CN103074354B - miR-125b在红细胞成熟化中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及miR-125b在红细胞成熟化中的用途。其中，制备成熟红细胞的方法包括：使红细胞前体细胞表达miR-125b，所述miR-125b具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列；以及培养所述表达miR-125b的红细胞前体细胞，以便获得成熟红细胞，其中，所述红细胞前体细胞为选自原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞和网织红细胞的至少一种。利用该方法能够有效地制备成熟红细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的，本发明涉及miR-125b在红细胞成熟化中的用途。
背景技术
战伤救治和常规治疗中，输血都是及其关键的一个环节，我国血液供应长期处于供不应求的状况，近年来，我国多个城市甚至出现“血荒”的说法。要解决血液来源匮乏的问题，开发新的血源已经成为当前医疗中的迫切需要，其中干细胞研究为体外制备红细胞提供了新希望，包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPSC）及脐带、骨髓、外周血来源的造血干祖细胞都可能作为种子细胞，通过大量诱导扩增生成可用于移植的红细胞。
然而，目前关于成熟红细胞的制备仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有能够有效地制备成熟红细胞的手段。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：通过在红细胞前体细胞中引入miR-125b，可以提高红细胞脱核效率。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括编码miR-125b的核酸分子，所述miR-125b具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。由此，利用该构建体，可以有效地将表达miR-125b的核酸分子引入到红细胞前体细胞中，并进一步可以在该细胞中表达miR-125b，从而可以促进该红细胞前体细胞转化为成熟的红细胞。
根据本发明的实施例，编码miR-125b的核酸分子具有选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的至少一种所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高表达miR-125b的效率，从而进一步提高使得红细胞前体细胞转化为成熟的红细胞的效率。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备成熟红细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使红细胞前体细胞表达miR-125b，所述miR-125b具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；以及培养表达miR-125b的红细胞前体细胞，以便获得成熟红细胞，其中，该红细胞前体细胞为选自原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞和网织红细胞的至少一种。由此，通过在红细胞前体细胞中表达miR-125b，可以使得红细胞前体细胞转化为成熟红细胞，从而获得成熟红细胞，实现红细胞的体外成熟化。
根据本发明的实施例，该制备成熟红细胞的方法，还可以进一步包括下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，使红细胞前体细胞表达miR-125b进一步包括利用前面所述的构建体，将编码miR-125b的核酸分子引入到红细胞前体细胞中。由此，可以进一步提高在红细胞前体细胞中表达miR-125b的效率，从而进一步提高制备成熟红细胞的效率。
根据本发明的实施例，所述红细胞前体细胞为成红细胞。由此，可以进一步提高制备成熟红细胞的效率。
根据本发明的实施例，利用添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EPO、2mM的L-谷氨酰胺、1μM的地塞米松、40ng/ml的类脂和100μg/m的转铁蛋白的Stem span培养基，培养表达miR-125b的红细胞前体细胞。由此，可以进一步提高将红细胞前体细胞转化为成熟红细胞的效率，进而进一步提高制备成熟红细胞的效率。
在本发明的第三方面，本发明还提出了前面所述的构建体、或者miR-125b在制备成熟红细胞中的用途。
在本发明的第四方面，本发明还提出了一种用于制备成熟红细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：适于使红细胞前体细胞表达miR-125b的试剂。由此，利用该试剂盒，能够有效地通过红细胞前体细胞表达miR-125b，可以从红细胞前体细胞制备成熟红细胞。
