CN108359636B - 一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法:在第0~1天对传代培养至4~5代的多能干细胞进行诱导分化,使用的培养基中含有2~15μM的GSK‑3抑制剂;在第2~3天使用含有0.2~5μM视黄酸的培养基继续诱导分化;在第4~5天使用含有2~10μM的Wnt抑制剂的培养基诱导分化;以后利用培养基对细胞进行诱导分化,在第9~10天能观察到心肌细胞的跳动;其中,在第1~6天,使用第一诱导分化培养基,其包括RPMI‑1640基础培养基、B27‑insulin;在第7天以后,使用第二诱导分化培养基,其包括RPMI‑1640基础培养基以及B27;或者在整个诱导分化培养过程中,使用CDM3诱导分化培养基或无血清的诱导分化培养基,其中CDM3诱导分化培养基包括RPMI‑1640基础培养基、血清白蛋白、抗坏血酸和双抗。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域,尤其涉及一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法。
背景技术
心脏疾病在国内外的发病率和死亡率已居于首位,成为严重危害人类健康的疾病之一。大多数病人由于缺血性或其他病理性损伤从而导致心肌受损,出现心脏功能不足,严重威胁生命。干细胞具有高度自我更新、增殖和多向分化潜能、可植入性及具备重建能力等特征,在再生医学领域具有不可估量的医学价值和诱人的应用前景。这些年,随着干细胞技术的深入发展,利用干细胞分化的心肌细胞为损伤心肌修复和替代治疗提供了可能。胚胎发育过程为干细胞定向分化提供了重要线索,在过去的几年中,通过操控心脏发育关键通路,在心肌定向分化方面取得了重要进展,但是现有的诱导心肌细胞的分化方法仍不成熟,表现为可重复性差、分化效率不稳定等。
目前,关于心肌细胞的分化技术已经有许多种方法,由于所用专有培养基的复杂性,体外心脏分化的相对自主性,所以人们对于体外心脏分化所需的途径和大分子知之甚少。2012年,Lian XJ通过调节经典Wnt通路的开启和关闭实现了心肌细胞的定向分化,之后,基于这一原理实现了在成分明确的培养基中进行心肌细胞的定向分化,为心肌细胞的临床应用奠定了基础。2014年,Paul指出过去的诱导方法中所用专有培养基成分复杂,所以提出利用化学成分确定的诱导培养基,通过添加CHIR99021等小分子化合物,获得相对较高的心肌细胞。
目前,关于心肌细胞的分化技术的缺点主要有以下几个方面:(1)现有的分化方法仍不成熟,表现为可重复性差、分化效率不稳定;(2)分化方法复杂,所需成本较高;(3)分化的心肌细胞纯度低、安全性较低、均一性差;(4)诱导的心肌细胞移植到动物体内,存在心率失常、致瘤性和重塑心脏结构差等问题。
视黄酸(RA,retinoic acid,all-trans-RA)是来源于视黄醇(Retinol,又称维生素A,Vitamin A)的形态发生素,在细胞生长、分化和器官发生过程中发挥重要作用。过去研究的是视黄酸(RA)通路在心脏发育过程中发挥重要作用,RA缺失会导致心房变小、心室小梁减少、心肌壁增厚且细胞间连接松散。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法,本发明的方法简单、稳定高效,大大提高了多能干细胞向心肌细胞的分化效率。
本发明提供了一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法,包括以下步骤:
(1)在第0~1天对传代培养至4~5代的多能干细胞进行诱导分化,所使用的培养基中含有2~15μM的GSK-3抑制剂;
(2)在第2~3天使用含有0.2~5μM视黄酸的培养基继续进行诱导分化;
(3)在第4~5天使用含有2~10μM的Wnt抑制剂的培养基继续进行诱导分化;
(4)第7天以后利用培养基对细胞进行诱导分化,第9~10天能观察到心肌细胞的跳动;其中,
