CN111500532A - 心肌细胞诱导和生长培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，涉及心肌细胞诱导和生长培养基，公开了一个稳定、经济地生产心肌细胞的无血清生产方法，整套系统分为诱导分化系统(IS，induced system)和长期培养系统(LCS，long‑term culture system)。诱导分化系统的组分包括：氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、谷胱甘肽、HEPES、酚红、重组人白蛋白、抗坏血酸；长期培养体系的组分包括：氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、谷胱甘肽、HEPES、酚红、抗坏血酸、转铁蛋白、胰岛素、亚硒酸钠、脂质浓缩物。整套系统规避了常规不稳定的混合物添加剂的成分，提高了心肌细胞分化和培养的稳定性，且整套系统添加剂价格低廉，适用于大规模心肌细胞生产。

Description

心肌细胞诱导和生长培养基
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及心肌细胞诱导和生长培养基及其生产方法和应用。
背景技术
人源心肌细胞在药物评价以及细胞治疗等方面具有广阔的应用前景。因心肌细胞增殖能力极弱，且人类心脏组织获取困难，由人多能干细胞分化获得心肌细胞成为获取人源心肌细胞的主要途径。
心肌细胞分化研究已非常深入，通过操纵WNT信号通路即可成功诱导人多能干细胞分化形成心肌细胞，但心肌细胞的分化稳定性在不同体系中差异巨大。现有心肌细胞分化、培养技术往往通过配合添加胎牛血清、牛血清白蛋白或B27添加剂(B-27TM Supplement,minus insulin(ThermoFisher，A1895601))实现，而这些添加剂在不同批次之间存在差异，导致心肌细胞分化的不稳定。此外，不同的人多能干细胞系在心肌生产方面也存在差异。当下的人多能干细胞分化心肌细胞体系普遍存在添加剂多的问题，导致心肌细胞生产成本昂贵、细胞分化不稳定以及细胞有添加剂成分残留等问题。因此，在开发心肌细胞培养体系时，需要注重剔除不稳定过成分以及对不同的细胞系开发不同的生产体系。
发明内容
本发明涉及一种经济的心肌细胞分化培养基和生长培养基。本发明的培养基使用化学成分明确的单一成分添加剂替换混合成分添加剂：在分化系统中，使用重组人白蛋白和抗坏血酸代替混合成分添加剂；在生长系统使用化学成分确定的脂质浓缩物以及胰岛素代替胎牛血清。解决了由混合成分添加剂带来的心肌细胞生产的不稳定性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明第一方面提供一种诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的无血清分化培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、pH调节剂、白蛋白、抗坏血酸或由其组成。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含基础培养基、白蛋白和抗坏血酸。在一个或多个实施方案中，基础培养基选自以下的一种或多种：RPMI1640培养基、GlutaMAX、DMEM/F12。
在一个或多个实施方案中，分化培养基是液体。
在一个或多个实施方案中，抗坏血酸浓度为0.1-5g/L、0.1-4.5g/L、0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.1-1.5g/L、0.1-1g/L、0.1-0.9g/L、0.1-0.8g/L、0.1-0.7g/L、0.1-0.6g/L、0.1-0.5g/L、0.1-0.4g/L、0.1-0.3g/L、0.1-0.2g/L、0.2-0.4g/L、0.3-0.4g/L、0.2-0.3g/L。
在一个或多个实施方案中，白蛋白是重组人白蛋白。
在一个或多个实施方案中，重组人白蛋白浓度为0.1-5g/L、0.1-4.5g/L、0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.1-1.5g/L、0.1-1g/L、0.1-0.5g/L、0.25-1g/L、0.25-0.5g/L。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含1％-5％氨基酸、1％-5％维生素、无机盐、1-4g/L碳源、0.5-1.5mg/L谷胱甘肽、0.15-1.5g/L白蛋白、0.1-0.6g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含2％-4％氨基酸、2％-4％维生素、无机盐、1-3g/L碳源、1mg/L谷胱甘肽、0.25-1g/L白蛋白、0.1-0.4g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含2％氨基酸、2％维生素、无机盐、1g/L碳源、1mg/L谷胱甘肽、0.25g/L白蛋白、0.1g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包含1-20uM、2-15uM、3-12uM的GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂。优选地，GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂是CHIR-99021。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含3-12uM的CHIR-99021。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包含1-20uM、2-15uM、2.5-10uM的Wnt通路抑制剂。优选地，Wnt通路抑制剂是IWR1。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包含2.5-10uM IWR1。
在一个或多个实施方案中，碳源是葡萄糖。
在一个或多个实施方案中，pH调节剂是HEPES。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基的pH为6-9，优选pH为7-8，更优选pH为7.6。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包含抑菌剂，例如抗生素。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包括pH指示剂，例如酚红。
在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：甘氨酸、丙氨酰、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。优选地，所述各氨基酸是L-氨基酸。
在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：5-15mg/L的甘氨酸、400-500mg/L的丙氨酰、150-250mg/L的精氨酸、40-60mg/L的天冬酰胺、15-25mg/L的天冬氨酸、40-60mg/L的胱氨酸、15-25mg/L的谷氨酸、10-20mg/L的组氨酸、15-25mg/L的羟脯氨酸、40-60mg/L的异亮氨酸、40-60mg/L的亮氨酸、30-50mg/L的盐酸赖氨酸、10-20mg/L的蛋氨酸、10-20mg/L的苯基丙氨酸、15-25mg/L的脯氨酸、25-35mg/L的丝氨酸、15-25mg/L的苏氨酸、2-8mg/L的色氨酸、15-25mg/L的酪氨酸、15-25mg/L的缬氨酸。优选地，所述各氨基酸是L-氨基酸。
在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：10mg/L的甘氨酸、446mg/L的L-丙氨酰、200mg/L的L-精氨酸、50mg/L的L-天冬酰胺、20mg/L的L-天冬氨酸、50mg/L的L-胱氨酸、20mg/L的L-谷氨酸、15mg/L的L-组氨酸、20mg/L的L-羟脯氨酸、50mg/L的L-异亮氨酸、50mg/L的L-亮氨酸、40mg/L的L-盐酸赖氨酸、15mg/L的L-蛋氨酸、15mg/L的L-苯基丙氨酸、20mg/L的L-脯氨酸、30mg/L的L-丝氨酸、20mg/L的L-苏氨酸、5mg/L的L-色氨酸、20mg/L的L-酪氨酸、20mg/L的L-缬氨酸。