根据本发明的实施例，该试剂盒还可以具有下列附加技术特征：
在本发明的一个实施例中，所述适于使红细胞前体细胞表达miR-125b的试剂为前面所述的构建体。由此，可以进一步提高利用该试剂盒使得红细胞前体细胞表达miR-125b的效率，进而可以进一步提高从红细胞前体细胞制备成熟红细胞的效率。
在本发明的一个实施例中，可以进一步包括：培养基，该培养基为添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EPO、2mM的L-谷氨酰胺、1μM的地塞米松、40ng/ml的类脂和100μg/m的转铁蛋白的Stem span培养基，其中，该培养基与该适于使红细胞前体细胞表达miR-125b的试剂设置在不同的容器中。由此，可以进一步提高将红细胞前体细胞转化为成熟红细胞的效率，进而进一步提高制备成熟红细胞的效率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例，红细胞成熟脱核过程中，miR-125b内源性表达检测的结果，其中，A.脐带血来源的造血干细胞在14天的红系诱导过程中红细胞表面标志CD71/CD235表达的检测结果，B.未分化的造血干细胞以及红系分化不同成熟阶段的红细胞的miR-125b表达的检测结果，C.TF-1细胞及其经红系诱导分化体系诱导分化的第一阶段的表面标志CD71/CD235的表达检测结果，以及第二阶段的表面标志CD71阳性/核标志LDS751阴性的表达检测结果，D.TF-1细胞及其经红系诱导分化体系诱导分化的两个阶段的细胞的miR-125b表达的检测结果；
图2显示了根据本发明一个实施例，红白血病细胞K562中过表达miR-125b对红系分化和脱核影响的实验结果，其中，A.稳定过表达miR-125b的K562细胞经红系诱导分化后的联苯胺染色结果，B.过表达miR-125b的细胞经红系诱导分化后的表面标志CD71/CD235双阳性细胞的流式细胞术检测结果，C.流式细胞术检测LDS751阴性/CD71阳性的脱核细胞比例的结果，D.实时定量PCR检测基因修饰的K562细胞系中miR-125b的表达情况，E.实时定量PCR检测过表达miR-125b的K562细胞经红系诱导分化后α和γ血红蛋白的表达情况；以及
图3显示了根据本发明一个实施例，过表达miR-125b的成红细胞与转染随机对照（NC）组进一步诱导成熟后的流式细胞术检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，这些实施例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明是基于发明人对红细胞成熟的深入研究而完成的。发明人发现，多种类型的干细胞诱导生成的成红细胞（erythroblast），若要在体外环境下成为成熟红细胞，脱核是关键的一步：因为有核红细胞的携氧能力低于脱核红细胞，而且有核红细胞在跨越狭窄的毛细血管时容易发生溶血；此外，由于脱核细胞丢失了染色体和分裂能力，移植后导致受者恶性转化的风险也明显降低。虽然红细胞的脱核成熟对于输注应用意义重大，但是迄今为止在诱导干细胞红系分化的体系中，只有在基质细胞的辅助下诱导造血干祖细胞能实现较为高效的成熟和脱核，而无基质细胞体系、或是以胚胎干细胞、iPSC为起始细胞的诱导体系中，红细胞成熟和脱核效率仍然很低。在生理条件下，造血干细胞向红系定向分化的过程经历了原成红细胞（也称为原始红细胞）（proerythroblast）→嗜碱性成红细胞（也称为早幼红细胞）（basophilic erythroblast）→多染性成红细胞（也称为中幼红细胞）（ploychromatophilic erythroblast）→正染性成红细胞（也称为晚幼红细胞）（orhtochromatic erythroblast）→网织红细胞（rticulocyte）→成熟红细胞（redblood cells）几个阶段，其中具有携氧作用的血红蛋白的产生起始于早幼红细胞阶段，而细胞核的排出则发生在网织红细胞阶段。血红蛋白的生成和细胞核的排出是红细胞成熟的指标。其中，脱核过程又可以具体到细胞核凝集、核极化、膜蛋白聚类、核排出并被巨噬细胞吞噬几个阶段。目前，关于脱核过程的机制仍不明确。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一种广泛存在于动植物中的内源性非编码RNA，它们通常靶向一个或者多个mRNA，发挥抑制作用。研究发现，在造血分化中，miRNA的表达也发生有规律的变化，它们通过瞄靶转录因子、生长因子受体以及响应细胞外刺激的特异转录本发挥作用。在红系发育调控中，miR-150、miR-155、miR-221和miR-222在红系分化和成熟过程中下调表达，miR-451（红系特异表达）和miR-16（网织红细胞中特异表达）随红系分化上调，而miR-339和miR-378则表现出分阶段表达模式。此外，miR-191是目前报道的对红细胞脱核有关键促进作用的微小RNA，它通过下调Riok3和Mxi1发挥作用，而Riok3和Mxi1都能调控组蛋白的乙酰化、促进细胞核凝集，从而产生促脱核的效应。
