CN108823149B - 一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，通过抽取外周静脉血，分离并提取单个核细胞，并诱导其分化为早期内皮祖细胞，且培养过程中严格控制技术参数。本发明方法简单易行，安全性高，且早期内皮祖细胞的得率高(98.8％)，适合大规模的推广应用。

Description

一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，属于生物技术领域。
背景技术
内皮祖细胞(EPCs)有两种亚型，分别为早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞，其两种亚型在细胞来源、细胞形态、细胞表面标志、细胞增殖能力、分化能力和功能方面存在差异。其共同存在的问题是内皮祖细胞的来源比较困难，或者获取细胞的风险较大。目前比较常见的是培养晚期内皮祖细胞。虽然晚期内皮祖细胞在形成内皮细胞和修复损伤内皮的功能较好，但是由于其抗氧化能力和抗炎能力均弱于早期内皮祖细胞，在进行自体回输治疗血栓栓塞性疾病时，由于机体普遍存在脂质过氧化和炎症的情况下，会影响晚期内皮祖细胞在体内的存活时间及功能。早期EPCs可通过分泌各种细胞因子促进损伤的血管内皮和缺血组织的内皮修复和血管生长、增强晚期EPCs的成血管作用，从而参与血管的新生。因此，有必要研究一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，为早期内皮祖细胞的推广应用奠定基础。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法。
本发明采取的技术方案如下：
一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1：将磷酸盐缓冲液和外周静脉血混匀，得到稀释的血液；
S2：把稀释的血液加到淋巴细胞分离液上，不要混匀；
S3：以400～500g离心40～50分钟，温度控制在18℃～20℃；
S4：除去血浆部分，取出单个核细胞层，将单个核细胞层与磷酸盐缓冲液混匀；
S5：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，并用15～20mL磷酸盐缓冲液重悬细胞；
S6：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，即得单个核细胞；
S7：将获得的单个核细胞用EBM完全培养基重悬，调整细胞密度后，放置于人纤维黏连蛋白包被的细胞培养瓶，放入培养箱中；培养至4～5天，即得早期内皮祖细胞。
优选的，步骤S1中，磷酸盐缓冲液和外周静脉血的体积比为1:1。
优选的，步骤S2中，稀释的血液与淋巴细胞分离液的体积比为4：3。
优选的，步骤S4中，单个核细胞层与磷酸盐缓冲液的体积比为1：3。
优选的，步骤S7中，调整后细胞密度为1×107个/mL。
优选的，步骤S7中，在培养箱内培养的条件为：培养的24h内，保持氧浓度为3％，培养的第2～3天，保持氧浓度为10％，培养至第4天，保持与室内氧浓度相同。
优选的，步骤S7中，在培养箱内培养的条件为：培养的24h内，保持二氧化碳浓度为3.5％，培养的第2～3天，保持二氧化碳浓度为4.5％，培养至第4天，保持与室内二氧化碳浓度相同。
优选的，步骤S7中，在培养的第2～3天，加入黄芪提取物和山苦茶提取物。
优选的，黄芪提取物的浓度为1.2μg/mL，山苦茶提取物的浓度为1.0μg/mL。
优选的，黄芪提取物的活性成分为黄芪多糖，山苦茶提取物的活性成分为山苦茶多糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
A.离心参数是关键要素之一，离心速度过快、时间过长、温度控制不合理，容易损伤细胞，成活率降低，离心过慢、时间过短，则导致细胞之间相互混杂，细胞纯度降低。本发明限定了每一次的离心参数，能最大限度的提高细胞存活率和纯度。
B.本发明还具体限定了细胞接种密度和换液时机，在该条件下，细胞贴壁和分化最为理想。
C.培养过程中，内皮祖细胞易分化为成熟的内皮细胞，从而限制了其在临床上的应用。本发明研究发现，在细胞培养过程中，合理控制氧浓度、二氧化碳浓度以及加入一定量的黄芪提取物和山苦茶提取物，有利于单个核细胞分化为早期内皮祖细胞，有利于早期内皮祖细胞的增殖，且有效缓解早期内皮祖细胞分化为成熟的内皮细胞的现象。
D.本发明通过抽取外周静脉血，分离并提取单个核细胞，并诱导其分化为早期内皮祖细胞。方法简单易行，比较安全，由于早期内皮祖细胞相对于晚期内皮祖细胞，具有更强的抗炎和抗氧化能力，本发明为自体回输早期内皮祖细胞治疗血栓栓塞性疾病奠定了基础。
