CN115109756B - 一种重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞的方法及其应用。通过高表达蛋白重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞（hiGC），并通过AMH报告系统和/或CD55卵巢颗粒细胞特异性标记分子，分选获得具有不同类固醇激素合成水平、对应不同卵泡发育阶段的hiGC。将为研究颗粒细胞的功能及其与卵母细胞的相互作用提供细胞模型，也将帮助我们了解和治疗颗粒细胞相关疾病，如多囊卵巢综合征及卵巢早衰，其类固醇激素分泌特性有临床应用潜能，该方法具有重要的基础及临床研究意义。

Description

一种重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞的方法及其应用
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞的方法及其应用。
背景技术
卵巢颗粒细胞与卵母细胞共同组成卵泡结构，在卵母细胞的发育和成熟过程中不可或缺。人类卵泡发育起始于胚胎期，卵泡的发生起始于原始卵泡，根据卵泡大小、卵母细胞和颗粒细胞的发育程度，卵泡可以大致分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡和排卵前卵泡五个发育阶段(Li et al., 2020; Saitou and Miyauchi, 2016)。由于人类颗粒细胞的来源及数量有限，难以获得大量不同时期的颗粒细胞，目前对于人类颗粒细胞的功能及其与卵母细胞相互作用的研究还不够深入和全面。
此前有研究报道，可诱导人胚胎干细胞hESC分化成为人类颗粒细胞样细胞，然而该研究未在分化体系中通过分选获得颗粒细胞，也没有将分化得到的细胞与体内颗粒细胞进行比较。hESC的诱导分化过程中会产生多种细胞类型，因此该研究所报道的颗粒细胞分化体系异质性较高，该体系中未经分选的颗粒细胞并不能应用于体外研究。目前尚未有研究报道体外诱导获得较纯的有功能性的人类颗粒细胞。直接重编程是指直接将一种细胞类型诱导成另一种细胞类型而不经过中间多能性阶段的体外诱导方法。目前尚未有研究报道利用直接重编程方法获得小鼠或人类卵巢颗粒细胞，因此，鉴定新的转录因子组合并利用直接重编程方法体外诱导人类卵巢颗粒细胞是尚未解决的问题。
FOXL2是卵巢发育中非常关键的一个转录因子，FOXL2 在卵巢中的主要作用是通过抑制睾丸特异性的基因以维持颗粒细胞特性。在患有无角间性综合症的雌性山羊中，Foxl2表达异常导致向雄性转变的症状，以及卵巢向睾丸转分化(Pailhoux et al.,2002)。但该转录因子在重编程中的应用未见报道。
NR5A1属于NR5A孤儿核受体家族，在成体雌性中，NR5A1可调控STAR、HSD3B2、CYP11A1基因的表达，并调节卵巢颗粒细胞的孕酮合成(Lai et al., 2013)。但在重编程类卵巢颗粒细胞中的应用未见报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞（（human induced granulosa like cells，hiG））的方法及其应用，具体的：
本发明第一方面，提供一种类卵巢颗粒细胞，所述类卵巢颗粒细胞表达抗缪勒氏管激素（anti-Müllerianhormone，AMH）和/或卵巢颗粒细胞特异性标记分子。
优选的，所述类卵巢颗粒细胞包括多个发育阶段的类卵巢颗粒细胞。
更优选的，所述类卵巢颗粒细胞包括原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡和/或排卵前卵泡发育阶段的类卵巢颗粒细胞。
进一步优选的，所述类卵巢颗粒细胞包括原始卵泡、初级卵泡、有腔卵泡和/或排卵前卵泡发育阶段的类卵巢颗粒细胞。
更优选的，相对于未重编程的成纤维细胞，所述类卵巢颗粒细胞高表达原始卵泡、初级卵泡、有腔卵泡和/或排卵前卵泡相关基因或者蛋白，进一步优选的，所述基因或者蛋白包括NR5A1、FOXL2、CYP11A1、PGR、STAR、OCA2、SPR、DCN、KDSR、TST、ZEB2、HSD3B2、PLA2G1B、FST和/或AR中的一种或者多种。例如，所述基因或者蛋白包括HSD3B2、PLA2G1B、HSD17B1、CYP11A1和/或PGR，或者，所述基因或者蛋白包括FST和/或AR等等。
优选的，所述类卵巢颗粒细胞经刺激后可分泌类固醇激素，更优选的，所述的类固醇激素包括雌激素和/或孕激素，所述的雌激素包括17β-雌二醇；所述的孕激素包括孕酮。
更优选的，相对于未重编程的成纤维细胞或卵巢颗粒细胞，所述类卵巢颗粒细胞的17β-雌二醇分泌增加。
优选的，所述刺激包括添加睾酮、FSH和/或Activin A对类卵巢颗粒细胞进行培养。
优选的，所述类卵巢颗粒细胞表达AMH。
更优选的，所述类卵巢颗粒细胞经刺激后分泌类固醇激素，更优选的，所述的类固醇激素包括雌激素，例如17β-雌二醇，进一步优选的，所述类固醇激素还包括孕激素，例如孕酮。更优选的，相对于未重编程的成纤维细胞或卵巢颗粒细胞，所述类卵巢颗粒细胞的17β-雌二醇和/或孕酮分泌增加。
优选的，所述刺激包括添加睾酮、FSH和/或Activin A对类卵巢颗粒细胞进行培养。
优选的，所述类卵巢颗粒细胞的转录组与卵丘颗粒细胞具有相似性，相对于成纤维细胞，类卵巢颗粒细胞与卵丘颗粒细胞具有共同上调或者共同下调的基因，例如共同上调可达到704个基因，或者低于704的任意值；共同下调的基因可达到964个基因，或者低于964的任意值。
更优选的，共同上调基因包括与脂质代谢、对类固醇激素的响应、类固醇激素代谢、类固醇激素合成、类固醇的代谢调控、胆固醇运输等调控类固醇激素合成及代谢的过程相关的基因。共同下调基因包括与DNA复制、细胞核分裂、染色体分离等与细胞增殖相关的生物学过程关联的基因。
进一步优选的，所述共同上调基因包括但不仅限于CYP11A1、AR、PGR、STAR、OCA2、SPR、DCN、KDSR、TST、ZEB2。
优选的，所述类卵巢颗粒细胞高表达NR5A1、FOXL2、CYP11A1、AR、PGR、STAR、OCA2、SPR、DCN、KDSR、TST、ZEB2、HSD17B1、HSD3B2和/或PLA2G1B中的一种或者多种基因和/或蛋白。
优选的，所述类卵巢颗粒细胞在RNA水平有腔卵泡或排卵前卵泡相关基因表达较高。进一步的，所述类卵巢颗粒细胞中上调的基因与细胞外基质组成、类固醇激素合成与代谢、生殖系统发育等生物学过程相关联。
优选的，所述类卵巢颗粒细胞为有腔卵泡或排卵前卵泡发育阶段的类卵巢颗粒细胞。优选的，所述类卵巢颗粒细胞表达卵巢颗粒细胞特异性标记分子。
更优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55、GPC4、DLK1、CD9及IGF1R中的一种或者多种。更优选的，所述特异性标记分子包括CD55。
更优选的，相对于人卵巢颗粒肿瘤细胞系COV434，所述表达卵巢颗粒细胞特异性标记分子的类卵巢颗粒细胞中17β-雌二醇分泌增加，和/或孕酮分泌无变化，所述无变化是指统计学上无显著性差异。
更优选的，所述类卵巢颗粒细胞高表达早期颗粒细胞相关基因。进一步优选的，所述类卵巢颗粒细胞在RNA水平原始或初级卵泡相关基因表达较高。更优选的，所述类卵巢颗粒细胞上调的基因与上皮形成、肾发育、中胚层分化等生物学过程相关联。
更优选的，所述类卵巢颗粒细胞为早期，例如原始或初级卵泡期发育阶段的类卵巢颗粒细胞。
更优选的，相对于未重编程的成纤维细胞，所述类卵巢颗粒细胞高表达FST和/或AR，进一步的，所述类卵巢颗粒细胞还高表达HSD3B2、PLA2G1B、PGR。
更优选的，所述类卵巢颗粒细胞为CD55+类卵巢颗粒细胞，相对于AMH+类卵巢颗粒细胞，CD55+类卵巢颗粒细胞高表达FST和/或AR，低表达HSD3B2、CYP11A1、PGR、PLA2G1B。
在一个具体的实施方式中，所述类卵巢颗粒细胞表达CD55（卵巢颗粒细胞特异性标记分子），所述类卵巢颗粒细胞高分泌雌激素，低分泌孕酮。
在一个具体的实施方式中，所述类卵巢颗粒细胞表达AMH，所述类卵巢颗粒细胞高分泌雌激素和孕酮。
所述类卵巢颗粒细胞包括富含类卵巢颗粒细胞的细胞群，或者具有单一类卵巢颗粒细胞的细胞系。
本发明的第二方面，提供一种蛋白在成纤维细胞重编程为上述类卵巢颗粒细胞中的应用，所述蛋白包括FOXL2、NR5A1、RUNX1、GATA4、WT1和/或RSPO1中的一种或者多种。
优选的，所述蛋白包括FOXL2和/或NR5A1
更优选的，所述蛋白包括FOXL2和NR5A1。
更优选的，所述蛋白包括1）FOXL2和/或NR5A1，和2）RUNX1、GATA4、WT1/或RSPO1中的一种或者多种。
更优选的，所述成纤维细胞直接重编程为类卵巢颗粒细胞。所述直接重编程是指直接将一种细胞类型诱导成另一种细胞类型而不经过中间多能性阶段。
优选的，所述成纤维细胞来自于哺乳动物，更优选的，所述哺乳动物选自人、大鼠、小鼠、狗、猫、牛、兔、马、猪或猴，进一步优选的，所述成纤维细胞来自dH9成纤维细胞株、人肺成纤维细胞株或者胚胎干细胞分化而获得的成纤维细胞株。
本发明第三方面，提供了一种上述类卵巢颗粒细胞的制备方法，所述的制备方法包括：1）对成纤维细胞进行基因修饰，所述基因修饰使得成纤维细胞中蛋白的活性提高或者过表达，所述蛋白包括FOXL2、NR5A1、RUNX1、GATA4、WT1和/或RSPO1中的一种或者多种；2）培养所述成纤维细胞重编程为类卵巢颗粒细胞。
优选的，所述步骤1）的基因修饰方式包括点突变，连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数、融合共表达或者转基因，更优选的，所述基因修饰方式包括转基因导入外源基因，所述外源基因编码所述的蛋白，进一步优选的，利用转染载体，例如慢病毒，转染成纤维细胞导入外源基因。
优选的，所述蛋白包括FOXL2和/或NR5A1。
更优选的，所述蛋白包括FOXL2和NR5A1。
更优选的，所述蛋白包括1）FOXL2和/或NR5A1，和2）RUNX1、GATA4、WT1/或RSPO1中的一种或者多种。
