機會,且其中該重鏈可變區包括源自序列編號:17(或序列編號:17)的三
個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:18(或序列編號:18)的三個CDR。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包括來自序列編號:17(或序列編號:17)的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括來自序列編號:18(或序列編號:18)的該三個CDR。在某些實施例中,該抗體包含:(i)重鏈可變區,且該重鏈可變區包括與序列編號:17之第1~119個胺基酸有至少約95%相似度的序列;及/或(ii)輕鏈可變區,且該輕鏈可變區包括與序列編號:18之第1~108個胺基酸有至少約95%相似度的序列。在某些實施例中,該抗體包含:重鏈可變區且該重鏈可變區包括序列編號:17的第1~119個胺基酸;及/或輕鏈可變區且該輕鏈可變區包括序列編號:18的第1~108個胺基酸。
在某些實施例中,該抗體為人源化抗體(humanized antibody)。在某些實施例中,該抗體為嵌合抗體。在某些實施例中,該抗體為人類抗體(human antibody)。在某些實施例中,該抗體為IgG(例如,IgG1、IgG2或IgG4)。在某些實施例中,該抗體為人類IgG,例如人類IgG1。
在某些實施例中,該抗體與非造血性癌細胞所表現的輸鐵蛋白受器專一性結合,其中該非造血性癌細胞係例如胰臟癌細胞、胃癌細胞、大腸直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、攝護腺癌細胞、子宮內膜癌細胞、乳癌細胞或肝癌細胞。在某些實施例中,該抗體不與CHO細胞、紅血球、血小板、HUVEC細胞、單核球、多形核白血球(PMN)、T細胞或活化T細胞所表現的輸鐵蛋白受器結合。在某些實施例中,
該癌細胞為人類癌細胞。在某些實施例中,該抗體與該等癌細胞之細胞表面上的輸鐵蛋白受器結合之後,該抗體被內化(internalized),例如被內化而進入癌細胞中。在某些實施例中,在無需連接細胞毒素(cytotoxin conjugation)和無免疫效應子功能(immune effector function)的情況下,該抗體與該等癌細胞之細胞表面上的輸鐵蛋白受器結合之後能夠誘發該等癌細胞的細胞凋亡作用。在某些實施例中,該抗體與細胞毒素連接。在某些實施例中,該抗體與一標記連接。
本文中亦提供藥學組成物,該等藥學組成物包含文中所述該等抗體中之任一抗體及藥學上可接受之載劑。在某些實施例中提供一種聚核苷酸,且該聚核苷酸包含編碼著文中所述該等抗體中之任一抗體的核酸序列。在某些實施例中提供一種載體(vector),且該載體包含編碼著文中所述該等抗體中之任一抗體的核酸序列。在某些實施例中提供一種包含文中所述該等載體中之任一載體的宿主細胞。在某些實施例中提供一種製造抗體的方法,該方法包括培養文中所述之宿主細胞且該宿主細胞可製造文中所述之抗體,及回收該宿主細胞所製造之抗體。在某些實施例中,可例如在該宿主細胞製造出該抗體之後,分離或純化該抗體。
本文中亦提供一種治療生物個體之非造血性癌症的方法,該方法包括對該生物個體施用有效量的文中所述抗體。本文中還提供一種治療生物個體之非造血性癌症的方法,該方法包括對該生物個體施用一數量之文中所述抗體及一數量的另一抗癌劑,且藉由該抗體與該抗癌劑協同合作而
為該生物個體提供有效癌症治療。在某些實施例中,該抗癌劑為化療藥劑。在某些實施例中,該抗體與細胞毒素連接。在某些實施例中,該非造血性癌症為胰臟癌、胃癌、大腸直腸癌(colorectal cancer)、肺癌、卵巢癌、攝護腺癌、子宮內膜癌、乳癌或肝癌。在某些實施例中,該生物個體是人。
本文中亦提供包含中所述抗體中之任一抗體的套組。在某些實施例中,該套組進一步包括用於指示對生物個體施用有效量之該抗體以治療非造血性癌症的使用說明書。在某些實施例中,該套組進一步包括用於指示對該生物個體施用一數量之該抗體及一數量之另一抗癌劑以治療非造血性癌症並藉由該抗體與該抗癌劑協同合作而為該生物個體提供有效治療的使用說明書。在某些實施例中,該套組進一步包含第二抗癌劑。
本文中亦提供篩選能與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器專一性結合之抗體的方法,該方法包括以下步驟:a)提供多個抗體,並選出能與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器專一性結合的一或多個抗體,及b)使用從步驟a)選出的該一或多個抗體以進一步選出不會與活化T細胞或Jurkat細胞所表現之輸鐵蛋白受器專一性結合的抗體。在某些實施例中,該抗體與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器上的碳水化合物專一性結合。在某些實施例中,該方法進一步包括以下步驟:選出在無需連接細胞毒素和無免疫效應子功能的情況下,抗體與該等癌細胞之細胞表面上的輸鐵蛋白受器結合之後能夠誘發該等癌細胞之細胞凋亡作用的抗體。
在某些實施例中,該非造血性癌細胞為胰臟癌細胞、胃癌細胞、大腸直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、攝護腺癌細胞、子宮內膜癌細胞、乳癌細胞或肝癌細胞。
應理解文中所述各種實施例的一個、一些或全部性質可加以組合以形成本發明之其他實施例。所屬技術領域中熟悉該項技藝者將明白本發明之此等態樣和其他態樣。
第1圖為西方墨點實驗結果,其顯示源自6-90、55-31、122-72及5D7-54.17融合瘤選殖株的抗體能夠辨識癌症特異性人類輸鐵蛋白受器。(A)肺癌細胞H358及攝護腺癌細胞DU145的免疫沉澱和西方墨點實驗結果。(B)正常活化T細胞的免疫沉澱和西方墨點實驗結果。箭頭標示者為輸鐵蛋白受器(TfR)之蛋白質。圖中示出此實驗所使用的第一抗體。此實驗中使用的第二抗體為接有辣根過氧化物酶(HRP)的兔子抗山羊免疫球蛋白IgG或山羊抗小鼠IgG(H+L),此等第二抗體會與小鼠IgM交叉反應。
第2圖圖示抗體6-90之重鏈(A)和輕鏈(B)之可變區的胺基酸序列及核苷酸序列。各鏈中的訊息胜肽係以斜體和底線標示。各鏈中的CDR係以粗體和底線標示。
第3圖圖示抗體55-31之重鏈(A)和輕鏈(B)之可變區的胺基酸序列及核苷酸序列。各鏈中的訊息胜肽係以斜體和底線標示。各鏈中的CDR係以粗體和底線標示。
第4圖圖示抗體122-72之重鏈(A)和輕鏈(B)之可變
區的胺基酸序列及核苷酸序列。各鏈中的訊息胜肽係以斜體和底線標示。各鏈中的CDR係以粗體和底線標示。
第5圖圖示抗體5D7-54.17之重鏈(A)和輕鏈(B)之可變區的胺基酸序列及核苷酸序列。各鏈中的訊息胜肽係以斜體和底線標示。各鏈中的CDR係以粗體和底線標示。
第6圖圖示內化作用分析結果,其顯示源自6-90、55-31、122-72及5D7-54.17融合瘤選殖株的抗體能誘發Panc 02.03B、H358、DLD-1和OMC-3癌細胞株的內化作用。
第7圖係使用抗體122-72及抗體5D7-54.17辨識唾液酸基團的西方墨點實驗結果,如實驗結果證實該等抗體喪失對於經過α2-3,6,8-神經胺酸水解酶處理之rCEA蛋白的抗體辨識作用。圖中示出此實驗中使用的第一抗體。此實驗中使用的第二抗體為抗-小鼠IgG(H+L)-HRP,此第二抗體會與小鼠IgM交叉反應。
第8圖係使用抗體6-90辨識唾液酸基團的西方墨點實驗結果,如實驗結果證實該抗體喪失對於經過α-1→(2,3,4)-岩藻糖苷酶和N-聚醣酶(N-glycanase)處理之rCEA蛋白的抗體辨識作用。圖中示出此實驗中使用的第一抗體。此實驗中使用的第二抗體為抗-小鼠IgG(H+L)-HRP,此第二抗體會與小鼠IgM交叉反應。
第9圖之圖式係圖示使用Lewisa聚醣進行競爭下,抗體6-90、抗體55-31、抗體122-72及抗體5D7-54.17與胰臟癌Panc 02.03B細胞之結合作用的抑制百分率。
第10圖圖示在體內實驗中接有c5D7之抗體藥物接
合物(ADC)對抗大腸直腸癌DLD-1的抗腫瘤活性。
「抗體」為一種能經由位於免疫球蛋白分子之可變區內的至少一抗原辨識位置而與標的物(諸如,碳水化合物、聚核苷酸、脂質、聚胜肽等)專一性結合的免疫球蛋白分子。當用於本文時,該名詞不僅涵蓋完整的多株抗體或單株抗體,還包括抗體片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈抗體(ScFv)、抗體之突變型、包含抗體部分的融合蛋白以及任何包含抗原辨識位置之免疫球蛋白分子的其他修飾構造。抗體包括任何種類的抗體,例如IgG、IgA或IgM(或其亞類),且該抗體不需為任何特定的種類。根據抗體重鏈之恒定域的胺基酸序列,可將免疫球蛋白分為不同種類。免疫球蛋白有五大種類:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,且此五種類的其中數種可進一步細分多種亞類(同型,isotype),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應不同類型免疫球蛋白的重鏈恒定域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型免疫球蛋白的子單元(subunit)結構和立體構造已為人所熟知。
本發明之抗體欲進一步包括雙專一性(bispecific)、多專一性(multispecific)、單鏈、嵌合和人源化分子,該等分子係藉由該抗體的至少一個互補決定區(CDR)或高可變區(HVR)而賦予該分子對一聚胜肽具有親和力。本發明之抗體亦包括單域抗體(single domain antibody),其為一抗體重鏈之可
變區或為一抗體輕鏈之可變區(參閱Holt等人於2003年發表於Trends Biotechnol第21期484~490頁之論文)。製造結構域抗體(domain antibody)的方法亦是相關領域中所熟知的技術,該結構域抗體包含一抗體重鏈的可變區或一抗體輕鏈的可變區及包含來自一抗體之六個天然互補決定區的其中三個互補決定區(例如參閱Muyldermans於2001年發表在Rev.Mol.Biotechnol.第74期277~302頁之論文)。在某些實施例中,本發明之抗體涵蓋一種與試劑(例如,細胞毒素)連接的抗體。
當用於本文中時,「單株抗體」意指一種實質同質抗體(homogeneous antibody),即,在構成總體的各個抗體中除少量可能自然發生的突變株之外,該各個抗體皆相同。此外,多株抗體製備物通常包括多種針對不同決定簇(抗原決定位)的不同抗體,而與多株抗體製備物不同的是,單株抗體並非是由多種不同抗體所組成的混合物。形容詞「單株(monoclonal)」意指該抗體的特性是來自實質均同質的抗體族群,但不應推論為需由任何特定的方法以製造該抗體。例如,可藉由最早由Kohler和Milstein於1975年在期刊Nature第256期495頁所述的融合瘤(hybridoma)法,或藉由例如美國專利案第4,816,567號中所述之DNA重組法製造用於本發明的單株抗體。亦可從例如使用McCafferty等人於1990年在期刊Nature第348期552~554頁所述技術建構而成的噬菌體資料庫(phage library)中分離出該等單株抗體。
當用於本文中時,「嵌合抗體(chimeric antibody)」意指具有來自第一物種之可變區或部分可變區及來自第二物
種之恒定區的抗體。完整的嵌合抗體包含兩套(two copies)嵌合輕鏈及兩套嵌合重鏈。嵌合抗體的製造方法已為相關技術領域中所熟知(見Cabilly等人於1984年在期刊Proc.Natl.Acad.Sci.USA第81期3273~3277頁;Harlow和Lane於1988年由冷泉港實驗室出版書名為Antibodies:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory之書籍)。通常,在這些嵌合抗體中,輕鏈和重鏈的可變區模擬源自一哺乳動物品種之抗體的可變區,而該恒定區則與來自另一品種之抗體的序列同源。此種嵌合型之一明顯優點係例如,可使用容易取得的融合瘤或來自非人類宿主生物的B細胞從現有已知來源方便地取得該等可變區,並且使所取得的可變區與源自例如人類細胞製備物的恒定區組合。該可變區雖然具有容易製備且專一性不受來源影響的優點,但當注射抗體時,相較於來自非人類來源的恒定區而言,該來自人類的恒定區較不易誘發人類受試者的免疫反應。然而,此定義並不僅侷限於此特定的範例。
「經分離的(isolated)」抗體係指從抗體之天然環境組成中回收及/或分離且經鑑定的抗體。
如此處所述,「實質純的」意指具有至少50%純度(即,無污染物)、更佳為具有至少90%純度、更佳為至少95%純度、更佳為至少98%純度、更佳為至少99%純度的材料。
當用於本文中,「人源化(humanized)」抗體意指含有最少之衍生自非人類免疫球蛋白序列的非人類(例如,鼠)抗體形式,該等抗體形式可為專一性的嵌合免疫球蛋白、免
疫球蛋白鏈或其片段(例如,Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合序列。就大多數情況而言,人源化抗體為人類免疫球蛋白(接受體抗體,recipient antibody),其中來自該接受體之HVR或CDR的胺基酸殘基被來自具有期望專一性、親和力和結合量(capacity)的非人物種(諸如小鼠、大鼠或兔)之HVR或CDR的殘基(供體抗體)所取代。在一些實例中,人類免疫球蛋白的Fv架構區(framework region,FR)殘基被對應的非人殘基所取代。此外,該人源化抗體可包含在該接受體抗體及所引入之HVR或CDR或架構序列中皆不存在但卻被加入抗體中以使抗體性能進一步改進和最佳化的殘基。一般而言,該人源化抗體實質上包含至少一個且通常為兩個的可變區,其中全部或實質上全部的HVR或CDR區對應於非人類免疫球蛋白的HVR或CDR區,且全部或實質上全部的FR區是人類免疫球蛋白共同序列(consensus sequence)的FR區。該人源化抗體亦可適當地包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區或結構域(Fc),且通常是來自人類免疫球蛋白的恒定區或結構域(Fc)。抗體可具有如WO 99/58572中所述修飾的Fc區。其他形式的人源化抗體具有參照原始抗體而改變的一或多個HVR或CDR(1、2、3、4、5、6個),亦被稱為從原始抗體之一或多個HVR或CDR「衍生」而來的一或多個HVR或CDR。
當用於本文中,「人類抗體」意指具有對應於由人類所產生之抗體胺基酸序列的抗體,及/或使用所屬技術領域中已知或本文所揭露任何製造人類抗體技術所製成之抗體胺
基酸序列的抗體。此人類抗體的定義包括具有至少一人類重鏈聚胜肽或至少一人類輕鏈聚胜肽的抗體。此類抗體的一實例是含有小鼠輕鏈聚胜肽和人類重鏈聚胜肽的抗體。可利用技藝中已知的各種技術製造人類抗體。可使用所屬技術領域中已知的技術製造人類抗體。在一實施例中,該人類抗體係選自表現人類抗體的噬菌體資料庫(Vaughan等人於1996年發表於Nature Biotechnology第14期309~314頁之論文;Sheets等人於1998年發表於PNAS(USA)第95期6157~6162頁之論文;Hoogenboom和Winter於1991年發表於J.Mol.Biol.第227期381頁之論文;Marks等人於1991發表於J.Mol.Biol.第222期581頁之論文)。亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入基因轉殖動物(例如,小鼠)而製造出人類抗體,在該基因轉殖動物體體內的內源性免疫球蛋白基因已被部分或全部去活化。此方法已述於美國專利案第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號和第5,661,016號。或者,可藉由使人類B淋巴球永生化(immortalizing)以製造出針對標靶抗原的人類抗體(此種B淋巴球可取自一生物個體或已於活體外經免疫處理)。參閱例如Cole等人所著且由Alan R.Liss出版商於1985年出版之書籍《單株抗體和癌症治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》第77頁;Boerner等人於1991年發表在J.Immunol.第147期第1卷86~95頁之論文;及美國專利案第5,750,373號。
抗體的「可變區(variable region)」指該抗體輕鏈之可變區或該抗體重鏈之可變區的單獨任一者或兩者之組合。
通常,該等可變區介導抗原結合作用並定義一特定抗體對於一特定抗原的專一性。該等可變區可具有數個相對不變的架構,稱為架構區(FR,例如具有15~30個胺基酸的FR),且藉由稱為「高可變區(HVR)」的極多變較短區隔開該等架構區,例如該等高可變區各自長度為9~12個胺基酸。在某些實施例中,天然重鏈和天然輕鏈的可變區各自包含藉由三個高可變區連接的四個架構區(FR),該三個高可變區形成環狀連接而使該四個架構區形成主要為β-片狀(beta-sheet)的構造,且在某些情況下,該三個高可變區成為該β-片狀結構的一部分。在各鏈內的高可變區可藉由FR而緊密地接合在一起,並且與來自另一鏈的高可變區一同形成抗體的抗原結合位置,參閱Kabat等人所著且於1991年由美國馬里蘭州貝塞斯達市(Bethesda)之國家衛生研究院公共衛生服務部所出版的書籍《標靶免疫球蛋白的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Insterest)》第五版。恆定域可能不直接參與抗體與抗原的結合作用,但可能表現出各種效應子功能,例如使該抗體參與抗體依賴性細胞介導細胞毒性作用(ADCC)中。
當用於本文中時,「高可變區(hypervariable region,HVR)」意指抗體上負責與抗原結合的胺基酸殘基。高可變區通常包括來自「互補決定區」或稱「CDR」的胺基酸殘基(例如在VL中的約第24~34個殘基(L1)、第50~56個殘基(L2)及第89~97個(L3)殘基,及在VJJ中的約第31~35個殘基(H1)、第50~65個殘基(H2)及第95~102個殘基(H3),且在一實施例中,H1約位於第31~35個殘基(參閱Kabat等人所
著且於1991年由美國馬里蘭州貝塞斯達市(Bethesda)之國家衛生研究院公共衛生服務部所出版的書籍《標靶免疫球蛋白的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Insterest)》第五版),及/或包含來自「高變環(hypervariable loop)」的該等殘基(例如在VL中的約第26~32個殘基(L1)、第50~52個殘基(L2)及第91~96個(L3)殘基,及在VH中的約第26~32個殘基(H1)、第53~55個殘基(H2)及第96~101個殘基(H3),參閱Chothia與Lesk於1987年發表於J.MoI.Biol.第196期901~917頁之論文)。有兩種多種方式可測定CDR,例如其中一種方法係根據交叉種系的序列差異性(即參閱Kabat等人所著且於1991年由美國馬里蘭州貝塞斯達市(Bethesda)之國家衛生研究院公共衛生服務部所出版的書籍《標靶免疫球蛋白的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Insterest)》第五版);以及另一方法是根據抗原-抗體複合體的晶體學研究(參閱Al-lazikani等人於1997年發表於J.Molec.Biol.第273期927~948頁之論文)。即Kabat所述之互補決定區(CDR)的HVR是根據序列差異性而決定且最為常用(參閱前述Kabat等人所述書籍)。Chothia等人則改用結構環的位置來決定HVR(參閱Chothia與Lesk於1987年發表於J.MoI.Biol.第196期901~917頁之論文)。AbM HVR則是Kabat的CDR與Chothia結構環兩者之間的折衷方法,且牛津分子公司(Oxford Molecular)的AbM抗體模型建構軟體便採用此方法。「接觸性(contact)」HVR則是根據可取得複合結晶結構分析而得。當用於本文中,CDR可為藉由上述方
法中之任意一種方法或藉由上述方法中任意兩種或三種方法組合所定義的CDR。該CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR或接觸性CDR。以下列出此等HVR各自的胺基酸殘基。
HVR可包括下列「延伸式HVR(extended HVR)」:在VL中的第24~36個或第24~34個殘基(L1)、第46~56個或第50~56個殘基(L2)及第89~97個或第89~96個(L3)殘基,及在VH中的第26~35個殘基(H1)、第50~65個或第49~65個殘基(H2)(此較佳實施例)及第93~102個、第94~102個或第95~102個殘基(H3)。根據上述Kabat等人之方法為此等延伸式HVR定義之每一個延伸式HVR的可變域殘基進行編號。
抗體的「恒定區」指該抗體輕鏈之恆定區或該抗體重鏈之恆定區的單獨任一者或兩者之組合。抗體的恒定區通
常可提供結構穩定性及其他生物功能,例如抗體鏈的結合、分泌、胎盤流動性(transplacental mobility)和補體結合作用,但不涉及與抗原的結合作用。恒定區的胺基酸序列及其基因中對應的外顯子(exon)序列將視該恆定區的來源種系而定;然而在一種系中,對於特定恆定區中可導致同種異型(allotype)的胺基酸序列變異是相對有限的。各鏈的可變區係藉由連接性聚胜肽序列而與恒定區連接。輕鏈基因內的「J」序列編碼該連接序列(linkage sequence),且在該重鏈基因內則由「D」序列和「J」序列合併編碼該連接序列。
當用於本文中,「抗體依賴性細胞介導細胞毒性」和「ADCC」指一種細胞介導的反應,在該反應中,表現Fc受器(FcR)的非專一性細胞毒性細胞(例如,自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球和巨噬細胞)可辨識結合在標靶細胞上的抗體且隨後導致該標靶細胞溶解。可利用活體外ADCC檢測法測定所關注之分子的ADCC活性,例如可使用美國專利案第5,500,362號或第5,821,337號中所述方法。可用於此類檢測法的效應細胞(effector cells)包括周邊血液單核球(PBMC)和自然殺手(NK)細胞。或者或可附加地,可在活體內測定所關注之分子的ADCC活性,該活體係例如Clynes等人於1998年發表於PNAS(USA)第95期652~656頁中所述之動物模型。
「補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity)」和「CDC」指存在補體存在下之標靶細胞的溶解作用(lysing)。當補體系統的第一成分(C1q)與已和同源抗原(cognate antigen)複合的分子(例如,抗體)結合時便開始啟動
補體活化路徑。測定補體活性可使用例如Gazzano-Santoro等人於1996年在期刊J.Immunol.Methods第202期163頁中所述的CDC檢測法。