miR-125b（其核酸序列如SEQ ID NO：1所示）是发育分化调控和肿瘤生发研究中的一个明星分子，来自不同研究小组的报道显示，miR-125b能调控中内胚层、神经、造骨细胞、脂肪、造血干/祖细胞等多种干细胞的分化，在造血系统中miR-125b也发挥重要的调控作用：miR-125b及其同系物miR-125a在HSC中高表达，而随着前体细胞的分化发育其表达逐渐降低。在小鼠HSC中过表达miR-125b能扩增HSC和倾向淋系分化的干/祖细胞亚群，它靶向两个促凋亡分子Bmf和KLF 13的mRNA，其抗凋亡效应在倾向淋系分化的HSC亚群中更加显著。过表达miR-125b还能干扰人原代CD34+细胞的分化，抑制HL60和NB4白血病细胞系向单核和粒系的终末分化。对miR-125a的过表达同样能通过抗凋亡的机制扩增HSC组分，其效应可能是通过靶向促凋亡基因Bak1实现的。可见miR-125b能调控干细胞池的规模并赋予移植的造血细胞竞争优势。miR-125b的表达异常则参与多种白血病的发生。大量关于miR-125b调控机制的研究证实，miR-125b对p53信号网络中的多个分子都可能发挥调控作用，在miR-125b的靶基因中，与凋亡相关的包括Bak1、Igfbp3、Itch、Puma、Prkra、Tp53inp1、Tp53、Zac1，而与细胞周期相关的包括cyclin C、Cdc25c、Cdkn2c、Edn1、Ppp1ca、Sel1l。正是由于其靶基因的复杂性，miR-125b功能的最终体现还需要根据其所在细胞的特性决定。
miR-125b对于红系细胞的作用研究相对较少，Klusmann等人的研究提示，miR-125b-2对红系/巨核共祖细胞（megakaryocytic/erythroid progenitors,MEPs）的增殖和自我更新有促进作用。
本发明的发明人通过对由造血干细胞诱导生成的红细胞的连续检测发现，miR-125b随红系分化逐渐下调，但在成熟红细胞中却维持很高的表达水平；同时我们也发现红白血病细胞TF-1与基质细胞OP9共培养之后伴随脱核细胞比例的提高miR-125b的表达也明显提高，这些结果暗示该非编码RNA参与了脱核调控（图1），过表达miR-125b的红白血病细胞系K562在红系诱导条件下能表达出大量的α、γ血红蛋白，红系表面标志CD71的表达明显提高，与对照组相比，其脱核效率也出现明显提高（图2），在脐带血来源的红系祖细胞中，转染miR-125b mimics（其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示），发明人同样也观察到脱核效率的提高。
由此，本发明提出了通过引入miR-125b来提高造血干细胞/胚胎干细胞的红系诱导分化和红细胞脱核效率，高效获得功能性红细胞（即成熟红细胞）的技术方案，实现大规模红细胞诱导扩增，满足临床需求也有重要意义。
构建体
在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括编码miR-125b的核酸分子（在本文中也可以称为目的核酸分子），所述miR-125b具有SEQ ID NO：1（UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA）所示的核苷酸序列。由此，利用该构建体，可以有效地将表达miR-125b的核酸分子引入到红细胞前体细胞中，进一步可以在该细胞中表达miR-125b，从而可以使得该红细胞前体细胞转化为成熟的红细胞。根据本发明的实施例，编码miR-125b的核酸分子具有选自SEQ ID NO：2（TGCGCTCCTCTCAGTCCCTGAGACCCTAACTTGTGATGTTTACCGTTTAAATCCACGGGTTAGGCTCTTGGGAGCTGCGAGTCGTGCT）和SEQ ID NO：3（ACCAGACTTTTCCTAGTCCCTGAGACCCTAACTTGTGAGGTATTTTAGTAACATCACAAGTCAGGCTCTTGGGACCTAGGCGGAGGGGA）的至少一种所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高表达miR-125b的效率，从而能够进一步提高使得红细胞前体细胞转化为成熟的红细胞的效率。
