CN114231567B

CN114231567B - 一种人肺特络细胞系构建方法

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Publication number: CN114231567B
Application number: CN202111531041.XA
Authority: CN
Inventors: 宋东莉; 王向东
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: CN114231567A

Abstract

本发明涉及一种人肺特络细胞系构建方法，属于生物医药技术领域。本发明通过将携带TERT基因和CDK4基因的慢病毒转染原代人肺特络细胞；再将经鉴定稳定转染TERT和CDK4的人肺特络细胞再连续传代培养超过50代后，得到稳定的人肺特络细胞系。通过本发明获得的特络细胞可用于对急慢性疾病、肿瘤等发病机制和干预的基础研究，可用于与自身或其他细胞类型的细胞间通讯和相互作用的研究等；为临床新药筛选及药物治疗机理研究提供细胞模型，为后续的研究做储备。

Description

一种人肺特络细胞系构建方法

技术领域

本发明涉及一种人肺特络细胞系构建方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

目前研究特络细胞的功能是使用不同种属动物(如小鼠、大鼠、猪等)的不同器官(肺脏、肾脏、心脏等)原代提取的特络细胞，提取过程耗时且每次提取都需要进行分离纯化和鉴定，需要投入大量的人力物力。由于多次分离和提取原代细胞是由不同的人员进行，因此难以保证提取细胞的纯度和稳定性。如何保证细胞纯度、并使细胞可长期传代、保证细胞的稳定性(避免批次差异)用于临床应用研究和基础研究，以及用于干细胞发育分化等领域的研究，成为本技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为解决如何获得人肺特络细胞系的技术问题。

为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种人肺特络细胞系构建方法，包括以下步骤：

步骤1：采取分阶段贴壁法提取原代特络细胞，取手术后废弃组织提取原代人肺特络细胞；

步骤2：采取流式细胞术标记特络细胞，在原代人肺特络细胞培养液中加入vimentin、CD34和PDGFRα抗体；

步骤3：流式细胞术分选获得CD34⁺PDGFRα⁺vimentin⁺特络细胞；

步骤4：构建永生化的人肺特络细胞系；将携带TERT基因和CDK4基因的慢病毒转染原代人肺特络细胞；鉴定稳定转染TERT和CDK4的人肺特络细胞；再连续传代培养超过50代后，得到稳定的人肺特络细胞系。

本发明提供一种由上述人肺特络细胞系构建方法构建的一种人肺特络细胞系，细胞株已于2021年11月2日在中国典型培养物保藏中心保藏，培养物名称为人肺特络细胞系hTC-S1011，保藏编号为CCTCC NO:C2021275。

一种人肺特络细胞系构建方法，包括以下步骤：

1.提取原代特络细胞时采取分阶段贴壁法：取手术后废弃组织，无菌条件下在生理盐水中剪成约1mm³的组织块，置于1-5mg/mlⅡ型胶原酶中，35-40℃摇床消化20-40分钟，70微米孔径滤网过滤后，1000-2000rpm离心5-10分钟，弃上清，收集细胞沉淀，在含有10％FBS，10-40ng/mlEGF和/或FGF的DMEM/F12培养液中培养30分钟，待成纤维细胞贴壁后，将上清转移至另一培养皿，培养10-14小时后换液，继续培养3-5天后显微镜下观察特络细胞。

所述的培养液为：DMEM/F12培养基中加入10％体积分数的FBS、10-40ng/mL的表皮细胞生长因子(Recombinant Human Epidermal Growth Factor，EGF)和/或成纤维细胞生长因子(Recombinant Human fibroblast growth factor,FGF)、2mol/L的谷氨酰胺和100mg/ml的青霉素/链霉素。

2.流式细胞术标记特络细胞特异性标志物：CD34⁺PDGFRα⁺vimentin⁺特络细胞：将原代人肺特络细胞培养至70-90％的细胞密度，用消化液消化细胞至70-90％变圆，用无菌滴管吸取培养液吹打细胞，70微米孔径滤网过滤后，800-1200rpm，5min室温离心；弃去离心后的上清，用流式染色缓冲液重悬细胞并计算细胞活力；补充缓冲液，加入vimentin、CD34和PDGFRα抗体各5微升，2-8℃避光孵育30-40分钟，加入流式染色缓冲液，离心后去掉抗体；弃去离心后的上清，按10⁷细胞每mL的密度补充流式染色缓冲液，以备流式分选。

所述的消化液为：含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的胰蛋白酶-EDTA消化液。

所述的流式染色缓冲液为：酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中加入1.5％体积的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)。

3.流式细胞术分选CD34⁺PDGFRα⁺vimentin⁺特络细胞：准备空白对照管和单染管，设置合适的液滴延迟、电压和荧光补偿后，对CD34⁺PDGFRα⁺vimentin⁺特络细胞设门，取2mL无菌培养液加入无菌15mL离心管，置于收集槽，进行流式分选。

