PT99048B - Processo de preparacao de um meio de cultura de celulas de mamifero, isento de soro, a base de meio basal, levedura hidrolisada, dextrano ou albumina, insulinatransferrina, frutose ferrica. citrato e sulfato ferroso e um componente de acido gordo - Google Patents

Processo de preparacao de um meio de cultura de celulas de mamifero, isento de soro, a base de meio basal, levedura hidrolisada, dextrano ou albumina, insulinatransferrina, frutose ferrica. citrato e sulfato ferroso e um componente de acido gordo Download PDF

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Description

O presente invento refere-se ao campo dos meios de cultura de células. Mais particularmente o invento refere-se ao campo dos meios de cultura de células de mamífero.
Antecedentes do Invento
Verificou-se que para além de uma mistura basal nutriente de sais, açúcares, aminoácidos e vitaminas, as células in vitro também necessitam, para a proliferação, de um suplemento de fluidos ou extractos biológicos mal caracterizados. Devido à disponibilidade e facilidade de armazenamento, o suplemento mais comummente utilizado é o soro.
Contudo, o uso de soro em meios de cultura de células tem várias desvantagens. O soro é comparativamente caro. Uma vez que o soro não é um componente definido, diferentes lotes de soro podem variar na concentração dos compostos presentes e assim podem resultar em crescimento de culturas não predizivel. 0 soro pode, também, estar contaminado com vírus ou com micoplasmas. A proteína no soro pode complicar a purificação dos produtos celulares a partir do meio de cultura.
Em esforços para ultrapassar as desvantagens do meio contendo soro, os investigadores têm tentado proporcionar meios isentos de soro substituindo o soro por componentes definidos ou melhor caracterizados. Infelizmente, a complexidade do soro e os diferentes requisitos de crescimento de diferentes tipos de células têm tornado difícil proporcional esses meios. Para revisões sobre os meios isentos de soro para culturas de células de mamíferos ver Rizzino et al. (1979) Defined Media and the Determination Of Nutritional and Hormonal Requirements of Mammalian Cçlls in Culture, Nutrition Reviews 37.: 369-378; Barnes e Sato (1980) Serum-free Cell Culture: a Unifying Approach, Cell 22: 649-655; Barnes e Sato (1980) Methods for Growth of Cultured Cells in Serum-free Médium, Analyt. Biochem, 102: 255-270; e Bodecker et al. (1985) A Screening Method To
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Develop Serum-Free Culture Media For Adherent Cell Lines, Develop. Biol. Standard. 60.: 93-100.
A Patente U.S. 4 786 599, concedida em 22 de Novembro de 1988 a Chessbeuf e Padieu descreve um meio de cultura de tecido animal, isento de soro, contendo uma mistura de sessenta ácidos gordos e albumina ou dextrano. 0 meio é particularmente adaptado para a cultúra primária de células epiteliais de fígado de ratazana e, possivelmente, na presença de hormonas e/ou factores de crescimento, para a obtenção de linhas celulares, em particular linhas celulares de mieloma e hibridoma.
Referirám-se meios para a cultura isenta de soro de células de ovário de criceto chinês (CHO). Gasser et al. (1985) In Vitro Cellular & Developemental Biology 21:588-592 descreve um meio isento de soro para a cultura de células CHO. O meio isento de soro é composto por uma mistura 1:1 dos meios F12 de Ham e mínimo essencial, modificado, de Eagle suplementado com transferrina, insulina e selénio. Mendiaz et al. (1986) In Vitro Celullar & Developemental Biology 22: 66-74 descreve um meio isento de soro para a cultura de células CHO composto por um meio basal suplementado com insulina e sulfato férrico ou transferrina, selénio, elementos vestigiais, cloreto de cálcio, glutamina, ácido linoleico, aminoácidos não essenciais e insulina.
Pietrzkowski et al. (1988) Folia Histochemica et Cytobilogica 26: 123-132 referem um meio isento de soro para a cultura de células de embrião de galinha contendo dextrano. Pietrzkowski e Korohoda (1988) Folia Histochemica et Cytobiologica 26.: 143-154 referem um meio isento de soro contendo dextrano para a cultura de fibroblastos de embrião de galinha. Nestas duas publicações, adicionou-se o dextrano ao meio para intensificar a ligação e propagação das células. Ohmori (1988) Journal of immunological Methods 112: 227-233 refere um meio isento de soro que é capaz de suportar respostas primárias de anticorpo por linfôcitos murinos cultivados. Este meio é baseado num meio basal suplementado com jS-ciclodextrina, insulina, transferrina, albumina, lipoproteína de baixa densidade, ί»
-4* 73 138
SBC CASE 14533 putrescina e alanina.