「聚胜肽(polypeptide)」、「寡胜肽(oligopeptide)」、「胜肽(peptide)」和「蛋白質(protein)」用於本文中時可互換使用,且該等用語係指任何長度的胺基酸聚合物。該聚合物可為直鏈狀或支鏈狀,該聚合物可包含經修改的胺基酸且可被非胺基酸所中斷。該等用語亦涵蓋藉由自然或人為介入而經修改的胺基酸聚合物,例如,形成雙硫鍵、醣化、脂化(lipidation)、乙醯化、磷酸化或任何其他處理或修飾,例如可與標記成分接合。該定義亦包括例如含有一或多個胺基酸類似物(例如,包括非天然胺基酸,等等)及所屬技術領域中已知之其他修飾的聚胜肽。應瞭解,由於本發明的聚胜肽係以抗體為基礎,因此該聚胜肽可以單鏈或結合鏈的形式出現。
在本文中「聚核苷酸」或「核酸」可互換使用,該等用語係指任何長度之核苷酸聚合物,且包括DNA和RNA。該等核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修改之核苷酸或鹼基及/或其類似物,或可藉由DNA聚合酶或RNA聚合酶而併入一聚合物中的任何受質(substrate)。聚核苷酸包含經修改之核苷酸,例如甲基化核苷酸及其類似物。若存在經修改之核苷酸時,可在組合該聚合物之前或之後進行該核苷酸構造的修改。可利用非核苷酸成分中斷核苷酸的序列。可在核苷酸聚合反應之後,例如藉由與一標記成分接合以進一步修改該聚核苷酸。其他類型的修飾包括例如:「加帽作用
(cap)」;使用類似物對一或多個天然核苷酸進行或取代(substitution);核苷酸之間的修飾作用(例如該等修飾具有不帶電荷連結物,例如甲基亞磷酸酯類(methylphosphonates)、亞磷酸三酯類(phosphotriesters)、亞磷酸醯胺鹽類(phosphoamidates)、胺基甲酸酯類(cabamates),等等)及該等修飾具有帶電荷連結物,例如,硫代磷酸酯類(phosphorothioates)、二硫代磷酸酯類(phosphorodithioates),等等);含有綴飾基團(pendant moiety)之修飾,例如具有蛋白質(如核酸酶、毒素、抗體、訊息胜肽、聚-L-離胺酸,等等);具有嵌入物(intercalators)之修飾(例如吖啶(acridine)、補骨脂素(psoralen)等);含有螯合物之修飾(例如含金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬,等等);含有烷化劑之修飾;具有經修改之連接物的修飾(例如具有α異構(alpha anomeric)核酸,等等);以及該等聚核苷酸的未修飾形式。此外,可例如使用亞磷酸基(phosphonate group)、磷酸基(phosphate group)取代通常存在於糖類中的任何羥基,以及使用標準保護基保護糖類中的任何羥基;或活化糖類中的任何羥基以製備額外的連接處以連接附加的核苷酸或與固體承載物接合。該5’端和3’端的OH可被磷酸化,或使用胺類或具有1至20個碳原子的有機加帽基團取代該5’端和3’端的OH。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有所屬技術領域中眾所周知的核糖或去氧核糖的類似型包括例如:2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-疊氮基核糖;碳環糖類似物(carbocyclic sugar analog);α-異構糖類;差向異構糖類
(epimeric sugars),例如阿拉伯糖(arabinose)、木糖或來蘇糖(lyxoses)、哌喃糖(pyranose sugars)、呋喃糖(furanose sugars)、景天酮庚糖(sedoheptuloses);非環狀類似物和脫鹼基(abasic)核苷類似物,例如甲基核糖苷。可使用替代性的連接基團取代一或多個亞磷酸二酯連接物(phosphodiester linkage)。這些替代性連接基團包括但不限於下列實施例,在實施例中:使用P(O)S(「硫化」)、P(S)S(「二硫化」)、“(O)NR2(「醯胺化」)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(「甲縮醛」)取代磷酸酯,其中各個R或R'獨立地為氫或經取代或未經取代之烷基(1~20個碳原子),且該經取代或未經取代之烷基視需要可含有醚(-O-)鍵、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。並非聚核苷酸內所有的連接物都需相同。前述內容可應用於本文中所提出之包括RNA和DNA在內的所有聚核苷酸。
當用於本文中,「載體(vector)」意指一種能夠將一或多個目標基因或序列送入宿主細胞中且較佳能夠在宿主細胞內表現該一或多個目標基因或序列的構築體(construct)。載體的實例包括,但不限於,病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體(plasmid)、黏接質體(cosmid)或噬菌體載體、附有陽離子凝集劑(cational condensing agent)的DNA或RNA表現載體、包裹於微脂粒(liposome)內的DNA或RNA表現載體及某些真核細胞(例如,生產細胞,producer cell)。
當用於本文中,「表現控制序列(expression control sequence)」代表操縱核酸轉錄作用的核酸序列。表現控制序列可為啟動子,例如持續性啟動子(constitutive promoter)和誘
發性啟動子(inducible promoter),或是增強子(enhancer)。該表現控制序列與該欲進行轉錄的核酸序列可操作地連接。
當用於本文中時,藥物、化合物或藥學組成物的「有效劑量」或「有效量」一詞意指足以產生有益效果或期望結果的用量。用於預防時,有益或期望的結果包括例如在包括疾病的生物化學、組織學及/或行為症狀方面以及在疾病發展過程中出現的併發症和中間病理性表現型方面上,達到消除或降低疾病風險、減輕疾病嚴重度或延遲疾病發作等結果。用於治療時,有益或期望的結果包括例如減少一或多種因疾病所造成的症狀、提升病患生活品質、減少治療該疾病所需的其他藥物用量、例如經由針對目標進行攻擊(targeting)而強化另一藥物的作用、延緩疾病的發展進程及/或延長存活時間等臨床結果。在用於癌症或腫瘤時,一有效量的藥物可有效減少癌細胞數目;縮小腫瘤尺寸;抑制(即,減緩至某種程度且較佳停止)癌細胞侵犯周邊器官;抑制(即,減緩至某種程度且較佳停止)腫瘤的轉移;抑制腫瘤生長至某個程度;及/或舒緩一或多種疾病相關症狀達某種程度。有效劑量可分成一次或多次投藥。用於本發明之目的時,一有效劑量的藥物、化合物或藥學組成物為足以直接或間接達到預防或治療效果的用量。如臨床報告中所瞭解,可協同或不需協同另一藥物、化合物或藥學組成物而達到一藥物、化合物或藥學組成物的有效劑量。因此,在本文中,一「有效劑量」可視為是施用一或多種治療劑,以及若單一藥劑在與一或多種其他藥物搭配下可能達到或達到期望結果時,則該單一藥劑可被視為達
到有效劑量。在某些實施例中,「有效劑量」或「有效量」一詞意指使本發明所述之抗體或聚胜肽足以產生有益或期望結果的用量。
此處「協同(in conjunction with)」指在除了施予一種療程還施予另一種療程。因此,「協同」意指在對生物個體施用其他療程之前、期間內或之後施予一種治療模式。
當用於本文中,「治療」或「療法」一詞為獲得有益或期望結果(其包括且較佳為臨床上的結果)的方法。用於本發明之目的時,有益或期望的臨床結果包括,但不限於下列一或多種結果:減少癌細胞增殖或破壞癌細胞、減少因疾病所造成的症狀、提升病患的生活品質、減少用於治療該疾病所需的其他藥物劑量、延遲該疾病的發展進程及/或延長該生物個體的存活時間。
此處「延遲疾病的發展」意指延遲、阻止、減緩、妨礙、穩定及/或延後疾病(例如癌症)的發展。此延遲可視疾病的病史及/或接受治療的生物個體而有不同的時間長度。所屬技術領域中熟悉該項技藝者顯然能瞭解,足夠或明顯的延遲實際上包括阻止作用,在阻止作用中該患者的疾病不會發展。例如,可延後晚期癌症的發生,例如延後發生轉移情形。
「生物個體(individual)」或「受試者(subject)」係指哺乳動物,更佳指人類。哺乳動物亦包括,但不限於農畜動物、運動賽事用動物、寵物(例如貓、犬、馬)、靈長動物、小鼠和大鼠。
於本文中,「專一性辨識(specifically recognize)」
或「專一性結合(specifically bind)」意指可測量且可再現的交互作用,例如標靶物和抗體之間的吸引或結合作用,其可用於判斷在含有多種生物分子的異質分子族群中是否存在該標靶物。例如,專一或優先與一抗原決定位結合的抗體是指相較於該抗體與非目標之抗原決定位或與該標靶物之其他抗原決定位的結合作用而言,該抗體與此目標抗原決定位的結合作用具有較高的親和力、強烈度、更容易結合及/或更長久的結合時間。藉由此定義的說明亦瞭解,例如專一或優先與第一標靶物結合的抗體(或基團或抗原決定位)可能會或可能不會專一或優先與第二標靶物結合。因此,「專一性結合」或「優先結合」並不必然要求(雖然可能包括)獨佔性的結合作用。與標靶物專一性結合的抗體可具有至少約103M-1或104M-1的結合常數,有時具有約為105M-1或106M-1的結合常數,在其他實例中為約106M-1或107M-1、約108M-1或109M-1,或約1010M-1或1011M-1或更高。有多種免疫檢測方式可用於選出對特定蛋白質具有專一免疫反應性的抗體。例如,固相ELISA免疫檢測法便是常規用於選出能與一蛋白質發生專一性免疫反應的單株抗體。參閱例如Harlow和Lane於1988年由紐約冷泉港出版社所出版之《抗體:實驗室手冊(Antibodies:A Laboratory Manual)》一書,該手冊說明用於測定專一免疫反應性的免疫檢測方式和條件。
當用於本文中,「癌症(cancer)」、「腫瘤(tumor)」、「癌性的(cacerous)」和「惡性(maglignant)」等用語意指或描述在哺乳動物體內之細胞生長通常不受控制的生理狀況。癌
症的實例包括,但不限於,包括腺癌(adenocarcinoma)、淋巴瘤、胚細胞瘤(blastoma)、黑色素瘤和肉瘤(sarcoma)在內的惡性瘤。此類惡性瘤的更明確實例包括鱗狀細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、胃腸癌、何杰金氏與非何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s and non-Hodgkin’s lymphoma)、胰臟癌、膠質母細胞瘤(glioblastoma)、子宮頸癌、神經膠質瘤(glioma)、卵巢癌、肝癌(如肝癌和肝腫瘤)、膀胱癌、乳癌、大腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌(endometrial or uterine carcinoma)、唾液腺癌、腎癌(如腎細胞癌和威耳姆氏瘤(Wilms’tumors))、基底細胞癌(basal cell carcinoma)、黑色素瘤、攝護腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌、食道癌及各種頭頸癌。
除非本文中另有明述,否則當單數用語「一(a、an)」和「該」用於本文及後附申請專利範圍中時,亦包括複數之意。例如,當提及一「抗體」時係指一至多個抗體,例如數個莫耳數量的抗體,且包括所屬技術領域中熟悉該項技藝者已知的等效當量(equivalent),並依此類推。
文中提及「約(about)」為一值或一參數時,該用語包括(及描述)與該數值或參數本身有關的諸多實施例。例如,提到「約X」的說明內容包括「X」本身的敘述。
應瞭解文中所述之發明態樣和變化可包括「由…組成(consisting)」及/或「主要由...組成(consisting essentially of)」的態樣和變化。
本發明提供能與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器(例如,人類輸鐵蛋白受器)專一性結合的抗體及由該等抗體衍生而得的聚胜肽。該等抗體或聚胜肽能與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器上的修飾物(例如,碳水化合物)專一性結合。在某些實施例中,該輸鐵蛋白受器是人類輸鐵蛋白受器,例如具有基因庫登錄編號(GenBank accession number):AAA61153.1或基因庫登錄編號:AAF04564.1所載之胺基酸序列的人類輸鐵蛋白受器(該等基因庫登錄編號之內容以引用方式全部併入本文),或者該輸鐵蛋白受器可為具有下述序列編號:19所載之胺基酸序列的人類輸鐵蛋白受器(見下方)。在某些實施例中,該抗體或聚胜肽可與具有序列編號:19中第1~760個胺基酸之輸鐵蛋白受器上的修飾物(例如,碳水化合物)或該修飾物的一部分專一性結合。
本發明提供能與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器上之碳水化合物專一性結合的抗體或聚胜肽,且該非造血性癌細胞係例如胰臟癌細胞、胃癌細胞、大腸直腸癌細胞、
肺癌細胞、卵巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、膽囊癌細胞、攝護腺癌細胞、乳癌細胞或肝癌細胞。該等抗體或聚胜肽可能不與活化T細胞(例如周邊活化T細胞)或Jurkat細胞所表現的輸鐵蛋白受器專一性結合。在某些實施例中,該抗體與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器的結合作用不會被含有路易斯a結構(Lewis a structure,Lea)的碳水化合物抑制。在某些實施例中,該等癌細胞為人類癌細胞。在某些實施例中,該輸鐵蛋白受器為哺乳動物之輸鐵蛋白受器,例如人類輸鐵蛋白受器或小鼠輸鐵蛋白受器。在某些實施例中,該輸鐵蛋白受器為人類輸鐵蛋白受器。在某些實施例中,本文中所述之輸鐵蛋白受器上的修飾物係指該等癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器上的修飾物(例如,碳水化合物),其中該修飾物不會出現在活化T細胞或Jurkat細胞所表現的輸鐵蛋白受器上。
在某些實施例中,該抗體或聚胜肽與包含岩藻糖基團(fucose moiety)的抗原決定位結合。在某些實施例中,該抗體或聚胜肽與不含岩藻糖基團的抗原決定位結合。在某些實施例中,該抗體或聚胜肽包含唾液酸基團(sialyl motif)的抗原決定位結合。在某些實施例中,該抗體或聚胜肽與不含唾液酸基團的抗原決定位結合。
本文中所提供之抗體及聚胜肽可進一步具有以下一或多種特性:(i)若使用α2-3,6,8-神經胺酸水解酶(α2-3,6,8-Neuraminidase)、α-1→(2,3,4)-岩藻糖苷酶(α-1→(2,3,4)-Fucosidase)或N-聚醣酶(N-glycanase)處理該包含該抗原決定位的分子,會降低該抗體或聚胜肽對該輸鐵蛋
白受器上之抗原決定位的結合作用;(ii)含有Lewis a結構(Lea)的碳水化合物(例如,Lewis a三醣類)不會抑制該抗體或聚胜肽對該抗原決定位的結合作用;(iii)含有Lewis b(Leb)、Lewis y(Ley)或Lewis x(Lex)結構的碳水化合物不會抑制該抗體或聚胜肽對該抗原決定位的結合作用;(iv)在無需連接細胞毒素且無免疫效應子功能的情況下,(例如,在體外實驗中)該抗體或聚胜肽與表現在癌細胞之細胞表面上的抗原決定位結合之後能誘發非造血性癌細胞亡;及(v)該抗體或聚胜肽不與CHO細胞、紅血球、血小板、HUVEC細胞、單核球、多形核白血球(PMN)、淋巴球、Jurkat細胞、T細胞、活化T細胞、B細胞、白血病細胞、白血病T細胞或白血病B細胞所表現的輸鐵蛋白受器結合。當用於本文中,「抑制(inhibition)」一詞包括部分抑制或完全抑制。可藉由直接競爭或其他機制而抑制該抗體對該抗原決定位的結合作用。本發明所提供的該等抗體及聚胜肽與表現在癌細胞之細胞表面上的抗原決定位結合之後,該等抗體及聚胜肽可抑制癌細胞(例如,非造血性癌細胞)的細胞生長和增殖;及/或治療或預防該些在細胞表面上表現抗原決定位的癌細胞(例如,非造血性癌症)。非造血性癌細胞可為胰臟癌細胞、胃癌細胞、大腸直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、攝護腺癌細胞、乳癌細胞或肝癌細胞中之任一種細胞。表現該抗原決定位的非造血性癌細胞之實例包括,但不限於,肺癌細胞(例如,H358、A549、H520和H727)、胰臟癌細胞(例如,Panc 02.03B、SU.86.86和Panc-1)、胃癌細胞(例如,SNU-16、NCI-N87和
Kato III)、卵巢癌細胞(例如,OMC-3和SK-OV-3)、子宮內膜癌細胞(例如,HEC-1-A和KLE)、大腸直腸癌細胞(例如,COLO 205、WiDr和DLD-1)、乳癌細胞(例如,MDA-MB-453、Hs578T和T47D)、攝護腺癌細胞(例如,DU145、PC3和22Rv1)及肝癌細胞(例如,PLC/PRF/5、Hep G2和Hep 3B2.1-7)。
本發明之抗體和聚胜肽可辨識表現或出現在非造血性癌細胞上之輸鐵蛋白受器的胞外結構域,但不會與表現或出現在白血球(例如,周邊T細胞)或Jurkat細胞(一種類淋巴胚母白血病細胞)上之輸鐵蛋白受器的胞外結構域結合。在某些實施例中,本文中所提供之抗體和聚胜肽不與造血性來源細胞所表現的輸鐵蛋白受器專一性結合。
本發明之抗體可涵蓋單株抗體、多株抗體、抗體片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc,等等)、嵌合抗體、單鏈抗體(ScFv)、雙專一性抗體、與細胞毒素接合之抗體、抗體之突變型、包含抗體部分的融合蛋白以及任何包含具有所需專一性之抗原辨識位置的免疫球蛋白分子之其他修飾構造。該等抗體可能來自小鼠、大鼠、駱駝、人類或其他來源(包括人源化抗體)。
該聚胜肽(包括抗體)對於表現在非造血性癌細胞上之輸鐵蛋白受器的結合親和力可能小於下述任一者:約500 nM、約400 nM、約300 nM、約200 nM、約100 nM、約50 nM、約10 nM、約1 nM、約500 pM、約100 pM或約50 pM。所屬技術領域中皆知,結合親和力可用KD或解離常數表示,增加結合親和力相當於降低KD。其中一種測定抗體對輸鐵蛋白
受器之結合親和力的方法是測量該抗體之單功能性Fab的結合親和力。利用木瓜酵素(papain)切斷抗體(例如,IgG)或重組表現方式可獲得單功能性的Fab片段。可藉由表面電漿共振(B1Acore 3000TM表面電漿共振法(美國紐澤西州皮斯卡維市(Piscaway)之BIAcore公司所生產的BIAcore3000TM表面電漿共振(SPR)系統)及ELISA方法可測定抗體之Fab片段的親和力。通常在25℃下測量以獲得動力結合率(kon)和解離率(koff);並以koff/kon計算出平衡解離常數(KD)值。
在某些具體實施例中,本發明所提供之抗體和聚胜肽可減少癌症細胞數目,及/或抑制該些表現出能被該抗體和聚胜肽辨識之輸鐵蛋白受器的腫瘤或癌症細胞之生長或增殖。相較於未使用抗體或聚胜肽處理的細胞而言,細胞數目的減少或細胞生長或增殖之抑制作用較佳為至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約65%、約75%或更多。癌症細胞包括,但不限於,胰臟癌、胃癌、大腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、攝護腺癌、乳癌、膽囊癌或肝癌。
在一些具體實施例中,本發明所提供之抗體和聚胜肽在與非造血性癌細胞所表現的輸鐵蛋白受器結合之後,能夠例如經由細胞凋亡作用而獨自誘發細胞的死亡。當用於本文中,「誘發細胞死亡」一詞意指本發明之抗體或聚胜肽可直接與表現於細胞表面上的分子相互作用,且在無其他因子(例如,結合細胞毒素或其他免疫效應子功能,即,補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或吞噬作用)的幫助之下,僅靠該結合/相互作用便足以誘發細胞死亡。在
某些實施例中,文中所提供之該等抗體和聚胜肽在與癌細胞之細胞表面上的輸鐵蛋白受器結合之後能夠被內化(例如,被內化而進入癌細胞內)。
當用於本文中,「細胞凋亡(apoptosis)」一詞係指由基因引導的細胞內部破壞過程。細胞凋亡與壞死作用(necrosis)不同,細胞凋亡包括細胞骨架的瓦解、細胞質的收縮和凝聚、細胞膜外表面上表現磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine)及細胞膜空泡化,其將導致形成許多細胞膜結構囊狀物或凋亡小體(apoptotic bodies)的形成。此過程稱為「計畫性細胞死亡(programmed cell death)」。在細胞凋亡過程中,可觀察到細胞表面彎曲、核染色質凝縮、染色體DNA破碎以及粒腺體功能喪失等特徵現象。可利用各種已知的技術偵測細胞凋亡,例如以Annexin V、碘化丙啶(propidium iodide)、DNA片段檢測法及YO-PRO-1(Invitrogen公司)對細胞進行染色。
偵測細胞死亡(例如細胞凋亡)的方法包括,但不限於偵測細胞形態、DNA片段化作用、酵素活性及聚胜肽的分解作用,等等。可參閱Siman等人之美國專利案第6,048,703號;Martin和Green於1995年發表於Cell第82期349-52頁之論文;Thomberry和Lazebnik於1998年發表於Science第281期1312-6頁之論文;Zou等人之美國專利案第6,291,643號;Scovassi和Poirier於1999年發表在Mol.Cell Biochem.第199期125~37頁之論文;Wyllie等人於1980年發表在Int.Rev.Cytol.第68期251~306頁之論文;Belhocine等人於2004年發表在Technol.Cancer Res.Treat.第3期第1卷23~32頁
之論文,且該等文獻以引用方式併入本案。
在一些實施例中,本發明之抗體和聚胜肽會與抗體6-90、抗體55-31、抗體122-72、抗體5D7-54.17或由抗體5D7-54.17衍生而得的嵌合抗體(c5D7)競爭與表現在癌細胞之細胞表面上之輸鐵蛋白受器結合的機會。在某些實施例中,本發明之抗體或聚胜肽會與輸鐵蛋白受器上的抗原決定位結合,且該抗原決定位也會與抗體6-90、抗體55-31、抗體122-72、抗體5D7-54.17和抗體c5D7中的至少一個抗體結合。
在某些實施例中,可使用競爭檢測法鑑定出可與本發明所述抗體或聚胜肽(例如,抗體6-90、抗體55-31、抗體122-72、抗體5D7-54.17和抗體c5D7)競爭與癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器結合機會的單株抗體。癌細胞可為本文所述癌細胞中的任一種癌細胞。競爭檢測法可用於判斷兩種抗體是否可藉由辨識相同或空間上重疊(sterically overlapping)的抗原決定位結合而與同一個抗原決定位結合,或用於判斷一種抗體是否可競爭性地抑制另一種抗體與抗原的結合作用。在某些實施例中,此競爭性抗體及本發明所述之抗體或聚胜肽(例如,抗體6-90、抗體55-31、抗體122-72、抗體5D7-54.17和抗體c5D7)係與同一個抗原決定位(如本文中所述之輸鐵蛋白受器上的碳水化合物)結合。示例性的競爭檢測法包括,但不限於,諸如Harlow和Lane於1988年由紐約冷泉港之冷泉港實驗室所出版之《抗體:實驗室手冊(Antibodies:A Laboratory Manual)》第14章中所載之常規檢測法。Morris於1966年由美國紐澤西州多多瓦市(Totowa)之Humana出版