在第1~6天,使用的培养基为第一诱导分化培养基,第一诱导分化培养基包括RPMI-1640基础培养基、不含胰岛素的细胞培养添加剂B27(简称B27-insulin);在第7天以后,使用的培养基为第二诱导分化培养基,第二诱导分化培养基包括RPMI-1640基础培养基以及含胰岛素的细胞培养添加剂B27(简称B27);或者
在整个培养过程中,使用的培养基为CDM3诱导分化培养基或无血清的诱导分化培养基,所述CDM3诱导分化培养基包括RPMI-1640基础培养基、血清白蛋白、抗坏血酸和双抗。
进一步地,多能干细胞包括胚胎干细胞(ESC)和/或诱导多潜能干细胞(iPSC)。
进一步地,在步骤(1)之前,还包括使用mTeSR1或E8等维持培养基培养所述多能干细胞的步骤,当细胞密度达到80~85%时,对细胞进行传代培养。
进一步地,GSK-3抑制剂为CHIR99021。优选地,GSK-3抑制剂的浓度为5μM。
进一步地,在步骤(1)中,还包括将传代培养至4~5代的多能干细胞以104/cm2的密度接种至培养皿中,然后培养至细胞密度达85%以上时,再进行诱导分化的步骤。
优选地,在步骤(2)中,视黄酸的浓度为1μM。
进一步地,在步骤(3)中,Wnt抑制剂为IWR-1、IWP-2、IWP-4和C59中的一种。优选地,Wnt抑制剂为IWR-1。优选地,Wnt抑制剂的浓度为5μM。
进一步地,第一诱导分化培养基中B27-insulin的质量分数为2%。
进一步地,第二诱导分化培养基中B27的质量分数为2%。
进一步地,CDM3诱导分化培养基中血清白蛋白的浓度为450μg/mL,抗坏血酸的浓度为192μg/mL。
进一步地,细胞培养均在37℃、5%CO2的条件下进行。
进一步地,血清白蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白等。
进一步地,采用本发明的方法进行诱导多能干细胞分化,在第9~10天就能观察到明显的心肌跳动,其分化效率为85%左右。
本发明在化学成分确定的条件下,通过添加特定浓度的视黄酸能显著提高多能干细胞(hPSCs)分化为心肌细胞的效率。本发明公开的方法主要利用添加定向分化的诱导因子,包括GSK-3抑制剂和Wnt抑制剂。这些诱导因子直接作用于经典的Wnt信号通路,在诱导分化过程中,通过添加特定小分子化合物视黄酸(RA),在特定浓度(0.2μM~5μM)条件下进行诱导,可以明显提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的效率。
借由上述方案,本发明至少具有以下优点:
发明人通过深入研究RA在心肌分化各个阶段的作用机制,发现RA在心肌分化的第2~3天处理将有助于获得高质量的心肌细胞。与对照组相比本发明的方法心肌分化效率可提高20%左右,这能明显提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的效率。进一步说明视黄酸(RA)通路在体外心肌定向分化过程中,能提高心肌细胞的分化效率。本发明方法稳定高效,简单可靠,获得的心肌细胞移植到动物体内,具有低致瘤性、低心率失常性,有效地减少心梗面积、重塑心脏结构。该心肌细胞既可以用于心脏疾病的治疗,也可为心肌细胞损伤提供稳定的细胞来源,同时为临床治疗心肌梗死提供大量有功能性的心肌细胞。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如下。
附图说明
图1为生长在Matrigel基质胶上未分化的HES3细胞显微照片;
图2为HES3细胞定向分化为自主搏动心肌细胞的荧光显微照片;
图3为本发明的方法与对照组方法中的HES3细胞定向分化过程中的中胚层基因,FOXF1、KDR、PDGFRA基因的RNA表达水平测试结果;
图4为本发明的方法与对照组方法中的hPSCs定向分化为心肌细胞后,流式细胞分析:A、B为HES3细胞诱导的心肌细胞内基因NKX2.5的表达;C、D为SCCTM-iPSC-1细胞诱导的心肌细胞内基因cTnT的表达。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