在一个或多个实施方案中，维生素包括选自以下的一种或多种或全部：维生素H、氯化胆硷、右旋泛酸钙、维生素B、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素B2、盐酸硫胺素、维生素B12、肌醇。
在一个或多个实施方案中，维生素包括选自以下的一种或多种或全部：0.15-0.25mg/L的维生素H、2.5-3.5mg/L的氯化胆硷、0.2-0.3mg/L的右旋泛酸钙、0.5-1.5mg/L的维生素B、0.5-1.5mg/L的烟酰胺、0.5-1.5mg/L的对氨基苯甲酸、0.5-1.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.15-0.25mg/L的维生素B2、0.5-1.5mg/L的盐酸硫胺素、0.003-0.007mg/L的维生素B12、30-40mg/L的肌醇。
在一个或多个实施方案中，维生素包括选自以下的一种或多种或全部：0.2mg/L的维生素H、3mg/L的氯化胆硷、0.25mg/L的右旋泛酸钙、1mg/L的维生素B、1mg/L的烟酰胺、1mg/L的对氨基苯甲酸、1mg/L的盐酸吡哆醇、0.2mg/L的维生素B2、1mg/L的盐酸硫胺素、0.005mg/L的维生素B12、35mg/L的肌醇
在一个或多个实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：钙盐、镁盐、钾盐、硝酸盐、硫酸盐、氯化物、磷酸盐。
在一个或多个实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：Ca(NO3)24H2O、MgSO4-7H2O、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4。
在一个或多个实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：80-120mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、80-120mg/L的MgSO4 7H2O、300-500mg/L的KCl、1500-2500mg/L的NaHCO3、4500-6500mg/L的NaCl、500-1100mg/L的Na2HPO4。
在一个或多个实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：100mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、100mg/L的MgSO4 7H2O、400mg/L的KCl、2000mg/L的NaHCO3、5500mg/L的NaCl、800mg/L的Na2HPO4。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含2％氨基酸、2％维生素、1g/L碳源、1mg/L谷胱甘肽、0.25g/L白蛋白、0.1g/L抗坏血酸、100mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、100mg/L的MgSO4 7H2O、400mg/L的KCl、2000mg/L的NaHCO3、5500mg/L的NaCl、800mg/L的Na2HPO4、任选的pH调节剂或由其组成。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包含3-12uM的CHIR-99021或2.5-10uM的IWR1。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含基础培养基RPMI 1640培养基、0.25g/L白蛋白、0.1g/L抗坏血酸，或由其组成。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基还包含3-12uM的CHIR-99021或2.5-10uM的IWR1。
本发明第一方面还提供诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的培养基的制备方法，所述分化培养基包含以下组分：1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、pH调节剂和任选的1-20uM的GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂和任选的1-20uM的Wnt通路抑制剂，或由其组成，所述方法包括混合各组分。
优选地，所述分化培养基如本文第一方面所述。
本发明第一方面还提供诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的方法，包括用分化培养基孵育DYR0100细胞，所述分化培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、pH调节剂和任选的1-20uM的GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂和任选的1-20uM的Wnt通路抑制剂，或由其组成。
在一个或多个实施方案中，GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂是CHIR-99021。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含3-12uM的CHIR-99021。
在一个或多个实施方案中，Wnt通路抑制剂是IWR1。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基包含2.5-10uM的IWR1。
在一个或多个实施方案中，所述孵育的起始细胞浓度是1E+5～10E+5/cm2，优选2E+5～9E+5/cm2、3E+5～8E+5/cm2、3E+5～7E+5/cm2、3E+5～6E+5/cm2、3E+5～5E+5/cm2或3.5E+5～4.0E+5/cm2。
优选地，所述分化培养基如本文第一方面所述。
本发明第一方面还提供诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的方法，包括
(1)用含有1-20uM的GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂的分化培养基孵育DYR0100细胞，
(2)用含有1-20uM的Wnt通路抑制剂的分化培养基继续孵育，
任选的(3)用不含GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂和Wnt通路抑制剂的分化培养基继续孵育，
所述分化培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育的起始细胞浓度是1E+5～10E+5/cm2，优选2E+5～9E+5/cm2、3E+5～8E+5/cm2、3E+5～7E+5/cm2、3E+5～6E+5/cm2、3E+5～5E+5/cm2或3.5E+5～4.0E+5/cm2。
在一个或多个实施方案中，GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂是CHIR-99021。优选地，步骤(2)中加入3-12uM的CHIR-99021。
在一个或多个实施方案中，Wnt通路抑制剂是IWR1。优选地，步骤(3)中加入2.5-10uM的IWR1。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)孵育1-10天，优选1-5天，更优选3天。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)孵育1-10天，优选1-5天，更优选3天。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)孵育至少1天，优选1-5天，更优选3天。
优选地，所述分化培养基如本文第一方面所述。
本发明第一方面还提供由本文所述分化培养基培养的心肌细胞。
本发明第一方面还提供由本文所述诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的方法获得的心肌细胞。