É um objectivo deste invento proporcionar meios isentos de soro para a cultura de células de mamífero. É, também, objectivo deste invento proporcionar meios isentos de soro para a cultura de células de mamíferos, transformadas para produzirem produtos recombinantes, que aumentam o rendimento no produto. É ainda um outro objectivo do presente invento proporcionar meios isentos de soro para a cultura de células CHO.
k Sumário do Invento * 0 presente invento proporciona meios para a cultura de células de mamíferos. 0 invento está mais particularmente especificado nas reivindicações em anexo e é descrito nas suas concretizações preferidas na descrição seguinte.
Descrição detalhada do invento
Os meios do invento são úteis para a cultura de células de mamífero. Verificou-se que os meios do invento são úteis para a cultura de células de ovário de criceto chinês (CHO) e células HAK, uma linha de células de rim de cria de criceto . Verificou-se que os meios do invento não são adequados para a cultura de linhas celulares de mieloma.
>
Podem cUltivar-se as células em cultura em descontínuo ou em contínuo com os meios isentos de soro do invento. As células CHO cultivadas nos meios do invento atingem densidade celular mais elevada e mostram segregação aumentada de produto recombinante, quando comparadas com células CHO cultivadas num meio contendo soro.
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Os meios de cultura de células do invento são preparados por adição de componentes a um meio basal concebido para a cultura de células de mamíferos. Os meios são preparados de acordo com procedimentos comuns para a preparação de meios de cultura de células.
Os meios basais adequados incluem meios de cultura de
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células de mamífero, comuns, como meio de Ham, meio de Waymouth MB 752/1, meio de Eagle, meio E de Williams, meio 199 e meios derivados dos tipos MEM e MEMa e quaisquer combinações destes meios. Também são adequados para utilização no invento outros meios comuns usados para a cultura de células de mamífero. Um meio basal preferido é o meio basal do Exemplo 1. 0 meio basal preferido suporta o crescimento celular e reduz significativamente o tamanho dos grumos de células no meio durante a cultura das células.
Adiciona-se ao meio basal um hidrolisado de levedura, como Yeastolate, numa quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 10,0 gramas por litro, preferivelmente numa quantidade de cerca de 5 gramas por litro.
Adicionam-se ao meio basal a albumina ou o dextrano numa quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 5 gramas por litro. Adiciona-se ao meio basal, preferivelmente, albumina de soro bovino ou dextrano com uma massa molecular de cerca de 500 000. Adicona-se albumina de soro bovino, preferivelmente, na quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 gramas por litro. Adiciona-se dextrano com uma massa molecular de cerca de 500 000, como o dextrano T500, ao meio basal, preferivelmente na quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 1,0 gramas por litro.
Adiciona-se a insulina ao meio basal na quantidade de cerca de 2,0 a cerca de 20 miligramas por litro, preferivelmente na quantidade de cerca de 10 miligramas por litro.
A transferrina ou substituto de transferrina é adicionada ao meio basal na quantidade de cerca de 0 a cerca de 100,0 microgramas por mililitro. A transferrina pode ser substituída no meio por frutose férrica (de cerca de 1,0 a cerca de 10,0 miligramas por litro), citrato férrico (de cerca de 1,0 a cerca de 100,0 miligramas por litro) ou sulfato ferroso (de cerca de 5,0 micromoles a cerca de 200,0 micromoles por litro).
Adiciona-se uma mistura dos ácidos gordos, oleico, linoleico
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-6e linolénico, ao meio basal na razão de oleico 0,6:linoleico lzlinolénico 0,14 miligramas por litro de meio. Em concretizações preferidas do invento, mantendo esta razão de ácidos gordos, o ácido oleico é, preferivelmente adicionado ao meio basal na quantidade de cerca de 0,012 a cerca de 0,12 miligramas por litro; o áciclo linoleico é, preferivelmente, adicionado ao meio basal na quantidade de cerca de 0,2 a cerca de 5,0 miligramas por litro; o ácido linolénico é adicionado ao meio na quantidade de cerca de 0,028 a cerca de 0,7 miligramas por litro. Adiciona-se colestrol ao meio basal na quantidade de cerca de 0 a cerca de 10,0 miligramas por litro.