如无特殊说明,本发明以下实施例中,第一诱导分化培养基包括RPMI-1640基础培养基、2%的不含胰岛素的细胞培养添加剂B27,简称为RPMI1640+B27-insulin;第二诱导分化培养基包括RPMI-1640基础培养基以及2%的含胰岛素的细胞培养添加剂B27,简称为RPMI1640+B27。
实施例1胚胎干细胞的培养、传代
本实施例以hPSCs中的HES3细胞系作为实验对象,HES3细胞生长在Matrigel基质胶包被的培养皿上,以1:200DMEM/F12基础培养基稀释使用。然后将HES3细胞种植在基质胶上,使用mTeSR1或E8培养基进行细胞培养,每天换液。待HES3细胞密度达到80%左右,细胞克隆足够大的情况下,进行细胞传代。
传代时,先用DPBS洗涤2次,去除表面死掉的细胞碎片,加入0.1mol/L EDTA置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中消化7分钟。消化时间到了之后,在倒置显微镜下观察贴壁细胞间出现间隙但尚未相互分离,肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白,吸去消化液,加入干细胞培养基,用移液器扇形吹打培养皿底部,使皿底贴附的干细胞脱落,轻柔缓慢吹打均匀制成细胞悬液。一般以1:10或1:12的比例接种到用基质胶包被的培养皿中,以后每4天传代一次。
将未分化的HES3细胞在倒置荧光显微镜下拍照,步骤为先用DPBS洗涤细胞,去除细胞表面的一些死细胞,洗3次,然后换成干细胞生长培养基,于10×镜下观察拍照,结果如图1所示。
实施例2胚胎干细胞定向诱导分化为心肌细胞
将培养传代至4~5代的HES3细胞用DPBS洗涤后,0.1mol/L EDTA消化7分钟,以104/cm2的密度接种于培养皿中,置于37℃、5%CO2培养箱培养4天,细胞密度达到85%以上,换成RPMI1640+B27-insulin诱导培养基。
视黄酸处理组(RA组):第0~1天诱导分化是利用内含5μMCHIR99021的RPMI1640+B27-insulin进行诱导分化,第2~3天换成含有1μM视黄酸的RPMI1640+B27-insulin,在第4~5天利用含有5μM的Wnt抑制剂的RPMI1640+B27-insulin培养。第6天只使用RPMI1640+B27-insulin培养。第7天以后每天用RPMI1640+B27培养,诱导分化第9~10天(D9~D10)时能观察到明显的心肌跳动。其细胞分化效率为85%左右。
设置对照组(DMSO组),其培养过程同上述步骤,区别在于第2~3天添加与处理组溶液等体积的内含DMSO的诱导培养基进行培养。
将诱导的心肌细胞(D10)在倒置荧光显微镜下拍照,步骤是先用DPBS洗涤细胞,去除细胞表面的一些死细胞,洗3次,然后换成诱导培养基,于10×镜下拍照。结果如图2所示。
在心肌细胞诱导过程中,在第2~3天使用视黄酸进行处理,然后第4天收取一部分细胞,提RNA,通过实时荧光定量PCR仪进行检测在心肌分化的过程中某一阶段中胚层的基因的表达。通过检测FOXF1、KDR、PDGFRA的RNA水平上的表达(图3A、3B、3C),视黄酸处理组与对照组相比,以上三个基因均表现出明显的上调趋势,并且差异显著,说明视黄酸处理组RA能促进侧板中胚层的基因表达。这表明在诱导心肌分化的过程中,可以通过在特定时间特定浓度的条件下添加RA,促进侧板中胚层的分化,进而提高心肌细胞的分化效率。
将诱导的心肌细胞(D10)进行细胞内的标志物流式细胞学检测,步骤如下:
(1)吸弃培养基,用DPBS洗涤3次,加0.25%胰酶消化8分钟,在倒置显微镜下观察到细胞变圆后,加入含有RPMI-1640培养基(内含5%FBS)终止消化,用移液器扇形吹打培养皿底部,制成细胞悬液。
(2)将悬液置于1mL EP管中,1000rpm离心5分钟;弃上清,用PBS洗涤,1000rpm离心5分钟,重复两次。用PBS重悬,制成单细胞悬液。