4.根据形态和免疫标记鉴定：分选后，进行特征性结构telopode的观察和免疫标记鉴定特络细胞。共聚焦显微镜下观察到CD34和vimentin表达阳性。免疫胶体金颗粒染色后，电镜下观察到特络细胞vimentin、CD34和/或PDGFRα表达阳性。

5.构建永生化的人肺特络细胞系：

5.1包装携带TERT基因的慢病毒：取293T细胞接种于含FBS无抗性DMEM培养液中，CO₂培养箱中培养20-30h，当细胞密度达到40-60％时，将转染复合物逐滴加入；培养14h-18h后，吸出原有培养基，更换加入含有10％体积分数的FBS、0.01mol/L胆固醇、0.01mol/L蛋黄卵磷脂和chemically defined lipid concentrated的Advanced DMEM病毒包装液，继续培养约48h后，收集细胞上清，得到慢病毒上清液；

所述的转染复合物为：将包装质粒pLP/PsPAX、pLP/VSVG和质粒CMV-MCS(PHY-001)载体混合后加入Opti-MEM培养液中，然后加入转染试剂Turbofect，混匀放置20min。

5.2.包装携带CDK4基因的慢病毒

包装携带CDK4基因的慢病毒：取293T细胞接种于含FBS无抗性DMEM培养液中，CO₂培养箱中培养20-30h，当细胞密度达到40-60％时，将转染复合物逐滴加入；培养14h-18h后，吸出原有培养基，更换加入含有10％体积分数的FBS、0.01mol/L胆固醇、0.01mol/L蛋黄卵磷脂和chemically defined lipid concentrated的Advanced DMEM病毒包装液，继续培养约48h后，收集细胞上清，得到慢病毒上清液；

5.3待原代人肺特络细胞融合度达到40-60％，将收集到的慢病毒上清液与上述DMEM/F12培养液按1：1的体积比例换入人肺特络细胞；转染6小时后，换入新的DMEM/F12培养液；待细胞融合度达到80-95％时传代培养，鉴定稳定转染TERT和CDK4的人肺特络细胞。在37℃、5％CO₂条件下连续传代培养超过50代后，得到稳定的人肺特络细胞系。

6.连续培养至50代，并根据形态和免疫标记鉴定：进行特异性结构telopode的观察和免疫标记鉴定特络细胞。共聚焦显微镜下观察到vimentin、CD34和PDGFRα表达阳性。免疫胶体金颗粒染色后，电镜下观察到特络细胞vimentin、CD34和PDGFRα表达阳性。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

目前已经证明小鼠肺特络细胞在小鼠急性肺损伤模型和哮喘模型中起到明显的作用，细胞实验证明小鼠肺特络细胞系可以调节免疫细胞功能。本发明的前期研究也发现小鼠肺特络细胞系在对减轻急性肺损伤小鼠模型肺部炎症、促进血管内皮细胞增殖和抑制其凋亡中具有明显的功效。但由于原代人肺特络细胞提取非常困难，极大地限制了对人特络细胞的进一步研究。同时，其体外扩增困难，容易分化等问题，限制了对人特络细胞的基础研究和未来可能的临床研究和应用。

体内情况下，大多数体细胞端粒酶的表达是严格调控的，表达是瞬时和低水平的。在原代细胞中稳定表达人TERT基因能有效激活目的细胞端粒酶，维持端粒长度，从而使细胞获得持续增殖的能力。但对于人特络细胞，重建端粒酶活性并不足以使细胞永生化，因此本发明中同时转染了CDK4基因，使得细胞可以持续的分裂且不发生细胞类型的转化。本发明将解决目前人特络细胞进一步研究的瓶颈，为未来对特络细胞作用机制的研究和可能的临床应用提供可能。

通过本发明获得的特络细胞可用于对急慢性疾病、肿瘤等发病机制和干预的基础研究，可用于与自身或其他细胞类型的细胞间通讯和相互作用的研究等；未来还可能用于临床治疗。

保藏信息

2021年11月2日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，中国典型培养物保藏中心的地址位于：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，武汉大学保藏中心，邮编：430072，培养物名称为人肺特络细胞系hTC-S1011，保藏编号为CCTCC NO:C2021275

附图说明

图1为原代人肺特络细胞的鉴定相关图；

其中A图为显微镜下观察并记录特络细胞特征性结构telopode(↑，200×)；B图为应用免疫荧光法标记，并在激光共聚焦显微镜下鉴定图；

图2为原代人肺特络细胞的免疫电镜鉴定图；

其中CD34-20nm标记为“↑”；vimentin-10nm标记为“▲”；PDGFRα-10nm标记为

图3为人肺特络细胞TERT基因(A图)和CDK4基因(B图)的表达鉴定图；

图4为原代人肺特络细胞及传代的永生化的人肺特络细胞增值曲线图；

图5为传代的永生化人肺特络细胞光镜下的形态和特征性结构telopode(↑，200×)。

图6为免疫荧光法标记永生化的人肺特络细胞第2代、第5代、第10代、第20代、第30代和第50代细胞的相关免疫标记物vimentin和CD34的表达，并在激光共聚焦显微镜下图。