社所出版之《分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)》第66冊之「抗原決定位定位法(Epitope Mapping Protocols)」章節中載有數種可用於定位出與抗體結合之抗原決定位的詳細示範方法。若其中一種抗體可阻斷另一種抗體的結合作用達50%或更高,則表示該兩種抗體是與同一個抗原決定位結合。
在一示例性競爭檢測法中,使已固定化之癌細胞表現的輸鐵蛋白受器(TfR)在含有已標記之第一抗體(可與TfR結合,例如抗體6-90、55-31、122-72、5D7-54.17和c5D7)和未標記的第二抗體(待測抗體)的溶液中進行反應,以測定該第二抗體與第一抗體競爭與TfR結合的能力。該第二抗體可存在於融合瘤培養上清液中。作為對照組,使已固定化的TfR在含有已標記之第一抗體但不含未標記之第二抗體的溶液中進行反應。在允許第一抗體與TfR結合的條件下進行反應之後,移除未結合的過量抗體,且測量與固定化TfR結合的標記量。若相對於該對照組樣本而言,該待測樣本中之與固定化TfR結合的標記量實質降低,則表示該第二抗體會與該第一抗體競爭與TfR結合的機會。在某些實施例中,固定化的TfR可存在於細胞的表面上或出現在從表面上表現TfR之細胞所製備而成的薄膜上。此種競爭檢驗法常用的標示物可為放射性標示物或酵素標示物。
在某些實施例中,本發明之抗體為抗體6-90或從抗體6-90衍生而來的抗體。抗體6-90的重鏈和輕鏈的可變序列分別載於序列編號:1和序列編號:3中。在某些實施例中,
本發明抗體會和含有來自抗體6-90(或由抗體6-90衍生而來的抗體)輕鏈及/或重鏈之一、二或三個HVR(或CDR)的抗體互相競爭或專一性地競爭與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器結合的機會。本發明進一步提供含有抗體6-90之片段或區域的抗體或聚胜肽。在一實施例中,該片段為抗體6-90的輕鏈。在另一實施例中,該片段為抗體6-90的重鏈。在又另一實施例中,該片段含有來自抗體6-90(或由抗體6-90衍生而來的抗體)之輕鏈及/或重鏈的一或多個可變區。在又另一實施例中,該片段含有來自抗體6-90(或由抗體6-90衍生而來的抗體)之輕鏈及/或重鏈的一、二或三個HVR或CDR。在某些實施例中,從抗體6-90衍生而來的一或多個HVR或CDR係與抗體6-90的至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個HVR或CDR之間具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,其中該重鏈可變區包括來自序列編號:1(或序列編號:1)的三個HVR或CDR,及該輕鏈可變區包括來自序列編號:3(或序列編號:3)的三個HVR或CDR。
在一些實施例中,該抗體包含:(i)重鏈可變區,且該重鏈可變區所包含的序列與序列編號:1之第20~138個胺基酸具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少
約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度;及/或(ii)輕鏈可變區,且該輕鏈可變區所包含的序列與序列編號:3之第20~132個胺基酸具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包含序列編號:1之第20~138個胺基酸,及該輕鏈可變區包含序列編號:3之第20~132個胺基酸。
在某些實施例中,本發明之抗體為抗體55-31或從抗體55-31衍生而來的抗體。抗體55-31之重鏈和輕鏈的可變序列分別載於序列編號:5和序列編號:7中。在某些實施例中,本發明抗體會和含有來自抗體55-31(或從抗體55-31衍生而來的抗體)輕鏈及/或重鏈之一、二或三個HVR(或CDR)的抗體互相競爭或專一性地競爭與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器結合的機會。本發明進一步提供含有抗體55-31之片段或區域的抗體或聚胜肽。在一實施例中,該片段為抗體55-31的輕鏈。在另一實施例中,該片段為抗體55-31的重鏈。在又另一實施例中,該片段含有來自抗體55-31(或由抗體55-31衍生而來的抗體)之輕鏈及/或重鏈的一或多個可變區。在又另一實施例中,該片段含有來自抗體55-31(或由抗體55-31衍生而來的抗體)之輕鏈及/或重鏈的一、二或三個HVR或CDR。在某些實施例中,從抗體55-31衍生而來的一或多
個HVR或CDR係與抗體55-31的至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個HVR或CDR之間具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,其中該重鏈可變區包括來自序列編號:5(或序列編號:5)的三個HVR或CDR,及該輕鏈可變區包括來自序列編號:7(或序列編號:7)的三個HVR或CDR。
在某些實施例中,該抗體包含:(i)重鏈可變區,且該重鏈可變區所包含的序列與序列編號:5之第20~138個胺基酸具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度;及/或(ii)輕鏈可變區,且該輕鏈可變區所包含的序列與序列編號:7之第21~128個胺基酸具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包含序列編號:5之第20~138個胺基酸,及該輕鏈可變區包含序列編號:7之第21~128個胺基酸。
在某些實施例中,本發明之抗體為抗體122-72或從抗體122-72衍生而來的抗體。抗體122-72之重鏈和輕鏈的可變序列分別載於序列編號:9和序列編號:11中。在某些實施例中,本發明抗體會和含有來自抗體122-72(或從抗體122-72衍生而來的抗體)輕鏈及/或重鏈之一、二或三個HVR(或CDR)的抗體互相競爭或專一性地競爭與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器結合的機會。本發明進一步提供含有抗體122-72之片段或區域的抗體或聚胜肽。在一實施例中,該片段為抗體122-72的輕鏈。在另一實施例中,該片段為抗體122-72的重鏈。在又另一實施例中,該片段含有來自抗體122-72(或由抗體122-72衍生而來的抗體)之輕鏈及/或重鏈的一或多個可變區。在又另一實施例中,該片段含有來自抗體122-72(或由抗體122-72衍生而來的抗體)之輕鏈及/或重鏈的一、二或三個HVR或CDR。在某些實施例中,從抗體122-72衍生而來的該一或多個HVR或CDR係與抗體122-72的至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個HVR或CDR之間具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,其中該重鏈可變區包括來自序列編號:9(或序列編號:9)的三個HVR或CDR,及該輕鏈可變區包括來自序列編號:11(或序列編號:11)的三個HVR或CDR。
在某些實施例中,該抗體包含:(i)重鏈可變區,且該重鏈可變區所包含的序列與序列編號:9之第20~136個胺基酸具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度;及/或(ii)輕鏈可變區,且該輕鏈可變區所包含的序列與序列編號:11之第21~134個胺基酸具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包含序列編號:9之第20~136個胺基酸,及該輕鏈可變區包含序列編號:11之第21~134個胺基酸。
在某些實施例中,本發明之抗體為抗體5D7-54.17或從抗體5D7-54.17衍生而來的抗體。抗體5D7-54.17之重鏈和輕鏈的可變序列分別載於序列編號:13和序列編號:15中。在某些實施例中,本發明抗體會和含有來自抗體5D7-54.17(或從抗體5D7-54.17衍生而來的抗體)輕鏈及/或重鏈之一、二或三個HVR(或CDR)的抗體互相競爭或專一性地競爭與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器結合的機會。本發明進一步提供含有抗體5D7-54.17之片段或區域的抗體或聚胜肽。在一實施例中,該片段為抗體5D7-54.17的輕鏈。在另一實施例中,該片段為抗體5D7-54.17的重鏈。在又另一實施例中,該
片段含有來自抗體5D7-54.17(或由抗體5D7-54.17衍生而來的抗體)之輕鏈及/或重鏈的一或多個可變區。在又另一實施例中,該片段含有來自抗體5D7-54.17(或由抗體5D7-54.17衍生而來的抗體)之輕鏈及/或重鏈的一、二或三個HVR或CDR。在某些實施例中,從抗體5D7-54.17衍生而來的該一或多個HVR或CDR係與抗體5D7-54.17的至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個HVR或CDR之間具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,其中該重鏈可變區包括來自序列編號:13(或序列編號:13)的三個HVR或CDR,及該輕鏈可變區包括來自序列編號:15(或序列編號:15)的三個HVR或CDR。
在某些實施例中,該抗體包含:(i)重鏈可變區,且該重鏈可變區所包含的序列與序列編號:13之第20~138個胺基酸具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度;及/或(ii)輕鏈可變區,且該輕鏈可變區所包含的序列與序列編號:15之第23~130個胺基酸具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少
約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包含序列編號:13之第20~138個胺基酸,及該輕鏈可變區包含序列編號:15之第23~130個胺基酸。
在某些實施例中,本發明之抗體係從抗體5D7-54.17(抗體c5D7)或由抗體c5D7衍生出之抗體所衍生而來的嵌合抗體。抗體c5D7之重鏈和輕鏈的可變序列分別載於序列編號:17和序列編號:18中。在某些實施例中,本發明抗體會和含有來自抗體c5D7(或從抗體c5D7衍生而來的抗體)輕鏈及/或重鏈之一、二或三個HVR(或CDR)的抗體互相競爭或專一性地競爭與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器結合的機會。本發明進一步提供含有抗體c5D7(或由抗體c5D7衍生出的抗體)之片段或區域的抗體或聚胜肽。在一實施例中,該片段為抗體c5D7(或由抗體c5D7衍生出之抗體)的輕鏈。在另一實施例中,該片段為抗體c5D7(或由抗體c5D7衍生出之抗體)的重鏈。在又另一實施例中,該片段含有來自抗體c5D7(或由抗體c5D7衍生而來的抗體)之輕鏈及/或重鏈的一或多個可變區。在又另一實施例中,該片段包含來自抗體c5D7(或由抗體c5D7衍生而來的抗體)之輕鏈及/或重鏈的一、二或三個HVR或CDR。在某些實施例中,從抗體c5D7衍生而來的該一或多個HVR或CDR與抗體c5D7的至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個HVR或CDR之間具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、
至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,其中該重鏈可變區包括來自序列編號:17(或序列編號:17)的一、二或三個HVR或CDR,及該輕鏈可變區包括來自序列編號:18(或序列編號:18)的一、二或三個HVR或CDR。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,其中該重鏈可變區包括來自序列編號:17(或序列編號:17)的該三個HVR或CDR,及該輕鏈可變區包括來自序列編號:18(或序列編號:18)的該三個HVR或CDR。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包含序列編號:17之第1~119個胺基酸,及該輕鏈可變區包含序列編號:18之第1~108個胺基酸。在某些實施例中,該抗體為嵌合抗體。在某些實施例中,該抗體為人源化抗體。
在某些實施例中,該抗體包含:(i)重鏈可變區,且該重鏈可變區所包含的序列與序列編號:17之第1~119個胺基酸具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度;及/或(ii)輕鏈可變區,且該輕鏈可變區所包含的序列與序列編號:18之第1~108個胺基酸具有至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少
約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的相似度。在某些實施例中,該抗體包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區,且該重鏈可變區包含序列編號:17之第1~119個胺基酸,及該輕鏈可變區包含序列編號:18之第1~108個胺基酸。
當用於本文中時,與一胜肽、聚胜肽或抗體序列的「胺基酸序列相似百分率(%)」和「同源性(homology)」意指在進行序列排比(aligning),且如有必要可插入間隔(gap)以達到最大的序列相似百分率之後,候選序列中的胺基酸殘基與特定胜肽序列或聚胜肽序列的胺基酸殘基之間的相似百分率,並且任何保守性取代(conservative substitution)皆不視為該序列相似度的一部分。可藉由所屬技術領域中的各種方式進行排比(alignment)以達到判斷胺基酸序列相似度百分率之目的,例如可使用諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)軟體等可開放使用的電腦軟體進行排比。所屬技術領域中熟悉該項技藝者可判斷進行排比的適當參數,包括判斷可與欲比較之序列全長達到最大排比所需的任何運算法則。
在某些實施例中,本文中所述之CDR為Kabat CDR、Chothia CDR或接觸CDR。第2圖至第5圖及表6示出本發明所提供之抗體中之一些抗體的Kabat CDR。在其他實施例中,該CDR為Chothia CDR。在其他實施例中,該CDR為Kabat CDR與Chothia CDR之組合(亦稱為「組合式CDR」或「延伸式CDR」)。換言之,對於任何包含超過一個CDR
的實施例而言,該等CDR可為Kabat CDR或Chothia CDR其中任一者及/或兩者的組合。
在某些實施例中,本文中提供的抗體或聚胜肽係已分離的抗體或聚胜肽。在某些實施例,本文中提供的抗體為單株抗體。在某些實施例中,該抗體為人源化抗體。在某些實施例中,該抗體為嵌合抗體。在某些實施例中,該抗體為人類抗體。在某些實施例中,該抗體為IgG,例如IgG1、IgG2或IgG4。在某些實施例中,該抗體為人類IgG,例如人類IgG1。
本發明亦提供篩選抗體的方法,以用於篩選可辨識輸鐵蛋白受器上之癌症特異性修飾物的抗體。該方法包括測試或篩選能與輸鐵蛋白受器上之癌症特異性修飾物結合的抗體,例如測試或篩選出可與癌細胞(或癌細胞片段)結合或與從癌細胞分離或純化出之輸鐵蛋白受器結合的抗體。在某些實施例中,該方法包括測量抗體與輸鐵蛋白受器上之癌症特異性修飾物的結合作用,例如測量抗體與癌細胞(或癌細胞片段)或與從癌細胞分離或純化出之輸鐵蛋白受器的結合作用。該方法亦包括測試或篩選出對於在輸鐵蛋白受器上無癌症特異性修飾物的細胞(例如正常細胞,例如T細胞或活化T細胞、非癌症細胞、造血性癌細胞)或上述細胞之片段或從此等細胞分離或純化出之輸鐵蛋白受器不具有專一性結合作用或具有最小結合作用的抗體。可與輸鐵蛋白受器上之癌症特異性修飾物專一性結合的抗體可能顯示對於癌細胞(或癌細胞片段)或從癌細胞分離或純化出之輸鐵蛋白受器具有專一性結合作用,且顯示對於在輸鐵蛋白受器上無癌症特異性修飾物的細
胞(例如正常細胞,例如T細胞或活化T細胞、非癌症細胞、造血性癌細胞)或上述細胞之片段或從此等細胞分離或純化出之輸鐵蛋白受器不具有專一性結合作用或具有最小結合作用。該等癌細胞可為本文所述癌細胞中之任一者。在某些實施例中,該抗體可與癌細胞(其為非造血性癌細胞)上的輸鐵蛋白受器專一性結合。在某些實施例中,該抗體顯示對於下述任一細胞上的輸鐵蛋白受器不具有專一性結合作用或具有最小結合作用,該等細胞為:CHO細胞、紅血球、血小板、HUVEC細胞、單核球、多形核白血球(PMN)、淋巴球、Jurkat細胞、T細胞(例如,活化T細胞)、B細胞、白血病細胞、白血病T細胞或白血病B細胞。
在某些實施例中,提供一種篩選能與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器專一性結合之抗體的方法,該方法包括以下步驟:a)提供多種抗體,並選出能與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器專一性結合的一或多種抗體,及b)使用從步驟a)選出的該一或多個抗體以進一步選出不會與活化T細胞或Jurkat細胞所表現之輸鐵蛋白受器專一性結合的抗體。在某些實施例中,該抗體與非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器上的碳水化合物專一性結合。在某些實施例中,該方法進一步包括以下步驟:選出在無需連接細胞毒素和無免疫效應子功能的情況下,在抗體與該等癌細胞之細胞表面上的該輸鐵蛋白受器結合之後能夠誘發癌細胞之細胞凋亡的抗體。在某些實施例中,該非造血性癌細胞為胰臟癌細胞、胃癌細胞、大腸直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、子宮
內膜癌細胞、攝護腺癌細胞、乳癌細胞或肝癌細胞。
製造從該等抗體衍生出之抗體及聚胜肽的方法已是相關領域中的已知技術且揭示於本文中。可利用已完善建立的方法製備本發明之單株抗體。例如,可利用融合瘤技術製備本發明之單株抗體,該融合留技術係例如Kohler和Milstein於1975年發表在Nature第256期495頁中的該些技術。在融合瘤方法中,通常使用致免疫劑(immunizing agent,例如表現TfR或其胞外結構域和片段的癌細胞,或癌細胞所表現的TfR或其胞外結構域和片段)使小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物產生免疫反應,藉以誘使淋巴球製造或能夠製造出可與致免疫劑專一性結合的抗體。或者,可於體外使淋巴球產生免疫反應。隨後使用適合的融合劑(例如,聚乙二醇)使該等淋巴球與永生細胞株融合以形成融合瘤細胞(參閱Goding於1986年由美國學術出版社(Academic Press)出版之書籍《單株抗體:原理和實務(Monocolal Antibodies:Principles and Practice)》第59~1031頁)。永生細胞株通常由哺乳動物細胞轉形而成,特別指來自囓齒動物、兔、牛和人類來源的骨髓瘤細胞(myeloma cell)。通常使用大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞株。可在適當的培養基內培養該融合瘤細胞,該培養基較佳含有可抑制該未融合永生細胞之生長或存活的一或多種物質。例如,若親代細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT或HPRT)之酵素時,用於該融合瘤的培養基可含有次黃嘌呤(hypoxanthine)、胺基喋呤(aminopterin)和胸腺嘧啶(稱為HAT培養基),該等物
質可阻止缺乏HGPRT的細胞生長。可於本發明所提供之抗體中導入一段訊息胜肽序列,以利於生產抗體或聚胜肽之製程。訊息胜肽序列可為所屬技術領域中任何已知的訊息胜肽序列,或是本發明實施例中所描述的訊息胜肽序列。
較佳的永生細胞株為可有效率地融合、可藉由所選的抗體生產細胞穩定提供高抗體表現量且對培養基(例如HAT培養基)敏感的細胞株。永生細胞株更佳為鼠類的骨髓瘤細胞株,其從例如加州聖地亞哥的薩克學院(Salk)細胞分佈中心以及維吉尼亞州馬納薩斯市(Manassas)的美國標準生物收集中心取得。亦已有文獻說明使用人類骨髓瘤細胞株和小白鼠-人類雜合骨髓瘤細胞株生產人類單株抗體(參閱Kozbor於1984年發表在J.Immunol.第133期3001頁之論文;Brodeur等人於1987年由紐約Marcel Dekker公司出版之書籍《單株抗體製造技術及應用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)》第51~63頁)。
隨後,檢測培養融合瘤細胞之培養基中是否存在單株抗體。可篩選該抗體以選出可與非造血性癌症或腫瘤細胞所表現之輸鐵蛋白受器上的抗原決定位專一性結合,但不與白血球(例如,活化T細胞)、Jurkat細胞及/或其他可表現輸鐵蛋白受器之造血來源細胞所表現之輸鐵蛋白受器專一性結合的抗體。含有抗原決定位的癌細胞或胞外結構域(包括其片段)亦可用於此篩選法。
Jurkat細胞株是一種淋巴胚母白血病細胞,其係由Schneider等人利用一名14歲男孩的周邊血液所建立而成(參
閱Schneider等人於1977年發表於Int.J.Cancer第19期621~626頁之論文)。可從市面購得各種Jrukat細胞株,例如可取自美國典型培養物保存中心(如,ATCC TIB-152、ATCC TIB-153、ATCC CRL-2678)。
較佳可藉由免疫沉澱法或體外結合試驗(例如,放射性免疫檢測法(RIA)或酵素連結免疫吸附分析法(ELISA))測定融合瘤細胞所製造之單株抗體的結合專一性。此類技術和分析法已為所屬技術領域中之已知方法。可使用例如Munson和Pollard於1980年在期刊Anal.Biochem.第107期220頁所發表之斯卡查德(Scatchard)分析法測定單株抗體的結合親和力。
可使用所屬技術領域中已知及本文中所述的方法進一步檢測該等抗體誘發細胞死亡(例如,細胞凋亡)及/或抑制細胞生長或增殖的能力。
待鑑定所欲的融合瘤細胞之後,利用有限稀釋法及標準生長法對該等選殖株進行次選殖(subcloning),方法可參閱上述Goding所著之文獻。可於此目的之適當培養基包括例如杜氏改良之鷹氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)或RPMI-1640培養基。或者,該融合瘤細胞可在哺乳動物活體內的腹水中生長。