优选的，所述的制备方法包括以下步骤：
A）构建含有编码所述蛋白的核苷酸序列的转染载体A；
B）将步骤A）的转染载体A转染成纤维细胞。
更优选的，所述步骤A）中的转染载体A通过以下步骤获得：
a）构建高表达所述蛋白的慢病毒载体：扩增所述蛋白的基因，并将其分别克隆至慢病毒载体上。
进一步优选的，所述编码蛋白的核苷酸序列如下：
FOXL2基因的核苷酸序列如GenBank: AF301906.1所示；
NR5A1基因的核苷酸序列如GenBank: HQ709184.1所示；
RUNX1基因的核苷酸序列如GenBank: BC136380.1所示；
GATA4基因的核苷酸序列如GenBank: AY740706.1所示；
WT1基因的核苷酸序列如GenBank: AH003034.2所示；
RSPO1基因的核苷酸序列如GenBank: DQ318235.1所示。
进一步优选的，所述的慢病毒载体上包含强启动子的基因片段，例如EF1。
b）慢病毒包装：使用宿主细胞将步骤a）获得的慢病毒载体包装为慢病毒，并收集含有目的基因的慢病毒。
更优选的，所述步骤b）包括将辅助载体和包装载体一并导入宿主细胞，包装为慢病毒。
进一步优选的，所述宿主细胞包括293、293T、293FT。
优选的，所述步骤A）包括步骤A0）：构建含有报告系统的转染载体A0，所述报告系统包括卵巢颗粒细胞特异性启动子和报告基因，所述报告基因在卵巢颗粒细胞特异性启动子调控下表达；更优选的，所述特异性启动子在成纤维细胞中不启动报告基因表达，所述特异性启动子包括AMH启动子。
在一个具体的实施方式中，所述AMH启动子的核苷酸序列与NG_012190.1的3628-5185位具有至少90%的同一性，或者如NG_012190.1的3628-5185位所示。
优选的，所述转染载体包括慢病毒。
更优选的，所述步骤A0）在步骤A）之前、与步骤A）同步或者在步骤A）之后。
更优选的，所述步骤A0）之后包括步骤B0）将含有报告系统的转染载体A0转染成纤维细胞。
更优选的，所述步骤B0）在步骤B）之前、与步骤B）同步或者在步骤B）之后。
在一个具体的实施方式中，所述制备方法包括：
步骤A0）：构建含有报告系统的转染载体A0，所述报告系统包括卵巢颗粒细胞特异性启动子和报告基因，所述报告基因在卵巢颗粒细胞特异性启动子调控下表达；
步骤B0）将含有报告系统的转染载体A0转染成纤维细胞系；
步骤A）构建含有编码上述蛋白的核苷酸序列的转染载体A；
步骤B）将步骤A）的转染载体A转染步骤B0）获得的成纤维细胞。
优选的，所述成纤维细胞来自于哺乳动物，更优选的，所述哺乳动物选自人、大鼠、小鼠、狗、猫、牛、兔、马、猪或猴，进一步优选的，所述成纤维细胞来自dH9成纤维细胞或人肺成纤维细胞。
更优选的，所述dH9成纤维细胞的制备方法包括：胚胎干细胞在胚胎干细胞培养基中培养，然后在分化培养基中培养，分化获得dH9成纤维细胞。
优选的，所述的制备方法包括步骤C）富集、分离和/或分选类卵巢颗粒细胞，利用卵巢颗粒细胞特异性标记分子或者报告基因对类卵巢颗粒细胞进行富集、分离和/或分选。更优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55、GPC4、DLK1、CD9及IGF1R中的一种或者多种。更优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55。
更优选的，上述报告基因选自CAT、hGH、SEAP、RFP、GFP或EGFP、β-Gal、mCherry或萤火虫荧光素酶基因，进一步优选的，所述报告基因包括EGFP和/或mCherry。
更优选的，所述分选步骤包括根据类卵巢颗粒的报告基因将类卵巢颗粒细胞分选为有腔卵泡或排卵前卵泡时期的类卵巢颗粒细胞。
更优选的，所述分选步骤包括根据卵巢颗粒细胞特异性标记分子将类卵巢颗粒细胞分选为早期类卵巢颗粒细胞，例如原始或初级卵泡期的类卵巢颗粒细胞。所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55、GPC4、DLK1、CD9及IGF1R中的一种或者多种。更优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55。
进一步优选的，所述分选步骤包括对类卵巢颗粒特异性标记分子进行检测。
优选的，所述检测试剂包括抗卵巢颗粒细胞特异性标记分子的抗体。
更优选的，所述成纤维细胞直接重编程为类卵巢颗粒细胞。所述直接重编程是指直接将一种细胞类型诱导成另一种细胞类型而不经过中间多能性阶段。
本发明第四方面，提供一种载体，所述载体包括卵巢颗粒细胞特异性启动子和报告基因。
所述报告基因在卵巢颗粒细胞特异性启动子调控下表达；更优选的，所述特异性启动子在成纤维细胞中不启动报告基因表达，所述特异性启动子包括AMH启动子。
在一个具体的实施方式中，所述AMH启动子的核苷酸序列与NG_012190.1的3628-5185位具有至少90%的同一性，或者如NG_012190.1的3628-5185位所示。
优选的，上述报告基因包括报告基因选自CAT、hGH、SEAP、RFP、GFP或eGFP、β-Gal、mCherry或萤火虫荧光素酶基因，进一步优选的，所述报告基因包括EGFP和/或mCherry。
在一个具体的实施方式中，所述载体包括AMH-EGFP或AMH-mCherry。
本发明第五方面，提供一种上述载体在富集、标记、筛选和/或分选类卵巢颗粒细胞中的应用。
优选的，经上述载体分选，将类卵巢颗粒细胞分选为有腔卵泡或排卵前卵泡发育阶段的类卵巢颗粒细胞。
本发明第六方面，提供上述类卵巢颗粒细胞的应用，所述应用包括：
1）研究卵巢颗粒细胞的功能；
2）研究卵巢颗粒细胞与卵母细胞的相互作用，例如促进卵母细胞发育和分化；
3）研究卵巢颗粒细胞相关疾病；
4）筛选和/或制备药物。
本发明第七方面，提供一种卵巢颗粒细胞特异性标记分子或其检测试剂在分选卵巢颗粒细胞中的应用，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子将卵巢颗粒细胞分选为早期，例如原始或初级卵泡期的卵巢颗粒细胞。
优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55、GPC4、DLK1、CD9及IGF1R中的一种或者多种。更优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55。
本发明第八方面，提供一种卵巢颗粒细胞的分选方法，所述分选方法包括对卵巢颗粒细胞特异性标记分子进行检测，将卵巢颗粒细胞分选为早期，例如原始或初级卵泡期的卵巢颗粒细胞。
优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55、GPC4、DLK1、CD9及IGF1R中的一种或者多种。更优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55。
优选的，所述卵巢颗粒细胞包括类卵巢颗粒细胞，所述类卵巢颗粒细胞具有卵巢颗粒细胞的功能，但来源于非卵巢颗粒细胞；更优选的，所述类卵巢颗粒细胞包括上述任一的类卵巢颗粒细胞或者其他来源的类卵巢颗粒细胞。
本发明第九方面，提供一种卵巢颗粒细胞的分选系统，所述分选系统包括卵巢颗粒细胞特异性标记分子的检测试剂和/或上述任一的载体。
优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55、GPC4、DLK1、CD9及IGF1R中的一种或者多种。更优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55。
优选的，所述检测试剂包括抗卵巢颗粒细胞特异性标记分子的抗体。
本发明第十方面，提供一种上述分选系统在分选卵巢颗粒细胞中的应用。
优选的，所述卵巢颗粒细胞包括类卵巢颗粒细胞，所述类卵巢颗粒细胞具有卵巢颗粒细胞的功能，但来源于非卵巢颗粒细胞；更优选的，所述类卵巢颗粒细胞包括上述任一的类卵巢颗粒细胞。
优选的，上述分选系统将卵巢颗粒细胞分选为早期，例如原始或初级卵泡期的卵巢颗粒细胞，所述卵巢颗粒细胞表达卵巢颗粒细胞特异性标记分子，更优选的，所述卵巢颗粒细胞的表达量不超过0.2%（优选不超过0.1%）卵巢颗粒细胞特异性启动子调控下的报告基因，进一步优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性启动子为AMH。
优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55、GPC4、DLK1、CD9及IGF1R中的一种或者多种。更优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55。
优选的，上述分选系统将卵巢颗粒细胞分选为有腔卵泡或排卵前卵泡时期的卵巢颗粒细胞，所述卵巢颗粒细胞表达卵巢颗粒细胞特异性启动子调控下的报告基因，进一步优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性启动子为AMH。
本发明的类卵巢颗粒细胞是指具有卵巢颗粒细胞的功能，但来源于非卵巢颗粒细胞的细胞。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本申请所述的细胞不能发育为动物个体。
本申请引用的文献：
Suter, D.M.et al. Rapid generation of stable transgenic embryonicstem cell lines using modular lentivectors .Stem Cells 24 ,615–623，2006。
Zhang, Y., et al. Transcriptome Landscape of Human FolliculogenesisReveals Oocyte and Granulosa Cell Interactions. Mol Cell 72, 1021-1034 e1024,2018.