本发明第一方面还提供心肌细胞在药物筛选以及评估药物对心肌的毒理作用中的用途，所述心肌细胞由本文所述分化培养基培养或由本文所述诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的方法获得。
在一个或多个实施方案中，所述药物是促进心肌细胞的发育、分化、再生、生存等的药物。
本发明第一方面还提供心肌细胞在制备用于治疗受益于补充或更换心肌细胞的心脏疾病的药物中的用途，所述心肌细胞由本文所述分化培养基培养或由本文所述诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的方法获得。
在一个或多个实施方案中，所述受益于补充或更换心肌细胞的心脏疾病是缺血性心脏病、心率不齐或肥厚性心肌病。
本发明第二方面提供一种心肌细胞的无血清生长培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、抗坏血酸、转铁蛋白、亚硒酸钠、脂质浓缩物、胰岛素或由其组成。
在一个或多个实施方案中，所述生长培养基包含基础培养基、转铁蛋白、抗坏血酸、亚硒酸钠、脂质浓缩物、胰岛素。在一个或多个实施方案中，基础培养基选自DMEM/F12、RPMI 1640培养基、GlutaMAX。
在一个或多个实施方案中，心肌细胞衍生自DYR0100细胞。优选地，所述心肌细胞是本文第一方面所述的心肌细胞。
在一个或多个实施方案中，生长培养基是液体。
在一个或多个实施方案中，抗坏血酸浓度为0.1-5g/L、0.1-4.5g/L、0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.1-1.5g/L、0.1-1g/L、0.1-0.9g/L、0.1-0.8g/L、0.1-0.7g/L、0.1-0.6g/L、0.1-0.5g/L、0.1-0.4g/L、0.1-0.3g/L、0.1-0.2g/L、0.2-0.4g/L、0.3-0.4g/L、0.2-0.3g/L。
在一个或多个实施方案中，转铁蛋白浓度为0.1-5g/L、0.1-4.5g/L、0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.1-1.5g/L、0.1-1g/L、0.2-1g/L、0.3-1g/L、0.4-1g/L、0.5-1g/L、0.6-1g/L、0.6-0.8g/L。
在一个或多个实施方案中，胰岛素浓度为0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.2-2g/L、0.3-2g/L、0.4-2g/L、0.5-2g/L、0.6-2g/L、0.7-2g/L、0.8-2g/L、0.9-2g/L、1-2g/L。
在一个或多个实施方案中，亚硒酸钠浓度为0.1-3mg/L、0.2-2.5mg/L、0.3-2mg/L、0.4-1.5mg/L、0.5-1mg/L，优选0.5mg/L。
在一个或多个实施方案中，脂质浓缩物包含选自以下的一种或多种或全部：花生四烯酸、胆固醇、维生素E醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、十八烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、Pluronic F-68、硬脂酸、吐温80和任选的乙醇。
在一个或多个实施方案中，脂质浓缩物包括选自以下的一种或多种或全部：1.0-3.0mg/L的花生四烯酸、180-260mg/L的胆固醇、50-90mg/L的维生素E醋酸酯、5-15mg/L的亚油酸、5-15mg/L的亚麻酸、5-15mg/L的肉豆蔻酸、5-15mg/L的十八烯酸、5-15mg/L的棕榈酸、5-15mg/L的棕榈油酸、70-110g/L的Pluronic F-68、5-15mg/L的硬脂酸、1.5-2.8g/L的吐温80和任选的乙醇。
在一个或多个实施方案中，脂质浓缩物包括选自以下的一种或多种或全部：1.5-2.5mg/L的花生四烯酸、200-240mg/L的胆固醇、60-80mg/L的维生素E醋酸酯、8-12mg/L的亚油酸、8-12mg/L的亚麻酸、8-12mg/L的肉豆蔻酸、8-12mg/L的十八烯酸、8-12mg/L的棕榈酸、8-12mg/L的棕榈油酸、80-100g/L的Pluronic F-68、8-12mg/L的硬脂酸、1.8-2.5g/L的吐温80和任选的乙醇。
在一个或多个实施方案中，脂质浓缩物包括选自以下的一种或多种或全部：2.0mg/L的花生四烯酸、220.0mg/L的胆固醇、70.0mg/L的维生素E醋酸酯、10.0mg/L的亚油酸、10.0mg/L的亚麻酸、10.0mg/L的肉豆蔻酸、10.0mg/L的十八烯酸、10.0mg/L的棕榈酸、10.0mg/L的棕榈油酸、90g/L的Pluronic F-68、10.0mg/L的硬脂酸、2.2mg/L的吐温80和任选的乙醇。
在一个或多个实施方案中，脂质浓缩物浓度为0.1-5％、0.2-4.5％、0.3-4.0％、0.4-3.5％、0.5-3.0％、0.6-2.5％、0.7-2.0％、0.8-1.5％、0.9-1.0％，优选1.0％。
在一个或多个实施方案中，所述生长培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L转铁蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、0.1-3mg/L亚硒酸钠，0.1-5％脂质浓缩物、0.1-5g/L胰岛素、无机盐、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，所述生长培养基包含1％-5％氨基酸、1％-5％维生素、1-4g/L碳源、0.5-1.5mg/L谷胱甘肽、0.3-1.5g/L转铁蛋白、0.1-0.6g/L抗坏血酸、0.3-2mg/L亚硒酸钠，0.2-3％脂质浓缩物、0.2-3g/L胰岛素、无机盐、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，所述生长培养基包含2％-4％氨基酸、2％-4％维生素、无机盐、1-3g/L碳源、1mg/L谷胱甘肽、0.5-1g/L转铁蛋白、0.1-0.4g/L抗坏血酸、0.5-1mg/L亚硒酸钠、0.5-2％脂质浓缩物、0.5-2g/L胰岛素、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，碳源是葡萄糖。
在一个或多个实施方案中，pH调节剂是HEPES。
在一个或多个实施方案中，所述生长培养基的pH为6-9，优选7-8，更优选7.6。
在一个或多个实施方案中，所述生长培养基还包含抑菌剂，例如抗生素。
在一个或多个实施方案中，所述生长培养基还包括pH指示剂，例如酚红。
在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：甘氨酸、丙氨酰、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。优选地，所述各氨基酸是L-氨基酸。
在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：5-15mg/L的甘氨酸、400-500mg/L的丙氨酰、150-250mg/L的精氨酸、40-60mg/L的天冬酰胺、15-25mg/L的天冬氨酸、40-60mg/L的胱氨酸、15-25mg/L的谷氨酸、10-20mg/L的组氨酸、15-25mg/L的羟脯氨酸、40-60mg/L的异亮氨酸、40-60mg/L的亮氨酸、30-50mg/L的盐酸赖氨酸、10-20mg/L的蛋氨酸、10-20mg/L的苯基丙氨酸、15-25mg/L的脯氨酸、25-35mg/L的丝氨酸、15-25mg/L的苏氨酸、2-8mg/L的色氨酸、15-25mg/L的酪氨酸、15-25mg/L的缬氨酸。优选地，所述各氨基酸是L-氨基酸。
在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：10mg/L的甘氨酸、446mg/L的L-丙氨酰、200mg/L的L-精氨酸、50mg/L的L-天冬酰胺、20mg/L的L-天冬氨酸、50mg/L的L-胱氨酸、20mg/L的L-谷氨酸、15mg/L的L-组氨酸、20mg/L的L-羟脯氨酸、50mg/L的L-异亮氨酸、50mg/L的L-亮氨酸、40mg/L的L-盐酸赖氨酸、15mg/L的L-蛋氨酸、15mg/L的L-苯基丙氨酸、20mg/L的L-脯氨酸、30mg/L的L-丝氨酸、20mg/L的L-苏氨酸、5mg/L的L-色氨酸、20mg/L的L-酪氨酸、20mg/L的L-缬氨酸。