其中A图为永生化的人肺特络细胞第2代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达；B图为永生化的人肺特络细胞第5代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达；C图为永生化的人肺特络细胞第10代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达；D图为永生化的人肺特络细胞第20代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达；E图为永生化的人肺特络细胞第30代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达；F图为永生化的人肺特络细胞第50代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达。其中DAPI(蓝色)标记细胞核；FITC(绿色)标记显示了vimentin的表达；keyfluor594(红色)标记显示了CD34的表达；APC(紫色)标记显示了PDGFRα。

图7为免疫电镜鉴定特络细胞系第2代(G2)、第5代(G5)、第10代(G10)、第30代(G30)和第50代(G50)细胞的相关免疫标记物vimentin、CD34、PDGFRα的表达。免疫标志物和对应的免疫胶体金颗粒大小分别为CD34-20nm标记为“↑”；vimentin-10nm标记为“▲”；PDGFRα-10nm标记为

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：

如图1-7所示，本发明提供一种人肺特络细胞系构建方法，包括以下步骤：

步骤3：流式细胞术分选获得vimentin⁺CD34⁺PDGFRα⁺特络细胞；

实施例

本发明提供一种人肺特络细胞系构建方法，包括以下步骤：

1.提取原代特络细胞时采取分阶段贴壁法：取手术后废弃组织，无菌条件下在生理盐水中剪成1mm³的组织块，置于2mg/mlⅡ型胶原酶中37℃摇床消化30分钟，70微米孔径滤网过滤后，1500rpm离心5分钟，弃上清，收集细胞沉淀，在含有10％FBS，10-40ng/ml的EGF和/或FGF、2mol/L的谷氨酰胺和100mg/ml的青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液中培养30分钟，待成纤维细胞贴壁后，将上清转移至另一培养皿，培养12小时后换液，继续培养3-5天后显微镜下观察特络细胞。

2.流式细胞术标记特络细胞特异性标志物：CD34⁺vimentin⁺PDGFRα⁺特络细胞：将原代人肺特络细胞培养至80％的细胞密度，用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞至80％变圆，用无菌滴管吸取培养液吹打细胞，75微米孔径滤网过滤后，1000rpm，5min室温离心；弃去离心后的上清，用流式染色缓冲液(PBS中加入1.5％体积的BSA)重悬细胞并计算细胞活力；将缓冲液补足100微升体积，加入vimentin、CD34和PDGFRα抗体各5微升，4℃避光孵育30分钟，加入1mL流式染色缓冲液，1000rpm，5min，4℃离心；弃去离心后的上清，按10⁷细胞每mL的密度补充流式染色缓冲液，以备流式分选。

3.流式细胞术分选vimentin⁺CD34⁺PDGFRα⁺特络细胞：准备空白对照管和单染管，设置合适的液滴延迟、电压和荧光补偿后，对vimentin⁺CD34⁺PDGFRα⁺特络细胞设门，取2mL无菌培养液加入无菌15mL离心管，置于收集槽，进行流式分选。

4.根据形态和免疫标记鉴定：分选后，进行特异性结构telopode的观察鉴定和免疫标记鉴定特络细胞。共聚焦显微镜下应观察到vimentin、CD34和/或PDGFRα表达。电镜下观察特络细胞超微结构。免疫胶体金颗粒染色后，电镜下观察到特络细胞vimentin、CD34和/或PDGFRα表达。

5.过表达慢病毒载体的构建；

首先分别设计TERT和CDK 4合成引物，分别扩增目的片段，再通过其两端所含酶切位点将TERT或CDK 4连入酶切后的过表达慢病毒载体上；分别将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的目的基因过表达慢病毒载体。