Jorgez, C.J., et al. Granulosa cell-specific inactivation offollistatin causes female fertility defects. Mol Endocrinol 18,2004
Wang, Z., et al.. Follistatin288 Regulates Germ Cell Cyst Breakdownand Primordial Follicle Assembly in the Mouse Ovary. PLoS One 10, e0129643,2015
Steffensen, L.L., et al. Transcripts Encoding the Androgen Receptorand IGF-Related Molecules Are Differently Expressed in Human Granulosa CellsFrom Primordial and Primary Follicles. Front Cell Dev Biol 6, 85, 2018.
L. Li et al., Single-Cell RNA-Seq Analysis Maps Development of HumanGermline Cells and Gonadal Niche Interactions. Cell Stem Cell 20, 891-892(2017).
上述文献在此整体引用作为参考。
本发明的有益技术效果：
1）本发明首次利用包括转录因子FOXL2蛋白和/或NR5A1的蛋白将成纤维细胞重编程为类卵巢颗粒细胞，填补了卵巢颗粒细胞来源不足的困境，为卵巢颗粒细胞功能研究提供了丰富资源。
2）本发明获得类卵巢颗粒细胞包括多个发育阶段的类卵巢颗粒细胞，例如可包括原始卵泡、初级卵泡、有腔卵泡和/或排卵前卵泡发育阶段的类卵巢颗粒细胞，获得的类卵巢颗粒细胞群更接近在体的卵巢颗粒细胞状态，更接近在体的组织器官模型，而不仅仅是细胞模型。
3）本发明的蛋白将成纤维细胞直接重编程为类卵巢颗粒细胞，不经过中间多能性阶段，从而避免了从胚胎干细胞分化为类卵巢颗粒细胞的高度异质性。
4）本发明的重编程方法获得的类卵巢颗粒细胞阳性率高，AMH-EGFP+类卵巢颗粒细胞的阳性率可达5%，CD55+类卵巢颗粒细胞的阳性率可达35%，流式分选AMH-EGFP+和CD55+类卵巢颗粒细胞可获得较纯的类卵巢颗粒细胞，避免了未分选导致的细胞异质性。
5）优选的方案中，本发明利用包含卵巢颗粒细胞特异性启动子和报告基因的报告系统，便于类卵巢颗粒细胞的富集、分离和分选。
6）本发明首次发现利用卵巢颗粒细胞特异性标记分子可以将卵巢颗粒细胞进行分选，将卵巢颗粒细胞分选为早期，例如原始或初级卵泡期的卵巢颗粒细胞，对应不同的发育阶段，将类卵巢颗粒细胞功能进行细化，有利于建立更为精准的细胞模型，同时避免在细胞系中进行基因修饰，不依赖基因打靶的报告系统分选hiGC。
附图说明
图1：P3代dH9细胞形态图，图中标尺为500μm；
图2a：多能性相关基因在dH9和H9细胞中的表达，mRNA相对表达量以GAPDH为内参。实验数据来自两次独立的生物学重复，每个生物学重复有两个技术性重复。误差线代表标准误差；
图2b：成纤维细胞相关基因在dH9和H9细胞中的表达，mRNA相对表达量以GAPDH为内参。实验数据来自两次独立的生物学重复，每个生物学重复有两个技术性重复。误差线代表标准误差；
图3：AMH荧光报告载体示意图，PRSV/5’LTR和∆U/3’LTR为慢病毒表达载体上携带的控制病毒复制、转录和翻译的元件；
图4：携带AMH荧光报告系统的dH9细胞系的建立，由H9 hESC分化而来的dH9细胞系，在P3代被慢病毒侵染，经过BSD药筛获得dH9-AMH细胞系；
图5：dH9-AMH细胞重编程示意图；
图6：不同组合转录因子诱导AMH-EGFP阳性率的比较，每组实验数据来自三次独立的生物学重复，p2k7为侵染空载体慢病毒的对照组。误差线代表标准误差，组间差异用One-way ANOVA检验；
图7：流式分析AMH-mCherry及AMH-EGFP阳性率；
图8：FN诱导的AMH-EGFP+细胞形态，图为重编程后第11天经流式分选的AMH-EGFP+细胞贴壁后的细胞形态，及dH9成纤维细胞的形态，图中标尺为100μm；
图9：AMH-EGFP+细胞的雌激素分泌水平，AMH-EGFP+为重编程后第11天经流式分选的AMH-EGFP+细胞，各组细胞均以6×104/孔的密度铺板，24h后，添加100ng/ml睾酮或5IU/mlFSH或60ng/ml Activin A进行刺激，48h后收集上清液用于ELISA检测17β-雌二醇的分泌水平。实验数据来自三次独立的生物学重复，误差线代表标准误差，组间差异用One-wayANOVA检验，*代表p<0.05，***代表p<0.001；
图10：AMH-EGFP+细胞的孕酮分泌水平，AMH-EGFP+为重编程后第11天经流式分选的AMH-EGFP+细胞，各组细胞均以6×104/孔的密度铺板，24h后，添加5IU/ml FSH及60ng/mlActivin A处理，CTRL组为不添加FSH及Activin A的培养基对照组，48h后，收集细胞培养上清液用于ELISA检测孕酮分泌水平，实验数据来自三次独立的生物学重复，误差线代表标准误差。样本间差异用One-way ANOVA检验，ns代表差异无显著性；
图11：FOXL2及NR5A1在AMH-mCherry+细胞中的表达，AMH-mCherry代表流式分选的AMH-mCherry+细胞，p2k7为对照组细胞，图（a）为FOXL2及NR5A1的免疫荧光染色结果，图中标尺为50μm；图（b）为Western Blot结果，GAPDH为内参蛋白；
图12：AMH-mCherry+细胞中AMH及mCherry的免疫荧光染色，AMH-mCherry代表流式分选的AMH-mCherry+细胞，p2k7为对照组细胞，图中标尺为50μm；
图13：AMH-EGFP+细胞的差异表达基因分析，图（a）韦恩图显示人卵丘颗粒细胞（cumulus GC）、AMH-EGFP+细胞分别与p2k7对照组的差异基因数目及二者共同的差异表达基因数目，DEGs代表差异表达基因；图（b）显示二者共同上调、下调，或差异趋势相反的差异表达基因数目；
图14：AMH-EGFP+细胞与人卵丘颗粒细胞的转录组比较，图为聚类分析热图，Cumulus GC 代表人卵丘颗粒细胞样本，AMH-EGFP+_D7和AMH-EGFP+_D11分别为重编程后第7天和第11天经流式分选的AMH-EGFP+细胞，p2k7_D7和p2k7_D11分别为重编程后第7天和第11天经流式分选的对照组细胞，1、2代表两个独立的生物学重复，聚类分析所用的基因为人卵丘颗粒细胞和AMH-EGFP+细胞相比p2k7组共同的差异表达基因；图中左上角色块代表AMH-EGFP+细胞和Cumulus GC相对p2k7组共同上调的基因，右上角色块代表AMH-EGFP+细胞和Cumulus GC相对p2k7组共同下调的基因，左下及右下分别代表p2k7组相对AMH-EGFP+细胞和Cumulus GC下调和上调的基因；
图15：AMH-EGFP+细胞中颗粒细胞相关基因的表达，mRNA相对表达量以GAPDH为内参，误差线代表标准误差，实验数据来自两次独立的生物学重复，每个生物学重复包含两个技术性重复，各基因中柱状图中，从左到右分别代表人卵丘颗粒细胞（Cumulus GC）组、AMH-EGFP+组、p2k7组；
图16a：人卵丘颗粒细胞和AMH-EGFP+细胞共同上调基因的生物学过程的GO分析结果，图中圆点大小代表与对应的词条相关的基因数目；
图16b：人卵丘颗粒细胞和AMH-EGFP+细胞共同下调基因的生物学过程的GO分析结果，图中圆点大小代表与对应的生物学过程相关的基因数目；
图17a：卵巢颗粒细胞特异性标记分子筛选流程图；
图17b：五个卵巢颗粒细胞特异性标记分子在AMH-EGFP+hiGC、p2k7及人卵丘颗粒细胞中的表达及上调倍数，Cumulus GC代表人卵丘颗粒细胞；
图17c：CD55在AMH-EGFP+hiGC、p2k7及人卵丘颗粒细胞中的FPKM值；Cumulus GC代表人卵丘颗粒细胞；
图18：FN重编程体系中CD55的表达，图为FN诱导重编程后第11天的细胞经流式染色分析CD55阳性细胞比例；