E.本发明早期内皮祖细胞，Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双染色后，显示双阳性，确定为内皮祖细胞。流式细胞仪检测所有细胞均为CD45+，说明该细胞是血液来源，98.8％的细胞为CD31+和CD45+，证明其为早期内皮祖细胞，得率非常高，余1.1％为CD45+CD31-，说明其为正在向早期内皮祖细胞转化。
附图说明
图1为细胞形态图；
图2为Dil-ac-LDL染色结果；
图3为Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双染色结果；
图4为流式细胞仪检测结果图，图中，右侧为FSC-SSC散点图；左侧为FL1-FSC散点图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例所述磷酸盐缓冲液为
Figure BDA0001744184410000041
Phosphate Buffered Saline(1X)。
本发明实施例所述淋巴细胞分离液为Ficoll-PaqueTM PLUS(GE Healthcare)。
本发明实施例所述改进的EBM完全培养基为：EBMTM-2Medium+EGMTM-2-MV-SingleQuots+5％FBS
Figure BDA0001744184410000042
美国lonza公司。
每500mL改进的EBM完全培养基配方：
445.3mL EBMTM-2Medium+29.7mL EGMTM-2-MV-SingleQuots+25mL FBS
Figure BDA0001744184410000043
(10091148),胎牛血清(FBS)的终浓度为10％。
其中EGMTM-2-MV-SingleQuots的配方如表1所示。
表1
Figure BDA0001744184410000044
Figure BDA0001744184410000051
实施例一、一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法
一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1：采集健康志愿者50mL静脉血，将血液置于5mL EDTA试管。取磷酸盐缓冲液和静脉血，按照体积比1：1稀释并混匀。
S2：把稀释的血液加到淋巴细胞分离液上，注意不要混匀。稀释的血液与淋巴细胞分离液的体积比为4：3。
S3：以400～500g离心40～50分钟(18℃～20℃)。
S4：用移液器吸掉最上层(黄色混合物)，即血浆部分，并用移液器把第二层(单个核细胞层)转移到离心管中，将单个核细胞层与磷酸盐缓冲液按体积比1:3混匀。
S5：以400～500g离心10～20分钟(18℃～20℃)，倒掉上清液，并用15～20mL磷酸盐缓冲液重悬细胞。
S6：400～500g离心10～20分钟(18℃～20℃)，去上清，即得单个核细胞。
S7：将获得的单个核细胞用改进的EBM完全培养基重悬，调整细胞密度为1×107个/mL，放置于人纤维黏连蛋白(human fibronectin，HFN)包被的T75细胞培养瓶，放入培养箱中。培养的24h内，保持氧浓度为3％，二氧化碳浓度为3.5％，培养的第2～3天，加入1.2μg/mL黄芪多糖和1.0μg/mL山苦茶多糖，保持氧浓度为10％，二氧化碳浓度为4.5％，培养至第4天，二氧化碳浓度和氧气浓度保持与室内相同。
每3天用改进的EBM完全培养基进行换液一次。第3天在倒置显微镜下观察细胞形态，第4～5天进行早期内皮祖细胞的鉴定。
实施例二、早期内皮祖细胞的鉴定
2.1细胞形态学鉴定
多数细胞是圆形，出现成簇现象，有部分细胞出现梭形，呈条索样分布(见图1)。
2.2细胞功能鉴定
采用Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I染色，荧光显微镜下观察。
第一步：取培养至第5天的细胞，在T75培养瓶加入4μg Dil-ac-LDL(10mg/L)置于37℃培养箱孵育4h；
第二步：用3～5mL磷酸盐缓冲液清洗三次；
第三步：1mL 4％多聚甲醛固定20min；
第四步：用3～5mL磷酸盐缓冲液漂洗；
第五步：将4μg FITC-UEA-I(10mg/L)加于样品中置于37℃培养箱孵育1h；
第六步：荧光显微镜下观察染色情况，Dil-ac-LDL染色阳性为红色(见图2)，FITC-UEA-I染色阳性为绿色，二者双染色阳性为黄色(见图3)，即为内皮祖细胞。