术语“构建体”意指能够运输与之连接的另一种核酸（目的核酸分子）的核酸分子。一种类型的构建体是“质粒”，它指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的构建体是病毒构建体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些构建体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌构建体和游离型哺乳动物构建体）。其他构建体（例如非游离型哺乳动物构建体）在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组一起进行复制。此外，某些构建体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达构建体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“构建体”可以互换使用，因为质粒是最常用的构建体形式。然而，本发明预期包括此种其他形式的表达构建体，例如提供等价功能的病毒构建体（例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒）。构建体的RNA形式(其包括RNA病毒构建体)也可在本发明中发现用途。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
另外，根据本发明的实施例的表达构建体还可以进一步包含其他的元件，从而为表达构建体赋予额外的有益效果。本领域技术人员可以根据需要，选择这些元件在表达构建体上与编码miR-125b的核酸分子的相对位置。即可以设置在编码miR-125b的核酸分子的上游，也可以设置在编码miR-125b的核酸分子的下游，只要这些元件能够发挥其相应的功能即可。在本发明中所使用的术语“5’侧”可以与“上游”互换使用，“3’侧”可以与“下游”互换使用。
根据本发明的一个实施例，表达构建体可以进一步包含启动子序列，所述启动子序列与所述编码miR-125b的核酸分子可操作地相连。在本发明中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本发明中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，可以直接通过表达构建体在动物细胞中引入特定的启动子，并且该启动子可以用于启动编码miR-125b的核酸分子的转录和表达，由此，可以提高所获得的重组细胞中编码miR-125b的核酸分子的表达效率。根据本发明的具体实例，所述启动子为CAG启动子。发明人发现，当采用该启动子时，可以有效地在动物细胞中表达miR-125b。
根据本发明的一个实施例，表达构建体可以进一步包括编码报告蛋白的序列。在本发明中所使用的术语“报告蛋白”是指这样的一种蛋白质，其在表达后，能够产生可以直接或者间接检测的信号，进而能够反映表达构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。根据本发明的实施例，报告蛋白的种类并不受特别限制，只要其具有可检测的活性即可。根据本发明的实施例，报告蛋白可以是一种能够产生光学信号的蛋白质例如发光蛋白或者荧光蛋白例如绿色荧光蛋白等。或者报告蛋白可以是一种能够与底物相互作用以产生可检测信号的酶，例如lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶能催化一系列底物转化成极易检测的不同颜色的产物。但是lacZ在细胞内本底表达较高，并且检测需要破碎细胞壁，从而限制了其应用。因而，根据本发明的一些实施例，报告蛋白可以为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。例如可以采用：比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测。这其中，优选发光蛋白，因为发光蛋白能够发出特定波长的光，因而能够容易对发光蛋白进行检测，并且容易对其进行定量检测。根据本发明的一个实施例，报告蛋白为绿色荧光蛋白。由此，可以便捷地通过荧光显微镜，就能够确定表达构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。
根据本发明的一个实施例，表达构建体可以进一步包括筛选标记基因。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同构建体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选接受表达构建体的动物细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过接受外源表达构建体的重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加抗生素，则相应连同构建体接受并表达抗生素抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，所述筛选标记基因为新霉素抗性基因。由此，能够进一步提高筛选接受外源表达构建体的重组细胞的效率。
制备成熟红细胞的方法
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备成熟红细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
