CN115896032B - 一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用，属于动物细胞工程领域。上述构建方法是通过将外源病毒癌基因SV40‑LT转至牦牛卵巢卵丘细胞，获取能体外连续传代，并保留原代卵丘细胞特性的牦牛卵巢卵丘细胞系。本发明首次建立了牦牛卵巢卵丘细胞系，形态似铺路石状，呈串状生长，生长速度快，能连续传代获得大量均一细胞群体，并能冻存保存；与以往获取牦牛原代卵丘细胞相比，大大降低了细胞获取成本。本发明为牦牛生殖生理基因调控机制的研究提供了基础实验材料，可用于细胞生物学和分子生物学的研究。

Description

一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及动物细胞工程领域，特别是涉及一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

细胞在体外培养增殖到一定阶段就会发生形态学上的改变，但通过导入外源基因(端粒酶和TERT)或病毒癌基因(SV40)的转化等方法可使细胞维持端粒长度，突破衰老继续增殖，进而实现永生化，与原代细胞相比，细胞系容易获得。近些年，随着越来越多细胞系的建立，细胞系被广泛应用于各类研究，但哺乳动物生殖相关细胞系的建立还存在一些难以攻克的问题。

就哺乳动物卵巢生殖细胞而言，第一个保留颗粒细胞部分分化功能的颗粒细胞系是学者Zeleznik等在1979年利用原代大鼠颗粒细胞，与SV40转化的失去产生孕酮能力的大鼠卵巢颗粒细胞系杂交建立的大鼠GC48C细胞系，但其在连续培养11个月后，失去了分泌类固醇激素的特性；随后学者Fitz等利用SV40转化法于1989年建立了第一个保留未成熟、非黄体化颗粒细胞特性的模型，DC3细胞系；1998年，学者Sugino等人通过感染温度敏感的猿病毒(SV-40tsA209)突变体成功转化大鼠黄体细胞来开发了黄体细胞系GG-CL。此后各种哺乳动物卵巢细胞系培养迅速发展，2012年，李伟等通过将hTERT基因转染至山羊黄体细胞中得到了保持原代黄体细胞相关特性的永生化山羊黄体细胞系；2015年，Liang Zhang等人也利用hTERT基因导入的方法建立了黄体分泌功能和激素受体表达正常永生化猪黄体细胞系。但到目前为止，成功建立的卵巢卵丘细胞系少之又少，也并未见能用于细胞生物学和分子生物学研究的成品牦牛卵丘细胞系。

牦牛是青藏高原及其毗邻地区的主要畜种，在漫长的进化过程中形成了独特的形态特征和生理机制，对当地农牧民的生产生活具有不可替代的作用。在自然放牧条件下，牦牛繁殖率为60％～75％，繁殖成活率仅为45％～75％，严重制约了牦牛产业的发展。采用现代繁殖技术提高母牦牛的繁殖潜力是牦牛产业高效发展的重要途径之一，但牦牛不仅繁殖力低，其体外卵母细胞成熟率和胚胎发育能力也都较为低下，严重影响其体细胞克隆和体外受精等繁殖技术的发展。

卵母细胞作为现代繁殖技术的基础材料，其质量影响着后续胚胎质量，而卵母细胞周围的卵丘细胞专门为卵母细胞的发育服务。众所周知，卵母细胞与其周围卵丘细胞之间的双向信号交流对于调节卵母细胞的减数分裂成熟和发育至关重要，卵丘细胞扩张是卵母细胞减数分裂恢复的必要条件。目前，对牦牛卵母细胞成熟的研究较少，成熟过程中的相关分子机理也还尚不明确。

因此，为进一步在分子和细胞水平上了解调节卵巢类固醇生成和卵泡生成的机制，有必要建立一种易于获得的细胞进行体外研究，开发一种构建方法来解决研究过程中的上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明构建了一种易于培养，生长迅速的牦牛卵巢卵丘细胞系，该牦牛卵丘细胞系能在体外连续传代，并保留有原代细胞特性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法，所述建立方法包括：通过将外源病毒癌基因SV40-LT转至牦牛卵巢卵丘细胞，获取能体外连续传代，并保留原代卵丘细胞特性的牦牛卵巢卵丘细胞系。