5.1材料

A.试剂

试剂名称试剂来源

PCR用试剂primer(R&F)生工生物工程(上海)有限公司

Taq polymerase NEB

QIAGEN Plasmid大抽Kit QIAGEN

BSA Sigma

LB or SOB or SOC Alpha aeser

CaCL2 Sigma

T4 DNA ligase Fermentas

T4 DNA ligase buffer Fermentas

MgSO4 Sigma

琼脂糖Bio-Rad

DNA ladder Fermentas

Positive clone测序Invitrogen

内切酶1 Fermentas

内切酶2 Fermentas

B.仪器

仪器名称仪器来源

稳压电泳仪Bio-Rad

凝胶成像仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司

细菌摇床：上海一恒科学仪器有限公司

细菌培养箱：上海一恒科学仪器有限公司

PCR仪：Eppendorf

高速离心机：Thermo

一次性平皿：江苏海门实验器材部

1L烧瓶：蜀牛

50mL聚丙烯管：Corning

移液器：Gilson

5.2方法

A.设计并合成引物

1)根据基因名在NCBI中找到相应的目的基因序列。

2)确定所用载体为。载体名称为PHY-801，载体原件为EF1A-SV40-IRES-puro。

3)用序列分析软件找出目的序列中存在的限制性内切酶，并对应使用的载体确定引物两端的酶切位点BamH I和Xba I。

4)利用引物设计软件设计引物，并在5’端加入确定好的酶切位点(寡聚单链DNA序列5’to 3’)。

TERT引物序列为：

TERT-F:ctaccggactcagatctcgagGCCACC ATGCCGCGCGCTCCCCGCT

TERT-R:TtgttccagacgcgtggatccTCAGTCCAGGATGGTCTTGAAG

CDK4引物序列为：

CDK4-F:ctaccggactcagatctcgagGCCACCATGGCTACCTCTCGATATGAGC

CDK4-R:ttgttccagacgcgtggatccTCACTCCGGATTACCTTCATC

5)将设计好的引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

B.载体的双酶切

1)将含载体质粒的菌液过夜培养，并取新鲜菌液3-5mL提取质粒。具体方法参考QIAGEN质粒小抽说明书。

2)取1μg新鲜质粒，用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切体系如下：载体1μg

green Buffer 3μL

内切酶1 1.5μL

内切酶2 1.5μL

ddH2O补足30μL

于37℃酶切约3h。

3)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg＝100μL来计算凝胶的体积，并加入3倍凝胶体积的QG buffer置于50℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。

4)等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。

5)将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30s。(可重复一次)然后弃掉管内液体，向柱内加入750μL的PE buffer。离心1min.。弃掉管内液体，再次空离2min。换一个新的1.5mL的EP管，向柱子内加入20μL的ddH2O，离心1min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的载体片段，并测定浓度。

C.目的片段的扩增及酶切：

(1)将合成的TERT和CDK4引物分别稀释成终浓度为10μmol/L的储藏液。

(2)分别利用稀释的引物及模板进行PCR扩增。体系如下：

模板1-2μg

引物F 2μL

引物R 2μL

PCR mix 25μL

ddH2O补足50μL

将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入PCR仪内，选择好合适的退火温度和延伸温度，即可开始PCR扩增。

(3)PCR结束后分别进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的基因。方法同上。

(4)将回收后的目的基因分别进行双酶切，酶切体系如下：

PCR回收产物0.7μg

green Buffer 5μL

内切酶1 2.5μL

内切酶2 2.5μL

ddH2O补足50μL

于37℃酶切约5h或者过夜。

(5)将酶切产物分别进行琼脂糖电泳并回收目的片段，方法同上。

D.过表达载体与目的片段的连接

(1)测定回收载体和目的片段的浓度，并按载体：目的片段＝1:7的摩尔比例计算载体和目的片段所需的体积比。

(2)分别将TERT和CDK 4过表达载体与目的片段的连接，连接体系如下：

回收载体160ng

目的片段80ng

5×CE Entry Buffer 4μL

Exnase entry 2μL

ddH2O补足20μL

于37℃连接30min后，立即置于5℃冰水浴冷却。

D.转化

(1)将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μL连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min。

(2)之后于42℃水浴中热击90s。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。

(3)加入500μL不含抗生素的SOC培养基于37℃，225rpm振荡培养45min。

(4)3000rpm离心2min，弃掉900μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性(氨苄或卡那等)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀(涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体)，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。

E.PCR鉴定

(1)挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。

(2)进行菌液PCR初步鉴定，方法同上步骤3，只将模板替换成新鲜菌液2-3μL。

(3)将初步鉴定为阳性的样品，每个克隆挑选两个送测序公司进行测序鉴定。

6.构建永生化的人肺特络细胞系：

6.1包装携带TERT基因的慢病毒：

用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(packaging mix)共转染慢病毒包装细胞，包被病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度。

实验流程：抽提高纯度、无内毒素的过表达慢病毒载体及其辅助包装原件载体质粒，使用transgene reagent将构建好的过表达慢病毒载体及其辅助包装原件载体质粒共转染进慢病毒包装细胞，转染12h后加Enhancing buffer，接着4h后更换新鲜培养基，继续培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。

A、实验材料

1.细胞株

慢病毒的包装细胞：293T，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

2.菌株

大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

3.慢病毒包装系统

将构建成功的慢病毒重组质粒和包装质粒采用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取。所得的质粒DNA溶于无菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。

4.试剂

试剂名称	试剂来源
		台盼兰	上海生工生物工程有限公司
胎牛血清	GIBCO
		DMSO	sigma
DMEM	GIBCO
		胰酶	GIBCO
Polyethylenimine，liner，MW-25000	cat#23966

5.仪器

仪器名称	仪器来源
		荧光显微镜	奥林巴斯
CO₂培养箱	Thermo
		生物安全柜	Thermo
离心超滤装置	MILLIPORE

B.方法

1.慢病毒包装

1)细胞分盘

转染前一天，将已经长好的细胞以合适的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到80％-90％时准备转染。