首先，使红细胞前体细胞表达miR-125b，该miR-125b具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。在本文中所使用的术语“红细胞前体细胞”应做广义理解，其可以为任何可以用来制备成熟红细胞的细胞。根据本发明的实施例，红细胞前体细胞可以为选自原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞和网织红细胞的至少一种。这些红细胞前体细胞，可以是从生物体例如人分离的，也可以是通过干细胞的分化获得的。根据本发明的一些实施例，可以由生物体的血液直接提取或通过诱导多能干/祖细胞获得前述红细胞前体细胞。根据本发明的实施例，所述红细胞前体细胞为成红细胞。由此，可以进一步提高制备成熟红细胞的效率。根据本发明的实施例，使红细胞前体细胞表达的方法并不受特别限制。可以通过向细胞中引入可以表达miR-125b的核酸分子，也可以直接将miR-125b引入到细胞中来实现。根据本发明的实施例，可以利用前面所述的构建体，将编码miR-125b的核酸分子引入到所述红细胞前体细胞中。由此，可以进一步提高在红细胞前体细胞中表达miR-125b的效率，从而进一步提高制备成熟红细胞的效率。将构建体引入到细胞中的方法可以包括但不限于，吸收质粒穿过细胞膜、病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。
接下来，培养上述表达miR-125b的红细胞前体细胞，以便获得成熟红细胞。由此，通过在红细胞前体细胞中表达miR-125b，可以使得红细胞前体细胞转化为成熟红细胞，从而获得成熟红细胞，实现红细胞的体外成熟化。根据本发明的实施例，培养表达miR-125b的红细胞前体细胞的方法并不受特别限制。根据本发明的实施例，利用添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EPO、2mM的L-谷氨酰胺、1μM的地塞米松、40ng/ml的类脂和100μg/m的转铁蛋白的Stem span培养基，培养所述表达miR-125b的红细胞前体细胞。由此，可以进一步提高将红细胞前体细胞转化为成熟红细胞的效率，进而进一步提高制备成熟红细胞的效率。
由此，在本发明的第三方面，本发明还提出了前面所述的构建体、或者miR-125b在制备成熟红细胞中的用途。
在本发明的第四方面，本发明还提出了一种用于制备成熟红细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：适于使红细胞前体细胞表达miR-125b的试剂。由此，利用该试剂盒，能够有效地通过红细胞前体细胞表达miR-125b，可以从红细胞前体细胞制备成熟红细胞。在本发明的一个实施例中，所述适于使红细胞前体细胞表达miR-125b的试剂为前面所述的构建体。由此，可以进一步提高利用该试剂盒使得红细胞前体细胞表达miR-125b的效率，进而可以进一步提高从红细胞前体细胞制备成熟红细胞的效率。在本发明的一个实施例中，可以进一步包括：培养基，该培养基为添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EPO、2mM的L-谷氨酰胺、1μM的地塞米松、40ng/ml的类脂和100μg/m的转铁蛋白的Stem span培养基，其中，该培养基与该适于使红细胞前体细胞表达miR-125b的试剂设置在不同的容器中。由此，可以进一步提高将红细胞前体细胞转化为成熟红细胞的效率，进而进一步提高制备成熟红细胞的效率。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，例如可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1：内源性miR-125b的表达随红细胞成熟上调
一、从新鲜的脐带血（24小时内）中按照标准的操作的步骤分离MNC细胞（需要时用磁珠分离CD34+细胞）。分离步骤如下所示：
1、混合，沉降
新鲜抗凝的脐带血标本一份与PBS按照1：1等体积比例混合后，再加入总体积1/4的0.5%甲基纤维素。颠倒混匀后，室温静置30分钟直，至沉降直界限分明。小心吸出上清至50ml离心管中，待接近界面时可用小吸管吸取，防止吸取红细胞。之后1800rpm，离心5分钟。
2、重悬，梯度离心
弃上清，每管加入5ml PBS重悬细胞。取15ml离心管，每管加入预热人淋巴细胞分离液5ml，轻柔将细胞悬液加到人淋巴细胞分离液液面之上。室温离心，1800rpm，离心25分钟，为保持不打破密度梯度，应最慢速升降离心机的转速。
3、收集MNC
离心完毕，离心管内上层为透明液体，下层为其他细胞，中间为白色薄膜层，即MNC层。将各管MNC曾细胞集中于1管，加入PBS重悬至15ml体积，1800rpm，离心5分钟，弃去残余的淋巴细胞分离液，再用PBS清洗细胞一次，将细胞重悬至10ml取10μl计数细胞。
4、从MNC细胞中分离脐带血造血干细胞（采用miniMACS分离系统，Miltenyl Biotec)
（1）、标记抗体，孵育
