CN115537386A - 一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方法和应用，包括如下步骤：使用细胞松弛素B对干细胞进行脱核，利用Percoll离心法或涡旋法分离出脱去细胞核的干细胞胞质体，使用带有滤膜的挤出装置反复挤出，即得脱核干细胞微囊泡。本发明中的方法在除去了干细胞的细胞核的同时保留了干细胞发挥促修复功能的关键蛋白质和RNA，降低了危险基因转移的风险。而且基于挤出法能够有效控制微囊泡的粒径分布，而且基于滤膜的孔径大小，灵活调整所制备的微囊泡的大小，并在组织损伤等方面具有显著治疗效果。

Description

一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
由于受到各种生理/病理因素的影响，在很多情况下组织损伤无法实现理想的再生修复。究其原因，一方面在于组织损伤处的细胞往往存在老化甚至凋亡、坏死等异常情况；另一方面，损伤部位微环境严重失衡，长期处于炎症状态，细胞表型进一步恶化，正常修复进程被干扰打断。因此，逆转细胞老化，改善微环境，是实现组织高效快速修复的关键。
干细胞能够分泌多种促修复的生物活性因子，从而改善损伤处的微环境、激活组织修复相关的细胞，改善其生物功能性；此外，干细胞内部含有大量的活性线粒体，研究表明，干细胞能够通过纳米管、囊泡等，向损伤的、线粒体功能失调的细胞转运活性线粒体，从而恢复细胞活力，提高其产能水平，减少氧化应激的负面影响；干细胞还具有一定的免疫调节作用，因此，干细胞是组织修复领域最常使用的细胞之一。但相关技术中，研究发现将干细胞移植到组织损伤处以期望其能够进行组织修复时，发现干细胞很难长期停留在移植处并按照理想的方向分化，而且存在致癌致畸风险。而选择使用其他物质用于促进组织修复时，如干细胞分泌的细胞外囊泡，又存在着很多其他问题，如通过收集细胞培养上清、离心获得细胞外囊泡的方法需要培养大量的干细胞，步骤繁琐、成本高、产量低，收集到的细胞外囊泡粒径不均一、不可控等等。因此，极大地限制了干细胞在组织修复方面的实际使用。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方法和应用。本发明中的方法能够直接利用干细胞使其基于挤出法和具有特定孔径的滤膜的联用实现无核干细胞微囊泡的制备，相对于传统方法具有更显著的技术优势，且操作简单、成本低、产量高、囊泡粒径均一可控，具有极高的应用价值。
本发明的第一个方面，提供一种脱核干细胞微囊泡的制备方法，包括如下步骤：
使用细胞松弛素B对干细胞进行脱核，利用Percoll离心法或涡旋法分离出脱去细胞核的干细胞胞质体，使用带有滤膜的挤出装置反复挤出，即得脱核干细胞微囊泡。
在本发明的一些实施方式中，使用Percoll离心法分离出脱去细胞核的干细胞胞质体。
在本发明中，发明人发现，如果直接将完整的干细胞进行挤出，细胞核中潜在的风险基因无法从制备的囊泡中除去，后续将囊泡应用在受损组织处时，存在一定的风险基因转移的可能。为了尽可能避免风险基因的转移，在挤出制备囊泡之前，将干细胞的细胞核从细胞中除去是十分有必要的。
在本发明中，除去细胞核后的胞质体仍然能够继续维持活性，且在除去核成分外，干细胞内的细胞器以及其他蛋白质大分子、RNA的成分基本不发生变化，这也为微囊泡在促修复等方面的应用提供了物质基础。
在本发明的一些实施方式中，所述干细胞包括人源干细胞和非人哺乳动物源干细胞。
在本发明中，对于干细胞的来源没有特别限制，包括人源干细胞和非人哺乳动物源干细胞，哺乳动物的实例包括小鼠、大鼠、兔、猪、狗、牛、灵长类动物(除人外)等。
在本发明的一些实施方式中，所述干细胞根据功能性或阶段性包括但不限于：间充质干细胞、造血干细胞、iPS(诱导性多能干细胞)等。
在本发明中，对于干细胞的要求仅为干细胞为健康的干细胞，从而才能保证该细胞在经过本发明中的方法后，能够得到包含具有生物活性的线粒体、蛋白质、RNA等内容物的微囊泡，且基于该基础下，其能够在4℃储存条件下维持长期稳定的活性，能够促进细胞生长、促进组织修复。
在本发明的一些实施方式中，所述滤膜的孔径为0.2μm～10μm。
在本发明的一些实施方式中，所述滤膜的孔径为3.0μm～10μm。
在本发明的一些实施方式中，所述挤出装置选自脂质体挤出器。
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他可以用于细胞囊泡挤出的装置进行挤出操作，包括但不限于脂质体挤出器。