可藉由培養宿主細胞或融合瘤細胞以生產該等抗體或單株抗體,並可進一步分離和純化該宿主細胞或融合瘤細胞所分泌的抗體。可利用習知的免疫球蛋白純化程序從該培養基或腹水分離或純化抗體,該純化程序係例如蛋白質A瓊脂糖凝膠法(Protein A sepharose)、羥基磷灰石層析法
(hydroxylapatite chromatography)、凝膠電泳法、透析法或親和性層析法。
亦可利用DNA重組法製造本發明之抗體,例如可使用美國專利案第4,816,567號和第6,331,415號中所述之方法,該等文獻以引用方式併入本文。例如,利用習知程序(例如,使用能與編碼著鼠抗體之重鏈和輕鏈基因專一性結合的寡聚核苷酸探針)可輕易地分離和定序編碼著本發明單株抗體的DNA。本發明之融合瘤細胞可作為此類DNA的較佳來源。分離之後,該DNA可被置入表現載體中,隨後將該等表現載體轉染至宿主細胞內,例如猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞,藉以在該重組宿主細胞內合成單株抗體。亦可藉由例如該鼠同源序列中的重鏈和輕鏈恆定區置換成人類重鏈和輕鏈恒定區的編碼序列(美國專利案第4,816,567號),或藉著使非免疫球蛋白聚胜肽的所有或部份編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接,而修飾該DNA。此類非免疫球蛋白聚胜肽可取代本發明抗體的恒定區,或可取代本發明抗體之一抗原結合位置的可變區,藉以創造雙價性的嵌合抗體。
在一些實施例中,由兩種表現載體表現本發明之抗體。第一表現載體編碼該抗體的重鏈,該重鏈包含編碼該抗體重鏈之可變區的第一部分及編碼該抗體重鏈之恒定區的第二部分。在一些實施例中,該第一部分所編碼的可變區包含文中所述之胺基酸序列,例如序列編號:1之第20~138個胺基酸、序列編號:5之第20~138個胺基酸、序列編號:9之
第20~136個胺基酸、序列編號:13之第20~138個胺基酸或序列編號:17之第1~119個胺基酸。第二表現載體編碼該抗體的輕鏈,該輕鏈包含編碼該抗體輕鏈之可變區的第一部分及編碼該抗體輕鏈之恒定區的第二部分。在某些實施例中,該第一部分所編碼之可變區包含文中所述之胺基酸序列,例如序列編號:3之第20~132個胺基酸、序列編號:7之第21~128個胺基酸、序列編號:11之第21~134個胺基酸、序列編號:15之第23~130個胺基酸或序列編號:18之第1~108個胺基酸。
或者,由單一表現載體表現本發明之抗體。該單一表現載體編碼本發明抗體的重鏈和輕鏈兩者。在某些實施例中,該表現載體包含一編碼該重鏈之可變區及編碼該輕鏈之可變區的聚核苷酸序列,其中該重鏈之可變區包含文中所述之胺基酸序列,例如序列編號:1之第20~138個胺基酸、序列編號:5之第20~138個胺基酸、序列編號:9之第20~136個胺基酸、序列編號:13之第20~138個胺基酸或序列編號:17之第1~119個胺基酸,且該輕鏈之可變區包含文中所述之胺基酸序列,例如序列編號:3之第20~132個胺基酸、序列編號:7之第21~128個胺基酸、序列編號:11之第21~134個胺基酸、序列編號:15之第23~130個胺基酸或序列編號:18之第1~108個胺基酸。
通常該表現載體具有由可與宿主細胞相容之種系衍生而來的轉錄調節序列和轉譯調節序列。此外,該載體通常攜帶能夠在轉形細胞中提供表現型(phenotype)選擇的特定性
基因。
已知有各式各樣適用於真核細胞的重組宿主-載體表現系統,且該等表現系統可用於本發明中。例如,啤酒釀造酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或普通的烘焙酵母菌是最常用的真核微生物,但亦有許多其他的菌株可供使用,例如嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)。從多細胞生物衍生而來的細胞株(例如,Sp2/0或中國倉鼠卵巢(CHO),取自ATCC)亦可作為宿主。適合用於進行真核細胞轉形(transformation)的典型載體質體為例如pSV2neo和pSV2gpt(ATCC)、pSVL和pSVK3(Pharmacia)以及pBPV-1/pML2d(國際生物科技公司,International Biotechnology,Inc.)。
可用於本發明中的真核宿主細胞較佳為融合瘤、骨髓瘤、漿細胞瘤或淋巴瘤細胞。然而,假若哺乳動物宿主細胞能夠達成下列事項,可適當地採用其他真核宿主細胞:能辨識用於表現蛋白質的轉錄和轉譯DNA序列;能藉著切斷前導序列對該前導胜肽(leader peptide)進行加工處理並分泌蛋白質;以及能提供蛋白質的轉譯後修飾,例如醣化作用。
因此,本發明提供的數種真核宿主細胞,且可利用含有文中揭示之DNA構築體的重組表現載體使該等真核宿主細胞轉形,且該等真核宿主細胞能表現本發明的抗體或聚胜肽。在一些實施例中,本發明之轉形宿主細胞因而包含至少一個DNA構築體,該DNA構築體包含本文中所述之輕鏈和重鏈DNA序列以及轉錄和轉譯調控序列,且相對於編碼著該等輕鏈和重鏈的DNA序列配置該等轉錄和轉譯調控序列的位
置,藉以引導抗體或聚胜肽的表現作用。
可使用所屬技術領域中熟知的標準轉染程序使該等用於本發明之宿主細胞轉形。在諸多標準轉染程序中,可用的方法為電穿孔技術、原生質融合技術和磷酸鈣沉澱法。以下文獻概括說明此類技術:F.Toneguzzo等人於1986發表於Mol.Cell.Biol.第6期703~706頁之論文;G.Chu等人於1987年發表於Nucleic Acid Res.第15期1311~1325頁之論文;D.Rice等人於1979年發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA第79期7862~7865頁之論文;及V.Oi等人於1983年發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA第80期825~829頁之論文。
在兩個表現載體的實例中,該兩個表現載體可一個接一個地個別遞送至宿主細胞內,或一同遞送(共同傳遞或共轉染)至宿主細胞內。
本發明亦提供一種用於製造該等抗體或聚胜肽的方法,該方法包括:利用所屬技術領域中熟悉該項技藝者熟知的方式培養含有編碼該抗體或聚胜肽之表現載體的宿主細胞,並從培養基中收集該抗體或聚胜肽。
此外,可在基因轉殖動物體內生產所欲的抗體。可根據標準方法獲得適合的基因轉殖動物,該方法包括將適當的表現載體以微注射方式注入卵子中,將該等卵子移入假性懷孕的雌性動物體內,並然後選出表現該所欲抗體的後代。
本發明亦提供嵌合抗體,該等嵌合抗體可專一地辨識非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器上的抗原決定位。例如,該等嵌合抗體的可變區和恒定區來自不同品種。在一
些實施例中,重鏈和輕鏈兩者的可變區是來自文中所述的鼠類抗體。在一些實施例中,該等可變區包含序列編號:1之第20~138個胺基酸及/或和序列編號:3之第20~132個胺基酸。在一些實施例中,該等可變區包含序列編號:5之第20~138個胺基酸及/或和序列編號:7之第21~128個胺基酸。在一些實施例中,該等可變區包含序列編號:9之第20~136個胺基酸及/或和序列編號:11之第21~134個胺基酸。在一些實施例中,該等可變區包含序列編號:13之第20~138個胺基酸及/或和序列編號:15之第23~130個胺基酸。在一些實施例中,該等可變區包含序列編號:17之第1~119個胺基酸及/或和序列編號:18之第1~108個胺基酸。在一些實施例中,重鏈和輕鏈兩者的恆定區是來自人類抗體。在一些實施例中,該等恆定區為來自人類IgG或人類IgG1的恆定區,例如表6中所述之恆定區。在一些實施例中,該嵌合抗體包含來自序列編號:17的重鏈恆定區及/或來自序列編號:18的輕鏈恆定區。在一些實施例中,該嵌合抗體包含含有序列編號:17的重鏈序列及含有序列編號:18的輕鏈序列。
可使用所屬技術領域中完整建立的技術製備本發明之嵌合抗體,該等技術請參閱例如美國專利案第6,808,901號、美國專利案第6,652,852號、美國專利案第6,329,508號、美國專利案第6,120,767號和美國專利案第5,677,427號,且該等文獻係以引用方式個別併入本文。通常,可透過下述方式製備該嵌合抗體:取得編碼該等抗體之重鏈和輕鏈可變區的cDNA,將該等cDNA插入表現載體中,接將該表現載體送
入真核宿主細胞內而表現本發明之嵌合抗體。較佳地,該表現載體攜帶功能完整的重鏈或輕鏈恆定序列,以便於將任何重鏈或輕鏈的可變序列輕易地插入該表現載體中。
本發明提供一種人源化抗體,該人源化抗體可專一地辨識非造血性癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器上的抗原決定位。該人源化抗體通常是人類抗體,且在該人類抗體中,該人類抗體之HVR或CDR的殘基被具有期望專一性、親和力和結合量之非人物種(如小鼠、大鼠或兔)的HVR或CDR殘基所取代。在一些實例中,該人類抗體的Fv架構殘基被對應的非人類殘基所取代。
使單株抗體人源化有四個概要步驟。該等步驟為:(1)測定起始抗體之輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸序列及預測的胺基酸序列;(2)設計該人源化抗體,即,在該人源化過程中決定使用哪一個抗體架構區;(3)實際進行人源化的方法/技術;以及(4)轉染和表現該人源化抗體。參閱例如美國專利案第4,816,567號、第5,807,715號、第5,866,692號、第6,331,415號、第5,530,101號、第5,693,761號、第5,693,762號、第5,585,089號、第6,180,370號和第6,548,640號。例如,若該抗體欲用於人體臨床試驗和治療中,可對該恒定區進行改造,使其更類似於人類恒定區以避免發生免疫反應。參閱例如美國專利案第5,997,867號和第5,866,692號。
重要的是,被人源化的抗體保留了對抗原的高親和力和其他有利的生物性質。為達此目的,可藉由分析親代序列並利用親代序列和人源化序列之三維模型做出各種概念性
人源化產物的程序而製備出人源化抗體。免疫球蛋白的三維模型可普遍取得且已為所屬技術領域中之熟悉該項技藝者所熟悉。有數種電腦程式可供取用,該等電腦程式可圖解說明並顯示所選擇之候選免疫球蛋白序列可能的三維構形結構。檢視這些顯示內容,得以分析該殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用,即,分析出會對該候選免疫球蛋白與其抗原之結合能力造成影響的殘基。以此方法,可從該等共同序列和輸入序列選擇FR殘基並加以組合,從而達成所欲的抗體特性,例如提高對標靶抗原的親和力。一般而言,該等HVR或CDR殘基會直接且極大幅度地影響抗原結合作用。該人源化抗體亦可能在絞鏈區(hinge region)內具有修飾,藉以改善該抗體的一或多種特性。
在另一種替代方案中,藉由噬菌體顯現技術(phage display)篩選及重組製備抗體。例如參閱美國專利案第5,565,332號、第5,580,717號、第5,733,743號和第6,265,150號;以及Winter等人於1994年發表在期刊Annu.Rev.Immunol.第12期433~455頁之論文。或者,可利用噬菌體顯現技術(McCafferty等人於1990年發表在Nature第348期552~553頁)從來自未經免疫供體之免疫球蛋白可變(V)結構域基因庫在體外製造人類抗體及抗體片段。根據此技術,抗體V結構域基因以符合讀框(in-frame)的方式選殖至絲狀噬菌體之主要或次要外鞘蛋白基因(如M13或fd)內,並作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。由於絲狀顆粒含有噬體基因組的單股DNA複製本,因此根據該抗體的功能性質
進行篩選也就是選出編碼著呈現這些性質之抗體的基因。因此,該噬菌體模擬B細胞的某些性質。可利用各種方法進行噬菌體展示技術,有關該等方法之回顧請參閱例如Johnson Kevin S.和Chiswell David J.於1993年所出版之書籍《Current Opinion in Structural Biology 3》第564~571頁。有數種V-基因片段的來源可用於噬菌體展示技術。Clackson等人(參閱1991年之Nature期刊第352期624~628頁)從經過免疫之小白鼠脾臟衍生出之V基因的小型隨機組合庫分離出一系列多樣的抗噁唑酮(anti-oxazolone)抗體。可從未經免疫的人類供體建立出V基因庫,且可基本上根據Mark等人於1991年發表在J.Mol.Biol.第222期581~597頁之論文或Griffith等人於1993年發表在EMBO J.第12期725~734頁之論文中所述的技術分離出針對一系列多種抗原(包括自體抗原)的抗體。在自然免疫反應中,抗體基因以高速累積突變(體細胞高突變作用)。所引入的某些改變將賦予更高的親和力,而展示出高親和力表面免疫球蛋白的B細胞在隨後的抗原刺激(antigen challenge)過程中將優先複製和分化。可藉由被稱為「鏈改組(chain shuffling)」的技術模擬此自然過程(參閱Marks等人於1992年發表在Biol./Technol.第10期779~783頁之論文)。在此方法中,使用得自未免疫供體之V結構域基因的天然變異株(基因庫)依序取代該重鏈和輕鏈V區基因,可改善利用噬菌體顯現法所獲得之「初代」人類抗體的親和力。此技術允許製造出具有pM~nM範圍內之親和力的抗體和抗體片段。製造極大噬菌體抗體基因庫(亦稱為「基因庫之母」)的策略已述
於Waterhouse等人於1993年發表在Nucl.Acids Res.第21期2265~2266頁之論文中。基因改組法亦可用於從囓齒類抗體衍生出人類抗體,該人類抗體具有與起始囓齒類抗體相似的親和力和專一性。根據此方法(此法亦稱為「抗原決定位印跡法(epitope imprinting)」),使用人類V結構域基因的基因庫取代利用噬菌體顯示技術所獲得之囓齒類抗體的重鏈或輕鏈V結構域基因,可創造出囓齒類-人類嵌合體。對抗原的選擇,會導致把能夠復原一功能性抗原結合位置的人類可變區獨立出來,即,該抗原決定位能決定(銘記,imprint)對於配偶體的選擇。當為了更換其餘的囓齒類V結構域而重複此過程時,可獲得人類抗體(請見1993年4月1日公開之PCT公開號WO 93/06213)。與利用CDR嫁接法對囓齒類抗體進行人源化的傳統人源化法不同,此技術提供完整的人類抗體,該抗體不具有囓齒類來源的架構或HVR或CDR殘基。顯然儘管上述討論內容關於人源化抗體,然而以上所討論的一般原則可應用於訂製例如用於犬、貓、靈長類、馬和牛類上的抗體。
在某些實施例中,該抗體為全人類抗體。能與抗原專一性結合的非人類抗體可用於製造能與該抗原結合的全人類抗體。例如,技術人員可運用鏈交換技術(chain swapping technique),在該技術中,非人類抗體的重鏈會與表現不同人類輕鏈的基因表現庫共同表現出來。所產生的雜合抗體含有一條人類輕鏈和一條非人類重鏈,隨後對該等雜合抗體進行抗原結合的篩選。接著使該參與抗原結合的輕鏈與人類抗體重鏈的基因庫共同表現。所獲得的人類抗體再一次進行抗原
結合的篩選。諸如此類技術在美國專利案第5,565,332號中有進一步說明。此外,可利用抗原接種經基因轉殖人類免疫球蛋白基因的動物。參閱,例如美國專利5,661,016。
該抗體可為一種雙專一性抗體,即,對至少兩種不同抗原具有結合專一性的單株抗體,可利用本文中揭示的該等抗體製造該雙專一性抗體。製造雙專一性抗體的方法已為所屬技術領域中所知悉(參閱例如Suresh等人於1986年發表於Methods in Enzymology第121期210頁之論文)。傳統上,該雙專一性抗體的重組製造方式是基於使兩組免疫球蛋白重鏈-輕鏈配對共同表現,其中該兩條重鏈具有不同的專一性(參閱Millstein和Cuello於1983發表於Nature第305期537~539頁之論文)。
根據製造雙專一性抗體的一種方法,將具有所欲結合專一性(抗體-抗原結合位置)的抗體可變結構域與免疫球蛋白恒定結構域序列融合。該融合較佳是使用免疫球蛋白重鏈恒定結構域,且該免疫球蛋白重鏈恆定結構域包含至少部分的絞鏈區、CH2區和CH3區。較佳在至少一個融合物中存在該第一重鏈恒定區(CH1),該CH1區含有用於與輕鏈結合所需的位置。將編碼該免疫球蛋白重鏈融合物(如希望,將編碼免疫球蛋白輕鏈)的DNA插入各別的表現載體中,並且共同轉染至適合的宿主生物內。當在構築體內使用三種不等比例之聚胜肽鏈可獲得最佳產量的實施例中,此種做法在調整該三種聚胜肽片段彼此之間的比例上提供了極大的靈活度。然而,當至少兩種相等比例之聚胜肽鏈的表現可達到高產量或當該
比例不具特殊意義時,可將二或全部三種聚胜肽鏈的編碼序列插入同一個表現載體內。
在一方法中,該雙專一性抗體係由一條臂中具有第一結合專一性的雜合免疫球蛋白重鏈以及另一臂中的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈配對(提供第二結合專一性)所組成。此種僅在半邊的雙專一性分子中具有免疫球蛋白輕鏈的不對稱構造,有助於從諸多不想要的免疫球蛋白鏈組合物中分離出所需的雙專一性化合物。此方法述於1994年3月3日公開的PCT公開案WO 94/04690。
包含二個共價鍵連接抗體的異質接合抗體(heteroconjugate antibody)亦屬於本發明範圍。此類抗體已被用於使免疫系統細胞把不想要的細胞作為攻擊目標(見美國專利案第4,676,980號)以及用於治療HIV感染(見PCT公開案WO 91/00360和WO 92/200373;以及EP 03089)。可利用任何便利的交聯法製造異質接合抗體。適用的交聯劑和技術已為所屬技術領域所熟知且述於美國專利案第4,676,980號中。
亦可製造單鏈的Fv片段,例如Iliades等人於1997年發表於FEBS Letters第409期437~441頁之論文中所述者。在Kortt等人於1997年發表在Protein Engineering第10期423~433頁的論文中描述使用各種連接子(linkers)接合此類的單鏈片段。許多用於抗體之重組製造和操縱的技術已為所屬技術領域所熟知。
可預期,本發明不僅包括上述單株抗體,亦包括含有該等抗體之活性結合區的任何抗體片段,例如Fab、F(ab’)2、
scFv、Fv片段及諸如此類者。可使用所屬技術領域中已建立完善的技術由本文中所述的單株抗體製造出此類片段,參見Rousseaux等人於1986年發表在Methods Enzymol.第121期663~69頁之論文,美國學術出版社出版(Academic Press)。
製備抗體片段的方法已為所屬技術領域中所知悉。例如,利用胃蛋白酶(pepsin)對抗體進行酵素剪切可提供100 Kd的片段(稱為F(ab')2),而製造出抗體片段。利用硫醇還原劑可進一步切割此片段,且視需要可對切斷雙硫鍵所產生的氫硫基(sulfhydryl group)使用阻隔劑(blocking agent),而製造出大小為50 Kd的Fab’單價片段。或者,使用木瓜蛋白酶(papain)進行酵素切割可直接製造兩條單價Fab片段和一條Fc片段。這些方法已描述於例如美國專利案第4,036,945號和第4,331,647號及該等專利案中所載參考文獻,且該等專利案以引用方式併入本文。亦可參閱Nisonoff等人於1960年發表在Arch.Biochem.Biophys.第89期230頁之論文;Porter於1959年發表於Biochem.J.第73期119頁之論文;及Edelman等人所著《酵素學方法(Methods in Enzymology)》第1冊422頁(美國學術出版社於1967出版)。
或者,將編碼該抗體之Fab的DNA插入用於原核生物之表現載體或用於真核生物之表現載體中,並將該載體導入原核生物或真核生物內以表現該Fab片段,而製造出該Fab片段。
本發明涵蓋針對本文中所述抗體或聚胜肽所做的修飾,包括不會顯著影響抗體或聚胜肽性質的功能等效抗體以
及具有強化或降低活性及/或親和力的變異體。例如,可使本文中提供之抗體或聚胜肽的胺基酸序列突變,藉以獲得對癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器具有所欲結合親和力的抗體。聚胜肽的修飾是所屬技術領域中的常規技術,故無需在此多加贅述。經修飾之聚胜肽的實例包括具有下述修飾的胜肽:胺基酸殘基的保守取代、對功能活性不會造成明顯有害變化的一或多個胺基酸刪減或添加,或使用化學類似物。
胺基酸序列的插入包括:氨端及/或羧端的融合,且插入胺基酸序列的長度範圍從一個殘基至含有一百個或更多殘基的聚胜肽;以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入(intrasequence insertion)。末端插入的實例包括具有N-端甲硫胺醯基殘基的抗體或與抗原決定位標籤(epitope tag)融合的抗體。該抗體分子的其他插入變異體包括使該抗體的N-端或C-端與酵素或可增加抗體之血清半衰期的聚胜肽融合。
經過取代(substitution)的變異體在抗體分子中移除了至少一胺基酸殘基且在該被移除的位置處插入不同殘基。對於取代型突變(substitutional mutagenesis)具有最大影響的位置包括高變區(hypervariable region),但也可考慮位在架構區(FR)的改變。在下表中之「保守取代」標題下方列出多種保守取代。若欲使此等取代作用造成生物活性改變,則可引入如下表內命名為「示例性取代」之欄位中所記載或如以下依據胺基酸種類做進一步描述之更實質上的變化,並篩選產物。
抗體生物性質的實質修飾可藉由選擇取代基而達
成,且該等取代基在維持下述事項方面有明顯不同效果,該等維持的事項包括:(a)在取代區域內的該聚胜肽骨架結構,例如片狀(sheet)或螺旋狀(helical)構型;(b)該分子在目標位置處的電荷或疏水性;或(c)側鏈的體積(bulk)。根據一般側鏈性質可將天然殘基分類成:(1)非極性:正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)極性但不帶電:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性(帶負電):Asp、Glu;(4)鹼性(帶正電):Lys、Arg;(5)影響鏈方向性的殘基:Gly、Pro;及(6)芳族:Trp、Tyr、Phe、His。
非保守取代是將此等類型之某一類型中的一成員換成另一類型。
任何不涉及維持抗體適當構型的半胱胺酸殘基亦可進行取代,且通常用絲胺酸取代該半胱胺酸殘基,以增進該分子的氧化安定性(oxidative stability)及避免發生異常的交聯反應。反之,可在該抗體中加入半胱胺酸鍵,藉以增進該抗體的穩定性,尤其當該抗體為一抗體片段時,例如Fv片段,更應如此。
胺基酸的修飾範圍可從改變或修飾一或多個胺基酸到完全重新設計一塊區域,例如重新設計可變區。改變可變區可改變結合親和力及/或專一性。在一些實施例中,在一HVR或CDR結構域內進行不超過一個至五個保守胺基酸取代。在其他實施例中,在一HVR或CDR結構域內進行不超
過一個至三個保守胺基酸取代。