参照CD34+MicroBead Kit（货号140-000-672.05Miltenyl Boitec公司）说明书，将单个核细胞按照每108cells重悬于300μl体积4℃～8℃预温半小时的除气PBS，加入FcR Blocking Reagent及CD 34MicroBeads各100μl的比例与抗体混合，4℃旋转孵育30分钟。
（2）、分离CD 34+细胞
向孵育体系内加入PBS，重悬至1.5ml，充分混匀后，1800rpm，离心5分钟，依照此方法，洗涤细胞2次。按照每108cells重悬于500μl体积细胞分离缓冲液重悬细胞。将分离柱MS Column安装于磁力架上，使用2ml细胞分离缓冲液湿润分离柱后，将单个核细胞悬液缓缓沿分离柱内壁加入，避免产生气泡。待其自然流出后，使用1ml除气的PBS冲洗分离柱3次，以便将未结合的单个核细胞冲洗出分离柱。
（3）、加压洗脱
将分离柱移出磁场，依次置于三个Ep管上，每管用1ml PBS加压洗脱，之后1800rpm离心5分钟，最后将细胞重悬至1ml，计数细胞。
（4）、纯度分析
1)由于每次分出的细胞数不一定，如果细胞过少，可以考虑用CD34+细胞的培养基培养细胞1-2天，使细胞增殖后进行流式的检测。
2)流式检测时可将4~5×105细胞悬浮平分到2个1.5ml Ep管，每管中加90μl PBS；
3)分别加入5μl CD34-FITC和5μl CD38-PE，另一个Ep管中加入5μl PE和5μl FITC标记的小鼠IgG作为对照。充分混匀后，4℃避光标记30分钟；
4)待标记时间到后，用PBS重悬至1.5ml洗涤细胞，1800转离心5分钟；之后进行2次重复洗涤。
5）最后将细胞重悬于500μl PBS中，流式细胞仪检测造血干细胞的比例。若不能当天进行流式检测，可以用2%新鲜配制的多聚甲醛溶液重悬细胞，4℃避光保存，之后进行流式检测。
之后将分离/磁珠分选获得的MNC/CD34+细胞于红系诱导分化的培养基中，培养14天。再进行流式检测，检测标志为CD71和CD235，结果见图1A。图1A显示了脐带血来源的造血干细胞在14天的红系诱导过程中红细胞表面标志CD71/CD235表达的检测结果。从图1A中可以看到，随着红系培养天数的增加，红系相关标志CD71和CD235的比例上调，在14天时双阳性细胞的比例已经超过70%，CD71-CD235-细胞的比例小于10%。这说明在该时间点，大部分的细胞都已经是红系的细胞，并且双阳性细胞的比例较高，已经将细胞诱导至前红细胞阶段。
二、收集CD34及红系诱导14天后经流式细胞术分选的CD71+/CD235-细胞、CD71+/CD235+细胞、脐血中红细胞，进行RNA的提取、microRNA的反转录，之后实时定量PCR检测microRNA-125b的表达水平，结果见图1B。如图1B所示，以U6为内参，可以看出同起始细胞（CD34+细胞）相比较，红细胞中micorRNA-125b的表达水平是非常高的。
三、TF-1细胞在红系的诱导分化体系下进行红系的诱导分化，其诱导分化体系为：诱导红系分化阶段：RPMI1640添加10%FBS及5U/ml EPO培养6天，细胞起始培养密度1×105/ml；诱导脱核阶段，将上一阶段获得的细胞转移至OP9基质细胞层上，以RPMI1640添加10%FBS培养4天，细胞起始培养密度3×105/ml。
对各阶段获得的细胞均进行流式细胞检测，结果见图1C。图1C显示了TF-1细胞及其经红系诱导分化体系诱导分化的第一阶段的表面标志CD71/CD235的表达检测结果，以及第二阶段的表面标志CD71阳性/核标志LDS751阴性的表达检测结果，其中，从下至上，第一张图为TF-1细胞的表面标志CD71/CD235的表达检测结果，第二张图为TF-1细胞经红系诱导分化体系诱导分化的第一阶段的表面标志CD71/CD235的表达检测结果，第三张图为TF-1细胞经红系诱导分化体系诱导分化的第二阶段的表面标志CD71阳性/核标志LDS751阴性的表达检测结果。由1C可知，第一阶段诱导结束，能获得较高比例CD71/CD235双阳性细胞，提示TF-1细胞被成功诱导成红系祖细胞；至第二阶段诱导结束，有较高比例CD71+/LDS751-细胞出现，即脱核的红细胞。表明，红白血病细胞TF-1与基质细胞OP9共培养后红系表面标志CD71/CD235表达提高，同时出现核染料LDS751染色阴性的脱核红细胞。然后，对诱导前后的细胞提取RNA检测内源性miR-125b的表达，结果见图1D。图1D显示了TF-1细胞及其经红系诱导分化体系诱导分化的两个阶段的细胞经定量PCR检测的miR-125b表达的结果。由图1D可知，随红细胞成熟和脱核，miR-125b表达逐渐提高，提示miR-125b的表达可能调控红细胞成熟和脱核。
实施例2：外源过表达miR-125b促进红白血病细胞K562的红系成熟和脱核
一、细胞转染和稳定株筛选：
1.K562细胞以添加10％胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基培养，每3天1：5传代。
2.转染时，取3×105K562细胞以1.5ml培养基重悬，置于6孔板中，4μg质粒和10μl脂质体lipofectamin2000分别与250μl optiMEM混合，室温孵育5min后再混匀，静置室温20min，滴加到细胞悬液上。转染次日换液，48小时后添加G418筛选转染阳性细胞，筛选浓度为500μg/ml。3周后获得稳定转染、表达外源基因的K562细胞株。