在一个或多个实施方案中，维生素包括选自以下的一种或多种或全部：维生素H、氯化胆硷、右旋泛酸钙、维生素B、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素B2、盐酸硫胺素、维生素B12、肌醇。
在一个或多个实施方案中，维生素包括选自以下的一种或多种或全部：0.15-0.25mg/L的维生素H、2.5-3.5mg/L的氯化胆硷、0.2-0.3mg/L的右旋泛酸钙、0.5-1.5mg/L的维生素B、0.5-1.5mg/L的烟酰胺、0.5-1.5mg/L的对氨基苯甲酸、0.5-1.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.15-0.25mg/L的维生素B2、0.5-1.5mg/L的盐酸硫胺素、0.003-0.007mg/L的维生素B12、30-40mg/L的肌醇。
在一个或多个实施方案中，维生素包括选自以下的一种或多种或全部：0.2mg/L的维生素H、3mg/L的氯化胆硷、0.25mg/L的右旋泛酸钙、1mg/L的维生素B、1mg/L的烟酰胺、1mg/L的对氨基苯甲酸、1mg/L的盐酸吡哆醇、0.2mg/L的维生素B2、1mg/L的盐酸硫胺素、0.005mg/L的维生素B12、35mg/L的肌醇
在一个或多个实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：钙盐、镁盐、钾盐、硝酸盐、硫酸盐、氯化物、磷酸盐。
在一个或多个实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：Ca(NO3)24H2O、MgSO4-7H2O、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4。
在一个或多个实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：80-120mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、80-120mg/L的MgSO4 7H2O、300-500mg/L的KCl、1500-2500mg/L的NaHCO3、4500-6500mg/L的NaCl、500-1100mg/L的Na2HPO4。
在一个或多个实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：100mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、100mg/L的MgSO4 7H2O、400mg/L的KCl、2000mg/L的NaHCO3、5500mg/L的NaCl、800mg/L的Na2HPO4。
在一个或多个实施方案中，生长培养基包含2％氨基酸、2％维生素、1g/L碳源、1mg/L谷胱甘肽、0.5g/L转铁蛋白、0.1g/L抗坏血酸、0.5mg/L亚硒酸钠、1％脂质浓缩物、0.5g/L胰岛素、100mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、100mg/L的MgSO4 7H2O、400mg/L的KCl、2000mg/L的NaHCO3、5500mg/L的NaCl、800mg/L的Na2HPO4、任选的pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，生长培养基包含基础培养基DMEM/F12、0.5g/L转铁蛋白、0.1g/L抗坏血酸、0.5mg/L亚硒酸钠、1％脂质浓缩物、0.5g/L胰岛素，或由其组成。
本发明第二方面还提供心肌细胞的无血清生长培养基的制备方法，所述生长培养基包含以下组分：1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L转铁蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、0.1-3mg/L亚硒酸钠，0.1-5％脂质浓缩物、0.1-5g/L胰岛素、无机盐、pH调节剂或由其组成，所述方法包括混合各组分。
优选地，所述生长培养基如本文第二方面所述。
在一个或多个实施方案中，心肌细胞衍生自DYR0100细胞。
本发明第二方面还提供培养心肌细胞的方法，包括用生长培养基孵育心肌细胞细胞，所述生长培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L转铁蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、0.1-3mg/L亚硒酸钠，0.1-5％脂质浓缩物、0.1-5g/L胰岛素、无机盐、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，心肌细胞衍生自DYR0100细胞。
在一个或多个实施方案中，所述心肌细胞是本文第一方面所述方法获得的心肌细胞。
在一个或多个实施方案中，所述孵育的起始细胞浓度是1E+5～10E+5/cm2，优选2E+5～9E+5/cm2、3E+5～8E+5/cm2、3E+5～7E+5/cm2、3E+5～6E+5/cm2、3E+5～5E+5/cm2或3.5E+5～4.0E+5/cm2。
在一个或多个实施方案中，所述孵育持续至少2天，优选至少3天，更优选3-7天。
优选地，所述生长培养基如本文第二方面所述。
本发明第二方面还提供由本文所述生长培养基培养的心肌细胞。
本发明第二方面还提供由本文所述培养心肌细胞的方法获得的心肌细胞。
本发明第二方面还提供心肌细胞在药物筛选以及评估药物对心肌的毒理作用中的用途，所述心肌细胞由本文所述生长培养基培养或由本文所述培养心肌细胞的方法获得。
在一个或多个实施方案中，所述药物是促进心肌细胞的发育、分化、再生、生存等的药物。
本发明第二方面还提供心肌细胞在制备用于治疗受益于补充或更换心肌细胞的心脏疾病的药物中的用途，所述心肌细胞由本文所述生长培养基培养或由本文所述培养心肌细胞的方法获得。
本发明第三方面提供一种心肌细胞的分化和生长培养系统，包含本文第一方面所述的分化培养基，和生长培养基。
在一个或多个实施方案中，所述生长培养基是本文第二方面所述的生长培养基。
本发明第三方面还提供制备心肌细胞的方法，包括：
(1)用含有1-20uM的GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂的分化培养基孵育DYR0100细胞，
(2)用含有1-20uM的Wnt通路抑制剂的分化培养基继续孵育，
任选的(3)用不含GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂和Wnt通路抑制剂的分化培养基继续孵育；
任选的(4)用生长培养基孵育步骤(3)得到的细胞，
所述分化培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，所述生长培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L转铁蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、0.1-3mg/L亚硒酸钠，0.1-5％脂质浓缩物、0.1-5g/L胰岛素、无机盐、pH调节剂或由其组成。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育的起始细胞浓度是1E+5～10E+5/cm2，优选2E+5～9E+5/cm2、3E+5～8E+5/cm2、3E+5～7E+5/cm2、3E+5～6E+5/cm2、3E+5～5E+5/cm2或3.5E+5～4.0E+5/cm2。
在一个或多个实施方案中，GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂是CHIR-99021。优选地，步骤(2)中加入3-12uM的CHIR-99021。
在一个或多个实施方案中，Wnt通路抑制剂是IWR1。优选地，步骤(3)中加入2.5-10uM的IWR1。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)孵育1-10天，优选1-5天，更优选3天。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)孵育1-10天，优选1-5天，更优选3天。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)孵育至少1天，优选1-5天，更优选3天。