在本发明的一些实施方式中，所述挤出次数大于等于20次。
在本发明的一些实施方式中，所述挤出次数为20～30次。
在本发明的一些实施方式中，所述滤膜选自径迹蚀刻滤膜。
在本发明的一些实施方式中，所述带有滤膜的挤出装置为带有滤膜的脂质体挤出器。通过使用注射器或其他输入性设备将脱去细胞核的干细胞胞质体反复通过带有滤膜的脂质体挤出器进行挤出，即可得到脱核干细胞微囊泡。
在本发明的一些实施方式中，具体挤出步骤为：
(1)使用注射器吸取脱去细胞核的干细胞胞质体，将注射器与夹有孔径为0.2μm～10μm的滤膜的脂质体挤出器相连，然后在脂质体挤出器的另一端连接一支空的注射器用于接收通过滤膜的物质；
(2)来回推拉两个注射器，使得胞质体悬液反复多次通过挤出器中间的滤膜，重复20次以上，即得脱核干细胞的微囊泡。
在本发明中，除去干细胞的细胞核后再进行囊泡挤出的方法，相比于直接利用脱核干细胞而言，具有粒径均一可控的优势，其能够以细胞外囊泡的形式被组织处的受体细胞吞噬，从而能够将囊泡中促修复的蛋白质、RNA、活性线粒体有效递送到受体细胞内，改善受体细胞的生物活性。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的制备方法制备得到的脱核干细胞微囊泡。
在本发明的一些实施方式中，所述脱核干细胞微囊泡是由干细胞质膜包裹的含有活性内容物的微纳米级囊泡。
在本发明的一些实施方式中，所述活性内容物包括母体干细胞来源的细胞器和/或生物活性大分子物质。
在本发明中，基于本发明中制备得到的脱核干细胞微囊泡，一方面能够实现大批量生产的、避免危险基因转移和致畸致癌风险低；另一方面，由于其内容成分与干细胞本身活性组分高度类似或相同，且粒径均一可控、能够包载细胞器并能够被受体细胞吞噬利用，因此能够很好的被本体所吸收并更好地促进组织修复。
在本发明的一些实施方式中，所述活性内容物包括母体干细胞来源的细胞器和生物活性大分子物质。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞器包括线粒体。
在本发明的一些实施方式中，所述生物活性大分子物质包括蛋白质、核酸分子。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子包括RNA。
在本发明的一些实施方式中，所述RNA包括microRNA。
在本发明的一些实施方式中，所述脱核干细胞微囊泡的粒径为0.2μm～10μm。
在本发明的一些实施方式中，所述脱核干细胞微囊泡的粒径为1.0μm～10μm。
本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面所述的脱核干细胞微囊泡在如下(1)～(3)中的应用；
(1)制备组织修复或辅助修复产品；
(2)制备抑制细胞衰老的产品；
(3)制备预防或治疗组织损伤导致的炎症反应的产品。
在本发明中，基于脱核干细胞制备得到的促修复微囊泡能够被组织损伤处的细胞吞噬，实现生物活性因子的高效递送，从而改善细胞的生物功能，激活细胞参与修复、调控微环境，可以在治疗慢性难愈合创面、压疮、重度烧伤、心肌梗死、骨/软骨损伤等组织损伤中作为促修复物质单独或与其他载体材料联合应用，以促进组织修复。
本发明的有益效果是：
(1)本发明中的制备方法是通过化学诱导和高速离心有效除去了干细胞的细胞核，同时保留了干细胞发挥促修复功能的关键蛋白质和RNA，降低了危险基因转移的风险。
(2)本发明中的制备方法基于挤出法制备微囊泡，通过该方法能够得到粒径分布可控、均一的微囊泡，且能基于后续实验和应用需要，通过改变径迹蚀刻滤膜的孔径大小，灵活调整所制备的微囊泡的大小，具有极好的使用灵活性。
(3)本发明避免了大量培养干细胞后提取条件培养基收集外泌体、小细胞外囊泡等天然微囊泡的繁琐过程，囊泡的产率高，制备过程简单高效，且经过试验验证，能被组织损伤处细胞吞噬，实现生物活性因子的高效递送，从而改善细胞生物功能，激活细胞参与修复、调控微环境，在治疗慢性难愈合创面、压疮、重度烧伤、心肌梗死、骨/软骨损伤等组织损伤中作为促修复物质单独或与其他载体材料联合应用，以促进组织修复。
附图说明
图1为本发明实施例中的方法挤出的不同粒径微囊泡的免疫荧光染色图。
图2为本发明实施例中的方法制备得到的微囊泡的粒径分布图，其中，MicroVesicles表示微囊泡，Microspheres表示流式细胞术粒径校准微球。