二、对获得的K562细胞进行红系诱导和脱核，诱导方案如下：
1.第一阶段：细胞以1×105/ml的密度进行红系诱导，诱导培养基为RPMI1640，添加10％FBS、0.1μg/ml araC、40μM hemin，培养6天。
2.第二阶段：取第一阶段获得的细胞，调整密度到3×105/ml，继续诱导红细胞脱核，诱导培养基为RPMI1640，添加10％FBS、40μM hemin、1μg/mlcytoB、210mM DMSO，培养4天。
3.转染获得的稳定细胞株经实时定量PCR确定microRNA及功能基因的表达水平。K562细胞诱导结束后经联苯胺染色及流式细胞术检测，确定红系分化效率及红细胞脱核效率，结果见图2。图2显示了红白血病细胞K562中过表达miR-125b对红系分化和脱核影响的实验结果，其中A.稳定过表达miR-125b的K562细胞经红系诱导分化后的联苯胺染色结果，B.过表达miR-125b的细胞经红系诱导分化后的表面标志CD71/CD235双阳性细胞的流式细胞术检测结果，C.流式细胞术检测LDS751阴性/CD71阳性的脱核细胞比例的结果，D.实时定量PCR检测基因修饰的K562细胞系中miR-125b的表达情况，E.实时定量PCR检测过表达miR-125b的K562细胞中经红系诱导分化后α和γ血红蛋白的表达情况。如图2所示，A显示了小分子hemin及ara-C、细胞松弛素B、DMSO诱导稳定过表达miR-125b的K562细胞分化脱核，诱导10天后，过表达组细胞直径缩小，棕色的联苯胺（血红蛋白指示剂）染色阳性细胞比例明显提高；B显示了表面标志流式细胞术检测结果，过表达miR-125b的细胞CD71/CD235双阳性细胞比例增加，提示红系分化效率提高；C显示了流式细胞术检测LDS751阴性/CD71阳性的脱核细胞比例，miR-125b的过表达明显提高了红细胞脱核效率；D显示了实时定量PCR检测基因修饰的K562细胞系中miR-125b的表达情况；E显示了实时定量PCR检测结果，miR-125b的过表达提高了K562细胞中α和γ血红蛋白的表达。因此，由图2可知，miR-125b的过表达（图2D）显著提高了K562细胞的血红蛋白表达水平（图2A、E），CD71/CD235双阳性细胞比例显著提高（图2B），在第二阶段诱导结束后也出现更高的红细胞脱核效率（图2C）。
三、联苯胺染色：
1.2×104细胞经1200rpm离心2min甩片到载玻片上。
2.细胞团滴加甲醇固定10～15s。
3.联苯胺染液染色5min（联苯胺染液配方：融解0.1g联苯胺至10ml甲醇中，即得联苯胺染液）。
4.氧化处理2.5min（氧化液配方：将1体积30％H2O2与11体积70％乙醇混匀，即得氧化液）。
5.蒸馏水洗涤2.5min。
6.细胞甩片经瑞氏－基姆萨染液（公司）染色，镜下观察，拍照。
7.红细胞表达血红蛋白，联苯胺染色呈现棕色。
四、流式细胞术检测：
1.以PBS重悬细胞至1×107/ml。
2.在100μl的细胞悬液中根据说明书加入标记有荧光染料的抗体，冰上孵育30min。
3.当需要检测细胞的脱核状态时，在加入抗体的同时在100μl的细胞悬液中加入0.5μl 0.2mg/ml核染料LDS751，同样冰上孵育30min。
4.加入PBS洗涤2次，离心弃上清。
5.以500μl PBS重悬细胞，流式细胞术检测细胞表面抗原的表达情况和细胞脱核情况。
五、实时定量PCR涉及的RNA提取、反转录及PCR流程和反应体系如下：
1RNA提取：
1.1收集约1×106细胞，转移到1.5ml EP管中，离心成团块，加入1mlTrizol，吹打裂解细胞。
1.2加入氯仿0.2ml/ml Trizol，用力振摇15s，15－30℃下孵育2-3min，离心（4℃，12000g，15min）。
1.3离心后液体分为三层，小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。
1.4加入等体积异丙醇，混匀，4℃下孵育30min，离心（4℃，12000g，10min）。
1.5去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，轻微振荡15s，离心（4℃，7500g，5min）。
1.6小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。
1.7加入30μl DEPC水溶解，-80℃冰箱保存。
2反转录：
2.1利用miScript II RT Kit（Qiagen公司）进行microRNA的反转录，操作方法参见产品说明书。
2.2利用Reverse Transcriptase MMLV（Takara公司）进行RNA反转录，操作方法参见产品说明书。
3PCR：
按以下体系（见表1和表2）配置反应液，反应条件见表3，实验涉及的引物及退火温度见表4。
表1microRNA表达实时定量PCR检测反应体系
| cDNA（40×稀释） | 2μl |