在一个或多个实施方案中，步骤(4)孵育持续至少2天，优选至少3天，更优选3-7天。
优选地，所述分化培养基如本文第一方面所述。
优选地，所述生长培养基如本文第二方面所述。
本发明第三方面还提供由本文所述培养系统培养的心肌细胞。
本发明还提供由本文所述制备心肌细胞的方法获得的心肌细胞。
本发明还提供心肌细胞在药物筛选以及评估药物对心肌的毒理作用中的用途，所述心肌细胞由本文所述培养系统培养或由本文所述制备心肌细胞的方法获得。
在一个或多个实施方案中，所述药物是促进心肌细胞的发育、分化、再生、生存等的药物。
本发明还提供心肌细胞在制备用于治疗受益于补充或更换心肌细胞的心脏疾病的药物中的用途，所述心肌细胞由本文所述培养系统培养或由本文所述制备心肌细胞的方法获得。
本发明还提供氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、pH调节剂、白蛋白、抗坏血酸、GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂、Wnt通路抑制剂中的一种或多种或全部在诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞或培养细胞中的应用。所述氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、pH调节剂、白蛋白、抗坏血酸、GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂、Wnt通路抑制剂如本文第一方面和第二方面中所述。
本发明的优点：
提供了一种化学成分明确的心肌细胞分化和生长培养系统。使用该系统生产DYR0100来源的心肌细胞，生产成功率(80％以上)、心肌细胞生产效率(90％以上高)以及生产成本上有显著优势。此外，因生产体系化学成分明确，且没有过多地添加细胞因子或生长因子，使得到的心肌细胞较B27培养或胎牛血清培养的心肌细胞减少其他成分的干扰。
附图说明
图1显示使用IS和LCS系统的目的和使用时段。其中，IS系统适用于心肌细胞分化阶段，LCS系统适用于心肌细胞培养阶段。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
发明人经过研究，在心肌细胞生产过程中剔除了含不稳定的混合成分添加剂如B-27和血清：在分化系统中，使用重组人白蛋白和抗坏血酸代替混合成分添加剂；在生长系统使用化学成分确定的脂质浓缩物以及胰岛素代替胎牛血清。使心肌细胞生产更为稳定，减小了心肌细胞生产失败的风险，利用廉价添加剂进行生产也显著降低心肌细胞生产的成本。
本发明所使用的培养基包括分化培养基和生长培养基。分化培养基包含氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、pH调节剂、白蛋白、抗坏血酸或由其组成。在一个较佳的实施方案中，分化培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。所述培养基还可包含GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂和/或Wnt通路抑制剂。分化培养基可以是液体、固体或半固体。
分化培养基中的抗坏血酸浓度可为0.1-5g/L、0.1-4.5g/L、0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.1-1.5g/L、0.1-1g/L、0.1-0.9g/L、0.1-0.8g/L、0.1-0.7g/L、0.1-0.6g/L、0.1-0.5g/L、0.1-0.4g/L、0.1-0.3g/L、0.1-0.2g/L、0.2-0.4g/L、0.3-0.4g/L、0.2-0.3g/L。
分化培养基中的白蛋白可以是本领域已知的任何种类或来源的白蛋白。在示例性实施例中，本发明使用重组人白蛋白，其浓度为0.1-5g/L、0.1-4.5g/L、0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.1-1.5g/L、0.1-1g/L、0.1-0.5g/L、0.25-1g/L、0.25-0.5g/L。
分化培养基中的碳源可以是本领域已知的任何种类的碳源，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、L-谷氨酰胺。在示例性实施例中，碳源是葡萄糖，其浓度为0.1-10g/L、0.1-9g/L、0.1-8g/L、0.1-7g/L、0.1-6g/L、0.1-5g/L、0.1-4g/L、0.1-3g/L、0.2-3g/L、0.3-3g/L、0.4-3g/L、0.5-3g/L、0.6-3g/L、0.7-3g/L、0.8-3g/L、0.9-3g/L、1-3g/L。
分化培养基中的谷胱甘肽浓度可为0.1-5mg/L、0.1-4.5mg/L、0.1-4mg/L、0.1-3.5mg/L、0.1-3mg/L、0.1-2.5mg/L、0.1-2mg/L、0.1-1.5mg/L、0.1-1mg/L、0.2-1mg/L、0.3-1mg/L、0.4-1mg/L、0.5-1mg/L、0.6-1mg/L、0.7-1mg/L、0.8-1mg/L、0.9-1mg/L、1mg/L。
分化培养基中的pH调节剂可以是本领域已知的任何种类的pH调节剂，例如HEPES、碳酸氢钠。在示例性实施例中，pH调节剂是HEPES。本领域技术人员知晓根据所需pH确定pH调节剂用量的方法。
分化培养基中的氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：甘氨酸、丙氨酰、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。优选地，所述各氨基酸是L-氨基酸。在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：5-15mg/L的甘氨酸、400-500mg/L的丙氨酰、150-250mg/L的精氨酸、40-60mg/L的天冬酰胺、15-25mg/L的天冬氨酸、40-60mg/L的胱氨酸、15-25mg/L的谷氨酸、10-20mg/L的组氨酸、15-25mg/L的羟脯氨酸、40-60mg/L的异亮氨酸、40-60mg/L的亮氨酸、30-50mg/L的盐酸赖氨酸、10-20mg/L的蛋氨酸、10-20mg/L的苯基丙氨酸、15-25mg/L的脯氨酸、25-35mg/L的丝氨酸、15-25mg/L的苏氨酸、2-8mg/L的色氨酸、15-25mg/L的酪氨酸、15-25mg/L的缬氨酸。优选地，所述各氨基酸是L-氨基酸。在示例性具体实施方案中，氨基酸包括：10mg/L的甘氨酸、446mg/L的L-丙氨酰、200mg/L的L-精氨酸、50mg/L的L-天冬酰胺、20mg/L的L-天冬氨酸、50mg/L的L-胱氨酸、20mg/L的L-谷氨酸、15mg/L的L-组氨酸、20mg/L的L-羟脯氨酸、50mg/L的L-异亮氨酸、50mg/L的L-亮氨酸、40mg/L的L-盐酸赖氨酸、15mg/L的L-蛋氨酸、15mg/L的L-苯基丙氨酸、20mg/L的L-脯氨酸、30mg/L的L-丝氨酸、20mg/L的L-苏氨酸、5mg/L的L-色氨酸、20mg/L的L-酪氨酸、20mg/L的L-缬氨酸。
分化培养基的维生素包括选自以下的一种或多种或全部：维生素H、氯化胆硷、右旋泛酸钙、维生素B、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素B2、盐酸硫胺素、维生素B12、肌醇。在一个或多个实施方案中，维生素包括选自以下的一种或多种或全部：0.15-0.25mg/L的维生素H、2.5-3.5mg/L的氯化胆硷、0.2-0.3mg/L的右旋泛酸钙、0.5-1.5mg/L的维生素B、0.5-1.5mg/L的烟酰胺、0.5-1.5mg/L的对氨基苯甲酸、0.5-1.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.15-0.25mg/L的维生素B2、0.5-1.5mg/L的盐酸硫胺素、0.003-0.007mg/L的维生素B12、30-40mg/L的肌醇。在示例性具体实施方案中，维生素包括：0.2mg/L的维生素H、3mg/L的氯化胆硷、0.25mg/L的右旋泛酸钙、1mg/L的维生素B、1mg/L的烟酰胺、1mg/L的对氨基苯甲酸、1mg/L的盐酸吡哆醇、0.2mg/L的维生素B2、1mg/L的盐酸硫胺素、0.005mg/L的维生素B12、35mg/L的肌醇