视黄酸处理组的处理与对照组细胞悬液采用1%PFA(多聚甲醛)固定20min;90%甲醇4度孵育15min;FlowBuffer-1洗两次,每次5min,1000rpm离心5分钟,弃上清;将一抗NKX2.5抗体置于FlowBuffer-2中,室温1h,抗体比例1:200,1000rpm离心5分钟,弃上清;用FlowBuffer-2洗两次,1000rpm离心5分钟,弃上清;孵二抗,于FlowBuffer-2中,室温30min,避光,1000rpm离心5分钟,弃上清;FlowBuffer-2洗两次,1000rpm离心5分钟,弃上清;用FlowBuffer-1重悬细胞。FlowBuffer-1配法是0.1g BSA、20mL PBS;FlowBuffer-2的配法是0.1g BSA、20μLTritonx-100、20mL PBS。
然后把各样本上样于流式细胞仪,测定标记的细胞占总细胞数的百分比。
根据流式细胞仪统计实验结果表明HES3细胞诱导的心肌细胞对照组(DMSO组)的NKX2.5阳性表达为83.63%(图4A),RA组的NKX2.5阳性表达为90.32%(图4B);上述结果足够可以说明,胚胎干细胞在特定时间(第2~3天)经过视黄酸处理后,能有效地提高心肌分化效率。
实施例3诱导多潜能干细胞的培养、传代及定向诱导
本实施例将实施例1和2中的HES3细胞换成hPSCs中的SCCTM-iPSC-1细胞系作为实验对象,其它具体实施方式参照实施例1和2,根据流式细胞仪统计实验结果表明SCCTM-iPSC-1细胞诱导的心肌细胞对照组(DMSO组)的cTnT阳性表达为36.93%(图4C),RA组的cTnT阳性表达为59.85%(图4D)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的分化效率的方法,所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞,其特征在于,包括以下步骤:
(1)在第0~1天对传代培养至4~5代的多能干细胞进行诱导分化,所使用的培养基中含有2~15μM的GSK-3抑制剂;所述GSK-3抑制剂为CHIR99021;
(2)在第2~3天使用含有1μM视黄酸的培养基进行诱导分化;
(3)在第4~5天使用含有2~10μM的Wnt抑制剂的培养基继续进行诱导分化;所述Wnt抑制剂为IWR-1;
(4)在第7天以后利用培养基对细胞进行诱导分化,第9~10天能观察到心肌细胞的跳动;其中,
在第1~6天,使用的培养基为第一诱导分化培养基,所述第一诱导分化培养基包括RPMI-1640基础培养基、不含胰岛素的细胞培养添加剂B27;在第7天以后,使用的培养基为第二诱导分化培养基,所述第二诱导分化培养基包括RPMI-1640基础培养基以及含胰岛素的细胞培养添加剂B27。
2.根据权利要求1所述的提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的分化效率的方法,其特征在于:在步骤(1)之前,还包括使用mTeSR1或E8培养基培养所述多能干细胞的步骤,当细胞密度达到80~85%时,对细胞进行传代培养。
3.根据权利要求1所述的提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的分化效率的方法,其特征在于:在步骤(1)中,还包括将传代培养至4~5代的多能干细胞以104/cm2的密度接种至培养皿中,然后培养至细胞密度达85%以上时,再进行诱导分化的步骤。
4.根据权利要求1所述的提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的分化效率的方法,其特征在于:所述第一诱导分化培养基中不含胰岛素的细胞培养添加剂B27的质量分数为2%。
5.根据权利要求1所述的提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的分化效率的方法,其特征在于:所述第二诱导分化培养基中含胰岛素的细胞培养添加剂B27的质量分数为2%。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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