图3显示，荧光显微镜下观察，多数细胞被染色为黄色，呈现细胞内部染为绿色，外部染为红色，或呈现黄色，部分细胞已经呈梭形，条索状排列。说明本发明培养的细胞为Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I染色双阳性，确定为内皮祖细胞。
2.3细胞表面分子鉴定
CD34和CD45染色，流式细胞仪下检测。
第一步：倒掉细胞培养基，用水浴锅加热至37℃的胰蛋白酶消化细胞，用9mLEBMTM-2Medium+1mL FBS终止消化，细胞分离后，200-400g离心5～10分钟。
第二步：用4℃磷酸盐缓冲液重悬细胞2次，200g离心5～10分钟，洗涤细胞，去除上清。
第三步：加入磷酸盐缓冲液悬浮细胞，调整终浓度为106个细胞/100μL。在上样管中加入200μL重悬的细胞溶液(上样管内应含2×106个细胞)；
第四步：
CD31单标记：在单标管样本溶液中加入20μL的BD Pharmingen TMCD31混匀后，避光，室温孵育20min；
CD45单标记：在单标管样本溶液中加入5μL的BD Pharmingen TMCD45混匀后，避光，室温孵育20min；
CD31和CD45双标记：在每一管样本溶液中分别加入20μL的BD PharmingenTMCD31和5ul BD PharmingenTM CD45混匀后，避光，室温孵育20分钟；
另取200μL重悬的细胞溶液，不加任何BD PharmingenTMCD31和BDPharmingenTMCD45染液，做为阴性对照；
第五步：1小时内用流式细胞仪检测；
CD31和CD45双阳性为早期内皮祖细胞。CD31为内皮细胞特异性家族标记，CD45为血液源标记，二者双阳性说明该内皮细胞处于早期状态，即为早期内皮祖细胞，具体见图4。
从图4可知，流式细胞仪检测所有细胞均为CD45+，说明该细胞是血液来源，98.8％的细胞为CD31+和CD45+，证明其为早期内皮祖细胞，得率非常高，余1.1％为CD45+CD31-，说明其为正在向早期内皮祖细胞转化。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (6)

1.一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将磷酸盐缓冲液和外周静脉血混匀，得到稀释的血液；
S2：把稀释的血液加到淋巴细胞分离液上，不要混匀；
S3：以400～500g离心40～50分钟，温度控制在18℃～20℃；
S4：除去血浆部分，取出单个核细胞层，将单个核细胞层与磷酸盐缓冲液混匀；
S5：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，并用15～20mL磷酸盐缓冲液重悬细胞；
S6：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，即得单个核细胞；
S7：将获得的单个核细胞用EBM完全培养基重悬，调整细胞密度后，放置于人纤维黏连蛋白包被的细胞培养瓶，放入培养箱中，在培养的第2～3天，加入黄芪多糖和山苦茶多糖；培养至4～5天，即得早期内皮祖细胞；
在培养箱内培养的条件为：培养的24h内，保持氧浓度为3％，二氧化碳浓度为3.5％，培养的第2～3天，保持氧浓度为10％，二氧化碳浓度为4.5％，培养至第4天，保持与室内氧浓度及二氧化碳浓度相同。
2.根据权利要求1所述的人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，步骤S1中，磷酸盐缓冲液和外周静脉血的体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，步骤S2中，稀释的血液与淋巴细胞分离液的体积比为4：3。
4.根据权利要求1所述的人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，步骤S4中，单个核细胞层与磷酸盐缓冲液的体积比为1:3。
5.根据权利要求1所述的人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，步骤S7中，调整后细胞密度为1×107个/mL。
6.根据权利要求1所述的人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，黄芪多糖的浓度为1.2μg/mL，山苦茶多糖的浓度为1.0μg/mL。
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