CN117535245A - 永生化的猪卵巢颗粒细胞系及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种永生化的猪卵巢颗粒细胞系及其构建方法。所述永生化的猪卵巢颗粒细胞系是以猪卵巢颗粒细胞作为宿主细胞，通过慢病毒转导，导入SV40T基因，再经嘌呤霉素筛选得到。该细胞培养方便且稳定性强。利用本方法构建得到的猪卵巢颗粒细胞系(pGCs‑SV40T)已经传代至40次以上，仍然能够正常生长，且保持着颗粒细胞的特性，可以作为猪卵巢功能研究的体外模型使用。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，具体地说，涉及一种永生化的猪卵巢颗粒细胞系及其构建方法。
背景技术
在畜牧生产中，母猪繁殖性能是一项重要指标，是决定生猪养殖经济效益的关键因素之一。而母猪的排卵数和卵母细胞质量又是影响母猪繁殖性能的主要因素。卵巢颗粒细胞是猪卵泡中最大的细胞群，它通过与卵母细胞之间的间隙连接向其输送营养物质和进行信息交流。同时，作为卵泡的功能细胞，其增殖、分化对多种卵巢功能活动如原始卵泡的生长启动、增殖分化、闭锁、排卵、黄体形成和激素分泌起着关键作用。所以，近些年越来越多的试验将其作为研究卵巢中细胞增殖、分化、信号转导和激素分泌的细胞模型。
目前，猪卵巢颗粒细胞的原代分离纯化技术已经比较成熟，其中，抽取卵泡液来获取颗粒细胞是目前的主流方法。但是，猪原代颗粒细胞在体外培养无法持续传代，随着传代次数增加，细胞伸长，形态差异变大，生长速度变慢，一般经过3-4次传代就会停止生长，不再满足试验要求，必须重新获取原代颗粒细胞，步骤繁琐且消耗大量的人力、物力和财力。
发明内容
本发明的目的是提供一种永生化的猪卵巢颗粒细胞系及其构建方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种永生化的猪卵巢颗粒细胞系，其是以慢病毒载体介导SV40 T抗原转染猪卵巢颗粒细胞获得的永生化细胞系。可将该永生化猪卵巢颗粒细胞系作为猪卵巢功能研究的体外模型使用。
进一步地，本发明提供传代稳定性强的永生化的猪卵巢颗粒细胞系pGCs-SV40T，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.45321，保藏日期2022年10月9日。
第二方面，本发明提供永生化的猪卵巢颗粒细胞系的构建方法，以猪卵巢颗粒细胞作为宿主细胞，用慢病毒载体介导SV40 T抗原转染所述宿主细胞，再经嘌呤霉素筛选得到。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
1)将编码SV40 T抗原的DNA序列(SEQ ID NO:1)构建到慢病毒载体上，得到重组慢病毒载体；
2)将1)的重组慢病毒载体与慢病毒包装辅助质粒共转染HEK-293T细胞，进行假病毒包装；
3)将2)的假病毒转染原代分离的猪卵巢颗粒细胞获得永生化细胞系。
优选地，所述重组慢病毒载体为pBABE-puro-SV40 LT，所述慢病毒包装辅助质粒为psPAX2和pMD2.g。上述载体、质粒均购自北京启航立业科技有限公司。
更优选地，pBABE-puro-SV40 LT、psPAX2和pMD2.g的摩尔比为5:3:2。
前述的方法，还包括对获得的永生化细胞系进行细胞增殖活力测定的步骤。
此前在研究猪卵巢功能时，只能分离猪原代颗粒细胞进行研究，但是猪原代颗粒细胞在体外培养无法持续传代，随着传代次数增加，细胞伸长，形态差异变大，生长速度变慢，一般经过3-4次传代就会停止生长，不再满足试验要求，必须重新获取原代颗粒细胞，步骤繁琐且消耗大量的人力、物力和财力。
本发明通过建立pGCs-SV40T细胞系，该细胞系保留了原代颗粒细胞的特性，可用于猪卵巢功能的相关研究，填补了现阶段在研究猪卵巢相关细胞增殖、分化、信号转导和激素分泌时，无可供使用的细胞系的空白。
进一步地，本发明具有下列优点及有益效果：