分化培养基的无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：钙盐、镁盐、钾盐、硝酸盐、硫酸盐、氯化物、磷酸盐。所述无机盐可包括Ca(NO3)2 4H2O、MgSO4-7H2O、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4。在一个或多个实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：80-120mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、80-120mg/L的MgSO4 7H2O、300-500mg/L的KCl、1500-2500mg/L的NaHCO3、4500-6500mg/L的NaCl、500-1100mg/L的Na2HPO4。在示例性具体实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：100mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、100mg/L的MgSO4 7H2O、400mg/L的KCl、2000mg/L的NaHCO3、5500mg/L的NaCl、800mg/L的Na2HPO4。
分化培养基还可包含抑菌剂，用于防止培养期间的细菌污染。常用抑菌剂本领域熟知，例如抗生素。本领域技术人员知晓常用抗生素的用量和使用方法。
分化培养基还可包含pH指示剂，用于在培养期间指示培养基的pH。常用pH指示剂本领域熟知，例如酚红。本领域技术人员知晓常用pH指示剂的用量和使用方法。
分化培养基中还可包含GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂。示例性GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂是CHIR-99021，其浓度为1-20uM、1-19uM、1-18uM、1-17uM、1-16uM、1-15uM、1-14uM、1-13uM、1-12uM、2-15uM、2-12uM、3-12uM。
分化培养基中还可包含Wnt通路抑制剂，例如IWR1、IWP2或IWP4。示例性Wnt通路抑制剂是IWR1，其浓度为1-20uM、1-19uM、1-18uM、1-17uM、1-16uM、1-15uM、1-14uM、1-13uM、1-12uM、1-11uM、1-10uM、1.5-10uM、2-15uM、2-10uM、2.5-10uM。
上述分化培养基可使用本领域周知的方法制备，包括混合上述各组分的固体和溶解。还可以通过先制备各组分的高浓度母液并混合至终浓度而获得分化培养基。本领域技术人员知晓常见的制备方法。
本文的分化培养基还可通过按比例混合基础培养基、白蛋白和抗坏血酸等成分来制备。在一个或多个实施方案中，基础培养基选自以下的一种或多种：RPMI 1640培养基、GlutaMAX、DMEM/F12。
本文所述的分化培养基可用于诱导细胞分化为心肌细胞。诱导步骤包括用该分化培养基孵育分化前的细胞，该细胞可以是本领域已知的任何可衍生出心肌细胞的细胞，包括已建立的干细胞系、iPSC细胞系、ESC细胞系，例如DYR0100细胞。具体地，所述方法包括(1)用含1-20uM的GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂的本文所述的分化培养基孵育浓度为3.5E+5～4.0E+5/cm2的DYR0100细胞1-10天，(2)用含1-20uM的Wnt通路抑制剂的本文所述的分化培养基继续孵育1-10天，和任选的(3)用不含GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂和Wnt通路抑制剂的本文所述的分化培养基继续孵育至少1天。这些抑制剂及其浓度如本文他处所述。利用本文所述的分化培养基和/或生长培养基所得的心肌细胞可维持体内和体外跳动。
本发明还涉及心肌细胞的无血清生长培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、抗坏血酸、转铁蛋白、亚硒酸钠、脂质浓缩物、胰岛素或由其组成。在一个较佳的实施方案中，生长培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L转铁蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、0.1-3mg/L亚硒酸钠，0.1-5％脂质浓缩物、0.1-5g/L胰岛素、无机盐、pH调节剂或由其组成。该生长培养基可用于培养分化培养基分化得到的心肌细胞。生长培养基可以是液体、固体或半固体。
生长培养基中的抗坏血酸浓度可为0.1-5g/L、0.1-4.5g/L、0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.1-1.5g/L、0.1-1g/L、0.1-0.9g/L、0.1-0.8g/L、0.1-0.7g/L、0.1-0.6g/L、0.1-0.5g/L、0.1-0.4g/L、0.1-0.3g/L、0.1-0.2g/L、0.2-0.4g/L、0.3-0.4g/L、0.2-0.3g/L。
生长培养基中的转铁蛋白浓度可为0.1-5g/L、0.1-4.5g/L、0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.1-1.5g/L、0.1-1g/L、0.2-1g/L、0.3-1g/L、0.4-1g/L、0.5-1g/L。
分化培养基中的碳源可以是本领域已知的任何种类的碳源，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖。在示例性实施例中，碳源是葡萄糖，其浓度为0.1-10g/L、0.1-9g/L、0.1-8g/L、0.1-7g/L、0.1-6g/L、0.1-5g/L、0.1-4g/L、0.1-3g/L、0.2-3g/L、0.3-3g/L、0.4-3g/L、0.5-3g/L、0.6-3g/L、0.7-3g/L、0.8-3g/L、0.9-3g/L、1-3g/L。
生长培养基中的谷胱甘肽浓度可为0.1-5mg/L、0.1-4.5mg/L、0.1-4mg/L、0.1-3.5mg/L、0.1-3mg/L、0.1-2.5mg/L、0.1-2mg/L、0.1-1.5mg/L、0.1-1mg/L、0.2-1mg/L、0.3-1mg/L、0.4-1mg/L、0.5-1mg/L、0.6-1mg/L、0.7-1mg/L、0.8-1mg/L、0.9-1mg/L、1mg/L。
生长培养基中的亚硒酸钠浓度可为0.1-3mg/L、0.1-2.5mg/L、0.1-2mg/L、0.1-1.5mg/L、0.1-1mg/L、0.2-1mg/L、0.3-1mg/L、0.4-1mg/L、0.5-1mg/L。
生长培养基中的脂质浓缩物可以是本领域已知的任何种类的脂质浓缩物。示例性的脂质浓缩物包括选自以下的一种或多种或全部：花生四烯酸、胆固醇、维生素E醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、十八烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、Pluronic F-68、硬脂酸、吐温80和任选的乙醇。例如，在一个实施方案中，脂质浓缩物包括选自以下的一种或多种或全部：2.0mg/L的花生四烯酸、220.0mg/L的胆固醇、70.0mg/L的维生素E醋酸酯、10.0mg/L的亚油酸、10.0mg/L的亚麻酸、10.0mg/L的肉豆蔻酸、10.0mg/L的十八烯酸、10.0mg/L的棕榈酸、10.0mg/L的棕榈油酸、90g/L的Pluronic F-68、10.0mg/L的硬脂酸、2.2g/L的吐温80和任选的乙醇。在具体实施例中，脂质浓缩物是ThermoFisher公司的Chemically Defined LipidConcentrate。本文中，脂质浓缩物的浓度可为0.1-5％、0.1-4.5％、0.1-4％、0.1-3.5％、0.1-3％、0.1-2.5％、0.1-2％、0.2-2％、0.3-2％、0.4-2％、0.5-2％。