| 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix（Qiagen公司） | 12.5μl |
| miUniv3（10μM） | 0.5μl |
| microRNA probe（10μM） | 0.5μl |
| H2O | 9.5μl |
| 总体积 | 25μl |
表2mRNA表达实时定量PCR检测反应体系
| cDNA（5×稀释） | 1μl |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo公司） | 10μl |
| FP（10μM） | 0.5μl |
| RP（10μM） | 0.5μl |
| H2O | 9.5μl |
| 总体积 | 20μl |
表3.反应条件
| 95°C | 15min | |
| 94°C | 15s | |
| 55°C | 30s | |
| 70°C | 30s | 40个循环 |
| (55+0.5)°C | 10s | 75个循环 |
| 4°C | ∞ |
表4.引物及退火温度
实施例3：在脐带血来源的成红细胞中过表达miR-125b能提高红细胞的成熟和脱核效率
从新鲜的脐带血（24小时内）中按照标准的操作的步骤分离MNC细胞，之后将分离/所得的细胞置于前面所述的红系诱导分化诱导培养基中培养14天，之后进行流式检测，在CD71+CD235+比例到达70%以上时进行micorRNA小片段的转染，包括mimics-NC及mimics-125b（使用的转染试剂为L ipofectin2000，转染的操作流程参照使用说明书）。转染完成6小时后，将细胞转移至前述的红系成熟脱核的诱导培养基中，培养9天后进行流式的检测，结果见图3。其中，检测的指标为核染料-LSD751及红系相关标志-CD71。成熟的脱核红细胞为LDS751-CD71+细胞。如图3所示，过表达miR-125b的红细胞与转染随机对照（NC）组相比表现出更高的脱核效率（CD71+/LDS751-%）。由图3可知，miR-125b的过表达显著提高了LDS751-CD71+细胞的比例，表明miR-125b过表达能够促进成红细胞的脱核。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (6)
1.一种制备成熟红细胞的方法，其特征在于，包括：使红细胞前体细胞过表达miR-125b，所述miR-125b的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及培养过表达miR-125b的红细胞前体细胞，以便获得成熟红细胞，
其中，
所述红细胞前体细胞为选自原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞和网织红细胞的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使红细胞前体细胞过表达miR-125b进一步包括：
利用包括表达miR-125b的核酸分子的构建体，将表达miR-125b的核酸分子引入到所述红细胞前体细胞中，其中，所述表达miR-125b的核酸分子具有选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的至少一种所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红细胞前体细胞为成红细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EPO、2mM的L-谷氨酰胺、1μM的地塞米松、40ng/ml的类脂和100μg/m的转铁蛋白的Stem span培养基，培养所述过表达miR-125b的红细胞前体细胞。
5.包括表达miR-125b的核酸分子的构建体、或者miR-125b在制备成熟红细胞中的用途，其中，所述表达miR-125b的核酸分子具有选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的至少一种所示的核苷酸序列。
6.一种用于制备成熟红细胞的试剂盒，其特征在于，包括：
适于使红细胞前体细胞过表达miR-125b的试剂，
其中，所述适于使红细胞前体细胞过表达miR-125b的试剂为包括表达miR-125b的核酸分子的构建体，其中所述表达miR-125b的核酸分子具有选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的至少一种所示的核苷酸序列，
进一步包括：
培养基，所述培养基为添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EPO、2mM的L-谷氨酰胺、1μM的地塞米松、40ng/ml的类脂和100μg/m的转铁蛋白的Stem span培养基，
其中，所述培养基与所述适于使红细胞前体细胞过表达miR-125b的试剂设置在不同的容器中。
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