修飾作用還包括醣化和非醣化(nonglycosylated)的聚胜肽以及具有其他轉譯後修飾的聚胜肽,舉例而言,例如具有不同糖類的醣化作用、乙醯化作用和磷酸化作用。抗體是在其恒定區內的保守位置處進行醣化(參閱Jefferis和Lund於1997年發表在Chem.Immunol.第65期111~128頁之論文;Wright和Morrison於1997年發表在TibTECH第15期26~32頁之論文)。免疫球蛋白的寡醣側鏈會影響蛋白質的功能(參閱Boyd等人於1996發表在Mol.Immunol.第32期1311~1318頁之論文;Wittwe和Howard於1990年發表在Biochem.第29期4175~4180頁之論文)以及影響醣蛋白(glycoprotein)部位之間的分子內相互作用,這些部位可影響醣蛋白的構形和所呈現的三維表面(參閱如上述Hefferis和Lund所著之文獻;Wyss和Wagner於1996年發表在Current Opin.Biotech.第7期409~416頁之論文)。寡醣亦可根據專一性的辨識結構使指定的醣蛋白將某些分子視為目標。有報告指出抗體的醣化作用亦會影響抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。尤其是據報告指出,具有四環黴素調節性β(1,4)-N-乙醯葡萄糖胺轉移酶III(GnTIII)表現作用的CHO細胞具有改善的ADCC活性,GnTIII是一種能催化形成對半切開之GlcNAc的醣基轉移酶(參閱Umana等人於1999發表在Mature Biotech.第17期176~180頁之論文)。
抗體的醣化作用通常為N-連接型或O-連接型。N-連接型指碳水化合物基團連接至天門冬醯胺酸(asparagine)殘
基的側鏈。天門冬醯胺酸-X-絲胺酸、天門冬醯胺酸-X-蘇胺酸及天門冬醯胺酸-X-半胱胺酸的三胜肽序列(其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸)是可供碳水化合物基團經酵素作用而連接至該天門冬醯胺酸側鏈上的辨識序列。因此,在多、聚胜肽內出現此等三胜肽序列其中任一者時即產生潛在的醣化位置。O-連接型醣化作用係指將N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖其中之一連接至羥基胺基酸,且最常連接至絲胺酸或蘇胺酸上,但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
可藉由改變胺基酸序列以使該胺基酸序列含有一或多個上述三胜肽序列而輕易地在抗體上添加醣化位置(作為N-連接型醣化位置)。藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基加入原始抗體序列中或將原始抗體序列中的一或多個胺基酸殘基置換成絲胺酸或蘇胺酸殘基亦可做出上述改變(以作為O-連接型醣化位置)。
亦可在不改變基本核苷酸序列的情況下,改變該抗體的醣化模式(glycosylation pattern)。醣化作用大部分取決於用來表現該抗體的宿主細胞。由於用來表現重組醣蛋白(例如,可能作為治療劑之抗體)的細胞類型極少是原生細胞,因此可預期到該抗體的醣化模式有所變化(參閱例如Hse等人於1997發表在J.Biol.Chem.第272期9062~9070頁之論文)。
除了選擇宿主細胞之外,在抗體的重組製造過程中影響醣化作用的因素還包括生長模式、培養基配方、培養密度、氧合作用(oxygenation)、酸鹼值、純化方法及諸如此類者。已提出各種改變特定宿主生物內之醣化模式的方法,包括導
入或過量表現某些與寡醣生產相關的酵素(參閱美國專利案第5,047,335號、第5,510,261號和第5.278,299號)。例如使用內切糖苷酶H(endoglycosidase H,EndoH)、N-糖苷酶F、內切糖苷酶F1、內切糖苷酶F2、內切糖苷酶F3可藉由酵素催化(enzymatically)而移除醣蛋白上的醣化作用或某些類型的醣化作用。此外,可藉由基因工程使該重組宿主細胞無法處理某些類型的多醣。此等技術及類似技術已為所屬技術領域中之熟知技術。
其他修飾方法包括使用所屬技術領域中已知的耦合技術(coupling),包括但不限於酵素法、氧化取代法和螯合法。修飾法可用於例如在免疫檢測中用於連接標示物。使用所屬技術領域中已建立的程序製造經修飾的聚胜肽,並可使用所屬技術領域中已知的標準檢測法篩選該等經修飾的聚胜肽。
本發明之抗體或聚胜肽可與藥劑接合(例如,與藥劑連接),該藥劑係例如治療劑及標示物。因此,本發明提供一種接合物(conjugate),該揭合物包含本文中所述抗體或聚胜肽及一種藥劑(或治療劑,例如化療劑、細胞毒素、細胞毒性藥物、藥物基團、抗癌劑或標示物)。治療劑的實例為放射性基團、細胞毒素、細胞毒性藥物、抗癌劑或化療分子。可使用所屬領域中已知的方法製造抗體接合物,該等方法係例如美國專利第7,553,816號、美國專利第6,214,345號及Ducry L和Stump B於2010年發表在Bioconjugate Chem.第21期5~13頁之論文中所述之方法。在某些實施例中,該藥劑或治療劑係如2012年12月21日申請之美國專利臨時申請案第
61/745,448號中所述的藥物基團、細胞毒性藥物或細胞毒素。在某些實施例中,該接合物中的細胞毒性藥物為海兔毒素10(Dolastatin 10)或其衍生物,例如單甲基海兔毒素10(Monomethyl Dolastatin 10)。在某些實施例中,本發明之抗體或聚胜肽係透過連接子而與藥劑、治療劑(例如細胞毒性藥物或細胞毒素)及標示物接合。因此,本發明提供一種接合物,該接合物包含文中所述之抗體、藥劑(或治療劑、細胞毒素、細胞毒性藥物、藥物基團或標示物)及連接子。在某些實施例中,該藥劑或治療劑為如2012年12月21日申請之美國專利臨時申請案第61/745,448號中所述的連接子或如本發明之實施例6中所述的連接子。可使用如2012年12月21日申請之美國專利臨時申請案第61/745,448號中所述的方法製造抗體接合物,且該案內容以引用方式全文併入本文。
本發明之抗體(或聚胜肽)可與一標示物連接,例如可與螢光分子、放射性分子、酵素或所屬技術領域中已知的任何其他標示物連接。如文中所述,「標示物(label)」一詞指可被偵測的任何分子。在某些實施例中,可藉由併入經放射性標記之胺基酸而標記抗體。在某一實施例中,可將生物素(biotin)基團附接至抗體上,並可利用經標記的親和素(avidin)偵測該生物素基團(其中該經標記的親和素係例如含有螢光標示物或酵素活性的鏈黴親合素,且可藉由光學法或比色法偵測含有螢光標示物或酵素活性的鏈黴親合素)。在某些實施例中,可將標示物併入另一試劑或附接至另一試劑,且該另一試劑進而與所關注的抗體結合。例如,將標示物併入抗體中
或附接至抗體,且該抗體進而專一性地與所關注的抗體結合。在某些實施例中,該標示物或標記物亦可具備治療性。標示聚胜肽和醣蛋白的各種方法已為所屬技術領域所知悉且可供使用。某些通用類型的標示物包括,但不限於,酵素、螢光、化學發光和放射性標示物。可用於聚胜肽的標示物實例包括,但不限於下列者:放射性同位素或放射性核種(例如,3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I);螢光標示物(例如,異硫氰酸螢光素(fluorescein isothocyanate,FITC)、羅丹明(rhodamine)、鑭系磷光體(lanthanide phosphor)、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE));酵素性標示物(例如,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、β-半乳糖苷酶、螢光素酶(luciferase)、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)、醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase)、青黴素酶、螢光素酶);化學發光物;生物素基團;第二報導子(reporter)可辨識的預定聚胜肽抗原決定基(例如,白胺酸拉鍊狀成對序列(leucine zipper pair sequence)、供第二抗體用的結合位置、金屬結合結構區、抗原決定位標籤)。在某些實施例中,可利用各種長度的間隔臂(spacer arm)連接該等標示物,藉以減少潛在的立體阻礙。
本發明亦提供藥學組合物,該等藥學組合物包含文中所述抗體或聚胜肽及藥學上可接受之載劑或輔劑。藥學上可接受之輔劑為所屬技術領域中已知且有助於藥學上有效物質施用的相對惰性物質。例如,輔劑可助於塑造形狀或造成
稠度,或作為稀釋劑。適用的輔劑包括,但不限於,安定劑、濕潤劑和乳化劑;改變滲透壓的鹽類;囊化劑;緩衝劑和皮膚穿透促進劑。用於非腸胃道(parenteral)和經腸胃道(nonparenteral)藥物遞送的輔劑及配方載於Remingtion所著且由Mack出版社於2000年出版之《藥學的科學與實務(Science and Practice of Pharmacy)》第20版。
在一些實施例中,本發明提供用於文中所述任何方法的組成物(如本文所述者),不論該組成物在本文中是作為藥物使用及/或用於製造藥物。
本發明亦提供包含編碼本文中所述單株抗體和聚胜肽其中任一者之核苷酸序列的聚核苷酸。在一些實施例中,該等抗體或聚胜肽包含輕鏈可變區和重鏈可變區的序列。
在一些實施例中,該等聚核苷酸包含編碼重鏈可變區之核酸序列及/或編碼輕鏈可變區之核酸序列,其中該重鏈可變區包含序列編號:1之第20~138個胺基酸,且該輕鏈可變區包含序列編號:3之第20~132個胺基酸。在一些實施例中,該等聚核苷酸包含編碼重鏈可變區之核酸序列及/或編碼輕鏈可變區之核酸序列,其中該重鏈可變區包含序列編號:5之第20~138個胺基酸,且該輕鏈可變區包含序列編號:7之第21~128個胺基酸。在一些實施例中,該等聚核苷酸包含編碼重鏈可變區之核酸序列及/或編碼輕鏈可變區之核酸序列,其中該重鏈可變區包含序列編號:9之第20~136個胺基
酸,且該輕鏈可變區包含序列編號:11之第21~134個胺基酸。在一些實施例中,該等聚核苷酸包含編碼重鏈可變區之核酸序列及/或編碼輕鏈可變區之核酸序列,其中該重鏈可變區包含序列編號:13之第20~138個胺基酸,且該輕鏈可變區包含序列編號:15之第23~130個胺基酸。
在一些實施例中,該等聚核苷酸包含編碼重鏈可變區之核酸序列及/或編碼輕鏈可變區之核酸序列,其中該重鏈可變區包含源自序列編號:1(或序列編號:1)的一個、兩個或三個HVR(或CDR),及該輕鏈可變區包含源自序列編號:3(或序列編號:3)的一個、兩個或三個HVR(或CDR)。在一些實施例中,該等聚核苷酸包含編碼重鏈可變區之核酸序列及/或編碼輕鏈可變區之核酸序列,其中該重鏈可變區包含源自序列編號:5(或序列編號:5)的一個、兩個或三個HVR(或CDR),及該輕鏈可變區包含源自序列編號:7(或序列編號:7)的一個、兩個或三個HVR(或CDR)。在一些實施例中,該等聚核苷酸包含編碼重鏈可變區之核酸序列及/或編碼輕鏈可變區之核酸序列,其中該重鏈可變區包含源自序列編號:9(或序列編號:9)的一個、兩個或三個HVR(或CDR),及該輕鏈可變區包含源自序列編號:11(或序列編號:11)的一個、兩個或三個HVR(或CDR)。在一些實施例中,該等聚核苷酸包含編碼重鏈可變區之核酸序列及/或編碼輕鏈可變區之核酸序列,其中該重鏈可變區包含源自序列編號:13(或序列編號:13)的一個、兩個或三個HVR(或CDR),及該輕鏈可變區包含源自序列編號:15(或序列編號:15)的一個、兩個或三個HVR(或
CDR)。在一些實施例中,該等聚核苷酸包含編碼重鏈可變區之核酸序列及/或編碼輕鏈可變區之核酸序列,其中該重鏈可變區包含源自序列編號:17(或序列編號:17)的一個、兩個或三個HVR(或CDR),及該輕鏈可變區包含源自序列編號:18(或序列編號:18)的一個、兩個或三個HVR(或CDR)。
在一些實施例中,該等聚核苷酸包含含有序列編號:2之第58~414個核苷酸的核酸序列及/或含有序列編號:4之第58~396個核苷酸的核酸序列。在一些實施例中,該等聚核苷酸包含含有序列編號:6之第58~414個核苷酸的核酸序列及/或含有序列編號:8之第61~384個核苷酸的核酸序列。在一些實施例中,該等聚核苷酸包含含有序列編號:10之第58~408個核苷酸的核酸序列及/或含有序列編號:12之第61~402個核苷酸的核酸序列。在一些實施例中,該等聚核苷酸包含含有序列編號:14之第58~414個核苷酸的核酸序列及/或含有序列編號:16之第67~390個核苷酸的核酸序列。
所屬技術領域中熟習該項技藝者應瞭解,由於基因碼簡併(degeneracy)的結果,因此會有許多個核苷酸序列編碼文中所述的一條聚胜肽。這些聚核苷酸中的一些聚核苷酸與任何天然基因的核苷酸序列具有最低的同源性(homology)。因此,本發明特別考慮到因密碼子使用上的差異而有所不同的聚核苷酸。此外,包含文中所述聚核苷酸序列之基因的等位基因(allele)亦屬本發明範圍。等位基因是由於一或多個突變(例如核苷酸的刪除、添加及/或取代)而導致改變的內源性基
因。所產生的mRNA和蛋白質可能(但不必然)具有改變的結構或功能。可利用標準技術(例如,雜交法、擴增法及/或資料庫序列比對法)鑑定等位基因。
可使用化學合成法、重組法或聚合酶鏈鎖反應法(PCR)獲得本發明的聚核苷酸。聚核苷酸的化學合成法已為所屬技術領域所熟知,故無需在此詳述。所屬技術領域中熟習該項技藝者可使用本文中所提供的序列和商用DNA合成儀製造所欲的DNA序列。
如本文進一步所述般,使用重組法製造聚核苷酸時,可將包含所欲序列的聚核苷酸插入適當的載體內,隨後將該載體插入適當的宿主細胞中以進行複製和擴增。可利用所屬技術領域中已知的任何方式將聚核苷酸插入宿主細胞內。以直接攝取(uptake)、內吞作用(endocytosis)、轉染(transfection)、F-配對(F-mating)或電穿孔法導入外源性聚核苷酸而使細胞轉形。導入聚核苷酸之後,該外源性聚核苷酸可採非整合載體(例如,質體)形式或整合至宿主細胞基因組中而留在細胞內。利用所屬技術領域中已知的方法從宿主細胞分離出擴增的聚核苷酸,參閱例如Sambrook等人於1989所揭示之方法。
或者,可利用PCR複製DNA序列。PCR技術在所屬技術領域中為眾所周知的技術,並且在美國專利案第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號和第4,683,202號以及由Mullis等人編輯且由波士頓Birkauswer出版社於1994年出版《PCR:聚合酶鏈鎖反應(PCR:The Polymerase
Chain Reaction)》一書中描述PCR技術。
本發明亦提供包含編碼本文所述任何聚胜肽(包括抗體)之核酸序列的載體(例如,選殖載體、表現載體)。可根據標準技術構築適合的選殖載體,或可從所屬技術領域中可取得的大量選殖載體中選出適合的選殖載體。選殖載體的選擇雖然根據欲使用的宿主細胞而有所不同,但可用的選殖載體通常具有自我複製能力,可能擁有可供特定限制性核酸內切酶辨識的單一目標位置,及/或可攜帶標記基因以供篩選含有該載體的選殖株之用。適合的實例包括質體和細菌病毒,例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如,pBS SK+)和其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA以及轉運載體(shuttle vector),例如pSA3和pAT28。此等選殖載體和諸多其他選殖載體可購自例如BioRad、Strategene和Invitrogen等市場供應商。
表現載體通常為可複製的聚核苷酸構築體,聚核苷酸構築體包含根據本發明的聚核苷酸。該表現載體可在宿主細胞內以附加體(episomes)的形式或作為染色體DNA中的一組成部分進行複製。適合的表現載體包括,但不限於,質體、病毒載體(包括腺病毒、腺病毒相關病毒、反轉錄病毒)、黏接質體和PCT公開案WO 87/04462中所揭示的表現載體。載體通常包含(但不限於)下列一或多者:訊號序列;複製起始點;一或多個標記基因;適合的轉錄控制元件(例如,啟動子、增強子和終止子)。進行表現(即轉譯)時,通常亦需要一或多個轉譯控制元件,例如核糖體結合位置、轉譯起始位置和終止
密碼子。
可藉由諸多適當方法中的任意一種方法將含有所關注之聚核苷酸的載體導入宿主細胞,該等方法包括電穿孔法;採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚醣(DEAE-dextran)或其他物質進行轉染;微粒子槍轟擊法(microprojectile);微脂粒感染法;及感染法(例如,載體為諸如牛痘病毒之感染劑)。選擇導入載體或聚核苷酸的方法通常取決於宿主細胞的特性而定。
本發明亦提供包含任一種本文中所述聚核苷酸或載體的宿主細胞。任何能夠過量表現異源DNA的宿主細胞皆可用於分離編碼所關注之抗體、聚胜肽或蛋白質的基因。哺乳動物宿主細胞的非限制性實例包括,但不限於,COS細胞、HeLa細胞和CHO細胞,亦請參閱PCT公開案WO 87/04462中所載實例。適合的非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(例如,大腸桿菌(E.coli)或枯草桿菌(B.subtillis))及酵母菌,例如釀酒酵母菌(S.cerevisae)、粟酒裂殖酵母菌(S.pombe)或乳酸酵母菌(K.lactis)。
本發明提供一種使用本發明之抗體、聚胜肽和聚核苷酸以偵測、診斷和監控與抗原決定位表現(epitope expression)有關之疾病、失調或症狀的方法(包括相對於正常樣本而言表現量增高或降低及/或不當表現,例如在正常情況下不表現該抗原決定位的組織及/或細胞內出現該抗原決定位表現情形)。
在一些實施例中,該方法包括偵測從疑似患有癌症(例如胰臟癌、胃癌、大腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、攝護腺癌、乳癌及肝癌)之病患身上所取得之樣本中的該抗原決定位表現情形。該偵測方法較佳為包括使該樣本與本發明之抗體、聚胜肽或聚核苷酸接觸,及判斷該等抗體、聚胜肽或聚核苷酸與對照組樣本或與比較樣本在結合程度上是否有所差異。此方法亦可用於判斷本文中所述之抗體或聚胜肽是否適合用於治療該病患。
當用於本文中時,「樣本」或「生物樣本」一詞意指整個有機生物體或一小撮該生物體的組織、細胞或組成分,例如,體液(包括,但不限於,血液、黏液、淋巴液、滑液(synovial fluid)、腦脊髓液、唾液、羊水、臍帶血、尿液、陰道分泌物和精液)。「樣本」或「生物樣本」進一步指由下列材料製備而成的均質物、溶解液或萃取物:完整有機生物體或一小撮撮該生物體的組織、細胞或組成分或其分提液(fraction)或其一部分,包括但不限於例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液;皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外部切片;淚液;唾液;乳液;血球;腫瘤;器官。最常見者,該樣本已從動物體內取出,但「樣本」或「生物樣本」一詞亦可指在活體內進行分析的細胞或組織,即不從動物體內取出樣本。「樣本」或「生物樣本」通常含有來自動物的細胞,但該用語亦可指非細胞的生物材料,例如血液、唾液或尿液中不含細胞的部分,此等材料可用來測定與癌症相關之聚核苷酸或聚胜肽的含量。「樣本」或「生物樣本」進一步指已用於繁殖有機生物
後的培養基,例如營養液或營養膠,且該培養基中含有細胞成分,例如含有蛋白質或核酸分子。
在一實施例中,使細胞或細胞/組織溶解物與抗體相接觸,並且測定該抗體和該細胞之間的結合作用。當與相同組織類型的對照組細胞相較之下,該受試細胞展現結合活性時,暗示該受試細胞為癌性細胞。在一些實施例中,該等受試細胞來自人類組織。
可使用所屬技術領域中各種用於偵測專一性抗體-抗原結合作用的已知方法。可根據本發明而實施的示例性免疫檢測法包括螢光偏振免疫檢測法(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)、螢光免疫檢測法(FIA)、酵素免疫檢測法(EIA)、散射免疫比濁抑制法(nephelometric inhibition immunoassay,NIA)、酵素連結免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及放射免疫測定法(RIA)。可使指示劑基團或標示物基附著於標的抗體,並可選擇該等指示基團或標示物,以期符合通常取決於檢測設備和相容免疫檢測程序之可取得性而使用不同方法的需求。適合的標示物包括,但不限於,放射性核種(例如,125I、131I、35S、3H或32P);酵素(例如,鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或β-半乳糖苷酶);螢光基團或螢光蛋白質(例如,螢光素、羅丹明、藻紅蛋白、GFP或BFP)或發光基團(例如,位於美國加州Palo Alto市之Quantum Dot公司所供應的QdotTM奈米粒子)。所屬技術領域中具有通常技藝者熟知執行上述各種免疫檢測法的一般技術。
用於診斷目的時,可使用可偵測的基團標示該含抗體的聚胜肽,該等可偵測的基團包括,但不限於,所屬技術領域中已知的放射性同位素、螢光標示物和各種酵素-受質標示物(enzyme-substrate label)。使標示物與抗體連接的方法已為所屬技術領域所熟知。
在一些實施例中,含有本發明抗體的聚胜肽無需具有標示物,並可使用能與本發明抗體結合的經標示之抗體來偵測該等聚胜肽的存在。
本發明之抗體可運用於任何已知的檢測方法中,例如競爭性結合作用檢測法、直接和間接三明治式檢測法(direct and indirect sandwich assays)及免疫沉澱法,請參閱Zola所著且由CRC出版公司於1987年所出版之書籍《單株抗體:技術手冊(Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques)》第147~158頁。
該等抗體和聚胜肽亦可用於體內診斷檢測法,例如可用於體內造影法。通常使用放射性核種(例如,111In、99Tc、14C、131I、125I或3H)標示該等抗體或聚胜肽,而可利用免疫閃爍顯像技術定位出所關注的細胞或組織。
利用所屬技術領域中已知的技術亦可使用該抗體作為病理學上的染色劑。
本發明提供本發明抗體和聚胜肽在治療生物個體中之癌症或腫瘤(例如,人類癌症或腫瘤)方面的治療用途。該癌
症可為非造血性癌症,例如胰臟癌、胃癌、大腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、攝護腺癌、乳癌或肝癌。在一些實施例中,該生物個體是人。