Numa concretização preferida do invento, que é descrita mais em detalhe no Exemplo 2, adiciona-se cloreto de cálcio (CaCl2)(anidro) ao meio basal na quantidade de cerca de 0 a cerca de 200 miligramas por litro, preferivelmente na quantidade de cerca de 66,67 miligramas por litro. Adiciona-se sulfato de magnésio (Mg8o4)(anidro) ao meio basal na quantidade de cerca de 0 a cerca de 100,0 miligramas por litro, preferivelmente na quantidade de cerca de 24 miligramas por litro.
O pH do meio é, preferivelmente, de cerca de 6,8 a cerca de 7,4. A osmoláridade do meio é, preferivelmente, de cerca de 280 a 360 miliosmoles.
O meio basal pode ser armazenado como um pó a 4°C durante um ano. O meio çompleto (meio basal com os suplementos adicionados), numa forma liquida pode ser armazenado a 4°C durante seis meses.
Descrevem-se concretizações preferidas do invento nas Exemplos seguintes.
Exemplo 1 Preparação de Meio Basal
Os componentes do meio basal são misturados e moídos num moinho de bolas para se formular um pó homogéneo. 0 meio em pó é, então, distribuído em pacotes de 100 1 e armazenado a 4°C.
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-7COMPONENTES DO MEIO BASAL
MEIOS MR-1 ISENTOS DE SORO
COMPONENTES miligramas/litro
SAIS INORGÂNICOS/ELEMENTOS VESTIGIAIS
NaCl 7066,333000
KC1 341,200000
NaH2PO4.H2O 93,333000
Na2PO4 47,347000
MgCl2.6H2O 4,050000
MgSO4 (anidro) 6,510000
CuSO4.5H2O 0,000866
Fe(NO3)3.9H2O 0,000033
FeSO4·7H2O 0,278000
znso4.7H2o 0,287700
MnCl2.4H2O 0,000033
Na2SeO3 (anidro) 0,172900
AMINOÁCIDOS
L-Alanina 41,300000
L-Arginina HC1 112,546700
L-Arginina FB 16,666000
L-Asparagina H2O 28,336700
Ácido L-aspártico 24,433300
L-Cistina 2HCL 19,116600
L-Cisteína HC1.H2O 45,040000
L-Cisteína FB 13,333300
Ácido L-glutâmico 46,566700
L-Glutamina 292,000000
Glicina 35,833300
L-Histidina HC1.H2O 20,986700
L-Histidina FB 5,000000
L-Isoleucina 35,480000
L-Leucina 46,833300
L-Lisina HCl 65,486600
L-Metionina 11,493300
L-Fenilalanina 20,653300
L-Prolina 34,833300
L-Serina 15,166700
L-Treonina 33,300000
L-Tripotofano 7,346700
L-Tirosina 2Na2H2O 36,776700
L-Valina 35,900000
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VITAMINAS /COMPONENTES VÁRIOS
Dextrose 4500,000000
Putrescina 2HC1 0,053700
Piruvato de Sódio 81,666700
Ácido Ascórbico 17,333300
Biotina 0,202400
D-Pantotenato de Cálcio 0,160000
Pantotenato de Sódio 0,337330
Cloreto de Colina 5,486700
Ácido Fólico 1,100000
i-Inositol 7,333300
Nicotinamida 0,679000
Fosfato de Na2 alfa Tocoferol 0,003300
Glutationa (reduzida) 0,016700
Menadiona Bissulfito de Na 0,003300
Piridoxina HCl 0,020700
Piridoxal HCl 0,666700
Riboflavina 0,079300
Tiamina HCl 0,780000
Vitamina BI2 0,973300
Calciferol 0,033300
Linoleato de Metilo 0,010000
Vitamina A Acetato 0,033000
Ácido Linoleico 0,028000
Ácido Lipóico 0,136700
Preparação de Meio Basal-para um volume final de 100 1
Medem-se noventa litros de água desionizada-destilada para um recipiente de mistura adequado. Adiciona-se um pacote para 100 1 do meio em pó, moído em moinho de bolas (ver acima). Ajusta-se o pH do meio a 7,2 usando HCl IN. Leva-se o volume do meio a 100 1 por adição de água. O meio pode, seguidamente, ser esterilizado por filtração em membrana usando um filtro de acetato de celulose de 0, 2 micra.