生长培养基中的胰岛素浓度可为0.1-4g/L、0.1-3.5g/L、0.1-3g/L、0.1-2.5g/L、0.1-2g/L、0.2-2g/L、0.3-2g/L、0.4-2g/L、0.5-2g/L、0.6-2g/L、0.7-2g/L、0.8-2g/L、0.9-2g/L、1-2g/L。
生长培养基中的pH调节剂可以是本领域已知的任何种类的pH调节剂。在示例性实施例中，pH调节剂是HEPES。本领域技术人员知晓根据所需pH确定pH调节剂用量的方法。
生长培养基中的氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：甘氨酸、丙氨酰、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。优选地，所述各氨基酸是L-氨基酸。在一个或多个实施方案中，氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：5-15mg/L的甘氨酸、400-500mg/L的丙氨酰、150-250mg/L的精氨酸、40-60mg/L的天冬酰胺、15-25mg/L的天冬氨酸、40-60mg/L的胱氨酸、15-25mg/L的谷氨酸、10-20mg/L的组氨酸、15-25mg/L的羟脯氨酸、40-60mg/L的异亮氨酸、40-60mg/L的亮氨酸、30-50mg/L的盐酸赖氨酸、10-20mg/L的蛋氨酸、10-20mg/L的苯基丙氨酸、15-25mg/L的脯氨酸、25-35mg/L的丝氨酸、15-25mg/L的苏氨酸、2-8mg/L的色氨酸、15-25mg/L的酪氨酸、15-25mg/L的缬氨酸。优选地，所述各氨基酸是L-氨基酸。在示例性具体实施方案中，氨基酸包括：10mg/L的甘氨酸、446mg/L的L-丙氨酰、200mg/L的L-精氨酸、50mg/L的L-天冬酰胺、20mg/L的L-天冬氨酸、50mg/L的L-胱氨酸、20mg/L的L-谷氨酸、15mg/L的L-组氨酸、20mg/L的L-羟脯氨酸、50mg/L的L-异亮氨酸、50mg/L的L-亮氨酸、40mg/L的L-盐酸赖氨酸、15mg/L的L-蛋氨酸、15mg/L的L-苯基丙氨酸、20mg/L的L-脯氨酸、30mg/L的L-丝氨酸、20mg/L的L-苏氨酸、5mg/L的L-色氨酸、20mg/L的L-酪氨酸、20mg/L的L-缬氨酸。
生长培养基的维生素包括选自以下的一种或多种或全部：维生素H、氯化胆硷、右旋泛酸钙、维生素B、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素B2、盐酸硫胺素、维生素B12、肌醇。在一个或多个实施方案中，维生素包括选自以下的一种或多种或全部：0.15-0.25mg/L的维生素H、2.5-3.5mg/L的氯化胆硷、0.2-0.3mg/L的右旋泛酸钙、0.5-1.5mg/L的维生素B、0.5-1.5mg/L的烟酰胺、0.5-1.5mg/L的对氨基苯甲酸、0.5-1.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.15-0.25mg/L的维生素B2、0.5-1.5mg/L的盐酸硫胺素、0.003-0.007mg/L的维生素B12、30-40mg/L的肌醇。在示例性具体实施方案中，维生素包括：0.2mg/L的维生素H、3mg/L的氯化胆硷、0.25mg/L的右旋泛酸钙、1mg/L的维生素B、1mg/L的烟酰胺、1mg/L的对氨基苯甲酸、1mg/L的盐酸吡哆醇、0.2mg/L的维生素B2、1mg/L的盐酸硫胺素、0.005mg/L的维生素B12、35mg/L的肌醇
生长培养基的无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：钙盐、镁盐、钾盐、硝酸盐、硫酸盐、氯化物、磷酸盐。所述无机盐可包括Ca(NO3)2 4H2O、MgSO4-7H2O、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4。在一个或多个实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：80-120mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、80-120mg/L的MgSO4 7H2O、300-500mg/L的KCl、1500-2500mg/L的NaHCO3、4500-6500mg/L的NaCl、500-1100mg/L的Na2HPO4。在示例性具体实施方案中，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：100mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、100mg/L的MgSO4 7H2O、400mg/L的KCl、2000mg/L的NaHCO3、5500mg/L的NaCl、800mg/L的Na2HPO4。
生长培养基还可包含抑菌剂，用于防止培养期间的细菌污染。常用抑菌剂本领域熟知，例如抗生素。本领域技术人员知晓常用抗生素的用量和使用方法。
生长培养基还可包含pH指示剂，用于在培养期间指示培养基的pH。常用pH指示剂本领域熟知，例如酚红。本领域技术人员知晓常用pH指示剂的用量和使用方法。
上述生长培养基可使用本领域周知的方法制备，包括混合上述各组分的固体和溶解。还可以通过先制备各组分的高浓度母液并混合至终浓度而获得分化培养基。本领域技术人员知晓常见的培养基制备方法。
本文的分化培养基还可通过按比例混合基础培养基、转铁蛋白、抗坏血酸、亚硒酸钠、脂质浓缩物、胰岛素等成分来获得。在一个或多个实施方案中，基础培养基选自以下的一种或多种：RPMI 1640培养基、GlutaMAX、DMEM/F12。
本文所述的生长培养基可用于培养心肌细胞，包括用该生长培养基孵育心肌细胞，该心肌细胞可以是本领域已知的任何心肌细胞，也可以是衍生自DYR0100细胞的心肌细胞，例如使用本文所述的诱导细胞分化的方法所得的心肌细胞。所述孵育持续至少2天，优选至少3天，更优选3-7天。利用本文所述的生长培养基培养所得的心肌细胞可维持体内和体外跳动。
本发明还包括心肌细胞的分化和生长培养系统，包含上述分化培养基和生长培养基。该系统可用于制备心肌细胞。本文中，制备心肌细胞的方法具体包括：(1)用含1-20uM的GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂的分化培养基孵育浓度为3.5E+5～4.0E+5/cm2的DYR0100细胞1-10天，(2)用含1-20uM的Wnt通路抑制剂的本文所述的分化培养基继续孵育1-10天，和任选的(3)用不含GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂和Wnt通路抑制剂的本文所述的分化培养基继续孵育至少1天，和任选的(4)用生长培养基孵育步骤(3)得到的细胞至少1天。这些抑制剂及其浓度如本文他处所述。其中，步骤(1)中的分化培养基可为本领域已知的任何分化培养基或本文所述的分化培养基；步骤(4)中的生长培养基可为本领域已知的任何生长培养基或本文所述的生长培养基。利用本文所述的培养系统所得的心肌细胞可维持体内和体外跳动。
本文方法所得的心肌细胞可用于药物筛选以及评估药物对心肌的毒理作用。这些药物例如促进心肌细胞的发育、分化、再生、生存等的药物。本文方法所得的心肌细胞还可用于制备治疗受益于补充、更换心肌细胞的心脏疾病的药物。
使用本发明提供的心肌细胞分化培养基、生长培养基或生产系统，心肌细胞生产过程中剔除了含不稳定的混合成分添加剂，使心肌细胞生产更为稳定，减小了心肌细胞生产失败的风险，利用廉价单一添加剂进行生产也显著降低心肌细胞生产的成本。
实施例
实施例1，细胞预处理
用Laminin(10ng/ml)、Fibronectin(10ng/ml)等基质预处理培养皿，在细胞培养箱(温度37度，湿度95％，CO2浓度5％)中放置2小时。将DYR-0-100细胞DYR0100细胞(中科院上海细胞库)按0.2E+5～0.6E+5/cm2的密度种至预处理的培养皿上。一般长至3-4天，细胞密度达到3.5E+5～4.0E+5/cm2时，即可使用本专利的方法进行心肌细胞生产。
实施例2，细胞诱导分化
在细胞达到密度后，用PBS清洗细胞2遍以去除残留培养基和死细胞，在诱导分化开始(Day 0，D0)至第七天(Day 7，D7)使用分化培养基(IS)培养细胞；并且，在D0-D2，加入3-12uM CHIR-99021；在D2-D4，另加入2.5-10uM IWR1。一般，在D7便能够见到部分跳动的心肌细胞。