可使用本文所提供之該等抗體及聚胜肽中之任意一者進行治療的癌症包括下述任一種癌症:肝細胞癌、甲狀腺癌、大腸癌、大腸直腸癌、肺癌、乳癌、腦瘤、惡性黑色素瘤、腎細胞癌、膀胱癌、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、胃癌、胰臟癌、子宮頸癌、子宮內膜惡性瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、食道癌、肝癌、頭頸部鱗狀細胞瘤、皮膚癌(cutaneous cancer)、尿道癌、攝護腺癌、絨毛膜癌(choriocarcinoma)、咽癌、喉癌、泡膜細胞增生症(thecomatosis)、雄胚瘤(androblastoma)、子宮內膜肥厚症(endometrium hyperplasy)、子宮內膜異位(endometriosis)、胚組織瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、血管瘤(hemangioma)、海綿狀血管瘤(hemangioma cavernous)、血管母細胞瘤(angioblastoma)、視網膜母細胞瘤、星狀細胞瘤、神經纖維瘤、寡樹突神經膠質細胞瘤(oligodendroglioma)、髓母細胞瘤、神經節母細胞瘤(ganglioneuroblastoma)、神經膠質瘤(glioma)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、錯構胚細胞瘤(hamartoblastoma)、骨性肉瘤(osteogenic sarcoma)、子宮肌瘤(leiomyosarcoma)、甲狀腺肉瘤和威耳姆氏瘤(Wilms tumor)以及只要表現出本文所述抗體或聚胜肽能辨識之抗原決定位的癌細胞。
可使用本文所提供之該等抗體及聚胜肽中之任意一
者進行治療的癌症亦包括下述任一種癌症:腎上腺腫瘤、愛滋病(AIDS)相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星狀細胞瘤、膀胱炎(鱗狀細胞癌、移行細胞癌)、骨癌(釉質瘤、動脈瘤性骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦脊髓癌、轉移性腦瘤、乳癌、頸動脈體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色腎細胞癌、亮細胞癌、大腸癌、大腸直腸癌、室管膜瘤、皮膚良性纖維性組織細胞瘤、促纖維化小圓細胞瘤、伊文氏瘤(Ewing's tumor)、骨骼外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維生成不良症、骨纖維發育不全、膽囊與膽管癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、小島細胞瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌(腎母細胞瘤、乳突樣腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤樣腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤樣腫瘤、肝癌(肝母細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴癌、肺癌、髓母細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤(meningiomas)、多發性內分泌腺瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群(myelodysplastic syndrome)、神經母細胞瘤、神經內分泌瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、胰臟癌、乳突狀甲狀腺癌、副甲狀腺腫瘤、小兒癌症、周邊神經鞘膜瘤、嗜鉻細胞瘤、腦下垂體腫瘤、攝護腺癌、葡萄膜或眼內黑色素瘤、罕見血液症候群(rare hematologic disorders)、轉移性腎癌、類橫紋肌肉瘤(rhabdoid tumor)、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、轉移性甲狀腺癌及子宮癌(子宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肌瘤)。本文中所述癌細胞可表現出能被本文所揭示之抗體或聚胜肽辨識的抗原決定表位。
該方法可進一步包括以下步驟:偵測本文中所述抗體或聚胜肽與欲接受治療之生物個體體內腫瘤或癌細胞之間的結合作用。
通常,對需藥治療的受試者施用含有抗體或聚胜肽的有效量組成物,從而抑制癌細胞生長及/或誘使癌細胞死亡。
本文中亦提供治療生物個體體內之非造血性癌症的方法,該方法包括對生物個體施用本文中所述抗體或聚胜肽及另一種抗癌劑。在某些實施例中,該抗體與該抗癌劑協同合作而為該生物個體提供有效的癌症治療。本文中所提供的抗體與該其他抗癌劑可存在於不同的組成物中或從在於同一個組成物中。本文中所提供的抗體與其他抗癌劑可分開施用、同時施用或依序先後施用。
可使用藥學可接受之載劑配製本文所提供之該等組成物中之任一組成物。在一實施例中,該組成物係配製成可用於腹腔內、靜脈內、皮下和肌肉內注射投藥,以及調配成可用於例如口服、黏膜、吸入、舌下等投藥方式的其他劑型。
在另一實施例中,本發明亦思及可施用與其他分子接合之本發明抗體或聚胜肽的組成物,且該等其他分子係例如可偵測的標示物、試劑、治療劑(例如,化療劑)、藥物基團、抗癌劑或細胞毒性劑(例如,細胞毒素)。在一些實施例中,本發明之抗體或聚胜肽係透過連接子而與諸如可偵測之標示物、試劑、治療劑、藥物基團、抗癌劑或細胞毒性劑(例如,細胞毒素)等其他分子接合。該等試劑可包括,但不限於,放射線同位素、毒素、類毒素(toxoid)、至發炎劑(inflammatory
agent)、酵素、反義分子(antisense molecular)、胜肽、細胞激素(cytokine)或化療劑。使抗體與此類分子接合的方法通常已為習知技藝者所熟知,可參閱例如PCT公開案WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624、美國專利案第5,314,995號和歐洲專利案EP 396,387,且該等文獻之揭示內容係以引用方式併入本案。亦可使用如於2012年12月21日提出申請的美國專利臨時申請案第61/745,448號中所述方法製造抗體接合物(antibody conjugates)。
在一實施例中,該組成物含有與細胞毒性劑接合的抗體或聚胜肽。細胞毒性劑可包括任何對細胞有害的藥物。可與抗體或其片段接合的一類較佳細胞毒性劑包括,但不限於,紫杉醇(paclitaxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙啶、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、表鬼臼毒(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、秋水仙素(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅比星(daunorubicin)、二羥基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-脫氫睪固酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質素(glucocorticoid)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、海兔毒素10(或其衍生物,例如單甲基海兔毒素10)及嘌呤黴素(puromycin)和其類似物或同源物。
治療所需的劑量取決於所選擇的投藥途徑、配製物
的性質、病患疾病的性質、病人的體積、體重、表面積、年齡和性別;欲施用的其他藥物及主治醫生的判斷而定。適合的劑量範圍在0.01~1000.0毫克/公斤間。
通常,可使用下列任一劑量:施用至少約50毫克/公斤體重;至少約10毫克/公斤體重;至少約3毫克/公斤體重;至少約1毫克/公斤體重;至少約750微克/公斤體重;至少約500微克/公斤體重;至少約250微克/公斤體重;至少約100微克/公斤體重;至少約50微克/公斤體重;至少約10微克/公斤體重;至少約1微克/公斤體重或更低劑量。用於在數天內或更長時間內重複投藥時,視疾病情況持續進行治療直到該疾病症狀出現如期望的抑制作用。示例性的給藥方案包含每週投予約6毫克/公斤的抗體劑量。然而,視醫生所欲達到的藥物動力衰變模式可使用其他給藥方案。經驗上的考慮因素(例如半衰期)通常通常有助於決定劑量。藉由習知的技術和檢測法可輕易地監控此治療的進程。
在一些受試者中,可能需要投予一劑以上的劑量。可決定和調整在療程中的投藥頻率。例如,可根據欲治療之癌症的種類和期數、施用的藥物是用於預防或治療目的、先前治療情況、病患的臨床病史和對該藥劑的反應以及主治醫生的判斷來決定或調整投藥頻率。通常醫生將先投與一治療性抗體,直至達到可達成所欲結果的適當劑量。在一些情況下,使用抗體的持續釋放型配製物是適宜的。可達到持續釋放效果的各種配製物和裝置為所屬技術領域中所知悉。
在一實施例中,在受試者用藥一或多次之後,可憑
經驗決定投予該受試者的抗體或聚胜肽之劑量。投予受試者的抗體或聚胜肽劑量可逐漸遞增。為評估該抗體或聚胜肽的效果,可監控該疾病症狀的指標。亦可藉由評估腫瘤的負荷量(burden)或體積、疾病發展進程時間(TDP)及/或測定回應速率(response rate,RR)而測量抗體或聚胜肽在體內的效果。
可取決於例如受試者的生理狀況、投藥目的是用於治療或預防以及熟悉該項技藝之醫生所知的其他因素,而根據本發明方法連續或間歇性地施用抗體或聚胜肽。抗體或聚胜肽基本上可在一段預定時間內持續地施用或可分成一系列間隔的劑量而施用。
其他配製物包括所屬技術領域中已知適合的遞送形式,包括,但不限於載劑,例如微脂粒,參閱例如Mahato等人於1997年發表在Pharm.Res.第14期853~859頁之論文。微脂粒製劑包括,但不限於,細胞轉染劑(cytofectin)、多層微脂粒(multilamellar vesicle)和單層微脂粒。
在另一實施例中,該組成物可包含一或多種抗癌劑、一或多種本文中所述抗體或附帶包含可與不同抗原結合的抗體或聚胜肽。此組成物可含有至少一種、至少二種、至少三種、至少四種或至少五種不同抗體。該等抗體和其他抗癌劑可存在於同一個配製物內(例如,在所屬技術領域中一般所稱的混合物),或該等抗體和其他抗癌劑可置於各別的配製物內但該等配製物可同時施用或依序先後施用,此方式特別適用於治療較大範圍的生物個體族群。
編碼本發明任何抗體或聚胜肽的聚核苷酸亦可用於
在所欲細胞內遞送和表現本發明之任何抗體或聚胜肽。顯然地可使用表現載體直接表現該抗體或聚胜肽。可藉由所屬技術領域中任何已知的方式施用該表現載體,該等方式係例如經腹腔內、靜脈內、肌肉內、皮下、鞘內(intrathecally)、室內、口服、腸內(enterally)、非腸道(parenterally)、鼻內、皮膚、舌下或藉由吸入而施用。例如,表現載體的施用包括局部或全身性施用,包括注射、口服、粒子槍或插管投藥以及局部外用(topical)投藥。所屬技術領域中熟習該項技藝者熟悉表現載體之施用方式以在體內表現外源性蛋白質,可參閱例如美國專利案第6,436,908號、第6,413,942號和第6,376,471號。
亦可採用目標性遞送方式而遞送含有編碼本發明任何抗體或聚胜肽之多核苷酸的治療組成物。在以下文獻中描述受器介導性DNA遞送技術:例如Findeis等人於1993年發表在Trends Biotechnol.第11期202頁之論文;Chiou等人所著且由J.A.Wolff編輯於1994年所出版之《基因治療:直接基因傳遞的方法和應用(Gene Therapeutics:Method And Applications Of Direct Gene Transfer)》;Wu等人於1988年發表在J.Biol.Chem.第263期621頁之論文;Wu等人於1994年發表在J.Biol.Chem.第269期542頁之論文;Zenke等人於1990年發表在Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87期3655頁之論文;Wu等人於1991年發表在J.Biol.Chem.第266期338頁之論文。在基因療法中,含有聚核苷酸之治療組成物的局部投藥量範圍約100毫微克(ng)至約200毫克的DNA。在基
因治療期間亦可使用濃度範圍約500毫微克至約50毫克、約1微克至約2毫克、約5微克至約500微克及約20微克至約100微克的DNA。
可利用基因遞送工具輸送本發明的治療性聚核苷酸和聚胜肽。該基因遞送工具可為病毒性或非病毒性來源(通常可參閱Jolly於1994年發表在Cancer Gene Therapy第1期51頁;Kimura於1994年發表在Human Gene Therapy第5期845頁;Conelly於1985年發表在Human Gene Therapy第1期185頁;及Kaplitt於1994年發表在Nature Genetics第6期148頁之論文)。可利用內源性哺乳動物啟動子或異源性啟動子誘使此等編碼序列表現。該編碼序列的表現為持續性(constitutive)或調節性(regulated)其中任一者。
可用於遞送所欲之聚核苷酸並且在所欲細胞內進行表面的病毒系載體為所屬技術領域中所熟知。示例性的病毒系載體包括,但不限於,重組反轉錄病毒(例如參閱PCT公開案WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805、美國專利案第5,219,740號、第4,777,127號、英國專利案第2,200,651號和歐洲專利案第0 345 242號);α-病毒系載體,例如新德比斯(Sindbis)病毒載體、聖利基(Semliki)森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、羅斯河(Ross River)病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)和委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan equine encephalitis)病毒(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR 1249、ATCC VR-532);及腺相關病毒(adeno-associated virus,
AAV)載體,可參閱例如PCT公開案WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984和WO 95/00655。亦施用如Curiel於1992年發表在Hum.Gene Ther.第3期147頁之論文中所述與已死之腺病毒連接的DNA。
亦可採用非病毒性的遞送工具及方法,包括,但不限於,單獨與已死之腺病毒連接或未連接的聚陽離子凝集DNA(polycationic condensed DNA,請參閱例如Curiel於1992年發表在Hum.Gene Ther.第3期147頁之論文);與配體連接的DNA(參閱例如Wu於1989年發表於J.Biol.Chem.第264期16985頁之論文);真核細胞遞送工具細胞(參閱例如美國專利案第5,814,482號、PCT公開案WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763和WO 97/42338)及核電荷中和法(nucleic charge neutralization)或與細胞膜融合方法。
亦可採用裸DNA(naked DNA)。示例性的裸DNA導入方法已述於PCT公開案WO 90/11092和美國專利案第5,580,859號中。在美國專利案第5,422,120號、PCT公開案WO 95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445和歐洲專利案第0 524 968號中則描述可作為基因遞送工具的微脂粒。其他方法揭示於Philip於1994年發表在Mol.Cell Biol.第14期2411頁和Woffendin於1994發表在Proc.Natl.Acad.Sci第91期1581頁之論文中。
包含本發明抗體的組成物可配合一或多種其他治療劑施用(例如,依序先後施用或同時施用),該一或多種其他治療劑係例如:化療劑,如5-FU、5-FU/MTX、5-FU/亞葉酸
(Leucovorin)、左旋咪唑(Levamisole)、伊立替康(Irinotecan)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、卡培他賓(Capecitabin)或尿嘧啶(Uracil)/替加氟(Tegafur);免疫佐劑;生長抑制劑;細胞毒性劑和細胞激素,等等。抗體和治療劑的用量取決於所使用之藥物類型、欲治療的生理狀況及用藥計劃和用藥途徑而定,但通常小於該等藥物各別單獨施用時的用量。
在施用含有本文中所述抗體的組成物之後,可利用所屬技術領域中具有通常知識者所熟習的各種方法評估該組成物在體外和體內的效果。已知用有各種動物模型可用於測試候選組成物的抗癌活性。此等動物模型包括將人類腫瘤異種移殖至無胸腺裸鼠或嚴重複合免疫不全症(scid/scid)小鼠體內,或基因鼠類腫瘤模型(例如,p53基因剔除小鼠)。這些動物模型的體內性質使該等模型可特定地預測在人類病患體內的應答行為(response)。使用諸如皮下注射、尾部靜脈注射、脾臟移植、腹腔內植入和腎包膜下移植等標準技術將細胞導入同源(syngeneic)小鼠體內可產生此種模型。
本發明亦提供用於本發明方法中的套組。本發明之套組包含一或多個含有文中所述之抗體或聚胜肽(例如經純化或已分離之抗體或聚胜肽)的容器以及依照本文中所述任一種本發明方法使用的使用說明書。在一些實施例中,此等說明書包含依據本文中所述任何方法施用該抗體或聚胜肽以治療非造血性癌症的描述內容(該非造血性癌症係例如胰臟癌、胃
癌、大腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、攝護腺癌、乳癌及肝癌)。在某些實施例中,此等說明書包含施用本文中所提供之抗體或聚胜肽及另一抗癌劑以治療非造血性癌症,且藉由該抗體與該抗癌劑協同合作而提供有效癌症治療。該套組可進一步包含依據鑑定該生物個體是否罹患該疾病及疾病的病期階段,或鑑定該生物個體所具有之癌細胞是否表現能被本文所提供之抗體或聚胜肽結合或辨識之輸鐵蛋白受器,而選擇適合進行治療之生體個體的描述內容。在一些實施例中,該套組可進一步包含第二抗癌劑。
在一些實施例中,用於偵測樣本中之癌症細胞的套組包含本文所述之抗體或聚胜肽及/或用於偵測該抗體或聚胜肽與樣本內細胞之結合作用的試劑。
涉及使用抗體或聚胜肽治療癌症的說明書通常包括有關用於預期治療之劑量、給藥計劃和投藥途徑的資訊。該等容器可為單位劑量(unit dose)、大包裝(例如,多劑包裝)或子單位劑量。附於本發明套組內的說明書一般為書寫於標籤或包裝附頁(例如,套組內的紙片)上的說明書,但亦可為機器可讀取式說明書(例如,儲存於磁碟或光碟片上的說明書)。該標籤或包裝附頁指示該組成物係用於治療本文中所述癌症。可提供說明書內容以說明實施本文中所述的任何方法。
本發明之套組置於適當包裝內。適合的包裝包括,但不限於,小瓶、瓶、罐、軟包裝(例如,密封聚酯薄膜(Mylar)或塑膠袋)及諸如此類者。該等包裝亦可與特殊裝置組合使用,該等特殊裝置係例如吸入器、鼻內給藥裝置(如,霧化器)
或灌注器(如,微型泵)。套組可具有無菌取用口,例如,該容器可為靜脈輸液袋或具有可讓皮下注射針刺入的塞子。該容器亦可具有無菌取用口,例如該容器可為靜脈輸液袋或具有可讓皮下注射針刺入的塞子。組成物內之至少一種活性劑為本文中所述的抗體。該容器可進一步包含第二種藥學活性劑。
套組可視需要而提供附加成分,例如緩衝劑和解說資訊。通常,該套組包含容器和在容器上或伴隨該容器的標籤或包裝附頁。
以下為本發明之方法和組成物的實例。應明白,基於以上所提供之概括說明,尚可實施各式各樣的其他實施例。
使用300微克的胰臟癌細胞株Panc 02.03B細胞膜分提液(membrane fraction)或自Panc 02.03B細胞純化而得的50微克之輸鐵蛋白受器對Balb/c小鼠進行三次接種,以使該小鼠產生免疫。使小鼠的脾臟細胞與P3X63骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤,隨後在添加10%胎牛血清(FBS,Hyclone®)和HAT(Hybri-Max®,Sigma H0262,最終濃度為100μM之次黄嘌呤、0.4 μM之胺基喋呤和16 μM之胸腺嘧啶)的DMEM培養基中培養該融合瘤。篩選出對癌症衍生性輸鐵蛋白受器或癌細胞呈現陽性結合反應但對活化T細胞呈現陰性結合反應的融合瘤。篩選對Panc 02.03B癌細胞呈陽性結合反應但對活化T細胞呈現陰性結合反應之融合瘤的結果係分離出三個
融合瘤選殖株:6-90(IgM,κ)、55-31(IgM,κ)和122-72(IgM,κ)。
使用從肺癌細胞株H358取得之300微克的細胞膜分提液對Balb/c小鼠進行一次接種以使該小鼠產生免疫可製造並分離出額外的融合瘤。使該小鼠的脾臟細胞與P3X63骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤,並如上述般選擇該等融合瘤,且使用FACS技術篩選該等融合瘤所製造的抗體,以篩選出對H358細胞株呈現陽性結合反應者。根據抗體辨識肺癌細胞株H358上之人類輸鐵蛋白受器的能力選出一融合瘤選殖株5D7-54.17,且經鑑定為小鼠IgM,κ。
進行免疫沉澱分析和西方墨點分析以進一步證實該等抗體對於癌細胞所表現之輸鐵蛋白受器具有專一性(見第1圖)。使用抗-人類輸鐵蛋白受器抗體MEM189對來自肺癌H358細胞株或攝護腺癌DU145細胞株的細胞溶解液進行免疫沉澱。使用另一種市售抗-人類輸鐵蛋白受器抗體C20作為陽性對照組以定位人類輸鐵蛋白受器(約95 kDa)在SDS-PAGE上的位置。第1A圖圖示抗體MEM189從H358或DU145細胞株中免疫沉澱出的蛋白質能分別被抗體6-90、抗體122-72、抗體5D7-54.17或抗體55-31辨識。抗體60-43與抗體122-72具有相同的CDR。反之,只有抗體C20能辨識使用抗體MEM189從活化T細胞溶解液中經免疫沉澱所製備而得的蛋白質,但上述四種抗體無法辨識該抗體MEM189從活化T細胞溶解液中經免疫沉澱所製備而得的蛋白質(見第1B圖)。此等數據暗示此四種抗體能夠辨識輸鐵蛋白受器上的癌症特異性修飾物,但無法辨識正常細胞(例如活化T細胞)中所
生成的蛋白質骨架或修飾。
為確定該等抗體的胺基酸序列和核苷酸序列,利用PCR法擴增該抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的cDNA,且將所合成的cDNA選殖至pCRII載體(InvitrogenTM)中以進行序列鑑定。分析來自數個獨立選殖株的核苷酸序列。第2圖至第5圖示出包含該訊息胜肽之重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列及經轉譯的蛋白質序列。此等圖式中標示出該等抗體之重鏈和輕鏈中所使用的訊息胜肽。在此等圖式中以粗體和底線標示此等抗體的Kabat CDR。先前已說明同型之小鼠免疫球蛋白M重鏈(見Kawakami等人於1980年發表在Nucleic Acid Res.第8期17卷3933~3945頁)及κ-輕鏈(Hieter等人於1980年發表在Cell第22期(1 pt 1)第197~207頁)的恆定區序列。