图3为本发明实施例中的方法制备得到的3μm微囊泡中线粒体含量的流式细胞术表征图。
图4为本发明实施例中的方法制备得到的微囊泡对成纤维细胞的增殖影响。
图5为本发明实施例中的方法制备得到的微囊泡对成纤维细胞炎性因子(TNF-α、IL-6)的影响。
图6为使用本发明实施例中的方法制备得到的微囊泡处理HUVEC后的细胞染色图像，其中，蓝色细胞为衰老的HUVEC。
图7为使用本发明实施例中的方法制备得到的微囊泡处理HUVEC的衰老情况统计图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
在本发明中，所用干细胞为大鼠脂肪间充质干细胞。当然需要理解的是，该干细胞仅仅只是作为示例性演示，而非是对于本发明中干细胞种类的具体限定，本发明中可用的干细胞包括但不限于大鼠脂肪间充质干细胞。
干细胞脱核
具体步骤为：
(1)取传代至P4～P5之间的大鼠脂肪间充质干细胞，使用细胞消化液对大鼠脂肪间充质干细胞进行消化，以便于将其从细胞培养瓶中脱离出来。用大鼠脂肪间充质干细胞培养基重悬，加入终浓度为10μg/mL的细胞松弛素B，在细胞培养箱中孵育30～60min(在本实施例中为30min)。
(2)取Percoll分离液，按照9：1的体积比加入8.5％NaCl得到等渗的SIP溶液，再用等体积生理盐水稀释，得到50％(v/v)的Percoll溶液。
(3)取(1)中孵育后的大鼠脂肪间充质干细胞，1200rpm离心5min，去除上清，得到细胞沉淀。加入(2)中得到的50％(v/v)的Percoll溶液重悬，加入终浓度为20μg/mL的细胞松弛素B，室温下18000×g离心1.5h，收集上下液体中间的白膜层，用培养基或PBS缓冲液重悬(本实施例中为PBS)，得到去核的大鼠脂肪间充质干细胞胞质体悬液。
干细胞微囊泡的制备
具体步骤为：
(1)使用注射器吸取上述实施例中制备得到的去核的大鼠脂肪间充质干细胞胞质体。将注射器与夹有孔径为0.2μm～10μm的滤膜(在本实施例中使用的3μm孔径的径迹蚀刻滤膜)的脂质体挤出器相连，然后在脂质体挤出器的另一端连接一支空的注射器用于接收通过滤膜的物质。
(2)将连接好的装置水平放置于桌面，来回推拉两个注射器，使得胞质体悬液反复多次通过挤出器中间的滤膜，重复20次以上，残余的液体中即含有所需的脱核干细胞的微囊泡。
干细胞微囊泡的表征
(1)免疫荧光染色：
取基于不同孔径滤膜(0.4μm、1.0μm和3.0μm)制得的脱核干细胞的微囊泡，使用免疫荧光染色法对干细胞微囊泡进行染色，其中，所用的染剂为Dil(细胞膜红色荧光探针)、Hoechst 33342(细胞核染色)、Mito Tracker-Green(线粒体绿色荧光探针)。
具体染色操作为：
用PBS按照1：200的比例稀释DiI，按照1：100的比例稀释Hoechst 33342，按照1：5000的比例稀释MitoTracker-Green，得到对应染剂的染色工作液，用该染色工作液对去核后的胞质体进行重悬，在培养箱中避光孵育30min，1000×g离心15min，得到染色的胞质体，加入PBS洗涤2次后，按照上述实施例中的方法进行挤出，得到染色后的囊泡。
结果如图1所示，通过观察不同孔径滤膜(0.4μm、1.0μm和3.0μm)得到脱核干细胞的微囊泡的免疫荧光染色图，可以发现，三组囊泡中均不含细胞核成分。而仅有当去核干细胞微囊泡由3μm滤膜进行挤出制备时，能够有效包载具有活性的线粒体。
(2)粒径分布：
取3.0μm孔径滤膜制得的脱核干细胞的微囊泡，与流式细胞术粒径校准微球(粒径为1.0μm、4.0μm、6.0μm和10.0μm，购自ThermoFisher)进行比较，通过流式细胞术结果中的FSC的峰值来对比各个样品之间的粒径差异。
结果如图2所示。
可以发现，将3.0μm孔径滤膜制得的脱核干细胞的微囊泡与流式细胞术粒径校准微球进行比较，发现有70.7％的囊泡直径分布在1～4μm之间。
(3)脱核干细胞微囊泡中包载线粒体的比例表征：
按照上述实施例中的方法，用MitoTracker-Green标记线粒体，DiI标记细胞膜，用流式细胞术对3.0μm孔径滤膜制得的脱核干细胞的微囊泡中包载的线粒体的比例进行表征。
结果如图3所示。
可以发现，3.0μm孔径滤膜制得的脱核干细胞微囊泡中有约80.9％的微囊泡中包载了线粒体。
干细胞微囊泡的使用效果
(1)干细胞微囊泡的细胞增殖活性：