图19：CD55+细胞分泌雌激素水平，重编程后第11天经流式分选的AMH-EGFP+hiGC及CD55+细胞，以6×104/孔的密度铺板，24h后，添加睾酮及FSH，48h后收集上清液用于ELISA检测17β-雌二醇的分泌水平，CTRL为添加睾酮及FSH的培养基对照，实验数据为三次独立的生物学重复，误差线代表标准误差，组间差异用One-way ANOVA检验，*代表p＜0.05，ns代表差异无显著性；
图20：CD55+细胞分泌孕酮水平，重编程后第11天经流式分选的AMH-EGFP+hiGC及CD55+细胞，各组细胞均以6×104/孔的密度铺板，24h后换液，48h后收集上清液用于ELISA检测孕酮的分泌水平，图中各柱从左到右，分别代表AMH-EGFP+组、CD55+组、COV434组、dH9组、CTRL组，CTRL组为培养基对照组，实验数据来自三次独立的生物学重复，误差线代表标准误差，组间差异用One-way ANOVA检验，***代表p＜0.001，ns代表差异无显著性；
图21：流式分析CD55+细胞中的AMH-EGFP+及AMH-EGFP-细胞，FN为FOXL2及NR5A1诱导重编程后第11天的细胞，dH9及FN组均为CD55染色后的细胞；
图22：CD55+AMH-EGFP-细胞分泌雌激素水平，重编程后第11天经流式分选AMH-EGFP+hiGC及CD55+AMH-EGFP-细胞，均以6×104/孔的密度铺板，24h后，添加睾酮及FSH，48h后收集上清液用于ELISA检测17β-雌二醇的分泌水平，实验数据来自三次独立的生物学重复，误差线代表标准误差。组间差异用One-way ANOVA检验，**代表p＜0.01，***代表p＜0.001，ns代表差异无显著性；
图23：CD55+AMH-EGFP-细胞分泌孕酮水平，重编程后第11天经流式分选的AMH-EGFP+细胞、CD55+细胞、CD55+AMH-EGFP-细胞，均以6×104/孔的密度铺板，24h后换液，48h后收集上清液用于ELISA检测孕酮的分泌水平，CTRL为培养基对照组，实验数据来自三次独立的生物学重复，误差线代表标准误差，组间差异用One-way ANOVA检验，***代表p＜0.001，ns代表差异无显著性；
图24：CD55+及AMH-EGFP+细胞的转录比较，AMH-EGFP+及CD55+细胞为重编程后第11天经流式分选的细胞。收集细胞提取RNA，qRT-PCR检测HSD17B1等基因的mRNA水平，相对表达量以GAPDH为内参，误差线代表标准误差，实验数据为两次独立的生物学重复，每个生物学重复包含两个技术性重复；
图25：CD55+AMH-EGFP-及CD55+AMH-EGFP+细胞的转录比较，CD55+AMH-EGFP-细胞及CD55+AMH-EGFP+细胞为重编程后第11天经流式分选的细胞，收集细胞提取RNA，qRT-PCR检测HSD3B2等基因的mRNA水平，mRNA相对表达量以GAPDH为内参，误差线代表标准误差，实验数据来自两次独立的生物学重复，每个生物学重复包含两个技术性重复；
图26：CD55+、CD55+AMH-EGFP-细胞及AMH-EGFP+hiGC的转录组表达分析热图，AMH-EGFP+代表重编程后第11天经流式分选的AMH-EGFP+hiGC，CD55+、CD55+AMH-EGFP-分别代表重编程后第11天经流式分选的CD55+、CD55+AMH-EGFP-细胞，1、2代表两个独立的生物学重复；
图27a：CD55+AMH-EGFP-细胞中上调基因的生物学过程的GO分析结果，图中展示的均为排名前十的GO词条，图中圆点大小代表与对应词条相关的基因数目；
图27b：AMH-EGFP+hiGC中上调基因的生物学过程的GO分析结果，图中展示的均为排名前十的GO词条，图中圆点大小代表与对应词条相关的基因数目；
图28：hiGC阻滞小鼠GVBD发生的统计分析结果，图为CD55+AMH-EGFP-组（左柱，n=18）、AMH-EGFP+组（中间柱，n=21）、对照组（右柱，n=15）的GVBD发生率，CD55+AMH-EGFP-及AMH-EGFP+细胞为重编程后第11天经流式分选的hiGC，CTRL组为没有与hiGC共培养的对照组，误差线代表标准误差，实验数据来自三次独立的生物学重复；组间差异用One wayANOVA检验，*代表p<0.05；
图29：hiGC阻滞小鼠GVBD的发生，图为1h时，CD55+AMH-EGFP-组、AMH-EGFP+组、对照组发生GVBD的代表图，CD55+AMH-EGFP-及AMH-EGFP+细胞为重编程后第11天经流式分选的hiGC，铺板24h后用矿物油覆盖，12h后将取出的小鼠GV期卵母细胞放入细胞孔内，CTRL为没有与hiGC共培养的对照组，黑色箭头指示GV期卵母细胞，白色箭头指示发生GVBD的卵母细胞，图中标尺为200μm；
图30：CD55+AMH-EGFP-细胞及AMH-EGFP+细胞抑制PB1排出，CD55+AMH-EGFP-细胞及AMH-EGFP+细胞为重编程后第11天经流式分选的hiGC，铺板24h后用矿物油覆盖，12h后将取出的小鼠GV期卵母细胞放入细胞孔内，CTRL为没有与hiGC共培养的对照组，图（a）为AMH-EGFP+组（n=18）、CD55+AMH-EGFP-组（n=18）、对照组（n=15）的PB1排出率，误差线代表标准误差，实验数据来自三次独立的生物学重复；图（b）为16h时，各组排出PB1的代表图，白色箭头指示排出PB1的卵母细胞，图中标尺为200μm。组间差异用Two-way ANOVA检验，***代表p<0.001；
图31：CD55+细胞与DFBV细胞共培养方法示意图，将两类细胞以1：1比例混合后，在低吸附板上聚集两天，然后将细胞团转移至Transwell 上，用浓度为50%的Matrigel包裹，在添加DOX、RA、forskolin、SCF、BMP2的培养基继续培养；
图32：CD55+细胞维持共培养细胞团形态，图为培养8天后的细胞团在Transwell上的形态，CD55+DFBV代表共培养组，DFBV为单独培养的对照组，每组展示的是两个培养在同一Transwell上的细胞团，图中标尺为500μm；
图33：共培养细胞团中CD55+细胞及DAZL-mCherry+细胞的定位，图为CD55+hiGC与DAZL-mCherry+hPGCLC共培养8天后细胞团的免疫荧光染色结果，DAZL染色细胞代表过表达DAZL及BOULE的DAZL-mCherry+hPGCLC，CD55染色代表CD55+hiGC，图中标尺为100μm（上）及5μm（下）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中主要使用的材料和试剂来源：
小鼠胚胎成纤维细胞系（MEF）取自E13.5天的ICR孕鼠；
雌性胚胎干细胞H9细胞系购自WiCell公司；
293FT细胞系和HT1080细胞系购自Invitrogen公司；
人卵丘颗粒细胞由温州医科大学附属医院生殖中心提供；
CD55抗体（555694）购自BD Biosciences公司；
KnockOutTM DMEM、减血清培养基（Opti-MEM）、非必需氨基酸（NEAA）、谷氨酰胺（Glutamax）、脂质体转染试剂（Lipofectamine 2000）、杀稻瘟菌素（Blasticidin）、聚凝胺（Polybrene）均购自Gibico公司；
基底胶Matrigel购自Corning公司；
Activin A、卵泡刺激素（FSH）购自R&D公司；
ROCK抑制剂（Y-27632）及睾酮（Testosterone）购自上海陶素生化科技有限公司；
胎牛血清FBS购自Gemini公司。
雌激素酶联免疫吸附检测试剂盒（Estradiol ELISA Kit）购自Cayman Chemical公司；
孕酮酶联免疫吸附检测试剂盒（Pg ELISA Kit）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
四甲基乙二胺（TEMED）、RUNX1 cDNA载体购买自维真生物公司。
cDNA反转录试剂盒及qRT-PCR mix购自全式金生物公司。
实施例1 人成纤维细胞系（dH9）的分化
原代培养小鼠成纤维细胞MEF，为人类雌性胚胎干细胞系H9的培养提供饲养层细胞，并培养人类雌性胚胎干细胞系H9。
人成纤维细胞系（dH9）的分化：
1. 提前准备Matrigel包被的六孔板，配Matrigel（500μl Matrigel+50mlKnockout DMEM），每孔加入1ml，4℃保存；
2. 抠克隆前将孔内Matrigel吸走，换成dH9培养基；
3. dH9细胞的培养基配方如表1所示：
表1：dH9培养基配方
Figure 259854DEST_PATH_IMAGE001