使用FACS分析法測定該等抗-輸鐵蛋白受器抗體6-90、55-31、122-72及5D7-54.17與人類正常細胞的結合作用,人類正常細胞包括紅血球、多形核白血球(PMN)、淋巴球、單核球、血小板和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。並使用高免疫血清(Hyp-serum)或針對某些細胞類型的對應細胞標記抗體作為陽性對照組(positive control)。表2列示相較於小鼠IgM同型對照組而言,抗體6-90、抗體55-31及抗體122-72不與正常細胞結合。偵測到抗體5D7-54.17對淋巴球呈陽性結合
(範圍介於4%至42%),且又進一步檢測顯示該抗體5D7-54.17不能與T淋巴細胞結合且僅能與極少的B淋巴細胞結合(未出示數據)。相較於其他三種抗體,觀察到抗體5D7-54.17與某些提供者的PMN細胞和單核球具有輕微的結合力(範圍介於8%~19%)。
檢測出抗-輸鐵蛋白受器抗體6-90、55-31、122-72及5D7-54.17與人類癌細胞株結合,包括肺癌、胰臟癌癌、胃癌、卵巢癌、子宮內膜癌、大腸直腸癌、乳癌、攝護腺癌及肝癌。該等數據整理於表3中。抗體6-90顯示對於H358細胞株、Panc 02.03細胞株、SU.86.86細胞株、SNU-16細胞株、NCI-N87細胞株、Kato III細胞株、OMC-3細胞株、DLD-1細胞株、Colo 205細胞株及WiDr細胞株具有強結合力(平均
螢光強度>1000)。抗體122-72能與H358細胞株、Panc 02.03細胞株、SU.86.86細胞株、SNU-16細胞株、NCI-N87細胞株、OMC-3細胞株、DLD-1細胞株、Colo 205細胞株及WiDr細胞株強烈結合力(平均螢光強度>1000)。抗體5D7-54.17顯示對於H358細胞株、Panc 02.03細胞株、SU.86.86細胞株、SNU-16細胞株、NCI-N87細胞株、Kato III細胞株、OMC-3細胞株、SK-OV-3細胞株、DLD-1細胞株、Colo 205細胞株、WiDr細胞株、MDA-MB-453細胞株及KLE.55-31細胞株具有強結合力(平均螢光強度>1000)。抗體55-31顯示能與A549細胞株、Panc 02.03B細胞株、Panc-1細胞株、SK-OV-3細胞株、DU-145細胞株及HEC-1-A細胞株結合。此等抗體不會與白血病細胞株「Jurkat」結合。除了NCI-N87細胞株(平均螢光強度(MFI):33)、OMC-3細胞株(MFI:16)、KLE細胞株(MFI:10)及HEC-1-A細胞株(MFI:13)之外,同型對照組抗體與該等細胞株的結合強度大部份在10以下。
綜合上述結果,抗-輸鐵蛋白受器抗體6-90、55-31、122-72及5D7-54.17能與種類廣泛的人類癌細胞結合,包括大腸直腸癌、胃癌、胰臟癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、攝護腺癌、乳癌及肝癌。
表3、6-90、55-31、122-72及5D7-54.17抗-輸鐵蛋白受器抗體對癌細胞的結合模式(示出結合平均螢光強度(MFI)大於50的癌細胞株)6-90*
以上數據顯示該等抗-輸鐵蛋白受器抗體6-90、55-31、122-72及5D7-54.17可與各種人類癌細胞株結合。隨後檢測在證實與該等抗體呈陽性結合的癌細胞株中,該等抗體誘發細胞凋亡的能力。進行Annexin V及碘化丙啶(PI)染色且利用FACS分析法進行偵測以測量此等抗體誘發的細胞凋亡作用。於37℃下在融合瘤培養液(表中示出經價數滴定之稀釋倍數)存在的情況下培養細胞過夜。使用同型對照小鼠IgM在細胞中誘發的信號做為背景值,表4整理出在背景值下該等抗體可在細胞中誘發10%~60%之細胞凋亡作用的細胞株。
表4、癌症專一性抗-輸鐵蛋白受器抗體之細胞凋亡誘發能力
檢測抗體6-90、抗體55-31、抗體122-72及抗體5D7-54.17在結合反應陽性癌細胞株中誘發受器內化作用的能力,該等結合反應陽性癌細胞株係例如Panc 02.03B、H358、DLD-1及OMC-3。於37℃下使用抗體處理癌細胞4小時,並使用螢光標示之第二抗體偵測內化作用。如第6圖所示,於37℃下進行培育後,發現抗體6-90、抗體55-31、抗體122-72及抗體5D7-54.17累積在癌細胞的細胞質液(cytosol)中。反之,在4℃下進行培育無法誘發內化作用,並且僅觀察到細胞膜有染色情形(未出示數據)。
為判斷輸鐵蛋白受器上的碳水化合物修飾物是否參與抗體6-90、抗體122-72及抗體5D7-54.17與癌細胞之間的結合作用,以Colo205細胞表現重組性FLAG標籤人類CEA(rCEA)片段,隨後使用該重組性FLAG標籤人類CEA片段鑑定此等抗體的醣類-抗原決定位。藉由西方墨點法確認在此重組片段中存在著可供抗體6-90、抗體122-72及抗體5D7-54.17辨識的抗原決定位(見第7圖,未處理之泳道)。使用西方墨點法評估經糖苷酶處理之後該等抗體與rCEA蛋白之間的結合作用。此外,使用抗-FLAG標籤抗體證實在經酵素處理之後的相等蛋白質用量及蛋白質完整度。使用小鼠IgM作為同型對照組。使用抗-唾液酸lewisa抗體(選殖株名:
KM231,EMD化學公司,型錄編號:565942)以證實α2-3,6,8-神經胺酸水解酶的酵素有效功能。
待使用α2-3,6,8-神經胺酸水解酶處理蛋白質之後,觀察到抗體122-72及抗體5D7-54.17與rCEA的結合力明顯降低(見第7圖),此暗示供抗體122-72及抗體5D7-54.17辨識用的抗原決定位含有唾液酸(sialyl)基團。經過神經胺酸水解酶處理之後,抗體6-90的辨識作用不受影響,此表示供抗體6-90辨識用的抗原決定位不含唾液酸基團。
使用α-1→(2,3,4)-岩藻糖苷酶和N-聚醣酶或兩者之組合處理rCEA蛋白之後,抗體6-90與rCEA的結合力完全消失(見第8圖),此結果暗示供抗體6-90辨識用的抗原決定位含有岩糖基團。由於供抗體122-72及抗體5D7-54.17辨識用的抗原決定位含有唾液酸基團(此基團可能防止岩藻糖苷酶切除鄰近的岩藻糖),故此檢測可能無法測定岩藻糖基團在供抗體122-72及抗體5D7-54.17辨識用之抗原決定位中可能提供的貢獻。
進行聚醣類競爭試驗以測定lewis a三醣類是否能干擾抗體6-90、抗體122-72、抗體55-31及抗體5D7-54.17與Panc 02.03B細胞之間的結合作用。使用抗-Lewisa抗體(選殖PR4D2)作為陽性對照組。第9圖中的結果顯示,在此等抗體與Panc 02.03B細胞之間的結合作用方面,Lewis a結構不會與此等抗體中之任何一者進行競爭。
5D7-54.17嵌合抗體(c5D7)係用於製備抗體藥物接合物(ADC),c5D7-單甲基海兔毒素10之抗體藥物接合物(參閱以下製造該ADC之方法)。在DLD-1移植SCID小鼠體內評估該c5D7-單甲基海兔毒素10的抗腫瘤活性。在移植腫瘤後的第1天和第5天使用3毫克/公斤的ADC或溶劑開始進行治療。相較於溶劑組小鼠在第14天時體內腫瘤達到500毫米立方公分,c5D7-ADC在整個研究期間完全抑制腫瘤生長(見第10圖)。施予治療之後,來自每組之小鼠的體重維持不變(平均25公克)。該數據顯示,利用抗-輸鐵蛋白受器c5D7抗體進行細胞毒性藥物的癌症標靶給藥能夠有效抑制活體內的腫瘤生長。
使用癌細胞膜萃取物/純化之輸鐵蛋白受器進行免疫:使用300微克的胰臟癌細胞株Panc 02.03B細胞膜分提液(membrane fraction)或自Panc 02.03B細胞純化而得的50微克之輸鐵蛋白受器對Balb/c小鼠進行三次接種,以使該小鼠產生免疫,並使小鼠的脾臟細胞與P3X63骨髓瘤細胞融合。隨後在添加10% FBS(Hyclone®)和HAT(Hybri-Max®,Sigma H0262,最終濃度為100μM之次黄嘌呤、0.4μM之胺基喋呤和16μM之胸腺嘧啶)的DMEM培養基中培養並篩選該等融合瘤。篩選出對癌症衍生性輸鐵蛋白受器或癌細胞呈現陽性結
合反應但對活化T細胞呈現陰性結合反應的融合瘤。根據融合瘤辨識Panc 02.03B細胞上人類輸鐵蛋白受器之癌症特異性修飾物的能力,選出三個融合瘤選殖株:6-90(IgM,κ)、55-31(IgM,κ)和122-72(IgM,κ)。
使用從肺癌細胞株H358取得之300微克的細胞膜分提液對Balb/c小鼠進行一次接種以使該小鼠產生免疫,並使該小鼠的脾臟細胞與P3X63骨髓瘤細胞融合。在如上述之培養基中培養該等融合瘤,且使用FACS技術篩選該等融合瘤以選出對H358細胞株呈現陽性結合反應者。根據抗體辨識肺癌細胞株H358上人類輸鐵蛋白受器之癌症特異性修飾物的能力,進一步選出一融合瘤選殖株5D7-54.17,且經鑑定為小鼠IgM,κ。
細胞ELISA檢測法:在96孔平底孔盤的每個孔中於100微升的完整培養基內種入6~7×104個Panc 02.03B細胞且置於37℃培養過夜,以使細胞完全貼附至孔壁。第二天,丟棄培養基,並於該96孔平底孔盤各孔中加入50微升之培養過融合瘤的培養基置於4℃下反應1小時。使用磷酸鹽緩衝液(PBS,pH 7.2)清洗之後,在室溫下以2%的三聚甲醛(paraformaldehyde)固定該等Panc 02.03B細胞持續20分鐘。使用PBS(pH 7.2)清洗細胞一次之後,於每孔中加入50微升之1:5000倍稀釋的HRP接合之山羊抗小鼠Ig(Southern biotechTM,型錄編號:1010-05)且置於4℃下反應0.5~1小時。使用PBS(pH 7.2)清洗細胞一次之後,加入50微升之含有TMB的受質(BDTM,型錄編號:555214)
並反應5~10分鐘直到顯現顏色。加入50微升之0.5N的H2SO4溶液以終止反應,並利用分子儀器公司(Molecular Devices)的VERSEmax讀取儀以OD450測量該顏色。
利用PCR法擴增該抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的cDNA,並將所合成的cDNA次選殖至pCRII載體(InvitrogenTM)中以進行序列鑑定。從數個獨立選殖株取得核苷酸序列並且分析該等核苷酸序列。選出從數個獨立選殖株且具有相同序列的cDNA序列,且使用FACS法進一步驗證該等cDNA序列編碼有各個抗體的輕鏈可變區或重鏈可變區。
使用溶解緩衝液溶解2×107個H358細胞或3.5×107個活化T細胞,其中該溶解緩衝液(lysis buffer)係TN緩衝液(50mM之Tris-HCl、150mM之NaCl、1%之NP-40及蛋白酶抑制器(於製備出活化T細胞溶解液時額外添加0.5%去氧膽酸(deoxycholate)),並使用抗-輸鐵蛋白受器抗體MEM-189(AbcamTM,型錄編號:ab1086)對該細胞溶解液進行免疫沉澱。使用8%的SDS-PAGE電泳膠分離所沉澱的蛋白質,並將該電泳膠轉移到NC薄膜上,隨後使用7%的脫脂牛奶於室溫下遮蓋(blocking)該NC薄膜,接著使用抗體6-90、抗體55-31、抗體122-72、抗體5D7-54.17或抗-輸鐵蛋白受器多株抗體C20(作為陽性對照組,Santa Cruz
BiotechnologyTM,型錄編號:Sc-7087)在室溫下對該NC薄膜進行印跡反應2~18小時。使用TBS-T溶液(20mM之Tris-鹼,pH 7.4、150mM之NaCl、0.125%之Tween 20)清洗該薄膜後,使該薄膜在室溫下與接有辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(H+L)(Southern biotechTM,型錄編號:1031-05)或兔子抗山羊IgG(Santa Cruz BiotechnologyTM,型錄編號:Sc-2768)反應1小時。使用TBS-T清洗該薄膜之後,使用ECL偵測系統(Fujifilm LAS-4000)使該蛋白質顯影。
抗體之製備:於荷商台醫股份有限公司台灣台北分公司製造目前研究中所使用之融合瘤選殖株6-90、55-31、122-72及5D7-54.17的培養上清液(culture supernatant)。從BD PharmingenTM公司購買同型對照抗體小鼠IgM κ(型錄編號:557275)。從Southern BiotechTM山羊抗小鼠IgM-PE(型錄編號:1022-09)。
以下詳述正常細胞之製備方法。
製備PBMC及PMN:使用等體積的PBS稀釋全血並與1/10體積的15%葡聚糖溶液混合。於室溫下靜置20分鐘,使用PBS清洗該富含白血球(WBC)的上層物並將該上層物懸浮於PBS中,並將一半體積的聚蔗糖(Ficoll,購自GE Healthcare公司的Ficoll-PaqueTMPLUS,型錄編號:17-1440-03)加至試管底部。以2200rpm離心15分鐘之後(轉子:SORVALL,PN11788,及離心機:SORVALL,RT7),收集集
中在界面處的PBMC,並且使用大量的FACS緩衝液(PBS緩衝液中添加2%的FBS)清洗該等PBMC以備將來使用。收集富含PMN的沉澱物(pellet),並將該沉澱物置於0.2%的NaCl溶液中藉由低張壓溶解作用去除該沉澱物中殘餘的紅血球(RBC)。
製備紅血球及血小板:於室溫下使9毫升的全血與1毫升的檸檬酸鈉緩衝液(pH6.5)混合並以200×g的速度離心15分鐘。離心之後,使用細胞層(下層)如下述般製備紅血球(RBC)。小心地將血漿(上層,富含血小板)轉移至乾淨的離心管中並與1/10體積的ACD緩衝液混合(ACD緩衝液:85mM之檸檬酸鈉、64.54mM之檸檬酸、75.5mM之右旋-葡萄糖)。以900×g的速度於室溫下離心5分鐘之後,丟棄血漿,並將血小板沉澱物重新懸浮在1毫升之HEPES-泰羅德氏緩衝液中(HEPES-Tyrode buffer:134mM之NaCl、2.9mM之KCl、5mM之葡萄糖、12mM之NaHCO3、0.34mM之NaH2PO4、5mM之HEPES、1%之BSA,pH7.4)。測量所獲得之血小板溶液的OD600。先將該血小板溶液的OD600調整至0.25~0.3,且隨後稀釋5倍以用於進行結合試驗。將細胞相(下層)與等體積的PBS混合,並小心地使該混合物層疊在聚蔗糖(Ficoll)之頂部上,其中Ficoll係購自GE Healthcare公司的Ficoll-PaqueTMPLUS(型錄編號:17-1440-03)。以2400rpm離心15分鐘之後(轉子:SORVALL,PN11788,及離心機:SORVALL,RT7),將紅血球(RBC)沉澱物重新懸浮在10倍體積的PBS中並計算紅血球數量。在抗體結合試驗中使用1×106
個細胞的分裝量。
製備活化T細胞:使用PHA(5微克/毫升,Roche Diagnostics GmbH)活化人類PBMN,並使該等細胞在含有IL-2(5毫微克/毫升,R&D System)之培養基中增殖至第4天~第5天以用於進行結合作用檢測或免疫沉澱/西方墨點分析。
從位於美國維吉尼亞州馬納薩斯(Manassas)市的美國標準生物收集中心(ATCC)取得人類癌細胞株H358(型錄編號:CRL-5807)、H727(型錄編號:CRL-5815)、SU.86.86(型錄編號:CRL-1837)、SK-OV-3(型錄編號:HTB-77)、PC3(型錄編號:CRL-1435)、KLE(型錄編號:CRL-1622)及DU 145(型錄編號:HTB-81)。
從台灣新竹食品工業研究與發展研究所取得人類癌細胞株A549(型錄編號:BCRC 60074)、H520(型錄編號:BCRC 60124)、PANC-1(型錄編號:BCRC 60284)、SNU-16(型錄編號:BCRC 60212)、NCI-N87(型錄編號:BCRC 60217)、KATO III(型錄編號:BCRC 60200)、COLO 205(型錄編號:BCRC 60054)、DLD-1(型錄編號:BCRC 60132)、WiDr(型錄編號:BCRC 60157)、Hs578T(型錄編號:BCRC 60120)、T47D(型錄編號:BCRC 60250)、MDA-MB-453(型錄編號:BCRC 60429)、22Rv1(型錄編號:BCRC 60545)、Hep 3B2.1-7(型錄編號:HB-8064)、Hep G2(型錄編號:BCRC 60025)、HEC-1-A(型錄
編號:BCRC 60552)及PLC/PRF/5(型錄編號:BCRC 60223)。從日本茨城縣(Ibaraki)理研生物資源中心取得人類癌細胞株OMC-3(型錄編號:RCB0755)。
細胞係在下列培養基中生長且於37℃下在含有5% CO2的潮濕環境下進行培養。
由ATCC獲得的原始細胞株Panc 02.03(型錄編號:CRL-2553)經調適而得到胰臟癌細胞株Panc 02.03B,並在添加15%之FBS、1mM之丙酮酸鈉(GIBCOTM,型錄編號:11360)及100單位/毫升之盤尼西林和100微克/毫升之鏈黴素(GIBCOTM,型錄編號:15140)的RPMI培養基1640(GIBCOTM,型錄編號:22400)中培養該胰臟癌細胞株Panc 02.03B。
使乳癌細胞株MDA-MB-453在添加10%之FBS、2mM之左旋-麩醯胺酸及100單位/毫升之盤尼西林和100微克/毫升之鏈黴素(GIBCOTM,型錄編號:15140)的萊博維茨氏L-15培養基(Leibovitz’s L-15 medium,GIBCOTM,型錄編號:11415)中生長且於37℃下在不含CO2的潮濕環境下進行培養。
在v形底之96孔盤的各個孔中種入1×105個細胞,並使該等細胞與50微升且稀釋1倍及稀釋10倍的融合瘤培養上清液反應或與濃度為1微克/毫升的同型對照組抗體小鼠IgM,κ(BDTM,型錄編號:557275)反應。使用稀釋300倍的人類細胞高免疫血清作為可用於所有細胞種類的陽性結合對照組。使用PE-接合之抗人類CD41a(Southern BiotechTM,型錄編號:9391-09)作為用於對人類血小板進行染色的陽性對照組。抗-唾液酸基Lewis x抗體(MilliporeTM,型錄編號:MAB2096)是用以作為對人類PMN進行染色的陽性對照組。抗-人類CD31抗體抗體(HycultTM,型錄編號:HM2039)係用以作為對人類HUVEC進行染色的陽性對照組。於4℃下反應30分鐘後,以200微升的FACS緩衝液(1×PBS中含有1%的FBS)清洗細胞兩次,取50微升之加在FACS緩衝液中且濃度為1微克/毫升的山羊F(ab’)2-抗小鼠IgG(H+L)-PE(Southern BiotechTM,型錄編號:1032-09)或濃度為1微克/毫升的山羊
F(ab’)2-抗小鼠IgM(H+L)-PE(Southern BiotechTM,型錄編號:1022-09)對細胞進行染色。於4℃下反應30分鐘後,用FACS緩衝液清洗細胞兩次,並使用流式細胞儀(BD LSR,BD生命科學公司生產)分析該等細胞。
在v形底之96孔盤的各個孔中種入1×105個細胞,並使該等細胞與50微升之(稀釋1倍及稀釋5倍的)融合瘤培養上清液反應或與同型對照組抗體小鼠IgM,κ(BDTM,型錄編號:557275)(濃度為5微克/毫升)反應。使用小鼠高免疫血清(HPS稀釋300倍)及抗-輸鐵蛋白受器抗體MEM-189作為用於所有細胞類型的陽性結合對照組。於4℃下反應30分鐘後,以200微升的FACS緩衝液(1×PBS中含有1%的FBS)清洗細胞兩次,取50微升之加在FACS緩衝液中且濃度為1微克/毫升的山羊F(ab’)2-抗小鼠IgM(H+L)-PE(Southern BiotechTM,型錄編號:1022-09)對細胞進行染色,且隨後於4℃下反應30分鐘。用FACS緩衝液清洗細胞兩次,並使用流式細胞儀(BD LSR,BD生命科學公司生產)分析該等細胞。
在96孔盤的各個孔中種入1×105個測試用癌細胞。在培養基中加入新鮮的培養過融合瘤之培養基(hybridoma culture medium)及對照組抗體,並將上述新鮮製備的培養基加入各個孔中。該等接受處理的細胞置於37℃下反應過夜,
之後進行FACS分析以檢測細胞凋亡情形。用於細胞凋亡檢測時,使用Annexin-V-FITC細胞凋亡偵測試劑套組(Strong BiotechTM,型錄編號:AVK250)依照製造商提供的說明書進行Annexin-V染色。簡言之,使細胞與含有1微升之Annexin-V-FITC的Annexin V結合緩衝液在室溫下於黑暗中反應15分鐘,隨後使用200微升的Annexin V結合緩衝液清洗細胞2次。進行FACS分析之前加入1微升的碘化丙啶(PI)。在BD-LSR流式細胞儀(Becton Dickinson)上使用Cell Quest軟體進行所有的流式細胞分析。呈現Annexin V陽性及/或PI陽性的細胞視為進行細胞凋亡的細胞。
進行染色之前,使1×105個細胞在蓋玻片上培養3天。於檢測當天,使用150微升之測試用抗體於4℃下(陰性對照組)或於37℃下(允許進行內吞作用)處理細胞4小時。使用冷PBS清洗細胞以去除未結合的抗體後,使用150微升之3.7%的甲醛在4℃下固定細胞20分鐘。再次使用冷PBS清洗細胞,並使用150微升之含有0.5% triton X-100的3.7%甲醛溶液於4℃下處理細胞20分鐘以使細胞可通透化(permeabilized)。使用冷PBS清洗細胞一次之後,加入第二抗體FITC-接合之山羊F(ab)2抗-小鼠IgM(1微克/毫升,Southern BiotechTM,型錄編號:1022-02),並使細胞與該抗體在室溫下反應20分鐘。最後,以冷PBS清洗細胞一次,並使用共軛焦雷射顯微鏡(LSM700-CarlZeiss)檢測該等細胞的免疫螢光
情形。
醣苷酶剪切作用(glycosidase digestion):從Colo205細胞表現並純化出重組CEA(rCEA)片段,該rCEA片段顯示含有某些融合瘤選殖株的抗原決定位,使用該rCEA片段鑑定抗-輸鐵蛋白受器抗體的醣類-抗原決定位(glycol-epitope)。使該rCEA蛋白質(0.2~1.2微克)與下述醣苷酶在50~70微升之製造商所建議的緩衝液中於37℃反應18小時,所使用醣苷酶如下:α2-3,6,8-神經胺酸水解酶(EMDTM,型錄編號:480717)、α-1→(2,3,4)-岩藻糖苷酶(Sigma-AldrichTM,型錄編號:f1924-1VL)或Glyko®N-聚醣酶TM(ProZymeTM,型錄編號:ws0041)。隨後使用SDS-PAGE電泳膠分析該經處理後的蛋白質樣本,並使用測試用抗體對該蛋白質進行墨點分析。
在v形底之96孔盤中以每孔1×105個細胞在各個孔中種入Panc 02.03B細胞。在沒有或具有1mM之寡醣競爭劑Lewis a(Calbiochem®CB-434626)的存在下,使細胞與稀釋300~900倍的融合瘤培養上清液在50微升的最終體積中進行反應。於4℃反應1小時後,以200微升的FACS緩衝液(1×PBS中含有1%的FBS)清洗細胞兩次,取50微升之加在FACS緩衝液中且濃度為1微克/毫升的山羊F(ab’)2-抗小鼠IgG(H+L)-PE(Southern BiotechTM,型錄編號:1032-09)或濃
度為1微克/毫升的山羊F(ab’)2-抗小鼠IgM(H+L)-PE(Southern BiotechTM,型錄編號:1022-09)對細胞進行染色,且於4℃反應30分鐘後,隨後用FACS緩衝液清洗細胞兩次,並使用流式細胞儀(BD LSR,BD Life Science)分析該等細胞。使用抗-Lewisa抗體(選殖株名名稱:PR4D2,ChemiconTM,型錄編號:MAB438)作為該試驗中的陽性對照組。