本发明提供一种永生化的猪卵巢颗粒细胞系，其以猪卵巢颗粒细胞作为宿主细胞，通过慢病毒转导，导入SV40T基因，再经嘌呤霉素筛选得到。该细胞培养方便且稳定性强。
利用本方法构建得到的猪卵巢颗粒细胞系(pGCs-SV40T)已经传代至40次以上，仍然能够正常生长，且保持着颗粒细胞的特性，正常表达促卵泡激素受体，激素分泌情况在补充底物后和原代颗粒细胞差异不大，可以作为猪卵巢功能研究的体外模型使用。
附图说明
图1为本发明pBABE-puro SV40 LT载体结构。
图2为本发明较佳实施例中原代猪卵巢颗粒细胞形态。其中，p1、p3分别为第1代和第3代细胞。
图3为本发明较佳实施例中永生化后猪卵巢颗粒细胞形态。其中，p1、p10、p20、p30分别为第1代、第10代、第20代和第30代细胞。
图4为本发明较佳实施例中pGCs-SV40T细胞生长曲线。
图5为本发明较佳实施例中SV40T基因表达情况。
图6为本发明较佳实施例中pGCs-SV40T细胞关键基因表达情况。
图7为本发明较佳实施例中FSHR在pGCs-SV40T细胞中的表达情况。
图8为本发明较佳实施例中pGCs-SV40T细胞的激素合成情况。
图9为本发明较佳实施例中猪卵巢颗粒细胞黄体化的情况。
图8～图9中，*、**表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的主要试验材料见表1：
表1主要试验材料
pGCs-P1：原代猪卵巢颗粒细胞。
pGCs-SV40T-P10、pGCs-SV40T-P20、pGCs-SV40T-P30分别为永生化后第10代、第20代、第30代的猪卵巢颗粒细胞。
实施例1永生化的猪卵巢颗粒细胞系的构建
1.试验方法
1.1猪原代卵巢颗粒细胞(pGCs细胞)的分离
a)收集母猪卵巢后用预热的生理盐水反复清洗，用灭菌的擦手纸擦干，随后使用注射器抽取卵泡液。
b)卵泡液收集至15mL离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清液，加入5mL含有10％双抗的PBS清洗，1500rpm离心5min，弃去上清液，重复3-5次。
c)提前将多聚赖氨酸铺在10cm培养皿上，并将其置于紫外下吹干，再在培养皿中接种细胞。
d)培养基的配方为DMEM高糖培养基+10％ FBS+2％青-链霉素。
1.2慢病毒包装及感染
(1)准备pBABE-puro-SV40 LT质粒以及辅助质粒
慢病毒包装使用的质粒为pBABE-puro-SV40 LT、psPAX2、pMD2.g。将含有质粒的菌液从-80℃冰箱中取出，常温融化，以1％的浓度接种至摇瓶中，37℃摇床培养过夜，第二天进行质粒大提。质粒大提按照康为世纪生物科技股份有限公司无内毒素大提试剂盒(EndoFree Plamid Mini Kit)的产品说明书操作。
pBABE-puro-SV40 LT质粒图谱如图1所示。
(2)转染HEK-293T细胞
准备HEK-239T细胞，提前一天铺板4×106～5×106个细胞至10cm培养皿。用500μL的Opti-MEM减血清培养基稀释质粒，转染共20μg质粒，其中pBABE-puro-SV40 LT：psPAX2：pMD2.g＝5:3:2。再加入40μL purefection转染试剂，涡旋5～10s混匀，孵育20min，将混合液加入到细胞中。转染8h后，更换为DMEM-Hepes培养基，48h和72h后，分别收取病毒上清液。将得到的上清液2,000g离心10min，经过0.22μm的滤膜过滤，再用慢病毒浓缩试剂按比例浓缩病毒上清，4℃过夜。然后，4℃4,000g离心20min，弃上清液，灰白色沉淀即为病毒，用PBS重悬，分装后于-80℃保存。
(3)感染pGCs细胞
慢病毒感染前18～24h，将pGCs细胞以2×105/孔铺到6孔板中，使细胞在第二天慢病毒感染时的汇合度达到40％～60％。第二天，加入1mL收集的48h病毒悬液，同时加入polybrene使其终浓度为5μg/mL，8-12h后观察细胞状态，若细胞无明显病变，则加入1mL新鲜的完全培养基继续培养，继续培养24h后用2mL新鲜的pTr细胞完全培养基替换含有病毒的培养基，随后准备开始Puro筛选。