外源病毒癌基因SV40-LT(SEQ ID NO：1)：

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下划线区域为目的序列区。

优选的是，所述建立方法具体包括以下步骤：

(1)收集卵巢卵丘复合体，成熟培养后，消化、分离，去除卵母细胞，收集卵丘细胞；利用原代培养基培养所述卵丘细胞；

(2)待步骤(1)中原代培养基培养的卵丘细胞长至80％-90％后，消化，待细胞回缩变圆后终止消化，之后离心、重悬，再经传代培养，得到稳定传代的原代卵丘细胞；

(3)将SV40-LT过表达慢病毒载体转染至293细胞中，收集SV40-LT过表达慢病毒，之后感染原代卵丘细胞，转入含胎牛血清的DMEM-F12培养液继续培养，再经筛选、鉴定，得到阳性牦牛卵巢卵丘细胞系。

优选的是，步骤(1)中，成熟培养所用的培养基包括如下浓度的组分：M199培养液+10％胎牛血清+50μg·mL^-1促黄体生成素+100μg·mL^-1促卵泡生成素+100μg·mL^-1雌二醇+100μg·mL^-1青霉素+100μg·mL^-1链霉素。

优选的是，所述原代培养基包括如下组分：DMEM培养液+10％胎牛血清+100μg·mL^-1青霉素+100μg·mL^-1链霉素。

优选的是，所述含有SV40的过表达载体为EF1α-SV40-IRES-puromycin。

优选的是，传代次数为3代。

优选的是，步骤(3)中，所述SV40过表达慢病毒感染所述原代卵丘细胞浓度为5×10³个/μL。

优选的是，步骤(3)中，所述DMEM-F12培养液中添加体积分数为20％的胎牛血清。

本发明还提供所述的建立方法构建的牦牛卵巢卵丘细胞系。

本发明还提供所述的牦牛卵巢卵丘细胞系在提高体外卵母细胞成熟率和胚胎发育能力方面的应用。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明首次建立了牦牛卵巢卵丘细胞系，提供了一种高原哺乳动物体外研究模型；与现有的获取牦牛原代卵丘细胞相比，大大降低了细胞获取成本。

(2)本发明建立的牦牛卵巢卵丘细胞系形态似铺路石状，呈串状生长，生长速度快，能连续传代，获得大量均一细胞群体，并能冻存保存。

(3)本发明建立牦牛卵巢卵丘细胞系在体外传代20代以上，仍能保持原有形态正常增殖，且主要分泌功能和激素受体表达正常，可直接用于牦牛生殖相关功能基因的研究，为牦牛生殖生理基因调控机制的研究提供了基础实验材料。

(4)利用本发明牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法构建的卵丘细胞系，进行PEX-1-EGFP质粒的转染实验，观察到了绿色荧光，证明该细胞系可用于细胞生物学和分子生物学的研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为EF1α-SV40-IRES-puromycin质粒图谱

图2为质粒验证结果；M：DL10000 DNA相对分子质量标准；1：质粒DNA双酶切产物；

图3为永生化卵丘细胞形态学观察图片；

图4为各细胞中SV40-LT基因的表达电泳检测图；A：内参基因；B：SV40-LT基因；M：DL2000 DNA相对分子质量标准；1：3代牦牛卵丘细胞(Yak Cumulus Cells,YCCs)；2：3代永生化牦牛卵丘细胞(Ysh-Yak Cumulus Cells,Y-YCCs)；3：10代Y-YCCs；

图5为各细胞中SV40-LT基因的表达水平统计结果；

图6为各细胞中卵巢激素合成相关基因的表达结果；1：3代YCCs；2：3代Y-YCCs；3：10代Y-YCCs；4：13代Y-YCCs；

图7为YCCs与Y-YCCs的生长曲线；

图8为Y-YCCs致瘤性鉴定图；

图9为Y-YCCs核型分析图；

图10为Y-YCCs绿色荧光蛋白转染图；

图11为PSIN-EF2-SV40-LT、pMD2.G、psPAX2质粒图谱；

图12为质粒验证结果；M：DL10000 DNA相对分子质量标准；1：PSIN-EF2-EGFP；2：psPAX2；3：pMD2.G；

图13为PSIN-EF2-EGFP质粒转染结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1牦牛卵巢卵丘细胞系的建立