用含有浓度为35mM的葡萄糖的DMEM培养基对大鼠成纤维细胞培养5天以上，通过β-半乳糖苷酶染色验证细胞处于衰老状态。于孔板中接种正常成纤维细胞和衰老成纤维细胞，正常细胞用低糖DMEM培养，衰老细胞用高糖DMEM培养，实验组中分别用20μg/mL、40μg/mL的微囊泡进行处理，用CCK8试剂对细胞的增殖活性进行检测(CCK8试剂的使用方法参考使用说明书)。
结果如图4所示。
成纤维细胞是创面处的典型细胞，可以发现，使用上述实施例中的方法制备得到的脱核干细胞微囊泡对正常和高糖衰老的成纤维细胞进行处理后，通过检测细胞增殖活性的变化，发现脱核干细胞微囊泡能够显著提高高糖衰老状态的成纤维细胞的增殖活性，从而利于组织损伤处的伤口愈合。
(2)干细胞微囊泡对炎性因子TNF-α的抑制效果：
于孔板内接种正常/衰老的成纤维细胞(rF)，正常细胞(Control)用低糖DMEM培养基培养，衰老rF对照组(Sen-Control)用高糖DMEM培养，衰老细胞实验组用40μg/mL微囊泡进行处理，分别于处理第3天、第5天收集细胞培养上清，用ELISA检测试剂盒对细胞分泌的炎性因子TNF-α、IL-6进行检测。
结果如图5所示。
使用上述实施例中的方法制备得到的脱核干细胞微囊泡对成纤维细胞进行处理后，通过检测处理前后成纤维细胞分泌的炎性因子TNF-α、IL-6的浓度进行检测，可以发现，脱核干细胞微囊泡能够缓解高糖状态下的成纤维细胞炎症表型，从而有利于慢性组织损伤处的修复。
(3)干细胞微囊泡的抗衰老效果：
用高葡萄糖浓度(35mM)的DMEM对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养5天，对照组继续用高糖DMEM进行培养，两个实验组分别用20μg/mL、40μg/mL的微囊泡进行处理，于第3、5、7天对细胞进行β-半乳糖苷酶染色，对视野中蓝色的衰老细胞比例进行统计。
结果如图6和图7所示。
使用上述实施例中的方法制备得到的脱核干细胞微囊泡对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行处理后，通过β-半乳糖苷酶染色对HUVEC衰老情况进行表征。结果显示，在初始状态相同的情况下，使用一定浓度的微囊泡处理HUVEC 5天或以上时，能够显著改善HUVEC的衰老情况。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脱核干细胞微囊泡的制备方法，包括如下步骤：
使用细胞松弛素B对干细胞进行脱核，利用Percoll离心法或涡旋法分离出脱去细胞核的干细胞胞质体，使用带有滤膜的挤出装置反复挤出，即得脱核干细胞微囊泡。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞包括人源干细胞和非人哺乳动物源干细胞。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.2μm～10μm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述挤出装置选自脂质体挤出器。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述挤出次数大于等于20次。
6.权利要求1～5任一项所述的制备方法制备得到的脱核干细胞微囊泡。
7.根据权利要求6所述的脱核干细胞微囊泡，其特征在于，所述脱核干细胞微囊泡是由干细胞质膜包裹的含有活性内容物的微纳米级囊泡。
8.根据权利要求7所述的脱核干细胞微囊泡，其特征在于，所述活性内容物包括母体干细胞来源的细胞器和/或生物活性大分子物质；
所述细胞器包括线粒体；
所述生物活性大分子物质包括蛋白质、核酸分子。
9.根据权利要求7所述的脱核干细胞微囊泡，其特征在于，所述脱核干细胞微囊泡的粒径为0.2μm～10μm，优选为1.0μm～10μm。
10.权利要求6～9任一项所述的脱核干细胞微囊泡在如下(1)～(3)中的应用；
(1)制备组织修复或辅助修复产品；
(2)制备抑制细胞衰老的产品；
(3)制备预防或治疗组织损伤导致的炎症反应的产品。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115433708A (zh) * 2022-08-22 2022-12-06 浙江大学 特定细胞靶向的代谢系统递送的生物材料及制备方法和应用

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