Exemplo 2 Preparação de Meio MR1-3 meio MR1-3 contém o meio basal do Exemplo 1 suplementado com 5000 mg/1 de TC Yeastolate (Difco, Detroit, Miçhigan), 500 mg/1 de albumina de soro bovino (BSA) (Armour, Kankakee,
ί“
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-9Illinois), 10 mg/1 de insulina bovina (Waitaki, Toronto, Canada), 10 mg/1 de transferrina bovina (Sigma Chemical Co. , St. Louis, Missouri), 0,12 mg/1 de ácido oleico (Ameresco, Cleveland, Ohío), 0,20 mg/1 de ácido linoleico (Ameresco), 0,028 mg/1 de ácido linolénico (Ameresco), 2 mg/1 de colesterol (Ameresco), 66,67 mg/1 de cloreto de cálcio anidro e 24 mg/1 de sulfato de magnésio anidro. Prepara-se o meio como se segue:
Para um volume final de 100 1
1. Medir 90 litros de água desionizada-destilada para um recipiente de mistura adequado.
2. Adicionar um pacote de 100 1 de meio em pó, moído num moinho de bolas (do Exemplo 1).
3. Adicionar 2,4 gramas de MgSO4 (anidro) e misturar até à dissolução.
4. Adicionar 6,7 gramas de CaCl2 (anidro) e misturar até à dissolução.
5. Adicionar 500 gramas de TC Yeastolate, misturar até à dissolução.
6. Adicionar 50 gramas de BSA, misturar até à dissolução.
7. Adicionar 220 gramas de NaHCO3, misturar até à dissolução.
8. Adicionar 1 grama de insulina, 1 grama de transferrina (ou 100 ml de frutose férrica) e misturar até à dissolução.
9. Dissolver 12 mg de ácido oleico, 20 mg de ácido linoleico, 2,8 gramas de ácido linolénico e 200 mg de colesterol em 100 ml de etanol absoluto e adicionar esta mistura de ácidos gordos ao recipiente de mistura.
10. Ajustar o pH a 7,2 usando HC1 IN.
11. Levar o volume a 100 1 e misturar completamente.
12. Esterilizar por filtração usando um filtro de acetato de celulose de 0,2 micra.
13. Verificar a osmolaridade e registar.
14. Armazenar a 4°C durante até seis meses.
Exemplo 3 Preparação de Meio MR1-6
O meio kRl-6 contém o meio basal do Exemplo 1 suplementado
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-10com 5000 mg/1 de TC Yeastolate (Difco, Detroit, Michigan), 500 mg/1 de albumina de soro bovino (Armour, Kankakee,Illinois), 10 mg/1 de insulina bovina (Waitaki, Toronto, Canada), 10 mg/1 de transferrina bovina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MIssouri), 0,12 mg/1 de ácido oleico (Ameresco, Cleveland, Ohio), 0,20 mg/1 de ácido linoleico (Ameresco), 0,028 mg/1 de ácido linolénico (Ameresco) e 2 mg/1 de colesterol (Ameresco). Prepara-se o meio da mesma forma que o meio MR1-3 no Exemplo 2 com a excepção de se omitirem os passos 3 e 4. Neste meio não se adicionam MgSO4 ou CaCl2 adicionais.
Exemplo 4 Preparação do Meio MR1-7
O meio basal contém o meio basal do Exemplo 1 suplementado com 5000 mg/1 TC Yeastolate (Difco, Detroit, Michigan), 1000 mg/1 de Dextrano T-500 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey), 10 mg/1 de insulina bovina (Waitaki, Toronto, Canada), 10 mg/1 de transferrina bovina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), 0,12 mg/1 de ácido oleico (Ameresco, Cleveland, Ohio), 0,20 mg/1 de ácido linoleico (Ameresco), 0,028 mg/1 ácido linolénico (Ameresco) e 2 mg/1 colesterol (Ameresco). Prepara-se o meio MR1-7 do mesmo modo que o meio MR1-3 no Exemplo 2 com a excepção de se omitirem os passos 3 e 4 e o Dextrano T-500 substituir a albumina de soro bovino no passo 6. No passo 6, adicionam-se 100 gramas de Dextrano T-500 e misturam-se até se dissolverem.