1.3嘌呤霉素筛选稳转株
首先通过预实验确定嘌呤霉素最适筛选浓度为1μg/mL，用该浓度的嘌呤霉素筛选培养基培养pGCs细胞两周，期间每2-3天以1:2比例传代。将得到的稳转株细胞命名为pGCs-SV40T。
1.4细胞增殖活力测定
以每孔4000个细胞的浓度将pGCs-P1、pGCs-SV40T-P10和pGCs-SV40T-P20细胞接种至96孔板，按照CCK8试剂盒说明书(上海碧云天生物技术有限公司)，分别在接种后6h、12h、24h、36h和48h进行细胞增殖活力的测定。
1.5免疫荧光
a)固定：将pGCs细胞、pGCs-SV40T-P10和pGCs-SV40T-P30细胞分别接种至96孔板，置于培养箱中过夜。次日，弃去培养基，每孔加入100μL PBS，静置5min，吸弃PBS，每孔加入100μL 4％多聚甲醛固定液，室温固定30min。
b)洗涤：每孔加入100μL PBS，静置5min，吸弃液体，重复3次。
c)封闭：每孔加入100μL 5％牛血清封闭液，37℃孵育2h，弃去液体。
d)孵一抗：每孔加入100μL采用2％牛血清稀释的FSHR抗体，4℃孵育过夜。随后再进行一次洗涤和封闭过程。
e)孵二抗：每孔加入100μL采用2％牛血清稀释的二抗，37℃避光孵育1h。
f)核染：每孔加入100μL 5μg/mL DAPI溶液，室温避光染色15min。
g)洗涤与拍照：每孔加入100μL PBS，静置5min，吸弃液体，重复3次。洗涤完毕后每孔加入100μL PBS，将细胞置于显微镜下观察，拍照保存。
1.6激素测定
将pGCs-SV40T-P30接种至6孔板，过夜后更换含有FSH和雄烯二酮的培养基(2.5IU/mL FSH和3ng/mL雄烯二酮)进行培养，24h后收集细胞上清，3,000g离心10min以去除细胞，保留上清液测定E2和P4。E2和P4分别按照猪雌二醇(E2)酶联免疫检测试剂盒(南京建成)和猪孕激素/孕酮(PROG)ELISA(上海酶联生物)检测试剂盒说明书进行检测。
1.7颗粒细胞黄体化
颗粒细胞在细胞培养皿中长满后，添加2.5IU/mL的LH和FSH于细胞培养液中，继续培养细胞72h。之后进行细胞收集，实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测黄体化相关基因STAR、HSD3B1的表达。
1.8基因表达测定
分别提取pGCs、pGCs-SV40T-P10和pGCs-SV40T-P30细胞的RNA，经反转录后，进行普通PCR，检测SV40、FSHR、LHR、STAR、CYP11a1等基因是否正常表达。PCR所用引物如表2所示。
表2引物序列
2.实验结果
2.1细胞形态
猪原代颗粒细胞的形态如图2所示，呈长梭型，随着代数增加，细胞形态伸长，到P3转变为条状，且不能继续传代。永生化后的猪颗粒细胞形态如图3所示，随着代数增加，细胞不会过度伸长，且形态基本与原代细胞一致。
2.2生长曲线
如图4所示，pGCs-SV40T-P10和pGCs-SV40T-P20与pGCs-P1(原代猪卵巢颗粒细胞)生长曲线基本一致，表明永生化后的猪卵巢颗粒细胞细胞与原代相比，并不会影响细胞的生长状况。pGCs-SV40T-P10和pGCs-SV40T-P20细胞数量均在36h达到最高，48h时有所减少。pGCs-P1细胞数在48h细胞才达到最高，且与36h相比相差不大。
2.3基因表达
为了检测细胞是否处于永生化的状态，测定了SV40基因在pGCs-P1(原代猪卵巢颗粒细胞)、pGCs-SV40T-P10(第10代永生化后的猪卵巢颗粒细胞)和pGCs-SV40T-P30(第30代永生化后的猪卵巢颗粒细胞)中的表达情况。结果如图5所示，SV40T基因(设计了两组引物，SV40-1和SV40-2)在pGCs-SV40T-P10和pGCs-SV40T-P30中均表达，而在pGCs-P1中没有表达，表明pGCs-SV40T细胞通过慢病毒感染，成功导入了SV40基因，进入了永生化状态。