4. 用玻璃针将H9克隆从MEF饲养层上抠下，加入Matrigel包被的六孔板上；
5. 用H9培养基培养2到3天，每天换液，待克隆长至大小适中，将培养基更换成dH9培养基进行分化；
6. 每两天换液一次，观察H9形态变化；
7. H9克隆在dH9培养基中逐渐分化，首先在克隆边缘出现细长的成纤维细胞样细胞；随着培养时间的延长，成纤维细胞样细胞发生增殖和迁移，靠近中间的细胞逐渐分化，而较大克隆中间的细胞由于则由于周围细胞的挤压而突出，这一代细胞为P0。
8. 两周后，待孔内分化的成纤维细胞开始变密，进行传代；
9 传代前，吸走培养基，PBS洗一次；
10. 37℃ Tryple消化细胞5min，将细胞1:3传代；
结果显示：至P3时细胞形态较均一，大多数细胞呈成纤维细胞形态，如图1所示。
进一步检测多能性干细胞相关基因及成纤维细胞相关基因的表达情况，qRT-PCR结果显示，相比H9 hESC，dH9细胞中多能性干细胞相关基因OCT4、SOX2、NANOG的表达下调（图2a），而成纤维细胞相关基因COL1A1、COL1A2、P4Hβ的表达上调（图2b）。根据细胞形态及基因表达确定dH9为成纤维细胞。
实施例2 AMH荧光报告载体的构建
1.首先从人的cDNA序列中PCR扩增得到AMH启动子片段（其核苷酸序列如NG_012190.1的3628-5185位所示），连接进入门载体pENTR™5′-TOPO®，构建pENTR-AMH-promoter载体；
2.将EGFP（其核苷酸序列如GenBank: KY295921.1所示）或者mCherry（其核苷酸序列如GenBank: MK024392.1所示）连接至入门载体pENTR™/D-TOPO®构建pENTR-D-mCherry或pENTR-D-EGFP载体；
3. 用LR酶(Cat .No .11791-020)将pENTR-D-mCherry载体或pENTR-D-EGFP载体、pENTR-AMH-promoter载体以及病毒载体p2k7带有杀稻瘟菌素（BSD）抗性的p2k7-BSD质粒进行同源重组从而得到目的载体p2k7-AMH-mCherry-BSD载体和p2k7-AMH-EGFP-BSD载体。
AMH荧光报告载体示意图如图3所示。
实施例3 高表达目的蛋白的慢病毒载体构建
其中目的蛋白包括FOXL2、NR5A1、RUNX1、GATA4、WT1和RSPO1
一：高表达FOXL2慢病毒载体的构建
1)首先从人的cDNA序列中PCR扩增得到FOXL2基因片段，其核苷酸序列如GenBank:AF301906.1所示，连接至入门载体pENTR™/D-TOPO®构建pENTR-D-FOXL2载体；
2) 将强启动子EF1的基因片段（其核苷酸序列如MT612432.1的639-1822位所示）连接进入门载体pENTR™5′-TOPO®构建pENTR-5’-EF1α载体；
3) 通过LR反应，将pENTR-D-FOXL2、pENTR-5’-EF1α、以及p2k7-G418质粒进行同源重组从而得到目的高表达载体p2k7-EF1α-FOXL2。
构建得到的p2k7-EF1α-FOXL2高表达FOXL2蛋白。
二：高表达其他蛋白慢病毒载体的构建
其他蛋白的构建同p2k7-EF1α-FOXL2。
构建得到的p2k7-EF1α-NR5A1高表达NR5A1蛋白，其中NR5A1的基因片段的核苷酸序列如GenBank: HQ709184.1所示。
构建得到的p2k7-EF1α- RUNX1高表达RUNX1蛋白，其中RUNX1的基因片段的核苷酸序列如GenBank: BC136380.1所示。
构建得到的p2k7-EF1α- GATA4高表达GATA4蛋白，其中GATA4的基因片段的核苷酸序列如GenBank: AY740706.1所示。
构建得到的p2k7-EF1α- WT1高表达WT1蛋白，其中WT1的基因片段的核苷酸序列如GenBank: AH003034.2所示。
构建得到的p2k7-EF1α- RSPO1高表达RSPO1蛋白，其中RSPO1的基因片段的核苷酸序列如GenBank: DQ318235.1所示。
实施例4慢病毒包装及滴度测定
1使用293FT细胞系进行慢病毒包装，在15cm培养皿上培养293FT细胞，包病毒所用293FT代数控制在20代以内；
2 293FT细胞培养基配方如表2所示：
表2：293FT培养基配方
Figure 708152DEST_PATH_IMAGE002
3 当293FT密度为90-95%时进行慢病毒包装，慢病毒包装步骤如下：
i）准备A、B两个50ml离心管，A管加入：5ml Opti-MEM+120μl Lipo2000，B管中加入：10ml Opti-MEM+10μg Vsvg包装质粒+15μg ∆8.9包装质粒+目标质粒（实施例2构建的载体）；
ii）涡旋混匀，室温静置5min；
iii）然后将A液缓缓加入B液，涡旋混匀，室温静置20min；
iv）将A+B混液加入293FT中，放入37℃细胞培养箱；
v）6h后换液成25ml无抗293FT培养基；
vi）72h后，收集培养液，2000rpm离心5min；
vii）取上清，用0.45μm孔径滤膜过滤，分装并冻存于-80℃；
利用HT1080细胞系进行病毒的滴度测定，结果显示病毒滴度为105-106TU/ml。
实施例5 dH9-AMH细胞系的建立
携带AMH荧光报告系统的dH9细胞系如图4所示，具体构建步骤如下：
1 将P3代形态较均一的dH9传代至六孔板，密度约为40%-50%；
2 每孔加入500μl p2k7-AMH-EGFP-BSD或p2k7-AMH-mcherry-BSD病毒，及500μldH9培养基，在病毒混合液中加入终浓度为8μg/ml的Polybrene；
3 6h后，补液1ml dH9培养基；
4 病毒侵染24h后，吸走病毒混合液，2ml PBS洗两次，换成正常dH9培养基；
5 病毒侵染48h后，加BSD进行药筛；
6 每天换液，BSD药筛3-4天后，停止药筛；
7 待细胞密度为80-90%左右，37℃消化5min，传代至P5代；
8 待P5代细胞长至80-90%密度，冻存至液氮罐备用;
实施例6 dH9成纤维细胞重编程
dH9-AMH细胞重编程示意图如图5所示，重编程具体步骤如下：
1 复苏P5代dH9-AMH-EGFP或dH9-AMH-mcherry细胞至15cm培养皿；
2 待P7代细胞长到约90%密度，将细胞传代用于重编程；
3 吸走培养基，PBS洗两次，37℃用Tryple消化细胞5min；
4 1000rpm离心5min，吸走上清，dH9培养基重悬；
5 细胞计数，将细胞稀释成1.5×106/ml；
6 1.5×106个细胞/培养皿的密度传代至15cm培养皿；
7 传代第2天，使用滴度在同一数量级的高表达上述蛋白的慢病毒（实施例3）侵染dH9；
8 病毒侵染当天为Day-2，病毒侵染体系如下：
1）单因子（FOXL2、NR5A1、RUNX1、GATA4、WT1或RSPO1）侵染体系中，病毒体积6ml，培养基体积12ml，8μg/ml polybrene；
2）两因子（FOXL2和NR5A1，FN）侵染体系中，病毒各6ml，培养基体积6ml，8μg/mlpolybrene；
3）三因子（FOXL2和NR5A1，第三个因子为RUNX1、GATA4、WT1或RSPO1中的任意一种）侵染体系中，病毒体积各6ml，8μg/ml polybrene；
9 Day-1，将病毒吸走，PBS洗两次，换成正常培养基；
10 Day-0，加入1mg/ml G418药筛，每2天换一次液；
11 Day-5，停止药筛，将培养基换成没有G418的正常培养基；
12 此后每两天换液，Day-7或Day-11收集细胞用于流式分析或分选。
单因子、两因子和三因子侵染体系结果如图6和表3所示。
表3：各因子侵染体系的AMH-EGFP阳性率
Figure 19048DEST_PATH_IMAGE003
结果显示：相比p2k7对照组，六组单因子高表达组均能诱导AMH-EGFP阳性（AMH-EGFP+）细胞，其中FOXL2和NR5A1组的阳性率显著高于其它四组，FOXL2和NR5A1两因子组合（FN）的阳性率显著高于WT1、GATA4、RUNX1、RSPO1组。但由于NR5A1并非雌性特异性基因，在雄性中也有表达，因此选择FOXL2和NR5A1两因子组合（FN）组用于下一步的实验。
实施例7AMH-mCherry与AMH-EGFP荧光报告系统的比较