Exemplo 5 Cultura de Células
Cultivaram-se células CHO transformadas para produzirem T4 solúvel, uma forma solúvel do receptor da célula linfocítica T-4 (linha celular 37-80N), em quatro meios de cultura diferentes: soro contendo Alfa (-) MEM/ 5% de soro de bovino fetal (FBS) e os meios descritos nos Exemplos 2, 3 e 4. Cultivaram-se 5xl05 células por mililitro durante 7 dias, após sementeira em balões SP de 250 ml, com 150 ml de meio. Determinou-se o número total de células por contador Coulter e determinou-se a viabilidade por exclusão de corante azul de triptofano usando um hemocitómetro. Determinou-se a concentração de ST4 por um ensaio baseado em
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-11ELISA. No dia dois após a sementeira, os meio isentos de soro mostraram um maior número de células do que os meio contendo soro. No meio contendo soro, existiam aproximadamente 1,3x10® células ao passo que nos meios isentos de soro existiam aproximadamente 1,6x10® células. Nos dias 3 até 7 estavam presente significativamente mais células nos meios isentos de soro do que no meio contendo soro. No dia 3, existiam aproximadamente 2,4xl06 células no meio contendo soro e aproximadamente 3,3x10® células nos meios isentos de soro. No dia 4, o número total de células no meio contendo soro tinha descido ligeiramente para 2,25x10® células. Em contraste, o número de células noS meios isentos de soro tinha aumentado para aproximadamente 3,6x10® células em MR1-7, 4,1x10® células em MR1-3 e 4,3x10® células em MR1-6. No dia 7, o número total de células no meio MR1-7 tinha aumentado para aproximadamente 4,0x10® e o número de células nos outros meios permanecia em níveis comparáveis aos níveis no dia 4.
Três dias após a sementeira, as células cultivadas nos meios isentos de soro produziam significativamente mais sT4 do que as células desenvolvidas no meio contendo soro. A diferença na quantidade do produto sT4 tornou-se mais pronunciada nos dias
4-7. No dia 7, as células cultivadas nos meios isentos de soro produziram de cerca de 75 a 87 microgramas de sT4 por mililitro de meio, ao passo que as células cultivadas no meio contendo soro produziram cèrca de 35 microgramas de sT4 por mililitro de meio.
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Claims (15)

1 - Processo de preparação de um meio de cultura de células de mamífero, isento de soro, caracterizado por se misturar: (a) um meio basal sintético destinado à cultura de células de mamífero; com (b) cerca de 0,1 a cerca de 10 gramas por litro de levedura hidrolisada; (c) cerca de 0,1 a cerca de 5 gramas por litro de dextrano ou albumina; (d) cerca de 2 a 20 miligramas por litro de insulina; (e) 0 a cerca de 100 miligramas por litro de um composto seleccionado de entre o grupo que consiste em transferrina, frutose férrica, citrato ferroso e sulfato ferroso; e (f) um componente de ácido gordo consistindo em ácido oleico, ácido linolçico e ácido linolénico numa razão de cerca de 0,6:1:0,14 miligramas de ácido gordo por litro.
2 - Proâesso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se misturar ainda 0 a cerca de 10 miligramas por litro de colesterol.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se misturar 0 a cerca de 200 miligramas por litro de cloreto de cálcio anidro e 0 a cerca de 100 miligramas por litro de sulfato de magnésio anidro.
>
4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida levedura hidrolisada estar presente no meio na quantidade de cerca de cinco gramas por litro.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a albumipa estar presente no referido meio na quantidade de cerca de 0,5 gramas por litro.
6 - Proâesso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida albumina ser albumina de soro bovino.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido dextrano estar presente no referido meio na quantidade de cerca de um grama por litro.
I
73 138
SBC CASE 14533
-138 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido dextrano ser dextrano com uma massa molecular de cerca de 500 000.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida insulina estar presente no referido meio na quantidade de cerca de 10 miligramas por litro.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida transferrina estar presente na quantidade de cerca de 10 miligramas por litro.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ácido ©leico estar presente na quantidade de cerca de 0,12 miligramas por litro, o ácido linoleico estar presente na quantidade de cerca de 0,20 miligramas por litro, e o ácido linolénico estar presente na quantidade de cerca de 0,028 miligramas por litro.