图6为猪卵巢、颗粒细胞几种关键基因的表达情况。每种基因从左到右三个条带分别为pGCs-P1、pGCs-SV40T-P10和pGCs-SV40T-P30的表达情况。由图可以看出STAR、CYP11a1、FSHR和LHR均在pGCs-P1、pGCs-SV40T-P10和pGCs-SV40T-P30中表达。其中，CYP11a1和LHR在三种细胞中的表达水平基本一致，而相较于pGCs-P1、pGCs-SV40T-P10，pGCs-SV40T-P30的STAR和FSHR表达水平有所下降。
2.4细胞鉴定
在卵泡中，FSHR(促卵泡激素受体)仅表达于颗粒细胞表面，所以可以用FSHR抗体对猪卵巢颗粒细胞进行鉴定。用FSHR抗体免疫细胞，荧光显微镜下观察到被免疫的细胞发出红色荧光，则说明FSHR蛋白与FSHR抗体结合，贴壁生长的细胞为卵巢颗粒细胞。免疫荧光染色的结果如图7所示，pGCs-P1、pGCs-SV40T-P10和pGCs-SV40T-P30均正常表达FSHR。
2.5激素合成
如图8所示，分别测定了pGCs-P1(原代猪卵巢颗粒细胞)、pGCs-SV40T-P30(未添加底物)和pGCs-SV40T-P30(添加2.5IU/mL FSH和3ng/mL雄烯二酮)的雌激素和孕激素的表达情况。结果显示，第30代的永生化颗粒细胞的孕激素和雌激素的合成水平均低于原代颗粒细胞，但是添加了激素合成底物FSH和雄烯二酮后，两种激素的含量都基本恢复到了原代颗粒细胞的水平。
2.6猪卵巢颗粒细胞黄体化
选取pGCs-SV40T-P20进行颗粒细胞黄体化试验，以检测永生化后的猪卵巢颗粒细胞是否可以发生黄体化。结果如图9所示，与对照组相比，黄体化组(添加2.5IU/mL的LH和FSH)颗粒细胞中STAR和HSD3B1表达显著上调(P<0.01)，表明颗粒细胞黄体化成功。
本发明通过慢病毒转导的方法，成功将SV40T整合至原代猪卵巢颗粒细胞的基因组中，使其永生化，经过抗性筛选后，得到永生化的猪卵巢颗粒细胞系，命名为pGCs-SV40T(保藏编号CGMCC No.45321)。经后续试验验证，该细胞系保留了原代颗粒细胞的特性，可用于猪卵巢功能的相关研究，填补了现阶段在研究猪卵巢相关细胞增殖、分化、信号转导和激素分泌时，无可供使用的细胞系的空白。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.永生化的猪卵巢颗粒细胞系，其特征在于，其是以慢病毒载体介导SV40 T抗原转染猪卵巢颗粒细胞获得的永生化细胞系。
2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.45321。
3.永生化的猪卵巢颗粒细胞系的构建方法，其特征在于，以猪卵巢颗粒细胞作为宿主细胞，用慢病毒载体介导SV40 T抗原转染所述宿主细胞，再经嘌呤霉素筛选得到。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将编码SV40 T抗原的DNA序列构建到慢病毒载体上，得到重组慢病毒载体；
2)将1)的重组慢病毒载体与慢病毒包装辅助质粒共转染HEK-293T细胞，进行假病毒包装；
3)将2)的假病毒转染原代分离的猪卵巢颗粒细胞获得永生化细胞系。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组慢病毒载体为pBABE-puro-SV40LT，所述慢病毒包装辅助质粒为psPAX2和pMD2.g。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，pBABE-puro-SV40 LT、psPAX2和pMD2.g的摩尔比为5:3:2。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，还包括对获得的永生化细胞系进行细胞增殖活力测定的步骤。
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