2)转染前换液

转染前1-2h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，10mL/10cm皿。

3)转染

取无菌的1.5mL EP管，转染体系按下表：

Opti-MEM	1mL
		Lenti-v	15μg
PA	3μg
		PB	9μg
Polyethylenimine(1mg/mL)	67.5μL

混匀后，室温放置15min-20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于CO₂培养箱中培养。

4)加Enhancing buffer

转染12h后，均匀滴加100×Enhancing buffer促进转染。

5)换液

转染18-20h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15mL新鲜的细胞培养基(含2％血清的DMEM)继续培养。

6)病毒收集

换液48h后，吸取细胞上清液于50mL离心管，4℃，4500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到centrifugal filter devices中，4℃，4500g，离心10min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃，4500g，离心20min，此时可见滤器上层中的液体即为病毒浓缩液。

7)病毒分装与保存

将病毒以50μL分装，保存于-80℃。

2.滴度测定

1)RT-PCR分析整合的拷贝数

病毒检测分别取0.1μL质粒标准品和待测样品基因组DNA，另留1个孔加入无菌水做为无模板对照(no-template control)。每个样品重复1次。基因组检测分别取0.1μL基因组标准品和待测样品基因组DNA，另留1个孔加入无菌水做为无模板对照(no-templatecontrol)。每个样品重复1次。RT-PCR循环条件设定为：95℃5min，然后是95℃15s，60℃1min的40个循环。

2)滴度测定

测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度(integration units per mL，IU mL-1)的计算公式如下：IU mL-1＝(C×N×D×1000)/V。其中：C＝平均每基因组整合的病毒拷贝数；N＝感染时细胞的数目；D＝病毒载体的稀释倍数＝10；V＝加入的稀释病毒的体积数(0.5μL，5μL，50μL和100μL)。滴度跨度为:10⁷-10⁹。

6.3过表达稳转株的构建

将经鉴定的纯化的原代人肺特络细胞分为3组：原代人肺特络细胞组(细胞不转染)、NC组(空载体Lenti转染对照组)和人肺特络细胞系组(重组慢病毒表达载体TERT和CDK4转染组)。以合适的比例(聚合度约为50％左右)接种靶细胞于6孔板中。24h后，感染前，将带有TERT的病毒和CDK 4的病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含感染增强剂8μg/mL Polybrene的新鲜培养基稀释病毒原液，吸除6孔板里旧培养基，加含有慢病毒稀释液到靶细胞中，6小时后换液。此慢病毒载体带有puromycin抗性，向细胞中加入2μg/mLpuromycin，37℃，5％CO₂，常规培养24h，用以筛选稳转株。更换DMEM继续培养，细胞聚合度约为80％-90％时，传到培养瓶中。第五天，感染效率检测：收稳转株后，通过RT-qPCR验证感染效率。

2.目的片段的扩增及验证

(1)使用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒并参照试剂盒操作规程提取各组细胞中的RNA。首先以OLIGO六聚体为逆转录引物，提取各组细胞中的总RNA为模板，在反转录酶催化下反转录出cDNA。体系为：RNA模板500ng,5×缓冲液2μL,primerscript RT Enzymemix I0.5μL,10μmol/L 50μM OLIGO六聚体0.5μL,100μM Random 6mers 0.5μL,DEPC水补足10μL。37℃15min。

(2)以合成的cDNA为模版，TERT或CDK4基因上下游引物进行PCR扩增。扩增后产物电泳观察结果，重组慢病毒表达载体TERT或CDK4转染组出现条带，初步确定为相应基因的扩增产物，其他两组未出现条带。

TERT引物序列为：

TERT-F:ctaccggactcagatctcgagGCCACC ATGCCGCGCGCTCCCCGCT

TERT-R:TtgttccagacgcgtggatccTCAGTCCAGGATGGTCTTGAAG

CDK4引物序列为：

CDK4-F:ctaccggactcagatctcgagGCCACCATGGCTACCTCTCGATATGAGC

CDK4-R:ttgttccagacgcgtggatccTCACTCCGGATTACCTTCATC

待原代人肺特络细胞融合度达到50％，将收集到的慢病毒上清液与DMEM/F12培养液按1：1的体积比例换入人肺特络细胞；转染6小时后，换入新的DMEM/F12培养液；待细胞融合度达到80-95％时传代培养。在37℃、5％CO₂条件下连续传代培养超过50代后，得到稳定转染TERT和CDK4的人肺特络细胞。

7.连续培养至50代以上，并根据特征性形态和免疫标记物的表达进行鉴定：在显微镜下观察特络细胞特异性结构telopode并拍照。进行免疫标记物标记，荧光鉴定特络细胞，激光共聚焦显微镜下观察到vimentin、CD34和/或PDGFRα表达阳性。免疫胶体金颗粒染色后，电镜下观察到特络细胞vimentin、CD34和/或PDGFRα表达阳性。

实验结果：

1、对原代人肺特络细胞的鉴定：

如图1所示，显微镜下观察并记录特络细胞特征性结构telopode(↑，如图1A图，200×)；应用免疫荧光法标记，并在激光共聚焦显微镜下鉴定。结果显示特络细胞相关的免疫标记物CD34，vimentin和PDGFRα有表达，其中keyfluor594(红色)标记显示了CD34的表达，FITC(绿色)标记显示了vimentin的表达，APC(紫色)标记显示了PDGFRα，DAPI(蓝色)标记细胞核。