本发明同时构建了AMH-EGFP及AMH-mCherry荧光报告体系。接下来，本实施例检测了FN诱导的AMH-EGFP及AMH-mCherry阳性率，对这两个荧光报告系统进行比较。如图7所示，相比p2k7对照组，AMH-EGFP报告系统中的AMH-EGFP阳性率及AMH-mCherry报告系统中的AMH-mCherry阳性率相当，前者为5.11，后者为5.03，说明这两个荧光报告系统具有一致性。因此，我们认为AMH-mCherry+细胞及AMH-EGFP+细胞没有差别。
实施例8AMH-EGFP+或AMH-mCherry+类卵巢颗粒细胞功能分析
一、流式细胞分析及分选
1 AMH-EGFP+或AMH-mCherry+细胞的分析或分选，具体步骤如下：
1）消化细胞前，用PBS洗两次细胞；
2）37℃，8ml Tryple消化细胞8min，等量培养基中和；
3）1000rpm离心5min，弃上清；
4）1ml培养基悬起，用流式管滤网进行过滤，制成单细胞悬液，用influx流式细胞仪进行分析或分选。
二、分选后的细胞的形态
颗粒细胞有两个来源，一是来源于体腔上皮细胞，二是来源于卵巢上皮细胞，因此颗粒细胞是一类上皮细胞来源的细胞，具有上皮细胞样形态。观察分选的重编程后第11天的AMH-EGFP+细胞形态，发现AMH-EGFP+细胞呈卵圆形的上皮细胞样形态，明显区别于dH9成纤维细胞的形态，说明FN诱导的AMH-EGFP+细胞具有颗粒细胞形态（参见如图8）。
三、AMH-EGFP+细胞雌激素及孕酮水平检测
1.将流式分选得到的AMH-EGFP+细胞以6×104/孔的密度铺在96孔板上；
2.铺板第二天，加入100μl含有5IU/ml FSH，100ng/ml睾酮的培养基，在检测Activin A作用的实验中，加入60ng/ml的Activin A；
3.48h后，收集上清液；
4.2000rpm离心10min，取上清，-80℃冻存或直接用于酶联免疫吸附实验（ELISA）；
5.根据实验需要，稀释收集液，每组须稀释相同倍数；
6.根据ELISA试剂盒说明书加样反应；
7.雌激素水平检测使用Estradiol ELISA Kit（Cayman Chemical），浓度检测范围为6.6-4,000pg/ml，灵敏度为15mg/ml。
8.孕酮水平检测使用Pg(Progesterone) ELISA Kit（Sangon Biotech），检测范围为0.31-20ng/mL，灵敏度为0.19ng/ml。
结果表明，AMH-EGFP+细胞具有内分泌功能，分泌较高水平雌激素和孕酮的能力。
如图9所示，在没有添加睾酮前体的条件下，AMH-EGFP+细胞不分泌17β-雌二醇，添加100ng/ml睾酮前体的条件下，AMH-EGFP+细胞分泌较高水平的17β-雌二醇，达到1739.2-2014.1pg/ml，添加5IU/ml的FSH显著提高了17β-雌二醇的分泌水平，达到-2104.5-2290.8pg/ml（p=0.0408），同时添加FSH和Activin A进一步提高了分泌水平，达到2280.2-3131.6pg/ml，相比FSH组差异显著（p=0.0208），相比对照组dH9（63-90.5 pg/ml）差异极显著（p=0.0004），且AMH-EGFP+细胞分泌17β-雌二醇的水平显著高于人卵巢颗粒肿瘤细胞系COV434的分泌水平（190.5-252.8 pg/ml）（p<0.001）。
如图10所示，相比dH9对照组，AMH-EGFP+细胞分泌较高水平的孕酮（5.4-9.5ng/ml），而COV434细胞则分泌水平较低（0.7-1.3 ng/ml），添加FSH及ActivinA并未提高孕酮分泌水平。
四、AMH-mCherry+细胞表达颗粒细胞相关蛋白
实施例8获得的AMH-mCherry+细胞，首先通过免疫荧光染色和Western Blot确认AMH-mCherry+细胞中FOXL2、NR5A1的高表达。如图11（a，b），免疫荧光染色结果显示，相比p2k7对照组，大部分AMH-mCherry+细胞过表达NR5A1及FOXL2，且NR5A1及FOXL2定位在细胞核中，Western Blot结果也证明NR5A1及FOXL2在AMH-mCherry+细胞中高表达。通过免疫荧光染色确认了AMH及mCherry荧光蛋白在AMH-mCherry+细胞中的表达。如图12所示，免疫荧光染色结果表明，分选的AMH-mCherry阳性细胞均表达mCherry，AMH与mCherry在细胞质中有共定位，而p2k7对照组没有mCherry及AMH的表达，说明AMH-mCherry荧光报告系统特异性指示AMH的表达。
五、AMH-EGFP+细胞与人卵丘颗粒细胞的转录组相似
本实施例分别对重编程第7天的AMH-EGFP+细胞与p2k7对照组的差异基因及人卵丘颗粒细胞与p2k7的差异基因进行了分析，差异基因的筛选标准如下：（1）log2FoldChange>1或<-1，即Count值差异大于2倍；（2）p值＜0.05。如图13（a，b）所示，人卵丘颗粒细胞与p2k7对照组的差异基因为5832个，AMH-EGFP+细胞与p2k7对照组的差异基因为3220个，人卵丘颗粒细胞与AMH-EGFP+细胞相比p2k7对照组共同的差异基因为1925个，其中704个基因为二者共同上调的基因，964个基因为共同下调的基因，另外有257个基因在人卵丘颗粒细胞及AMH-EGFP+细胞中呈现相反的变化趋势。对其共同的差异表达基因进行聚类分析，图14为聚类分析结果。聚类分析热图的颜色深浅代表基因表达水平，由此可以看出，人卵丘颗粒细胞与重编程第7天及第11天的AMH-EGFP+细胞的转录组在表达水平上具有相似性，因此认为AMH-EGFP+细胞与人卵丘颗粒细胞的转录组相似。
qRT-PCR结果验证了颗粒细胞相关基因在人卵丘颗粒细胞及重编程第11天的AMH-EGFP+细胞中的表达。如图15，CYP11A1、AR、PGR、STAR为已知的颗粒细胞相关基因，OCA2、SPR、DCN、KDSR、TST、ZEB2为已报道的从人颗粒细胞单细胞测序结果中筛选出的颗粒细胞标记基因，其中OCA2、SPR为有腔卵泡颗粒细胞标记基因，DCN为排卵前卵泡颗粒细胞标记基因，KDSR、TST、ZEB2为人颗粒细胞特异标记基因；与在人卵丘颗粒细胞中的表达模式类似，相比p2k7对照组，这些基因的表达均在AMH-EGFP+细胞中上调。
图16a显示人卵丘颗粒细胞和AMH-EGFP+细胞共同上调基因的生物学过程的GO分析结果，这些基因主要包括与脂质代谢、对类固醇激素的响应、类固醇激素代谢、类固醇激素合成、类固醇的代谢调控、胆固醇运输等调控类固醇激素合成及代谢的过程相关的基因；
图16b显示人卵丘颗粒细胞和AMH-EGFP+细胞共同下调基因的生物学过程的GO分析结果，这些基因主要与DNA复制、细胞核分裂、染色体分离等与细胞增殖相关的生物学过程关联。
以上结果说明，本发明获得报告基因阳性的重编程细胞为类卵巢颗粒细胞，表达卵巢颗粒细胞特异性蛋白，尤其是排卵前卵泡颗粒细胞或有腔卵泡颗粒细胞的特异性蛋白，具有卵巢颗粒细胞分泌雌激素的功能。包含报告基因的载体具有富集、分离和/或分选类卵巢颗粒细胞的作用。
实施例9 CD55表面标记的筛选
为了在FN重编程体系中获得不同时期的hiGC，以及避免在细胞系中进行基因修饰，不依赖基因打靶的报告系统分选hiGC，在FN重编程体系中筛选卵巢颗粒细胞特异性标记分子以用于分选早期，例如原始或初级卵泡期的hiGC。
通过分析AMH-EGFP+hiGC及人卵丘颗粒细胞相对p2k7对照组差异表达的基因中共同上调的基因，对卵巢颗粒细胞特异性标记分子进行筛选。筛选过程如图17a所示，筛选标准如下：（1）为细胞表面膜蛋白；（2）上调倍数大于2倍（Log2FoldChange>1）；（3）FPKM值大于10。在704个共同上调的基因中共筛选到卵巢颗粒细胞特异性标记分子23个，其中符合要求的有5个，分别为CD55、GPC4、DLK1、CD9及IGF1R。综合考虑上调倍数、表达量、dH9细胞中的本底表达等因素，最后选择了上调倍数最高的CD55。CD55在AMH-EGFP+hiGC、p2k7及人卵丘颗粒细胞中的FPKM值如图17c所示。
筛选结果如图17b所示，颜色深浅代表基因表达水平，由图可见，这五个标记分子在AMH-EGFP+hiGC及人卵丘颗粒细胞（Cumulus GCs）中的表达水平均高于p2k7组。图左侧标记的数值为右侧相对应的基因，在AMH-EGFP+hiGC中的表达量相比在p2k7组中的表达量上调倍数的对数值。由图可见，CD55在AMH-EGFP+hiGC中的上调倍数最高，log2 FoldChange为6.2，而在p2k7对照组中的表达量很低，因此将其作为类卵巢颗粒细胞分选的卵巢颗粒细胞特异性标记分子。
实施例10 CD55在FN重编程体系中的表达