分化培养基组分为：基础培养基RPMI 1640Medium(ThermoFisher)，添加0.25g/L白蛋白(Sigma)、0.1g/L抗坏血酸(Sigma)。
实施例3，心肌细胞生长
在D7后，将细胞转至生长培养基(LCS)，并长期使用LCS进行培养。一般在D10-D14即可见心肌细胞成片状跳动。
生长培养基具体组分为：基础培养基DMEM/F12(ThermoFisher)，添加0.5g/L转铁蛋白(Sigma)、0.1g/L抗坏血酸(Sigma)、0.5mg/L亚硒酸钠(Sigma)、1％脂质浓缩物(Chemically Defined Lipid Concentrate，ThermoFisher)、0.5g/L胰岛素(Sigma)。
不同容器中培养的心肌细胞得率如表1所示。
表1
Figure BDA0002449615850000221
实施例4，培养基成分筛选
经要素减除实验发现，在IS培养基中，氨基酸、维生素、葡萄糖，谷胱甘肽、无机盐、谷胱甘肽等为DYR0100细胞维持生长所需；重组人白蛋白，抗坏血酸为心肌细胞诱导所需。
经要素减除实验发现，在LCS培养基中，氨基酸、维生素、葡萄糖，谷胱甘肽、无机盐、抗坏血酸，转铁蛋白，亚硒酸钠，脂质浓缩物为心肌细胞生长所需，胰岛素0.5-2g/L能调节心肌细胞摄取葡萄糖的能力，为心肌细胞维持体内和体外跳动所需。

Claims (10)

1.一种诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的无血清分化培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸，或由其组成，
优选地，所述培养基具有选自以下的一个或多个特征：
碳源是葡萄糖；
氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：甘氨酸、丙氨酰、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；
维生素包括选自以下的一种或多种或全部：维生素H、氯化胆硷、右旋泛酸钙、维生素B、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素B2、盐酸硫胺素、维生素B12、肌醇；
无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：钙盐、镁盐、钾盐、硝酸盐、硫酸盐、氯化物、磷酸盐；
所述培养基还包含pH调节剂。
2.如权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸或由其组成，
优选地，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：80-120mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、80-120mg/L的MgSO4 7H2O、300-500mg/L的KCl、1500-2500mg/L的NaHCO3、4500-6500mg/L的NaCl、500-1100mg/L的Na2HPO4。
3.如权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，
所述培养基还包含1-20uM的GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂，优选地，GSK-3α的抑制剂或GSK-3β的抑制剂是CHIR-99021，或
所述培养基还包含1-20uM的Wnt通路抑制剂，优选地，Wnt通路抑制剂是IWR1。
4.一种诱导DYR0100细胞分化为心肌细胞的方法，包括用权利要求1-3中任一项所述的分化培养基孵育DYR0100细胞，
优选地，所述方法包括
(1)用含有1-20uM的GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂的分化培养基孵育DYR0100细胞，
(2)用含有1-20uM的Wnt通路抑制剂的分化培养基继续孵育，和
任选的(3)用不含GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂和Wnt通路抑制剂的分化培养基继续孵育，
其中，所述分化培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成。
5.一种心肌细胞的无血清生长培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、碳源、谷胱甘肽、抗坏血酸、转铁蛋白、亚硒酸钠、0.1-5％脂质浓缩物、0.1-5g/L胰岛素，或由其组成，
优选地，所述生长培养基具有选自以下的一个或多个特征：
碳源是葡萄糖；
氨基酸包括选自以下的一种或多种或全部：甘氨酸、丙氨酰、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；
维生素包括选自以下的一种或多种或全部：维生素H、氯化胆硷、右旋泛酸钙、维生素B、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素B2、盐酸硫胺素、维生素B12、肌醇；
脂质浓缩物包含选自以下的一种或多种或全部：花生四烯酸、胆固醇、维生素E醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、十八烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、Pluronic F-68、硬脂酸、吐温80和任选的乙醇；
无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：钙盐、镁盐、钾盐、硝酸盐、硫酸盐、氯化物、磷酸盐。
6.如权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L转铁蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、0.1-3mg/L亚硒酸钠、0.1-5％脂质浓缩物、0.1-5g/L胰岛素、无机盐、pH调节剂或由其组成，
优选地，无机盐包括选自以下的一种或多种或全部：80-120mg/L的Ca(NO3)2 4H2O、80-120mg/L的MgSO4 7H2O、300-500mg/L的KCl、1500-2500mg/L的NaHCO3、4500-6500mg/L的NaCl、500-1100mg/L的Na2HPO4。
7.一种培养心肌细胞的方法，包括用权利要求5或6所述的生长培养基孵育心肌细胞。
8.一种心肌细胞的分化和生长培养系统，包含权利要求1-3中任一项所述的分化培养基，和权利要求5-6中任一项所述的生长培养基。
9.一种制备心肌细胞的方法，包括：
(1)用含有1-20uM的GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂的分化培养基孵育DYR0100细胞，
(2)用含有1-20uM的Wnt通路抑制剂的分化培养基继续孵育，
任选的(3)用不含GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂和Wnt通路抑制剂的分化培养基继续孵育；
任选的(4)用生长培养基孵育步骤(3)得到的细胞，
优选地，所述分化培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、无机盐、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L白蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、pH调节剂或由其组成，
优选地，所述生长培养基包含1％-6％氨基酸、1％-6％维生素、0.5-5g/L碳源、0.1-2mg/L谷胱甘肽、0.1-2g/L转铁蛋白、0.1-0.8g/L抗坏血酸、0.1-3mg/L亚硒酸钠，0.1-5％脂质浓缩物、0.1-5g/L胰岛素、无机盐、pH调节剂或由其组成。
10.由权利要求4、7或9所述的方法获得的心肌细胞。
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