1、牦牛卵丘细胞的分离及培养

1.1牦牛卵巢的采集

在屠宰场收集成年健康雌性牦牛的卵巢，放置于含有青链霉素(双抗)(100万单位)的37℃生理盐水中送至实验室细胞间处理。

1.2细胞培养基的制备

卵丘-卵母细胞复合体(COCS)成熟培养液：M199培养液+10％FBS+50μg·mL^-1促黄体生成素(LH)+100μg·mL^-1促卵泡生成素(FSH)+100μg·mL^-1雌二醇(E2)+100μg·mL^-1青霉素+100μg·mL^-1链霉素。M199培养液购自GIBCO。

卵丘细胞培养液：DMEM培养液+10％胎牛血清。

1.3原代卵丘细胞的培养

将采集到的卵巢组织用添加了2倍双抗的生理盐水清洗数次后，用酒精棉球擦拭卵泡表面，于超净台中用注射器抽取卵巢表面直径为2～8cm卵泡的卵泡液，体视显微镜下收集COCs，将其置于COCs成熟培养液中，并在37.5℃、20％O₂培养箱中培养24h后，每200颗卵母细胞加100μL 0.1％透明质酸酶消化，并用移液枪不断吹吸COCs，待卵丘细胞和卵母细胞分离后移除卵母细胞，收集卵丘细胞制成悬液，1500r/min离心5-10min后，重悬至细胞培养瓶中，后置于5％CO₂、37℃培养箱中培养。

1.4卵丘细胞的传代

将融合度为90％的原代卵丘细胞，吸出培养液，PBS洗三遍，加入0.25％胰蛋白酶消化，显微镜下观察，待细胞回缩变圆加完全培养基终止消化，吸出细胞悬液，1000r/min，5min离心，弃上清，加入新鲜培养液制成悬液，将其按体积比1:2的比例接种于培养瓶中，于37℃培养箱中培养至稳定的三代。

2、质粒的制备

2.1质粒的克隆

取转化EF1α-SV40-IRES-puromycin过表达载体质粒(见图1)的感受态DH5α菌液10μL，加入含有氨苄(100μg/m L)的5mL液体培养基(酵母粉0.5g，蛋白胨1.0g，氯化钠1.0g，蒸馏水100mL)中，置于37℃摇床中过夜，按天根无内毒素质粒提取试剂盒说明书步骤提取质粒DNA,利用分光光度计测定DNA浓度和OD260nm/280nm值，调整质粒浓度至500ng/μL。

2.2质粒的鉴定

利用双酶切法鉴定EF1α-SV40-IRES-puromycin质粒。选用X bal(位点3107)和KpnⅠ(位点6164)两种快切酶，按照快切酶使用说明书添加体系，37℃双酶切30min，将双酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。

EF1α-SV40-IRES-puromycin质粒双酶切后，电泳结果如图2所示，出现了大小分别为6600bp左右和3300bp左右的基因片段，证明载体正确，可用于后续试验。

2.3嘌呤霉素浓度的筛选

将未转化原代牦牛卵巢卵丘细胞接至24孔板中，待细胞融合度至70％左右时，按如下浓度梯度加入嘌呤霉素：0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL，6μg/mL，7μg/mL，8μg/mL，每2天换一次液，一周后杀死所有细胞的最小浓度为最佳浓度。

2.4卵丘细胞的病毒感染及阳性细胞株的筛选

2.4.1病毒颗粒的收集

转染前24h，将293T细胞接至六孔板中，待细胞融合度至60％左右时，换新鲜高糖培养基(4.5g/L葡萄糖，GIBCO)，将质粒DNA与转染试剂(Advanced DNA RNA TransfectionReagent(ZETA LIFE))按照1:1关系混匀，每孔6μg质粒DNA+6μL转染试剂，室温静止10-15分钟后，滴入细胞中，24h后换液，48-72h观察细胞状态，96h后收集上清液，用0.2μM的滤器过滤后，置于-80℃保存备用。

2.4.2卵丘细胞的病毒感染

感染前24h，将卵丘细胞接至12孔板中，待细胞融合度至60％左右时，按每100μL为梯度加入病毒液，浓度范围为300μL-1000μL，感染24h后更换新鲜培养基，筛选最佳感染浓度。重复上述操作，将新鲜培养基与病毒颗粒按照最佳感染浓度(300μL)比例的关系加入细胞中，24h后可再加入300μL病毒液重复感染，观察细胞状态。