CD55+及CD55+AMH-EGFP-细胞的分析或分选步骤如下：
1）消化细胞前，用PBS洗两次细胞；
2）Tryple消化细胞8min，培养基中和；
3）1000rpm离心5min，弃上清，100μl流式细胞染色缓冲液（PBS+10%FBS）悬起，按抗体推荐浓度加入CD55抗体；
4）将细胞置于冰上染色30min；
5）1ml培养基清洗细胞，1000rpm离心5min，重复两次；
6）1ml培养基悬起，用流式管滤网进行过滤，制成单细胞悬液，用Influx流式细胞仪进行分析或分选。
7）如图18所示，相对dH9组，FN组有一群AMH-EGFP+细胞和AMH- EGFP-细胞，设门圈出AMH-EGFP-细胞，在AMH-EGFP-细胞中有一群CD55+细胞，设门圈出AMH-EGFP-细胞群中的CD55+细胞，即可分选获得CD55+AMH-EGFP-细胞。
实施例11 在FN重编程体系中CD55+细胞分析
一、CD55+细胞具有内分泌功能
为了鉴定CD55+细胞是否为类卵巢颗粒细胞，本实施例分别检测了流式分选的CD55+细胞分泌17β-雌二醇及孕酮的水平，并与AMH-EGFP+hiGC进行比较。
如图19所示，CD55+细胞分泌较高水平的17β-雌二醇，略低于AMH-EGFP+hiGC的分泌水平，但差异无显著性；与AMH-EGFP+hiGC一致，CD55+细胞分泌17β-雌二醇的水平显著高于COV434细胞（p=0.0438）。该结果说明CD55+细胞具有合成及分泌雌二醇的能力。
如图20所示，CD55+细胞的孕酮分泌水平低于AMH-EGFP+hiGC，差异极显著（p＜0.001）；相比COV434细胞，CD55+细胞分泌孕酮水平略高，但是差异不显著。该结果说明CD55+细胞分泌低水平的孕酮。卵泡颗粒细胞合成雌激素及孕酮的能力随卵泡发育成熟而增加，孕酮主要是在排卵前期颗粒细胞中大量合成。与AMH-EGFP+细胞分泌高水平的雌激素及孕酮的特征不同，CD55+细胞分泌较高水平的雌激素及低水平的孕酮，说明不同于AMH-EGFP+hiGC，CD55+细胞群包含相对早期的卵泡颗粒细胞。
二、CD55+AMH-EGFP-细胞具有内分泌功能
进一步分析CD55+细胞群，如图21所示，流式分析结果显示CD55+细胞群包含AMH-EGFP+细胞及AMH-EGFP-细胞。CD55+AMH-EGFP+细胞属于AMH-EGFP+细胞群，上述结论认为AMH-EGFP+细胞是有腔卵泡或排卵前卵泡期的hiGC，但CD55+AMH-EGFP+细胞占比较低；CD55+AMH-EGFP-细胞是CD55+细胞中的主要细胞群，因此推测CD55+细胞的相对早期颗粒细胞的特性来源于CD55+AMH-EGFP-细胞群。
检测CD55+AMH-EGFP-细胞群分泌雌激素及孕酮的水平，从内分泌水平方面鉴定CD55+AMH-EGFP-细胞是否为相对早期的类卵巢颗粒细胞。
如图22所示，雌二醇的检测结果显示，CD55+AMH-EGFP-细胞（左柱）分泌17β-雌二醇的水平与AMH-EGFP+细胞（中间柱）相当，差异无显著性，且显著高于COV434细胞（右柱）。
如图23所示，CD55+AMH-EGFP-细胞的孕酮分泌水平显著低于AMH-EGFP+细胞（p<0.001），而与CD55+细胞群没有显著差异。以上结果说明 CD55+AMH-EGFP-与CD55+细胞类似，有较高的雌激素分泌水平，但分泌孕酮水平较低，证实了此前关于CD55+AMH-EGFP-细胞为相对早期卵泡发育阶段类卵巢颗粒细胞的推测。
三、CD55+细胞的转录组分析
基于已报道的成体卵巢颗粒细胞的测序数据(Zhang et al., 2018)，挑选了随着卵泡发育，从原始卵泡到排卵前卵泡表达量逐渐增加的基因，分别为：HSD17B1、HSD3B2、CYP11A1、PGR，此外，PLA2G1B是基于不同时期颗粒细胞的差异表达基因筛选出的有腔卵泡颗粒细胞的标记基因，FST是在原始卵泡形成过程中有重要作用的基因(Jorgez et al.,2004;Wang et al., 2015)，AR是原始卵泡颗粒细胞表达相对高的基因，此前有研究比较原始卵泡及初级卵泡颗粒细胞，发现AR在原始卵泡颗粒细胞中更加富集(Steffensen etal., 2018)。比较以上基因在CD55+细胞及AMH-EGFP+细胞中的表达，如图24（从左到右依次为AMH-EGFP+、CD55+、dH9组），qRT-PCR结果显示，晚期颗粒细胞相关基因HSD17B1、HSD3B2、CYP11A1、PGR、PLA2G1B的表达在AMH-EGFP+hiGC中明显较高，而早期颗粒细胞相关基因FST及AR的表达在CD55+细胞中的表达更高。
对上述基因在CD55+AMH-EGFP-及CD55+AMH-EGFP+细胞中的表达进行比较。如图25（从左到右依次为CD55+AMH-EGFP-、CD55+AMH-EGFP+、dH9组）所示，与CD55+细胞的表达模式基本一致，HSD3B2、CYP11A1、PGR、PLA2G1B在CD55+AMH-EGFP-中的表达水平相比CD55+AMH-EGFP+细胞较低，而FST及AR则在CD55+AMH-EGFP-细胞中表达较高。
进一步对CD55+细胞、CD55+AMH-EGFP-细胞及AMH-EGFP+hiGC进行RNA测序，从转录组水平对其进行比较。如图26所示，颜色深浅代表基因表达水平，“有腔卵泡或排卵前卵泡相关”标记对应的基因（从COL9A1至AMH）为在有腔卵泡或排卵前卵泡中高表达的基因，如图所示，该部分基因在AMH-EGFP+hiGC中的表达水平较高，而在CD55+AMH-EGFP-细胞中的表达水平较低；“原始或初级卵泡相关”标记对应的基因（MGP、CD274、AR、FST）为在原始卵泡或初级卵泡中高表达的基因，如图所示，该部分基因在CD55+细胞、CD55+AMH-EGFP-细胞中的表达水平较高，而在AMH-EGFP+hiGC中的表达水平较低。对CD55+AMH-EGFP-细胞与AMH-EGFP+hiGC的差异表达基因进行GO分析，结果表明，如图27a所示，相比AMH-EGFP+hiGC，CD55+AMH-EGFP-细胞中上调的基因与上皮形成、肾发育、中胚层分化等生物学过程相关联，而原始卵泡颗粒细胞起源于中肾上皮及卵巢上皮，这说明CD55+AMH-EGFP-细胞可能是早期的类卵巢颗粒细胞；如图27b所示，在CD55+AMH-EGFP-细胞中下调，而在AMH-EGFP+hiGC中表达水平较高的基因与细胞外基质组成、类固醇激素合成与代谢、生殖系统发育等生物学过程相关联，这与有腔卵泡及排卵前卵泡期颗粒细胞大量分泌细胞外基质及合成类固醇激素等特征相符。
以上结果说明，在转录水平上，CD55+细胞及其主要细胞群CD55+AMH-EGFP-细胞，相比AMH-EGFP+hiGC是对应更早发育时期卵泡的类卵巢颗粒细胞；其转录表达模式与其合成雌激素但不合成孕酮的内分泌特征一致，支持了此前认为CD55+细胞及 CD55+AMH-EGFP-细胞是相对早期的类卵巢颗粒细胞的推论。结合AMH在不同发育时期卵泡颗粒细胞中的表达模式及其转录、内分泌特征，认为CD55+AMH-EGFP-细胞为原始卵泡或初级卵泡时期的类卵巢颗粒细胞；CD55+细胞是包含了CD55+AMH-EGFP-及CD55+AMH-EGFP+两类不同时期细胞的细胞群，其中主要细胞群为相对早期的CD55+AMH-EGFP-细胞。
实施例12 AMH-EGFP+及CD55+hiGC的功能分析
一、AMH-EGFP+及CD55+AMH-EGFP-hiGC对小鼠卵母细胞成熟的作用
为进一步研究AMH-EGFP+及CD55+AMH-EGFP-hiGC与卵母细胞的相互作用，通过将AMH-EGFP+或CD55+AMH-EGFP-细胞与小鼠GV期卵母细胞共培养，并通过活细胞成像观察GVBD及第一极体的发生率，以探究AMH-EGFP+及CD55+AMH-EGFP-hiGC对卵母细胞成熟的作用。如图28、29所示，与CD55+AMH-EGFP-或AMH-EGFP+hiGC共培养的卵母细胞GVBD的发生明显滞后于对照组，对照组在0.5h就已发生GVBD，而CD55+AMH-EGFP-组在1.5h才发生GVBD，AMH-EGFP+组则在1h后发生GVBD；CD55+AMH-EGFP-组的GVBD发生率在1h与对照组差异显著（p＜0.05）；虽然CD55+AMH-EGFP-组及AMH- EGFP+组的卵母细胞发生GVBD的时间被滞后，但1.5h及 2h时，各组的GVBD发生率并无显著性差异。