如图2所示，免疫电镜鉴定特络细胞相关的免疫标记物vimentin、CD34和PDGFRα的表达。免疫电镜下可见特络细胞相关的免疫标记物vimentin、CD34和PDGFRα的表达。免疫标志物和对应的免疫胶体金颗粒大小分别为CD34-20nm；vimentin-10nm；PDGFRα-10nm。

2、对转染TERT基因和CDK4基因的鉴定

2.1对含有TERT基因的质粒测序结果如下：

gtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgactctactagaggatcgctagcgctaccggactcagatctcgaggccaccATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGAGCCGTGCGCTCCCTGCTGCGCAGCCACTACCGCGAGGTGCTGCCGCTGGCCACGTTCGTGCGGCGCCTGGGGCCCCAGGGCTGGCGGCTGGTGCAGCGCGGGGACCCGGCGGCTTTCCGCGCGCTGGTGGCCCAGTGCCTGGTGTGCGTGCCCTGGGACGCACGGCCGCCCCCCGCCGCCCCCTCCTTCCGCCAGGTGTCCTGCCTGAAGGAGCTGGTGGCCCGAGTGCTGCAGAGGCTGTGCGAGCGCGGCGCGAAGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCGCGCTGCTGGACGGGGCCCGCGGGGGCCCCCCCGAGGCCTTCACCACCAGCGTGCGCAGCTACCTGCCCAACACGGTGACCGACGCACTGCGGGGGAGCGGGGCGTGGGGGCTGCTGCTGCGCCGCGTGGGCGACGACGTGCTGGTTCACCTGCTGGCACGCTGCGCGCTCTTTGTGCTGGTGGCTCCCAGCTGCGCCTACCAGGTGTGCGGGCCGCCGCTGTACCAGCTCGGCGCTGCCACTCAGGCCCGGCCCCCGCCACACGCTAGTGGACCCCGAAGGCGTCTGGGATGCGAACGGGCCTGGAACCATAGCGTCAGGGAGGCCGGGGTCCCCCTGGGCCTGCCAGCCCCGGGTGCGAGGAGGCGCGGGGGCAGTGCCAGCCGAAGTCTGCCGTTGCCCAAGAGGCCCAGGCGTGGCGCTGCCCCTGAGCCGGAGCGGACGCCCGTTGGGCAGGGGTCCTGGGCCCACCCGGGCAGGACGCGTGGACCGAGTGACCGTGGTTTCTGTGTGGTGTCACCTGCCAGACCCGCCGAAGAAGCCACCTCTTTGGAGGGTGCGCTCTCTGGCACGCGCCACTCCCACCCATCCGTGGGCCGCCAGCACCACGCGGGCCCCCCATCCACATCGCGGCCACCACGTCCCTGGGACACGCCTTGTCCCCCGGTGTACGCCGAGACCAAGCACTTCCTCTACTCCTCAGGCGACAAGGAGCAGCTGCGGCCCTCCTTCCTACTCAGCTCTCTGAGGCCCAGCCTGACTGGCGCTCGGAGGCTCGTGGAGACCATCTTTCTGGGTTCCAGGCCCTGGATGCCAGGGACTCCCCGCAGGTTGCCCCGCCTGCCCCAGCGCTACTGGCAAATGCGGCCCCTGTTTCTGGAGCTGCTTGGGAACCACGCGCAGTGCCCCTACGGGGTGCTCCTCAAGACGCACTGCCCGCTGCGAGCTGCGGTCACCCCAGCAGCCGGTGTCTGTGCCCGGGAGAAGCCCCAGGGCTCTGTGGCGGCCCCCGAGGAGGAGGACACAGACCCCCGTCGCCTGGTGCAGCTGCTCCGCCAGCACAGCAGCCCCTGGCAGGTGTACGGCTTCGTGCGGGCCTGCCTGCGCCGGCTGGTGCCCCCAGGCCTCTGGGGCTCCAGGCACAACGAACGCCGCTTCCTCAGGAACACCAAGAAGTTCATCTCCCTGGGGAAGCATGCCAAGCTCTCGCTGCAGGAGCTGACGTGGAAGATGAGCGTGCGGGACTGCGCTTGGCTGCGCAGGAGCCCAGGGGTTGGCTGTGTTCCGGCCGCAGAGCACCGTCTGCGTGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTGTGTACGTCGTCGAGCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATGTCACGGAGACCACGTTTCAAAAGAACAGGCTCTTTTTCTACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTGCAAAGCATTGGAATCAGACAGCACTTGAAGAGGGTGCAGCTGCGGGAGCTGTCGGAAGCAGAGGTCAGGCAGCATCGGGAAGCCAGGCCTGCCCTGCTGACGTCCAGACTCCGCTTCATCCCCAAGCCTGACGGGCTGCGGCCGATTGTGAACATGGACTACGTCGTGGGAGCCAGAACGTTCCGCAGAGAAAAGAGGGCCGAGCGTCTCACCTCGAGGGTGAAGGCACTGTTCAGCGTGCTCAACTACGAGCGGGCGCGGCGCCCCGGCCTCCTGGGCGCCTCTGTGCTGGGCCTGGACGATATCCACAGGGCCTGGCGCACCTTCGTGCTGCGTGTGCGGGCCCAGGACCCGCCGCCTGAGCTGTACTTTGTCAAGGTGGATGTGACGGGCGCGTACGACACCATCCCCCAGGACAGGCTCACGGAGGTCATCGCCAGCATCATCAAACCCCAGAACACGTACTGCGTGCGTCGGTATGCCGTGGTCCAGAAGGCCGCCCATGGGCACGTCCGCAAGGCCTTCAAGAGCCACGTCTCTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCAGGAGACCAGCCCGCTGAGGGATGCCGTCGTCATCGAGCAGAGCTCCTCCCTGAATGAGGCCAGCAGTGGCCTCTTCGACGTCTTCCTACGCTTCATGTGCCACCACGCCGTGCGCATCAGGGGCAAGTCCTACGTCCAGTGCCAGGGGATCCCGCAGGGCTCCATCCTCTCCACGCTGCTCTGCAGCCTGTGCTACGGCGACATGGAGAACAAGCTGTTTGCGGGGATTCGGCGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACCCACGCGAAAACCTTCCTCAGGACCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAGTATGGCTGCGTGGTGAACTTGCGGAAGACAGTGGTGAACTTCCCTGTAGAAGACGAGGCCCTGGGTGGCACGGCTTTTGTTCAGATGCCGGCCCACGGCCTATTCCCCTGGTGCGGCCTGCTGCTGGATACCCGGACCCTGGAGGTGCAGAGCGACTACTCCAGCTATGCCCGGACCTCCATCAGAGCCAGTCTCACCTTCAACCGCGGCTTCAAGGCTGGGAGGAACATGCGTCGCAAACTCTTTGGGGTCTTGCGGCTGAAGTGTCACAGCCTGTTTCTGGATTTGCAGGTGAACAGCCTCCAGACGGTGTGCACCAACATCTACAAGATCCTCCTGCTGCAGGCGTACAGGTTTCACGCATGTGTGCTGCAGCTCCCATTTCATCAGCAAGTTTGGAAGAACCCCACATTTTTCCTGCGCGTCATCTCTGACACGGCCTCCCTCTGCTACTCCATCCTGAAAGCCAAGAACGCAGGGATGTCGCTGGGGGCCAAGGGCGCCGCCGGCCCTCTGCCCTCCGAGGCCGTGCAGTGGCTGTGCCACCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGACACCGTGTCACCTACGTGCCACTCCTGGGGTCACTCAGGACAGCCCAGACGCAGCTGAGTCGGAAGCTCCCGGGGACGACGCTGACTGCCCTGGAGGCCGCAGCCAACCCGGCACTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTGAggatccacgcgtctggaacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccc

2.2对含有CDK4基因的质粒测序结果如下：

cctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgactctactagaggatcgctagcgctaccggactcagatctcgaggccaccATGGCTGCCACTCGATATGAACCCGTGGCTGAAATTGGTGTCGGTGCCTATGGGACGGTGTACAAAGCCCGAGATCCCCACAGTGGCCACTTTGTGGCCCTCAAGAGTGTGAGAGTTCCTAATGGAGGAGCAGCTGGAGGGGGCCTTCCCGTCAGCACAGTTCGTGAGGTGGCCTTGTTAAGGAGGCTGGAGGCCTTTGAACATCCCAATGTTGTACGGCTGATGGATGTCTGTGCTACTTCCCGAACTGATCGGGACATCAAGGTCACCCTAGTGTTTGAGCATATAGACCAGGACCTGAGGACATACCTGGACAAAGCACCTCCACCGGGCCTGCCGGTTGAGACCATTAAGGATCTAATGCGTCAGTTTCTAAGCGGCCTGGATTTTCTTCATGCAAACTGCATTGTTCACCGGGACCTGAAGCCAGAGAACATTCTAGTGACAAGTAATGGGACCGTCAAGCTGGCTGACTTTGGCCTAGCTAGAATCTACAGCTACCAGATGGCCCTCACGCCTGTGGTGGTTACGCTCTGGTACCGAGCTCCTGAAGTTCTTCTGCAGTCTACATACGCAACACCCGTGGACATGTGGAGCGTTGGCTGTATCTTTGCAGAGATGTTCCGTCGGAAGCCTCTCTTCTGTGGAAACTCTGAAGCCGACCAGTTGGGGAAAATCTTTGATCTCATTGGATTGCCTCCAGAAGACGACTGGCCTCGAGAGGTATCTCTACCTCGAGGAGCCTTTGCCCCCAGAGGGCCTCGGCCAGTGCAGTCAGTGGTGCCAGAGATGGAGGAGTCTGGAGCGCAGCTGCTACTGGAAATGCTGACCTTTAACCCACATAAGCGAATCTCTGCCTTCCGAGCCCTGCAGCACTCCTACCTGCACAAGGAGGAAAGCGACGCAGAGTGAggatccacgcgtctggaacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgt

如图3所示，为琼脂糖凝胶电泳鉴定转染TERT基因和CDK4基因后，人肺特络细胞TERT基因(A图)和CDK4基因(B图)的表达。

3、对持续传代的永生化人肺特络细胞仍具有稳定的增殖能力的鉴定(生长曲线测定)：

取未转染的原代人肺特络细胞和传代的永生化的人肺特络细胞(第2代、第5代、第10代、第20代、第30代、第40代和第50代)，以1×103个/孔的细胞密度接种96孔板(n＝6)，在37℃，5％CO₂培养，分别在培养0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h和72h后取出，向每个孔中加入10μLCell Counting Kit-8(CCK8)溶液，将培养板放回37℃，5％CO₂培养箱中孵育20min，使用酶标仪测量450nm处的吸光度。比较传代的永生化人肺特络细胞和未转染的原代人肺特络细胞的生长曲线，结果显示，转染的原代人肺特络细胞几乎没有表现出增殖，而传代的永生化的人肺特络细胞在72h内表现出稳定的增殖(如图4)。

4、对持续传代的人肺特络细胞系稳定性的鉴定：

4.1光镜观察第2代(G2)、第5代(G5)、第10代(G10)、第15代(G15)、第20代(G20)、第25代(G25)、第30代(G30)、第35代(G35)、第40代(G40)、第45代(G45)、第50代(G50)和第55代(G55)传代的永生化人肺特络细胞特征性结构telopode,并进行拍照记录。如图5所示，分别为第2代、第5代、第10代、第15代、第20代、第25代、第30代、第35代、第40代、第45代、第50代和第55代传代的永生化人肺特络细胞光镜下的形态和特征性结构telopode(↑，200×)。

4.2用免疫荧光法标记永生化的人肺特络细胞第2代、第5代、第10代、第20代、第30代和第50代细胞的相关免疫标记物vimentin和CD34的表达，并在激光共聚焦显微镜下观察拍照(如图6所示)。A图为永生化的人肺特络细胞第2代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达；B图为永生化的人肺特络细胞第5代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达；C图为永生化的人肺特络细胞第10代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达；D图为永生化的人肺特络细胞第20代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达；E图为永生化的人肺特络细胞第30代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达；F图为永生化的人肺特络细胞第50代细胞CD34、vimentin和PDGFRα的表达。其中DAPI(蓝色)标记细胞核；FITC(绿色)标记显示了vimentin的表达；keyfluor594(红色)标记显示了CD34的表达；APC(紫色)标记显示了PDGFRα。

4.3用免疫电镜鉴定特络细胞系第2代(G2)、第5代(G5)、第10代(G10)、第30代(G30)和第50代(G50)细胞的相关免疫标记物vimentin、CD34、PDGFRα和ckit的表达。如图7所示，免疫标志物和对应的免疫胶体金颗粒大小分别为CD34-20nm；vimentin-10nm；PDGFRα-10nm。

本发明人肺特络细胞系的应用：

1.可用于基础研究：可用于急慢性疾病、肿瘤等发病机制和干预的基础研究，可用于与自身或其他细胞类型的细胞间通讯和相互作用的研究等。细胞实验建议的细胞浓度为10⁶-10⁷/ml，推荐接种密度为70-90％，消化和培养方法同上述方法。用于动物实验的建议浓度为10⁴-10⁶/ml，静脉注射或局部给药，给药前需经200-300目滤网过滤。

2.未来可能用于临床治疗。根据目前小鼠肺特络细胞的动物实验，推测人特络细胞治疗范围可能包含急性肺损伤的预防和早期治疗、急性心梗的早期治疗和慢性难治性创面的治疗等。扩展治疗范围可能为急慢性疾病的预防和治疗。其他治疗范围参考干细胞，可能使用于恶性肿瘤放化疗的支持治疗，糖尿病、白血病的辅助治疗，帕金森、老年痴呆症、亚健康状态治疗等。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种人肺特络细胞系构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤4：构建永生化的人肺特络细胞系；将携带TERT基因和CDK4基因的慢病毒转染原代人肺特络细胞；鉴定稳定转染TERT和CDK4的人肺特络细胞；再连续传代培养超过50代后，得到稳定的人肺特络细胞系；所述的人肺特络细胞系于2021年11月02日在中国典型培养物保藏中心保藏，培养物名称为人肺特络细胞系hTC-S1011，保藏编号为CCTCC NO：C2021275。

2.如权利要求1所述的一种人肺特络细胞系构建方法构建的一种人肺特络细胞系，其特征在于，所述的人肺特络细胞系于2021年11月02日在中国典型培养物保藏中心保藏，培养物名称为人肺特络细胞系hTC-S1011，保藏编号为CCTCCNO：C2021275。