2.4.3阳性细胞株的筛选

将病毒感染后的细胞传代3-4次后，铺入24孔板，加1μg/mL嘌呤霉素进行阳性细胞株筛选。将转染后传代3次的牦牛卵丘细胞铺入24孔板中，24h后更换为含嘌呤霉素(1μg/mL)的筛选培养基，每天观察细胞状态，每两天更换新鲜的筛选培养基，至阴性对照组细胞全部死亡后，加正常含20％胎牛血清的培养液培养阳性细胞，待阳性细胞稳定生长，扩大培养。

以PSIN-EF2-EGFP转染牦牛卵巢卵丘细胞作为对照，具体步骤如下：

(1)质粒的克隆

分别取转化PSIN-EF2-EGFP、pMD2.G、psPAX2(图11)慢病毒载体(载体来源于实验室现存)的感受态DH5α菌液10μL，加入含有氨苄(100μg/m L)的5mL液体培养基(酵母粉0.5g，蛋白胨1.0g，氯化钠1.0g，蒸馏水100mL)中，置于37℃摇床中过夜，按天根无内毒素质粒提取试剂盒说明书步骤提取质粒DNA,利用分光光度计测定DNA浓度和OD_260nm/280nm值，调整质粒浓度至500ng/μL。

(2)质粒的鉴定

利用DNA 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PSIN-EF2-EGPF、pMD2.G、psPAX2质粒。

电泳结果如图(图12)，出现了大小分别为8000bp、10000bp、5800bp左右的基因片段，证明载体正确，可用于后续试验。

(3)G418浓度的筛选

将未转化原代牦牛卵巢卵丘细胞接至24孔板中，待细胞融合度至70％左右时，按如下浓度梯度加入G418：100μg/mL，200μg/mL，300μg/mL，400μg/mL，500μg/mL，600μg/mL，700μg/mL，800μg/mL，900μg/mL，每2天换一次液，六天后药量减半，两周内杀死所有细胞的最小浓度为最佳浓度。

(4)PSIN-EF2-EGFP质粒转染牦牛卵巢卵丘细胞

1)将细胞接入12孔板中，待其密度至55％-70％；

2)将质粒DNA与转染试剂(Advanced DNA RNA Transfection Reagent(ZETALIFE))按照1:1关系混匀，每孔6μg质粒DNA+6μL转染试剂，室温静止10-15分钟后，滴入细胞中，24h后显微镜下观察转染效果，并换液，继续培养至铺满皿底。

转染结果显示(图13)，牦牛卵丘细胞成功表达绿色荧光蛋白，PSIN-EF2-EGFP质粒转染成功。

(5)阳性细胞株的筛选

将转染后的细胞传代1次后，铺入24孔板，加350μg/mL嘌呤霉素进行阳性细胞株筛选，每两天更换新鲜的筛选培养基，六天后降低药物浓度至175μg/mL至阴性对照孔细胞全部死亡，加正常含20％胎牛血清的培养液培养阳性细胞，待阳性细胞稳定生长，扩大培养。

(6)结果

阳性细胞株药物筛选后细胞状态下降，形态发生改变，增殖速度降低，细胞逐渐死亡。

实施例2卵丘细胞系的鉴定

1、形态学鉴定

显微镜(Olympuse公司)下观察永生化牦牛卵丘细胞Y-YCCs的形态，并与原代牦牛卵丘细胞进行比较。

观察Y-YCCs与原代卵丘细胞形态，发现两种细胞形态相似，皆呈铺路石状排列，串状生长，多为卵圆形或多边形，可见清晰的细胞核(图3)。

2、基因稳定性检测

2.1引物的设计及细胞总RNA的提取

参照GenBank公布的SV40-LT基因、牛(Bos taurus)STAR、CYP19A1、CYP17A1、FSHR、LHR、ERα基因和牦牛内参基因β-Actin(肌动蛋白,β-non-muscle)序列，利用NCBI Primer-BLAST设计引物，所用引物均在上海生工合成，引物信息如下表：