分析各组第一极体（first polar body，PB1）排出率，如图30（a,b）所示，在12h、14h、16h，CD55+AMH-EGFP-及AMH-EGFP+hiGC共培养组排出PB1的比例明显低于对照组，差异极显著（p＜0.001）。其中图30a分组从左至右分别为CD55+AMH-EGFP-、AMH-EGFP+、CTRL。以上结果说明，CD55+AMH-EGFP-及AMH-EGFP+hiGC阻滞小鼠卵母细胞发生GVBD，且抑制小鼠卵母细胞排出PB1，即有抑制小鼠卵母细胞重启减数分裂及成熟的作用，这与体内颗粒细胞抑制减数分裂重启以防止卵母细胞过早成熟的作用一致。
二、CD55+ hiGC与hPGCLC的共培养
在实施例11中认为CD55+hiGC包含了CD55+AMH-EGFP-及CD55+AMH-EGFP+两种不同时期的类卵巢颗粒细胞，因此能为与人原始生殖细胞样细胞hPGCLC的共培养提供更多的可能性。
1. DFBV细胞的分化按如下步骤：
1）将状态良好的DFBV H9细胞以40-50%密度，抠克隆到提前用1%Matrigel包被的六孔板上；
2）用MEF条件培养基培养一天；
3）用添加50ng/ml BMP4及50ng/ml BMP8a的分化培养基培养，分化培养基配方如表4所示：
表4：H9分化培养基配方
Figure 148678DEST_PATH_IMAGE004
4）每天换液，六天后，用Tryple 37℃消化5分钟，800rpm离心3min；
5）GK15培养基重悬并细胞计数，GK15培养基配方如表5所示：
表5：GK15培养基配方
Figure 494209DEST_PATH_IMAGE005
2. 将3×104个DFBV细胞，与经流式分选的CD55+细胞混匀，放入在低吸附板上聚合形成细胞团；
3. 2天后，冰上配制50%Matrigel，用Matrigel包裹细胞团；
4.将细胞团转移至Collagen包被的Traswell上；
5. 在添加2ug/ml DOX、1uM RA、10uM forskolin、100ng/ml SCF及200ng/ml BMP2的GK15培养基中继续培养；
6. 对照组为细胞总量与共培养组相同，但不添加CD55阳性细胞的DFBV细胞。
将CD55+hiGC与DAZL及BOULE过表达的hPGCLC共培养，以探究CD55+hiGC是否能与hPGCLC聚合。共培养方法如图31所示。
观察共培养细胞团形态，如图32所示，CD55+细胞与DFBV细胞聚合形成的细胞团在共培养后8天能很好地维持聚合的形态，而对照组细胞团则在培养8天后呈现扁平和细胞弥散的形态，且细胞团中间出现空泡。
取共培养后第8天的细胞团进行石蜡切片及免疫荧光染色，分析CD55+细胞及hPGCLC在细胞团中的定位。图33所示为两个培养在同一Transwell上的细胞团在培养过程中连接形成了一个细胞团，免疫荧光染色结果显示，CD55+细胞与DAZL及BOULE过表达的DAZL-mCherry阳性（DAZL-mCherry+）hPGCLC聚集在细胞团的一侧，而没有高表达DAZL及BOULE的细胞分布在细胞团另一侧，另一侧则没有CD55+细胞及很少量DAZL-mCherry+细胞，该结果说明DAZL-mCherry+细胞与CD55+细胞可能在共培养的过程中共同发生了迁移，DAZL-mCherry+细胞倾向于分布在CD55+细胞附近，而未高表达DAZL及BOULE的DAZL-mCherry+细胞则没有这种倾向性。CD55+细胞与DAZL-mCherry+细胞能很好地聚合形成细胞团，二者在共培养的过程中发生迁移并聚集在细胞团一侧，说明CD55+hiGC可能与DAZL-mCherry+hPGCLC有相互作用。
以上结果说明，无论是AMH-报告基因还是CD55卵巢颗粒细胞特异性标记分子，都可以对类卵巢颗粒细胞进行分选，分选获得的细胞表达卵巢颗粒细胞特异性蛋白，具有卵巢颗粒细胞分泌雌激素和促进卵母细胞发育。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (13)

1.一种蛋白过表达在成纤维细胞重编程为类卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于，所述蛋白为FOXL2和NR5A1。
2.一种类卵巢颗粒细胞的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：1）对成纤维细胞进行基因修饰，所述基因修饰使得成纤维细胞中蛋白的过表达，所述蛋白为FOXL2和NR5A1；2）培养所述成纤维细胞重编程为类卵巢颗粒细胞。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）的基因修饰的方式包括连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数、融合共表达或者转基因。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述基因修饰的方式包括转基因导入外源基因，所述外源基因编码所述的蛋白。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述基因修饰的方式包括利用转染载体转染成纤维细胞导入外源基因。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）包括：
A）构建含有编码所述蛋白的核苷酸序列的转染载体A；
B）将步骤A）获得的转染载体A转染成纤维细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤A）包括：
a）构建高表达所述蛋白的慢病毒载体：扩增所述蛋白的基因，并将其分别克隆至慢病毒载体上；
b）慢病毒包装：使用宿主细胞将步骤a）获得的慢病毒载体包装为慢病毒，并收集含有目的基因的慢病毒。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤A）还包括步骤A0）：构建含有报告系统的转染载体A0，所述报告系统包括卵巢颗粒细胞特异性启动子和报告基因，所述报告基因在卵巢颗粒细胞特异性启动子调控下表达，所述卵巢颗粒细胞特异性启动子为AMH启动子。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括步骤C）富集、分离和/或分选类卵巢颗粒细胞，利用卵巢颗粒细胞特异性标记分子CD55或者报告基因对类卵巢颗粒细胞进行富集、分离和/或分选。
10.权利要求2-9任一所述的制备方法获得的类卵巢颗粒细胞的应用，其特征在于，所述应用包括：
1）研究卵巢颗粒细胞的功能；
2）研究卵巢颗粒细胞与卵母细胞的相互作用；
3）研究卵巢颗粒细胞相关疾病；
4）筛选和/或制备药物。
11.一种卵巢颗粒细胞特异性标记分子或其检测试剂在分选类卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子为CD55；
所述的应用还包括使用卵巢颗粒细胞特异性启动子和报告基因，所述的卵巢颗粒细胞特异性启动子为AMH启动子；
其中，
当细胞群为CD55+AMH-EGFP-细胞群时，分选为原始或初级卵泡期的早期卵巢颗粒细胞；
当细胞群为CD55+AMH-EGFP+细胞群时，分选为有腔卵泡或排卵前卵泡期的卵巢颗粒细胞。
12.一种类卵巢颗粒细胞的分选方法，其特征在于，所述分选方法包括对卵巢颗粒细胞特异性标记分子进行检测，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子为CD55；
所述的分选方法还包括使用卵巢颗粒细胞特异性启动子和报告基因，所述的卵巢颗粒细胞特异性启动子为AMH启动子；
其中，
当细胞群为CD55+AMH-EGFP-细胞群时，分选为原始或初级卵泡期的早期卵巢颗粒细胞；
当细胞群为CD55+AMH-EGFP+细胞群时，分选为有腔卵泡或排卵前卵泡期的卵巢颗粒细胞。
13.一种类卵巢颗粒细胞的分选系统，其特征在于，所述的分选系统包括检测卵巢颗粒细胞特异性标记分子的试剂，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子为CD55；
所述分选系统还包括卵巢颗粒细胞特异性启动子和报告基因，所述的卵巢颗粒细胞特异性启动子为AMH启动子；
其中，
当细胞群为CD55+AMH-EGFP-细胞群时，分选为原始或初级卵泡期的早期卵巢颗粒细胞；
当细胞群为CD55+AMH-EGFP+细胞群时，分选为有腔卵泡或排卵前卵泡期的卵巢颗粒细胞。
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