12 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o colesterol estar presente na quantidade de cerca de dois miligramas por litro.
13 - Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o referido cloreto de cálcio estar presente na quantidade de cerca de 66 a cerca de 67 miligramas por litro; e o sulfato de magnésio estar presente na quantidade de cerca de 24 miligramas por litro.
14 - Processo de preparação de um meio de cultura de células de mamífero, isento de soro, caracterizado por se misturar: (a) um meio basal sintético destinado à cultura de células de mamífero; com (b) cerca de 5 gramas por litro de levedura hidrolisada; (c) cerca de 1 grama por litro de albumina; (d) cerca de 10miligramas por litro de insulina; (e) cerca de 10 miligramas por mililitro de transferrina; (f) um componente de ácido gordo consistindo em cerca de 0,12 miligramas por litro de ácido oleico, cerca de 0,20 miligramas por litro de ácido
73 138
SBC CASE 14533
-14linoleico é cerca de 0,028 miligramas por litro de ácido linolénico; β (g) cerca de 2 miligramas por litro de colesterol.
15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por se misturar ainda cerca de 66 a cerca de 67 miligramas por litro de cloreto de cálcio anidro; e cerca de 24 miligramas por litro de sulfato de magnésio anidro.
16 - Processo de preparação de um meio de cultura de células de mamífero, isento de soro, caracterizado por se misturar: (a) um meio basal sintético destinado à cultura de células de mamífero; com (b) cerca de 5 gramas por litro de levedura hidrolisada; (c) cerca de 1 grama por litro de dextrano com uma massa molecular de cerca de 500 000; (d) cerca de 10 miligramas por litro de insulina; (e) cerca de 10 miligramas por litro de transferrina; (f) um componente de ácido gordo consistindo em cerca de 0,12 miligramas por litro de ácido oleico, cerca de 0,20 miligramas por litro de ácido linoleico e cerca de 0,028 miligramas por litro de ácido linolénico; e (g) cerca de 2 miligramas pôr litro de colesterol.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE501217C2 (sv) * 1990-12-06 1994-12-12 Skandigen Ab Cellproliferationsmatris och användning därav
SE9303601D0 (sv) * 1993-11-01 1993-11-01 Kabi Pharmacia Ab Improved cell cultivation method and medium
EP0891419A4 (en) 1996-03-12 2000-03-01 Life Technologies Inc NUTRIENT ADDITIVE FOR HEMATOPOETIC CELL CULTURES
JP2000517188A (ja) * 1996-08-30 2000-12-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 無血清哺乳動物細胞培養培地およびその使用
US6103529A (en) * 1996-10-10 2000-08-15 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising peptides derived from rice
US6692961B1 (en) 1996-10-11 2004-02-17 Invitrogen Corporation Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
NZ524661A (en) 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
CA2494379C (en) 2002-09-05 2012-11-06 Bavarian Nordic A/S Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions
GB2404665B (en) 2003-08-08 2005-07-06 Cambridge Antibody Tech Cell culture
PT1651754E (pt) * 2003-08-08 2007-07-06 Cambridge Antibody Tech Cultura de células de mieloma em meio de baixo teor de ferro e isento de transferrina.
WO2020127613A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 Genfit In vitro model of liver steatosis and fibrosing non-alcoholic steatohepatitis
CN110343666B (zh) * 2019-07-10 2023-05-30 通化东宝药业股份有限公司 一种cho细胞培养的补料培养基及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2543158B1 (fr) * 1983-03-24 1985-11-15 Inst Nat Sante Rech Med Milieu de culture de cellules animales sans serum, sans hormones et sans facteurs de croissance et procedes de culture primaire et d'obtention de lignees cellulaires utilisant ce milieu
US5024947A (en) * 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
DE3801236A1 (de) * 1988-01-18 1989-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Pentosansulfat-medium
AU4254489A (en) * 1989-10-03 1991-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Method of induction and activation of cytotoxic t cells
DE69128538T2 (de) * 1990-09-25 1998-07-16 Smithkline Beecham Corp Kulturmedien für drosophilazellen

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