表1目的基因和内参基因引物序列

参照Trizol试剂盒说明书提取Y-YCCs与原代卵丘细胞总RNA，利用分光光度计测定RNA浓度和OD_260/OD280值，两步法反转录(Go Script^TMReverse Transcription Syatem,Promega)合成cDNA-20℃保存备用。

2.2SV40-LT基因表达检测

以3代YCCs、3代Y-YCCs和10代Y-YCCs cDNA为模板，β-actin、SV-40LT为引物，PCR技术鉴定cDNA模板是否能用于试验，SV40-LT基因是否正确表达，PCR反应体系为20μL：TaqPCR Master Mix 10μL，ddH₂O 8μL，cDNA模板1μL，上下游引物各0.5μL。PCR反应条件：预变性5min(95℃)，变性30s(95℃)，退火30s(56℃)，延伸72℃20s，循环40次，72℃保存5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。使用SYBR Green Pro Taq预混型qPCR试剂盒，RT-PCR方法检测各细胞中SV40-LT的基因表达水平变化。

结果显示，cDNA模板合适，能用于后续试验(图4A)；第3代YCCs没有特异性条带，3代Y-YCCs和10代Y-YCC成功扩增出大小131bp左右的明亮条带，证明Y-YCCs可稳定表达SV40-LT基因(图4B)，RT-PCR结果显示3代YCCs中SV40-LT mRNA几乎不表达，3代Y-YCCs和10代Y-YCCs中SV40-LT mRNA相对表达水平较高，且随着代次增加在升高(图5)。

3、卵巢激素合成相关基因表达的检测

以3代YCCs、3代Y-YCCs、10代Y-YCCs和13代Y-YCCs的cDNA为模板，STAR、CYP19A1、CYP17A1、FSHR、LHR、ERα、和β-Actin为引物，检测卵巢甾体类激素合成相关基因的表达，引物序列见表1，反应体系及反应程序同2.2。

如图6所示，Y-YCCs中卵巢甾体类激素合成相关基因的表达检测结果显示，3代YCCs、3代Y-YCCs、10代Y-YCCs和13代Y-YCCs中STAR、CYP19A1、CYP17A1、FSHR、LHR、ERα均可被扩增，证明Y-YCCs可正常表达卵巢甾体类激素合成相关基因。

4、Y-YCCs增殖活力的检测

将3代YCCs和10代Y-YCCs按每孔5000个细胞接种到96孔板中，每隔24h加入10μLCCK8，四个重复，培养箱继续培养3h后使用酶标仪检测吸光度值，连续7d，根据吸光度值计算并绘制生长曲线。

如图7所示，Y-YCCs增殖活力的检测结果显示，Y-YCCs与3代YCCs相比，第一天到第二天两种细胞增殖均较缓慢，从第二天开始Y-YCCs增长速度明显加快，进入对数生长期，第五天增长速度变缓，进入平台期，两种细胞生长曲线均呈“S”形。

5、细胞致瘤性鉴定

利用软琼脂克隆试验鉴别细胞Y-YCCs是否具有致瘤性。

(1)制备1.2％的下层低熔点琼脂与0.8％的上层低熔点琼脂，高压除菌。

(2)将下层琼脂胶与2×DMEM/F12培养液(含有20％的FBS)按1：1的比例混匀，加入6孔板中。

(3)待下层胶凝固后，将上层琼脂胶与2×DMEM/F12培养液(含有20％的FBS)按1：1的比例混匀，并将第10代Y-YCCs(实验组)与CACO-2(对照组)按5×10³个细胞数量重悬，并分别加入制备好的上层胶中，再将其加到凝固后的下层胶上面，待其凝固后置于培养箱中培养。

(4)每两天补200μL完全培养基，两周后观察克隆是否形成。

如图8所示，Y-YCCs软琼脂克隆试验结果显示，培养两周后，对照组的CACO-2形成了大片克隆，实验组10代Y-YCCs没有发现克隆形成，证明Y-YCCs不具有致瘤性。