以降低百分率表示競爭能力,降低百分率之計算方式為:100%×[(在缺乏寡醣競爭劑下的MFI)-(在各別寡醣競爭劑存在下的MFI)]/(在缺乏寡醣競爭劑下的MFI)。
使用含有鼠類5D7-54.17之重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因之表現載體pcDNA5-FRT-hIgG1轉染Flp-In CHO細胞,且由該經轉染之Flp-In CHO細胞製造嵌合5D7-54.14(c5D7)抗體。下方表6示出該c5D7抗體之重鏈序列及輕鏈序列的胺基酸序列。
使c5D7抗體經由含有連接子的哌嗪(見下示結構)而與細胞毒性藥物單甲基海兔毒素10接合,藉以評估該抗體在活體內的抗癌效果。可使用如2012年12月21申請之美國專利臨時申請案第61/745,448號中所述的方法製造該ADC,且該案內容係以引用方式全文併入本文。在一實施例中,首先使用3.0當量的TCEP溶液與純化的c5D7抗體在37℃反應2小時以還原該純化的c5D7抗體,其中TCEP又稱三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine),且TCEP溶液中含0.025M之硼酸鈉(pH8)、0.025M之NaCl、1mM之二亞乙基三胺五醋酸(DTPA或稱pentetic acid或diethylene triamine pentaacetic acid)。使用在280奈米下具有1.346之吸光值定量該蛋白質濃度以獲得濃度為1.0毫克/毫升的溶液,並且以145194公克/莫耳的分子量算出莫耳濃度。使用DTNB(或稱5,5’-二硫雙-(2-硝基苯甲酸,5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid))進行滴定以測定所製成之mAb-半胱胺酸的硫醇濃度。通常,當使用3.0莫耳當量之TCEP會製造出4.0~4.5的硫醇/mAb比值。使用2.4莫耳濃度(molar)的順丁烯二醯亞胺乙醯基-單甲基海兔毒素10/mAb-半胱胺酸硫醇
(maleimidocaproyl-monomethyl dolastatin 10/mAb-systeine thiols)對該已部分還原的c5D7抗體進行烷化(alkylated)。該烷化反應於10℃下進行30分鐘。使用半胱胺酸(1mM之最終濃度)抑制任何未反應的過量順丁烯二醯亞胺乙醯基-單甲基海兔毒素10藥物。藉著在4℃下透析過夜而將所產生的ADC換到磷酸緩衝液中。
為建立皮下異種移植模型,係將5×106個DLD-1細胞植入C.B-17 SCID小鼠(台灣台北市,樂斯科生物科技股份有限公司(Lasco))的右側腹中。在腫瘤移植後的第1天和第5天以3毫克/公斤的用量以靜脈注射方式對小鼠施用藥物接合c5D7抗體之藥物抗體接合物(ADC)。使用卡尺於兩垂直方向上每週測量兩次腫瘤體積,並根據以下公式計算腫瘤體積:0.52×長×寬×高。
儘管以上藉由圖解說明和舉例方式相當詳細敘述本發明以期清楚理解本發明,然而該等敘述內容和實例不應用於限制本發明範圍。
<110>BIOALLIANCE C.V.
LIN,Shih-Yao
LIN,Leewen
TSAI,Yu-Ying
HUANG,Chiu-Chen
CHIANG,Feng-Lin
HSIEH,Yu-Chi
<120> ANTI-TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS USING SAME
<130> 606592000741
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 61/584,125
<151> 2012-01-06
<160> 19
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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Claims (54)
- 一種經分離之抗體,該抗體與非造血性癌細胞所表現之一輸鐵蛋白受器上的一碳水化合物專一性結合,但不會與活化T細胞或Jurkat細胞所表現之一輸鐵蛋白受器專一性結合,其中該抗體與該輸鐵蛋白受器的結合作用不會被一包含一Lea結構的碳水化合物抑制。
- 如請求項1所述之抗體,其中該抗體係一單株抗體。
- 如請求項2所述之抗體,其中該抗體與一包含一岩藻糖基團的抗原決定位結合。
- 如請求項2所述之抗體,其中該抗體與一包含一唾液酸基團(sialyl moiety)的抗原決定位結合。
- 如請求項2所述之抗體,其中該抗體與一不含一唾液酸基團的抗原決定位結合。
- 如請求項1至5之任一項所述的抗體,其中該抗體與該輸鐵蛋白受器的結合作用不會被一包含一Leb、Ley或Lex結構的碳水化合物抑制。
- 如請求項1至6之任一項所述的抗體,其中該抗體和一包 含一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區的抗體競爭與該輸鐵蛋白受器結合的機會,且其中該重鏈可變區包括源自序列編號:1的該三個互補決定區(CDR),及該輕鏈可變區包括源自序列編號:3的該三個CDR。
- 如請求項1所述之抗體,其中該抗體包含一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區,且該重鏈可變區包括源自序列編號:1的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:3的該三個CDR。
- 如請求項1所述的抗體,其中該抗體包含:(i)一重鏈可變區,該重鏈可變區包括與序列編號:1之第20~138個胺基酸有至少約95%相似度的一序列;及/或(ii)一輕鏈可變區,該輕鏈可變區包括與序列編號:3之第20~132個胺基酸有至少約95%相似度的一序列。
- 如請求項9所述之抗體,其中該抗體包含:一重鏈可變區且該重鏈可變區包括序列編號:1的第20~138個胺基酸;及/或一輕鏈可變區且該輕鏈可變區包括序列編號:3的第20~132個胺基酸。
- 如請求項1至6之任一項所述的抗體,其中該抗體和一包含一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區的抗體競爭與該輸鐵蛋白受器結合的機會,且其中該重鏈可變區包括源自序列編 號:5的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:7的該三個CDR。
- 如請求項1所述之抗體,其中該抗體包含一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區,且該重鏈可變區包括源自序列編號:5的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:7的該三個CDR。
- 如請求項1所述之抗體,其中該抗體包含:(i)一重鏈可變區,該重鏈可變區包括與序列編號:5之第20~138個胺基酸有至少約95%相似度的一序列;及/或(ii)一輕鏈可變區,該輕鏈可變區包括與序列編號:7之第21~128個胺基酸有至少約95%相似度的一序列。
- 如請求項13所述之抗體,其中該抗體包含:一重鏈可變區且該重鏈可變區包括序列編號:5的第20~138個胺基酸;及/或一輕鏈可變區且該輕鏈可變區包括序列編號:7的第21~128個胺基酸。
- 如請求項1至6之任一項所述的抗體,其中該抗體和一包含一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區的抗體競爭與該輸鐵蛋白受器結合的機會,且其中該重鏈可變區包括源自序列編號:9的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:11的該三個CDR。
- 如請求項1所述之抗體,其中該抗體包含一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區,且該重鏈可變區包括源自序列編號:9的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:11的該三個CDR。
- 如請求項1所述之抗體,其中該抗體包含:(i)一重鏈可變區,該重鏈可變區包括與序列編號:9之第20~136個胺基酸有至少約95%相似度的一序列;及/或(ii)一輕鏈可變區,該輕鏈可變區包括與序列編號:11之第21~134個胺基酸有至少約95%相似度的一序列。
- 如請求項17所述之抗體,其中該抗體包含:一重鏈可變區且該重鏈可變區包括序列編號:9的第20~136個胺基酸;及/或一輕鏈可變區且該輕鏈可變區包括序列編號:11的第21~134個胺基酸。
- 如請求項1至6之任一項所述的抗體,其中該抗體和一包含一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區的抗體競爭與該輸鐵蛋白受器結合的機會,且其中該重鏈可變區包括源自序列編號:13的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:15的該三個CDR。
- 如請求項1所述之抗體,其中該抗體包含一重鏈可變區 及/或一輕鏈可變區,且該重鏈可變區包括源自序列編號:13的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:15的該三個CDR。
- 如請求項1所述之抗體,其中該抗體包含:(i)一重鏈可變區,該重鏈可變區包括與序列編號:13之第20~138個胺基酸有至少約95%相似度的一序列;及/或(ii)一輕鏈可變區,該輕鏈可變區包括與序列編號:15之第23~130個胺基酸有至少約95%相似度的一序列。
- 如請求項21所述之抗體,其中該抗體包含:一重鏈可變區且該重鏈可變區包括序列編號:13的第20~138個胺基酸;及/或一輕鏈可變區且該輕鏈可變區包括序列編號:15的第23~130個胺基酸。
- 如請求項1至6之任一項所述的抗體,其中該抗體和一包含一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區的抗體競爭與該輸鐵蛋白受器結合的機會,且其中該重鏈可變區包括源自序列編號:17的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:18的該三個CDR。
- 如請求項1所述之抗體,其中該抗體包含一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區,且該重鏈可變區包括源自序列編號:17的該三個CDR,及該輕鏈可變區包括源自序列編號:18的該 三個CDR。
- 如請求項1所述之抗體,其中該抗體包含:(i)一重鏈可變區,該重鏈可變區包括與序列編號:17之第1~119個胺基酸有至少約95%相似度的一序列;及/或(ii)一輕鏈可變區,該輕鏈可變區包括與序列編號:18之第1~108個胺基酸有至少約95%相似度的一序列。
- 如請求項25所述之抗體,其中該抗體包含:一重鏈可變區且該重鏈可變區包括序列編號:17的第1~119個胺基酸;及/或一輕鏈可變區且該輕鏈可變區包括序列編號:18的第1~108個胺基酸。
- 如請求項1至26之任一項所述的抗體,其中該抗體係一人源化抗體(humanized antibody)。
- 如請求項1至27之任一項所述的抗體,其中該抗體係一嵌合抗體。
- 如請求項1至8、11、12、15、16、19、20、23和24之任一項所述的抗體,其中該抗體係一人類抗體(human antibody)。
- 如請求項1至29之任一項所述的抗體,其中該非造血性 癌細胞係胰臟癌細胞、胃癌細胞、大腸直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、攝護腺癌細胞、乳癌細胞或肝癌細胞。
- 如請求項1至30之任一項所述的抗體,其中該抗體不與CHO細胞、紅血球、血小板、HUVEC細胞、單核球、多形核白血球(PMN)或T細胞所表現的一輸鐵蛋白受器結合。
- 如請求項1至31之任一項所述的抗體,其中該抗體與該等癌細胞之細胞表面上的該輸鐵蛋白受器結合之後,該抗體被內化(internalized)。
- 如請求項1至32之任一項所述的抗體,其中在無需連接細胞毒素(cytotoxin conjugation)和無免疫效應子功能(immune effector function)的情況下,該抗體與該等癌細胞之細胞表面上的該輸鐵蛋白受器結合之後能誘發該等癌細胞的細胞凋亡。
- 如請求項1至33之任一項所述的抗體,其中該抗體與一細胞毒素連接。
- 如請求項1至34之任一項所述的抗體,其中該抗體與一標記連接。
- 一種藥學組合物,其包含如請求項1至35中任一項所述之抗體及一藥學上可接受之載劑。
- 一種聚核苷酸,其包含一編碼如請求項1至33項中任一項所述之抗體的核酸序列。
- 一種載體,其包含一編碼如請求項1至33中任一項所述之抗體的核酸序列。
- 一種包含請求項38所述之載體的宿主細胞。
- 一種製造一抗體的方法,包括:培養如請求項39所述之宿主細胞,該宿主細胞製造該抗體,及回收該宿主細胞所製造的該抗體。
- 一種治療一生物個體之非造血性癌症的方法,包括:對該生物個體施用一有效量之如請求項1至33中任一項所述的抗體。
- 如請求項41所述之方法,其中該非造血性癌症係胰臟癌、胃癌、大腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、攝護腺癌、子宮內膜癌、乳癌或肝癌。
- 如請求項41至42之任一項所述的方法,其中該抗體與 一細胞毒素連接。
- 一種治療一生物個體之非造血性癌症的方法,包括:對該生物個體施用一數量之如請求項1至33中任一項所述的抗體及一數量的另一抗癌劑,且藉由該抗體與該抗癌劑協同合作而為該生物個體提供有效癌症治療。
- 如請求項44所述之方法,其中該非造血性癌症係胰臟癌、胃癌、大腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、攝護腺癌、子宮內膜癌、乳癌或肝癌。
- 如請求項44或45所述之方法,其中該抗癌劑係一化學治療藥劑。
- 如請求項44至46之任一項所述的抗體,其中該抗體與一細胞毒素連接。
- 一種包含如請求項1至35中任一項所述之抗體的套組。
- 如請求項48所述之套組,進一步包括用於指示對該生物個體施用一有效量之該抗體以治療非造血性癌症的使用說明書。
- 如請求項48所述之套組,進一步包括用於指示對該生物 個體施用一數量之該抗體及一數量之另一抗癌劑以治療非造血性癌症並藉由該抗體與該抗癌劑協同合作而為該生物個體提供有效治療的使用說明書。
- 一種篩選能與非造血性癌細胞所表現之一輸鐵蛋白受器專一性結合之抗體的方法,包括以下步驟:a)提供多個抗體,並選出能與非造血性癌細胞所表現之一輸鐵蛋白受器專一性結合的一或多個抗體,及b)使用從步驟a)選出的該一或多個抗體以進一步選出不會與活化T細胞或Jurkat細胞所表現之一輸鐵蛋白受器專一性結合的抗體。
- 如請求項51所述之方法,其中該抗體與非造血性癌細胞所表現之該輸鐵蛋白受器上的一碳水化合物專一性結合。
- 如請求項51或52所述之方法,進一步包括以下步驟:選出在無需連接細胞毒素和無免疫效應子功能的情況下,抗體與該等癌細胞之細胞表面上的該輸鐵蛋白受器結合之後能夠誘發該等癌細胞之細胞凋亡的抗體。
- 如請求項51至53之任一項所述的方法,其中該非造血性癌細胞係胰臟癌細胞、胃癌細胞、大腸直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、攝護腺癌細胞、子宮內膜癌細胞、乳癌細胞或肝癌細胞。
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---|---|---|---|---|
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IL302822A (en) | 2015-11-12 | 2023-07-01 | Seagen Inc | Compounds interacting with glycans and methods of use |
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WO2017132486A1 (en) * | 2016-01-27 | 2017-08-03 | Siamab Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for targeting cancer stem cells |
MA45328A (fr) * | 2016-04-01 | 2019-02-06 | Avidity Biosciences Llc | Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci |
WO2018094143A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Siamab Therapeutics, Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
FR3062213B1 (fr) * | 2017-01-20 | 2021-02-26 | Endodiag | Utilisation du recepteur cd71 dans la detection et le traitement de l’endometriose |
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AU2018231127A1 (en) | 2017-03-09 | 2019-09-19 | Cytomx Therapeutics, Inc. | CD147 antibodies, activatable CD147 antibodies, and methods of making and use thereof |
MA51103A (fr) | 2017-12-06 | 2020-10-14 | Avidity Biosciences Inc | Compositions et procédés de traitement de l'atrophie musculaire et de la dystrophie myotonique |
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KR102258015B1 (ko) * | 2019-05-15 | 2021-05-27 | 강원대학교 산학협력단 | 암 줄기세포 세포막 단백질에 특이적인 항체 및 그 응용 |
KR102258014B1 (ko) * | 2019-05-15 | 2021-05-27 | 강원대학교 산학협력단 | 암 줄기세포 세포막 단백질에 특이적인 항체 및 그 응용 |
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US11555190B2 (en) | 2020-03-19 | 2023-01-17 | Avidity Biosciences, Inc. | Compositions and methods of treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy |
US11633498B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-04-25 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy |
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US11648318B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-05-16 | Dyne Therapeutics, Inc. | Anti-transferrin receptor (TFR) antibody and uses thereof |
US11771776B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-10-03 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies |
WO2023010004A1 (en) * | 2021-07-26 | 2023-02-02 | Cardone Michael H | Methods and compositions related to mcl-1 and bim heterodimer antibodies |
AU2022340568A1 (en) | 2021-09-01 | 2024-03-28 | Biogen Ma Inc. | Anti-transferrin receptor antibodies and uses thereof |
US11931421B2 (en) | 2022-04-15 | 2024-03-19 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009502123A (ja) * | 2005-07-08 | 2009-01-29 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | Sp35抗体およびその使用 |
US8043620B2 (en) * | 2007-11-21 | 2011-10-25 | Amgen Inc. | Wise binding agents and epitopes |
-
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI726879B (zh) * | 2015-05-04 | 2021-05-11 | 美商Cytomx生物製藥公司 | 抗cd71抗體類、可活化之抗cd71抗體類及使用彼等之方法 |
US11267896B2 (en) | 2015-05-04 | 2022-03-08 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Anti-CD71 antibodies, activatable anti-CD71 antibodies, and methods of use thereof |
TWI787796B (zh) * | 2015-05-04 | 2022-12-21 | 美商Cytomx生物製藥公司 | 抗cd71抗體類、可活化之抗cd71抗體類及使用彼等之方法 |
CN116121306A (zh) * | 2023-03-27 | 2023-05-16 | 迦进生物医药(上海)有限公司 | 一种human TfR1高表达的稳转细胞株及其构建方法和应用 |
CN116179607A (zh) * | 2023-03-27 | 2023-05-30 | 迦进生物医药(上海)有限公司 | 一种human TfR2高表达的稳转细胞株及其构建方法和应用 |
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