6、Y-YCCs核型分析

利用细胞核型分析实验检测Y-YCCs染色体数目及结构的变化。

(1)将三代Y-YCCs细胞接种至6孔板，培养24h至细胞密度密度达到70％-80％左右，加秋水仙素(0.1μg/mL)处理6h。

(2)消化处理后的细胞，并用氯化钾溶液(0.075mol/L)重悬，37℃静置30min，弃去氯化钾，加入400μL固定液，1500rpm离心5min。

(3)弃液并保留1mL上清液,重悬后再次离心，重复上述过程。

(4)弃去上清液，固定液重悬细胞后，将玻片从水浴中拿出，吸取重悬液从50cm高处滴下，风干30min。

(5)晾干玻片，用10％的Giemsa染液染色20min，蒸馏水冲洗，封片后显微镜下观察。

如图9所示，细胞核型分析结果显示，Y-YCCs染色体核型为2n＝60，符合牦牛染色体数目，且SV40-LT的转染并未影响牦牛染色体形态。

7、功能验证

将Y-YGCs作为目的细胞，用不同的转染试剂转染PEX-1-EGFP(GenePharma)质粒，观察转染效果，将细胞接入12孔板中，待其密度至55％-70％；

(1)GP Mate：换为不含双抗的OPTI-MEM培养基。取两个无菌离心管，各加入100μLOPTI-MEM，并分别添加3.2μL GP Mate和2.3μg质粒DNA，静止5min后，将GP Mate培养基混合物加入DNA培养基混合物中，室温静止15min后，滴入目的细胞中，6h后换新鲜培养基，24h后观察转染效果。

(2)Lip 6000：换为含血清，不含双抗的新鲜培养基，取两个无菌离心管，各加入50μL OPTI-MEM，并分别添加2μL Lip 6000和1μg质粒DNA，静止5min后，将Lip 6000培养基混合物加入DNA培养基混合物中，室温静止5min后，滴入目的细胞中，24后换新鲜培养基，观察转染效果。

(3)Lip 8000：换为含血清，含双抗的新鲜培养基，取一个无菌离心管，加入100μLOPTI-MEM，先加1μg质粒DNA，再加入1.6μL Lip 8000，混匀后滴入目的细胞中，24后换新鲜培养基，观察转染效果。

如图10所示，观察结果显示，不同的转染试剂均可以将绿色荧光蛋白成功转染至Y-YGCs中，证明Y-YGCs可用于细胞生物学和分子生物学的研究。

以上实验结果显示：本实验通过将SV40-LT转染至牦牛原代卵丘细胞中，成功建立起一种牦牛卵巢卵丘细胞系，将其命名为Y-YGCs。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括：通过将外源病毒癌基因SV40-LT转至牦牛卵巢卵丘细胞，获取能体外连续传代，并保留原代卵丘细胞特性的牦牛卵巢卵丘细胞系；

所述建立方法具体包括以下步骤：

(1)收集卵巢卵丘-卵母细胞复合体，成熟培养后，消化、分离，去除卵母细胞，收集卵丘细胞；利用原代培养基培养所述卵丘细胞；

(2)待步骤(1)中原代培养基培养的卵丘细胞长至80％-90％后，消化，待细胞回缩变圆后终止消化，之后离心、重悬，再经传代培养，得到稳定传代的原代卵丘细胞；

(3)将含有SV40-LT基因的过表达载体转染至293T细胞中，收集SV40过表达慢病毒，用其感染原代卵丘细胞后，转入含胎牛血清的DMEM-F12培养液继续培养，再经筛选、鉴定，得到阳性牦牛卵巢卵丘细胞系；

步骤(1)中，成熟培养所用的培养基包括如下浓度的组分：M199培养液、10％胎牛血清、50μg·mL^-1促黄体生成素、100μg·mL^-1促卵泡生成素、100μg·mL^-1雌二醇、100μg·mL^-1青霉素和100μg·mL^-1链霉素；

所述原代培养基包括如下组分：DMEM-F12培养液、10％胎牛血清、100μg·mL^-1青霉素和100μg·mL^-1链霉素。

2.如权利要求1所述的牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法，其特征在于，所述含有SV40-LT的过表达载体为EF1α-SV40-IRES-puromycin。

3.如权利要求1所述的牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法，其特征在于，传代次数为3代。

4.如权利要求1所述的牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，所述SV40过表达慢病毒感染所述原代卵丘细胞浓度为5×10³个/μL。

5.如权利要求1所述的牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，所述DMEM-F12培养液中添加体积分数为20％的胎牛血清。